CN108403701A - 二氢雷公藤红素在制备预防或治疗血液肿瘤疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及二氢雷公藤红素(Dihydrocelastrol,式I)在制备预防或治疗血液肿瘤疾病的药物中的用途。本发明提供的二氢雷公藤红素除了具有明显的预防和治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤等肿瘤的效果外，较之雷公藤红素，二氢雷公藤红素的毒副作用大大降低，具有较好的临床应用前景。

Description

二氢雷公藤红素在制备预防或治疗血液肿瘤疾病的药物中的 用途

技术领域

本发明涉及二氢雷公藤红素的医药用途，具体涉及二氢雷公藤红素(Dihydrocelastrol)、其药学上可接受的盐或药物组合物在制备预防和/或治疗血液肿瘤疾病的药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害人类的健康，并将成为新世纪人类的第一杀手。恶性肿瘤已不再只是发达工业国家的严重疾病，发展中国家面临着更大的疾病负担。

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，是血液系统第二位常见的恶性肿瘤，约占血液系统恶性肿瘤的10％，多发于中老年人群，目前仍无法治愈，其中位生存时间为5～6年。传统治疗多发性骨髓瘤的主要方法是化疗和造血干细胞移植，其临床疗效很难维持。近10年来，随着新型药物如蛋白酶体抑制剂硼替佐米、免疫调节剂沙利度胺及来那度胺等的出现，多发性骨髓瘤患者的完全缓解率及总体生存率明显提高。但同时仍存在以下不足：首先，以上这些药物在复发/难治患者中的单药有效率仅为25％～50％；其次，尽管无疾病生存时间得到延长，但多数患者终将复发，且出现显著的药物抵抗；第三，神经炎等某些严重的副作用限制了药物的应用。因而，研发、检验新的治疗药物仍然是目前多发性骨髓瘤治疗所需面临的重要难题。

淋巴瘤是血液系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国常见恶性肿瘤中占第8位，并且近年来它的发病率仍在逐渐增加。新的化疗方案、单克隆抗体、细胞免疫治疗等治疗方式已经显著改善了淋巴瘤患者的生存。特别是利妥昔单抗的出现，淋巴瘤的治疗有了突破性的进展，尤其是对CD20阳性的B细胞淋巴瘤，有效率更高，缓解时间更长，显著改善预后。但是，淋巴瘤患者出现复发或耐药的比例仍然很高。因此仍需进一步研发新药，以提高淋巴瘤的治疗效果与治愈率。

虽然化学药物治疗作为治疗肿瘤的重要手段之一，在近三十年已经有了巨大的发展和进步，得到了一大批具有不同作用机制的临床抗肿瘤药物。但是抗肿瘤药也存在许多不良反应，比如脱发、呕吐、快速产生耐药性等等，这些都导致化学药物无法达到预期的治疗效果。因此，新的抗肿瘤药物的研究与开发是目前药学领域的热点和难点问题之一。

雷公藤红素是从中药雷公藤中提取分离得到的一类天然产物，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种药理作用，但是同时存在毒副作用大，剂量窗口窄的问题，从而阻碍其进一步的临床应用。

二氢雷公藤红素是从雷公藤红素结构改造得到的化合物，未有文献报道其用于血液肿瘤的治疗。

发明内容

本发明提供了二氢雷公藤红素(Dihydrocelastrol)、其可药用盐或药物组合物，用于预防或治疗血液肿瘤疾病，包括骨髓瘤或淋巴瘤等。

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供二氢雷公藤红素的制药新用途。

本发明的第二个目的是，提供一种用于治疗血液肿瘤疾病的药物组合物。

本发明的第三个目的是，提供如上所述药物组合物的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

二氢雷公藤红素在制备预防和/或治疗血液肿瘤疾病的药物中的应用，所述二氢雷公藤红素的结构式如式I所示；

二氢雷公藤红素在制备预防和/或治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用，所述二氢雷公藤红素的结构式如式I所示。

二氢雷公藤红素在制备预防和/或治疗淋巴瘤的药物中的应用，所述二氢雷公藤红素的结构式如式I所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于治疗血液肿瘤疾病的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的二氢雷公藤红素及组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

二氢雷公藤红素与组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat药物联用，用于制备预防或治疗血液肿瘤疾病的药物。

二氢雷公藤红素与组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat药物联用，用于制备预防或治疗多发性骨髓瘤的药物。

进一步，所述二氢雷公藤红素以药学上可接受的盐形式存在。

进一步，所述二氢雷公藤红素以前药形式存在，所述前药形式包括酯化、乙酰化等药学上可接受的形式。

进一步，所述二氢雷公藤红素可以单独使用或者以药物组合物的形式使用，所述药物组合物包含治疗有效量的二氢雷公藤红素、其药学上可接受的盐或它的前药，以及药学上的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂和媒介物的至少一种。

进一步，所述二氢雷公藤红素可以单独使用或者作为活性成分与其他常规的辅料混合使用。

本发明优点在于：

本发明提供了二氢雷公藤红素用于制备预防或治疗血液肿瘤疾病的药物，本发明提供的二氢雷公藤红素除了具有明显的预防和治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤等肿瘤的效果外，较之雷公藤红素，二氢雷公藤红素的毒副作用大大降低，具有较好的临床应用前景。

附图说明

附图1为DHCE化学式。

附图2为DHCE体外细胞实验结果：48小时的DHCE作用可以抑制骨髓瘤细胞株H929、8226、OCI-MY5、ARP-1及万珂耐药骨髓瘤细胞株H929R的增殖。随着DHCE药物浓度的增加，抑制率显著升高。

附图3为DHCE体外细胞实验结果：DHCE对骨髓瘤细胞ARP-1和H929细胞的抑制作用呈现时间依赖性。随着作用时间的延长，DHCE的抑制作用增强。

附图4为IL-6对DHCE作用影响实验，结果证明：IL-6不影响DHCE对骨髓瘤细胞的抑制作用，DHCE仍然可以在高浓度的IL-6中起到对骨髓瘤细胞的抑制作用。

附图5为流式细胞术凋亡实验，结果证明：DHCE对骨髓瘤细胞株ARP-1和H929可以起到促凋亡的作用。并且48小时的药物作用比24小时作用效果明显，说明随着时间的延长，DHCE的效果增强。

附图6为Western Blot实验，实验证明DHCE在引起骨髓瘤细胞凋亡的过程中，可以导致凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白的活化，说明DHCE是可以通过同时激活内源性和外源性caspase通路引起凋亡的。

附图7为Caspase抑制剂z-VAD-FMK在逆转DHCE所引起的凋亡作用实验，结果显示：caspase抑制剂z-VAD-FMK可以减少DHCE引起的细胞凋亡，证明DHCE所诱发的细胞凋亡是通过caspase途径的。

附图8为细胞周期实验，结果证明：DHCE可以引起骨髓瘤细胞发生细胞周期阻滞，经过DHCE处理的骨髓瘤细胞，细胞周期停滞于G0/G1期。

附图9为周期蛋白的western blot，结果显示DHCE可以下调细胞周期蛋白cyclinD1、CDK4/CDK6的表达，从而引起细胞的G0/G1期周期阻滞。

附图10为DHCE信号通路的研究，结果显示：DHCE可以下调STAT3和ERK蛋白的磷酸化，下调IL-6的表达，从而对骨髓瘤细胞的ERK和STAT3/IL-6信号通路达到抑制的作用。

附图11为二氢雷公藤红素体内抑制裸鼠移植骨髓瘤生长结果。

附图12为二氢雷公藤红素与组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat药物联用对骨髓瘤细胞的抑制活性。

附图13为DHCE体外细胞实验结果，显示DHCE对于淋巴瘤细胞株OCI-LY8、NUDUL-1均具有抑制作用。在OCI-LY8细胞中的IC50为0.42μM,在NUDUL-1细胞中的IC50为0.47μM。

附图14为流式细胞术凋亡实验：DHCE对淋巴瘤细胞株OCI-LY8和NUDUL-1均可以起到促进凋亡的作用。并且随着浓度的增加，凋亡作用越显著。

附图15为DHCE在淋巴瘤作用中的细胞周期实验，结果证明：DHCE可以引起淋巴瘤细胞发生细胞周期阻滞，经过DHCE处理的淋巴瘤细胞，细胞周期停滞于G0/G1期。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明所用术语“可接受的”，指一个处方组分或活性成分对一般治疗目标的健康没有过分的有害影响。

本发明所用术语“治疗”，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生；改善或预防潜在代谢综合症；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用，某一化合物或药物组合物，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于或与给药有关的情况。

本发明所用术语“药学上可接受”这里指一种物质，如载体或稀释液，不会使化合物的生物活性或性质消失，且相对无毒，如，给予个体某物质，不会引起不想要的生物影响或以有害的方式与任何其含有的组分相互作用。

本发明中所述的二氢雷公藤红素(Dihydrocelastrol,DHCE)其化学式如图1所示，该化合物可参考文献(J.Am.Chem.Soc.2011,133,19634–19637)所记载的方法制备得到。其制备过程主要包括：雷公藤红素与四氢硼钠在甲醇或者乙醇溶剂中反应后，经稀酸酸化、有机溶剂萃取、硅胶柱分离纯化获得本发明描述的DHCE化合物(化合物长期保存注意避光、防潮，在干燥、阴凉的环境中可保持化合物质量稳定)。

活性测试实验实施例

实验例1针对人多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性

1.实验材料：

(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(H929、RPMI8226、OCI-MY5、ARP-1细胞购自美国ATCC，本实验室传代保存；NCI-H929R细胞由第二军医大学侯健教授提供)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)主要试剂：1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，DHCE(本实验室合成)，LBH589(Panobinostat，CAS：404950-80-7，是广谱的HDAC抑制剂)，CellCounting Kit-8试剂盒(CCK8，日本株式会社同仁化学研究所)。

(3)主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK，Elx800)。

2.实验方法：

(1)细胞培养

细胞培养于1640培养基(含10％胎牛血清，pH 7.2)，培养基加2mmol/L谷氨酰胺，置于细胞培养箱中在37℃、5％CO₂环境下培养。

(2)CCK8试剂盒测定各药物的细胞毒性

取人多发性骨髓瘤细胞(H929、RPMI8226、OCI-MY5、ARP-1、H929R细胞)的单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×10^5个/mL。取96孔培养板每孔加入95μL上述细胞悬液，然后加不同浓度的用培养基配制的药物5μL，对照组加入相应体积的培养基，每组设置3个平行孔。连续培养72h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10μL，于CO₂孵箱中继续培养。2h后用自动酶标仪检测450nm各孔OD值。计算细胞存活率与抑制率：细胞存活率(％)＝(实验孔OD均值/对照孔OD均值)×100％。细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率(％)。拟合函数求出抑制细胞生长达50％时药物浓度IC₅₀。实验重复三次。

3.实验结果

实验结果见图2-图10，为二氢雷公藤红素对骨髓瘤细胞的体外抑制活性及机制研究结果。

图2为DHCE体外细胞实验结果。从图2的细胞实验结果可以看出，DHCE可以以浓度依赖的方式抑制H929、8226、OCI-MY5、ARP-1及万珂耐药骨髓瘤细胞株H929R的增殖。

图3A、图3B分别为DHCE对两种骨髓瘤细胞株ARP-1、H929的抑制作用实验结果。CCK-8实验证明：DHCE对骨髓瘤细胞ARP-1和H929细胞的抑制作用是时间依赖的。且随着作用时间的延长，DHCE的抑制作用增强。

图4A、图4B分别为IL-6对DHCE抑制骨髓瘤细胞株ARP-1、H929作用的影响。从图中的结果可以看出：IL-6不影响DHCE对骨髓瘤细胞的抑制作用，DHCE仍然可以在高浓度的IL-6中起到对骨髓瘤细胞的抑制作用。

图5A为DHCE促进骨髓瘤细胞株ARP-1、H929凋亡的流式细胞术结果，图5B为统计的相关细胞凋亡率条形图。流式细胞术实验证明：DHCE对骨髓瘤细胞株ARP-1和H929可以起到促凋亡的作用。并且48小时作用比24小时作用明显，说明随着时间的延长，DHCE的效果可以增强。

附图6为凋亡蛋白的western Blot实验。Western Blot实验证明，DHCE在引起骨髓瘤细胞凋亡的过程中，可以导致caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白的活化，说明DHCE是可以通过同时激活内源性和外源性caspase通路引起凋亡的。

附图7为Caspase抑制剂z-VAD-FMK在逆转DHCE所引起的凋亡作用的实验。从图7的结果可以看出：caspase抑制剂VAD-FMK可以减少DHCE引起的细胞凋亡，证明DHCE所诱发的细胞凋亡是通过caspase途径的。

附图8为DHCE在骨髓瘤作用中的细胞周期实验。周期实验证明：DHCE可以引起骨髓瘤细胞发生细胞阻滞，经过DHCE处理的骨髓瘤细胞，细胞周期停滞于G₀/G₁期。

附图9为周期蛋白的western blot实验。Western blot实验证明，DHCE可以下调细胞周期蛋白cyclinD1、CDK4/CDK6的表达，从而引起细胞的G₀/G₁期周期阻滞。

附图10为信号通路蛋白的western blot实验。对DHCE信号通路的研究证实，DHCE可以下调STAT3和ERK蛋白的磷酸化，下调IL-6的表达，从而对骨髓瘤细胞的ERK和STAT3/IL-6信号通路达到抑制的作用。

实验结论：二氢雷公藤红素能有效抑制骨髓瘤细胞生长。

实验结果见图12，为二氢雷公藤红素与组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat药物联用对骨髓瘤细胞的抑制活性。DHCE与Panobinostat联合作用于骨髓瘤细胞H929，结果显示DHCE与Panobinostat联合时的效果大于两者单独作用时的抑制效果，A.CCK-8测试两者作用于骨髓瘤细胞时的效果，B.各浓度时的CI指数，CI值＜1证明Panobinostat与DHCE共同作用时有协同效果。

实验结论：二氢雷公藤红素与Panobinostat药物联用具有协同作用，能有效抑制骨髓瘤细胞生长。

实施例2针对多发性骨髓瘤的动物实验

1.实验材料

(1)细胞株：人多发性骨髓瘤细胞(H929细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。

(2)实验动物：雄性BALB/C裸鼠(5周，购自上海斯莱克实验动物有限公司)，置于SPF级环境中饲养(上海第十人民医院中心实验室动物房)。

2.实验方法

(1)细胞培养参见实施例3。

(2)动物实验

将含2×10^6个H929细胞的1640培养基注射到裸鼠左腋窝皮下，当瘤子长成并可测量时，随机分至对照组和给药组。给药组裸鼠每天腹腔注射DHCE 10mg/kg，对照组裸鼠每天腹腔注射相同体积的溶剂(200μL，溶剂＝15μL DMSO+185μL生理盐水)。每两天测量一次瘤子大小(测量瘤子的长和宽，瘤子体积＝4π/3×(宽/2)^2×(长/2))。给药14天后处死老鼠并取瘤子拍照。

3.实验结果

实验结果见图11A-D，为二氢雷公藤红素体内抑制裸鼠移植骨髓瘤生长结果。DHCE的动物体内实验显示：DHCE可以抑制裸鼠体内骨髓瘤的生长，并且不引起明显的体重减轻。图D.瘤子切片HE染色显示，DHCE加药组和对照组相比，可以明显地引起瘤子组织的凝固性坏死，证明了DHCE的体内药物活性。

实验结论：二氢雷公藤红素具有动物体内抑制骨髓瘤生长的作用，且对动物体重无明显影响，未见明显毒副作用。

实施例3针对人淋巴瘤细胞的杀伤活性

1.实验材料

人淋巴瘤细胞(OCI-LY8细胞、NUDUL-1细胞)(美国ATCC，本实验室传代保存)，培养于1640培养基(含10％胎牛血清)。其他同实施例1。

2.实验方法

参见实施例1。

3.实验结果

实验数据见图13-图15，为二氢雷公藤红素对淋巴瘤细胞的体外抑制活性。

附图13为DHCE体外细胞实验结果。对于淋巴瘤细胞OCI-LY8、NUDUL-1细胞的CCK-8结果证实：DHCE对淋巴瘤细胞也具有抑制作用。在OCI-LY8中的IC50为0.42μM,在NUDUL-1细胞中的IC50为0.47μM。

附图14为流式细胞术凋亡实验。流式细胞术实验证明：DHCE对淋巴瘤细胞株OCI-LY8和NUDUL-1可以起到促凋亡的作用。并且随着浓度的增加，凋亡作用越显著。

附图15为DHCE在淋巴瘤作用中的细胞周期实验。周期实验证明：DHCE可以引起淋巴瘤细胞发生细胞阻滞，经过DHCE处理的淋巴瘤细胞，细胞周期停滞于G₀/G₁期。

实验结论：二氢雷公藤红素对淋巴瘤细胞有良好的抑制活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.二氢雷公藤红素在制备预防和/或治疗血液肿瘤疾病的药物中的应用，所述二氢雷公藤红素的结构式如式I所示；

2.二氢雷公藤红素在制备预防和/或治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用，所述二氢雷公藤红素的结构式如式I所示。

3.二氢雷公藤红素在制备预防和/或治疗淋巴瘤的药物中的应用，所述二氢雷公藤红素的结构式如式I所示。

4.一种用于治疗血液肿瘤疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的二氢雷公藤红素及组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat。

5.二氢雷公藤红素与组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat药物联用，用于制备预防或治疗血液肿瘤疾病的药物。

6.二氢雷公藤红素与组蛋白脱乙酰酶抑制剂Panobinostat药物联用，用于制备预防或治疗多发性骨髓瘤的药物。

7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述二氢雷公藤红素以药学上可接受的盐形式存在。

8.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述二氢雷公藤红素以前药形式存在，所述前药形式包括酯化、乙酰化等药学上可接受的形式。

9.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述二氢雷公藤红素可以单独使用或者以药物组合物的形式使用，所述药物组合物包含治疗有效量的二氢雷公藤红素、其药学上可接受的盐或它的前药，以及药学上的载体，赋形剂，稀释剂，辅剂和媒介物的至少一种。