TW201436797A - 赤靈酸s用於製造癌症治療藥物的新穎用途 - Google Patents
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Abstract
本文揭示一種小分子-赤靈酸S(ganodermic acid S,GMAS)的新穎用途。此GMAS是潛在可用來製造一種能治療患者身上之癌症(包括具抗藥性或轉移性癌症)的醫藥品或藥學組合物的先導化合物。
Description
本揭示內容是有關於一單離自靈芝(Ganoderma lucidum)的小分子化合物-赤靈酸S(ganodermic acid 5,GMAS)的新穎用途,特別是以其作為潛在可用來製造癌症治療藥物的醫藥品或藥學組合物的先導化合物。
長久以來,在東南亞地區,食用性真菌都被當作營養補充品或健康食品來使用,其中又以靈芝(Ganoderma lucidum)為大宗,且因其具有醫療效果也被當作藥材使用超過千年之久。自靈芝中分離出來的活性成分大致包括靈芝三萜類(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides)、核苷(nucleic acids)、多肽類(polypeptides)、和植物固醇類(phytosterols)等等。在這些活性成分中,又以靈芝三萜類最重要,因其具有藥學活性,包括抑制膽固醇合成、抗癌、抗高血壓等等。靈芝三萜類包含各式靈芝酸(ganoderic acids,GAs)、赤靈酸(ganodermic acids,GMAs)、靈芝醇(ganoderic alcohol)、靈芝酮(ganoderic ketone)、靈芝醛(ganoderic aldehyde)等化合物。在靈芝酸的相關研究中發現,靈芝酸具有可殺死癌細胞的細胞毒性和抑制其擴增的效果。舉例來說,已知靈芝酸D(ganodermic acid D,GAD)可防止人類子宮
頸癌細胞(即,Hela細胞)增生(Yue et al.,Mol Cell Proteomics(2008)7:949-961);靈芝酸A和H(ganodermic acids A and H;簡稱GAA及GAH)可抑制乳癌細胞生長或防止其侵犯其他組織(Jiang et al.,Int J Mol Med(2008)21:577-584);靈芝酸X(ganodermic acid X,GAX)可抑制拓墣酶活性並能誘使肝癌細胞進入細胞凋亡程序(L et al.,Life Sci.(2005)77,252-265);靈芝酸M除了可有效地抑制癌細胞生長外,還可抑制肺癌細胞的遷移(Wang et al.,Int Immunopharmacol(2007)7:864-870)。但是,目前除了已知GMAS可誘發血小板聚集(Wang et al.,Biochim.Biophys.Acta.(1989)986,151-160)、抑制血小板功能(Wang et al.,Biochem.J.(1991)277(Pt 1),189-197)和抑制由血栓素A2(Su et al.,Biochem.Pharmacol.(1999)58,587-595;Su et al.,Biochim.Biophys.Acta.(1999b)1437,223-234)或前列腺素El(Su et al.,Thromb.Res.(1999c)99,135-145)在血小板中所誘發的細胞反應外,僅有少數研究曾探討過赤靈酸S(ganodermic acid S,GMAS)本身的生理活性或用途。
本案發明人意外地發現,GMAS除了文獻中已報導過的抑制血小板聚集或抑制由血栓素A2或前列腺素El在血小板內引發的訊遞反應外,還可抑制特定種類的癌細胞,包括具抗藥性和/或轉移性的癌細胞,使其不致增生,因此,可做為能治療或預防癌症之藥物的先導化合物。
本揭示內容至少部分係基於發現自靈芝分離
出來的赤靈酸S(GMAS)具有可延緩癌細胞生長或遷移的特性而來。上述發現暗示本揭示內容中的GMAS可作為能治療或預防癌症(包括對藥物具有抗性的癌症或是具轉移性的癌症)之藥物的先導化合物。
因此,本揭示內容之第一目的是關於一種以GMAS來製造一種可抑制癌細胞的醫藥品或藥學組合物的新穎用途。
因此,本發明目的之一實施方式是提供一種可治療或預防癌症的醫藥品或藥學組合物。此醫藥品或藥學組合物包含一治療有效量之GMAS或其藥學上可接受的鹽類,以及一藥學上可接受的佐劑。適合以本發明之醫藥品或藥學組合物進行治療的癌症可以是直腸癌、肝癌、乳癌、或肺癌。在一較佳實施例中,上述的肺癌對吉非替尼(geftinib,以此為活性成分之抗癌藥物的商品名為艾瑞莎膜衣錠)。在另一實例中,該直腸癌是指具有轉移性的直腸癌。在又一實例中,該肺癌是指具有轉移性的肺癌。
若以所述醫藥品或藥學組合物總重量為基準,本發明化合物-GMAS,約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
在某些實施方式中,該醫藥品或藥學組合物更包括另一種已知可改善該癌症治療效果的藥物。這類藥物的實例包括,但不限於,抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、抗生素、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物、細胞激素、顆粒細胞株刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、抗嘔吐藥物以及其他類似物。
本揭示內容之第二目的是關於在活體外,以GMAS來抑制一癌細胞生長的方法。所述方法包含在活體外使該癌細胞接觸一足夠量之GMAS或其藥學上可接受的鹽類。該足夠量之GMAS介於約1 μM至約50 μM間;較佳是介於約5 μM至約45 μM間;更佳是介於約10 μM至約40 μM間。在一實例中,對直腸癌和肺癌細胞來說,該GMAS之量最佳是約8 μM。在另一實例中,對肝癌和乳癌細胞來說,該GMAS之量最佳是約20μM。
本揭示內容之第三目的是提供一種治療癌症的方法。所揭示方法包括對需要治療的個體施用一治療有效量之GMAS或其藥學上可接受的鹽類。適合以上述本發明之醫藥品或藥學組合物進行治療的癌症可以是直腸癌、肝癌、乳癌、或肺癌。在一較佳實施例中,上述的肺癌對吉非替尼具有抗藥性。在另一實例中,該直腸癌是指具有轉移性的直腸癌。在又一實例中,該肺癌是指具有轉移性的肺癌。該個體可以是哺乳動物,較佳是人類。。
透過以下的詳細說明與附隨之申請專利範圍
將可更了解本揭示內容的這些及其他特徵。需知以上的概述及以下的詳細說明僅為例示,用來闡述本揭示內容,而非用以限制本揭示內容之範疇。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:第1圖繪示出依據本發明一實施方式,不同劑量的GMAS對(A)人類肺癌細胞株A549,(B)人類直腸癌細胞株HCT-116,(C)人類肝癌細胞株Huh7,及(D)人類乳癌細胞株MDA-MB-231之細胞活性的影響;第2A圖繪示出依據本發明一實施方式,不同劑量的吉非替尼對人類非小細胞肺癌細胞株PC-9或對吉非替尼具有抗性的人類非小細胞肺癌細胞株PC9-IR之細胞活性的影響;第2B圖繪示出依據本發明一實施方式,不同劑量的GMAS對PC-9或PC9-IR細胞株之細胞活性的影響;第3圖繪示出依據本發明一實施方式,以傷口癒合試驗測量25或50 μM GMAS對HCT-116細胞之傷口癒合效果,其中(A)為傷口癒合試驗期間於不同時間下所拍攝的照片,(B)為傷口癒合試驗的定量結果,以不同時間下細胞之相對爬行面積來表示各細胞的遷移力;和第4圖繪示出依據本發明一實施方式,以傷口癒合試驗測量5或0 μM GMAS對PC-9細胞之傷口癒合
效果,其中(A)為傷口癒合試驗期間於不同時間下所拍攝的照片,(B)為傷口癒合試驗的定量結果,以不同時間下細胞之相對爬行面積來表示各細胞的遷移力。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備,下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述;但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而,亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
以下為本說明書中所用特定名詞的說明:在本文中,「治療(treatment or treating)」一詞包括可導致欲求之藥學和/或生理效果的防止性(即,預防性)、治癒性或緩和性處置。該效果較佳是指醫療上可部分或完全治癒或防止癌細胞的生長。此外,「治療」一詞在此係指基於可部分或完全減輕、延遲發生、抑制進程、減輕嚴重性、和/或減少一種特定疾病、異常和/或醫療狀況之一或多個病徵出現機率之目的,而對受測個體(或患者),尤指具有一種醫療狀況、一種該醫療狀況之症狀、一種因該醫療狀況而引起的疾病或病症、或是一種會使朝向該醫療狀況發展的先期狀況的個體,施用或施加本揭示內容的化合物。可對尚未出現特定疾病、異常和/或醫療狀況之明顯病徵的個體,和/或僅對該特定
疾病、異常和/或醫療狀況產生早期病徵的個體進行治療,以期降低產生該特定疾病、異常和/或醫療狀況相關之病理的風險。在本文中,所述病徵、疾病、異常和/或醫療狀況可以是原位癌或轉移性癌。若能減少一或多個病徵或臨床指標即代表該治療是「有效」的。
「預防(prophylaxis)」在此是指對一種未來事件的防制手段。基於本文中預防癌細胞或因手術或診斷程序進而潛藏地提高了癌細胞轉移的文意,因此可在實施該手術或診斷程序之前、同時或之後,實施本文所述的預防性處置手段。
「一有效量(an effective amount)」一詞意將對於治療癌症的目的,此一用量在經過適當的給藥期間後,能夠達到減少癌細胞數目的欲求效果。
「化合物(compound)」、「組合物(composition)」、「藥劑(agent)」或「醫藥品(medicine or medicament)」等詞在此可交替使用,且都是指當施用於一個體(人類或動物)時,能夠透過局部和/或全身性作用而誘發所亟求的藥學和/或生理反應的一種化合物或組合物。
「施用(administered、administering或、administration)」一詞在此係指直接施用所述的化合物或組合物,或施用活性化合物的前驅藥(prodrug)、衍生物(derivative)、或類似物(analog)等,而可於施用個體體內形成該活性化合物之一相當用量者。
本文中交替使用「個體(subject)」或「患者
(patient)」等詞,其係指可接受所述化合物和/或方法治療的動物(包括人類)。「個體」或「患者」在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別,除非另有具體說明。因此「個體」或「患者」包含任何哺乳類動物,包括,但不限於,人類、非人類的靈長類,如哺乳動物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等,其可因利用所述化合物進行治療而獲益。適合接受本發明化合物和/或方法治療的動物較佳為人類。一般來說,「患者」一詞及「個體」一詞在本文中可彼此交替使用。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值,此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而,任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處,「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是,「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內,視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外,或除非另有明確的說明,當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此,除非另有相反的說明,本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值,且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
除非本說明書另有定義,此處所用的科學與
技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外,在不和上下文衝突的情形下,本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型;而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
本揭示內容至少有一部分是肇因於單離自靈芝的赤靈酸S(GMAS)具有可對抗癌細胞(包括具抗藥性的癌細胞)增生和/或轉移之特性而發展出來的。因此,GMAS是潛在可用來製造出可治療或預防癌症藥劑的先導化合物。
本揭示內容中該單離自靈芝的赤靈酸S(GMAS)具有以下的化學結構:
本揭示內容之GMAS是由靈芝屬菌類中分離而來,並可透過習知的純化方法由赤芝(Ganoderma lucidum)的子實體中分離而得,例如利用Hirotani等人(Phytochemistry(1987),26(10),2797-2803)所揭示的方法進行分離純化。或者,也可依據2013年1月11日授予給陳等人的台灣專利號I381844中所述方法,利用取自培養靈芝用
的廢棄太空包中的靈芝菌絲體做為原料來進行分離。無論原料來自靈芝子實體或是菌絲體,所用的分離純化方法一般都包括以溶劑(較佳是醇類溶液),在高於室溫的溫度下進行萃取,接著將萃取物進行管柱層析,其包括但不限於高效率液態層析(HPLC)和逆相液態層析(Reverse Phase Liquid Chromatograpy)等,以及濃縮、乾燥等步驟,直到獲得一種靈芝萃出物的乾燥粉末為止。
依此,本揭示內容提供一種可治療一患者之癌症的方法。所揭示方法包括對該患者施用一有效量的上述本發明化合物或其之藥學上可接受的鹽類。本發明化合物可經由抑制癌細胞生長和/或防止其遷移而能有效地治療該患者之癌症。適於以本發明化合物進行治療的癌症包括直腸癌、肝癌、乳癌或肺癌。較佳是以本發明化合物來治療具有抗藥性的癌,包括對伊馬替尼或是吉非替尼具有抗藥性的癌。
在本文中,抗藥性(drug-resistance)是指癌的一種特定狀態,尤指已對單一藥物發展出抗性的癌的狀態。舉例來說,已發展出抗藥性的癌包括對長春花生物鹼(vinca alkaloids)(如,長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞賓(vinorelvine))具有抗性;對蒽環黴素(anthracyclines)(如,阿黴素(doxorubicin)、唐黴素(daunorubicin)、艾達黴素(idarubicin))具有抗性;對微管穩定藥物-泰素(paclitaxel)具有抗性;和對以酪胺酸激酶(tyrosine kinase,TK)活性做為標的之藥物(如,達沙替尼(dasatinib)、尼羅替尼(nilotinib)、伊馬替尼(imatibib)、
吉非替尼(geftinib))具有抗性。
依據一較佳實施方式,適合以本發明化合物進行治療的癌是肺癌,其係已對一種FDA核可藥物-吉非替尼發展出抗藥性的肺癌。在又一實施方式中,適合以本發明化合物進行治療的癌是直腸癌,且是已經轉移的直腸癌。在再一實施方式中,適合以本發明化合物進行治療的癌是肺癌,且是已經轉移的肺癌。
在某些實施方式中,可經由口服、靜脈注射或肌肉注射方式施用GMAS至一個體身上,所施用的有效用量約為1-100毫克/公斤個體體重間。每天可施用至該個體身上之GMAS的有效用量約為10、20、30、40、50、60、70、80、90或100毫克/公斤體重;較佳是約30-70毫克/公斤體重,例如約30、40、50、60、70毫克/公斤體重;更佳是約50毫克/公斤體重。這些劑量可以單次施用或是分成多次在一天內施用。
在某些實施方式中,所述方法更包含在對該患者施用本發明化合物之後,額外對該患者施用放射線治療。
在某些實施方式中,所述方法更包含在對該患者施用本發明化合物之前、同時或之後,額外對該患者施用另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。此類藥劑的實例包括,但不限於,抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物、細胞激素、顆粒細胞株刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、抗嘔吐藥物以及其他類似物。
抗癌藥物的實例包括,但不限於,紫杉醇(paclitaxel)、異丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜樹鹼(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿黴素(Doxorubicin)、丹阿黴素(daunorubicin)、艾阿黴素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、順鉑(cis-platin)、碳鉑(cyclophosphamide)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、尹氟醯胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、絲裂黴素(mitomycin)、氨基甲基葉酸(methotrexate)、絲羥酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博萊黴素(bleomycin)、亞葉酸(leucovorin)、星狀素(cytarabine)、放線菌素D(dactinomycin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸鹽(combretastatin A4-phosphate)、SU5416及其他類似物。抗血管增生藥物實例包括,但不限於,DS 4152、TNP-470、SU6668、內皮生長抑制素(endostatin)、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol)、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、沙利竇邁(thalidomide)、四硫鉬酸銨(tetrathiomolybdate)、三羧氨基喹啉(linomide)、IL-12及其他類似物。抗病毒藥物實例包括,但不限於,金剛烷胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)及其他類似物。減輕疼痛藥物實例包括,但不限於,對乙醯胺基酚(如,對乙醯胺基苯酚)、非固醇類抗發炎藥物(NSAID)(如,水楊酸鹽)及鴉片樣藥物(如,嗎啡及鴉片)。抗貧血藥物實例包括,但不限於,紅血球生長素。
本揭示內容也提供一種用於治療癌症的藥學
組合物,此組合物包括一藥學有效量之上述本發明化合物,以及一種藥學上可接受的佐劑。
一般來說,上述本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量約0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,上述本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少1%(重量%)。在特定實施方式中,上述本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少5%(重量%)。在另一些實施方式中,上述本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少10%(重量%)。在又另一些實施方式中,上述本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少25%(重量%)。
在某些實施方式中,所述醫藥品或藥學組合物可更包含一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。此類藥劑的實例包括,但不限於,抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物、細胞激素、顆粒細胞株刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、抗嘔吐藥物以及其他類似物。
可根據眾所接受的藥學製程來製備上述藥劑或上述藥學組合物,如Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th edition,ed.Alfonoso R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985))中所述的製程。藥學上可接受的賦型劑係指可和製劑中其他成分相容且與生物體相容者。
一般來說,本發明化合物(即,GMAS)可經由口服(如,口服用膠囊、藥包(sachets)、懸浮液或藥錠)、
或腸胃外(parenterally)等適當方法施用。腸胃外(parenterally)施用方式包括例如肌肉內注射、靜脈注射、皮下注射或腹膜內注射等系統性方式施用。或是,也可透過穿皮膜方式施用,如局部皮膚塗抹或是吸入性(如支氣管內、鼻腔內、口腔內或鼻滴劑等);或是直腸內方式施用。施用時可單獨給藥或併同習知藥學可接受輔劑一起給藥。在較佳實施方式中,可經由口服方式(如,透過食物)將本發明化合物投予個體。
若以口服方式施用,可將本發明化合物(即,GMAS)配方成為內含各種輔劑(如,微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸);各種崩解劑(如澱粉、藻酸及特定矽酸鹽);以及顆粒黏合劑(如,聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此外,還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。上述的固態劑型也可非必要地包括塗層或殼,例如腸衣塗層,以及用來改善任一藥物活性成分釋放速率的塗層。這類塗層的實例已為此領域中人士所熟知。在一實例中,所述藥學組合物是被配方成為藥錠。在另一實例中,所述藥學組合物是被配方成為充填在軟或硬明膠膠囊內或是封裝在生物可分解之藥包內的顆粒。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時,可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方,需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑,以及諸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀釋劑。
在某些實施方式中,本發明藥學組合物是被配方成為適合口服的液體劑型。此類液體配方可更包括用來維持pH值的緩衝液。也可將此液體配方充填在軟膠囊內。此液體劑型可為一種溶液,懸浮液,乳化液,微乳化液,沉澱或是可攜帶本發明化合物、其之藥學上可接受的衍生物、異構物、代謝物、鹽類或溶合物之任何液體介質。此液體可被設計成能改善本發明化合物其之藥學上可接受鹽類之溶解度,以便形成一種含有藥物的乳化液或分散液。當使用這種劑型時,是將活性化合物與至少一種藥學上可接受的輔藥(包括,但不限於,上述輔藥)一起混合後形成。
若以腸胃外(parenterally)方式施用,可將本發明化合物配方成為液態的藥學組合物,其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來製造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括,但不限於,1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張性氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如,油酸)及其之甘油酯衍生物,或是天然藥學可接受的油(如,橄欖油或菜籽油)來製造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其他常用的界面活性劑(如,Tweens或Spans系列)或乳化劑,或藥學領域製造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。
亦可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物製
成多種適用於黏膜給藥(mucosal application)的劑型,如經頰(buccal)和/或舌下(sublingual)藥物劑型單元,以遞送藥物穿過口腔黏膜。可使用多種生物可降解且藥學可接受的高分子輔劑,此種輔劑可使得藥學組合物具有可接受的吸附效果以及所欲的藥物釋放模式,且可和經頰和/或舌下藥物劑型單元中所含的欲施用活性成分或其他成分相容。一般來說,上述的高分子輔劑包含親水性聚合物,其可黏附至口腔黏膜的濕潤表面。高分子輔劑的實施例包括但不限於丙烯酸聚合物與共聚物(acrylic acid polymers and copolymers);水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol);聚乙烯氧化物(polyethylene oxides);聚丙烯酸酯(polyacrylates);乙烯聚合物與共聚物(vinyl polymers and copolymers);聚乙烯吡咯啶;葡萄糖(dextran);瓜膠(guar gum);果膠(pectins);澱粉;及纖維素聚合物(cellulosic polymers)。
當可理解,本發明化合物的劑量會因個體而異,這不僅是因為所用的特定化合物或組合物、給藥途徑、化合物(單獨或連同一或多種藥物)於患者體內所引發之所欲反應等因素之不同,還可能受到其他因素影響,例如:欲治療症狀的疾病狀態或嚴重程度;患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況;以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者於同時進行的其他醫療或特殊飲食內容;以及本領域通常知識者可想到的其他因素;而負責照料的醫療人員最終可基於這些因素而判斷出適
當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指化合物或組合物所致的毒性或有害的效果不及於其所帶來的治療利益。在較佳的情形中,本發明之化合物或組合物於投藥時,應採用適當的劑量並持續一段時間,以減少出現症狀的次數和/或嚴重程度。
本揭示內容之另一目的是提供一種可在活體外以GMAS來抑制癌細胞生長的方法。所述方法包含在活體外使該癌細胞接觸足夠量之GMAS或其藥學上可接受的鹽類,其中該GMAS之量係足以抑制癌細胞的生長或遷移。該足夠量之GMAS介於約1 μM至約50 μM間;較佳是介於約5 μM至約45 μM間;更佳是介於約10 μM至約40 μM間。在一實例中,對直腸癌和肺癌細胞來說,該GMAS之量最佳是約8 μM。在另一實例中,對肝癌和乳癌細胞來說,該GMAS之量最佳是約20μM。
以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣,並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。
本研究係使用人類肺腺癌(lung adenocarcinoma)細胞株A549,人類肝臟細胞癌株Huh7(human hepatocarcinoma cell line Huh7)、人類直腸癌細胞株HCT116、人類非小型肺癌細胞株PC-9、對吉非替尼具
有抗性的人類非小型肺癌細胞株PC-9(PC9-IR),以及人類乳癌細胞株MDA-MB-231。
將每一細胞株的細胞分別培育在經Dulbecco氏改良過之Eagle氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中,並添加10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、100單位/ml之盤尼西林、100 ng/ml之鏈黴素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2mM L-穀氨酸和非必要胺基酸及丙酮酸鈉,並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO2及95%空氣)。平時將細胞培養於10公分培養盤內,當細胞長到八分滿時進行繼代培養。繼代培養方式係先吸去舊的培養液後,以3毫升的磷酸緩衝液(PBS)清洗培養細胞一次,接著,在37℃下以1毫升之胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.025%)溶液處理細胞5分鐘,使細胞脫離培養盤成懸浮狀態;接著,在懸浮細胞中加入2毫升新鮮的培養液,以中和胰蛋白酶的活性。然後,將細胞打散使平均分布於細胞懸浮液中,留下適當比例的細胞數後,加入新培養液補至適當體積並混勻後,放入37℃培養箱內培養。
細胞活性分析 取約3,000個細胞,將之接種在平底96孔盤中,以培養液補充每一培養孔內的培養液,使體積達180 μL,接著將培養盤放入37℃之培養箱培養過夜。次日加入含不同濃度的式(I)化合物及艾瑞莎之上述培養液。各培養孔內最終體積為200 μL,每個濃度進行三重覆,放入37℃培養箱培養,於48小時後測定細胞活性。
酸性磷酸酶活性(Acid phosphatase,ACP)分 析 活細胞中有大量ACP可將其受質磷酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)轉換成對-硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP),p-NP在405 nm波長下有最大吸光值,故可藉測定吸光值可定量出細胞中ACP活性,進而推算出細胞的活性。測定細胞活性時,先吸去培養液,以200 μL PBS清洗一次,加入100 μl的分析用緩衝液(內含10 mM p-NPP、0.1 M醋酸鈉、0.1% Triton X-100,且pH約為5.5),於37℃反應30-40分鐘後加入10 μl的氫氧化鈉(0.1 N)終止反應,以SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)於波長405 nm測定吸光值為細胞活性,以未處理藥物組的細胞活性為1,計算出不同條件處理下的細胞活性比。
傷口癒合試驗乃是透過模擬活體內傷口癒合過程中所出現的細胞遷移現象而被研發出來用於研究體外細胞遷移能力的幾種方法之一。基本的步驟包括在一單層的細胞層上創造出一個傷口,接著在試驗開始及每隔一段固定的時間傷口拍照,比較所拍攝的照片,即可定量出遷移至傷口以將傷口癒合的細胞數目或效果。
簡言之,以IBIDI出品的培育插入物和24-孔培養盤(IBIDI GmbH,Martinsried,Germany)來進行試驗。試驗開始時,分別在每一培養孔中插入一培育插入物。接著,在每一培養孔內由同一培育插入物所造成的兩個小槽中加入70μL培養基(其中含有3x104個各式測試細胞)並培育8小時,接著移除培育插入物,並重新添加500μL培養基,其
中含有10% FBS、GMAS(20或50μM)或是溶劑(即,控制組)。分別在重新添加培養基後的第0、12、24、48或72小時,以倒裝顯微鏡拍攝一張照片,之後再利用Metamorph軟體(Molecular Devices)分析遷移區域或「傷口區域」。
分別依上述方式,透過測定ACP活性來評估GMAS抑制各種癌細胞株,包括直腸癌、肝癌、乳癌及肺癌的功效,結果示於第1圖。
如第1圖所示,GMAS可抑制包括肺癌細胞株A549、直腸癌細胞株HCT-116、肝癌細胞株Huh7、乳癌細胞株MDA-MB-231等癌細胞的活性,且其抑制效果與GMAS的劑量相關。GMAS抑制每一細胞株之50%活性的濃度總結於下表1中。
依據實施例1.1所述方式,測試GMAS在已對吉非替尼發展出抗藥性之肺癌細胞株PC9-IR上的效果。
結果示於第2圖,GMAS或吉非替尼抑制細胞株之50%活性的濃度,以及兩細胞株對藥物的細胞抗性(resistant ratio,RR)總結於下表2中。細胞抗性乃是一種用以決定一細胞株對一測試藥物之感受性的方式,透過將某一特定藥物對不同細胞株的IC50濃度相除,即可獲得RR值,用以表示一細胞株,相對於另一細胞株而言,對該測試藥物的敏感程度。
無論是PC-9或PC9-IR細胞,在以吉非替尼處理72小時後,其細胞活性均明顯下降,其50%細胞活性受到抑制的濃度分別為0.0267 μM與12.6 μM。類似的,GMAS同樣可抑制PC-9或PC9-IR細胞的細胞活性,且其可抑制50%細胞活性的濃度均約在60 μM左右(分別為56.1與62.8 μM)。
但是如果比較兩細胞株對兩種藥物的細胞抗性比(resistant ratio),明顯可看出吉非替尼對不具抗藥性
的PC-9細胞株較有效。相反的,兩株肺癌細胞株對GMAS的細胞抗性比則大略相同,表示無論癌細胞是否具有抗藥性,GMAS毒殺肺癌細胞的能力並無差異。
以上述「材料與方法」段落中敘述的傷口癒合試驗,來評估GMAS對直腸癌細胞遷移能力的影響。結果示於第3圖。
如第3圖所示,在一單層的直腸癌細胞培育物中利用外來插入物創造出一個傷口,接著利用拍照觀察在不同時間下GMAS對傷口癒合的影響。實驗發現,控制組細胞傷口在經過48小時培育後開始癒合(即,細胞開始遷入傷口處),到了72小時,即已明顯癒合;若培養基中添加了25μM的GMAS,則發現癒合會受到抑制,若升高GMAS濃度至50μM,則其抑制細胞遷入傷口的現象更為明顯。
類似的,GMAS同樣可抑制肺癌細胞的遷移,如第4圖所示,5 μM GMAS即足以阻止將近50%的肺癌細胞遷移。
綜上所述,本發明結果顯示GMAS是潛在可用來開發成癌症治療藥物的先導化合物,特別是具抗藥性或轉移性癌症之治療藥物的先導化合物。
當可理解上述實施方式與實施例僅為例示,
且熟習此技藝者可對齊進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備,並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上,然其並非用以限定本揭示內容,任何熟習此技藝者,在不脫離本揭示內容之精神和範圍內,當可作各種之更動與潤飾,因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (11)
- 一種赤靈酸S(ganodermic acid S,GMAS)的用途,其可用來製造一種癌症治療藥物,其中該癌可以是肝癌、直腸癌、肺癌或乳癌。
- 如請求項1所述的用途,其中該直腸癌具有轉移性。
- 如請求項1所述的用途,其中該肺癌具有轉移性。
- 如請求項1所述的用途,其中該肺癌對吉非替尼(geftinib)具有抗藥性。
- 一種於活體外用來抑制一癌細胞生長或遷移的方法,包含使該癌細胞接觸一足夠量之GMAS或其藥學上可接受的鹽類,其中該癌細胞可以是肝癌細胞、直腸癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞或血癌細胞。
- 如請求項5所述之方法,其中該癌細胞是直腸癌細胞且該足夠量之GMAS是約8 μM。
- 如請求項6所述之方法,其中該直腸癌具有轉移性。
- 如請求項5所述之方法,其中該肺癌具有轉移性。
- 如請求項5所述之方法,其中該癌細胞是肝癌細胞且該足夠量之GMAS是約20 μM。
- 如請求項5所述之方法,其中該癌細胞是乳癌細胞且該足夠量之GMAS是約20 μM。
- 如請求項5所述之方法,其中該癌細胞是肺癌細胞且該足夠量之GMAS是約8 μM。
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