DE112009003659T5

DE112009003659T5 - Mittel zur Beseitigung einer Multiarzneimitelresistenz

Info

Publication number: DE112009003659T5
Application number: DE112009003659T
Authority: DE
Inventors: Vasiliy Vyacheslavovich LEBEDEV
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2012-10-11
Also published as: GB2478456A; US20160022762A1; SMAP201100028A; GB201108788D0; GB2478456B; US20120129792A1; WO2010062217A1; RU2434879C2; RU2008146409A; SMP201100028B

Abstract

Die Erfindung gehört zur Medizin, nämlich zur Pharmakologie, und könnte zur Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz bei onkologischen und infektiösen Patienten verwendet werden, die sich einer langfristigen Chemotherapie unterziehen. Essenz der Erfindung: Als therapeutisches Mittel zur Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz wird hier ein Hexapeptid mit der folgenden Strukturformel vorgeschlagen: Lysyl-Histidyl-Glycyl-Lysyl-Histidyl-Glycin.

Description

Die Erfindung gehört zur Medizin, nämlich zur Pharmakologie, und könnte zur Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz bei onkologischen und infektiösen Patienten verwendet werden, die sich einer langfristigen Chemotherapie unterziehen.
Es ist bekannt, dass sich eine Multiarzneimittelresistenz (in der Folge als MDR bezeichnet) von Tumorzellen, gram-negativen Bakterien und Protozoen gegenüber zytostatischen und antimikrobiellen Agentien aufgrund der natürlichen Zellabwehrmechanismen entwickelt. Solche Mechanismen stellen durch ATP-abhängige Transportproteine ein intensives Austreiben aller schädlichen Verbindungen aus Zellen sicher, einschließlich chemotherapeutischer Mittel. Einer verstärkte Intensität der Funktion der zellulären Transportpumpe während der Chemotherapie führt zu einer markanten Abnahme in der Konzentration chemischer Mittel in der Zelle, wodurch die therapeutische Wirkung von Arzneimitteln in Patienten dramatisch verringert wird, die an bakteriellen, parasitären und Pilzinfektionen wie auch onkologischen Krankheiten leiden. Das oben genannte breite Spektrum von Krankheiten, deren Behandlung aufgrund der Entwicklung einer MDR kompliziert ist und sich manchmal sogar als unmöglich erweist, ist eine klarer Hinweis auf den dringenden Bedarf, neuartige wirksame Mittel zu gestalten, die eine MDR verhindern oder umgehen sollen.
In den Säugetierzellen sind für die MDR vorwiegend zwei Arten von Transportproteinen verantwortlich: Multiarzneimittelresistenzproteine (MRPs) und P-Glykoprotein (P-gp). Sowohl MRPs als auch P-gp finden sich in Tumoren unterschiedlichen Ursprungs: Lymphomen, Sarkomen, Karzinomen und Neuroblastomen.
Die Substrate für die beiden Arten von Transportproteinen scheinen ein breites Spektrum antineoplastischer Arzneimittel zu sein: Anthracyclin, Etoposid, Vincristin, Taxol, usw. Anders als P-gp jedoch, transportiert das MRP verschiedene Substanzen aus Zellen in der Form von Konjugaten mit Glutathion oder Glucuronsäure. Infolge der Funktion der Transportproteine gelangen zytostatische Mittel in den extrazellulären Raum und Tumorzellen erlangen gleichzeitig Resistenz gegenüber einer Reihe von Arzneimitteln.
Von einer Vielzahl von Substanzen ist bekannt, dass sie die Aktivität des Transportproteins P-gp unterdrücken und die Exkretion chemischer Mittel aus Zellen hemmen. Es zeigt sich, dass praktisch alle MDR-hemmenden Verbindungen, die wir kennen, durch ihre physicochemischen Eigenschaften gemeinsame Merkmale haben, einschließich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, geringes Molekulargewicht, intrinsische hydrophobe physicochemische Merkmale und das Vorhandensein des aromatischen Rings im Molekül. Zu MDR-Inhibitoren gehören therapeutische Mittel der folgenden Gruppen: Kalziumkanalblocker, Calmodulin-Inhibitoren, Koronarvasodilatoren, Indolalkaloide, Hormone, Zyklosporine, oberflächenaktive Substanzen und Antibiotika [Krishna R., Mayer R. D., Eur. J. Pharmacol. Sci. 2000. Band 11. Nr. 4. 265–283].
Die oben genannten Substanzen scheinen jedoch eine geringe spezifische Aktivität in Bezug auf die Hemmung einer MDR von Tumorzellen zu zeigen. Somit ist bekannt, dass Kalziumkanalblocker, zum Beispiel Verapamil, eine in vitro hemmende Aktivität bei einer Dosis von etwa 10 μM aufweisen.
Eine andere bekannte Gruppe von Mitteln – Calmodulin-Antagonisten: Trifluorperasin, Chlorpromazin, Prochlorperazin, scheint die Fähigkeit zu haben, die Resistenz von Tumorzellen gegen chemotherapeutische Mittel nur bei relativ hohen Konzentrationen von etwa 5–50 μM zu senken. Obwohl MDR-Inhibitoren identifiziert wurden, hat sich keiner von ihnen bisher als klinisch nützlich ohne nachteilige Nebenwirkungen erwiesen. Die Verabreichung bekannter Arzneimittel bei den wirkenden Konzentrationen an Labortiere erfordert derart hohe Dosen, die entweder zu letalen Ergebnissen oder schweren Komplikationen führen [Sandar V., Fojo T., Bates S. E., Drug Res. Aktualisierungen 1998. Band 1, 190–200]. Schwere toxische Reaktionen der bekannten MDR-Inhibitoren verhindern deren Verwendung bei Patienten zur Überwindung einer MDR. Daher bieten bisher keine Arzneimittel die Möglichkeit, eine MDR bei onkologischen oder infektiösen Patienten zuverlässig zu umgehen.
Die Entwicklung einer MDR in Tumorzellen wird nicht nur durch Transporter vermittelt, die als P-pg bekannt sind, sondern auch durch andere Transportmittel, einschließlich Multiarzneimittelresistenzproteine (MRPs). Diese verleihen denselben chemischen Verbindungen Resistenz wie dies P-gp macht, aber mit einem etwas anderen Spektrum einer Kreuzresistenz. Mit Multiarzneimittelresistenz in Zusammenhang stehende Proteine, die zu der MRP-Familie gehören, anders als die P-gp-Proteine, haben eine weite interspezifische Darstellung und scheinen die Entwicklung einer MDR von Tumorzellen wie auch in Helminthen, Protozoen und Bakterien zu kontrollieren [Borst T., Kool M., Evers R. Sem. Cancer Biol. 1997. Band 8, 205–213]. Daher haben die therapeutischen Mittel, die imstande sind, die Aktivität von MRP-Transportproteinen zu beeinflussen, ein breiteres Wirkungsspektrum im Vergleich zu den Arzneimitteln, die die Aktivität der P-gp-Transportproteine beeinflussen. Erstgenannte könnten nicht nur die Bildung einer MDR von Tumorzellen beeinflussen, sondern auch die Manifestation einer Multiarzneimittelresistenz in Helminthen, Protozoen, einschließlich Malaria-Plasmodium, und Bakterien.
Als therapeutisches Mittel ist ein Cyclohexapeptid mit der folgenden Strukturformel bekannt: Cyclo-Lysyl-Histidyl-Glycyl-Lysyl-Histidyl-Glycin [Russische Föderation Patent RU 2157235 – Mittel zur Behandlung von Immunmangelzuständen]. Die bekannte, pharmakologisch wirksame Substanz ist jedoch nicht imstande, eine MDR zu überwinden und unterscheidet sich in der chemischen Formel von dem vorgeschlagenen Hexapeptid der linearen Struktur Lysyl-Histidyl-Glycyl-Lysyl-Histidyl-Glycin. Empirische Formel C₂₈H₄₄O₆N₁₂. Molekulargewicht 644,7 D. Daher betrifft die Überlegung ganz andere chemische Substanzen, die verschiedene Wirkungen haben: eine Substanz, Cyclo-Lysyl-Histidyl-Glycyl-Lysyl-Histidyl-Glycin, beeinflusst das Immunsystem, die andere Lysyl-Histidyl-Glycyl-Lysyl-Histidyl-Glycin beeinflusst die Multiarzneimittelresistenz.
Einer der wirksamsten MDR-Inhibitoren, der von uns als der ähnlichste Prototyp verwendet wurde, ist ein allgemein bekanntes Arzneimittel, das ein Peptid als Wirkungsprinzip enthält – Cyclosporin A [Russisches Arzneimittelregister, Band 16, S. 983–984, 2008]. Das Arzneimittel hat seine klinische Anwendung als Immundepressor in der Organ- und Gewebetransplantation gefunden. Zur Überwindung einer MDR wird dieses Arzneimittel nur zu Versuchszwecken in Zellkulturen verwendet. Cyclosporin A ist ein hydrophobes zyklisches Peptid mit der folgenden Strukturformel:
Das bekannte Peptid Cyclosporin A hemmt eine MDR vorwiegend über eine kompetitive Hemmung der ATP-abhängigen Transportproteine, die zur P-gp-Familie gehören. Cyclosporin A hat nachweislich eine geringe Wirkung, wenn überhaupt, auf Multiarzneimittelresistenzproteine (MRPs) [Legrand O., Simonin G., Perrot J. Y. Blood. 1998. Band 91. Nr. 12. 4480–4488]. Cyclosporin A hemmt in In vitro-Experimenten die Aktivität von Transportproteinen bei Konzentrationen von 0,5–2 μM. Es hemmt eine MDR in Tierexperimenten, indem es die Wirkungseffizienz von Doxorubicin auf das Tumorwachstum bei Mäusen erhöht. Seine klinische Anwendung zur Überwindung einer MDR in Patienten scheint jedoch unmöglich, da das Arzneimittel in wirksamen Dosen eine starke toxische Wirkung hat.
Die vorgeschlagene Erfindung hat die Schaffung eines therapeutischen Mittels zum Ziel, das eine erhöhte Wirksamkeit in der Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz, eine verstärkte Wirkungsspezifität in Bezug auf Transportproteine einer Multiarzneimittelresistenz (MRPs), eine erhöhte Sicherheit, eine zuverlässige Entlastung von toxischen Reaktionen und Schaffung annehmbarer Dosierungsformen zur Prävention und Therapie bei Patienten garantiert, die Manifestationen einer Multiarzneimittelresistenz aufweisen.
Die hier angeführte Aufgabe wird durch die Tatsache gelöst, dass ein therapeutisches Mittel, das zur Überwindung einer MDR gegenüber verschiedenen chemischen Substanzen verwendet wird, ein hydrophobes Hexapeptid mit der folgenden Strukturformel ist: Lysyl-Histidyl-Glycyl-Lysyl-Glycin. Empirische Formel: C₂₈H₄₆O₇N₁₂.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Ansammlung von Calcein in den R388VR-Zellen in der Kontrolle (1) und nach Zugabe von 12 nM Peptid (2) in Gegenwart von Co²⁺-Ionen im Medium (Abschrecken von extrazellulärem Calcein).
2 zeigt einen Calceinausfluss aus den vorläufig mit Calcein beladenen R388VR-Zellen in der Kontrolle (1) und nach Zugabe von 120 nM Peptid (2).
3 zeigt die Kinetik des R123-Ausflusses aus Hep-2-Zellen in der Kontrolle (1), nach Zugabe von Cyclosporin A, 1 μg/ml (2) und Digitonin, 0,02% (3).
4 zeigt die Kinetik des Rhodamin R123-Ausflusses aus Hep-2-Zellen in der Kontrolle (1) und nach Zugabe von Cyclosporin A, 1 μg/ml.
5 zeigt die Abhängigkeit der Hemmung der Rate einer R123 (R)-Expression von Hep-2-Zellen durch Hexapeptid und Cyclosporin A (Cs A) von deren Konzentrationen.
6 zeigt das Überleben von Hep-2-Zellen nach der Belastung mit 50 μM Arsenat mit 1 (2) and 100 (3) mg/ml Hexapeptid.
7 zeigt die Wirkung von Hexapeptid auf das Wachstum von Hep-2 Tumorzellen.
Das vorgeschlagene therapeutische Mittel enthält als Wirkungsprinzip ein synthetisches Hexapeptid mit einem Molekulargewicht von 662,7 D.
Das Wirkprinzip ist ein geruchloses weißes Pulver, das leicht in Wasser und isotonischer Natriumchloridlösung löslich ist. Die Substanz ist nicht alkohol- oder chloroformlöslich.
Das vorgeschlagene therapeutische Mittel, das eine MDR überwinden soll, enthält das Hexapeptid in einer Dosis von 1–0,001% (10–0,01 mg). Die hergestellten Dosierungsformen des vorgeschlagenen Mittels enthalten eine sterile Hexapeptidlösung für subkutane oder intramuskuläre Injektionen in Ampullen. Als Stabilisator enthält das Mittel eine 1,0–0,5%ige Lösung (10–0,5 mg) von Aminoessigsäure. Eine Dosierungsform für subkutane oder intramuskuläre Injektionen für die geplante Verwendung ist bevorzugter eine 0,005%ige sterile Hexapeptidlösung in 1,0-ml-Fläschchen mit 0,5% Aminoessigsäure als Stabilisator. Die Haltbarkeit ist 2 Jahre bei Lagerung bei 4–8°C.
Eine Sprühdosierungsform für eine dosierte intranasale Anwendung ist bevorzugter in 10,0–20,0-ml-Flaschen, die jeweils 10–20 Dosen des vorgeschlagenen Mittels enthalten. Jede Dosis enthält 0,05–0,1 mg Hexapeptid und 5–10 mg Aminoessigsäure als Stabilisator. Die Lösung für eine dosierte intranasale Verabreichung enthält 0,0040 bis 0,00012 g/ml Benzalkoniumchlorid, das als Konservierungsmittel verwendet wird. Die bevorzugteste Dosierungsform enthält eine Einzeldosis von 100 mg Hexapeptid, 0,5% Aminoessigsäure als Stabilisator und 0,00010 g/ml Benzalkoniumchlorid. Die Haltbarkeit ist 2 Jahre bei Lagerung bei 4–8°C.
Die Zäpfchendosierungsform, die für eine rektale oder vaginale Verabreichung bestimmt ist, enthält das Wirkprinzip – Hexapeptid bei einer Einzeldosis von 5–0,05 mg, 20–0,5 mg Aminoessigsäure als Stabilisator (Russische Pharmakopöe, Monographie 42-599-92, ND 42-11253-00) oder einen weiteren in Russland registrierten Stabilisator ähnlicher Qualität, Tween 80 (Polysorbat 80) (PhM 42-2540-88) 120–150 mg, Wasser für Injektionszwecke (PhM 42-2620-97) und Hartfett (PhM 42-346-97, ND 42-8991-98), um ein Zäpfchen mit einem Gewicht von 1,2–2,5 g zu erhalten. Die Haltbarkeit ist 2 Jahre bei Lagerung bei 4–80°C.
Das therapeutische Mittel wurde in Limited Liability Company Research and Production Enterprise ”Bionox” entwickelt und aufgrund seiner Zusammensetzung scheint es nicht möglich, sofort neuartige, günstige und patientenfreundliche Eigenschaften in Betracht zu ziehen, wie unten angeführt:

– Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz von Zellen;
– Wirkungsspezifität in Bezug auf Transportproteine einer Multiarzneimittelresistenz (MRPs);
– erhöhte Sicherheit;
– zuverlässige Entlastung systemischer toxischer Reaktionen;
– Schaffung annehmbarer Dosierungsformen zur Prävention und Therapie von Patienten, die Manifestationen einer Multiarzneimittelresistenz aufweisen.

Die Ergebnisse präklinischer und klinischer Studien des vorgeschlagenen Mittels haben gezeigt, dass es weder eine ausgeprägte toxische Reaktion auslöst, noch zur Entwicklung von Nebenwirkungen führt.
Experimentelle und klinische Befunde zeigten, dass:

1. Das Hexapeptid die Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz 3.000-mal effektiver garantiert als die Prototypsubstanz (Beispiel 3, 5) und ausreichende Sicherheit in Bezug auf das Tumorwachstum besitzt (Beispiel 4, 7).
2. Das vorgeschlagene Mittel Wirkungsspezifität in Bezug auf Transportproteine einer Multiarzneimittelresistenz (MRP) hat. Die Prototypsubstanz, d. h., Cyclosporin A, liefert keine ähnliche Wirkung. Das Hexapeptid führt bei einer Konzentration von 1,2 nM einen dreifachen Anstieg in der Empfindlichkeit humaner Kehlkopfkrebszellen Hep-2 gegenüber dem spezifischen Inhibitor des Proteins herbei, das eine Multiarzneimittelresistenz gegen zytostatische Substanz – Arsenat – vermittelt (6).
3. Das Hexapeptid besitzt eine außergewöhnlich geringe Toxizität und bietet einen großen therapeutischen Sicherheitsbereich. Eine Einzeldosis, die die durchschnittliche therapeutische um das 1.000-Fache überstieg (1,5 mg/kg), führte bei Labortieren nicht zum Tod.
4. Der chronische Toxizitätstest des vorgeschlagenen Mittels zeigte zuverlässig dessen Sicherheit. Es zeigte sich, dass Schwankungen der hämatologischen und biochemischen Parameter, wenn das Mittel einen Monat täglich bei der therapeutischen Dosis (1,5 μg/kg) oder bei einer Dosis, die die therapeutische um das 10-Fache überstieg (15 μg/kg), an Tiere verabreicht wurde, nach dem Absetzen des Mittels wieder auf die Grundlinienwerte zurückgekehrt waren.
5. Bei Verabreichung erzeugt das therapeutische Mittel keine örtlichen Reizungen und hat weder allergische noch mutagene Aktivität.

Das therapeutische Mittel lieferte gute klinische Ergebnisse in einer umfangreichen Chemo- und Strahlentherapie von humanem Zervixkarzinom, Speiseröhrenkrebs und anderen malignen Tumoren. Das vorgeschlagene Mittel ist in Kuren vor und während einer Chemostrahientherapie zu verabreichen.
Die Wirksamkeit der Behandlung wird anhand klinischer und laboratorischer Werte bewertet, einschließlich des Grades des Pathomorphismus des Tumors, der Entwicklung toxischer und Strahlenbelastungsreaktionen, der Kontinuität der Chemotherapie, des Zustandes der oxidativen-antioxidativen und Immunsysteme des Körpers. Das Arzneimittel sollte vorzugsweise in Kuren bei einer Einzeldosis von 1–1,5 μg/kg Körpergewicht täglich, vor Beginn der Chemostrahlentherapie über 5–10 Tage und begleitend im verlauf der Chemostrahlentherapie verabreicht werden. Wenn es notwendig ist, toxische Reaktionen zu entlasten, sollte das Arzneimittel 2–3 Wochen nach Beendigung der Chemostrahlentherapie verabreicht werden.
Es folgen spezifische Beispiele der Herstellung des Wirkprinzips und eine Beschreibung der biologischen und therapeutischen Eigenschaften der vorgeschlagenen Substanz.
Beispiel 1.
Herstellung des Wirkprinzips
Das Hexapeptid wird nach der Festphasensynthetisierung auf dem automatisierten Synthetisierer ”Beckman-990” synthetisiert.
Aminomethylpolymerase (1,8 g, 1 mmol) wird in Chloroform 30 Minuten quellen gelassen, gefolgt von der Zugabe von tert-Butoxycarbonyl-Gly-OCH₂C₆H₄CH₂COOH (0,65 g, 2 mmol) mit Hilfe von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCHC) (0,4 g, 2 μmol in 15 ml Chloroform über 2 Stunden). Nach dem Waschen mit Dimethylformamid wird das Polymer 30 Minuten mit 20 ml eines Gemisches behandelt, das Diisopropylethylamin:Essigsäureanhydrid 2:1 enthält. Nach dem Waschen mit Dimethylformamid und Chloroform wird das Polymer 20 Minuten mit 30 ml eines Gemisches behandelt, das aus Trifluoressigsäure:Chloroform 1:1 besteht, mit Chloroform gewaschen und mit einer 7%igen Lösung von Diisopropylethylamin in Dimethylformamid 10 Minuten neutralisiert und dann wird das Aminoacylpolymer mit Dimethylformamid gewaschen. Die Zugabe von tert-Butoxycarbonyl-aminosäure (BOC-Aminosäure) wird mit Hilfe eines symmetrischen Anhydriden der BOC-Aminosäure ausgeführt: 4 mmol BOC-Aminosäure werden in 5 ml Chloroform aufgelöst, auf 0°C abkühlen gelassen, gefolgt von der Zugabe einer 2-mmol-Lösung aus DCHC zu 5 ml Chloroform. Nach dem Rühren über 10 Minuten bei 0°C wird das Gemisch dem Peptidylpolymer zugegeben, 10 ml Dimethylformamid werden eingegossen und mit dem Peptidylpolymer 30 Minuten bei 28°C gerührt.
Nach der Zugabe der nächsten Aminosäure wird das Peptidylpolymer mit Dimethylformamid, Chloroform gewaschen, gefolgt von der Entfernung der schützenden BOC-Gruppe.
Entfernung der Dinitrofenylgruppe: 2 g des Peptidylpolymers werden 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur in 40 ml einer 20%igen Thiophenolösung in Dimethylformamid gerührt. Dann wird das Peptidylpolymer mit Chloroform gewaschen und vakuumgetrocknet.
Entfernung des Peptids vom Harz: 2 g Peptidylpolymer werden in das Reaktionsgefäß der Vorrichtung für eine Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff eingebracht, 1 g n-Cresol wird zugegeben, mit flüssigem Stickstoff gekühlt, und das Gefäß unter Vakuum gesetzt, gefolgt von der Zugabe von 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff, Einstellen der Temperatur des Reaktionsgefäßes auf – 20°C und Rühren des Polymers über 30 Minuten, wobei die Temperatur des Gemisches aufrechterhalten wird, das aus CCl₄ – festem CO₂ besteht, wonach das Reaktionsgefäß in ein Bad aus Eiswasser gestellt wird, dann dort stehen gelassen wird, während es weitere 30 Minuten gerührt wird. Danach wird wasserfreier Fluorwasserstoff auf der Wasserstrahlpumpe verdampft und das Polymer auf dem Filter mit Diethylester gewaschen. Das Peptid wird dann mit 20% Essigsäure extrahiert und gefriergetrocknet.
Entfernung der Trifluoroacetylgruppe. Das vom Harz entfernte Peptid wird mit 60 ml einer 1 M wässrigen Lösung aus Piperidin bei 0°C 2 Stunden verarbeitet. Das Reaktionsgemisch wird dann lyophilisiert und durch Gelfiltration auf der Sephadex G-25-Säule in 5% Essigsäure entsalzt.
Beispiel 2.
Wirkungsspezifität der vorgeschlagenen Substanz im Vergleich zum Prototyp
Untersuchung der Wirkung des Hexapeptids (vorgeschlagene Substanz) und von Cyclosporin A (Prototypsubstanz) auf die Wirkungsspezifität in Bezug auf die Transportproteine, die für eine MDR verantwortlich sind.
Die humanen Kehlkopfkrebszellen Hep-2 in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (in der Folge als DMEM bezeichnet) (Sigma) ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (Sigma) und 40 μg/ml Gentamycin (Sigma) wurden in einer Kulturplatte mit 96 Kavitäten, 0,1 ml pro Kavität, bei einer Konzentration von 50.000/ml gesät, gefolgt von der Zugabe der untersuchten Mittel und einer Inkubation über 72 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 0,02% Kristallviolettlösung (Sigma) in 20% Ethanol 10 Minuten gefärbt, gefolgt von dem Verwerfen der Färbungslösung, Waschen der Zellen mit Wasser und Zugabe einer 0,1% SDS-Lösung für die Extraktion des Färbemittels aus den Zellen. Die optische Dichte wurde bei 570 nm auf dem Multiscan Plus Spektrophotometer gemessen. Die Wirkung wurde durch die Formel: N_o/N_k = (D_o – D)/(D_k – D)100% bestimmt, wobei D_o, D_k, D optische Dichten in dem Experiment, der Kontrolle bzw. dem Hintergrund sind und N_o/N_k die Zellüberlebensrate ist: die Anzahl lebender Zellen in dem Experiment im Verhältnis zur Kontrolle.
R388-Zellen wurden in der Bauchhöhle der DBA2-Mäuse gezüchtet. Vincristin-resistente R388-Zellen wurden erhalten, indem sie in männlichen DBA2-Mäusen gezüchtet wurden, die 1 μg/g Vincristin (Gedeon Richter, Ungarn) ausgesetzt wurden. Vincristin wurde intraperitoneal 24 Stunden nach der Tumorinokulation (10⁸ Zellen pro Maus) verabreicht. Nach der Vermehrung wurden die Zellen sofort transinokuliert, gefolgt von einer erneuten Verabreichung von 1 μg/g Vincristin. Die Prozedur wurde sechsmal wiederholt. Der derart erhaltene Zellstamm wurde als R388VR (Vincristin-resistent) bezeichnet.
Alle Messungen der Fluoreszenz wurden auf dem Perkin-Elmer MF-44-Spektrophotometer unter kontinuierlichem Rühren bei einer Temperatur von 37°C vorgenommen. Die Erregungs- und Emissionswellenlängen für Calcein waren 493 bzw. 515 nm. Die Hep-2-Zellen (1–1,5 min) wurden in eine Schale eingebracht, vorläufig an eine Kunststoffplatte angeheftet, während die R388-Zellen (500.000) suspendiert platziert wurden. Bei der Bestimmung der Calceinbildung wurde Calcein AM der Schale zugegeben, die Rate der Calceinbildung in der Kontrollprobe wurde registriert, dann wurden die zu untersuchenden Mittel der Schale zugegeben, während die erhöhte Fluoreszenz weiter registriert wurde. Die Wirkung wurde durch das Ratenanstiegsverhältnis nach der Zugabe des Mittels bewertet. Bei der Untersuchung der Rate des Calceinausflusses aus den Zellen wurden letztgenannte vorläufig mit demselben Fluorochrom in Gegenwart von 1 μg/ml Cyclosporin A beladen, um ihr Auspumpen aus den Zellen zu hemmen, dann gewaschen und bis zur Messung auf Eis gelagert. Bei der Bestimmung des Calceinausflusses aus den suspendierten Zellen (R388VR), wurden 2 μM Co²⁺ der Schale zugegeben, um die Fluoreszenz von extrazellulärem Calcein abzuschrecken, und somit nur das Calcein in den Zellen zu registrieren. Zuerst bestimmten wir die Fluorochrom-Ausflussrate in der Kontrolle, dann gaben wir das zu untersuchende Mittel in die Schale und fuhren mit der Registrierung einer Abnahme von Calcein in den Zellen fort. Die Wirkung der Belastung wurde durch das Verhältnis der Ausflussraten in der Kontrolle und nach Zugabe der Mittel bewertet. Alle Wirkungen wurden mit jenen von Cyclosporin A verglichen.
Die Rate der Calceinbildung in der Schale mit Calcein AM, das ohne Co²⁺-Ionen zugegeben wurde, ermöglicht die Bestimmung der Aktivität der Transportproteine, Calcein AM aus den Zellen auszutreiben, anstatt jener der Proteine, die imstande sind, Calcein aus den Zellen zu transportieren (MRP), da in diesem Fall Gesamtcalcein registriert wird: sowohl intra- wie auch extrazelluläres.
Cyclosporin A, das ein vorherrschender Inhibitor von P-gp ist, erhöht die Calceinbildungsrate in der Schale, die die R388VR-Zellen enthält, effektiv, wobei MDR vorwiegend durch die Superexpression von P-gp vorbestimmt ist. Die Anstiegsrate der Calceinbildung in den R388VR-Zellen mit Cyclosporin A betrug 7 ± 0,4 bei seiner Konzentration von 0,8 μM und mehr. Das Hexapeptid wirkt nicht auf die Calceinbildungsrate in der Schale mit den R388VR-Zellen bis zu einer Konzentration von 1,2 μM. In Gegenwart von Co jedoch (Abschreckung von extrazellulärem Calcein) scheint das Hexapeptid bei einer Konzentration von 12 μM die Calceinbildungsrate in diesen Zellen zu verdoppeln (1). Die Ergebnisse zeigten, dass das Hexapeptid keine Wirkung auf die Aktivität von P-gp hatte (Auspumpen von Calcein AM in den R388VR-Zellen), aber MRP hemmte, das Calcein aus den Zellen transportiert. Tatsächlich zeigte die Calcein-Exkretionsrate aus den vorläufig Calcein-beladenen R388VR-Zellen, dass das Hexapeptid MRP effektiv zu hemmen schien: die Calcein-Exkretionsrate nahm um das 1,5-Fache bei der Peptidkonzentration von nur 1,2 nM ab, wobei das Rateninhibierungssverhältnis 2,6 bei einer Konzentration von 120 nM betrug (2).
Im Gegensatz dazu wies Cyclosporin A eine extrem niedere Wirksamkeit in der Unterdrückung von MRP auf, wobei das Verhältnis gleich 1,3 ± 0,1 bei einer Konzentration von 0,8 μM war.
Die erhaltenen Daten zeigen, dass das Hexapeptid (die vorgeschlagene Substanz) nicht auf die Aktivität von P-gp wirkt (Auspumpen von Calcein AM in R388VR-Zellen), aber das MRP hemmt, das in kleinen Mengen auch in den R388VR-Zellen vorhanden ist und Calcein aus der Zelle transportiert. Ähnlich Schlussfolgerungen ergeben sich aus den Befunden, die bei einem anderen Modell erhalten wurden den Hep-2-Zellen. Die Multiarzneimittelresistenzproteine in den Hep-2-Zellen, anders als die R388VR-Zellen, tragen massiv zu der Entwicklung einer MDR bei. Daher hemmt das Hexapeptid in der Hep-2-Zelle eine MDR viel wirksamer als in den R388VR-Zellen. Somit erhöht das Hexapeptid bei einer Konzentration von nur 1,2 nM die Rate der Calceinbildung in Zellen (mit gleichzeitig vorhandenen Co²⁺-Ionen) um das Zweifache und wenn die Konzentration des Peptids auf 120 mM erhöht wird, beträgt das Calceinbildungsratenerhöhungsverhältnis 2,6 (2).
Somit verleiht das Hexapeptid (die vorgeschlagene Substanz), anders als Cyclosporin A, eine ausgesprochene spezifische Wirkung in Bezug auf die Hemmung der Transportproteine einer Multiarzneimittelresistenz (MRPs).
Beispiel 3.
Untersuchung der Wirkung des Hexapeptids und der Prototypsubstanz (Cyclosporin A) auf die Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz von Hep-2-Tumorzellen
Die Aktivität der mit der Multiarzneimittelresistenz in Zusammenhang stehenden Transportproteine in Zellen wurde durch die Rate der Austreibung der Rhodamin 123 (Rh123) (”ICN”, USA) aus Zellen bestimmt. Das Verhältnis der Rh123-Ausflussraten bei Gesundheit und vollständiger Hemmung des aktiven Transports minus eins, d. h., (R – 1)_max, ist bekanntlich gleich dem Verhältnis des aktiven und passiven Transports und charakterisiert folglich die Aktivität von in Zellen enthaltenen Proteinen, die für eine Multiarzneimittelresistenz verantwortlich sind. Hep-2-Zellen wurden in der Menge von 1–1,5 min in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Kälberserum mit Gentamycin auf den Platten (50 × 9 × 2 mm groß) ausgesät, die sich in Schalen mit 6 cm Durchmesser befanden, wobei das Mediumvolumen 8 ml betrug, unmittelbar gefolgt von einer Inkubation in einem CO₂-Inkubator. Nach 24 Stunden Inkubation in CO₂ bei 37°C, wurden die Zellen in RPMI 1640-Medium gewaschen und mit 0,5 μg/ml Rh123 in Gegenwart des Inhibitors der Transportproteine, Cyclosporin A, 3 μg/ml, in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum 60 min bei 37°C beladen. Nach der Inkubation wurden die Zellen anschließend dreimal (jeweils 10 min) von dem Färbungsmittel mit kalter (2°C) Kochsalzlösung, ergänzt mit 1% fötalem Kälberserum, gewaschen. Nach dem Waschen und bis zu dem Moment der Messung wurden die Zellen enthaltenden Platten in Hanks-Lösung mit 0,5% fötalem Kälberserum, auf Eis gestellt gelagert. Die gewaschene Platte mit Zellen wurde in eine Küvette des MF44 Perkin-Elmer-Spektrophotometers mit Hanks-Lösung und 0,5% fötalem Kälberserum, Volumen 3 ml, bei 37°C gestellt und zur Bestimmung einer Erhöhung in der Menge an Rh123 im Medium mit kontinuierlichem Schütteln verwendet. Die Erregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 488 bzw. 520 nm. Am Ende des Experiments wurden zur Bestimmung der maximalen Menge von Rh123 in den Zellen, letztgenannte durch Zugabe von 0,02% Digitonin (”Sigma”, USA) zu der Küvette zerstört.
Während der Untersuchung der Wirkung der Inhibitoren auf die Freisetzung von Rh123, wurde der Küvette nach mehreren Minuten der normalen Exkretion des Färbemittels der Inhibitor in der erforderlichen Konzentration zugegeben. Die Bestimmung der Kontrolle und gehemmten Konstanten von Rhodamin-Exkretionsraten auf der Platte verringerte den Bestimmungsfehler ihres Verhältnisses, was notwendig ist, um den R-Wert zu erhalten. 3 zeigt die Kinetik des Rh123-Anstiegs im Kontrollmedium (1), nach Zugabe von Cyclosporin A (2) und Digitonin (3). Die Gesamtmenge an Rhodamin in den Zellen wurde durch den Unterschied der Fluoreszenzwerte nach Zugabe von Digitonin und vor Zugabe von Zellen zu der Küvette bestimmt. Die relative Menge an Rh123 in den Zellen (N) wurde nach der folgenden Formel bestimmt: N = 1 – {I_t – I₀/I_max – I₀}, wobei I_t, I₀, I_max die Werte der Fluoreszenz von Rh123 im Medium zu den Zeitpunkten t, 0 bzw. der Spitzenfluoreszenz nach Zugabe von Digitonin sind. Wie aus 4 hervorgeht, nimmt die Menge an Rh123 in den Zellen in der Kontrolle und nach Zugabe des Inhibitors exponential ab, da auf einer semilogarithmischen Skala diese Kinetiken durch gerade Linien beschrieben sind. In dem gegebenen Beispiel senkte Cyclosporin A bei einer Dosis von 1 μg/ml die Rhodamin-123-Exkretionsratenkontante um das 2,8-Fache: R = 2,8.
Das oben beschriebene Verfahren wurde zur Bestimmung der Wirkung des vorgeschlagenen Hexapeptids im Vergleich zu jener des bekannten MDR-Inhibitors Cyclosporin A auf den Ausfluss von Rh123 aus der Hep-2-Zelle verwendet. Die Wirkung jeder Konzentration der Mittel auf die Rh123-Exkretion wurde in mehreren Experimenten bestimmt. 5 zeigt die Mittelwerte von R mit Standardabweichungen für die Konzentrationen, wobei mehr als 3 Replikationen vorhanden waren.
Wie aus 5 hervorgeht, hemmt das Hexapeptid (HP) die Rh123-Exkretion bei einer optimalen Konzentration von 1 ng/ml maximal. Der R-Wert für das Hexapeptid ist gleich 3,2. Ein ähnlicher R-Wert für Cyclosporin A wird bei einer Konzentration erreicht, die mehr als dreitausend Mal höher ist als jene des vorgeschlagenen Hexapeptids.
Somit garantiert die vorgeschlagene Substanz – Hexapeptid – die Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz mehr als dreitausend Mal effektiver im Vergleich zu der Prototypsubstanz, d. h., Cyclosporin A.
Beispiel 4.
Onkologische Sicherheit und Harmlosigkeit des vorgeschlagenen Hexapeptids
Humane Hep-2-Kehlkopfkrebszellen in DMEM-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 40 μg/ml Gentamycin, wurden in 2-ml Penicillin enthaltenden Fläschchen inokuliert, 200.000 pro Fläschchen. Das Hexapeptid wurde bei einer Dosis von 1 μg/ml 3 Stunden nach der Zellinokulation zugegeben (wenn diese bereits an dem Glas hafteten) und im Medium über die gesamte Inkubationsperiode belassen. Drei Tage nach der Inokulation wurden die Zellen mit Trypsin vom Glas gelöst, gefolgt von der Berechnung der Anzahl lebender Zellen: ungefärbt mit einer 0,04%igen Lösung Trypanblau.
Somit führt Hexapeptid zu keiner Stimulierung des Tumorzellwachstums. Im Gegenteil, es erhöht die Empfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber dem zytostatischen Präparat Arsenat und hemmt das Überleben der Hep-2-Zellen (6). 7 zeigt einen Befund bezüglich der Wirkung des Hexapeptids auf das Hep-2-Zellwachstums.
Es ist erkennbar, dass das Hexapeptid bei einer Konzentration von 1 μg/ml im Prinzip keinen Einfluss auf das Wachstum der Hep-2-Tumorzellen hat (7).
Somit zeigen die erhaltenen Befunde, dass das Hexapeptid (die vorgeschlagene Substanz) die Wirkung des zytostatischen Mittels verstärkt und in Bezug auf eine Stimulierung eines Tumorwachstums sicher ist.
Beispiel 5.
Weibliche Patientin R., 37 Jahre alt. Klinische Diagnose: Stufe III Zervixkarzinom (T3NX-1M0). Die Untersuchung der Patientin beinhaltete eine klinische und laboratorische Bewertung sowohl bei der Aufnahme als auch während der Behandlung. Ihr allgemeiner Zustand war von mäßiger Schwere. Vor dem Hintergrund der im Prinzip normalen Parameter des oxidativen-antioxidativen Systems zeigte sich, dass die Patientin an einer akuten Immundepression litt, wie anhand des Parameters des Prozentgehalts der Hauptsubpopulationen von T-Lymphozyten beurteilt wurde. Der Prozentsatz an CD3-, CD4-, CD8-, CD16-positiven Zellen war relativ zu den durchschnittlichen statistischen Normalwerten um das Zweifache verringert. Die Frau hatte vor der antineoplastischen Behandlung eine Kur einer fünffachen Verabreichung des Hexapeptids in der Form von 1 ml einer 0,005%igen Lösung subkutan täglich über 5 Tage erhalten. Die Chemostrahlentherapie wurde nach folgendem Schema ausgeführt: 500 mg 5-Fluoruracil (Gesamtdosis 2.500 mg). Während des gesamten Verlaufs der Chemostrahlentherapie erhielt die Frau 1 ml einer 0,005%igen Lösung des Hexapeptids (Biopoetin) fünfmal täglich. Zwei Tage nach dem Absetzen von 5-Fluoruracil wurde die Patienten einer Fernbestrahlung bei einer Einzeldosis von 4 Gy vor dem Hintergrund einer intravenösen Verabreichung von 30 mg Cysplastin über 3 Tage unterzogen (die Gesamtdosis Cysplastin betrug 90 mg). Dann wurde die Strahlentherapie in dem Modus einer täglichen mehrteiligen Dosis fortgesetzt. Die Bestrahlung wurde bis zu einer fokalen Dosis von 20 Gy auf die Fläche des primären Fokus und Zonen einer regionalen metastatischen Ausbreitung fortgesetzt, gefolgt von einer zusätzlichen intrakavitären Gamma-Therapie (10 Fraktionen, jeweils 5 Gy) und die Fernbestrahlung wurde an den Zonen einer parametrialen metastatischen Ausbreitung fortgesetzt, bis die Gesamtdosis 44 Gy betrug. Es wurden keine ausgeprägten Nebenreaktionen beobachtet, wodurch es möglich wurde, eine Diskontinuität des Verlaufs einer Chemostrahlentherapie aufrechtzuerhalten. Es wurden keine Ereignisse einer MDR-Entwicklung beobachtet. Gleichzeitig zeigen die durchschnittlichen statistischen Werte einer Chemostrahlentherapie von Patienten, die an einem Cervixkarzinom der Stufe III leiden, bei 33–34% die Entwicklung spezifischer Reaktionen, die eine langfristige Unterbrechung der Therapie erforderten, bei 78–87% die Entwicklung einer Epithelitis, bei 55–58% einer inselförmigen Epithelitis, und bei 15–20% einer narbigen Epithelitis, die 4–5 Monate Behandlung erfordert. Es ist wichtig, dass sich die Werte einer Immunität und das Gesamtblutbild nach einer Chemostrahlentherapie bei der Frau im Prinzip nicht änderten, während in der Kontrollgruppe, die keine Hexapeptidlösung erhalten hatte, eine weitere Abnahme in den oben genannten Werten zu beobachten war. Die durchgeführte Behandlung führte zu einer vollständigen Resorption des Tumors.
Somit scheint das vorgeschlagene Mittel Manifestationen einer Toxikose, die Entwicklung von Nebenwirkungen und Strahlungsreaktionen auf Chemostrahlentherapie zu verringern.
Beispiel 6.

Patient N., 52 Jahre.

Klinische Diagnose: Stufe III Speiseröhrenkrebs (T3-4N0-2MOP3). Bei der Aufnahme war der allgemeine Zustand des Patienten von mäßiger Schwere. Die Laborwerte des Gesamtblutbildes ohne ausgeprägte Veränderungen. Festgestellt wurde ein beachtliches Ungleichgewicht der Werte des oxidativen-antioxidativen Systems vor dem Hintergrund einer Immunsuppression mäßigen Grades. Der Zustand des oxidativen-antioxidativen Systems bei den Patienten wurde durch die Intensität der Lipidperoxidation durch Messung der Blutserumkonzentration von Malonsäuredialdehyd (MDA, μmol/L) und endogenen Antioxidantien: Lactoferrin (LF, mg/L), Caeruloplasmin (CP, herkömmliche Einheiten), und dem Antioxidansenzym Catalase (CAT, herkömmliche Einheiten) bewertet. Die Analyse des Prozentgehalts der Hauptsubpopulationen von T-Lymphozyten wurde an Oberflächenrezeptoren von CD3 (T-Lymphozyten), CD4 (T-Helfer/Inducer), CD8 (T-Suppressoren/zytotoxische Lymphozyten), CD16 (natürliche Killerzellen), CD25 (aktivierte Lymphozyten, die den Rezeptor für Interleukin-2 exprimieren), CD72 (8-Lymphozyten) durchgeführt. Bei der Aufnahme in der Chemotherapieabteilung zeigte sich, dass der Patient ein wesentliches Ungleichgewicht im oxidativen-antioxidativen System hatte: MDA – 3,5 (Norm 3,0 ± 0,1), CAT – 450 (Norm 576 ± 48), CP – 0,59 (Norm 0,52 ± 0,04), LF – 3,8 (Norm 1,0 ± 0,4). Gleichzeitig waren die Werte der lymphazytären Links im Prinzip innerhalb der normalen Werte. Da CP und LF Proteine der akuten Phase einer Entzündung sind, spiegelte ein Anstieg im Blutserum das Vorliegen eines entzündlichen Prozesses wider, der die Entwicklung von Speiseröhrenkrebs begleitete. Vor der Chemostrahlentherapie erhielt der Patient täglich Hexapeptid bei einer Einzeldosis von 1 ml der 0,1%igen Lösung fünfmal täglich über 5 Tage intramuskulär verabreicht. Eine umfangreiche Chemostrahlentherapie wurde nach dem folgenden Schema ausgeführt: 750 mg 5-Fluoruracil (5-FU) wurden intravenös über 5 Tage (Gesamtdosis 3.750 mg) verabreicht, zwei Tage nach dem Ende der Verabreichung von 5-FU wurde der Patient nach dem Schema einer dynamischen Fraktionierung der Dosis bestrahlt, mit einer Einzeldosis von 4 Gy vor dem Hintergrund einer intravenösen Verabreichung von Cysplastin bei einer Dosis von 30 mg über 3 Tage (90 mg Gesamtdosis Cysplastin, 12 Gy gesamte fokale Dosis). Während der gesamten Periode der Chemostrahlentherapie erhielt der Patient Hexapeptid bei einer Einzeldosis von 100 μg zweimal täglich (am Morgen und am Abend). Beginnend mit Tag 11 wurde die Strahlentherapie in dem Modus der klassischen fraktionierten Dosis fortgesetzt, wobei die Einzeldosis gleich 2 Gy war (40 Gy gesamte fokale Dosis). Es wurden keine ausgeprägten Neben- oder Post-Strahlungsreaktionen beobachtet, was für eine Fortsetzung der Chemostrahlentherapiekuren sorgte. Während des gesamten Verlaufs der Chemostrahlentherapie änderten sich die Werte des natürlichen zellulären und T-lymphozytären Immunitäts-Links, die Erzeugung von Proteinen der akuten Entzündungsphase nicht wesentlich. Der Patient zeigte verbesserte Werte für das oxidative-antioxidative System und eine Abnahme in der Malinsäuredialdehyd-Konzentration auf 3,2 μmol/L. Es wurden keine Symptome einer MDR beobachtet. Die durchgeführte Behandlung bei dem Patienten mit einem Speiseröhrenkrebs der Stufe III führte zu einer beachtlichen Verbesserung des Allgemeinzustandes, einer Verringerung von Toxikose-Ereignissen, einer Behebung von Nebenwirkungen und Strahlenreaktionen auf die Chemostrahlentherapie und schließlich zu einer vollständigen Resorption des Tumors.
Somit verringerte das vorgeschlagene Mittel Toxikose-Ereignisse, die Entwicklung von Nebenwirkungen und Reaktionen auf die Chemostrahlentherapie. Die durchgeführte Behandlung führte zu einer vollständigen Tumorresorption.
Bei einer Nachuntersuchung nach 12 Monaten des Patienten, der sich der Behandlungskur mit dem vorgeschlagenen Mittel unterzogen hatte, wurde kein Wiederauftreten der Krankheit festgestellt.
Beispiel 7.

Weibliche Patientin P., 54 Jahre alt.

Die Krankheit manifestierte sich in retrosternalem Schmerz, Schwäche, Gewichtsverlust. Eine Untersuchung durch Endoskopie, Röntgenkontrastuntersuchung zeigte einen Krebs der mittleren und unteren sternalen ösophagealen Abschnitte von etwa 10 cm Länge mit metastatischem Befall regionaler Lymphknoten. Die Histologie der Tumorbiopsie zeigte squamöse Karzinome. Vor der Chemostrahlentherapie erhielt die Patientin das Hexapeptid in Form eines Zäpfchens bei einer Dosis von 5 mg fünfmal täglich über 5 Tage.
Die erste Stufe der Behandlung kombinierter Modalität bestand aus zwei Polychemotherapiekuren.
Während der gesamten Periode der Chemostrahlentherapie erhielt die Patientin eine Behandlung mit dem vorgeschlagenen Mittel in der Form rektaler Zäpfchen von 5 μg zweimal täglich (am Morgen und am Abend). Es wurden keine deutlich ausgeprägten Manifestationen einer Toxikose während der Polychemotherapie beobachtet, mit nur mäßiger Neutropenie, die von einer Abnahme in den T-Zell-Immunitätswerten, sporadischer Diarrhö, Übelkeit und Schwindel begleitet war.
Bei den Kontrolluntersuchungen war kein Speiseröhrentumor festzustellen, mit wesentlich verringerter Größe der regionalen Lymphknoten. Die Analyse des histologischen und Biopsiematerials konnte das Vorhandensein von Tumorzellen nicht bestätigen. Die histologische Untersuchung des biologischen Materials einer subtotalen Speiseröhrenresektion ermöglichte das Aufzeigen des gesamten kurativen Pathomorphismus des Tumors. Es wurden keine Metastasen in Lymphknoten festgestellt.
Beispiel 8.
Weibliche Patientin P., geboren 1939, wurde mit folgender Diagnose aufgenommen: Brustkrebs T4cN2M0 mit kutaner Ulzeration der Brustdrüse.
Aus der Anamnese: Die Patientin war etwa 2 Jahre zuvor erkrankt, als sie das erste Mal eine Tumorbildung in ihrer linken Brust entdeckte, die allmählich an Größe zunahm.
Bei der Aufnahme: Beschwerden wegen des Vorhandenseins eines Tumors in der linken Brust mit blutender Ulzeration, allgemeine Schwäche, Kopfschmerzen, Übelkeit, Schmerz in der linken Brust.
Befunde bei der Untersuchung:
Die linke Brustdrüse zeigte sichtbar an der Grenze der oberen Quadranten eine knotige Tumorbildung in der Form eines Karbunkels mit einer Ulzeration in der Mitte, begleitet von einem blutigen Ausfluss und üblem Geruch. Die Mammogramme der linken Brust zeigten einen tumorösen Knoten von mehr als 10 cm Durchmesser mit Hautinfiltration und Zerstörung im Zentrum (Ulcus).
Mammoszintigraphie: Foci der Hyperfixierung von ⁹⁹Tc, mit Maßen von etwa 10 cm Durchmesser in der linken Brust und etwa 6 cm Durchmesser in der linken Achselhöhlenregion. Die Befunde der Ultraschalluntersuchung zeigten eine runde globuläre Formation mit hypoechogenen Konturen mit einem Durchmesser von 92 mm an der Grenze der oberen Quadranten der linken Brust. Histologisch: Tumorzellen eines schlecht differenzierten Adenokarzinoms. Schlussfolgerung: Brustkrebs mit Zerstörung des Tumors, eine Metastase zu Achselhöhlenlymphknoten an der linken Seite.
Auf die Fläche der linken Brust von zwei tangentialen gegenüber liegenden Feldern und mit dem dargestellten Feld auf den Zonen des regionalen Lymphausflusses an der linken Seite, wurde mit einer Strahlentherapie mittels Linearbeschleuniger (LU-20-SL mit der Verlangsamungs-Strahlenenergie von 6 MeV) in dem Modus einer durchschnittlichen Dosisfraktionierung begonnen, bei 3 Gy täglich, fünfmal pro Woche auf die Fläche des Tumors bis zu der gesamten fokalen Dosis (TFD) von 45 Gy entsprechend dem Modus der herkömmlichen Fraktionierung, bestehend aus 2 Gy pro Tag, mit TFD 60 Gy, und auf die Zonen eines regionalen Lymphausflusses an der linken Seite (supraklavikuläre, subklavikuläre, axillare und parasternale Stellen) bei einer Einzeldosis von 3 Gy bis zu der TFD 33–36 Gy entsprechend 44–48 Gy der herkömmlichen Fraktionierung.
Der Zustand der Patientin nach der Bestrahlungskur war zufriedenstellend, wobei sich die Tumorulzeration in der Narbenbildungsphase befand und im Prinzip keinen Ausfluss zeigte. Zwei Wochen später wurde mit der Polychemotherapie nach dem CMF-Schema begonnen, das 4 Wochen lang einmal pro Woche ausgeführt wurde. An 5 Tagen vor Beginn der Chemotherapie erhielt die Frau das Hexapeptid täglich in der Form eines intranasalen dosierten Sprays fünfmal wöchentlich bei einer Einzeldosis von 100 μg. Das CMF-Schema enthielt eine intravenöse Tropfverabreichung von 1 g 5-Fluoruracil und 40 mg Methotrexat und eine intramuskuläre Verabreichung von 1 g Cyclophosphan. Während der Polychemotherapie erhielt die Patientin das Hexapeptid in der Form eines intranasalen dosierten Sprays mit einer Einzeldosis von 100 μg. Die Patientin vertrug die Chemostrahlentherapie zufriedenstellend: WBCs – 4,5 × 10⁹, Blutplättchen – 200 × 10³/L. Die Patientin wurde aus dem Klinikum in einem zufriedenstellenden Zustand entlassen.
Wiederholung der CMF-Kur: Die Patientin erhielt 40 mg Methotrexat und 1 g 5-Fluoruracil intravenös und 1 g Cyclophosphan intramuskulär. Der Zustand nach der Polychemotherapie war zufriedenstellend. Es bildete sich eine Cicatrix an der Stelle der vorherigen Brustulzeration. Es wurden keine regionalen Lymphknoten festgestellt, die Brust war weich anzugreifen, ohne frische Infiltrate. Auf den Mammogrammen hatte der Tumorknoten im Vergleich zu dem Mammographiebefund, der zu Beginn der Behandlung erhalten worden war, auf einen Durchmesser von 5 mm abgenommen. Dann wurde anschließend eine Polychemotherapiekur nach demselben Schema und in denselben Dosen durchgeführt. An 5 Tagen vor Beginn der Chemotherapie erhielt die Patientin täglich Hexapeptid in der Form eines intranasalen dosierten Sprays fünfmal täglich bei einer Einzeldosis von 100 μg. Während der Polychemotherapie erhielt die Patientin täglich Hexapeptid in der Form eines intranasalen dosierten Sprays fünfmal täglich bei einer Einzeldosis 100 μg.
Die Patientin wurde entlassen und vom örtlichen Onkologen nachuntersucht, dann wieder im Klinikum aufgenommen, wo sie sich einer vierten Polychemotherapiekur unterzog. Ihr Zustand war zufriedenstellend, mit einer geschmeidigen Narbe an der Ulcusstelle, ohne Infiltrationen, es wurden kein Achselhöhlen- und Schlüsselbeinlymphknoten festgestellt und die rechte Brustdüse war unverändert. Die Mammogramme zeigten, dass der Tumorknoten in der Form von fibrösem Gewebe auf 3,8 cm im Vergleich zu dem letzten Mammographiebefund abgenommen hatte. Bei dem klinischen Blutbild war nichts besonderes festzustellen.
Eine 2-wöchige chemotherapeutische Kur wurde nach dem CMF-Schema begonnen. An 5 Tagen vor Beginn der Chemotherapie erhielt die Patientin täglich Hexapeptid in der Form eines intranasalen dosierten Sprays fünfmal täglich bei einer Einzeldosis von 100 μg. Während der Polychemotherapie erhielt die Patientin täglich Hexapeptid in der Form eines intranasalen dosierten Sprays fünfmal täglich bei einer Einzeldosis von 100 μg. Die Patientin vertrug die Chemostrahlentherapie zufriedenstellend: WBCs – 4,5 × 10⁹, Blutplättchen – 200 × 10³/L.
Die klinische und röntgenologische Studie (körperliche Untersuchung, Mammographie, Ultraschalluntersuchung der Brustdrüsen und der Bauchhöhle, Röntgenographie und Tomographie der Lungen und des Mediastinums, Osteoszintigraphie, klinisches und biochemisches Blutbild und Harnanalyse) zeigten keine Befunde, die entweder ein Wiederauftreten eines Brusttumors oder von Metastasen nahelegten.
Die fünfte zweiwöchige Polychemotherapiekur wurde nach dem CMF-Schema durchgeführt, das von der Patientin gut vertragen wurde. Es wurde keine Entwicklung einer MDR festgestellt. An 5 Tagen vor Beginn der Chemotherapie erhielt die Patientin täglich Hexapeptid in der Form eines intranasalen dosierten Sprays fünfmal täglich bei einer Einzeldosis von 50 μg. Während der Polychemotherapie erhielt die Patientin täglich Hexapeptid in der Form eines intranasalen dosierten Sprays fünfmal täglich bei einer Einzeldosis von 50 μg. Der Zustand der Patientin war zufriedenstellend. Die klinische und röntgenologische Untersuchung lieferte keinen Hinweis für ein progressives Tumorwachstum. Es wurde noch einmal eine 2-wöchige Polychemotherapie nach dem CMF-Schema durchgeführt, die ebenso zufriedenstellend von der Patientin vertragen wurde. Sie wurde dann entlassen und vom örtlichen Onkologen nachuntersucht. Die Nachuntersuchung (15 Monate nach Beginn der Behandlung) zeigte keine Anzeichen eines Wiederauftretens der Krankheit.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

RU 2157235 [0009]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Sandar V., Fojo T., Bates S. E., Drug Res. Aktualisierungen 1998. Band 1, 190–200 [0007]
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Russisches Arzneimittelregister, Band 16, S. 983–984, 2008 [0010]
Legrand O., Simonin G., Perrot J. Y. Blood. 1998. Band 91. Nr. 12. 4480–4488 [0011]

Claims

Therapeutisches Mittel zur Überwindung einer Multiarzneimittelresistenz, umfassend ein Peptid und einen Zielzusatzstoff, dadurch gekennzeichnet, dass es als Peptid ein Hexapeptid mit der folgenden Strukturformel enthält: Lysyl-Histidyl-Glycyl-Lysyl-Histidyl-Glycin.
Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1, wobei es in der Form einer Lösung für subkutane und intramuskuläre Injektionen hergestellt wird und eine Aminoessigsäure als Zielzusatzstoff enthält.
Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1, wobei es in der Form eines Sprays hergestellt ist, das für eine dosierte Anwendung bestimmt ist und Aminoessigsäure und Benzalkoniumchlorid als Zielzusatzstoffe enthält.
Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1, wobei es in der Form eines Zäpfchens hergestellt ist und als Zielzusatzstoffe Aminoessigsäure, Tween 80 (Polysorbate 80), Wasser für Injektionszwecke und Hartfett enthält.