EA030986B1

EA030986B1 - Применение экстракта cynara spp.

Info

Publication number: EA030986B1
Application number: EA201592037A
Authority: EA
Inventors: Валентино Меркати
Original assignee: Абока С.П.А. Сосиета' Агрикола
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2018-10-31
Also published as: ITRM20130312A1; CN105307666A; AU2014272656B2; US20160120923A1; EP3003336A1; MX2015016270A; JP2016521689A; US10383905B2; CA2913709A1; EA201592037A1; AU2014272656A1; WO2014191954A1; HK1223282A1

Abstract

Изобретение относится к применению экстракта Cynara spp., а также композиции и набора, которые включают указанный экстракт, для профилактики и/или лечения патологического состояния, характеризующегося конститутивной активацией фактора транскрипции STAT3.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к применению экстракта Cynara spp. и композиции и набора, содержащих указанный экстракт, в профилактики и/или лечении патологического состояния, характеризующегося конститутивной активацией фактора транскрипции STAT3.

Предпосылки создания изобретения

В последние десятилетия в литературе появились сообщения о фундаментальной роли факторов транскрипции семейства STAT в широком наборе патологий, таких как воспалительные патологии, промотирующие опухоли, и воспаления в самих опухолях. Белки STAT являются цитоплазматическими факторами транскрипции, в которых фосфорилирование/активация (на специфических остатках серина и/или тирозина в результате действия семейства JAK, или Янус-киназных белков) определяют димеризацию двух мономеров STAT, транслокацию димера в ядра, построение элементов ДНК в STATспецифических целевых генах и индукцию генной транскрипции. Семейство STAT факторов состоит из семи членов (закодированных генами STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B и STAT6) с различными биологическими функциями, которые включают роли дифференциации, пролиферации, развития, апоптоза и воспаления клеток. Одной из характеристик белков, кодированных этими генами, является тот факт, что они играют двоякую роль, более конкретно роль трансдукции сигнала в цитоплазму и фактора транскрипции в ядра. В частности конститутивная активация STAT3 и в меньшей степени STAT5 была связана в различных неоплазмах с регулированием некоторых внутриклеточных маршрутов, включая определяющие выживаемость и пролиферацию клеток опухоли, но также в процессы ангиогенеза и метастазирования самой опухоли.

В обзоре Yu H. и др., опубликованном в Nature, 2009 (Nature Reviews Cancer 9, 798-809: 2009), показано, что постоянная активация STAT3 индуцирует воспаление, которое промотирует рак, и регулирует гены, существенные для воспаления и микроокружения опухоли. Гены, активированные STAT3, показаны в табл. 1 и 2 указанной работы, и также описаны некоторые ингибиторы активации STAT3 из природных веществ, таких как куркубитацин, ресвератрол, гальеллалактон и индирубин, однако указано, что механизм действия этих веществ не известен.

Во всяком случае в этой работе утверждается, что модулирование STAT3 представляет собой новый, более эффективный и многообещающий подход к лечению рака и сообщается, что удаление гена STAT3 в разных моделях опухоли приводило к ингибированию роста опухоли.

Конститутивная активация STAT3 была описана для большого числа опухолей, включая рак молочной железы, рак предстательной железы, чешуйчатую карциному головы и шеи, множественную миелому, лимфому и лейкемию, опухоли мозга, рак кишечника, саркому Эвинга, рак желудка, рак пищевода, рак носоглотки и рак поджелудочной железы (см. табл. 1 ниже). Для многих типов рака высокий уровень активированного STAT3 был связан с неблагоприятным прогнозом. Активация STAT3 блокирует апоптоз и увеличивает пролиферацию клеток и их выживаемость, промотируя ангиогенез и метастазирование и ингибируя противоопухолевый иммунный ответ. Линии клеток опухоли, в которых конститутивно активируется STAT3, требуют постоянной активации STAT3, фенотип, описанный как «зависимость от онкогенов» (Johnston PA and Grandis RG, Mollnterv; 11 (1); 18-26:2011).

Злокачественная множественная мезотелиома (МРМ) является агрессивной опухолью, образующейся из мезотелиальных клеток в полостях грудной клетки, и несмотря на химиотерапию (часто с использованием пеметрекседа), увеличивает время жизни пациентов с неоперабельной МРМ, так что среднее общее время жизни достигает 12 месяцев. Недавно было установлено, что потенциальной молекулярной терапевтической мишенью для МРМ является механизм сигнала от интерлейкина-6 (IL6)/JAK/STAT3, активированного высоким уровнем IL-6, присутствующегося в плевральной жидкости пациента с МРМ. Связывание IL-6 с его рецептором вызывает конформационное изменение в рецепторе, что инициирует активацию JAK, которая в свою очередь инициирует димеризацию фактора транскрипции STAT3, и димер STAT3 транслоцируется в ядра, что определяет инициирование трансактивации различных таргетных генов.

Этот механизм является ключевым для гематопоэза, иммунного ответа и онкогенеза. Кроме того, было показано, что дисфункция системы JAK/STAT3 обуславливает развитие рака.

В литературе сообщалось, что контакт с асбестом вызывает мезотелиому.

Согласно ожиданиям, частота проявления мезотелиомы в развитых странах будет возрастать в ближайшие 15 лет, и некоторые проекты прогнозируют ежегодное удвоение случаев hMPM в период с 1998 до 2018 г. Также ожидается резкое увеличение мезотелиомы в третьем мире, особенно в Индии, где использование асбеста продолжает расти экспоненциально без необходимых предосторожностей. В настоящий момент случаи мезотелиомы приводят к смерти примерно 3000 пациентов в год в США и примерно 5000 в Европе. Несмотря на программы исключения асбеста, частота возникновения мезотелиомы заметно не изменилась за последние 20 лет, и расчеты показывают, что в последующие 25 лет его использование в европейских странах будет расти на 5-10% в год.

По данным WHO, примерно 125 миллионов людей имеют контакт с асбестом в мире.

Ожидается, что в Соединенных Штатах общее прогнозируемое число случаев мезотелиомы у мужского населения в течение 50 лет составит 71000.

- 1 030986

В Европе, где годами запрещалось использование асбеста в промышленности, по данным первого анализа, прогнозируется, что число смертей от мезотелиомы у мужского населения будет расти и достигнет максимума примерно к 2020 г., а по последним расчетам даже к 2015 г. (учитывая, что средний латентный период составляет 44.6 лет.

Годовые показатели заболевания варьируются в зависимости от страны, однако можно предположить, что на развивающихся рынках число таких случаев будет резко возрастать из-за отсутствия регулирования добычи асбеста и расширенного использования асбеста в промышленности и домашнем хозяйстве.

Обычно hMPM делят на 4 подгруппы, и были названы различные прогностические факторы. Современная терапия включает хирургию, облучение, химиотерапию и мультимодальную терапию, но до сих пор она не принесла обнадеживающих результатов. Мезотелиома очень редко дает возможность радикальной хирургической операции и, по многочисленным литературным данным, она устойчива к химиотерапии и радиационной терапии. Продолжительность жизни с момента постановки диагноза составляет 8-18 месяцев.

Кроме того, в литературе присутствует подробное описание роли STAT3 в развитии и прогрессировании опухоли. Конститутивная активация STAT3 наблюдалась при раке крови (множественная миелома, лейкемия, лимфома) и при твердых опухолях (меланомы, карциномы яичников, предстательной железы и клеток почек, аденокарциномы поджелудочной железы, рака легких и рака мозга); табл. 3 ниже из работы Turkson J and Jove R, Oncogene; 19(56); 6613-26: 2000, более подробно показывает многие опухоли, напрямую связанные с аномальной активацией STAT3. В частности, аномальная активация повидимому вызывается действием трансформирующих тироксинкиназ, таких как v-Src, v-Ros, v-Fps, Etk/BMX и Lck, или аномального сигнала, индуцированного автокринным или паракринным высвобождением цитокинов. Конститутивная активация STAT3 ведет к большей экспрессии генов, кодирующих ингибиторы апоптоза (например, Bcl-xL, Mcl-1), регуляторов клеточного цикла (например, циклин D1/D2, с Мус) и индукторов ангиогенеза (например, VEGF: фактор васкулярного эндотелиального роста). Наконец, недавно было показано, что, помимо ключевой роли в образовании опухолей, конститутивная активация этого фактора транскрипции обеспечивает противодействие смертельной опасности, вызываемой химиотерапевтическими препаратами (Aggarwal В. В. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1091; 15169:2006).

Многие клинические исследования показали, что in vivo твердые опухоли растут и развиваются в среде с низкими концентрациями O₂, что делает сами опухоли нечувствительными к сигналам гибели клеток и устойчивыми к лечению радиотерапией и химиотерапией; с другой стороны, гипоксия промотирует способность к ангиогенезу, пролиферации и метастазированию. Агрессивность опухоли в этом контексте по-видимому связана с активацией и стабилизацией фактора HIF-1a как в результате гипоксии, так и гиперактивации STAT3.

По этой причине очень желательна противораковая терапия на основе таргетирования фактора STAT3 (Niu G. et al. Mol Cancer Res, 6 (7); 1099-105: 2008).

Приведенная табл. 1 взята из работы Aggarwal В. В. и др. 2006 и показывает список опухолей, которые экспрессируют конститутивно активный STAT3, активаторы STAT3, гены, регулируемые STAT3, и ингибиторы STAT3.

Таблица 1

Конститутивный STAT3	Активаторы	Гены	Киназы	ингибиторы
Гематопоэтические	EGF	Антиапоптоз	Нерецепторные	Синтетические
опухоли		BcI-Xl	тирозин киназы	AG4S0
-Множественная миелома	IL-6	Bcl-2	JAK	Салицилат натрия
-HTLV-1-зависимая	IL-5	МсИ	JAK2	Атипримод
лейкемия		clAP-2	JAK3	BMS-354B25
-CLL	IL-9	Сурвивин	TYK2	Этанол
-CML	IL-10		Src	Нелфинавир
-AML	IL-12	Прогрессия		FS-341
-Лейкоз из больших	IL-22	клеточного цикла	Рецепторные	R115777
зернистых лимфоцитов	TNF-a	Cyciin οι	тирозинкиназы	WP-1034
Эритролейкемия	МСР-1	с-Мус	EGFR	Соединения
-Попицитем и я-ве ра	GCSF	c-Fos	ЕгЬВ-2	платины
•Связанная с EBV лимфома	GMCSF	р21	Gp130	15-Деокси-дельта
Буркитта	CSF		Grf>2	12.14-PGJ2

- 2 030986

Констмтутивный STAT3	Активаторы	Гены	Киназы	ингибиторы
-Фунгоидный микоз	LIF	Инвазия в опухоль и		UCN-01
-Кояная Т-клеточная	OSM	метастаз	Серинкиназы	Статин
лимфома	IFN-V	ММР-2	JNK
-HSV saimiri-зависимая (Т	М1Р-1а	ММР-9	P3SMAPK	Пептиды
клетки)	RANTES	β-катенин	ER К	SOCS3
•Болезнь Ходжкина	SLF	VEGF		PIAS
-Анапластическая лимфома	UVB	hTERT	Тирозин	GRIM-19
	Осмотический	IRF-1	фосфатаза	Адипонектин
Твердые опухоли	шок	NLK	SHP2	Дуплин
•Рак молочной железы	Прогестин	MyD88		SSI-1
-Опухоль мозга	IPS	RANKL		а-Тромбин
-Карцинома кишечника	Tobacco	TNF		Липоксин А4
-Саркома Эвинга	HCV	β-макроглобупин		DIF-1
•Карцинома желудка		SOCS		РТРеС
-Рак легких		Ангиотензиноген		STAT3-DN
-Рак носоглотки		Антихимотрипсин		Пептид-ловушка
-Карцинома яичников •Аденокарцинома				Природные
поджелудочной железы				Флавопиридол
-Карцинома				Индирубин
предстательной железы				Магнолол
-Почечно-клеточная				Ресвератрол
карцинома				Пикеатаннол
-Рак SCCHN				Партенолид EGCG Куркумин Кукурбитацин
				Другие Ритуксимаб GQ-ODN Ретиноевая кислота STA-21 ЕКВ569

Пояснения: STAT - трансдуктор сигнала и активатор транскрипции; CLL - хроническая лимфоцитарная лейкемия; CML - хроническая миелоидная лейкемия; AML - острая миелогенная лейкемия; SCCHN плоскоклеточная карцинома на голове и шее; HTLV - человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус; EBVвирус Эпштейна-Барра; Нелфинавир - ингибитор HIV-1 протеазы; R115777 - ингибитор фарнесилтрансферазы; AG490 и пайсатаннол - ингибиторы тирозинкиназы; PIAS - ингибитор белка, активированного STAT3; GQ-ODN - G-квартетные олигонуклеотиды; SOCS - супрессор сигнала цитокина; GRIM - ген, связанный со смертностью, обусловленной ретиноидом-IFN; EGCG - эпигаллокатехин-3-галлат; SSI - ингибитор STAT, индуцированный STAT; РТРеС - фосфатаза еС тирозина белка; DN - доминантный негатив; EKb-569 - EGF-R ингибитор; DIF-1 - индуцирующий дифференциацию фактор-1; JAB - белок, содержащий домен SH2; IL интерлейкин; TNF - фактор некроза опухоли; MDA - антиген дифференциации меланомы; МСР - белокхемоаттрактант моноцитов; GCSF - фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов; LIF - фактор ингибирования лейкемии; OSM - онкостатин М; IFN - интерферон; MIP - макрофаговый белок воспаления; RANTES регулирование после активации, выделяющей нормальные Т-клетки; EGF - фактор роста эпидермиса; LPS липополисахарид; VEGF - фактор роста васкулярного эндотелия; ММР - матричная металлопротеиназа; hTERT - реверс человеческой теломеразы; SLF - стальной фактор, HCV - вирус гепатита С.

Табл. 2, взятая из работы Johnston PA and Grandis RG 2011, показывает корреляцию между STAT3 и многими опухолями, которая подтверждает тот факт, что STAT3 вызывает интерес с точки зрения эффективности противораковой терапии.

- 3 030986

Таблица 2

Характеризация опухолей с повышенной экспрессией STAT3 и активность	Корреляция небла го п риятн ого прогноза и высокой концентрации ЗТАТЗ	Аномальные восходящий и нисходящий потоки сигнала STAT3	Модели ксенотрансплантации, ответственной за ингибирование STAT3
-Лейкемия -Лимфома -Множественная миелома -Рак молочной железы -Карцинома предстательной железы -Рак легких -Рак легких (немалые клетки) -Карцинома клеток почек -Гепатоцеллюлярная карцинома -Холангиокарцинома -Карцинома яичников -Аденокарцинома поджелудочной железы •Меланома • Плоскоклеточная карцинома головы и шеи	-Карцинома клеток почек -Рак толстой кишки - Карцинома яичников -Карцинома желудка - Аденокарцинома желудка интестинального типа - Плоскоклеточная карцинома шейки матки -Остеосаркома -Эпителиальная карцинома яичника	-Повышенная экспрессия EGFR -Конститутивно активированный EGFR-RTK -Свехэкспрессия SFK -Гиперактивированный JAK -Повышенные уровни TNF-a/IL-6	- Плоскоклеточная карцинома головы и шеи -Глиобластома Миелопролиферативные неоплазмы • Карцинома клеток почек -Рак молочной железы -Аденокарцинома легких -Острая лимфобластная лейкемия

В табл. 3, взятой из работы Turkson J and Jove R 2000, приведены многие опухоли, связанные непосредственно с аномальной активацией STAT3.

- 4 030986

Таблица 3

Типы опухолей	активированные STATs	Ссылки
Опухоли молочной железы	STAT 1,3	(Garcia et al., 2000; Watson and Miller, 1995) (J Bromberg and JE Darnell, неопубликованные результаты; P Chaturvedi and EP Reddy, неопубликованные результаты; R Garcia, C Muro-Cacho, S Minton, C Cox, N Ku, R Falcone, T Bowman and R Jove, неопубликованные результаты)
Клетки	STAT3	(Garcia et al., 1997; Sartor et al., 1997)
Опухоли шеи и головы Линии клеток и опухоли	STAT 1,3	(Grandis et al., 1998, 2000a)
Злокачественные меланомы Линии клеток и опухоли	STAT 1,3	(Florenes et al., 1999; Kirkwood et al., 1999: Pansky et al., 2000)
Pituitary tumours Линии клеток	STAT 1	(Ray etal., 1998)
Опухоли мозга (первичные опухоли)
Глиомы	STAT 1,3	(Cattaneo et al., 1998)
Медуллобластомы	STAT3	(Cattaneo et al., 1998)
Менингоматозы мозга	STAT 1,3.5	(Magrassi et al., 1999; Schrell et al., 1998)
Множественные миеломы Линии клеток и опухоли	STAT 1,	(Catlett-Falcone et al., 1999b)
Лимфома (линии клеток и опухоли)
Большая анапластическая лимфома Т-клеток	STAT 3, 5	(Zhang et al., 1996c)
Синдром Сезари	STAT 3, 5	(Zhang et al., 1996c)
Связанная с EBV HSV лимфома Беркитта	STAT3	(Weber-Nordt e1 al.. 1996)
Саймири-зависимая HSV (Т-клетки)	STAT3	(Lund etal., 1997b, 1999)
Т-клеточная кожная лимфома	STAT3	(Sun etal., 1998)
LSTRA Т-клеточная лимфома (мышь)	STAT 5	(Yu etal., 1997)
Фунгоидные микозы	STAT3	(Nielsen etal., 1997)
HTLV-I зависимые	STAT 3, 5	(Migone et al., 1995; Takemoto et al., 1997)

Типы опухолей	активированные STATs	Ссылки
Хроническая лимфоцитарная лейкемия (CLL)	STAT 1, 3	(Frank etal., 1997)
Острая миелоидная лейкемия (AML)	STAT 1, 3, 5	(Chai et al., 1997; Gouilleux-Gruart et al., 1996; Weber- Nordt et al., 1996)
Мегакариоцита рная лейкемия	STAT 1, 3, 5	(Liu etal., 1999)
Лейкемия из больших зернистых лимфоцитов (LGL)	STAT3	(Epling-Bumette et al., 2000)

ДРУГИЕ ОПУХОЛИ (опухоли и линии клеток)		L Mora, R Garcia, J Seigne, T Bowman, M Huang, G Niu, J Pow-Sang, J Diaz, C Muro-Cacho, D Coppola, T Yeatman, J Cheng, S Nicosia, S Shivers, T Landowski, D Reintgen, W Dalton, H Yu and R Jove, неопубликованные результаты
Рак предстательной железы	STAT3
Карцинома клеток почек	STAT3
Карцинома яичника	STAT3
Меланома	STAT3

- 5 030986

Конкретно, в отношении STAT3 во многих публикациях было показано следующее:

1) STAT3 часто является конститутивно активным (фосфорилированным) в клетках многих видов рака человека, таких как множественная миелома, лимфома, лейкемия, рак легких, рак предстательной железы, в клетках плоскоклеточной карциномы головы и шеи и других типов опухолей.

2) STAT3 активируется факторами роста (например, EGF, TGF-α, IL-6, IL-10, IL-23, IL-21, IL-11, HGF), киназными канцерогенами (например, Src).

3) STAT3 участвует в пролиферации генов (например, c-myc, cyclin D1), генов супрессоров апоптоза (например, Bcl-XL и сурвивин), цитокин-кодирующих генов и генов, промотирующих ангиогенез (например, VEGF), увеличивая, будучи активированным, пролиферацию клеток и ингибирование апоптоза.

4) Активация STAT3 также коррелирует с явлениями резистентности к химическому воздействию и резистентности к облучению.

5) Постоянная активация STAT3 увеличивает в случае различных опухолей человека пролиферацию, выживаемость, ангиогенез и метастазирование, а также ингибирует противоопухолевый иммунитет.

Известно также, что хроническое воспаление в некоторых органах или в определенных местах промотирует злокачественное перерождение и STAT3 играет решающую роль во внешних и внутренних механизмах воспаления, которые ведут к раку, причем известно, что STAT3 фактически управляет характеристиками злокачественности, связанными с хроническим воспалением.

Из-за решающей роли STAT3 в образовании опухолей ингибиторы STAT3 обладают огромным потенциалом в профилактике и лечении рака. Вероятно, одним из самых известных ингибиторов активации STAT3 является AG490, который ингибирует активацию JAK2. Другие ингибиторы STAT3 включают малые пептиды, олигонуклеотиды и малые молекулы. Некоторые авторы идентифицировали пептиды, которые блокируют фосфорилирование/активацию STAT3, причем существует механизм, который включает участие в связывании с ДНК и активность в регулировании генов, а также превращениях клеток. Малые молекулы, которые блокируют STAT3, представляют собой PGJ2, комплексы платины, этанол, салицилат натрия, ретиноевую кислота, атипримод, PS-341 и статины. Было установлено, что многие растения, содержащие полифенолы, способны подавлять активацию STAT3. Они включают куркумин, ресвератрол, кукурбитацин, пикеатаннол, партенолид, флазопиридол, магнолол и эпигаллокатехин3-галлат. Механизм подавления активации STAT3 этими молекулами не вполне ясен. Например, куркумин проявляет эффект ингибирования JAK2, Src, Erb2 и EGFR, которые участвуют в активации STAT3, и также снижает регулирование экспрессии Bcl-xL, циклин D1, VEGF и TNF, экспрессия которых регулируется STAT3 (Aggarwal В. В. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1091; 151-69: 2006).

Таким образом, существуют различные стратегии и различные механизмы, создающие возможность внедрения в каскад сигналов от STAT3: ингибирование фосфорилирования/активации STAT3, ингибирование межмолекулярных взаимодействий с участием STAT3, ингибирование импорта/экспорта STAT3 в ядра, ингибирование транскрипции с участием STAT3. Кроме уже указанных химиотерапевтических препаратов, ингибирующих STAT3, существуют также другие (цетуксимаб, гефитиниб, эрлотиниб и т.п.), для которых ранее были получены различные результаты: умеренная эффективность, развитие резистентности, миелосуппрессия, токсичность для желудочно-кишечного тракта и различные побочные эффекты, включая токсичность для сердечно-сосудистой системы (см. табл. 4).

В табл. 4, взятой из работы Johnston PA and Grandis RG 2011, указаны стратегии и результаты терапевтической интервенции в сигнал от STAT3.

- 6 030986

Таблица 4

Стратегия	Таргет	Примеры	Результаты
Ингибирование фосфорилирова кия/ активации STAT3	Состязательность EGFR Активность TKR Активность JAK Активность SFK	Цетуксимаб, панитумумаб, гефитиниб, эрлотиниб, лапатиниб, AG490, LS-104, ICNB1324, СЕР-701, дазатиниб, AZD0530, базутиниб	Умеренная эффективность, развитие резистентности; миелосуппрессия; токсичность для жедуд оч н о-к и шеч н о го тракта (GI) и побочные эффе кт ы; се л екти в н ост ь киназ, селективность к киназам и токсичность для сердечнососудистой системы
Ингибирование межмолекулярных взаимодействий с участием STAT3	SH-2 домены STAT3	Обозначенные олигопептиды из EGFR, др130, и другие рецептоы или пептиды, содержащие ρΥ; октамериые пептиды, квартет G олигонуклеотидов; малые молекулы, моделирующие пептиды	Слабая проницаемость клеток и эффективность; слабая метаболическая стабильность; слабая селективность по специфическим SH2 доменам; возможные побочные события
Ингибирование импорта/экспорта STAT3 в ядра	Импорт α3,ο5,α7 импорт β Экспорт 1	Кариостатин 1А (неустновленное влияние на STAT3), лептомицин В и ратьядон А	Многокомпонентная природа ядерной поры и не полностью определенная транслокация; проблемная специфичность транслокации белков
Ингибирование транскрипции с участием STAT3	Неспецифическое	dsODNdecoy; октамерные пептиды	Слабая проницаемость клеток без эффективных и специфических систем распределения; слабая метаболическая стабильность
Природные продукты	Неспецифическое	Гугулсгерон, хонокиол, куркумин, ресвератрол, флавопиридол, кукурбитацин	Неизвестная специфичность, мощность, эффективность и механизм действия

Терапия, которая является таргетной и проводится с помощью соединений, ингибирующих конкретную таргетную молекулу более специфическим образом в популяции клеток, непосредственно участвующих в прогрессировании опухоли, представляет новую перспективу в лечении рака. Молекулы, которые регулируют пролиферацию и гибель клеток, такие как рецепторная тирозинкиназа (RTKs) для фактора роста, находятся среди лучших терапевтических препаратов этого типа. Эра таргетной терапии началась с трастузумаба, моноклонального антитела против HER2, в лечении метастатической карциномы молочной железы, и иматиниба, ингибитора BCR-ABL в хронической миелоидной лейкемии. Несмотря на первоначальный энтузиазм по поводу эффективности этого лечения, врачи вскоре столкнулись с проблемой обострения, т.к. у раковых больных почти всегда развивается резистентность к лекарствам, часто из-за активации альтернативных механизмов. Поскольку опухоли характеризуются различными механизмами и генными мишенями, которые часто разрегулированы, было бы разумнее применять комбинированную терапию, что является стандартным подходом в лечении рака, т.к. это приводит к рациональной стратегии для увеличения ответа и переносимости и уменьшения резистентности. Сейчас растет интерес к комбинированию противораковых лекарств с целью максимизации эффективности и минимизации систематической токсичности путем применения меньших доз лекарства.

Таким образом, фармакологически безопасные и эффективные терапевтические препараты, например вещества природного происхождения, которые могут блокировать конститутивную или индуцированную активацию STAT3, обладают потенциальной эффективностью в лечении рака по данным все большего числа тестов, и благодаря ингибированию фосфорилирования STAT3 путем фармакологического блокирования указанных молекул, включая Src и JAK, могут уменьшить образование опухоли, что позволяет уменьшать необходимую дозу химиотерапевтического препарата.

Кроме того, поскольку активация STAT3 также коррелирует с резистентностью к химиотерапии и радиационной терапии, ингибиторы такой активации представляют большой интерес для уменьшения этой резистентности и оптимизации эффекта химиотерапии и радиационной терапии.

Сущность изобретения

Авторы данного изобретения показали, что экстракты артишока (Супага spp.) способны селективно модулировать, точнее ингибировать, фосфорилирование белка STAT3, что приводит к предотвращению его последующего действия в клетке в качестве фактора транскрипции. Как будет видно в экспериментальной части Заявки, авторы данного изобретения показали во многих экспериментах и на линиях различных клеток злокачественной плевральной мезотелиомы, что описанные здесь экстракты являются эффективными ингибиторами активации (фосфорилирования) STAT3 и, следовательно, демонстрируют цитотоксическое действие на линии клеток опухоли, способны ингибировать регенерацию клеток опухо

- 7 030986 ли, действуя как цитостатики, индуцируют апаптоз в клетках опухоли, оказывают аддитивный и также синергетический эффекты с различными химиотерапевтическими препаратами, что приводит к уменьшению жизнеспособности клеток опухоли по сравнению с теми, которые прошли лечение только химиотерапевтическим препаратом или только экстрактом; действуют особым образом на клетки злокачественной плевральной мезотелиомы и ^трансформированные мезотелиальные клетки.

При изучении действия таких экстрактов на фактор STAT3 авторы данного изобретения показали экспериментально, что описанные здесь экстракты Cynara spp. способны предотвращать связывание STAT3 с ДНК и, следовательно, изменение экспрессии генов, обычно активированной фосфорилированным STAT3.

Другими словами, было доказано, что указанный экстракт способен модулировать, точнее ингибировать, белок STAT3 в фосфорилированной форме, предотвращая эффективное действие указанного белка в клетках как фактора транскрипции. В частности авторы изобретения показали, что экстракт Супага spp. способен ингибировать конститутивную или аномальную активацию STAT3 и индуцировать реактивацию апоптоза в культурах клеток опухоли МРМ. Кроме того, авторы настоящего изобретения также показали, что в экспериментах на культурах клеток опухоли МРМ экстракт Супага spp. ингибирует заживление ран, т.е. фактически предотвращает инвазию клеток опухоли. Кроме того, авторы настоящего изобретения также показали в опытах по приживлению клеток опухоли у мыши, что экстракт по настоящему изобретению оказывает in vivo противоопухолевый эффект по отношению к клеткам МРМ.

Во всех вариантах настоящего изобретения МРМ можно заменять на термин hMPM.

Первым предметом настоящего изобретения поэтому является применение экстракта Супага spp. в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, которое характеризуется конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

Вторым предметом данного изобретения является применение экстракта Супага spp. в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, которое характеризуется конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, вместе с одним или несколькими химиотерапевтическими препаратами.

Третьим предметом настоящего изобретения является композиция, включающая экстракт Cynara spp. и носитель и/или разбавитель и/или эксципиент для применения в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, которое характеризуется конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

В одном варианте композиция также содержит один или несколько компонентов с антиапоптозным действием.

Четвертым предметом настоящего изобретения является применение композиции, содержащей экстракт Cynara spp. в сочетании с одним или несколькими компонентами с противоопухолевыми и/или противовоспалительными компонентами и носителем и/или разбавителем и/или эксципиентами, в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, которое характеризуется конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

Пятым предметом настоящего изобретения является применение набора для одновременного или последовательного введения экстракта Cynara spp. и одного или нескольких химиотерапевтических препаратов, содержащий одну или несколько аликвот Cynara spp. или композиции, содержащей экстракт Cynara spp. и одну или несколько отдельных аликвот одной или нескольких композиций, содержащих препарат, в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, которое характеризуется конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, в сочетании с химиотерапевтическим препаратом.

Все описанные аспекты данного изобретения могут относиться в частности к случаю, в котором указанное патологическое состояние связано с образованием злокачественной плевральной мезотелиомы или является злокачественной плевральной мезотелиомой.

Подробное описание фигур

Отметим, что на представленных фигурах экстракт Cynara spp. часто обозначен аббревиатурой АВО-1.

Фиг. 1: Ингибирование фосфорилирования STAT3, p-STAT3 (Y705):

Фиг. 1А - Вестерн-блоттинг клеточных лизатов, полученных из MSTO211H, обработанных с помощью 100 мкг/мл экстракта Cynara scolymus в течение 24 ч. Количественную оценку провели по сравнению с актином в качестве контроля.

Фиг. 1В - Гистограмма данных, полученных вестерн-блоттингом на клетках MSTO211H. p-STAT3 (фосфорилированный STAT3) показан черным, STAT3 показан серым.

Чертеж показывает, что экстракт ингибирует образование p-STAT3 по сравнению с контролем.

Фиг. 2: Вестерн-блоттинг клеточных лизатов MSTO211^ обработанных с помощью 25-50-75 мкг/мл экстракта Cynara scolymus в ряду p-STAT3 вместе с актином в качестве контроля. Фигура показывает, что экстракт ингибирует фосфорилирование STAT3 и это ингибирование зависит от дозы.

- 8 030986

Фиг. 3: Оценка анализа клоногенности (см. условия в экспериментальной части) на линиях клеток человеческой злокачественной плевральной мезотелиомы при разных дозах экстракта Cynara scolymus:

график 3а - анализ, проведенный на линии клеток человеческой мезотелиомы MSTO211n, график 3b - анализ, проведенный на линии клеток человеческой мезотелиомы NCI-H28, график 3с - анализ, проведенный на линии клеток человеческой мезотелиомы МРР-89, график 3d - анализ, проведенный на линии клеток человеческой мезотелиомы NCI-H2052.

Фиг. 4: Экстракт по данному изобретению влияет на способность образовывать колонии в трех разных линиях воспалительной опухоли (НСТ116, MDA-MB-231 E DU145) в зависимости от дозы и независимо от их изотипа:

график 4а - анализ, проведенный на линии клеток опухоли кишечника НСТ116, график 4b - анализ, проведенный на линии клеток опухоли предстательной железы DU145, график 4с - анализ, проведенный на линии клеток опухоли молочной железы MDA-MB-231.

Фиг. 5: Анализ выживаемости клеток с помощью ATPIite теста (см. условия в экспериментальной части) на линии клеток злокачественной плевральной мезотелиомы (MSTO211H, MPP-89,NCI-H28). Анализ показывает, что в различных линиях клеток мезотелиомы экстракт Cynara scolymus по изобретению ингибирует выживаемость клеток и это ингибирование зависит от дозы.

Фиг. 6: сравнение трех кривых выживаемости на фиг. 5с с кривой пролиферации (фиг. 6а MSTO211H, фиг. 6b ММР-89, фиг. 6с NCI-H28), полученной путем обработки обычных клеток мезотелиомы (НМС) экстрактом Cynara scolymus. Линии клеток злокачественной мезотелиомы (MPMs) четко указывают на противопролиферативный эффект от экстракта Cynara scolymus по сравнению с HMCs.

Фиг. 7: Анализ выживаемости клеток в линии клеток конфлюэнтной аденокарциномы предстательной железы DU-145, обработанной экстрактами артишока различной концентрации (50-600 мкг/мл) в течение разного времени обработки (24 и 48 ч) в присутствии индикаторов содержания цинаропикрина в экстракте. Конфлюентность клеток повышает концентрации конститутивно активированного STAT3, делая сами клетки весьма устойчивыми к гибели. Выживаемость анализировали с помощью анализа WST-1 (тест WST-1, см. условия в экспериментальной части). Фигура показывает, что экстракт ингибирует выживаемость клеток в зависимости от времени и дозы. Квадраты показывают тенденцию за 24 ч и кружки показывают тенденцию за 48 ч при различных концентрациях экстракта от 0 до 600 мкг/мл (100, 200, 300, 400, 500, 600 мкг/мл) и соответствующее содержание цинаропикрина, выраженное как в мкг/мл, так и мкМ,.

Клетки с высоким уровнем активации STAT3: полученные результаты показывают, что экстракт ингибирует выживаемость клеток при EC₅₀= 380 мкг/мл за 24 часа и EC₅₀= 100 мкг/мл за 48 ч.

Фиг. 8. Анализ выживаемости клеток в линии клеток конфлюэнтной аденокарциномы предстательной железы DU-145, обработанной цинаропикрином в разных концентрациях (0-70 мкм), для разных времен обработки (24 или 48 ч). Конфлюентность повышает концентрации конститутивно активированного STAT3, делая сами клетки весьма устойчивыми к гибели. Выживаемость анализировали с помощью анализа WST-1 (тест WST-1, см. условия в экспериментальной части). Фигура показывает, что цинаропикрин ингибирует выживаемость клеток в зависимости от времени и дозы. Квадраты показывают тенденцию за 24 ч и треугольники показывают тенденцию за 48 ч при различных концентрациях: 10, 20, 30, 40, 50, 60 мкМ цинаропикрина.

Представленные данные показывают, что цинаропикрин менее эффективен, чем экстракт артишока. Фигура показывает, что цинаропикрин ингибирует выживаемость и пролиферацию клеток в зависимости от времени и дозы гораздо менее эффективно по сравнению с экстрактом артишока (см. фиг. 8 для сравнения). Например, когда цинаропикрин содержится в лиофилизированном экстракте, для получения эффекта понижения выживаемости примерно на 90% необходима обработка с помощью 50 мкМ в течение 48 ч по сравнению с обработкой при 0.94-2.82 мкМ.

Фиг. 9. Анализ выживаемости клеток в линии неконфлюэнтных клеток DU-145, при низких концентрациях конститутивно активированного STAT3, обработанного экстрактом артишока в разных концентрациях и в течение разных времен обработки (24-48-72 ч). Выживаемость анализировали с помощью анализа WST-1 (тест WST-1, см. условия в экспериментальной части). Кружки означают обработку с помощью 50 мкг/мл Cynara scolymus, квадраты означают обработку с помощью 100 мкг/мл и треугольники с помощью 200 мкг/мл. Фигура показывает, что выживаемость клеток в линии клеток DU145 сильно снижается в присутствии Cynara scolymus 200 мкг/мл. Полученные результаты показывают, что 200 мкг/мл экстракта ингибируют выживаемость клеток на 60% за 24 ч. Как видно из сравнения с фиг. 8 в отношении экспериментов с высокими уровнями активации STAT3, величина EC₅₀ в этом эксперименте значительно ниже (примерно 200 против 380 мкг/мл за 24 ч), что указывает на большую эффективность экстракта по изобретению в клетках с низким уровнем активации STAT3 (неконфлюентный). Эти эксперименты таким образом подтверждают, что клетки, в которых STAT3 активен, обладают большей степенью злокачественности. Ингибирование фосфорилирования STAT3 является первыми механизмом понижения выживаемости клеток.

Фиг. 10: Анализ выживаемости клеток (анализ ATPIite) после обработки экстрактом артишока вместе с пеметрекседом (РМТХ) на линиях клеток мезотелиомы МРМ (фиг. 11а MSTO211H и фиг. 11b NCI

- 9 030986

H2052) и трансформированных на клетках мезотелиомы (фиг. 11c HMC). Обработка с помощью РМТХ является цитотоксичной для клеток МРМ и высокотоксичной для неопухолевых клеток. Совместная обработка клеток экстрактом по изобретению +РМТХ сильно повлияла на выживаемость клеток в линиях клеток МРМ и уменьшила вызванную пеметрекседом летальность в нетрансформированных клетках (НСМ). Таким образом, ясно, что экстракт артишока по изобретению делает чувствительными к пеметрекседу только клетки опухоли.

Фиг. 11 Анализ выживаемости клеток WST-1 после обработки экстрактом артишока вместе с различными химиотерапевтическими препаратами: доксорубицином, таксолом, цисплатином (см. условия в экспериментальной части) на линии клеток человеческой опухоли предстательной железы DU145. Выживаемость анализировали с помощью анализа WST-1 (тест WST-1, см. условия в экспериментальной части). Фиг. 11 показывает выживаемость клеток после обработки в течение 24 ч двумя разными дозами экстракта артишока (100 и 200 мкг/мл), только цисплатином при 10 мкг/мл, а также экстрактом артишока (100 и 200 мкг/мл) вместе с цисплатином при 10 мкг/мл.

Фиг. 11b показывает выживаемость клеток на линиях клеток карциномы человека DU145 после 24часовой обработки двумя дозами экстракта артишока (100 и 200 мкг/мл), доксорубицином при 1 мкг/мл и экстрактом артишока (100 и 200 мкг/мл) вместе в доксорубицином при 1 мкг/мл.

Фиг. 11с показывает выживаемость клеток карциномы человека DU145 после обработки в течение 24 ч двумя разными дозами экстракта артишока (100 и 200 мкг/мл), таксолом 300 нМ, а также экстрактом артишока (100 и 200 мкг/мл) вместе с таксолом 300 нМ.

Во всех экспериментах экстракт, составляющий основу изобретения, повышает цитотоксичность трех химиотерапевтических препаратов с наибольшей эффективностью в случае цисплатина.

Фиг. 12. Анализ выживаемости клеток карциномы человека DU145 после обработки комбинацией экстракта артишока и цисплатина (см. условия в экспериментальной части). Фигура показывает сравнение обработок экстрактом артишока (черный), цисплатином (светло-серый) и артишоком + цисплатином (белый) при разных концентрациях экстракта артишока и при фиксированной концентрации цисплатина 15 мкг/мл.

Относительные концентрации цинаропикрина приведены на фигуре.

Экстракт, составляющий основу изобретения, повышает цитотоксичность цисплатина с наибольшим эффектом при дозе 200 мкг/мл.

Фиг. 13. Анализ выживаемости клеток на клетках карциномы человека DU145 после обработки комбинацией экстракта артишока и доксорубицина (см. условия в экспериментальной части). Фигура показывает сравнение обработок экстрактом артишока (черный), доксорубицином (светло-серый) и артишоком + доксорубицином (белый) при различных концентрациях экстракта артишока и фиксированной концентрации доксорубицина 2 мкг/мл.

Относительные концентрации цинаропикрина такие же, как на фиг. 13.

Экстракт, составляющий основу данного изобретения, повышает цитотоксичность доксорубицина с наибольшим эффектом при дозе 200 мкг/мл.

Фиг. 14. Анализ выживаемости клеток карциномы человека DU145 после обработки комбинацией цинаропикрина и цисплатина (см. условия в экспериментальной части). Фигура показывает сравнение обработок цинаропикрином (черный), цисплатином (светло-серый) и цинаропикрином + цисплатином (белый) при различных концентрациях цинаропикрина и фиксированной концентрации цисплатина 15 мкг/мл.

Оказалось, что для получения эффекта уменьшения выживаемости клеток до значения менее 20% необходима в 40 раз более высокая молярная концентрация цинаропикрина, чем молярная концентрация в экстракте артишока (см. фиг. 12).

Фиг. 15. Анализ выживаемости клеток карциномы человека DU145 после обработки комбинацией цинаропикрина и доксорубицина (см. условия в экспериментальной части).). Фигура показывает сравнение обработки цинаропикрином (черный), доксорубицином (светло-серый) и цинаропикрином + доксорубицином (белый) при различных концентрациях цинаропикрина и фиксированной концентрации доксорубицина 2 мкг/мл.

Оказалось, что для достижения уменьшения выживаемости клеток до значения ниже 20%, необходима примерно в 25 раз более высокая молярная концентрация цинаропикрина, чем молярная концентрация в экстракте артишока (см. фиг. 13).

Фиг. 16: Анализы заживления ран на линиях клеток мезотелиомы человека MSTO221H (см. условия в Экспериментальной части).

График 16а показывает заживление ран через 36 ч в контрольных планшетах только с носителем и продуктом при концентрации 6 мкг/мл, в то время как фиг. 16b показывает гистограммы, относящиеся к эффективности закрытия раны (количественная оценка числа клеток в %), обработанной экстрактом по данному изобретению и носителем в течение указанного времени.

Фиг. 17: Экстракт Cynara Scolymus модулирует механизм действия STAT3 в клетках DU145: в частности, данная фигура показывает, что экстракт ингибирует конститутивную активацию STAT3 в клетках DU-145 и также ингибирует связывание STAT3 с ДНК.

- 10 030986

17а) Вестерн блоттинг: экстракт Cynara scolymus (200 мкг/мл) ингибирует фосфорилирование STAT3 через 2-4 ч обработки без модифицирования экспрессии белка.

17b) EMSA:

EMSA: экстракт Cynara scolymus (200 мкг/мл) ингибирует связывание STAT3 с ДНК через 2-4 ч обработки в линии клеток DU-145 (Фиг. 17b).

Фиг. 18: Экстракт Cynara Scolymus модулирует действие STAT3 в клетках KARPAS: в частности, данная фигура показывает, что экстракт ингибирует конститутивную активацию STAT3 в клетках KARPAS и также ингибирует связывание STAT3 с ДНК.

18а) Вестерн блоттинг: экстракт Cynara scolymus (200 мкг/мл) ингибирует фосфорилирование STAT3 через 2-4 ч обработки без модифицирования экспрессии белка в линии клеток KARPAS.

18b) EMSA: экстракт Cynara scolymus (200 мкг/мл) ингибирует связывание STAT3 с ДНК после 2-4 ч обработки в линии клеток KARPAS.

Использованный экстракт Cynara scolymus содержит 0.181% цинаропикрина, следовательно 200 мкг/мл экстракт содержат 1.2 мкМ цинаропикрина.

Фиг. 19: цинаропикрин модулирует действие STAT3 в клетках DU-145.

Цинаропикрин в клетках DU-145 ингибирует как фосфорилирование STAT3, так и его способность связываться с ДНК с EC₅₀ = 25 мкМ (25 мкМ цинаропикрина = примерно 0.74 мкг/мл)

Вестерн блоттинг: 25 мкМ цинаропикрина ингибируют фосфорилирование STAT3 в клетках DU145 (фиг. 19а)

EMSA: 25 мкМ цинаропикрина ингибируют связывание STAT3 с DNA в клетках DU-145 (фиг. 19b) Фиг. 20: цинаропикрин модулирует действие STAT3 в клетках KARPAS.

Цинаропикрин ингибирует в клетках KARPAS как фосфорилирование STAT3, так и его способность связываться с ДНК с EC₅₀ = 25 мкМ (25 мкМ цинаропикрина = примерно 0.74 мг/мл)

Вестерн блоттинг: цинаропикрин (25 мкМ) ингибирует фосфорилирование STAT3 в клетках DU145 (фиг. 19а)

EMSA: цинаропикрин (25 мкМ) ингибирует связывание STAT3 с DNA в клетках DU-145 (фиг. 19b).

Фиг. 21: оценка влияния экстракта Cynara scolymus на клеточный цикл (метод FACS). Экстракт индуцирует гибель клеток МРМ (MSTO211H) путем увеличения % клеток в фазе sub G1 как после обработки в течение 48 ч (фиг. 21а), так и после обработки в течение 72 ч (фиг. 21b).

Фиг. 22: Анализ оценки индукции апоптоза (метод Вестерна). Экстракт по изобретению при дозе 100 мкг/мл индуцирует апоптоз в линии клеток MSTO211H, на что указывает увеличение уровня некоторых маркеров апоптоза в виде расщепленной формы PARP и каспаз 3 и 7.

Фиг. 23 Анализ оценки индукции апоптоза путем определения концентрации аннексина V. Экстракт по изобретению индуцирует апоптоз в линии клеток MSTO211H, как показывает окрашивания аннексина V в зависимости от времени и дозы.

Фиг. 24 Анализы внутриклеточной концентрации GSH (см. условия в экспериментальной части) после обработки при различных концентрациях цинаропикрина: треугольники 12.5 мкМ, квадраты 25 мкМ, ромбики 50 мкМ.

Цинаропикрин определяет уменьшение внутриклеточной концентрации GSH в зависимости от времени и дозы.

Фиг. 25 Анализ глутатионилирования STAT3 (см. условия в экспериментальной части). Цинаропикрин определяет глутатионилирование STAT3. Пятно - Контроль; Пятно 2 - GSH 1 мМ, Пятно 3 - диамид 0.5 мМ, Пятно 4 - GSSG, Пятно 5 - цинаропикрин 12 мкМ, Пятно 6 - цинаропикрин 25 мкМ.

Данные, полученные в этом эксперименте, показывают, что цинаропикрин понижает внутриклеточную концентрацию GSH (фиг. 26) и изменение окислительно-восстановительного состояния индуцирует глутатионилирование STAT3, предотвращая его фосфорилирование (фиг. 27). Восстановление физиологических значений GSH с помощью предварительной обработки глутатионэтиловым эфиром обращает способность цинаропикрина ингибировать фосфорилирование STAT3.

Фиг. 26 и 27 относятся к анализу противоопухолевой активности экстракта артишока в линии клеток MSTO211H, проведенному на самках голых мышей CD1 возраста 6-7 недель (приживление опухоли МРМ).

Фиг. 26: Влияние артишока на приживление линии клеток МРМ.

Клетки MSTO21m были обработаны артишоком в течение 24 ч. Затем их ввели в тело голых мышей CD1. Предварительная обработка экстрактом артишока повлияла на приживление опухоли и индуцировала значительное статистическое различие (р= 0.01) в объеме опухоли.

Фиг. 27: Влияние экстракта артишока на трансплантацию клеток МРМ. Мыши CD1 с ксенотрансплантатом MSTO были обработаны возрастающими количествами экстракта артишока в течение 3 недель. Наблюдали терапевтический эффект экстракта артишока в зависимости от дозы. Пеметрексед (РМТХ) использовали для позитивного контроля при известной терапевтической концентрации. Фигура показывает эффективность экстракта по изобретению по сравнению с известной терапевтической концентрацией пеметрекеда *р<0.0.

- 11 030986

Подробное описание изобретения

Настоящая заявка относится к применению экстракта Cynara spp. в профилактике и/или лечении патологий, при которых имеет место конститутивная или аномальная активация фактора STAT3. Как показано выше, аномальная или конститутивная активация по-видимому проявляется в аномальном или конститутивном фосфорилировании этого фактора, что приводит к воспалению и/или образованию как рака крови, так и опухоли тканей.

В последующем описании, формуле и на рисунках термин STAT3 означает фактор трансдукции сигнала и активации транскрипции STAT3 (трансдуктор сигнала и активатор транскрипции 3). Обычно, когда ссылаются на ген, используют прописные курсивные буквы, в то время как белок обозначают некурсивными прописными буквами.

Из литературы известно, что воспаление и опухоли тесно связаны с онкогенными факторами и окружающей средой и фосфорилирование фактора STAT3 (трансдуктор сигнала и активатор транскрипции 3) вызывает его активацию и замещение ядер, где он действует как активатор транскрипции различных цитокинов, хемокинов и других медиаторов, связанных с воспалением, что промотирует рак.

Поэтому ингибиторы активации STAT3 являются факторами, которые предотвращают и/или лечат те патологии, в которых имеет место конститутивная активация фактора STAT3. Настоящее изобретение впервые раскрывает действие специфических для STAT3 ингибиторов - экстрактов Cynara spp. Артишок или Cynara spp. для целей настоящего изобретения означает растения, относящиеся к роду Cynara (Cynara spp.), в частности Cynara cardunculus subsp. scolymus.

Для целей реализации данного изобретения экстракт может быть экстрактом листьев и/или цветочных бутонов или их смесей либо свежих, либо высушенных.

Термин цветочные бутоны означает головки цветов растения, например самого артишока (обычно применяемого в пище). Экстракт может быть жидким или может быть лиофилизован либо высушен с помощью известных способов сушки. Экстракт можно получить путем экстракции следующими растворителями: водой, этанолом, метанолом, ацетоном или изопропанолом, в каждом случае чистыми или в смесях. Спирт может представлять собой метанол, этанол, изопропанол и предпочтительно этанол. Этанол можно использовать в чистом виде или в смеси с водой в следующих концентрациях: 96, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1%. В неограничивающем варианте изобретения спирт, применяемый для экстракции, может быть смесью этилового спирта и воды в соотношении 50:50. Жидкий экстракт можно приготовить водно-спиртовой экстракцией путем перколяции/варки листьев артишока в соотношении лекарство/растворитель от 1:2 до 1:100 и предпочтительно в соотношении 1:10. Используют такую длительность экстракции, которую используют специалисты в данной области и которая может составлять от минимум 4 до примерно 8 ч. Температуру экстракции обычно регулируют предпочтительно в области примерно 50°С. Испарение спирта из водно-спиртового экстракта и последующую сушку водного концентрата можно провести путем лиофилизации или сушки и получить лиофилизованный или сухой экстракт.

Приготовление таких экстрактов известно специалистам в данной области и не нуждается в подробном описании. В целях реализации настоящего изобретения можно использовать любой экстракт из описанных выше, приготовленный согласно традиционным методикам.

В частности для целей настоящего изобретения экстракт также может быть фракцией экстракта, как здесь описано.

В этом случае стандартная процедура включает выпаривание спирта из экстракта в 50-градусном спирте, удаление не растворимых в спирте веществ с помощью центрифугирования при 4000 об/мин в течение 1-5 мин и введение полученного водного раствора (водного концентрата) в хроматографическую колонну с адсорбционной смолой.

Указанный выше водный концентрат, в свою очередь, можно получить путем суспендирования сухого или лиофилизованного экстракта артишока в воде в соотношении 1:10 р/р.

Поток жидкости через слой смолы должен отделять твердые вещества 0.2 при 1° Bix при скорости потока от 1 до 4 об/об/ч и предпочтительно 2 об/об/ч. Соответствующий водный элюат собирают и сушат путем лиофилизации или выпаривания, причем вещества, адсорбированные на смоле, элюируют с помощью 96%-го этилового спирта, метанола или ацетона, предпочтительно 96%-го этилового спирта. В этом последнем случае спиртовой элюат выпаривают или лиофилизуют после добавки воды в соотношении 1:1 об/об спиртового элюата и испаренного спирта.

Согласно настоящему изобретению, экстракт Cynara spp., как показано выше, можно применять для профилактики и/или лечения патологий, характеризующихся конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

Такие заболевания, как отмечено в литературе, могут быть воспалительными и/или предопухолевыми и/или опухолевыми заболеваниями.

Для целей настоящего изобретения патологические состояния, характеризующиеся конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, могут быть вызваны вирусными инфекциями (как отмечено в литературе), включая инфекции Н pylori, инфекции вируса гепатита В, инфекции HPV

- 12 030986 (вирус папилломы человека), инфекции вируса Эпштейна-Барра (как показал Yu et al 2009).

Как показано выше, термин STAT3 означает фактор транскрипции человека Трансдуктор сигнала и активатор транскрипции 3, кодированный у людей геном STAT3.

Данное изобретение относится к патологическим состояниям у людей, описанным подробно в настоящей заявке (например, ниже), при которых этот ген в любом случае активируется конститутивно или аномально.

Предопухолевые патологические состояния, при которых имеет место конститутивная или аномальная активация STAT3, могут быть любыми патологическими состояниями, при которых следует удаление опухоли, и поэтому они являются предопухолевыми в том смысле, что опухоль может появиться вновь, или они могут быть патологическими состояниями, при которых происходит переход от воспаления части клеток к приобретению злокачественных свойств, как показано в литературе.

Согласно настоящему изобретению опухолевые патологические состояния могут быть любыми опухолями и характеризуются конститутивной или аномальной активацией STAT3, известной еще на предшествующем уровне техники, и это следующие заболевания: рак предстательной железы, множественная миелома, лимфома, меланома, карцинома яичников, карцинома клеток почек, аденокарцинома поджелудочной железы, рак легких, опухоль мозга, эритролейкемия, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, рак кишечника, мезотелиома (которая означает злокачественную плевральную мезотелиому МРМ).

В частности, настоящее изобретение может применяться для лечения людей, контактирующих с асбестом и поэтому подверженных риску злокачественной плевральной мезотелиомы, и для уменьшения развития мезотелиомы у таких популяций пациентов.

Более конкретно, указанная опухоль мозга может быть, например, глиомой, менингиомой мозга, медуллобластомой, а указанная лимфома может быть синдромом Сезари, связанной с EBV лимфомой Буркитта, зависимой от Samiri HSV лимфомой, кожной Т-клеточной лимфомой; указанные лейкемии могут включать HTLV-I-зависимую лейкемию, хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL), острую миелогенную лейкемию (AML), мегакариоцитарную лейкемию, лейкемию из больших зернистых лимфоцитов (LGL).

Согласно неограничивающему примеру по настоящему изобретению, описанный выше экстракт of Cynara spp. можно применять для профилактики и/или лечения любого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией STAT3, которое показано выше в табл. 1.

Термины конститутивная активация или аномальная активация согласно настоящему изобретению следует понимать в смысле значения этих терминов в литературе, относящейся к STAT3 (например, как показано в библиографии) или как постоянную активацию этого фактора, обычно отсутствующего в здоровых клетках.

Благодаря специфичности ингибирования активации и активности STAT3 с помощью экстракта по данному изобретению, экстракт по изобретению можно использовать в лечении опухолевых патологий, устойчивых к лечению химиотерапевтическими препаратами, которые не ингибируют STAT3. Неограничивающим примером химиотерапевтических препаратов, которые не ингибируют STAT3, являются химиотерапевтические лекарства от мезотелиомы, которая является опухолью с pSTAT3, конститутивно активированным и высокоустойчивым к химиотерапии. Примеры обычно применяемых препаратов включают пеметрексед, который является ингибитором тимидилатсинтазы, метотрексат, который является конкурентным и обратимым ингибитором дигидрофолатредуктазы; гемцитабин, который ингибирует синтез ДНК как лжесубстрата в биосинтетических механизмах нуклеотидов пиримидина; винорелбин, который является антимитотическим лекарством, которое связывается с мономерами тубулина, ингибируя образование микротрубок; цисплатин, который способен вмешиваться во все фазы клеточного цикла связывания с ДНК путем образования промежуточных поперечных связей в ДНК.

Приведенные ниже фигуры и экспериментальные данные, полученные на линиях клеток опухоли, в которых имеет место конститутивная активация STAT3, показывают, что экстракт Cynara spp. по данному изобретению можно с успехом сочетать с одним или несколькими противоопухолевыми препаратами, усиливая, в том числе благодаря синергии, противоопухолевую эффективность самих лекарств.

Следовательно, согласно варианту настоящего изобретения описанный здесь экстракт Cynara spp. может быть использован для профилактики и/или лечения воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, в сочетании с одним или несколькими препаратами, обладающими противоопухолевой активностью, и/или одним или несколькими препаратами, обладающими противовоспалительным действием.

Согласно одному варианту, соединение с противоопухолевой активностью может быть химиотерапевтическим препаратом, и его можно выбрать из группы, состоящей из цисплатина, доксорубицина, пеметрекседа, метотрексата, винорелбина, гемцитабина и таксола.

Таким образом, настоящее изобретение включает использование описанного здесь экстракта Cynara spp. в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими препаратами для профилактики и/или лечения опухолевого или предопухолевого патологических состяний, характеризующихся консти

- 13 030986 тутивной или аномальной активацией STAT3.

Объединение с одним или несколькими химиотерапевтическими препаратами может быть одномоментным или последовательным, либо экстракт и химиотерапевтические препараты можно вводить в одно время (в виде одного введения или раздельных введений) либо через промежуток времени в несколько минут, либо можно вводить последовательно или в разное время с промежутком более нескольких минут в течение всех суток или периода терапевтического лечения.

Режим введения будет определен лечащим врачом в соответствии с полом, возрастом, состоянием заболевания, массой и историей пациента.

Как описано выше, лечение одним препаратом и применение комбинации веществ могут быть профилактическими, например, в известных случаях инфекции, способной вызвать образование опухоли, как описано выше, или в случае удаления опухоли, с тем чтобы предотвратить повторное образование опухоли.

Экстракт по настоящему изобретению можно ввести в комбинации, которые можно использовать в тех же целях, которые описаны выше.

Поэтому настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей в качестве активного ингредиента экстракт Cynara spp. и носитель и/или разбавитель и/или эксципиент, для применения в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

Как показано выше, экстракт артишока Cynara spp. для целей настоящего изобретения является экстрактом растения, относящегося к роду Cynara (Cynara spp.), в соответствии с приведенными выше примерами и определениями.

Композиция может содержать в качестве активного ингредиента описанный выше экстракт в виде лиофилизованного экстракта, сухого экстракта или жидкого экстракта. Как показано выше, экстракт можно получить экстракцией свежих или высушенных листьев артишока или цветочных бутонов артишока или их смесей в указанных выше соотношениях. Экстракцию можно проводить путем перколяции/варки, поддерживая температуру на уровне at 50°C, а растворитель экстракции представляет собой, например, воду, 96%-й этанол, метанол, ацетон, изопропанол, чистые или в смесях. Полученный жидкий экстракт затем можно выпарить и лиофилизовать либо выпарить и получить лиофилизованный экстракт или сухой экстракт. Согласно настоящему изобретению, описанную выше композицию можно применять для профилактики и/или лечения патологий, характеризующихся конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

Такие заболевания, как отмечено в литературе, могут быть воспалительными и/или предопухолевыми и/или опухолевыми заболеваниями. Определение различных патологических состояний, для которых можно использовать композицию по изобретению, является таким же, как описанное выше в отношении терапевтического использования экстракта по данному изобретению.

Для целей настоящего изобретения композиция должна лечить патологические состояния, характеризующиеся конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, как уже описано выше, опухолевые заболевания, как уже показано выше, характеризующиеся конститутивной или аномальной активацией STAT3, предопухолевые патологические состояния, в которых имеет место конститутивная или аномальная активация STAT3, как было проиллюстрировано в объеме настоящего описания.

В соответствии с неограничивающим примером по настоящему изобретению описанную композицию можно применять для профилактики и/или лечения любого из патологических состояний, характеризующихся конститутивной или аномальной активацией STAT3, которые приведены выше в табл. 1.

Кроме того, согласно следующему варианту, композиция по данному изобретению, как здесь описано, может также включать в качестве активных ингредиентов один или несколько противоопухолевых препаратов и/или один или несколько противовоспалительных препаратов.

Поэтому настоящее изобретение также относится к композиции, включающей в качестве активных ингредиентов экстракт Cynara spp. и одно или несколько соединений с противоопухолевой и/или противовоспалительной активностью для использования в лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

Согласно этому варианту такие соединения с противоопухолевой активностью могут быть химиотерапевтическими препаратами, которые выбирают из группы, состоящей из цисплатина, доксорубицина, пеметрекседа, метотрексата, винорелбина, гемцитабина и таксола.

Композицию по данному изобретению можно приготовить в единичных дозах, устанавливаемых лечащим врачом для терапии каждого пациента.

Таким образом, настоящее изобретение включает применение композиций, содержащих Cynara spp., как здесь описано, необязательно вместе с одним или несколькими активными ингредиентами с противоопухолевой активностью и/или с одним или несколькими активными ингредиентами с противовоспалительной активностью для профилактики и/или лечения опухолевого и/или воспалительного и/или

- 14 030986 предопухолевого патологических состояний, характеризующихся конститутивной или аномальной активацией STAT3.

Объединение с одним или несколькими химиотерапевтическими препаратами может быть одномоментным или последовательным, либо экстракт и химиотерапевтические препараты можно вводить в одно время (в виде одноразового введения или раздельных введений) или через промежуток времени в несколько минут, или он может быть введен последовательно или в разное время с промежутком между ними более нескольких минут в течение всех суток или всего периода терапевтического лечения.

Такими активными ингредиентами могут быть, например, химиотерапевтические препараты, а патологические состояния могут быть предопухолевыми или опухолевыми патологическими состояниями.

Как описано выше, лечение одним лекарством и использование комбинации веществ могут быть профилактическими, например, в известных случаях инфекции, способной вызвать образование опухоли, такой, как описано выше, или в случае удаления опухоли, чтобы предотвратить ее повторное образование.

Композиция с одним или несколькими активными ингредиентами, как описано выше (экстракт Cynara spp. необязательно в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми препаратами и/или одним или несколькими противовоспалительными препаратами) может включать один или несколько эксципиентов или адъювантов, применяемых в повседневной фармацевтической или косметической практике или в пищевой промышленности. Эксципиенты могут включать разбавители, растворители, дезинтеграторы, связующие, смазки, поверхностно-активные вещества, поверхностные смазки и добавки против слипания.

При необходимости композиция может также содержать отдушки, красители, консерванты, обычно применяемые в фармацевтической, косметической и пищевой промышленности.

Композицию по данному изобретению можно приготовить согласно методикам, известным специалистам в данной области, с использованием экстракта Cynara spp., как описано выше, необязательно одного или нескольких противоопухолевых препаратов и одного или нескольких эксципиентов, относящихся к указанным выше категориям.

Композиции могут иметь вид любого препарата, известного специалистам в данной области, для перорального введения (например, порошки, гранулы, капсулы в твердом или мягком желатине, таблетки, сиропы, капли, растворы и пероральные эмульсии), для ингаляции (например, аэрозоли, жидкие или порошковые спреи), для местного введения (гели, мази, эмульсии, пасты, пены, безводные твердые формы для местного нанесения и наклейки) и для парентерального введения по методикам, известным и применяемым специалистами в настоящее время (например, для подкожного применения, внутримышечного, внутривенного или внутрикожного введения). Во всех препаратах использование технологических эксципиентов или адъювантов определяется выбором веществ на основе тех, которые широко применяются в фармацевтической практике.

Для приготовления устойчивых терапевтических препаратов препарат на основе экстракта Cynara spp вместе с препаратами, обладающими противоопухолевой активностью, или без них специалист в данной области может использовать любой эксципиент, считавшийся пригодным на предшествующем уровне техники. Например, в категории разбавителей можно использовать твердые разбавители, такие как сахара, полиспирты (например, лактозу, маннит, сорбит), целлюлоза, соли неорганических кислот (например, двухосновный фосфат кальция), соли органических кислот, включая цитраты, карбонат и бикарбонат в виде солей натрия, калия и кальция, или жидкие разбавители, такие как вода, пищевые масла для перорального использования (подсолнечное масло, оливковое масло, кукурузное масло, сладкое миндальное масло, ореховое масло) или использования в препаратах местного применения (масло жожоба, триглицериды с короткой, средней и длинной цепью), полиспирты (глицерин, пропиленгликоли, гексиленгликоль).

В категории дезинтеграторов можно использовать, например, природные или модифицированные крахмалы (кукурузный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал), кроскарамеллозу натрия, крахмал из гликолята натрия, кросповидон); возможные связующие включают природные смолы (гуаровая камедь, ксантановая камедь, гуммиарабик), сахарозу и синтетические продукты, включая поливинилпирролидон и полусинтетические производные целлюлозы.

Оказалось эффективным использовать стеариновую кислоту и ее соли, включая магниевую соль, полимеры этиленгликоля, триглицериды и природные или синтетические воски в качестве смазок.

Поверхностно-активные вещества используют для того, чтобы повысить растворимость или смываемость водой одного или нескольких активных ингредиентов, содержащихся в препаратах по данному изобретению, причем эти активные ингредиенты действуют сами по себе или вместе с одним или несколькими разбавителями. Например, можно назвать сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сорбитанполиоксиэтилена, сложные эфиры сахарозы и лаурилсульфат натрия.

Препараты для скольжения можно выбрать из коллоидного оксида кремния, осажденного оксида кремния, в то время как реагенты против слипания включают, например, тальк или крахмал.

- 15 030986

Для приготовления препаратов для инъекции можно выбирать такие эксципиенты, которые способствуют эффективному растворению или диспергированию активного вещества. Например, для обеспечения нужного значения рН и осмотического давления, необходимых при введении в виде инъекции, наряду с водой можно использовать другие водорастворимые носители типа полиспиртов и солей органических или неорганических кислот.

В отдельных случаях можно использовать не растворимые в воде носители, такие как масла или синтетические вещества, обычно применяемые для инъекций.

Специалист в данной области может приготовить все препараты, используя известные ему общие схемы приготовления.

В качестве одного примера препарат в капсулах удобно готовить путем измельчения вручную экстракта Cynara spp., смешения полученного порошка в обычном миксере с одним или несколькими противоопухолевыми препаратами и эксципиентами, выбранными для данного лекарства, например, разбавителем, дезинтегратором, смазкой и реагентом для скольжения из числа указанных выше или имеющихся на рынке, пригодных для перорального использования.

В случае таблеток бывает необходимо гранулировать некоторые или все смеси со связующим реагентом, предварительно растворенным в воде или введенным в смеси, и использовать воду в качестве адъюванта гранулирования согласно предшествующему уровню техники.

Гранулы сушат, просеивают и затем смешивают с другими порошками и получают смесь для изготовления таблеток, как это делают специалисты в данной области.

В случае парентерального применения композицию можно составить из активных ингредиентов, помещенных в отдельные контейнеры, которые удобно смешивать в соответствии с конкретными рабочими требованиями.

Для облегчения использования описанных здесь композиций их можно приготовить в виде единичных доз, содержащих один из описанных здесь активных ингредиентов (экстракт Cynara spp. и необязательно один или несколько противоопухолевых препаратов и/или один или несколько противовоспалительных препаратов), эффективных для профилактического и/или терапевтического использования в случае конкретных патологических состояний, характеризующихся конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3.

Настоящее изобретение также относится к набору для одномоментного или последовательного введения экстракта Cynara spp. и одного или нескольких соединений, обладающих противоопухолевой активностью, и/или одного или нескольких соединений, обладающих противовоспалительной активностью, для применения в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, причем указанный набор содержит одну или несколько аликвот экстракта Cynara spp., как описано в настоящей заявке, и одну или несколько аликвот одного или нескольких соединений, обладающих противоопухолевой активностью, и/или одну или несколько аликвот одного или нескольких соединений с противовоспалительной активностью.

Альтернативно, такой набор может содержать одну или несколько аликвот композиции, содержащей в качестве активного ингредиента экстракт Cynara spp., описанного в настоящей заявке, и одну или несколько аликвот одного или нескольких соединений, обладающих противоопухолевой активностью, и/или одну или несколько аликвот одного или нескольких соединений с противовоспалительной активностью.

Как описано выше, такие соединения могут быть химиотерапевтическими препаратами, выбранными, например, из группы, включающей цисплатин, доксорубицин, пеметрексед, метотрексат, винорелбин, гемцитабин и таксол.

Патологии, для которых возможно лечение или профилактика с помощью набора или композиции по настоящему изобретению, были указаны выше; это патологии, характеризующиеся конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, которые могут быть вызваны, например, вирусными инфекциями (как показано в литературе), включая инфекции Н pylori, инфекции вируса гепатита В, инфекции HPV (вирус папилломы человека), инфекции вируса Эпштейна-Барра (как показал Yu et al 2009), или являются опухолевыми патологическими состояниями, которые могут представлять собой любую опухоль, характеризующуюся конститутивной или аномальной активацией STAT3, как это было известно на предшествующем уровне техники.

Неограничивающий пример таких опухолей включает рак предстательной железы, множественную миелому, лейкемию, лимфому, меланому, карциному яичников, карциному клеток почек, аденокарциному поджелудочной железы, рак легких, рак мозга, эритролейкемию, плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак кишечника, мезотелиому.

Более конкретно, указанная опухоль мозга может быть, например, глиомой, менингиомой, указанная лимфома может быть синдромом Сезари, связанной с EBV лимфомой Буркитта, зависимой от Samiri HSV лимфомой, кожной Т-клеточной лимфомой; указанные лейкемии могут включать HTLV-Iзависимую лейкемию, хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL), острую миелогенную лейкемию (AML), мегакариоцитарную лейкемию, лейкемию из больших зернистых лимфоцитов (LGL).

- 16 030986

Предопухолевые патологические состояния, в которых имеет место конститутивная или аномальная активация STAT3, могут быть или патологическими состояниями после удаления опухоли и предопухолевыми состояниями в том смысле, что опухоль может вернуться, или патологическими состояниями, в которых происходит переход у части клеток от воспаления до приобретения злокачественных характеристик, как известно из литературы.

Наконец, настоящее описание также относится к терапевтическому способу профилактики и/или лечения воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, включающим стадию введения пациенту терапевтически активного количества экстракта of Cynara spp. или фармацевтической композиции, содержащей экстракт Cynara spp. необязательно в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми и/или противовоспалительными соединениями.

Способ по настоящему изобретению можно реализовать путем введения субъекту с явным проявлением воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, терапевтически эффективных доз экстракта, как здесь описано, необязательно в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми и/или противовоспалительными лекарствами; или путем введения терапевтически эффективных доз композиции, описанной здесь, необязательно содержащей также одно или несколько противоопухолевых и/или противовоспалительных лекарств, или путем введения экстракта и одного или нескольких противоопухолевых и/или противовоспалительных лекарств, используя описанный здесь набор.

Вводить препарат, как описано выше, можно одномоментно или последовательно в соответствии с режимом, выбранным доктором.

Далее приведены экспериментальные данные, которые показывают эффективность экстракта по настоящему изобретению.

Использованные линии клеток

L428 линия клеток лимфомы человека.

Получена от DSMZ ACC197.

KARPAS линия клеток лимфомы человека с конститутивно активированным STAT3.

Получена из Cell Bank Australia #6072604.

Линия клеток Т-клеточной лимфомы человека, взятая из периферической крови человека возраста 25 лет, перенесшего не-Ходжкинскую Т-клеточную лимфому в 1986, теперь классифицируется как линия клеток лимфобластоидной лимфомы. Karpas 299 экспрессирует Stat3, фосфорилированный по тирозину 705 и серину 727.

MSTO211H линия клеток легочной бифазной мезотелиомы человека с конститутивно активированным STAT3. Получена от АТСС #CLR-2081.

Линия клеток мезотелиомы человека, взятая из кусочка плевры человека возраста 62 лет с мезотелиомой (бифазной злокачественной), который до тех пор не подвергался терапии. Линия клеток MSTO211H экспрессирует высокую концентрацию pStat3 (Tsao et al). Ингибирование экспрессии c-Src и активация злокачественной плевральной мезотелиомоы ведут к апаптозу, блокировке клеточного цикла и пониженной миграции и инвазии. MolCancerTher 2007;6:1962-1972.)

DU-145 Линия клеток карциномы человека, получена от АТСС #НТВ-81. Линия клеток DU145 является линией клеток рака предстательной железы человека с умеренным потенциалом метастазирования по сравнению с клетками РС3, у которых высок потенциал метастазирования. Клетки DU145 не чувствительны к гормонам и не экспрессируют PSA (специфический к простате антиген). Линия клеток DU145 экспрессирует pStat3 конститутивно.

НСТ116 линия клеток рака кишечника человека, получена от АТСС #CCL-247.

MDA-MB-231 Линия клеток аденокарциномы молочной железы. Получена от АТСС #НТВ-26.

NCI-h28 Линия клеток мезотелиомы человека 4 стадии. Получена от ATCC#CRL-5820.

МРР-89 Линия клеток мезотелиомы человека. Получена от CABRI, номер ICLCHTL00012

Следующие примеры показывают, как действует экстракт Cynara scolymus по настоящему изобретению:

Уменьшает выживаемость клеток мезотелиомы (MSTO211H, МРР-89, N04-42052. NCI-H28) в зависимости от дозы и действует слабее на нетрансформированные клетки мезотелиомы (НМС);

Уменьшает способность образовывать колонии в анализах клоногенной выживаемости тех же линий клеток,

Индуцирует гибель клеток злокачественной мезотелиомы ММ в анализах апаптоза;

Ингибирует миграцию и пролиферацию клеток ММ в анализах заживления ран;

Сенсибилизирует клетки ММ для успешного лечения химиотерапевтическим препаратом типа пеметрекседа;

Индуцирует гибель ДНК клеток ММ в отсутствие гибели ДНК клеток НМС;

Уменьшает способность трансплантации опухоли с клетками MSTO у клеток, предварительно обработанных экстрактом;

- 17 030986

Оказывает зависимый от дозы эффект в лечении ксенотрансплантации MSTO.

Примеры

1. Анализ фосфорилирования STAT3 с помощью Вестерн-блоттинга. Результаты показаны на фиг. 1-3.

1.1. Лизис клеток и Вестерн-блоттинг.

Клетки лизировали во льду в течение 30 мин в буфере для лизиса NP40 (50 mM Tris-HCl рН 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA) с добавкой ингибиторов протеазы и фосфатазы (5 mM PMSF, 3 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM NaVO4). Равные количества экстрактов белка (30 мкг) подвергли разложению с помощью денатурирующего электрофореза (SDS-PAGE) в 8% геле полиакриламида и перенесли в течение 2 час на мембрану из нитроцеллюлозы. Мембраны блокировали в 5% растворе молока, растворенного в TBS-Tween_20 0.05%, в течение 1 ч и инкубировали вместе с конкретными первичными антителами. Были использованы следующие первичные антитела: анти-бета актин (А-2228, SIGMA), анtu-pSTAT3 (Tyr-705) (sc8059, Santa Cruz) и анти-STAT3 (sc7179, Santa Cruz). Вторичные антитела были конъюгированы с пероксидазой (Santa Cruz), и ECL препараты (Amersham, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) использовали для хемилюминесценции.

1.2. Обработка линий клеток MPMs и нормальных промышленных мезотелиальных клеток (НМС) экстрактом Cynara scolymus.

Линии клеток MPMs (MSTO-211H, NCI-H28, NCI-H2052, МРР89) получены от АТСС (Rockville, MD), a HMCs (мезотелиальные клетки человека) получены от Tebu-Bio (Фракция). Все линии растили в монослоях при 37°С и при 5% СО₂ в конкретной культуральной среде. Экстракт артишока растворили в раствора воды для инъекций и этанола в соотношении 1:1 при начальной концентрации 30 мг/мл. Для тестирования противоопухолевых свойств продукт затем добавили непосредственно в среду различных линий клеток в разных концентрациях и в течение разных периодов времени, как показано на рисунках.

1.3. Результаты

Результаты на фиг. 1-3 показывают, что анализируемый экстракт ингибирует фосфорилирование STAT3 по сравнению с контрольными тестами, не обработанными экстрактом.

Фиг. 1 и 2 показывают данные, полученные на клетках MSTO211H, обработанных экстрактом Cynara spp. в соответствии с описанием.

Фиг. 1 показывает данные с контролем, обработанным только носителем и экстрактом Cynara spp., 100 мкг/мл культуральной среды в течение 24 ч (контроль с актином) и фиг. 2 показывает данные для клеток, обработанных в течение 24 ч разными концентрациями экстракта Cynara spp.: 25 мкг/мл, 50 мкг/мл, 75 мкг/мл.

Как на фиг. 1 показаны данные для контроля, обработанного только носителем и экстрактом Cynara spp., 100 мкг/мл культуральной среды в течение 24 ч (контроль с актином).

2. Экстракт Cynara scolymus и цинаропикрин ингибируют активацию STAT3 в клетках DU-145 и клетках KARPAS:

Как видно на фиг. 17-20, и экстракт Cynara scolymus и цинаропикрин действуют на STAT3. 200 мкг/мл экстракта, который содержит 0.181% цинаропикрина, содержит 1.2 мкМ цинаропикрина. Приведенные фигуры показывают, что эффект, наблюдаемый при введении 25 мкМ цинаропикрина, равен эффекту, наблюдаемому при 200 мкг/мл экстракта, с титром цинаропикрина, равным 0.181%, т.е. содержащим 1.2 мкМ цинаропикрина. Поскольку использованная доза экстракта содержит 1.2 мкМ цинаропикрина, полученные данные показывают, что экстракт более эффективен, чем цинаропикрин.

3. Анализ клоногенности на клетках злокачественной плевральной мезотелиомы (МРМ)

Клетки МРМ (MSTO211H, NCI-H28; МРР-89; NCI-H2052) посеяли с плотностью 200 клеток на лунку и обработали экстрактом Cynara scolymus по настоящему изобретению при различных возрастающих концентрациях (контроль только с носителем; 12.5 мкг/мл; 25 мкг/мл; 50 мкг/мл; 100 мкг/мл, 200 мкг/мл). Каждый образец посеяли в 6-луночный планшет в двух экземплярах. Через 15-21 суток образовавшиеся колонии окрасили Фиолетовым кристаллическим. Анализ образования колоний, известный также как клоногенный анализ, представляет собой метод оценки эффективности противоопухолевых соединений в терминах способности клеток опухоли образовывать колонии из единственной клетки. Колонией считают группу из 50 или более клеток (клонов), выросших из единственной клетки.

Экспериментальные результаты, приведенные на фиг. 3a-3d, показывают зависящую от дозы способность экстракта по данному изобретению ингибировать образование колоний во всех тестированных линиях клеток МРМ.

Такой же анализ провели на клетках рака кишечника НСТ116, клетках рака предстательной железы DU145 и клетках рака молочной железы MDA-MB-231. В этом случае данные, приведенные на фигурах 4а, b, e и с, также показывают эффективность ингибирования экстрактом по данному изобретению в образовании колоний в зависимости от дозы.

4. ATPIite™ анализ выживаемости клеток

Выживаемость различных линий клеток после контакта с экстрактом по данному изобретению при его различных концентрациях оценивали с помощью ATPIite™ анализа (Perkin Elmer) в соответствии с

- 18 030986 инструкциями производителя. Термин носитель относится к раствору воды для инъекций и этанола в соотношении 1:1 в тех же объемах, которые используют для обработки.

ATPLite™ представляет собой систему мониторинга концентрации аденозинтрифосфата (АТР) на основе активности люциферазы светлячка (Photinus pyralis). Анализ люминесценции является альтернативой колориметрическому, флюорометрическому и радиоизотопному тестам для количественной оценки пролиферации культуральных клеток молочной железы, подвергнутых обработке возможными веществами, содержащимися в культуральной среде. Мониторинг АТР применяют для оценки цитостатического и противопролиферативного эффектов широкого круга лекарств, модификаторов биологического отклика и биологических соединений. Тестовая система ATPLite™ основана на световой эмиссии за счет реакции тестируемого объекта с добавленными АТР люциферазой и D-люциферином. Световая эмиссия в определенных пределах пропорциональна концентрации АТР. Количество АТР в клетках коррелирует с выживаемостью клеток.

Выживаемость клеток линий клеток МРМ различных типов (MSTO211H, МРР89, NCI-H28, NCIH2052) и клеток НМС (нетрансформированные мезотелиальные клетки от готовых доноров) анализировали после обработки экстрактом по данному изобретению при различных концентрациях (контролем служил только носитель; концентрации 12.5; 25; 50; 100, 200 мкг/мл).

График на фиг. 5 с результатами анализа показывает, что экстракт способен значительно уменьшить выживаемость клеток в зависимости от дозы.

Влияние на выживаемость клеток было также изучено на нетрансформированных мезотелиальных клетках (HMCs), в случае которых экстракт по данному изобретению показал пониженную цитотоксичность по сравнению с линиями клеток опухоли (фиг. 6А-6С).

5. WST анализ выживаемости и пролиферации клеток, сравнение цитотоксической эффективности экстракта по данному изобретению и цинаропикрина.

Анализировали цитотоксичность с помощью WST анализа (WSTs - водорастворимые соли тетразолия) и использовали способность митохондриальных дегидрогеназ различать окраску тетразольного цикла от желтой окраски молекулы WST (соль тетразолия) с образованием оранжевой соли формазана. Количество формазана, полученного после обработки клеток протестированными веществами, определили спектрофотометрически, и оно пропорционально числу живых клеток. Молекулы WST-1 и в особенности WST-8 (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразолия) имеют преимущества в отношении МТТ, т.к. они действуют вне клеток в комбинации с PMS в качестве электронного медиатора с образованием водорастворимого формазана. Наконец, WST анализы отличаются тем, что: (1) их можно провести непосредственно (в отличие от МТТ, для которых необходима фаза солюбилизации), (2) они дают более эффективный сигнал, чем МТТ, и (3) они менее токсичны для клеток (в отличие от МТТ, которые образуют нерастворимый формазан, который аккумулируется внутри клеток). Были проведены следующие WST анализы:

6.1. WST-1 анализ на линии клеток DU145 с 50, 100 и 200 мкг/мл экстракта Cynara scolymus через 24-48-72 ч, показанный на фиг. 9.

6.2. WST-1 DU145 через 24 и 48 ч с 0-100-200-300-400-500-600 мкг/мл экстракта Cynara scolymus (цинаропикрин = 1.361%), который ингибирует в зависимости времени и дозы выживаемость клеток DU145. Фиг. 7 по этому опыту также показывает содержание цинаропикрина, выраженное как в мкг/мл, так и мМ, в анализируемом экстракте при концентрациях 100; 200; 300; 400; 500; 600 мкг/мл (которые соответствуют 0.47; 0.94; 1.41; 1.88; 2.35 мкМ и 2.82 цинаропикрина).

6.3. WST-1 анализ линии клеток DU145 через 24 и 48 ч показывает, что цинаропикрин в количестве 0-10-20-30-40-50-60 мкМ ингибирует выживаемость клеток DU-145 в зависимости от времени и дозы. Результаты показаны на фиг. 8.

Сравнение фиг. 7 и 8 показывает, что анализируемый экстракт более чем в 40 раз эффективнее цинаропикрина.

7. Анализ выживаемости клеток при обработке совместно с химиотерапевтическими препаратами.

Линии клеток MSTO211H и NCI-H2052 использовали для оценки эффектов от композиции экстракт Cynara scolymus + противоопухолевое лекарство.

Анализ, показанный на фиг. 10, был проведен с использованием ATPIite™ анализа (Perkin Elmer) согласно инструкциям производителя.

Раствор воды для инъекций и этанола в соотношении 1:1 использовали в тех же объемах, которые использовали при обработках.

Препараты:

Пеметрексед (Alimta, Lilly) разбавили согласно инструкциям производителя.

7.1 Анализ композиции экстракта Cynara spp. и пеметрекседа с помощью ATPIite™ анализа

На фиг. 10 показана кривая выживаемости для MSTO211H через 72 ч обработки пеметрекседом и пеметрекседом в комбинации с экстрактом Cynara spp. График А показывает обработку клеток MSTO211H экстрактом в нецитотоксической дозе (6 мкг/мл) и пеметрекседом, в то же время график В показывает обработку клеток NCI-H2052 экстрактом в нецитотоксической дозе (6 мкг/мл) и пеметрексе

- 19 030986 дом (различные концентрации), а график С показывает обработку нетрансформированных клеток экстрактом в нецитотоксической дозе (6 мкг/мл) и пеметрекседом (различные концентрации). Концентрации анализируемых соединений нанесены на оси абсцисс, а выживаемость клеток, выраженная в процентах, нанесена на оси ординат.

Фиг. 10А и В показывают, как обработка экстрактом сенсибилизирует линии опухоли к обработке пеметрекседом. На кривой с двойной обработкой видно, что даже концентрация пеметрекседа в 10 мкМ достаточна для того, чтобы понизить выживаемость клеток тестируемых линий. Интересно отметить, что для неопухолевой линии экстракт оказывает защитный эффект по отношению к пеметрекседу.

7.2 Оценка выживаемости клеток с помощью WST-1 анализа Параллельно с опытами при различных концентрациях цинаропикрина провели опыты с экстрактом, с тем чтобы сравнить эффективность экстракта и цинаропикрина.

На фиг. 10 приведены данные, полученные инкубированием клеток DU145 с цисплатином (график А), доксорубицином (график В) и таксолом (график С) только с носителем (контр.) при двух различных концентрациях экстракта Cynara scolymus (abo-1) и только с лекарством при двух различных концентрациях экстракта Cynara scolymus (abo-1) в комбинации с лекарством.

В опытах, представленных на фиг. 11, использовали 0.181% экстракт цинаропикрина. Фигура показывает, что концентрации цинаропикрина при 100 и 200 мкг/мл экстракта составляют соответственно 0.18 и 0.36 мкг/мл цинаропикрина.

Фиг. 11 показывает связь между возрастающими концентрациями экстракта Cynara Scolymus (цинаропикрин 1.361%) и цисплатина при фиксированной концентрации 15 мкг/мл и фиг. 12 показывает связь между экстрактом Cynara Scolymus (цинаропикрин 1.361%) и доксорубицином при фиксированной концентрации 2 мкг/мл.

Эта фигура также показывает обработку только экстрактом (черный) и только лекарством (белый).

Фиг. 13 и 14 аналогично фиг. 11 и 12 приводят результаты таких же экспериментов, проведенных с цинаропикрином вместо экстракта по данному изобретению и показывают, что экстракт значительно более эффективен, чем цинаропикрин.

Фиг. 14 показывают соотношение между цинаропикрином при возрастающих концентрациях и цисплатином при фиксированной концентрации 15 мкг/мл, а фиг. 14 демонстрирует соотношение между цинаропикрином и доксорубицином при фиксированной концентрации 2 мкг/мл.

Эта фигура также показывает обработку только цинаропикрином (черный) и только лекарством (белый).

8. Анализ заживления раны

Анализ заживления раны (фиг. 16) является простым, недорогим и одним из первых способов, разработанных для изучения направленной миграции клеток in vitro. Этот способ моделирует миграцию клеток в ходе заживления раны in vivo. Основные стадии включают образование раны в монослое клеток и последующее мониторирование специфической зоны раны путем фиксирования изображений в самом начале и через регулярные интервалы по ходу миграции клеток, необходимой для закрытия раны. Клетки MSTO211H, культивированные с конфлюентностью 95 %, высеяли в 6-луночные тканевые планшеты и создали рану (или порез), которую пунктировали с помощью стерильной 10 мкл пипетки для отбора клеток. Получали цифровые микрофотографии раны в назначенное время. Конечная гистограмма показывает эффективность закрытия пореза (количественное число клеток в %), обработанного носителем или АВО 1 в указанное время.

9. Анализ оценки индуцирования апоптоза См. фиг. (26-27)

9.1. Вестерн-блоттинг

Использовали те же методики, что и описанные в пункте 1.1, и следующие первичные антитела: анти-бета-актин (А-2228, SIGMA), анти-каспаза-3 (31А1067, Alexis), анти-каспаза-7 (#9492, Cell Signalling) и анти-PARP (#9542S, Cell Signalling).

9.2. FACS анализ и анализ окрашивания с помощью PI и с помощью PI/Annexin V

С целью выяснения влияния экстракта по данному изобретению на клеточный цикл провели FACS анализ.

Для окрашивания пропидий иодидом (PI) клетки высеяли в 6-луночные планшеты с плотностью 10⁴клеток/мл. Через 24 ч клетки опухоли обработали экстрактом по данному изобретению в указанных концентрациях через различные периоды времени. Клетки собрали в суспензию и прилипшие клетки промыли в PBS, зафиксировали в замороженном этаноле (70% об/об) и хранили при -20°С. Для анализа клетки промыли в PBS 1X и суспендировали в растворе PBS 1Z, PI (25 мг/мл) и RNasi A (200 мг/мл).

Для двойного окрашивания с помощью PI/annexin V обработанные клетки собрали и заново суспендировали в связующем буфере (HEPES рН 7.4, CaCl₂ 2.5 мМ, NaCl 140 мМ). Аликвоты клеток инкубировали 15 мин с annexin V FITC и PI (5 мг/мл) (Invitrogen).

В ходе всех анализов FACS были проанализированы 10⁵ случаев для каждого образца. Текущие цитометрические анализы проводили в проточном цитометре GuavaEasyCyte 8HT (Millipore).

Как видно на фиг. 25, экстракт по изобретению индуцирует апоптоз в клетках MSTO211H, как показывает окрашивание с помощью annexin V, в зависимости от времени и дозы.

- 20 030986

11. Анализ с глютатионом

Изменение окислительно-восстановительного состояния клетки, вызванное изменением соотношения между восстаноаленным и окисленным глютатионом, определяет глютатионирование STAT3, предотвращая его фосфорилирование в тирозине и, следовательно, его активацию (Butturini E. et al. PLoSOne. 2011;6(5):е20174.).

11.1 Внутриклеточные анализы GSH.

Внутриклеточную концентрацию GSH оценивали методом колориметрии. Экстракт клеток, депротеинизированных с помощью 10% трихлоруксусной кислоты, обработали дитионитробензолом (DTNB), и определили количество TNB, выделившегося в результате реакции с GSH, по поглощению при 412 нм.

11.2. Глютатионирование STAT3

STAT3 был иммуннопреципитирован путем инкубирования экстракта клеток белка с антителами анти-STAT3 в течение суток. Полученные белки отделили с помощью SDS-PAGE в невосстановительных условиях и перенесли на мембрану PVDF. Глютатионированный STAT3 определяли с использованием антител анти-GSH.

Данные, приведенные на фиг. 24 и 25, показывают, что цинаропикрин понижает внутриклеточную концентрацию GSH (фиг. 24) и изменение окислительно-восстановительного состояния индуцирует глютатионирование STAT3, предотвращая его фосфорилирование (фиг. 25). Восстановление физиологических значений GSH с помощью предварительной обработки этиловым эфиром глютатиона изменяет способность цинаропикрина ингибировать фосфорилирование STAT3.

12. Трансплантация клеток опухоли, обработанных или не обработанных экстрактом по данному изобретению

Описание опыта по первому приживлению

Клетки MSTO211Н обработали артишоком в концентрации 50 мкг/мл в течение 24 часов. Собрали суспензию 2 х 10⁶ клеток в PBS/Matrigel (BD Biosciences) и инокулировали в правое бедро голой мыши возраста 4 недель. За объемом опухолей следили дважды в неделю до 21-ых суток. Мышь умертвили и отделили опухоли.

13. Трансплантация клеток опухоли у мыши и обработка Cynara scolymus и пеметрекседом

Описание опыта по второму приживлению

Вырастили клетки до имплантации и оценили их выживаемость и загрязнение, т.е. они были пересчитаны и повторно суспендированы в PBS при концентрации 20 х 10⁶/мл. К суспензии добавили матригель до конечной концентрации 10х10⁶ клеток/мл PBS Matrigel 1/1. Клетки MSTO инокулировали под кожу 48 мышам.

Когда опухоль достигла среднего объема 60 мм³, мышей разделили на 8 групп по 6 животных в группе и обрабатывали их по-разному.

Две группы получали артишок в питьевой воде в течение 7 суток в неделю во время периода из трех недель; другие крупны получали пеметрексед внутрибрюшинно в течение 5 суток в неделю во время периода в 3 недели.

Группы описаны в табл. 5

Число животных

Линия клеток

Число клеток

механизм

объем

Обраб А

Начало обраб

Способ введения

Режим обраб

Обраб В

Начало обраб

Способ введения

Режим обраб

Группа 1

6

MSTO

2X10“

SC

02 (матригель)

экстракт Cynara 20мкг/мл

После появления опухоли

OS

Литьевая вода

Группа 2

6

MSTO

2X10^е

SC

02 (матригель)

экстракт Cynara 50МКГ/МЛ

После появления опухоли

OS

Литьевая вода

Группа 3

6

MSTO

2X10^е

SC

02 (матригель)

экстракт Cynara 750мкг/мл

После появления опухоли

OS

Питьевая вода

Группа 4

6

MSTO

2X10^е

SC

02 (матригель)

Группа 5

6

MSTO

2Х10⁸

SC

02 (матригель)

Пеметрексед (ЮОмг/кг)

После появления опухоли

IP

5 дней подряд

экстракт Cynara 20мкг/мл

После появления опухоли

OS

Питьевая вода

Группа 6

6

MSTO

2Х10⁶

SC

02 (матригель)

Пеметрексед (1 ООмг/кг)

После появления опухоли

IP

5 дней подряд

экстракт Cynara 50мкг/мл

После появления опухоли

OS

Питьевая вода

Группа 7

6

MSTO

2Х10⁶

SC

02 (матригель)

Пеметрексед (1 ООмг/кг)

После появления опухоли

IP

5 дней подряд

экстракт Cynara 70мкг/мл

После появления опухоли

OS

Питьевая вода

Группа 8

$

MSTO

2Х10⁸

$0

02 (матригель)

Пеметрексед (ЮОмг/кг)

После появления опухоли

IP

5 дней подряд i

SC = подкожно Обраб = обработка Введ = введение IP = внутрибрюшно OS = перорапьно

При прогрессировании опухоли (т.е. когда опухоль достигала объема 60 мм³), обработку начинали с Abo1 и вводили пеметрексед следующим образом: пеметрексед в дозе 100 мг/кг по 88 мл/мышь в течение 5 последовательных суток внутрибрюшинно, вводили экстракт артишока в питьевой воде при концентрациях 25, 50 и 75 мкг/мл и измеряли через сутки в течение 3 недель.

За мышами следили ежесуточно для оценки любых сигналов; массу тела определяли дважды в не

- 21 030986 делю.

В конце эксперимента (42 суток после инокуляции) опухоль собрали и зафиксировали в 10% формалине (перенесли через 24 ч в 70%-й этанол).

Диаметр опухоли измеряли дважды в неделю кронциркулем Mitutoyo.

Библиография

- Aggarwal В. В. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1091; 151-69: 2006

- Johnston PA e Grandis RG, Mollnterv; 11 (1); 18-26:2011

- Niu G. et al. Mol Cancer Res, 6 (7); 1099-105: 2008

-Turkson J. Jove R. “STAT proteins: novel molecular targets for cancer drug discovery”

Oncogene. 2000 Dec 27; 19(56):6613-26

- Yu.H. et al “STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3”

Nature Reviews Cancer 9, 798-809 (November 2009).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение экстракта Cynara cardunculus subsp. scolymus в профилактике и/или лечении предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, причем указанный экстракт является сухим или лиофилизованным или жидким экстрактом листьев Cynara либо цветочных бутонов или смеси обеих частей и причем указанное предопухолевое и/или опухолевое патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака мозга, меланомы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы яичников, рака кишечника, злокачественной плевральной мезотелиомы.

2. Применение по п.1 в профилактике и/или лечении указанного предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, в комбинации с одним или несколькими противоопухолевыми соединениями.

3. Применение по п.2, причем указанную комбинацию реализуют путем одномоментного или последовательного введения указанного экстракта с указанными одним или несколькими противоопухолевыми соединениями.

4. Применение по п.3, причем указанное одно или несколько противоопухолевых соединений выбирают из группы, состоящей из цисплатина, доксорубицина, пеметрекседа, метотрексата, винорелбина, гемцитабина и таксола.

5. Применение по любому из пп.1-4, причем указанное патологическое состояние представляет собой опухоль, устойчивую к лечению химиотерапевтическими препаратами, которые не ингибируют STAT3.

6. Применение композиции, включающей в качестве активного ингредиента экстракт Cynara cardunculus subsp. Scolymus, причем указанный экстракт является сухим или лиофилизованным или жидким экстрактом листьев Cynara либо цветочных бутонов или смеси обеих частей, и носитель и/или разбавитель и/или эксципиент, в профилактике и/или лечении предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, причем указанное предопухолевое и/или опухолевое патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака мозга, меланомы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы яичников, рака кишечника, злокачественной плевральной мезотелиомы.

7. Применение по п.6, причем указанная композиция включает также в качестве активного ингредиента одно или несколько противоопухолевых соединений.

8. Применение по п.7, причем одно или несколько противоопухолевых соединений выбирают из группы, состоящей из цисплатина, доксорубицина, пеметрекседа, метотрексата, винорелбина, гемцитабина и таксола.

9. Применение по любому из пп.1-8, причем указанное патологическое состояние представляет собой опухоль, устойчивую к лечению химиотерапевтическими препаратами, которые не ингибируют STAT3.

10. Применение набора для одномоментного или последовательного введения экстракта Cynara cardunculus subsp. scolymus и одного или нескольких соединений с противоопухолевой активностью, включающий одну или несколько аликвот экстракта Cynara cardunculus subsp. scolymus, причем указанный экстракт является сухим или лиофилизованным или жидким экстрактом листьев Cynara либо цветочных бутонов или смеси обеих частей, и одну или несколько аликвот противоопухолевых соединений в профилактике и/или лечении воспалительного и/или предопухолевого и/или опухолевого патологического состояния, характеризующегося конститутивной или аномальной активацией фактора транскрипции STAT3, причем указанное предопухолевое и/или опухолевое патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака мозга, меланомы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы яичников, рака кишечника, злокачественной плевральной мезотелиомы.

11. Применение по п.10, причем указанное патологическое состояние представляет собой опухоль,

- 22 030986 устойчивую к лечению химиотерапевтическими препаратами, которые не ингибируют STAT3.

12. Применение по п.10, причем указанные одно или несколько противоопухолевых соединений выбирают из группы, состоящей из цисплатина, доксорубицина, пеметрекседа, метотрексата, винорелбина, гемцитабина и таксола.

Фиг. 1а pSTAT3 (Y705)

Актин

Фиг. 2

- 23 030986 ϊ NCI-H28 ОБРАБОТАН ABO 1 мкг/мп мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг'мл

Фиг. 3b “ МРР-89 ОБРАБОТАН ABO 1 ш

и 1201 мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл

Фиг. 3с

Фиг. 3d

Фиг. 4b

- 24 030986

Фиг. 4с

Фиг. 5

120, X 100« * MSTO211H V о 80 t KMC г га ш 60* * « < Sb * л ш 40 ί 2(h а ni ί

Q 3 S 12 25 50 100 200 мкг/мл мкг/мл мкг/ыл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл

Фиг. 6a

Фиг. 6b

Фиг. 6с

- 25 030986

Фиг. 10a

- 26 030986

Пеметрексед

Пеметрексед + ABO 1

ABO (6 мкг/мл) + Пеметрексед

Фиг. 10b нмс

АВО (6 мкг/мл) + Пеметрексед

Фиг. 10c

ВРЕМЯ: 24 ч

л о о о о о см и S о о О 04 а =г ( к X о 1 о η < 6 л < 0 л ί 0 £2 ί

Фиг. 11а

ТЕСТИРОВАНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК: WST

ЛИНИЯ КЛЕТОК DU145

120

100

О

ВРЕМЯ 24 ч

Доксорубицин 1 МКГ/МП

Фиг. 11b

- 27 030986

300 нМ ТАКСОН

120

100 so

О

ВРЕМЯ: 24 ч

Фиг. 11с АРТИШОК

120

ДОКСОРУБИЦИН

Доксорубицин

Ф8 мкг/мл

544 мкг/мл мкМ

Фиг. 13

Артишок 200мкг/мл

Артишок ЗООмкг/мп

Артишок 400мкг/мл

Соответствующий цинаропикрин

272 мкг/мл

ОЭЯмкМ &В мкМ

Артишок ЮТмкг/мл мкг/мл Цисплатин

Время: 24 час Цинаропикрин Цисплатин

Цинаропикр Цинаропикр Цинаропикр Цинаропикр 12 5 мкМ 25 мкМ 40 мкМ 50 мкМ

Фиг. 14

- 28 030986

Фиг. 16а

Фиг. 16b

- 29 030986

Cynara scolymus

Время, час pTyr^rasSTAT3

Cynara scolymus мкг/мл свободные олигомеры

Фиг. 17

Фиг. 18 мкМ цинаропикрин

Время (час) о 1 2 4 24 _pTyr705_STAT3 — —

STATS

Фиг. 19

- 30 030986

КЛЕТКИ MSTO211H, ОБРАБОТАННЫЕ AB01 В ТЕЧЕНИЕ 72 ЧАС носитель 6 мкг/мл 12 мкг/мл 25 мкг/мп 50 мкг/мл 100 мкг/мл

Фиг. 21b <

I м

g расщепленная PARP расщепленная каспаза 7 расщепленная каспаза 3 (19 кДа)

MSTO211H

Фиг. 22

- 31 030986

MST0211Н ОБРАБОТАНЫ ΑΒΟ1 В ТЕЧЕНИЕ 24 час ф

Фиг. 23

Фиг. 25

Фиг. 26

Фиг. 27