WO2013147578A9 - Extracto crudo de un híbrido de sechium edule, método para su extracción y su uso para formulaciones con efecto antineoplásico - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the use of plant extracts for the formulation of compositions with antineoplastic effect. Specifically, the present invention relates to the use of a crude extract of a Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISeM", which is useful for the treatment of cancerous tumors due to its antineoplastic effect.
- Cancer is a growing public health problem worldwide that affects people of all ages and is caused by various changes in the behavior of cells that arise from changes in genetic information, due to which these cells proliferate without control forming malignant tumors that tend to grow invasively destroying normal tissues and organs (Karp, 1998).
- Such changes in the cell are caused by the accumulation of genetic alterations induced by physical, chemical or biological agents (Yocota, 2000), such as ultraviolet radiation, radioactive emissions, recurrent infections with pathogenic organisms, exposure to carcinogenic chemical compounds (Weinberg , 1996), damage to the immune system, endocrine imbalance, age and physiological conditions of the organism.
- Cancer is classified according to the type of tissue where it progresses, such as sarcomas from connective tissue, muscle tissue and adipose tissue; carcinomas, which come from epithelial tissue, and finally leukemias and lymphs whose origin is in hematopoietic and lymphoid tissue.
- Cancer treatment varies according to its type and condition; for which the medicine applies different procedures to try to cure it.
- Surgery is one of these, and involves the removal of cancer through a surgical operation, which depends on the location and size of the tumor, with side effects such as pain and fatigue depending on the type of surgery (NCI, 2008).
- Others such as radiotherapy, referred to the application of high-energy radiation to eliminate cancer cells in a given area, are applied externally in the direction of the tumor area, or internally by means of needles or catheters containing radioactive substances. Side effects are tiredness, immune system depletion, hair loss, as well as, redness, dryness and tenderness in the skin (NCI, 2008).
- Chemotherapy is another method and medications are used to eliminate cancer cells throughout the body, however, healthy cells are also damaged, presenting side effects such as immunosuppression, loss of appetite and hair, fatigue, nausea, vomiting, diarrhea and mouth sores (NCI, 2008).
- anticancer drugs derived from plants currently in clinical use, there are six main classes of compounds (including their synthetic and semi-synthetic derivatives): vinca alkaloids, epipodophyllotoxins, taxanes, camptothecins, homoharringtonins and ellipticins (Balunas et al., 2005, Vega et al., 2006), many of them found in plants used in ethnomedicine, however, about 58% of plant species used have not examined their chemical composition or biological activity (Vega et al., 2006).
- Sechium spp of the Cucurbitaceae family, commonly called “chayotes”. Of the neotropical species of the family present in Mexico, stands out Sechium edule (Jacq.) Sw., which is of great importance to man due to its food use and traditional medicine, since the fruits and seeds are rich in several amino acids, in addition to containing seven of the nine essential amino acids (lysine, leucine, methionine, phenylalanine, valine, isoleucine, histidine) (Flores, 1989).
- S. edule (Jacq.) Sw. It contains peroxidases, sterols, alkaloids, saponins, phenols, polyphenols, flavonoids and cucurbitacins (Cadena-I ⁇ iguez, 2005), molecules that are attributed with anti-allergenic, anti-inflammatory, anti-oxidant, antiviral and antitumor effects (Salama et al., 1986; Jayaprakasam et al., 2003; Setzer et al., 2003; Siciliano et al., 2004 and Ordo ⁇ ez et al., 2006), including u et al.
- the CN1603340 patent discloses the use of a chaiotic protein with antitumor activity in which the effect of said protein is shown in terms of the percentage of tumor inhibition.
- Another objective of the present invention is to provide an extract of a Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISeM", with an antineoplastic therapeutic effectiveness greater than those exerted by drugs that inhibit the growth of tumor cells such as cytarabine (Ara -C) .
- a further objective of the present invention is to provide a method for obtaining a crude extract of a Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISeM" with a high antineoplastic therapeutic effectiveness.
- Another objective of the invention is to provide an extract of a Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISeM", which produces an antineoplastic therapeutic effect and has no side effects.
- Figure 1 refers to a graph showing the dose response curve of the effect of the extract of the H-387-07-GISeM hybrid on the proliferation of normal bone marrow cells and tumor lines L929, HeLa and EHI-3 , evaluated with the violet crystal technique.
- Figure 2 refers to a graph showing the dose response curve of the effect of the extract of the H-387-07-GISeM hybrid on tumor line proliferation K-562, evaluated with the violet crystal technique.
- Figure 3 refers to an agarose gel where DNA fragmentation of the WEHI-3 cell line treated with the IC 50 of the H-387-07-GISeM hybrid and compared to cytarabine and a vehicle is observed, a technique used to evaluate death by apoptosis.
- Figure 4 refers to the survival of mice after 6 months of treatment with 6.6 mg / kg of the extract of the H-387-07-GISeM hybrid, every 48 hours intraperitoneally for 25 weeks and 12 more weeks without treatment.
- the present invention relates to a crude extract of the Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISe", which is the product of the cross between varieties: Sechium edule var. virens levis by Sechium edule var. to wild arus and its result by Sechium edule var. nigrum spinosum, which presents therapeutic effectiveness as an antineoplastic agent and the method for obtaining said extract.
- H-387-07-GISe is the product of the cross between varieties: Sechium edule var. virens levis by Sechium edule var. to wild arus and its result by Sechium edule var. nigrum spinosum, which presents therapeutic effectiveness as an antineoplastic agent and the method for obtaining said extract.
- Said organic or aqueous solvent is selected from the group comprising methanol, ethanol, hexane and water.
- Afoil one milliliter with PBS (Phosphates Buffer Solution) and homogenize using vortex.
- HeLa cell lines Sechium edule called "H-387-07-GISeM" on tumor cells
- HeLa cell lines were used which is an adenocarcinoma of epithelial tissue of the cervix from a woman
- cell line L929 that comes from male mouse lung fibrosarcoma of connective tissue areolar and adipose subcutaneous
- EHI-3 and K562 are lines from leukemia (liquid tumors) which are kept in IMDM culture medium (Iscove ' s Modificed Dulbeco's Medium).
- Tumor cells were cultured for 72 hours in 200 DL of culture medium and serum with 0.0, 0.15, 0.3, 0.6, 1.2, 2.5 and 5 Dg / mL of the extract and evaluated by the crystal violet technique ( Figure 1).
- the cells were maintained in culture for 5 days after being stimulated with different doses of extract or Ara-C as a control (5 ⁇ ) and was evaluated by the violet crystal technique, Figure 1, where a dose response curve of the Effect of H-387-07-GISeM extract on cell proliferation of WEHI-3, HeLa, L929 and bone marrow cells. Values are the average of three trials with three repetitions.
- the lines on the bars indicate ⁇ the standard deviation. ⁇ Significant difference (p ⁇ 0.05) with respect to the control.
- H-387-07-GISeM The extract of the Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISeM” inhibits proliferation in a dose-dependent manner and only less than 1.2 yg / mL was required to completely inhibit cell line proliferation of solid carcinomas of the cervix ( HeLa) or mouse WEHI-3 leukemia line, while for mouse lung fibrosarcoma (L929) in no dose completely blocks it.
- normal mouse bone marrow cells treated with 5 g / mL reach a proliferation of 60% in relation to the control, but with 5 pg / mL cytarabine (Ara-c) only reaches 35%.
- Figure 2 describes a dose response curve of the effect of H-387-07-GISeM extract on cell proliferation of the K-562 line. Values are the average of three trials with three repetitions. The lines on the bars indicate ⁇ the standard deviation. ⁇ Significant difference (p ⁇ 0.05) with respect to the control.
- IC 50 concentration of mean inhibition
- IC 50 the concentration of the extracts to inhibit cell proliferation by 50% (IC 50 ) of each cell line
- H-387-07-GISeM the linear regression equation of the proliferation dose-response curve corresponding to the cell lines treated with the extract of the Sechium edule hybrid
- H-387-07-GISeM An additional way to evaluate the effect of the extract of the Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISeM" on tumor cells was to determine the presence of apoptotic bodies by morphology, for this, lxlO 5 cells / mL of the lines were obtained HeLa, L929 and EHI-3, which were cultivated for 48 hours in 1000 ⁇ , of culture medium and serum for each well in 24-well flat bottom ultra-adhesion plates (Costar, Cambridge, MA, USA), with or without the IC 50 of the different extracts for each cell line. After the time, the cells were collected and placed on a slide, then fixed with 1 mL of methanol and stained for 20 minutes with 10% Giemsa dye.
- cell viability was evaluated with purpose of determining that the extract only acts against tumor cells, for which the tumor cells were cultured for 72 hours under the aforementioned conditions; in quantities of 200 L of medium and serum / well in 96-well flat bottom ultra-adhesion plates (Costar, Cambridge, MA, USA) with different doses of extract. After the time, direct counting was performed with hemocytometer and by exclusion of trypan blue; which enters the cells that have damage to the membrane staining the nucleus of blue, which indicates that they are no longer viable. The viability of bone marrow cells was evaluated after 5 days of culture.
- mice were treated where BALB / c females, 2 to 3 months old, were used. 4 groups were formed with 5 mice each.
- the extract (6.6 mg / kg in 1 mL of PBS) of the H-387-07-GISeM or PBS hybrid was inoculated, one group was treated with cytarabine as a cytotoxicity control. Four inoculations were performed, one every 48 hours, 24 hours after the last inoculation, the cells were removed and the processing was carried out to finally evaluate the mitotic index (1000 cells were counted per sheet).
- mice managed under the same conditions were injected with the extract every 48 h, for 6 months, weighed every week. The behavior was also determined and survived 3 more months after the last inoculation.
- the extract of the H-387-07-GISeM hybrid It is not cytotoxic for normal bone marrow cells.
- healthy mice were treated with the extract of the H-387-07-GISeM hybrid (6.6 mg / Kg) every 48 h for 7 days. The percentage of mitotic indices on bone marrow leukocytes in these mice was quantified. It was found that the extract of the Sechium edule hybrid called "H-387-07-GISeM" does not reduce the mitotic index with respect to the control mouse while Ara-c does, which indicates that the extract is not cytotoxic.
- Figure 4 describes the survival of mice treated with 6.6 mg / Kg of H-387-07-GISeM extract (CUCURBIN-387) every 48 hours, for 25 weeks and maintained for 12 weeks post inoculum.
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un extracto crudo del híbrido H-387-07-GISeM, producto de los cruzamientos entre las variedades: Sechium edule var. virens levis por Sechium edule var. amarus silvestrys y su resultante por Sechium
edule var. nigrum spinosum, el cual presenta actividad terapéutica como agente antineoplásico, dicha composición tiene un efecto mejorado respecto a sus progenitores y además no presenta efectos colaterales durante su administración.
Description
EXTRACTO CRUDO DE UN HÍBRIDO DE Sechlum e le, MÉTODO PARA SU EXTRACCIÓN Y SU USO PARA FORMULACIONES CON EFECTO
ANTINEOPLÁSICO
Campo de la Invención
La presente invención se refiere al uso de extractos vegetales para la formulación de composiciones con efecto antineoplásico . Específicamente, la presente invención se refiere al uso de un extracto crudo de un híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM", el cual es útil para el tratamiento de tumores cancerosos debido a su efecto antineoplásico.
Antecedentes de la Invención
El cáncer es un problema de salud pública creciente a nivel mundial que afecta a personas de todas las edades y que es producida por diversos cambios en la conducta de las células que surgen por modificaciones en la información genética, debido a lo cual éstas células proliferan sin control formando tumores malignos que tienden a crecer de manera invasiva destruyendo tejidos y órganos normales (Karp, 1998) . Tales cambios en la célula son provocados por la acumulación de alteraciones genéticas inducidas por agentes físicos, químicos o biológicos (Yocota, 2000), como son, la radiación ultravioleta, emisiones radiactivas, infecciones recurrentes con organismos patógenos, exposición a compuestos químicos carcinogénicos (Weinberg, 1996) , daños en el sistema inmune, desequilibro endocrino, edad y condiciones fisiológicas del organismo.
El cáncer se clasifican de acuerdo al tipo de tejido donde progresa, tales como, sarcomas procedentes de tejido conjuntivo, tejido muscular y tejido adiposo; los carcinomas, que provienen de tejido epitelial, y finalmente las leucemias y linfornas cuyo origen es en el tejido hematopoyét ico y linfoide.
El tratamiento del cáncer varia según el tipo y estado del mismo; para lo cual la medicina aplica diferentes procedimientos para intentar curarlo. La cirugía es uno de estos, y consiste en la extracción del cáncer por medio de una operación quirúrgica, la cual depende del lugar y tamaño del tumor, con efectos secundarios como dolor y cansancio según sea el tipo de cirugía (NCI, 2008). Otros como la radioterapia referido a la aplicación de radiaciones de alta energía para eliminar las células cancerígenas en un área determinada, es aplicada de forma externa en dirección al área del tumor, o interna por medio de agujas o catéteres que contienen las sustancias radioactivas. Los efectos secundarios son cansancio, abatimiento del sistema inmune, pérdida de pelo, así como, enrojecimiento, resequedad y sensibilidad en la piel (NCI, 2008) . La quimioterapia es otro de los métodos y se utilizan medicamentos para eliminar las células cancerígenas en todo el cuerpo, sin embargo, las células sanas también son dañadas, presentando efectos secundarios como inmunosupresion, pérdida de apetito y pelo, fatiga, nauseas, vómito, diarrea y llagas en la boca (NCI, 2008) .
Todos los tratamientos, en general, tienen por objetivo eliminar a las células cancerígenas llevándolas a iniciar algún proceso de muerte celular, pero afectan de
igual forma a las células sanas provocando finalmente y en conjunto los efectos secundarios.
En la actualidad se ha incrementado la necesidad de fortalecer las investigaciones de tratamientos alternativos o complementarios, con el fin de eliminar a las células tumorales y mitigar los efectos secundarios con mayores niveles de especificidad y eficacia para el tratamiento del cáncer. A este respecto, los productos naturales son utilizados por el hombre para la obtención de agentes medicinales (Setzer et al., 2003), usando como fuente de dichos compuestos a las plantas.
Dentro del grupo de drogas anticancerigenas derivadas de plantas actualmente en uso clínico, se encuentran seis principales clases de compuestos (incluyendo sus derivados sintéticos y semi-sintéticos) : alcaloides vinca, epipodofilotoxinas , taxanos, camptotecinas , homoharringtoninas y elipticinas (Balunas et al., 2005, Vega et al., 2006), muchas de ellas encontradas en las plantas usadas en la etnomedicina, sin embargo, cerca del 58% de especies de plantas empleadas no se han examinado su composición química o actividad biológica (Vega et al., 2006) .
Sechium spp, de la familia Cucurbitaceae , llamados comúnmente "chayotes". De las especies neotropicales de la familia presentes en México, sobresale Sechium edule ( Jacq. ) Sw. , la cual, es de gran importancia para el hombre debido a su uso alimentario y medicina tradicional, ya que los frutos y las semillas son ricas en varios aminoácidos, además de contener siete de los nueve aminoácidos esenciales (lisina, leucina, metionina, fenilalanina,
valina, isoleucina, histidina) (Flores, 1989) .
Otros estudios realizados con frutos, hojas y tallos de chayóte han revelado su actividad diurética (Jensen et al., 1986), anti-inflamatoria (Salama et al., 1986) e hipotensora (Cambar et al., 1980; Guppy et al., 2000), antimutagénica (Yen et al., 2001), antibacteriana (Ordoñez et al., 2003), ayuda a la eliminación de cálculos renales, es utilizado como complemento en el tratamiento de arteriosclerosis e hipertensión (Abdelnour et al., 2002), alivia la inflamación intestinal y cutánea además de favorecer la cauterización de úlceras (Diré et al., 2003) .
Se ha demostrado que S. edule (Jacq.) Sw . contiene peroxidasas, esteróles, alcaloides, saponinas, fenoles, polifenoles, flavonoides y cucurbitacinas ( Cadena-Iñiguez , 2005), moléculas a las que se les atribuye actividad anti- alergénica, anti-inflamatoria, anti-oxidantes , antiviral y efectos antitumorales (Salama et al., 1986; Jayaprakasam et al., 2003; Setzer et al., 2003; Siciliano et al., 2004 y Ordoñez et al., 2006), incluso u et al. (1998), caracterizaron a la proteina sechiumina de la semilla, la cual tiene propiedades de inactivación ribosomal y podría ser un posible agente quimioterapéut ico, sin embargo, el proceso de extracción es altamente complejo y se limita a la extracción de la proteina a partir de la piel de la semilla, por lo que la cantidad de material biológico empleada es muy alta.
Se ha reportado que los extractos crudos de ocho variedades de S. edule tienen potencial antiproliferativo, donde se registró que los extractos alcohólicos de los frutos de las variedades var. amarus silvestrys, var.
nigrum spinosum, var. virens levis, var. nigrum xalapensis y var. albus levis presentan actividad citotóxica en la proliferación de las lineas celulares L929 y P388 y que el extracto de var. albus inor y var. albus dulcís no inhibe la proliferación (Cadena-Iñiguez et al., 2007; Salas et al., 2007) . Mientras que en la linea celular HeLa las var. albus levis y virens levis tienen mayor potencial antiproliferativo (Rivera, 2010) . Sosa (2008), evaluó los extractos acuoso, metanólico y etanólico de S . edule (Jacq.) Sw. var. nigrum spinosum en las lineas HeLa y L929, donde concluye que los extractos metanólico y etanólico son los que tienen actividad antiproliferativa y citotóxica de forma dosis-dependiente sobre la linea celular L929. Posteriormente onroy-Vázquez (2009), confirma dicha actividad y adicionalmente menciona haber obtenido cuatro fracciones de dicho extracto, de las cuales tres presentaron actividad antiproliferativa similar; siendo la 5-7 la de mayor actividad y especificidad sobre HeLa, indicando que los componentes químicos de dicha fracción, correspondieron al grupo de esteres de ácidos grasos saturados; ampliando la gama de metabolitos y fuentes de especies vegetales con actividad antineoplásica .
Una revisión sobre plantas medicinales importantes de la familia Cucurbitacea , Dhiman et al. (2012) describe los efectos cardiovasculares, hepatoprotectores , antiinflamatorios y ant icancerigenos en la familia Curcubitaceae, particularmente se reporta la actividad anticancerigena de la especie Curcubita andrean y la actividad antioxidante, antihipertensiva y antiinflamatoria de S. edule. , sin embargo, no se especifica su actividad
antineoplásica.
La patente CN1603340 divulga el uso de una proteina del chayóte con actividad antitumoral en la que se muestra el efecto de dicha proteina en cuanto al porcentaje de inhibición de tumores.
Sumario de la Invención
Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención brindar un extracto de un híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM", con una efectividad terapéutica antineoplásica mayor que los extractos de otras especies del género Sechium .
Otro objetivo de la presente invención es brindar un extracto de un híbrido de Sechium edule denominado "H-387- 07-GISeM", con una efectividad terapéutica antineoplásica mayor que los ejercidos por fármacos que inhiben el crecimiento de células tumorales tal como citarabina (Ara-C) .
Un objetivo más de la presente invención es brindar un método para la obtención de un extracto crudo de un híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" con una alta efectividad terapéutica antineoplásica.
Así mismo, otro objetivo de la invención es brindar un extracto de un híbrido de Sechium edule denominado "H-387- 07-GISeM", el cual produce un efecto terapéutico antineoplásico y no presenta efectos colaterales.
Esto y otros objetivos serán alcanzados mediante la invención que se describe a detalle a continuación.
Breve Descripción de las Figuras de la Invención
La Figura 1 se refiere a una gráfica en donde se muestra la curva dosis respuesta del efecto del extracto del híbrido H-387-07-GISeM sobre la proliferación de células de médula ósea normal y de las líneas tumorales L929, HeLa y EHI-3, evaluada con la técnica de cristal violeta .
La Figura 2 se refiere a una gráfica en donde se muestra la curva dosis respuesta del efecto del extracto del híbrido H-387-07-GISeM sobre la proliferación línea tumoral K-562, evaluada con la técnica de cristal violeta.
La Figura 3 se refiere a un gel de agarosa donde se observa fragmentación de DNA de la línea celular WEHI-3 tratada con la IC50 del híbrido H-387-07-GISeM y comparada con citarabina y un vehículo, una técnica empleada para evaluar muerte por apoptosis.
La Figura 4 se refiere a la sobrevivencia de ratones después de 6 meses de tratamiento con 6.6 mg/Kg del extracto del híbrido H-387-07-GISeM, cada 48 h por vía intraperitoneal durante 25 semanas y 12 semanas más sin tratamiento.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención se refiere a un extracto crudo del híbrido Sechium edule denominado "H-387-07-GISe " , el cual es producto de la cruza entre las variedades: Sechium edule var. virens levis por Sechium edule var. a arus silvestres y su resultante por Sechium edule var. nigrum spinosum, el cual presenta efectividad terapéutica como agente antineoplásico y el método para la obtención de
dicho extracto.
De acuerdo con la presente invención, una forma preferente para obtener el extracto del híbrido H-387-Q7- GISe , se lleva a cabo de la siguiente manera:
1. Cortar los frutos (incluyéndo epidermis, espinas y semillas) y partes vegetativas del híbrido H-387- 07-GISeM en trozos pequeños.
2. Secar a 40°C con circulación de aire y moler los trozos para estandarizar el tamaño de partícula
3. Extraer el material seco del híbrido H-387-07- GISeM mediante una extracción discontinua con un disolvente ya sea orgánico o acuoso, haciendo recircular el disolvente por al menos 7 veces. Dicho disolvente orgánico o acuoso se selecciona del grupo que comprende metanol, etanol, hexano y agua .
4. Evaporar el disolvente a presión reducida, para obtener el extracto crudo.
5. Diluir el extracto crudo en relación 3:1 en etanol .
6. Aforar a un mililitro con PBS (Phosphates Buffer Solution) y homogenizar usando vórtex.
7. Centrifugar y colectar el sobrenadante.
8. Realizar diluciones empleando solo el sobrenadante .
9. Esterilizar durante 40 min con luz UV .
10. Almacenar las diluciones a 4°C.
Se realizó un análisis bioquímico al extracto del híbrido de de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" El contenido de metabolitos secundarios indica que el extracto
del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" tiene alto contenido de triterpenos y fenoles, mediano contenido en flavonoides, esteres de ácidos grasos y saponinas, y bajo contenido de saponinas, cada grupo de metabolito secundario relacionado con algún tipo de actividad antitumoral (Tabla 1) .
Tabla 1. Composición de metabolitos secundarios del híbrido H-387-07-GISeM.
En donde Cada "+" representa aproximadamente el 7.1 % de cada metabolito secundario que sumados constituyen el 100% .
Para determinar el efecto del extracto del híbrido de
Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" sobre células tumorales, se emplearon líneas celulares HeLa que es un adenocarcinoma de tejido epitelial del cérvix proveniente de una mujer, línea celular L929 que proviene de fibrosarcoma de pulmón de ratón macho de tejido conectivo subcutáneo areolar y adiposo, EHI-3 y K562 son líneas provenientes de leucemias (tumores líquidos) las cuales se
mantienen en medio de cultivo IMDM (Iscove's Modificed Dulbeco's Médium) . Las células tumorales fueron cultivadas durante 72 horas en 200 DL de medio de cultivo y suero con 0.0, 0.15, 0.3, 0.6, 1.2, 2.5 y 5 Dg/mL del extracto y se evaluó mediante la técnica de cristal violeta (Figura 1) . Las células fueron mantenidas en cultivo durante 5 dias después de ser estimuladas con diferentes dosis de extracto o Ara-C como control (5 μΜ) y se evaluó mediante la técnica de cristal violeta, Figura 1, en donde se describe una curva dosis respuesta del efecto del extracto H-387-07- GISeM sobre la proliferación celular de las lineas WEHI-3, HeLa, L929 y células de medula ósea. Los valores son el promedio de tres ensayos con tres repeticiones. Las lineas sobre las barras indican ± la desviación estándar. ^Diferencia significativa (p<0.05) con respecto al control. El extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387- 07-GISeM" inhibe la proliferación en forma dosis dependiente y sólo se requirió de menos de 1.2 yg/mL para inhibir completamente la proliferación de líneas celulares de tumores sólidos carcinoma de cérvix (HeLa) o línea leucémica WEHI-3 de ratón, mientras que para el fibrosarcoma de pulmón de ratón (L929) en ninguna dosis la bloquea completamente. Por su parte, las células normales de médula ósea de ratón tratadas con 5 g/mL alcanzan una proliferación del 60% en relación al control, pero con 5 pg/mL de citarabina (Ara-c) solo alcanza un 35%. El uso de 5 pg/mL del extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" en HeLa, eliminó completamente a las células, mientras que el ant ineoplásico en uso clínico no (Figura 1), por lo que este carcinoma es más
sensible al extracto objeto de la presente invención. El extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07- GISeM" también inhibe la proliferación de K562 en forma dosis dependiente (Figura 2) y similar al imatinib, un quimioterapéu ico en uso clínico para tratar leucemia mieloide crónica, patología de la cual se obtuvo esta línea celular y que el éxito de su tratamiento se basa en el uso de imatinib y sus análogos, sin llegar a ser curativos.
La Figura 2 describe una curva dosis respuesta del efecto del extracto H-387-07-GISeM sobre la proliferación celular de la línea K-562. Los valores son el promedio de tres ensayos con tres repeticiones. Las líneas sobre las barras indican ± la desviación estándar. ^Diferencia significativa (p<0.05) con respecto al control.
Asimismo, para determinar la concentración de inhibición media (IC50), es decir, la concentración necesaria de los extractos para inhibir la proliferación celular en un 50 % (IC50) de cada línea celular, se empleó la ecuación de regresión lineal de la curva dosis- respuesta de proliferación correspondiente a las líneas celulares tratada con el extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" .
Con los datos de proliferación obtenidos en los bioensayos, se determinaron las concentraciones para reducir a la mitad la proliferación celular (IC50) . Los resultados indican que las células de carcinoma de cérvix (HeLa) son 17 veces más sensibles que la médula ósea normal, seguida de la leucemia mieloide aguda (WEHI-3) (8 veces), leucemia mieloide crónica (K562) (2.5 veces) y fibrosarcoma de pulmón (L929) (2 veces) (Tabla 2) .
Tabla 2. Concentraciones (ug'mL-1) de IC50 del extracto H- 387-07-GISeM sobre las lineas tumorales y normales, calculada con base a la curva dosis-respuesta mediante una ecuación de regresión lineal.
Linea Celular IC50 (ug'mL )
WEHI-3 0. 50
K-562 1. 50
HeLa 0. 20
L929 1. 78
Médula ósea
3. 90
normal
Una forma adicional para la evaluación del efecto del extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07- GISeM" sobre células tumorales fue determinar la presencia de cuerpos apoptóticos por morfología, para esto se obtuvieron lxlO5 células/mL de las líneas HeLa, L929 y EHI-3, que fueron cultivadas por 48 horas en 1000 μΐ, de medio de cultivo y suero para cada pozo en placas de 24 pozos fondo plano ultra baja adherencia (Costar, Cambridge, MA, USA) , con ó sin la IC50 de los diferentes extractos para cada línea celular. Transcurrido el tiempo se colectaron las células y se colocaron en un portaobjetos, posteriormente se fijó con 1 mL de metanol y se tiñó durante 20 minutos con el colorante Giemsa al 10 %. Se observó al microscopio (Cari Zeiss, Primo Star, Germany) , equipado con un lente de objetivo lOOx. Los cambios morfológicos como disminución del volumen celular,
condensación de la cromatina, la pérdida de la regularidad de la membrana celular fueron parámetros citomorfológicos evaluados en la formación de cuerpos apoptóticos. Se contaron 200 células de cada experimento para obtener el porcentaje de células normales y apoptóticas. Las lineas tumorales muestran cuerpos apoptóticos (Tabla 3), no asi en células de médula ósea normal.
Tabla 3. Porcentaje de cuerpos apoptóticos inducidos sobre las tres lineas celulares después de 48h de estimulo con la IC50 del extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM", correspondiente a cada linea, el control y Ara-C 5ug/mL. Los valores se presentan como la media ± desviación estándar.
% Cuerpos apoptóticos
Linea Celular Ara-C
Η-387-GISeM
WEHI-3 0.510.71 53± 9.4 61.5 ± 8.2
HeLa 0 + 0 3 ±1. 4 21 ± 0
L929 0 ± 0 7 ± 4.2 6 ± 1.4
La inducción de apoptosis, se evaluó por la fragmentación de DNA. Los datos indican que WEHI-3 tratada con CUCURBIN-387 sufre fragmentación de DNA al igual que lo hace Ara-C, Figura 3, en donde se describe la fragmentación de DNA de células WEHI-3 cultivadas por 48h con diferentes tratamientos: 1.- Marcador de Peso Molecular; 2.- Control; 3.- H-387-07-GISeM; 4.- ARA-C.
Por otra parte se evaluó la viabilidad celular con la
finalidad de determinar que el extracto solamente actúa contra células tumorales, para lo cual las células tumorales se cultivaron por 72 horas bajo las condiciones antes mencionadas; en cantidades de 200 L de medio y suero /pozo en placas de 96 pozos fondo plano ultra baja adherencia (Costar, Cambridge, MA, USA) con diferentes dosis de extracto. Transcurrido el tiempo se realizó conteo directo con hemocitómetro y por exclusión de azul tripano; el cual entra a las células que presentan daño en la membrana tiñendo el núcleo de azul, lo que indica que ya no son viables. La viabilidad de las células de médula ósea se evaluó después de 5 días de cultivo.
El empleo de los valores de la IC50 del híbrido para cada línea celular, tal como se describe en la Tabla 2, en líneas celulares tumorales o células mononucleadas de médula ósea normal de ratón, indica la viabilidad de las células normales, Tabla 4. L929 tiene una viabilidad reducida (64%) seguida de HeLa (87%), reducción que también se correlaciona a la observada con citarabina. En WEHI-3 y K562, el extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" no altera su viabilidad, pero si lo hace totalmente Ara-c. Es decir, que el extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" sólo afecta a células tumorales no así para células normales de médula ósea.
Tabla 4. Porcentaje de la viabilidad de las líneas celulares tumorales tratadas con o sin la IC50 del extracto H-387-07-GISeM, con citarabina (Ara-C 5 ug/mL) o en su caso Imatinib. Los valores se presentan como la media +
desviación estándar.
% Viabilidad
Linea Celular
Η-387-GISeM Ara-c
WEHI-3 97.4 ± 5.1 91.7 ± 10.5 0 + 0
K-562 98.7 ± 6.7 92.8 ± 8.3 4 ± 2.3
HeLa 97.6 ±5.9 87.6 ±9.6 83.2 ± .
L929 95.6 ± 4.8 64.2 ± 8.2 82.4 ± 3
Médula ósea
98.2 ± 4.6 100 ± 9.1 0 ± 0 normal
Las únicas células tratadas con Imatinib (1 uM) . Para confirmar lo anterior, se realizó un tratamiento a ratones en donde se emplearon hembras BALB/c , de 2 a 3 meses de edad. Se formaron 4 grupos con 5 ratones cada uno. Se inoculó el extracto (6.6 mg/Kg en 1 mL de PBS) del híbrido H-387-07-GISeM o PBS, un grupo se trató con citarabina como control de citotoxicidad . Se realizaron 4 inoculaciones, una cada 48 h, 24 h después de la última inoculación se extrajeron las células y se procedió al procesamiento para finalmente evaluar el índice mitótico (se contaron 1000 células por lámina) . Para evaluar el efecto tóxico por administración prolongada, grupos de ratones manejados en las mismas condiciones, fueron inyectados con el extracto cada 48 h, durante 6 meses, pesados cada semana. Asimismo se determinó el comportamiento y las sobrevida 3 meses más después de la última inoculación. El extracto del híbrido H-387-07-GISeM
no es citotóxico para células de médula ósea normal. Para evaluar el efecto citotóxico in vivo, se trataron ratones sanos con el extracto del híbrido H-387-07-GISeM (6.6 mg/Kg) cada 48 h por 7 días. Se cuantificó el porcentaje de índices mitóticos sobre los leucocitos de médula ósea en esos ratones. Se encontró que el extracto del híbrido de Sechium edule denominado "H-387-07-GISeM" no reduce el índice mitótico con respecto al ratón testigo mientras que si lo hace Ara-c, lo cual indica que el extracto no es citotóxico.
Se llevó a cabo este mismo esquema de tratamiento, pero por un periodo de 25 semanas, y un monitoreo de 11 semanas posteriores al término del tratamiento, se mantuvieron el total de ratones con vida y en condiciones similares a los ratones que no recibieron tratamiento, lo cual indica que las dosis empleadas no son citotóxicas y no provocan daño en periodos prolongados de suministro por vía intraperitoneal .
La Figura 4 describe la supervivencia de ratones tratados con 6.6 mg/Kg del extracto H-387-07-GISeM (CUCURBIN-387 ) cada 48h, durante 25 semanas y mantenidos por 12 semanas post inoculo.
Claims
1 . Un extracto crudo del híbrido de Sechium edule H-387- 07-GISeM, caracterizado porque dicho extracto presenta efecto terapéutico ant ineoplásico .
2 . El extracto crudo del híbrido de Sechium edule H-387- 07-GISeM según la reivindicación 1, caracterizado porque se compone químicamente de terpenos, fenoles, flavonoides, taninos, saponinas y ésteres de ácidos grasos.
3 . El extracto crudo del híbrido de Sechium edule H-387- 07-GISe según la reivindicación 2, caracterizado porque se compone químicamente de terpenos en una proporción de aproximadamente 29%, fenoles en una proporción de aproximadamente 21%, flavonoides en una proporción de aproximadamente 14%, taninos en una proporción de aproximadamente 8%, saponinas en una proporción de aproximadamente 14% y ésteres de ácidos grasos en una proporción de aproximadamente 14%.
4. El extracto crudo del híbrido de Sechium edule H-387- 07-GISeM según la reivindicación 1, en donde dicho extracto es útil en el tratamiento de tumores líquidos y sólidos provocantes de muy diversos tipos de cáncer.
5 . El extracto crudo del híbrido de Sechium edule H-387- 07-GISeM según la reivindicación 1, en donde dicho extracto no presenta efectos colaterales sobre células normales durante su administración.
6. Un método para la obtención del extracto crudo del
híbrido de Sechium edule H-387-07-GISeM según la reivindicación 1, en donde dicho método comprende las siguientes etapas:
a) Cortar frutos del híbrido H-387-07-GISeM y cortar en trozos pequeños,
b) Secar dichos trozos y molerlos,
c) Extraer el material seco mediante una extracción discontinua con algún disolvente orgánico o acuoso,
d) Evaporar el disolvente,
e) Disolver en etanol,
f) Aforar con una solución buffer de fosfatos y homogenizar,
g) Centrifugar y colectar el sobrenadante,
h) Realizar diluciones,
i) Esterilizar por luz UV y,
j ) Almacenar
7. El método para la obtención de un extracto crudo del híbrido H-387-07-GISeM según la reivindicación 6, en donde en la etapa a) el fruto incluye epidermis, espinas y semillas .
8. El método para la obtención de un extracto crudo del híbrido H-387-07-GISeM, según la reivindicación 6, en donde en la etapa c) dicho disolvente puede ser metanol, etanol, hexano o agua.
9. El método para la obtención de un extracto crudo del híbrido H-387-07-GISeM, según la reivindicación 8, en donde el disolvente es preferentemente etanol.
10. El método para la obtención de un extracto crudo del híbrido H-387-07-GISeM, según la reivindicación 6, en donde
en la etapa h) las diluciones se llevan a cabo empleando el sobrenadante .
11. Uso de un extracto crudo del híbrido H- 387 - 07 -GI SeM según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la elaboración de una composición farmacéutica con un alto efecto antineoplásico .
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