JP2012530697A - ヒドロキシクロロキンを含む抗癌治療のための局所投与用注射剤の組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）を含む抗癌治療のための局所投与用注射剤組成物に関するもので、本発明による抗癌剤の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＴＴ ａｓｓａｙを通じたｓａｒｃｏｍａ１８０に対するＩＣ５０値がシスプラチンに比べて１０倍くらい低い値を示し、優れた細胞毒性効果を有し、またｉｎ ｖｉｖｏでもｓａｒｃｏｍａ１８０によって誘発された固形癌に対して容量依存的な効果を現すだけでなく、ｓａｒｃｏｍａ１８０によって誘発された腹水癌に対して寿命延長の効果がある。

Description

本発明は、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）を含む抗癌剤の組成物に関するもので、より詳しくは、ヒドロキシクロロキンを主成分とする局所投与用注射剤組成物であって、癌細胞に直接注射して抗癌効果を得るための製剤に関する。

腫瘍は細胞が無限に増殖し、正常な細胞の機能を邪魔する病気であり、病理組織学的、臨床医学的な判断基準により悪性腫瘍と良性腫瘍に分けられ、一般的に言う癌は悪性腫瘍に属する。

癌は韓国人の死亡原因１位を占めており、世界的にも死亡原因の優位を占めている。癌はその発生原因や治療方法がまだ明確にされておらず、今まで開発された治療剤は、臨床で使用した時、致命的な副作用、耐性発現、リンパ球及び骨髄破壊などの問題点を有している。従って、正常細胞には活性を表さず、癌細胞にだけ細胞毒性を有する新しい抗癌剤の開発が至急な実情である。

現在、人体の中で発生する癌は約２７０種で、これを研究するための細胞株は、肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ−１８０）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）、腺癌（ａｄｅｎｏ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、エールリッヒ腹水腫瘍（Ｅｈｒｌｉｃｈ ａｓｃｉｔｅｓ ｔｕｍｏｒ）及びウォーカー癌腫（Ｗａｌｋｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）などが報告されている。このうち、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０は、白色雄性マウスの腋窩癌から由来した肉腫化した腫瘍で、腹水癌から代を継いで保存させ、固形と腹水形とで互いに容易に移行でき、移植の時には種間特異性がないものと知られている。

一方、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）は、現在、リウマチ性関節炎、円板状及び全身性エリテマトーデス、光過敏皮膚病の治療剤、そしてマラリアの治療と予防に使用されており、最近は腎損傷抑制及び安全神経膠腫の研究等が報告されている。

大韓民国特許登録第１０−０３９０３３２号では、抗マラリア剤として一般に使用されるヒドロキシクロロキン、クロロキン、プリマキンなどを抗癌剤であるドキソルビシン、シスプラチンなどと併用して投与することにより、抗癌剤の最小有効濃度（ＩＣ_５０）を低め、抗癌剤による癌細胞の薬剤耐性を抑制することができる抗癌剤複合組成物を開示している。ここでは、ヒドロキシクロロキンなどの抗マラリア剤 が抗癌剤の耐性を抑制して抗癌効果を上昇させるための補助剤として使用されており、経口、非経口などの抗癌剤の投与経路による全身的な投与により効果を奏する。

すなわち、今までヒドロキシクロロキンが抗癌効果を有するということは知られておらず、従って、抗癌剤の主成分として使用された例も無い。

本発明は、ヒドロキシクロロキンを局所投与用抗癌剤として使用するためのもので、特に、正常細胞には活性されず、癌細胞だけに細胞毒性を有する抗癌剤の組成物を癌細胞に直接注射または注入するための局所投与用抗癌剤の組成物を提供するためのものである。

上記の目的を達成するため、本発明では、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）またはその塩を含む抗癌治療のための局所投与用注射剤組成物を提供する。

本発明の抗癌剤の組成物は癌細胞に直接注射または注入することができ、リドカインのような局所麻酔剤及び／またはリボフラビンのような抗酸化剤をさらに含むことが好ましい。

本発明は、ヒドロキシクロロキンを主成分とする組成物を癌細胞に直接注射または注入する局所投与により、抗癌効果を発するようにしたものである。ヒドロキシクロロキンを含有する局所投与用組成物を患部に直接投与して局所組織を硬化させることで、代謝を遮断する。癌細胞は正常細胞に比べて代謝が迅速に行われるため、ヒドロキシクロロキンにより代謝が遮断されると組織が不活性化し、結果的に組織の壊死に繋がる。

本発明の組成物においてヒドロキシクロロキンの含量は、５〜２５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、２０〜％（ｗ／ｖ）がより好ましい。ヒドロキシクロロキンの含量が５％（ｗ／ｖ）より低いと治療効果が期待し難く、２５％（ｗ／ｖ）より高いと癌細胞の周りの正常組織の壊死が一緒に起こるという副作用があって好ましくない。

本発明による局所投与用注射剤組成物において局所麻酔剤は、癌細胞に注射にて直接投与する時、痛みを除去する目的で使用され、好ましくは、リドカインを１〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で使用する。また、抗酸化剤は、製剤の安定性のために配合され、好ましくは、リボフラビンを０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用する。

また、ヒドロキシクロロキンの水に対する溶解性を考慮して、ヒドロキシクロロキンの塩を使用することができ、特に、硫酸塩が好ましい。

本発明による抗癌治療のための局所投与用注射剤組成物は、通常の注射剤の製造方法により製造できる。

本発明の抗癌治療のための局所投与用注射剤の組成物は、好ましくは、癌細胞に直接注射または注入するが、患者の状態に応じて３〜４日の間隔で数週間繰り返して投与でき、癌細胞の大きさと進行状態に応じて１〜２日の間隔を置いて繰り返し投与することで癌細胞の増殖を抑制し、細胞代謝を抑制して出来るだけ早く癌細胞を硬化、不活性させることができると思われる。

図１はＭＴＴ ａｓｓａｙによるｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株の成長に及ぼす本発明の組成物の効果を対照薬物と比べて示したグラフである。 図２はＩＣＲマウスにおいてｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株の分化に及ぼす本発明の組成物の効果を対照薬物と比べて示したグラフである。 図３はＩＣＲマウスにおいてｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株固形癌の成長に及ぼす本発明の組成物の効果を示したグラフである。 図４はＩＣＲマウスにおいてｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株腹水癌誘発後、本発明の組成物の寿命延長に及ぼす効果を示したグラフである。

以下、実施例を通じて本発明を詳しく説明する。ただし、これら実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明の範囲がこれにより限定されるのではない。

＜実験方法＞

（１）投与薬物

実験に使用する本発明の抗癌剤の組成物は、癌細胞に直接注射または注入する局所投与用製剤として製造した。詳しくは、注射用生理食塩水にヒドロキシクロロキンを２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、溶解補助剤として２０％エタノールを調剤容量の１０〜２０％加え、水浴上で加温溶解した後、リドカインを２％（ｗ／ｖ）、リボフラビンを０、１％（ｗ／ｖ）の濃度に添加して製造した。

良性対照薬として使用したシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）は、ｓｉｇｍａ ｃｏ（ＵＳＡ）から購入して使用した。

（２）癌細胞株

本実施例で使用した癌細胞株は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０（ＫＣＬＢ ４０６６）で、韓国細胞株バンクから分譲してもらったものである。

細胞株に対する細胞培養培地としては、１０％のｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）が添加されたＲＰＭＩ １６４０培地を使用し、ここにストレプトマイシン（１００μｌ／ｍｌ）とペニシリン（１００μｌ／ｍｌ）を添加した。

Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株の培養は、３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターで４８時間継代培養して実験に使用した。

動物実験のために、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株をＩＣＲマウスの腹腔内に２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で注入し、約２週間後、得られた腹水を採取して２０００ｒｐｍで遠心分離した沈殿液を２回繰り返して洗浄した後、０．４％のトリプシンブルで染色して２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように製造した。

（３）実験動物

生後５週齢のＩＣＲ系実験用マウスを購入して一週間、適応させた後、実験に使用した。動物の飼育条件は、室内の温度は２２±２℃、相対湿度５０％を保ちながら、１２時間の周期で昼と夜を調節して照明を実施した。

効果試験例１．Ｓａｒｃｏｍａ１８０での細胞毒性の測定

本発明の組成物が細胞毒性に及ぼす影響を評価するために、ＭＴＴ ａｓｓａｙを利用した。ＭＴＴ ａｓｓａｙは、細胞の生存率を測定するための実験室の試験法で、標準比色分析法（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）であるといえる。細胞の増殖と生きている細胞を正確に測定できる技法であるＭＴＴ ａｓｓａｙは、生命科学分野、特に、腫瘍生物学で必須的な技法の１つである。新しい抗癌剤の開発のための効能検索や既存に開発された抗癌剤の感受性を調べるために、動物実験など生体に適用する前に、生体外で薬物が腫瘍細胞の成長を抑制することを客観的に証明する過程が先行されるべきである。

１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈されたｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株を９６−ウェルプレートの各プレートに添加し、２４時間３７℃、５％のＣＯ_２のｉｎｃｕｂａｔｏｒで菌株を培養した。２４時間培養した後、本発明の組成物の濃度を１．０μｌから１０μｌまで 計８部類の濃度に希釈して各ウェルに添加し、シスプラチンも同じ方法で希釈してウェルに添加した。

以後、また、３７℃、５％のＣＯ_２のｉｎｃｕｂａｔｏｒで２４時間培養し、２ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬５０μｌを加えた後、３７℃の培養基で４時間放置した。

遠心分離機を利用して上澄液を除去し、ＤＭＳＯを２００μｌずつ各ウェルに仕込み、ＭＴＴ染色沈殿物を溶かした後、ＥＬＩＳＡ判読機で５４０ｎｍの波長でＯＤ_５４０値を測定した。

５０％の抑制濃度（ＩＣ_５０）は、生存率が５０％になるようにする薬物の濃度と正義し、ＩＣ_５０値を抗癌効果の指標として使用した。

図１は、ＭＴＴ ａｓｓａｙによるｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株の成長に及ぼす本発明の組成物の効果を対照薬物と比べて示したグラフである。

図１からわかるように、２×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度でｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株浮游液を接種した後、対照薬物であるシスプラチンとの抗癌力を比べた結果、シスプラチンのＩＣ_５０値は０．１ μg／ｍｌであらわれ、本発明の組成物のＩＣ_５０値は０．０１μｌの以下であらわれたことを確認した。

即ち、本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＴＴ ａｓｓａｙを通じたｓａｒｃｏｍａ１８０に対するＩＣ_５０値がシスプラチンに比べて１０倍程度低い値を示したため、優れた細胞特性効果を有するものと判断される。

効果試験例２．癌細胞分化の抑制効果

ＩＣＲマウスから本発明の組成物の抗癌力を観察するために、Ｓａｒｃｏｍａ１８０を接種した後、Ｓａｒｃｏｍａ１８０の分化に及ぼす影響を評価した。

飼育施設に適応した動物を次の表１のように計６個群（Ｇ１〜Ｇ６）に分けて、各群当り１２匹の動物を割り当て使用した。次の表１は、実験群の設定及び投薬濃度を示したものである。

２×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で製造したｓａｒｃｏｍａ１８０細胞浮游液を正常群を除いた全ての群の片方の鼠蹊部に皮下注射で移植して固形癌を誘発させた。本発明の組成物をそれぞれ低容量（１６．６μｌ／体重ｋｇ）、中間容量（８３．３μｌ／体重ｋｇ）、高容量（１６６．６μｌ／体重ｋｇ）に設定して、腹水癌を誘発した直後から３日の間隔で６週間投薬しながら癌細胞株の着床及び分化に及ぼす影響を評価し、シスプラチンと比べた。

抗癌の指標としては、実験修了日、剖検を通じてｓａｒｃｏｍａ１８０が安定的に成長した動物の検体数を測定し、同じ実験を２回実施して平均値を求めた。

図２は、ＩＣＲマウスにおいてｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株の分化に及ぼす本発明の組成物の効果を対照薬物と比べて示したグラフである。ここで、Ｌは本発明の組成物の低容量、Ｍは中間容量、Ｈは高容量を表し、ｃｉｓはシスプラチン、ＮとＣはそれぞれ正常群と対照群を表す。

図２からわかるように、試験修了後、剖検を通じて鼠蹊部の癌細胞の有無を確認した結果、本発明の組成物の低容量群は９．５匹、中間容量群及び高容量群はそれぞれ７．５匹から腫瘍が発見され、対照薬物であるシスプラチンでは４．５匹から腫瘍細胞が観察された。

即ち、本発明による組成物は、癌細胞分化に対する抑制効果が対照群に比べては多少増えたものの、シスプラチンと同等以上の効果は得られなかった。このように、本発明の組成物がｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性が互いに違う理由は、ヒドロキシクロロキンが常温で不溶性であることによる薬物の制限的な拡散距離の影響のためと推定される。

効果試験例３．固形癌に対する抗癌効果

ＩＣＲマウスにおいて本発明の組成物の抗癌力観察のために、ｓａｒｃｏｍａ１８０を接種して固形癌を誘発した後、ｓａｒｃｏｍａ１８０の死滅に及ぼす影響を評価した。

飼育施設に慣れた動物を次の表２のように計４つの群（Ｇ１〜Ｇ４）に分けて、各群当り１０匹の動物を割り当て使用した。次の表２は、実験群の設定及び投薬濃度を示したものである。

２×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で製造したｓａｒｃｏｍａ１８０細胞浮游液を全ての群の片方の鼠蹊部に皮下注射で移植して固形癌を誘発させた。本発明の組成物をそれぞれ表２の濃度に設定し、癌細胞株を移植し１週間後から週２回３日の間隔で６週間投薬しながら固形癌の誘発の程度を観察した。

抗癌の指標としては、実験修了日、剖検を通じた肉眼的な観察と腫瘍の平均重さを測定した。

図３はＩＣＲマウスにおいてｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株固形癌の成長に及ぼす本発明の組成物の効果を示したグラフである。ここで、Ｇ１は対照群、Ｇ２は本発明の組成物（２０％）を８３μｌ／体重ｋｇ、Ｇ３は１６６μｌ／体重ｋｇ、そしてＧ４は４１５μｌ／体重ｋｇの量で投与した場合である。

実験結果、薬物を投与しなかった対照群の場合、平均腫瘍細胞の重さは４．８１±１．６９ｇであった反面、本発明の組成物（２０％）の投与群においてＧ２群の場合は、４．１６±１．６８ｇ、Ｇ３群は３．９２±１．００ｇ、Ｇ４群は３．３１±０．７２ｇと容量依存的に固形癌の重さが減少することが分かった。

効果試験例４．腹水癌に対する抗癌効果の観察

Ｓａｒｃｏｍａ１８０の細胞株移植により腹水癌が誘発されたマウスにおいて本発明の組成物の抗癌効果及び寿命延長に及ぼす影響を評価した。

飼育施設に慣れた動物を次の表３のように計３つの群（Ｇ１〜Ｇ３）に分けて、各群当り１０匹の動物を割り当て使用した。次の表３は、実験群の設定及び投薬濃度を示したものである。

２×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で製造したｓａｒｃｏｍａ１８０細胞浮游液を全ての群の腹腔のうちに接種して腹水癌を誘発させた。本発明の組成物をそれぞれ表３の濃度に設定して、腹水癌誘発後から３日の間隔で６週間投薬しながら死亡動物の推移を観察し、シスプラチンと比べた。

図４は、ＩＣＲマウスにおいてｓａｒｃｏｍａ１８０細胞株の腹水癌誘発後、本発明の組成物の寿命延長に及ぼす効果を示したグラフである。ここで、Ｇ１は対照群、Ｇ２は本発明の組成物（２０％）を１６６μｌ／体重ｋｇ、Ｇ３は８３０μｌ／体重ｋｇの量で投与した場合である。

実験修了日の４２日まで腹水癌による死亡率をみると、対照群の場合、試験開始後、９日目から死亡する動物が現れ始め、２１日目には半数くらいが死亡し、４２日目には１匹が生き残ったが、これは腹水癌が誘発されなかったか、誘発程度が弱い動物であると判断される。Ｇ２群では、対照群より少し遅い１３日目に死亡動物が現れ始め、２６日目に半数が死亡したが、試験修了日に３匹が生存した。反面、Ｇ３群では薬物投与の開始日に全ての動物が死亡した。即ち、発明の組成物は腹水癌に対する寿命延長に寄与するが分かった。

本発明によるヒドロキシクロロキンを含む局所投与用注射剤組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＴＴ ａｓｓａｙを通じたｓａｒｃｏｍａ１８０に対するＩＣ_５０値がシスプラチンに比べて１０倍程度低い値をみせ、優れた細胞毒性効果を有し、またｉｎ ｖｉｖｏでもｓａｒｃｏｍａ１８０により誘発された固形癌に対して容量依存的な効果を奏するだけでなく、ｓａｒｃｏｍａ１８０により誘発された腹水癌に対して寿命延長の効果がある。

Claims (7)

1. ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）またはその塩を含む抗癌治療のための局所投与用注射剤組成物。
2. 癌細胞に直接注射または注入することを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤の組成物。
3. ヒドロキシクロロキンの塩が硫酸塩であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗癌剤の組成物。
4. ヒドロキシクロロキンが５〜２５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗癌剤の組成物。
5. ヒドロキシクロロキンが２０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項４に記載の抗癌剤の組成物。
6. 局所麻酔剤及び抗酸化剤を追加で含むことを特徴とする請求項１または２に記載の抗癌剤の組成物。
7. 局所麻酔剤としてリドカインを１〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で含み、抗酸化剤としてリボフラビンを０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で含むことを特徴とする請求項６に記載の抗癌剤の組成物。