CN102309483B - 小檗碱离子对化合物的抗肿瘤作用用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有结构式Ⅰ的小檗碱离子对化合物抗肿瘤的用途。

Description

小檗碱离子对化合物的抗肿瘤作用用途

技术领域

本发明涉及小檗碱一种离子对化合物体内抗肿瘤作用的用途。

发明背景

小檗碱离子对化合物是由小檗碱与烷酰基乙醛亚硫酸氢钠加成物（俗称鱼腥草素）作用生成的离子对化合物其结构式如下

其中R为C₈-C₁₂的烷基。

该化合物及其制备方法已经由中国发明专利（专利号ZL200510136655.2）公开。

小檗碱是黄连等多种中草药中的有效成分，药用其盐酸盐，有清热解毒，抗菌消炎作用，常用于肠道感染等疾病。近若干年来，研究发现小檗碱有很多重要的药理活性和临床治疗作用。如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、炎症、消化性溃疡、细菌和病毒感染、脑缺血损伤、精神疾病、阿尔茨海默症、骨质疏松等。其中对抗肿瘤的研究最受关注。体外抗癌研究表明小檗碱有广谱抗癌作用。如对K562细胞株、HL-60（人急性幼粒细胞白血病）、CCRF-CEM（淋巴母细胞白血病）、人胃癌细胞株（MGC-803\SGC-7901）、鼻咽癌细胞株HNE₃、人脑胶质瘤细胞株和大鼠9L肿瘤细胞、肝癌Bel7402、HepG2细胞、结肠癌细胞HCT116、人食管癌细胞ECCS、宫颈癌细胞U14以及乳腺癌和前列腺癌等细胞株均有抑制作用。其中有不少研究了它的抗癌机制。小檗碱的体内抗癌试验研究极少，有报道口服灌胃和腹腔注射给药对动物有体内抗肿瘤作用。但不及体外显著，尚未见临床研究报道。小檗碱是季胺型生物碱，常用的盐酸盐水溶性小，脂溶性更小，难以通过生物膜，再有药物酶的作用致使口服吸收困难，影响全身治疗作用的发挥。（参考文献，李波等 小檗碱及其衍生物的研究进展 药学学报2008，43（8）：773～787；许成山等，小檗碱抗肿瘤作用研究进展，现代肿瘤医学2009，17（1）：147；等）。小檗碱与鱼腥草素都有免疫调节作用，这有利于抗癌作用。有报道，新鱼腥草素对肉瘤S180有抑制作用。

发明内容

具有结构式Ⅰ的小檗碱离子对化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，

其中R为C₈-C₁₂的烷基。

小檗碱离子对化合物是以小檗碱为母体药物与鱼腥草素钠的阴离子结合成的离子对。它具有协同增效和良好的亲脂性，有利于透过生物膜，增加吸收。因此，预测小檗碱鱼腥草素离子对化合物有抗癌作用是可能的。

体外试验表明，本化合物的抗癌作用明显大于盐酸小檗碱。

本发明提供一种小檗碱离子对化合物用于体内抗癌作用的应用。口服该化合物能较好的抑制肝癌细胞HeGP2、Bel-7402及肠癌细胞系HCT116在裸鼠体内的生长。

附图说明

图1小檗碱鱼腥草素离子对化合物的量效曲线；

图2小檗碱鱼腥草素离子对化合物对HepG2、Be1-7402和HCT116三种癌细胞杀伤作用的IC50值；

图3阳性对照药物ADM对HEPG2和Be1-7402细胞株的毒性作用；

图4阳性对照药物CDDP对HCT116细胞株的毒性作用；

图5小檗碱鱼腥草素离子对化合物对HePG2、Be1-7402和HCT116三种细胞抑制作用的时效曲线；

图6小檗碱鱼腥草素离子对化合物治疗后各组肝癌细胞裸鼠移植瘤大体形态；

图7不同剂量小檗碱鱼腥草素离子对化合物不同时间对裸鼠移植瘤生长抑制率的影响。

具体实施方式

以下实验中的HB和黄癸素均为小檗碱鱼腥草素离子对化合物。

一、体外抗肿瘤实验之一

1、实验方法：

采用MTT法检测HB对A549肺癌细胞株、Bel1702肝癌细胞株、Hela宫颈癌细胞株的抑制活性，根据HB ID50预实验结果，共设5个HB实验组，分别为每毫升200μg、100μg、50μg、25μg、12.5μg；另设培养液空白对照组和盐酸小檗碱阳性对照组（100μg/ml）。

2、实验结果：

HB对Hela、Bel7402、A549三株体外培养癌细胞的抑制率分别为：在100μg/ml HB培养48小时的有效条件下，对Hela宫颈癌细胞的抑制率为95%，而同等条件下阳性对照组为45%；在100μg/ml HB培养48小时的有效条件下，对Bel7402肝癌细胞的抑制率为91%，而同等条件下阳性对照组为50%；在100μg/ml HB培养72小时的有效条件下，对A549肺癌细胞的抑制率为71%，而同等条件下阳性对照组为46%。详细结果见表1。

表1小檗碱鱼腥草素离子对化合物、盐酸小檗碱对癌细胞抑制率结果；

HB对Hela、Bel7402、A549三株体外培养癌细胞均有抑制作用，但对不同癌细胞之间的抑制效率有差异，并具有浓度依赖性和时间依赖性。从以上结果可见到HB的抗癌细胞活性明显大于盐酸小檗碱。

二、体外抗肿瘤实验之二

1、方法：MTT法，阳性对照药阿霉素（ADM）和顺铂（CDDP）。

细胞：肝癌细胞系HepG2、Bel-7402及肠癌细胞系HCT116.

2、实验分组：及阳性对照药浓度各6个组。

量效关系检测，药物作用48小时，用MTT法测定A值，计算抑制率（IR），根据抑制率与药物浓度的直线回归方程求出药物对细胞增殖的半数有效抑制剂量（IC₅₀）。时效关系检测，以药物IC₅₀浓度作用24h、48h、72h、96h、120h后，按MTT法检测，计算各时间点的黄癸素对三种细胞株的抑制率。

统计学分析采用t检验，数据以mean±SD表示，设定P<0.05为显著性差异。

3、结果：

（1）黄癸素杀伤三种细胞的作用及量效关系

随着的浓度增加，黄癸素对HepG2、Bel-7402和HCT116三种细胞株的抑制作用均逐渐增强（图1），呈剂量依赖性。黄癸素对HepG2、Bel-7402和HCT116三种细胞株的半数抑制剂量（IC₅₀）分别为14.72±2.92μg/ml、19.59±2.79μg/ml和51.52±4.84μg/ml，可见黄癸素对肝癌细胞HepG2和Bel-7402的杀伤作用明显大于肠癌细胞HCT116（P<0.01）（图2，表2）；其中对肝癌细胞HepG2的作用最为明显。阳性对照物ADM对HepG2和Bel-7402细胞株的毒性作用及cDDP对HCT116细胞株的毒性作用均呈剂量依赖性（图3、图4），且ADM对HepG2和Bel-7402细胞株的半数抑制剂量（IC₅₀）分别为0.124±0.033μg/ml和0.174±0.026μg/ml，cDDP对HCT116细胞株的半数抑制剂量（IC₅₀）为3.027±0.317μg/ml。

表2黄癸素对HCPG2、Be1-7402和HCT116三种癌细胞作用的IC50比较

细胞株	IC50（μg/ml）	P
			HepG2	14.72±2.92	＜0.01
Bel-7402	19.59±2.79	＜0.01
			HCT116	51.52±4.84

（2）黄癸素杀伤三种细胞的作用及时效关系

取黄癸素对HeG2、Be1-7402和HCT116三种细胞株的IC₅₀值分别作用于三种细胞株，从图5可见黄癸素对三种细胞株抑制作用随时间的延长抑制率逐渐增大，呈时间依赖性。在每个时间点黄癸素对HepG2细胞的抑制率均显著高于黄癸素对Be1-7402和HCT116细胞的抑制率。

从以上结果可见，黄癸素对体外培养的肝癌、肠癌细胞均具有明显的抑制作用，且随着剂量的增加和作用时间的延长，其抑制作用明显增强；尤其是HepG2细胞具有特异性抑制作用。

三.动物体内抗癌试验

方法

1、HepG2细胞移植瘤裸鼠模型建立：BALB/C-nu/nu裸鼠40只，雌雄各半，取对数生长期的人肝癌细胞系HepG2常规消化并吹打细胞制成单细胞悬液，以1000r/min离心5min除去上清液，收集细胞，加适量细胞，加适量无血清DMEM培养基重悬计数，在无菌条件下于裸鼠右前肢腋窝处皮下接种150μl/只（约1.6×10⁷个细胞），待移植瘤体积长至大于75mm³时，取肿瘤无自发性出血、坏死及感染灶的裸鼠做为实验对象。

2、分组及药物处理

1、按瘤体积和体重均衡原则随机分为5组（每组7只），以下是各组的处理方法（ig:灌胃；ip:腹腔注射）：

（1）溶剂组：ig,0.1mL/只，1次/天；

（2）阳性对照（ADM）组：2mg/kg ip,1次/天；

（3）黄癸素高剂量组：100mg/kg ig,0.1mL/只，1次/天；

（4）黄癸素中剂量组：50mg/kg ig,0.1mL/只，1次/天；

（5）黄癸素低剂量组：25mg/kg ig,0.1mL/只，1次/天。

总治疗时程为24天。动物全程饲养在22℃-26℃的环境之下，房间、饲料和垫料均紫外线照射处理。给药结束后次日处死全部裸鼠，剥离瘤肿块，称瘤重量。

2、药物疗效评价指标：给药前及全部用药过程每2天称取裸鼠体重，并用游标卡尺测量移植瘤的长径（a）和短径（b），依据下列公式计算：

（1）肿瘤体积（ＴＶ）＝1／2ａｂ²；

（2）肿瘤生长抑制率（IR）=（1-治疗组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）×100%（体积比）；

（3）肿瘤抑制率（IR）=（1-治疗组平均瘤重量/对照组平均瘤重量）×100%（瘤重比）

（4）相对肿瘤体积（RTV）=处死动物时肿瘤体积/初次给药时肿瘤体积；

（5）相对肿瘤增殖率（T/C）=治疗组RTV/阴性对照组RTV×100%。

用肿瘤抑制率（IR）和相对肿瘤增殖绿（T/C）评价药物抗肿瘤活性的作用，疗效的评价标准：IR＜40或T/C＞60为无效；而IR≥40或T/C≤60，并且p＜0.05为有效。

3、不良反应观察每日观察并记录各组裸鼠的精神状态，饮食活动、皮肤颜色、大小便是否正常，鼻、口腔、眼有无异物分泌等。

4、统计学分析 检测结果的两两比较采用t检验。数据

表示。设定P＜0.05为显著性差。结果

1、荷瘤裸鼠的基本情况：用体外培养的HepG2细胞接种第四天1只裸鼠死亡，一周后有4只肿瘤体积小于75mm³（均剔除实验），其余35只裸鼠的肿瘤体积均大于75mm³，成瘤率为87.5%，但肿瘤的大小不一。移植瘤仅在接种局部皮下生长，生长早期表现为圆形或椭圆形，后期为不规则形，有的表面呈多个结节融合状。从外观看这些移植瘤边界较清楚，活动度可，表皮血管丰富，但随着移植瘤体积的增大，其活动度逐渐下降。

2、荷瘤裸鼠不良反应观察：除阳性对照（ADM）组裸鼠精神状态、活动状况欠佳，食欲减退，体重增长速度明显减慢外，其余各组荷瘤裸鼠给药后精神状态均较好，活动正常，反应敏捷，每天正常饮食，皮肤颜色光滑，呼吸均正常，鼻、口腔、眼均无异物分泌，大小便正常，均未见明显异常反应，各组裸鼠生长速度均衡，体重均有增大，且各组体重没有明显差异。表3为各组动物体重变化情况，仅ADM组体重明显轻于对照组（P＜0.01）。

表3.动物实验前后体重（g）比较

^**P＜0.01 vs Con.

3、HB抑制裸鼠移植肝癌生长的量效-时效关系：图1各组在为每个时间点的肿瘤生长抑制率（肿瘤体积百分比），100mg/kg HB随治疗时间延长而肿瘤生长抑制率增加，呈时间依赖性，治疗10天后就表现出明显的抑制作用（IR=41.48%，p＜0.01）,至18天后达到平台期，抑制率达65%左右；50mg/kgHB、25mg/kgHB连续治疗24天后肿瘤生长抑制率均低于30%；ADM组在每一个时间点的抑制率均高于HB组。从图7还可见到，随着HB剂量增加肿瘤的抑制率明显增加，如HB处理24天后25mg/kg和50mg/kg组的IR分别为19.02%和28.99%，而100mg/kg组的IR达66.37%。

4、HB作用后相对肿瘤体积（RTV）和相对肿瘤增殖率（T/C）:表4显示，实验结束后药物处理组的肿瘤体积均小于对照组肿瘤体积；除阳性对照组外，各HB组肿瘤在处理完毕时的体积均大于实验前肿瘤体积，其中，50mg/kg组的TV和RTV虽然明显低于对照组（p＜0.05），但其和25mg/kg组的T/C均大于60；

100mg/kg组的TV和RTV明显低于对照组（p＜0.01）且T/C为33.98，小于60，表明该浓度具有较好的抑瘤。阳性对照（ADM）组的RTV和T/C均明显低于个治疗组，ADM抑瘤作用优于HB。

表4.HB对HepG2肝癌移植瘤生长的影响

^**P＜0.01、^*P＜0.05vs  Con.

5、HB对裸鼠肿瘤重量的影响：图6为裸鼠处死后剥离下的移植瘤照相，表5为移植瘤重量，从图和表中观察到HB呈剂量性抑制肿瘤的生长，100mg/kg HB组的肿瘤抑制率（瘤重比）为62.65%，而50mg/kg HB和25mg/kg HB组的IR分别为27.89%和22.14%。

表5HB对HepG2肝癌移植瘤的肿瘤重量

和IR比较；

^**P＜0.01、^*P＜0.05vs Con.

结论

1、黄癸素（ＨＢ）具有较明显的体内肝癌抑制作用，其作用与剂量有关，100mg/kg HB灌胃对在体肝癌的抑制率（IR）为62.65%（P＜0.01），此剂量作用后的相对肿瘤增值率（T/C）为33.98%（P＜0.01）；

黄癸素（HB）100mg/kgHB灌胃对裸鼠几无副作用，药物使用后裸鼠全身情况、体重增加值与对照组无差异。

Claims (2)

1.具有结构式Ⅰ的小檗碱离子对化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，

其中R为C₈-C₁₂的烷基。

2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于所说的肿瘤是肝癌。

Images