ITRM20130312A1 - Estratto di cynara spp. e suoi usi. - Google Patents

Description

"ESTRATTO DI CYNARA SPP. E SUOI USI"

CAMPO TECNICO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un estratto di Cynara spp.come anche a composizioni e kit che comprendono detto estratto, per la prevenzione e/o il trattamento di una condizione patologica caratterizzata da un’attivazione costitutiva del fattore trascrizionale STAT3.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

Negli ultimi dieci anni molte evidenze in letteratura indicano il ruolo fondamentale dei fattori trascrizionali della famiglia STAT in un’ampia varietà di patologie, come nelle patologie infiammatorie che promuovono i tumori e nei tumori stessi. Le proteine STAT sono fattori di trascrizione citoplasmatici la cui fosforilazione/attivazione (su specifici residui di serina e/o tirosina ad opera delle famiglie di proteine JAK o Janus chinasi) determina la dimerizzazione di due monomeri STAT, la traslocazione del dimero nel nucleo, il legame ad elementi del DNA di geni bersaglio STAT-specifici e l’induzione della trascrizione genica. La famiglia dei fattori STAT consiste di sette membri (codificati dai geni STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B e STAT6) con funzioni biologiche diverse che vanno dal ruolo nella differenziazione, proliferazione, sviluppo, apoptosi e infiammazione cellulare. Una caratteristica delle proteine codificate da questi geni à ̈ quella di presentare un doppio ruolo, e cioà ̈ un ruolo di trasduzione del segnale nel citoplasma e di fattore di trascrizione nel nucleo. In particolare, un’attivazione costitutiva di STAT3 e in misura minore di STAT5, in diverse neoplasie à ̈ stata associata alla deregolazione di alcuni pathway intracellulari tra cui quelli coinvolti nella sopravvivenza del tumore, nella proliferazione della cellula tumorale e ma anche al processo di angiogenesi e metastasi del tumore stesso.

Yu H. et al in una review pubblicata su Nature nel 2009 (Nature Reviews Cancer 9, 798-809: 2009) riportano che l’attivazione persistente di STAT3 induce infiammazione che promuove il cancro e regola geni cruciali per l’infiammazione e il microambiente tumorale. Geni attivati da STAT3 sono riportati nelle tabelle 1 e 2 del lavoro sopra indicato, e sono descritti alcuni inibitori dell’attivazione di STAT3 anche tra sostanze naturali come curcubitacina, resveratrolo, galiellalattone e indirubina indicando che non sono comunque noti i meccanismi d’azione con cui agiscono queste sostanze.

In ogni caso il lavoro indica che la modulazione di STAT3 rappresenta un nuovo approccio più efficace ed altamente auspicabile per la cura del cancro riportando che l’ablazione del gene STAT3 in diversi modelli tumorali ha portato all’inibizione della crescita tumorale.

L’attivazione costitutiva di STAT3 à ̈ stata riportata in un gran numero di tumori, compresi il cancro al seno, cancro alla prostata, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, mieloma multiplo, linfomi e leucemie, tumore al cervello, cancro al colon, sarcoma di Ewing, cancro gastrico, cancro esofageo, cancro ovarico, cancro nasofaringeo, e cancro al pancreas (tabella 1 sotto). Per molti tipi di cancro, elevati livelli di STAT3 attivati sono stati associati con una scarsa prognosi. L’attivazione di STAT3 determina blocco dell’apoptosi e aumento della proliferazione cellulare e della sopravvivenza cellulare, promuovendo l'angiogenesi e metastasi, e inibendo le risposte immunitarie antitumorali. Linee cellulari tumorali in cui STAT3 à ̈ costitutivamente attivato richiedono la continua attivazione di STAT3, un fenotipo che à ̈ stato definito "dipendenza da oncogene" (Johnston PA e Grandis RG, MolInterv; 11 (1); 18-26:2011).

Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) à ̈ un tumore aggressivo derivante dalle cellule mesoteliali delle cavità sierose e, anche se la chemioterapia (spesso si usa pemetrexed) migliora il tempo di sopravvivenza in pazienti con MPM non operabile, il tempo di sopravvivenza medio globale à ̈ di solo 12 mesi. È stato recentemente riportato che un potenziale bersaglio terapeutico molecolare per l’MPM à ̈ la via di segnalazione interleuchina-6 (IL-6)/JAK/STAT3 attivata dall’alto livello di IL-6 presente nel liquido pleurico di pazienti con MPM. Il legame di IL-6 al suo recettore porta ad un cambiamento conformazionale nel recettore che avvia l’attivazione JAK, che a sua volta attiva la dimerizzazione del fattore di trascrizione STAT3, il dimero STAT3 trasloca nel nucleo, determinando in tal modo l'avvio della transattivazione di vari geni target.

Questo percorso à ̈ fondamentale per il verificarsi dell’ematopoiesi, della risposta immunitaria e dell’oncogenesi. Inoltre, à ̈ stato anche dimostrato che la disfunzione del sistema JAK/STAT3 à ̈ coinvolta nello sviluppo del cancro.

Inoltre, sempre in letteratura, à ̈ presente un’ampia descrizione del ruolo svolto da STAT3 nello sviluppo e nella progressione del tumore. Un’attivazione costitutiva di STAT3 à ̈ stata osservata sia in tumori del sangue (mieloma multiplo, leucemie, linfomi) sia in tumori solidi (melanomi, carcinoma delle ovaie, di prostata e delle cellule renali, adenocarcinoma pancreatico, cancro ai polmoni e al cervello). Per maggiore approfondimento, la tabella 3 riportata sotto, presa da Turkson J e Jove R, Oncogene ;19(56);6613-26: 2000 indica numerosi tumori direttamente associati all’attivazione anomala di STAT3. In particolare, quest’attivazione anomala sembra essere dovuta all’azione di tirosin-chinasi trasformanti, come v-Src, v-Ros, v-Fps, Etk/BMX e Lck o ad un segnale anomalo indotto dal rilascio autocrino o paracrino di citochine. L’attivazione costitutiva di STAT3 porta ad una maggiore espressione di geni che codificano per inibitori di apoptosi (es. Bcl-xL, Mcl-1), regolatori del ciclo cellulare (es. ciclina D1/D2, c Myc) e induttori di angiogenesi (es. VEGF: Vascularendothelialgrowthfactor). Infine, à ̈ stato recentemente dimostrato che oltre ad avere un ruolo chiave nella tumorigenesi, l’attivazione costitutiva di questo fattore di trascrizione conferisce resistenza alla morte indotta dai chemioterapici(Aggarwal B. B. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1091; 151-69: 2006).

Diverse ricerche cliniche hanno dimostrato che in vivo i tumori solidi crescono e si sviluppano in un ambiente con bassi livelli di O2 che rendono il tumore stesso insensibile ai segnali di morte cellulare e resistente ai trattamenti radio e chemioterapici; dall’altra parte l’ipossia promuove l’angiogenesi, la proliferazione e la capacità metastatica. L’aggressività del tumore sembra in questo contesto associata all’attivazione e alla stabilizzazione del fattore di HIF-1α determinata sia dall’ipossia che dall’iperattivazione di STAT3.

Per tale motivo una terapia anticancro basata sul targeting del fattore STAT3 Ã ̈ altamente desiderata (Niu G. et al. Mol Cancer Res, 6 (7); 1099-105: 2008).

La tabella 1, sotto riportata, Ã ̈ presa dal lavoro di Aggarwal B. B. et al. 2006, e riporta una lista di Tumori che esprimono STAT3 costitutivamente attivo, attivatori di STAT3, geni regolati da STAT3, e inibitori di STAT3

Tabella 1

STAT3 costitutivo Attivatori Geni Chinasi Inibitori Tumori ematopoietici EGF Antiapoptosi Tirosinchinasi non Sintetici -Mieloma multiplo IL-6 Bcl-xLrecettoriale AG490 -Leucemia HTLV-1- IL-5 Bcl-2 JAK Sodio salicilato dipendente IL-9 Mcl-1 JAK2 Atiprimod -CLL IL-10 cIAP-2 JAK3 BMS-354825 -CML IL-12 Survivina TYK2 Etanolo -AML IL-22 Src Nelfinavir -Leucemia a grandi lifociti TNF-α Progressione del PS-341 granulari MCP-1 ciclo cellulare Tirosinchinasi R115777 -Eritroleucemia GCSF Ciclina-D1 recettoriale WP-1034 -Policitemia vera GMCSF c-Myc EGFR Composti del platino -Linfoma di Burkitt correlato a CSF c-Fos ErbB-2 15-Deossi-delta EBV LIF p21 Gp130 12,14-PGJ2 -Micosi fungoide OSM Grb2 UCN-01 -Linfoma cutaneo a cellule T IFN-γ Invasione tumorale e Statina -Herpesvirus saimiri- MIP-1α metastasi Serinchinasi

dipendente (cellule T) RANTES MMP-2 JNK Peptidi -Linfoma di Hodgkin SLF MMP-9 P38MAPK SOCS3 -Linfoma anaplastico UVB β-catenina ERK PIAS

Shock osmotico VEGF GRIM-19 Tumori solidi Progestina hTERT Tirosin fosfatasi Adiponectina -Tumore mammario LPS IRF-1 SHP2 Duplina -Tumore al cervello Tabacco NLK SSI-1

STAT3 costitutivo Attivatori Geni Chinasi Inibitori -Carcinoma del colon HCV MyD88 α-Trombina -Sarcoma di Ewing RANKL Lipossina A4 -Carcinoma Gastrico TNF DIF-1 -Tumore al polmone β-macroglobulina PTPεC -Cancro del nasofaringe SOCS STAT3-DN -Carcinoma ovarico Angiotensinogeno Peptide decoy -Adenocarcinoma Antichimotripsina

pancreatico Naturali -Carcinoma prostatico Flavopiridolo -Carcinoma delle cellule Indirubina renali Magnololo -Carcinoma SCCHN Resveratrolo Piceatannolo Partenolide EGCG

Curcumina Cucurbitacina

Altri Rituzimab GQ-ODN Acido retinoico STA-21 EKB569

Legenda: STAT, Trasduttore del segnale e attivatore della trascrizione; CLL, Leucemia linfocitica cronica; CML, Leucemia mieloide cronica; AML, Leucemia mieloide acuta; SCCHN, Carcinoma a cellule squamose di testa e collo; HTLV, virus umano linfotrofico a cellule T; EBV, virus Epstein-Barr; Nelfinavir, Proteasi inibitore HIV-1; R115777, inibitore farnesiltrasferasico; A G490 e piceatannolo, inibitori tirosinchinasici; PIAS, proteina inibitore di STAT3 attivato, GQ-ODN, quartetto di oligonucleotidi G; SOCS, soppressore del segnale citochinico; GRIM, gene associato con la mortalità indotta da retinoidi-IFN, EGCG, epigallocatechin-3-gallato; SSI inibitori di STAT-STAT indotto;PTPεC, Proteina tirosin fosfatasi εC; DN, dominante negatico; Ekb-569, inibitore EGF-R; DIF-1, fattore 1 di induzione delle differenziazione; JAB, proteina contenente un dominio SH2; IL, interleuchina; TNF, fattore di necrosi tumorale; MDA, antigene di differenziazione del melanoma; MCP, proteina chemoattraente dei monociti; GCSF, fattore stimolante la colonia dei granulociti; LIF, fattori inibitorio della leucemia; OSM, oncostatina M; IFN, interferone; MIP, proteina infiammatoria dei macrofagi; RANTES, regolato sotto attivazione, espresso e secreto da cellule T normali; EGF, fattore di crescita dell’epidermide; LPS, lipopolisaccaride; VEGF, fattore di crescita endoteliale vascolare; MMP metalloproteasi di matrice; hTERT, trascrittasi inversa della telomerasi umana; SLF, fattore d’acciaio, HCV, virus epatite C.

Tabella 2 presa da Johnston PA e Grandis RG 2011 e mette in correlazione STAT3

con numerosi tumori, convalidando il fatto che STAT3 Ã ̈ effettivamente un target di

interesse per terapie anticancro.

Tabella 2

Caratterizzazione di Prognosi infausta Anormalità a monte e Modelli di tumori con elevata correlata ad alti livelli a valle del segnale di xenotrapianto espressione di STAT3 di STAT3 STAT3 responsivi e attività all’inibizione di STAT3 -Leucemia -Carcinoma delle cellule -Elevata espressione di -Carcinoma a cellule -Linfomi renali EGFR squamose di testa e -Mieloma multiplo -Cancro colonrettale -EGFR-RTK collo

-Cancro al seno -Carcinoma ovarico costitutivamente attivato -Glioblastoma -Carcinoma prostatico -Carcinoma gastrico -Overespressione di -Neoplasmi -Cancro al polmone -Adenocarcinoma SFK mieloproliferativi -Cancro al polmone (non gastrico di tipo -JAK iperattivate -Carcinoma delle cellule a piccole cellule) intestinale -Elevati livelli di TNF- renali

-Carcinoma delle cellule -Carcinoma a cellule α/IL-6 -Cancro al seno renali squamose della cervice -Adenocarcinoma -Carcinoma -Osteosarcoma polmonare epatocellulare -Carcinoma epiteliale -Leucemia linfoblastica -Colangiocarcinoma dell’ovaio acuta

-Carcinoma ovarico

-Adenocarcinoma

pancreatico

-Melanoma

-Carcinoma a cellule

squamose di testa e

collo

La tabella 3, presa da Turkson J e Jove R 2000 indica numerosi tumori direttamente

associati all’attivazione anomala di STAT3.

Tabella 3

Tipo di tumore STAT attivati Riferimenti

Tumori al seno (Garcia et al., 2000; Watson and Miller, 1995) tumori STAT 1, 3 (J Bromberg and JE Darnell, unpublished results;

P Chaturvedi and EP Reddy, unpublished results; R Garcia, C Muro-Cacho, S Minton, C Cox, N Ku, R Falcone, T Bowman and R Jove, unpublished results) cellule STAT 3 (Garcia et al., 1997; Sartor et al., 1997)

Tumori a collo e testa

Linee cellulari e tumori STAT 1, 3 (Grandis et al., 1998, 2000a)

Melanomi maligni

Linee cellulari e tumori STAT 1, 3 (Florenes et al., 1999; Kirkwood et al., 1999; Pansky et al., 2000)

Tumoripituitari

Lineecellulari STAT 1 (Ray et al., 1998)

Tumori al cervello

(tumori primari)

Gliomi STAT 1, 3 (Cattaneo et al., 1998)

Midolloblastomi STAT 3 (Cattaneo et al., 1998)

Menangiomicerebrali STAT 1, 3, 5 (Magrassi et al., 1999; Schrell et al., 1998) Mielomi multipli

Linee cellulari e tumori STAT 1, (Catlett-Falcone et al., 1999b)

Linfomi

(tumori e linee cellulari)

Linfoma anaplastico a STAT 3, 5 (Zhang et al., 1996c)

grandi cellule T

Sindrome di Sezary STAT 3, 5 (Zhang et al., 1996c)

HSV Linfoma di Burkitt EBV

correlato STAT 3 (Weber-Nordt et al., 1996)

HSV Saimiri-dipendente

(cellule T) STAT 3 (Lund et al., 1997b, 1999)

Linfoma cutaneo cellule T STAT 3 (Sun et al., 1998)

Linfoma a cellule T LSTRA STAT 5 (Yu et al., 1997)

(topo)

Micosi fungoidi STAT 3 (Nielsen et al., 1997)

Leucemie (tumori e linee

cellulari)

Tipo di tumore STAT attivati Riferimenti

HTLV-I dipendenti STAT 3, 5 (Migone et al., 1995; Takemoto et al., 1997)

Leucemia linfocitica cronica

(CLL) STAT 1, 3 (Frank et al., 1997)

Leucemia mielogena acuta

(AML) STAT 1, 3, 5 (Chai et al., 1997; Gouilleux-Gruart et al., 1996; Weber-Nordt et al., 1996)

Leucemia megacariocitica STAT 1, 3, 5 (Liu et al., 1999)

Leucemia a grandi linfociti

granulari (LGL) STAT 3 (Epling-Burnette et al., 2000)

ALTRI TUMORI

(tumori e linee cellulari) L Mora, R Garcia, J Seigne, T Bowman, M Huang, G Prostata STAT 3 Niu, J Pow-Sang, J Diaz, C Muro-Cacho, D Coppola, T Carcinoma cellule renali STAT 3 Yeatman, J Cheng, S Nicosia, S Shivers, T Landowski, Carcinoma ovarico STAT 3 D Reintgen, W Dalton, H Yu and R Jove, Melanoma STAT 3 unpublishedresults

In particolare, relativamente a STAT3, Ã ̈ stato dimostrato quanto segue in numerose pubblicazioni:

1) STAT3 Ã ̈ spesso costitutivamente attivo (fosforilato) in molte cellule di cancro umano come mieloma multiplo, linfoma, leucemie, cancro al polmone, cancro della prostata, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo ed altre tipologie tumorali.

2) STAT3 à ̈ attivato da fattori di crescita (es. EGF, TGF-α, IL-6, IL-10, IL-23, IL-21, IL-11, HGF), chinasioncogeniche ( es. Src).

3) STAT3 media l’espressione di geni della proliferazione (es. c-myc, ciclina D1) di geni soppressori dell’apoptosi (es. Bcl-XL e survivina), di geni codificanti citochine, e di geni che promuovono l’angiogenesi (es. VEGF) aumentando, quando attivato, la proliferazione cellulare e l’angiogenesi e inibendo l’apoptosi.

4) L’attivazione di STAT3 correla anche con fenomeni di chemioresistenza e radioresistenza.

5) L’attivazione persistente di STAT3 aumenta in diversi cancri dell’uomo la proliferazione, la sopravvivenza, l’angiogenesi e le metastasi e inibisce l’immunità antitumorale.

E’ anche noto che l’infiammazione cronica in specifici organi o siti promuove la trasformazione maligna, à ̈ che STAT3 à ̈ cruciale per le vie estrinseche ed intrinseche delle infiammazioni che portano a cancro, STAT3 à ̈ infatti noto per guidare le caratteristiche maligne associate all’infiammazione cronica.

A causa del ruolo cruciale di STAT3 nella tumorigenesi, gli inibitori di STAT3 hanno un potenziale enorme nella prevenzione e nel trattamento del cancro. Forse uno dei più noti inibitori dell’attivazione STAT3 à ̈ AG490, che inibisce l'attivazione di JAK2. Altri inibitori di STAT3 includono piccoli peptidi, oligonucleotidi, e piccole molecole. Alcuni autori hanno identificato peptidi che bloccano la fosforilazione/attivazione di STAT3, meccanismo che media il legame al DNA e l’attività di regolazione genica, e trasformazione cellulare. Diverse piccole molecole che bloccano STAT3 includono PGJ2, complessi del platino, etanolo, salicilato di sodio, acido retinoico, atiprimod, PS-341, estatine. Molti polifenoli vegetali sono stati identificati per la loro capacità di sopprimere l'attivazione di STAT3. Questi includono la curcumina, il resveratrolo, la curcurbitacina, l’indirubina, il piceatannolo, il partenolide, il flavopiridolo, il magnololo, e epigallocatechina-3-gallato. Come queste molecole riescano a sopprimere l’attivazione di STAT3 non à ̈ del tutto chiaro. Per esempio la curcumina ha dimostrato di inibire JAK2, Src, Erb2, e EGFR, che sono tutti implicati nell’attivazione di STAT3, downregulando anche l'espressione di Bcl-xL, ciclina D1, VEGF, e TNF la cui espressione à ̈ regolata da STAT3 (Aggarwal B. B. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1091; 151-69: 2006).

Ci sono quindi varie strategie e vari meccanismi che permettono di intervenire nella cascata di segnalazione di STAT3: inibire la fosforilazione/attivazione di STAT3, inibire le interazioni intermeolecolari che coinvolgono STAT3, inibire l’importo/esporto nucleare di STAT3, inibire la trascrizione mediata da STAT3. Oltre ai chemioterapici inibitori di STAT3, già menzionati prima, ne esistono altri (cetuximab Gefitinib, erlotinib, etc) di cui si riportano diversi effetti: una modesta efficacia, lo sviluppo di resistenze, la mielosoppressione, la tossicità a livello gastro-intestinale, e vari eventi avversi tra cui la tossicità cardiovascolare (vedi tabella 4).

La tabella 4, sotto, presa da Johnston PA e Grandis RG 2011, riporta strategie e risultati per l’intervento terapeutico del segnale di STAT3.

Tabella 4

Strategie Target Esempi Risultati Inibizione della EGFR agonismo Cetuximab, panitumumab, Modesta efficacia; fosforilazione/attivazione di Attività TKR Gefitinib, erlotinib, sviluppo di resistenze;

STAT3 Attività JAK lapatinib, AG490, LS-104, mielosoppressione;

Attività SFK ICNB1824, CEP-701, tossicità gastro-Dasatinib, AZD0530, intestinale (GI) e eventi basutinib avversi; selettività chinasica e tossicità cardiovascolare Inibire le interazioni Domini SH-2 di Oligopeptidi designati da Scarsa permeabiltà intermolecolari che STAT3 EGFR, gp130, e altri cellulare ed efficacia; coinvolgono STAT3 recettori o peptidi scarsa stabilità contenenti pY; peptidi metabolica; scarsa ottameri, quartetto di selettività per domini oligonucleotidi G; piccole SH2 specifici; potenziali molecole peptidomimetici eventi avversi Inibire l’importo/esporto Importine α3, α5,α7 Karyostatin 1A (effetti su Natura multicomponente nucleare di STAT3 Importina β STAT3 non determinati), del poro nucleare e Esportina 1 Leptomycin B e Ratjadone traslocazione non A completamente determinate; problematica specificità per la traslocazione delle proteine

Inibizione della trascrizione Sito di legame sul dsODNdecoy; peptidi Scarsa permeabilità STAT3-mediata DNA per STAT3 ottameri cellulare senza effettivi e specifici sistemi di distribuzione; scarsa stabilità metabolicaProdotti naturaliNon specificato Guggulsterone, onokiolo, Specificità, potenza, e curcumina, resveratrolo, efficacia, meccanismo di flavopiridolo, cucurbitacina azione sconosciuto

Terapie mirate, per mezzo di composti che inibiscono una specifica molecola bersaglio

in modo più specifico, in sottopopolazioni di cellule direttamente coinvolte nella

progressione tumorale rappresentano una nuova prospettiva nel trattamento del

cancro. Le molecole che controllano la proliferazione cellulare e la morte, come i

recettori della tirosin-chinasi (RTK) per fattori di crescita, sono tra i migliori obiettivi di

questo tipo di approccio terapeutico. L'era della terapia mirata ha avuto inizio con

l'approvazione di trastuzumab, un anticorpo monoclonale contro HER2, per il

trattamento del carcinoma mammario metastatico e Imatinib, un inibitore di BCR-ABL,

nella leucemia mieloide cronica. Nonostante l'entusiasmo iniziale per l'efficacia di

questi trattamenti, i medici hanno dovuto affrontare subito il problema della recidiva, in

quanto quasi sempre i malati di cancro hanno sviluppato una resistenza ai farmaci,

spesso a causa dell'attivazione di percorsi alternativi. Essendo il tumore caratterizzato

da più meccanismi e più target genici frequentemente disregolati sarebbe auspicabile adottare una terapia di combinazione come cura standard nel trattamento del cancro, poiché risulta una strategia razionale per aumentare la risposta e la tollerabilità e per diminuire la resistenza. Attualmente, vi à ̈ un crescente interesse per la combinazione di farmaci antitumorali che mirano a massimizzare l'efficacia, riducendo al minimo la tossicità sistemica attraverso l’uso di dosi inferiori di farmaco.

Così, agenti terapeutici farmacologicamente sicuri ed efficaci come molecole di derivazione naturale, che possono bloccare l'attivazione costitutiva o inducibile di STAT3 hanno una potenziale efficacia nel trattamento del cancro dato che sempre più prove concludono che l'inibizione della fosforilazione di STAT3 attraverso un blocco farmacologico di molecole a monte, quali Src e JAK può ridurre la formazione di tumori portando anche alla possibile diminuzione nel dosaggio di farmaco chemioterapico necessario.

Inoltre, poiché l’attivazione di STAT3 correla anche con la resistenza alla chemio ed alla radioterapia, inibitori di tale attivazione sono di forte interesse anche per limitare tale resistenza ed ottimizzare l’effetto della chemioterapia e della radioterapia.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che estratti di carciofo (Cynara spp.) sono in grado di modulare in modo selettivo, essenzialmente inibendola, la fosforilazione della proteina STAT3, impedendone conseguentemente la successiva azione all’interno della cellula come fattore trascrizionale. Come si vedrà nella parte sperimentale della domanda, gli autori dell’invenzione hanno dimostrato, in numerosi esperimenti e su varie linee cellulari, che gli estratti qui descritti sono efficaci inibitori dell’attivazione (fosforilazione) di STAT3 e, come conseguenza,

-esercitano una efficace azione citotossica su linee cellulari tumorali,

-sono in grado di inibire la rigenerazione di cellule tumorali funzionando quindi come citostatici,

-inducono apoptosi su cellule tumorali

-hanno effetti additivi e anche sinergici con numerosi chemioterapici che risultano in una diminuzione della vitalità delle cellule tumorali rispetto a quelle trattate con il solo chemioterapico o con il solo estratto.

Dal punto di vista dell’effetto di tali estratti sul fattore STAT3, gli autori della presente invenzione hanno anche sperimentalmente dimostrato che gli estratti di Cynara spp. qui descritti sono in grado di impedire il legame di STAT3 al DNA e di impedire, quindi, l’alterazione dell’espressione dei geni normalmente attivati da STAT3 fosforilato.

In altre parole, detto estratto si à ̈ dimostrato capace di modulare, essenzialmente inibendo, la proteina STAT3 nella sua forma fosforilata, impedendone la successiva azione all’interno della cellula come fattore trascrizionale. In particolare, gli inventori della presente divulgazione hanno dimostrato che un estratto di Cynara spp. à ̈ in grado di inibire l’attivazione costitutiva o anomala STAT3 e di indurre la riattivazione dell’apoptosi in colture di cellule tumorali. Inoltre, gli autori della presente invenzione hanno anche dimostrato che in esperimenti su colture di cellule tumorali, l’estratto di Cynara spp. inibisce il wound healing, inibendo, di fatto, l’invasività delle cellule tumorali. Inoltre, gli autori della presente invenzione hanno anche dimostrato con esperimenti di engraftment di cellule tumorali in topo, che l’estratto della presente invenzione esercita in vivo un effetto antitumorale.

Un primo oggetto della presente invenzione à ̈, quindi, un estratto di Cynara spp. per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

Un secondo oggetto della presente invenzione à ̈ un estratto di Cynara spp. per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 in associazione con uno o più chemioterapici. Un terzo oggetto della presente divulgazione à ̈ una composizione comprendente un estratto di Cynara spp. e un veicolante e/o diluente e/o eccipiente per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

In una forma di realizzazione la composizione comprende anche uno o più componenti con attività anti-apoptotica.

Un quarto oggetto della presente invenzione à ̈ una composizione à ̈ un estratto di Cynara spp. in associazione con uno o più componenti con attività antitumorale e/o antiinfiammatoria e un veicolante e/o diluente e/o eccipiente per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

Un quinto oggetto della presente invenzione à ̈ un Kit per la somministrazione concomitante o sequenziale di un estratto di Cynara spp. e di uno o più chemioterapici comprendente una o più aliquote di un estratto di Cynara spp. o di una composizione comprendente un estratto di Cynara spp. e una o più aliquote distinte di una o più composizioni comprendente un chemioterapico per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 in associazione con un chemioterapico.

Un sesto oggetto dell’invenzione à ̈ un metodo terapeutico per la prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 comprendente il passaggio di somministrare ad un individuo che ne abbia bisogno un quantitativo terapeuticamente attivo di estratto di Cynara spp., di composizione farmaceutica comprendente estratto di Cynara spp. opzionalmente in associazione con uno o più componenti aventi attività antitumorale e/o anti infiammatoria.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE

Nota: Nelle presenti figure l’estratto di Cynara spp. utilizzato à ̈ spesso indicato con la sigla ABO-1.

Figura 1: Inibizione della fosforilazione di STAT3, p-STAT3 (Y705)

Figura 1A Analisi Western Blot di lisati cellulari ottenuti da MSTO211H trattate con 100 µg/ml di estratto Cynara scolymus per 24 ore. La quantificazione à ̈ stata fatta rispetto ad un controllo di Actina.

Figura 1B Istogramma dei dati ottenuti con Western Blot su cellule MSTO211H. In nero p-STAT3 (STAT3 fosforilato) in grigio STAT3.

La figura mostra che l’estratto inibisce la formazione di p-STAT3 rispetto al controllo.

Figura 2: Analisi Western Blot di lisati cellulari di cellule MSTO211H trattate con 25-50-75 µg/ml di estratto Cynara scolymus nella riga p-STAT3, sotto, controllo di Actina. La figura mostra che l’estratto inibisce la fosforilazione STAT3 e che tale inibizione à ̈ dose dipendente.

Figura3: Clonogenic assay (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni) su linee cellulari di mesotelioma umano con vari dosaggi di estratto di Cynara scolymus

pannello 3a. Saggio effettuato su linea cellulare di Mesotelioma umano MSTO211H

pannello 3b : saggio effettuato su linea cellulare di mesotelioma umano NCI-H28

pannello 3 c. Saggio effettuato su linea cellulare di Mesotelioma umano MPP-89

pannello 3d. Saggio effettuato su linea cellulare di Mesotelioma umano NCI-H2052

Figura 4: L’estratto dell’invenzione influenza la capacità di 3 differenti linee tumorali infiammatorie (HCT116, MDA-MB-231 E DU145) a formare colonie, in modo dose dipendente, indipendentemente dal loro istotipo.

pannello 4a. Saggio effettuato su linea cellulare di tumore del colon HCT116 pannello 4b. Saggio effettuato su linea cellulare di tumore della propstata DU145 pannello 4c. Saggio effettuato su linea cellulare di tumore della mammella MDA-MB-231

Figura 5: Saggio di vitalità cellulare con test ATPlite (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni) su linee cellulari di mesotelioma (MSTO211H, MPP-89,NCI-H28). Il saggio mostra che la vitalità cellulare à ̈ inibita dall’estratto di Cynara scolymus dell’invenzione in maniera dose dipendente in diverse linee cellulari di mesotelioma.

Figura 6: confronto delle tre curve di vitalità della figura 5 rispetto (Figura 6a MSTO211H, Figura 6b MMP-89, Figura 6c NCI-H28) alla curva di proliferazione ottenuta trattando cellule di mesotelio normale (HMC) con estratto di Cynara scolymus. Le linee cellulari di mesotelioma maligno (MPMs) risentono maggiormente dell’effetto anti-proliferativo dell’estratto di Cynara scolymus rispetto alle HMC.

Figura 7 Saggio di vitalità cellulare nella linea cellulare di adenocarcinoma prostatico DU-145 a confluenza, trattata con diverse concentrazioni di estratto di carciofo (50-600 µg/ml) per tempi di trattamento diversi (24 e 48 ore) con indicazione del contenuto in cinaropicrina dell’estratto. La confluenza delle cellule aumenta i livelli di STAT3 costitutivamente attivato rendendo le cellule stesse maggiormente resistenti alla morte. La vitalità à ̈ stata analizzata con il saggio WST-1 (test WST-1 vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La figura mostra che l’estratto inibisce la vitalità in maniera tempo e dose dipendente. I quadrati mostrano l’andamento in 24 ore e i cerchi l’andamento a 48 ore con dosaggi di estratto da 0 a 600 µg/ml ed il rispettivo contenuto in cinaropicrina, espresso sia in µg/ml che in µM, dell’estratto alle diverse concentrazioni (100, 200, 300, 400, 500, 600 µg/ml).

Cellule con alti livelli di attivazione di STAT3: i risultati ottenuti dimostrano che l’estratto inibisce la vitalità cellulare con EC50=380 microg/ml a 24 ore e EC50= 100 µg/ml a 48ore

Figura 8. Saggio di vitalità cellulare nella linea cellulare di adenocarcinoma prostatico DU-145 a confluenza, trattata con diverse concentrazioni di cinaropicrina (0-70 µM) per tempi di trattamento diversi (24 o 48 ore). La confluenza aumenta i livelli di STAT3 costitutivamente attivato rendendo le cellule maggiormente resistenti alla morte. La vitalità à ̈ stata analizzata con il saggio WST-1 (test WST-1vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La figura mostra che la cinaropicrina inibisce la vitalità cellulare in maniera tempo e dose dipendente. I quadrati mostrano l’andamento in 24 ore e i triangoli a 48 ore con differenti concentrazioni: 10, 20, 30, 40, 50, 60µM di cinaropicrina.

I dati presentati dimostrano che la cinaropicrina à ̈ meno efficace dell’estratto di carciofo. La figura mostra che la cinaropicrina inibisce la vitalità e la proliferazione cellulare in maniera tempo e dose dipendente in maniera molto meno efficace rispetto all’estratto di carciofo (vedere come paragone la figura 8). Per es: per avere un effetto di riduzione della vitalità pari a circa il 90% sono necessari trattamenti con 50 µM per 48 ore, rispetto a 0.94 – 2.82 µM necessari quando la cinaropicrina à ̈ contenuta all’interno dell’estratto liofilizzato.

Figura 9. Saggio di vitalità cellulare nella linea cellulare DU145 non a confluenza, quindi con bassi livelli di STAT3 costitutivamente attivato, trattate con diverse concentrazioni di estratto di carciofo e diversi tempi di trattamento (24-48-72 ore). La vitalità à ̈ stata analizzata con il saggio WST-1 (test WST-1vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). I cerchi riportano un trattamento con 50 µg/ml di Cynara scolymus, i quadrati un trattamento con 100 µg/ml, e i triangoli un trattamento con 200 µg/ml. La figura mostra come la vitalità cellulare della linea cellulare DU145 sia fortemente compromessa da Cynara scolymus 200 µg/ml. I risultati ottenuti dimostrano che 200 µ/ml di estratto inibisce del 60% la vitalità cellulare a 24 ore. Come si vede, in confronto alla figura 8, relativa ad esperimenti su cellule ad alti livelli attivazione di STAT3, le EC50di questo esperimento sono notevolmente inferiori (circa 200 vs 380 µg/ml a 24 ore) a dimostrare una maggiore potenza di estratto dell’invenzione in cellule con basso livello di attivazione di STAT3 (non a confluenza). Tali esprimenti confermano quindi che le cellule in cui STAT3 à ̈ attivo hanno un maggior grado di malignità. L’inibizione della fosforilazione di STAT3 à ̈ il principale meccanismo di riduzione della vitalità cellulare

Figura 10: Saggio di vitalità cellulare (ATPliteassay) a seguito di trattamento con estratto di carciofo in associazione con Pemetrexed (PMTX) su linee cellulari di mesotelioma MPM (Fig. 11a MSTO211H e Fig. 11b NCI-H2052) e trasformate su cellule di mesotelio (Fig.11c HMC). Il trattamento con PMTX à ̈ risultato citotossico per le cellule MPM e fortemente tossico per le cellule non tumorali. Il co-trattamento delle cellule con l’estratto dell’invenzione PMTX ha avuto un effetto significativo sulla vitalità cellulare in linee cellulari di MPM mentre riduce la mortalità dovuta al Pemetrexed nelle cellule non trasformate (HCM). Di conseguenza, à ̈ evidente che l’estratto di carciofo dell’invenzione sensibilizza al Pemetrexed solo le cellule tumorali.

Figura 11 Saggio di vitalità cellulare WST-1 a seguito di trattamento con estratto di carciofo in associazione a chemioterapici diversi: Doxorubicina, Taxolo, Cisplatino (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni) su una linea cellulare umana di tumore alla prostata DU145. La vitalità à ̈ stata analizzata con il saggio WST-1 (test WST-1vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La figura 11a mostra la vitalità cellulare a seguito di trattamento per 24 ore, con due diversi dosaggi di estratto di carciofo (100 e 200 µg/ml), con solo Cisplatino a 10 µg/ml e con estratto di carciofo (100 e 200 µg/ml) in associazione con Cisplatino a 10 µg/ml.

La figura 11b mostra la vitalità cellulare a seguito di trattamento per 24 ore, con due diversi dosaggi di estratto di carciofo (100 e 200 µg/ml), con Doxorubicina a 1 µg/ml e di estratto di carciofo (100 e 200 µg/ml) in associazione con Doxorubicina a 1 µg/ml su cellule di carcinoma umano DU145.

La figura 11c mostra la vitalità cellulare a seguito di trattamento per 24 ore, con due diversi dosaggi di estratto di carciofo (100 e 200 µg/ml), con Taxolo 300 nM e di estratto di carciofo (100 e 200 µg/ml) in associazione con Taxolo 300 nM su cellule di carcinoma umano DU145.

In tutti gli esperimenti, l’estratto oggetto dell’invenzione potenzia la citotossicità dei tre chemioterapici con una efficienza maggiore nel caso del cisplatino

Figura 12. Saggio di vitalità cellulare dopo trattamento con associazioni di estratto di carciofo e Cisplatino su cellule di carcinoma umano DU145 (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La figura mostra il paragone tra trattamenti con estratto di carciofo (nero), Cisplatino (grigio chiaro) e carciofo Cisplatino (bianco) a diverse concentrazioni di estratto di carciofo e a concentrazione fissa di 15 µg/ml di Cisplatino.

Sono riportate in figura le relative concentrazioni di cinaropicrina.

L’estratto oggetto dell’invenzione potenzia la citotossicità del cisplatino con un effetto maggiore alla dose di 200 µg/ml.

Figura 13. Saggio di vitalità dopo trattamento con associazione di estratto di carciofo e Doxorubicina su cellule di carcinoma umano DU145 (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La figura mostra il paragone tra trattamenti con estratto di carciofo (nero), Doxorubicina (grigio chiaro) e carciofo Doxorubicina (bianco) a diverse concentrazioni di estratto di carciofo e a concentrazione fissa di 2 µg/ml di Doxorubicina.

Le relative concentrazioni di cinaropicrina sono le stesse riportate in figura 13.

L’estratto oggetto dell’invenzione potenzia la citotossicità della doxorubicina a partire da concentrazioni di 200 µg/ml.

Figura 14. Saggio di vitalità dopo trattamento con associazione di cinaropicrina e Cisplatino su cellule di carcinoma umano DU145 (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La figura mostra il paragone tra trattamenti con cinaropicrina (nero), Cisplatino (grigio chiaro) e cinaropicrina Cisplatino (bianco) a diverse concentrazioni di estratto di cinaropicrina e a concentrazione fissa di 15 µg/ml di Cisplatino.

Appare evidente come, per ottenere un effetto che riduca la vitalità cellulare sotto al 20% sia necessaria una molarità di cinaropicrina circa quaranta volte superiore a quella presente nell’estratto di carciofo (vedere figura 12).

Figura 15 Saggio di vitalità dopo trattamento con associazione di cinaropicrina e Doxorubicina su cellule di carcinoma umano DU145 (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La figura mostra il paragone tra trattamenti con cinaropicrina (nero), Doxorubicina (grigio chiaro) e cinaropicrina Doxorubicina (bianco) a diverse concentrazioni di cinaropicrina e a concentrazione fissa di 2 µg/ml di Doxorubicina.

Appare evidente come, per ottenere un effetto che riduca la vitalità cellulare sotto al 20% sia necessaria una molarità di cinaropicrina circa venticinque volte superiore a quella presente nell’estratto di carciofo (vedere figura 13).

Figura 16: Saggi di wound healing su linea cellulare di mesotelioma umano MSTO221H (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni).

Il pannello 16a mostra il wound healing a 36 nelle piastre di controllo con solo veicolo e con prodotto alla concentrazione di 6 µgi/ml mentre il pannello 16b mostra gli istogrammi relativi all’efficienza di chiusura del solco (quantificazione del numero di cellule %) trattate con l’estratto dell’invenzione o con veicolo ai tempi indicati

Figura 17: L’estratto di Cynara Scolymus modula il pathway di STAT3 nelle cellule DU145: in particolare, la figura mostra che l’estratto inibisce l’attivazione costitutiva di STAT3 nelle DU-145 e inibisce anche il legame di STAT3 al DNA.

• 17a) Western Blot: l’estratto di Cynara scolymus (200 µg/ml) inibisce la fosforilazione di STAT3 dopo 2-4 ore di trattamento senza modificare l’espressione della proteina

• 17b) EMSA,

EMSA: l’estratto di Cynara scolymus (200 µg/ml) inibisce il legame di STAT3 al DNA dopo 2-4 ore di trattamento nella linea cellulare DU-145 (Figura 17b).

Figura 18: L’estratto di Cynara Scolymus modula il pathway di STAT3 nelle cellule KARPAS: in particolare, la figura mostra che l’estratto inibisce l’attivazione costitutiva di STAT3 nelle KARPAS e inibisce anche il legame di STAT3 al DNA.

• 18a) Western Blot: l’estratto di Cynara scolymus (200 µg/ml) inibisce la fosforilazione di STAT3 dopo 2-4 ore di trattamento senza modificare l’espressione della proteina nella linea cellulare KARPAS

• 18b) EMSA: l’estratto di Cynara scolymus (200 µg/ml) inibisce il legame di STAT3 al DNA dopo 2-4 ore di trattamento nella linea cellulare KARPAS L’estratto di Cynara scolymus utilizzato contiene 0,181% di cinaropicrina, quindi 200 µg/ml di estratto contengono 1,2 µM cinaropicrina.

Figura 19: La cinaropicrina modula il pathway di STAT3 nelle cellule DU-145 La cinaropicrina inibisce nelle cellule DU-145 sia la fosforilazione di STAT3 che la sua capacità di legame al DNA con EC50=25µM (25µM cinaropicrina =circa 0,74 µg/ml) • Western Blot: 25µM di cinaropicrina inibiscono la fosforilazione di STAT3 nelle cellule DU-145 (Figura 19a)

• EMSA: 25microM di cinaropicrina inibiscono il legame di STAT3 al DNA nelle cellule DU-145 (Figura 19b)

Figura 20: La cinaropicrina modula il pathway di STAT3 nelle cellule KARPAS La cinaropicrina inibisce nelle cellule KARPAS sia la fosforilazione di STAT3 che la sua capacità di legame al DNA con EC50=25µM (25µM cinaropicrina =circa 0,74 µg/ml) • Western Blot: cinaropicrina (25µM) inibisce la fosforilazione di STAT3 nelle cellule DU-145 (Figura 19a)

• EMSA: cinaropicrina (25µM) inibisce il legame di STAT3 al DNA nelle cellule DU-145 (Figura 19b).

Figura 21: valutazione dell’impatto dell’estratto di Cynara scolymus sul ciclo cellulare (metodo FACS). L’estratto induce la morte delle cellule MPM (MSTO211H) mediante un aumento della % di cellule in fase sub G1, sia dopo trattamento per 48 ore (figura 21a) che dopo trattamento per 72 ore (figura 21b)

Figura 22 Saggi per valutare l’induzione di apoptosi (Metodo Western). L’estratto dell’invenzione alla dose di 100 µg/ml induce apoptosi come dimostrato dall’aumento dei livelli di alcuni marcatori apoptotici come la forma clivata (cleaved) di PARP e delle caspasi 3 e 7 nella linea celluare MSTO211H .

Figura 23 Saggio per valutare l’induzione di apoptosi mediante misurazione del livello Annessina V. L’estratto dell’invenzione induce apoptosi nella linea cellulare MSTO211H, come determinato dalla colorazione dell’Annessina V, in modo tempo e dose dipendente.

Figura 24 Analisi della concentrazione intracellulare di GSH (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni) a seguito di trattamento con diverse concentrazioni di cinaropicrina, triangoli 12,5µM, quadrati 25 µM, rombi 50µM.

La cinaropicrina determina una diminuzione tempo e dose dipendente della concentrazione intracellulare del GSH.

Figura 25 Saggio di glutationilazione di STAT3 (vedere sezione sperimentale relativa per le condizioni). La cinaropicrina determina la glutationilazione di STAT3. Lane 1. Controllo, lane 2 GSH 1mM, lane 3 Diammide 0,5 mM, Lane 4 GSSG, lane 5 cinaropicrina 12 microM, lane 6 cinaropicrina 25 µM.

I dati ottenuti in questo esperimento dimostrano che la cinaropicrina abbassa la concentrazione intracellulare di GSH (Figura 26) e che la variazione dello stato redox induce la glutationilazione di STAT3 impedendone la sua fosforilazione (Figura 27). Il ripristino dei valori fisiologici di GSH, mediate pre-trattamento con glutationeetilen estere, reverte la capacità della cinaropicrina di inibire la fosforilazione di STAT3.

Le figure 26 e 27 sono relative alla valutazione dell’attività antitumorale dell’estratto di carciofo nella linea cellulare MSTO211H, realizzata in topi nudi CD1 femmina di 6--†7 settimane (MPM tumor engrafment)

Figura 26: Effetto del carciofo sull’engrafment di linee cellulari MPM

Le cellule MSTO211H sono state pretrattate con il carciofo per 24 ore. Poi sono state inoculate in topi nudi CD1. Il pretrattamento con l’estratto di carciofo ha influenzato l’engrafment del tumore e ha indotto una differenza statisticamente significativa (p= 0,01) nel volume del tumore.

Figura 27: Effetto dell’estratto di carciofo sul trapianto di cellule MPM. Topi CD1 con xenograft di MSTO trattati con quantità crescenti di estratto di carciofo, per 3 settimane. E’ stato osservato un effetto terapeutico e dose dipendente per l’estratto di carciofo. Come controllo positivo, il Pemetrexed (PMTX) à ̈ stato usato ad una concentrazione terapeutica nota. La figura mostra l’efficacia dell’estratto dell’invenzione paragonata alla concentrazione terapeutica nota del Pemetrexed * p < 0,0

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

La presente domanda riguarda quindi un uso dell’estratto di Cynara spp. nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie in cui à ̈ presente un’attivazione costitutiva o anomala del fattore STAT3. Come precedentemente indicato, l’attivazione anomala o costitutiva sembrerebbe consistere in una fosforilazione anomala o costitutiva di tale fattore con risultanti effetti infiammatori e/o tumorigenici sia nel sangue che nei tessuti. Nella seguente descrizione, nelle rivendicazioni e nei disegni il termine “STAT3†indica il fattore di trasduzione del segnale e attivazione della trascrizione STAT3 (SignalTransducer and Activator of Transcription 3). Convenzionalmente laddove si parla del gene sono utilizzate le lettere maiuscole con stile corsivo, mentre la proteina à ̈ indicata dal maiuscolo non corsivo.

E’ ormai noto in letteratura che l’infiammazione ed i tumori sono strettamente correlati da vie oncogeniche e ambientali, la fosforlilazione del fattore STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) ne causa l’attivazione e lo spostamento nel nucleo dove agisce da attivatore della trascrizione di numerose citochine, chemocine ed altri mediatori che sono associati all’infiammazione che promuove il cancro.

Inibitori dell’attivazione di STAT3 sono pertanto fattori che presentano un effetto preventivo e/o curativo verso tutte quelle patologie in cui à ̈ presente un’attivazione costitutiva del fattore STAT3. La presente invenzione divulga per la prima volta l’azione inibitoria specifica per STAT3 di estratti di Cynara spp.

Per carciofo o Cynara spp. ai fini della presente invenzione si intendono piante appartenenti al genere Cynara (Cynara spp.) come, ad esempio, Cynara cardunculus, Cynara boetica, Cynara cornigera, Cynara cyrenaica, Cybara humilis, Cynara siriaca, Cynara algarbiensis, Cynara aurantica. L’estratto di Cynara spp. secondo la presente invenzione potrà quindi essere un estratto da una delle specie sopra elencate o una miscela di estratti ottenuti da una o più delle specie sopra indicate o loro sottospecie.

In una forma di realizzazione della presente invenzione l’estratto di Cynara spp. potrà essere un estratto di Cynara cardunculus.

Come noto in letteratura, alla specie Cynara cardunculus sensu latu (s.l.) appartengono varie sottospecie, tra cui, Cynara cardunculus subsp. scolymus, Cynara cardunculus subsp. cardunculus, Cynara cardunculus subsp. flavescens.

L’estratto di Cynara cardunculus s. l. secondo la presente invenzione potrà quindi essere un estratto da una delle sottospecie sopra elencate o una miscela di estratti appartenenti ad una o più delle sottospecie sopra indicate.

Secondo una forma di realizzazione, l’estratto della presente invenzione sarà un estratto di Cynara cardunculus sottospecie scolymus.

Ai fini della realizzazione della presente invenzione, l’estratto potrà essere un estratto di foglie e/o capolini o loro miscele, sia fresche che essiccate.

Il termine capolini indica la testa del fiore prodotto dalla pianta, ad esempio il carciofo stesso (parte comunemente utilizzata come alimento). L’estratto potrà essere un estratto fluido, un estratto liofilizzato o essiccato mediante tecniche note di essiccazione. L’estratto si potrà ottenere mediante estrazione con i seguenti solventi: acqua, etanolo, metanolo, acetone, isopropanolo puri o in miscela tra loro. L’alcol potrà essere metanolo, etanolo, isopropanolo e preferenzialmente etanolo. L’etanolo può essere utilizzato puro o in miscela con acqua alle seguenti percentuali: 96%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%. In una forma non limitativa dell’invenzione il solvente utilizzato per l’estrazione potrà essere una miscela costituita da alcol etilico ed acqua in proporzione 50:50. L’estratto fluido potrà essere preparato mediante estrazione idroalcolica per percolo-digestione delle foglie di carciofo in rapporto droga/solvente da 1:2 a 1:100 e preferenzialmente in rapporto 1:10. La durata dell’estrazione à ̈ una durata comunemente utilizzata dal tecnico del settore e potrà essere, ad esempio, da un minimo 4 ore a circa 8 ore. La temperatura di estrazione à ̈ normalmente controllata e preferenzialmente potrà essere, ad esempio, una temperatura di circa 50°C. L’evaporazione dell’alcol dall’estratto idroalcolico ed il successivo essiccamento del concentrato acquoso potrà essere realizzata mediante liofilizzazione o disseccamento a fornire l’estratto liofilizzato o l’estratto secco.

La preparazione di tali estratti à ̈ comunemente nota al tecnico del settore e non necessita di particolari descrizioni nella presente divulgazione. Si potrà utilizzare, ai fini di realizzazione della presente invenzione, qualsiasi estratto tra quelli sopra indicati, preparato secondo tecniche convenzionali.

In particolare, ai fini della presente invenzione, l’estratto potrà essere anche una frazione degli estratti come qui descritti.

In questo caso un procedimento standard comporta l’evaporazione dell’alcool presente nell’estratto alcolico a 50° alcolici, l’allontanamento delle sostanze insolubili in acqua mediante centrifugazione a 4000 rpm per 1-5 minuti, l’introduzione della soluzione acquosa (concentrato acquoso) risultante in un colonna cromatografica contenente la resina di adsorbimento.

Il suddetto concentrato acquoso a sua volta può essere ottenuto sospendendo in acqua in rapporto 1:10 p/p l’estratto secco o liofilizzato di carciofo.

Il fluido di alimentazione della resina deve avere solidi sospesi indicativamente compresi tra 0.2 a 1° Bix, la portata di alimentazione à ̈ compresa tra 1 e 4BV/ora e preferibilmente 2 BV/ora. Il corrispondente eluato acquoso à ̈ raccolto e sottoposto ad essiccazione mediante liofilizzazione o disseccamento, le sostanze adsorbite alla resina sono eluite utilizzando alcol etilico 96%, o metanolo o Acetone, preferibilmente alcol etilico 96%. In quest’ultimo caso, l’eluato alcolico à ̈ sottoposto a disseccamento o a liofilizzazione, dopo aver aggiunto in quest’ultimo caso acqua in rapporto 1:1 v/v con l’eluato alcolico ed evaporato l’alcol etilico.

Secondo la presente invenzione, l’estratto di Cynara spp. come sopra definito, potrà essere utilizzato per la prevenzione e/o la cura di patologie caratterizzate da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

Tali malattie potranno essere, ad esempio, come noto in letteratura, malattie di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale.

Ai fini della presente invenzione, gli stati patologici caratterizzati da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 possono essere causati da infezioni virali (come noto in letteratura) quali infezioni da H pylori, infezioni da virus dell’epatite B, infezioni da HPV (human papilloma virus), infezioni da virus Epstein-Barr (come riportato in Yu et al 2009).

Come già detto per STAT3 s’intende quindi il fattore di trascrizione umano “Signal transducer and activator of transcription 3†codificato, nell’uomo dal gene STAT3.

L’invenzione riguarda stati patologici nell’uomo definiti in dettaglio nella presente descrizione (ad esempio sotto) in cui tale gene à ̈ attivato in maniera costitutiva o comunque anomala.

Gli stati patologici pretumorali in cui à ̈ presente un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3 possono essere sia stati patologici a seguito dell’ablazione di un tumore, quindi pretumorali nel senso che il tumore potrebbe riformarsi, sia stati patologici in cui avviene il passaggio dall’infiammazione all’acquisizione di caratteristiche maligne da parte delle cellule come riportato in letteratura.

Secondo la presente invenzione gli stati patologici tumorali potranno essere qualsiasi tumore caratterizzato da un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3 riportato nello stato della tecnica come ad esempio:

cancro alla prostata, mieloma multiplo, leucemie, linfoma, melanoma, carcinoma delle ovaie, carcinoma delle cellule renali, adenocarcinoma pancreatico, cancro ai polmoni, tumore cerebrale, eritroleucemia, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, cancro al colon, mesotelioma.

Più dettagliatamente, detto tumore cerebrale potrà ad esempio essere un glioma, un menangioma cerebrale, un midolloblastoma, detto linfoma potrà essere la sindrome di Sezary, il linfoma di Burkitt correlato ad EBV, il linfoma HSV Samiri-dipendente, il linfoma cutaneo correlato a cellule T; dette leucemie potranno essere la leucemia dipendente da HTLV-I, la leucemia linfocitica cronica (CLL), la leucemia mielogena acuta (AML), la leucemia megariocitica, la leucemia a grandi linfociti granulari (LGL) Secondo un esempio non limitativo, la presente invenzione, l’estratto di Cynara spp. come qui definito potrà essere utilizzato per la prevenzione e/o il trattamento di uno qualsiasi degli stati patologici caratterizzati da un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3 elencati nella tabella 1 sopra.

Come “attivazione costitutiva†o “attivazione anomala†di STAT3 secondo la presente invenzione, s’intende il significato dato a tali termini nella letteratura correlata a STAT3 (ad esempio riportata in bibliografia), ovvero un’attivazione persistente di tale fattore, comunemente assente nelle cellule sane.

Data la specificità nell’inibizione dell’attivazione e dell’attività di STAT3 mostrata dall’estratto dell’invenzione, quindi, l’estratto della presente invenzione potrà essere utile nel trattamento di patologie tumorali resistenti al trattamento con chemioterapici che non inibiscono STAT3. Un esempio non limitativo di chemioterapici che non inibiscono STAT3 à ̈ rappresentato dai farmaci chemioterapici usati per il mesotelioma, che à ̈ un tumore con pSTAT3 costitutivamente attivato e molto chemio resistente. Un esempio degli agenti comunemente usati sono il pemetrexed, che à ̈ un inibitore della timidilato sintasi; il metotrexato, che à ̈ un inibitore competitivo e reversibile della la diidrofolato reduttasi; la gemcitabina, che inibisce la sintesi del DNA agendo come falso substrato nelle vie biosintetiche dei nucleotidi pirimidinici; la vinorelbina, che à ̈ un farmaco antimitotico che si lega ai monomeri della tubulina inibendo la formazione dei microtubuli; il cisplatino che à ̈ un agente in grado di interferire con tutte le fasi del ciclo cellulare legandosi al DNA attraverso la formazione di legami crociati inter e intrafilamento nel DNA.

I dati sperimentali riportati sotto e nelle figure, ottenuti su linee di cellule tumorali in cui à ̈ nota l’attivazione costitutiva di STAT3, mostrano, inoltre, che l’estratto di Cynara spp. secondo l’invenzione potrà essere vantaggiosamente associato ad uno o più farmaci antitumorali, aumentando, in modo anche sinergico, l’efficacia antitumorale dei farmaci stessi.

Pertanto, secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, l’estratto di Cynara spp. come qui descritto potrà essere utilizzato nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3, in associazione con uno o più composti ad attività antitumorale e/o uno o più composti ad attività antiinfiammatoria.

Secondo una forma di realizzazione il composto ad attività antitumorale potrà essere un chemioterapico e potrà essere scelto nel gruppo comprendente cisplatino, doxorubicina, pemetrexed, metotrexato, vinorelbina, gemcitabina e taxolo.

La presente invenzione prevede quindi l’uso di estratto di Cynara spp. come qui definito in associazione con uno o più chemioterapici per la prevenzione e/o il trattamento di stati patologici tumorali o pretumorali caratterizzati da un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3.

L’associazione con uno o più chemioterapici potrà essere un’associazione concomitante o sequenziale, ovvero, l’estratto ed i chemioterapici potranno essere somministrati allo stesso momento (in un’unica somministrazione o in somministrazioni diverse) o in un arco di tempo di pochi minuti, oppure potranno essere somministrati in maniera sequenziale ovvero a tempi diversi, distanti tra loro più di qualche minuto, nell’arco della giornata o del periodo di trattamento terapeutico.

Il regime di somministrazione sarà stabilito dal medico curante secondo il sesso, l’età, lo stato di malattia, il peso e la storia anamnestica del paziente.

Sia da solo che in associazione, come sopra descritto, il trattamento potrà essere preventivo, ad esempio, in casi di infezioni note per avere possibili effetti tumorigenici come quelle sopra indicate, oppure nel caso di ablazione di tumori per evitare che gli stessi si riformino.

L’estratto secondo la presente invenzione potrà essere formulato in composizioni che potranno essere utilizzate per gli stessi scopi descritti sopra.

È quindi ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione comprendente, come principio attivo, un estratto di Cynara spp. e un veicolante e/o diluente e/o eccipiente per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

Come sopra indicato, l’estratto di carciofo o Cynara spp. ai fini della presente invenzione potrà essere un estratto da piante appartenenti al genere Cynara (Cynara spp.) secondo gli esempi e le definizioni forniti sopra.

La composizione potrà comprendere, come principio attivo, un estratto come sopra definito in forma di estratto liofilizzato, un estratto secco o un estratto fluido. Come già indicato, l’estratto può essere ottenuto per estrazione delle foglie di carciofo o dei capolini di carciofo o di miscele delle suddette parti sia fresche che essiccate. L’estrazione può essere eseguita mediante percolo-digestione, mantenendo la temperatura controllata a 50°C, il solvente di estrazione à ̈ rappresentato ad esempio da acqua, etanolo 96%, metanolo, acetone, isopropanolo, sia come tali che presi in miscela. L’estratto fluido ottenuto potrà poi essere sottoposto ad evaporazione e successiva liofilizzazione o essiccamento fornisce l’estratto liofilizzato o l’estratto secco. Secondo la presente invenzione, la composizione come sopra definita, potrà essere utilizzata per la prevenzione e/o la cura di patologie caratterizzate da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

Tali malattie potranno essere, ad esempio, come noto in letteratura, malattie di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale. La definizione dei vari stati patologici per i quali potrà essere utilizzata la composizione dell’invenzione à ̈ la stessa data sopra in relazione all’utilizzo terapeutico dell’estratto dell’invenzione.

Ai fini della presente invenzione, la composizione potrà trattare stati patologici caratterizzati da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 come già definiti sopra, stati patologici tumorali come già definiti sopra caratterizzati da una attivazione costitutiva o anomala di STAT3 e stati patologici pretumorali in cui à ̈ presente un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3 come già precedentemente illustrati nell’ambito della presente descrizione.

Secondo un esempio non limitativo, la presente invenzione, la composizione come qui definita potrà essere utilizzata per la prevenzione e/o il trattamento di uno qualsiasi degli stati patologici caratterizzati da un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3 elencati nella tabella 1 sopra.

Inoltre, secondo un’ulteriore forma di realizzazione, la composizione dell’invenzione come qui descritta potrà ulteriormente comprendere, come principi attivi, uno o più agenti antitumorali e/o uno o più agenti antiinfiammatori.

È quindi ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione comprendente come principi attivi, estratto di Cynara spp.e uno o più composti ad attività antitumorale e/o antiinfiammatoria per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

Secondo una forma di realizzazione tali composti ad attività anti tumorale potranno essere chemioterapici scelti, ad esempio, nel gruppo comprendente cisplatino, doxorubicina, pemetrexed, metotrexato, vinorelbina, gemcitabina e taxolo.

La composizione dell’invenzione potrà essere formulata in dosaggi unitari oppure in modo dosabile da parte del medico curante, al fine di permettere anche terapie adattate alle esigenze personali di ogni paziente.

La presente invenzione prevede quindi l’uso composizioni comprendenti un estratto di Cynara spp. come qui definito opzionalmente associazione con uno o più ulteriori principi attivi con attività antitumorale e/o uno o più ulteriori principi attivi con attività antiinfiammatoria per la prevenzione e/o il trattamento di stati patologici tumorali e/o infiammatori e/o pretumorali caratterizzati da un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3.

Tali ulteriori principi attivi potranno essere, ad esempio, composti chemioterapici e gli stati patologici potranno essere stati patologici pretumorali o tumorali.

L’associazione con gli uno o più chemioterapici potrà essere un’associazione concomitante o sequenziale, ovvero, l’estratto ed i chemioterapici potranno essere somministrati allo stesso momento (in un’unica somministrazione o in somministrazioni diverse) o in un arco di tempo di pochi minuti, oppure potranno essere somministrati in maniera sequenziale ovvero a tempi diversi, distanti tra loro più di qualche minuto, nell’arco della giornata o del periodo di trattamento terapeutico.

Il regime di somministrazione sarà stabilito dal medico curante secondo il sesso, l’età, lo stato di malattia, il peso e la storia anamnestica del paziente.

Sia da solo che in associazione, come sopra descritto, il trattamento potrà essere preventivo, ad esempio, in casi di infezioni note per avere possibili effetti tumorigenici come quelle sopra indicate, oppure nel caso di ablazione di tumori per evitare che gli stessi si riformino.

La composizione con uno o più principi attivi come sopra descritta (estratto di Cynaraspp. opzionalmente in associazione con uno o più agenti antitumorali e/o uno o più agenti antiinfiammatori), potrà ovviamente comprendere uno o più eccipienti od adiuvanti tecnologici impiegati nella comune pratica farmaceutica, cosmetica o nell’industria alimentare. Gli eccipienti impiegati potranno appartenere alle categorie dei diluenti, solubilizzanti, disgreganti, leganti, lubrificanti, tensioattivi, agenti di scorrimento ed antiaderenti.

Volendo la composizione potrà contenere anche aromatizzanti, coloranti e conservanti di comune impiego nell’industria farmaceutica cosmetica ed alimentare.

La composizione secondo l’invenzione potrà essere preparata secondo tecniche note al tecnico del settore ed utilizzando un estratto Cynaraspp. come sopra definito, opzionalmente uno o più agenti anti tumorali, e uno o più eccipienti appartenenti alle categorie sopramenzionate.

Le composizioni potranno essere in qualsiasi formulazione ritenuta idonea dal tecnico del settore allestendo formulazioni destinate alla somministrazione orale (quali ad esempio polveri, granulati, capsule in gelatina dura o molle, compresse, sciroppi, gocce soluzioni ed emulsioni orali), inalatoria (quali ad esempio aerosol, spray liquidi e polveri), topica (gel, unguenti, emulsioni, paste, schiume, forme solide anidre ad applicazione topica e cerotti) e per via parenterale secondo le tecniche attualmente in uso e note al tecnico del settore (ad esempio per uso sottocutaneo, intramuscolare, intravenoso o intradermico). In tutte le formulazioni il ricorso all’utilizzo di eccipienti od adiuvanti tecnologici avviene scegliendo le sostanze da impiegare nell’alveo di quelle comunemente utilizzate nella pratica farmaceutica.

Nella preparazione di formulazioni a base di estratto di Cynara spp in associazione o meno con agenti ad attività antitumorale, il tecnico esperto del settore potrà usare tutti gli eccipienti che riterrà utili secondo lo stato della tecnica per l’ottenimento di una preparazione stabile ed idonea all’impiego in terapia. A titolo esemplificativo nella categoria dei diluenti possono essere utilmente impiegati diluenti per formulazioni solide quali zuccheri, polialcoli (ad esempio lattosio, mannitolo, sorbitolo), cellulose, Sali di acidi inorganici (quali ad esempio calcio fosfato bibasico) Sali di acidi organici quali (citrati, tartrati carbonati e bicarbonati in forma di Sali di sodio, potassio e calcio) oppure diluenti per forme liquide quali acqua, olii edibili ad uso orale (olio di girasole, di oliva, di mais, di mandorle dolci, di nocciolo) oppure impiegati per formulazioni topiche (olio di jojoba, trigliceridi a catena corta, media o lunga), polialcoli (glicerina, glicole propilenico, glicole esilenico).

Nella categoria dei disgreganti possono trovare impiego, ad esempio, amidi nativi o modificati (amido di mais, di riso, di patata), sodio croscaramelloso, sodio amido glicolato, crospovidone; quali leganti si possono impiegare prodotti naturali tipo gomme (gomma guar, gomma xantano, gomma arabica), saccarosio e prodotti di sintesi quali polivinilpirrolidone e derivati semisintetici della cellulosa.

Come lubrificanti trovano efficace impiego l’acido stearico ed i suoi Sali quali quello di magnesio, polimeri del glicole etilenico, trigliceridi e cere naturali o di sintesi.

I tensioattivi hanno impiego per rendere più solubile o bagnabile dall’acqua uno o più principi attivi contenuti nelle formulazioni oggetto dell’invenzione agendo da soli oppure veicolati da uno o più diluenti. Possono essere citati ad esempio gli esteri del sorbitano, gli esteri del sorbitanopoliossietilenati, gli esteri del saccarosio ed il sodio laurilsolfato.

Gli agenti di scorrimento possono essere scelti ad esempio fra silice colloidale, silice precipitata mentre gli antiaderenti che possono trovare impiego sono ad esempio il talco o l’amido.

Nella preparazione di formulazioni iniettabili si potranno scegliere quegli eccipienti che consentono un’efficace solubilizzazione o dispersione del/delle sostanze attive. A titolo di esempio assieme all’acqua si possono impiegare altri veicoli idrosolubili quali polialcoli e Sali di acidi organici o inorganici allo scopo di ottenere pH ed osmolarità idonei alla somministrazione per via iniettiva.

In casi particolari sarà possibile ricorrere a veicoli non idrosolubili quali olii oppure sostanze di sintesi comunque approvate per uso iniettivo.

Il tecnico esperto del ramo potrà allestire tutte le formulazioni utilizzando i comuni schemi preparativi a lui noti.

A mero titolo esemplificativo, una formulazione in capsule potrà convenientemente essere preparata macinando preventivamente l’estratto di Cynara spp., miscelando in un comune miscelatore la polvere ottenuta assieme ad uno o più altri agenti antitumorali ed agli eccipienti scelti per allestire la formulazione quali ad esempio un diluente, un disgregante, un lubrificante ed un agente di scorrimento scelti fra quelli menzionati in precedenza oppure a disponibili sul mercato ed approvati per uso orale. Nel caso di una compressa potrebbe essere necessario granulare parte o tutta la miscela con un agente legante preventivamente sciolto in acqua oppure introdotto in miscela ed utilizzando l’acqua quale adiuvante del processo di granulazione secondo la tecnica nota.

Il granulato potrà essere essiccato, vagliato ed ulteriormente miscelato con altre polveri allo scopo di ottenere una miscela idonea all’ottenimento di compresse secondo quanto noto al tecnico del settore.

Nel caso di uso parenterale, la composizione potrà anche essere fornita con i principi attivi in contenitori separati miscelabili opportunamente secondo particolari esigenze operative.

Allo scopo di facilitare l’uso delle composizioni qui descritte possono essere presentate in forma di dosi unitarie contenenti uno dei principi attivi qui descritti (estratto di Cynara spp. e, opzionalmente uno o più agenti antitumorali e/o uno o più agenti antiinfiammatori) efficace per un uso preventivo e/o terapeutico di una particolare condizione patologica caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.

Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un kit per la somministrazione concomitante o sequenziale di un estratto Cynara spp. e uno o più composti ad attività antitumorale e/o uno o più composti ad attività antiinfiammatoria per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3, detto kit comprendendo una o più aliquote di un estratto di Cynara spp. come definito nella presente descrizione, e una o più aliquote di uno o più composti con attività antitumorale e/o una o più aliquote di uno o più composti ad attività antiinfiammatoria.

Alternativamente il kit potrà comprendere una o più aliquote della composizione contenente come principio attivo un estratto di Cynara spp. come definita nella presente descrizione ed una o più aliquote di uno o più composti ad attività antitumorale e/o una o più aliquote di uno o più composti ad attività antiinfiammatoria. Come sopra descritto, tali composti potranno essere chemioterapici scelti ad esempio nel gruppo comprendente cisplatino, doxorubicina, pemetrexed, metotrexato, vinorelbina, gemcitabina e taxolo.

Le patologie che potranno essere trattate o prevenute con il kit o con la composizione della presente invenzione sono quelle già indicate nella descrizione sopra, gli stati patologici caratterizzati da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 che possono ad esempio essere causati da infezioni virali (come noto in letteratura) quali infezioni da H pylori, infezioni da virus dell’epatite B, infezioni da HPV (human papilloma virus), infezioni da virus Epstein-Barr (come riportato in Yu et al 2009), oppure stati patologici tumorali che potranno essere rappresentati da qualsiasi tumore caratterizzato da un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3 riportato nello stato della tecnica.

Un esempio non limitativo di tali tumori comprende:

cancro alla prostata, mieloma multiplo, leucemie, linfoma, melanoma, carcinoma delle ovaie, carcinoma delle cellule renali, adenocarcinoma pancreatico, cancro ai polmoni, tumore cerebrale, eritroleucemia, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, cancro al colon, mesotelioma.

Più dettagliatamente, detto tumore cerebrale potrà ad esempio essere un glioma, un menangioma cerebrale, un midolloblastoma, detto linfoma potrà essere la sindrome di Sezary, il linfoma di Burkitt correlato ad EBV, il linfoma HSV Samiri-dipendente, il linfoma cutaneo correlato a cellule T; dette leucemie potranno essere la leucemia dipendente da HTLV-I, la leucemia linfocitica cronica (CLL), la leucemia mielogena acuta (AML), la leucemia megariocitica, la leucemia a grandi linfociti granulari (LGL). Gli stati patologici pretumorali in cui à ̈ presente un’attivazione costitutiva o anomala di STAT3 possono essere sia stati patologici a seguito dell’ablazione di un tumore, quindi pretumorali nel senso che il tumore potrebbe riformarsi, sia stati patologici in cui avviene il passaggio dall’infiammazione all’acquisizione di caratteristiche maligne da parte delle cellule come riportato in letteratura.

Infine, la presente descrizione ha per oggetto anche un metodo terapeutico per la prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 comprendente il passaggio di somministrare, ad un individuo che ne abbia bisogno, un quantitativo terapeuticamente attivo di estratto di Cynara spp. o di composizione farmaceutica comprendente estratto di Cynara spp. opzionalmente in associazione con uno o più composti antitumorali e/o antiinfiammatori.

Il metodo oggetto dell’invenzione potrà essere realizzato somministrando ad un soggetto che presenti una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3, dosaggi terapeuticamente efficaci dell’estratto come qui definito, opzionalmente in associazione con uno o più farmaci antitumorali o anti infiammatori; oppure somministrando dosaggi terapeuticamente efficaci della composizione come qui definita, opzionalmente ulteriormente comprendente uno o più farmaci antitumorali e/o anti infiammatori, oppure somministrando l’estratto e uno o più farmaci antitumorali e/o antiinfiammatori utilizzando il kit come qui definito.

La somministrazione, come descritto sopra, potrà essere effettuata in modo concomitante o sequenziale secondo il regime di somministrazione scelto dal medico.

Sono sotto riportati numerosi dati sperimentali che dimostrano l’efficacia dell’estratto secondo la presente invenzione.

LINEE CELLULARI UTILIZZATE

-L428 Linea cellulare umana Linfoma. Disponibili presso DSMZ ACC197

-KARPAS Linea cellulare umana Linfoma con STAT3 costitutivamente attivato. Disponibili presso Cell Bank Australia #6072604

Linea di cellule linfoma a cellule T umano, stabilito dal sangue periferico di uomo di 25 anni con linfoma a cellule T non-Hodgkin nel 1986, ora classificata come linea cellulare linfoblastoide linfoma. Karpas 299 esprime Stat3 fosforilato in tirosina 705 e serina 727.

-MSTO211H Linea cellulare umana Mesotelioma bifasico di polmone con STAT3 costitutivamente attivato. Disponibile presso ATCC #CLR-2081

Linea cellulare umana di Mesotelioma, stabilita dal versamento pleurico di un uomo di 62 anni caucasico con mesotelioma (maligno bifasico), che non aveva avuto alcuna precedente terapia. Linea cellulare MSTO211H esprime alti livelli di pStat3).(Tsao et al. Inhibition of c-Src expression and activation in malignant pleural mesothelioma tissues leads to apoptosis, cell cycle arrest, and decreased migration and invasion. MolCancerTher 2007;6:1962-1972.)

-DU-145 Linea cellulare di carcinoma umano disponibile presso ATCC #HTB-81 La linea cellulare DU145 Ã ̈ linea di cellule umane di cancro alla prostata che hanno moderato potenziale metastatico rispetto alle cellule PC3 che hanno un alto potenziale metastatico. Le DU145 non sono ormone-sensibili e non esprimono PSA (antigene prostatico specifico). La linea cellulare DU145 esprime pStat3 in modo costitutivo.

-HCT116 Linea cellulare umana di cancro al colon. Disponibile presso ATCC #CCL-247.

-MDA-MB-231 Linea cellulare umana di adenocarcinoma mammario. Disponibile presso ATCC #HTB-26.

-NCI-h28 Linea cellulare umana di mesotelioma a stadio 4. Disponibile pressoATCC#CRL-5820

-MPP-89 Linea cellulare umana di mesotelioma. Disponibile presso CABRI, numero d’accesso ICLC HTL00012

ESEMPI

1. Analisi della fosforilazione di STAT3 mediante Western Blot. Risultati riportati nelle figure 1-3.

1.1. Lisi cellulare e Westen blotting.

Le cellule sono state lisate in ghiaccio per 30 min in tampone di lisi NP40 (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA) complementato con inibitori della proteasi e fosfatasi (5 mM PMSF, 3 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM NaVO4). Quantità uguali di estratti di proteine totali (30 µg) sono stati risolti tramite elettroforesi denaturante (SDS-PAGE) in gel di poliacrilammide al 8% e trasferite per 2 ore su membrana di nitrocellulosa. Le membrane sono state bloccate con una soluzione al 5% di latte disciolto in TBS-Tween_200,05% per 1 ora e incubate con gli anticorpi primari specifici. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: antibeta actina (A-2228, SIGMA), anti-pSTAT3 (Tyr-705) (sc8059, Santa Cruz) e anti-STAT3 (sc7179, Santa Cruz). Gli anticorpi secondari erano perossidasi-coniugato (Santa Cruz), e sono stati utilizzati reagenti ECL (Amersham, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) per la chemio-luminescenza di rilevamento.

1.2. Trattamento delle linee cellulari di MPMs e di cellule normali di mesotelio (HMC) commerciali con estratto di Cynara scolymus.

Le linee cellulari di MPMs (MSTO-211H, NCI-H28, NCI-H2052, MPP89) sono state comprate dalla ATCC (Rockville, MD) mentre le HMC (Human Mesothelial Cells) sono state comprate dalla Tebu-Bio (France). Tulle le linee sono cresciute in monolayers a 37°C e al 5% di CO2 in specifici terreni di coltura. L’estratto di carciofo à ̈ stato opportunamente disciolto in una soluzione di acqua per soluzioni iniettabili ed etanolo in un rapporto di 1:1 ad una concentrazione iniziale di 30mg/ml. Per testarne le proprietà antitumorali, il prodotto à ̈ stato successivamente aggiunto direttamente nel terreno delle diverse linee cellulari utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi così come riportato nelle figure.

1.3. Risultati

I risultati, riportati nelle figure da 1 a 3, mostrano come l’estratto saggiato inibisca la fosforliazione di STAT3 rispetto ai controlli non trattati con l’estratto.

Le figure 1 e 2 riportano i dati ottenuti su cellule MSTO211H trattate con estratto di Cynara spp. secondo la descrizione.

In figura 1 sono riportati i dati con il controllo trattato con il solo veicolo ed estratto di Cynara spp. 100 µg/ml di terreno di coltura per 24 ore (controllo actina), e la figura 2 riporta i dati con cellule trattate 24 ore con diverse concentrazioni di estratto di Cynara spp.: 25µg/ml, 50 µg/ml, 75 µg/ml.

Come per la figura 1 sono riportati i dati con il controllo trattato con il solo veicolo ed estratto di Cynara spp.100µg/ml di terreno di coltura per 24 ore (controllo actina).

2. L’estratto di Cynara scolymus e la cinaropicrina inibiscono l’attivazione costitutiva di STAT3 nelle DU-145 e nelle KARPAS:

Come evidente dalle figure 17-20, sia l’estratto di Cynara scolymus che la cinaropricrina agiscono su STAT3. 200 µg/ml di estratto che contiene 0,181% di cinaropicrina, contengono 1,2 µM cinaropicrina. Le figure mostrano che l’effetto osservato con 25µM di cinaropicrina à ̈ pari all’effetto osservato con 200 µg/ml di estratto, con titolo di cinaropicrina pari a 0,181% che comprende1,2 µM di cinaropicrina. Poiché la dose di estratto utilizzata contiene 1,2 mM cinaropicrina, i dati ottenuti dimostrano che l’estratto à ̈ più efficace della cinaropicrina.

3. Saggio di clonogenicità su cellule di Mesotelioma Pleurico Maligno (MPM) Sono state seminate cellule MPMs (MSTO211H, NCI-H28; MPP-89; NCI-H2052), seminate a 200 cellule per pozzetto e trattati con diverse concentrazioni crescenti (controllo con solo veicolo; 12,5µg/ml; 25µg/ml; 50µg/ml; 100µg/ml, 200µg/ml) di estratto di Cynara scolymus secondo la presente descrizione. Ogni punto à ̈ stato piastrato in doppio nella multiwell da 6. Le colonie formate sono state colorate con cristal violetto 15-21 giorni dopo. Il saggio di formazione di colonie, noto anche come saggio clonogenico, à ̈ una tecnica utilizzata per valutare l’efficacia di composti antitumorali sulla capacità delle cellule tumorali di formare colonie a partire da una singola cellula. Si considera colonia un gruppo di 50 o più celle (cloni), che ha origine da una singola cellula.

I risultati dell’esperimento, riportati nelle figure 3a – 3d mostrano la capacità, dosaggio dipendente, dell’estratto dell’invenzione di inibire in maniera dose dipendente la formazione di colonie in tutte le linee cellulari MPMs testate.

Lo stesso saggio à ̈ stato effettuato anche su cellule HCT116 di cancro al colon, DU145 di cancro alla prostata e MDA-MB-231 di cancro al seno. Anche in questo caso i dati riportati nelle figure 4 a, b e c, mostrano l’efficacia di inibire in maniera dose dipendente la formazione di colonie da parte dell’estratto dell’invenzione.

4. Saggio di vitalità cellulareATPliteTM

La vitalità di diversi cellulari linee cellulari a seguito di esposizione all’estratto dell’invenzione a diverse concentrazioni à ̈ stata valutata con saggio ATPlite<TM>assay (Perkin Elmer) secondo le istruzioni del produttore. Dove indicato, veicolo ci si riferisce ad una soluzione di acqua per soluzioni iniettabili ed etanolo ad una concentrazione di 1:1 utilizzata negli stessi volumi usati per i trattamenti.

ATPLite<TM>à ̈ un sistema di monitoraggio dei livelli di adenosina trifosfato (ATP) basato sull’attività della luciferasi di lucciola (Fotinopyralis). Questo saggio di luminescenza à ̈ un'alternativa ai test colorimetrici, fluorimetrico e radioisotopici per la valutazione quantitativa della proliferazione di colture di cellule di mammifero sottoposte a trattamento con eventuali sostanze contenute nel terreno di coltura. Il monitoraggio di ATP à ̈ infatti utilizzato per valutare gli effetti citostatici e anti proliferativi di una vasta gamma di farmaci, modificatori della risposta biologica e composti biologici. Il sistema di test ATPLite<TM>à ̈ basato sulla produzione di luce causata dalla reazione con aggiunta di ATP luciferasi e D-luciferina. La luce emessa à ̈ proporzionale alla concentrazione di ATP entro certi limiti. La quantità di ATP in cellule correla con la vitalità cellulare.

È stata saggiata la vitalità cellulare di vari tipi di linee cellulari di MPM (MSTO211H, MPP89, NCI-H28, NCI-H2052) e di cellule HMC (cellule di mesotelio non trasformate fornite da donatori consenzienti) a seguito di trattamento con diverse concentrazioni di estratto secondo l’invenzione (controllo con solo veicolo; 12,5µg/ml; 25µg/ml; 50µg/ml; 100µg/ml, 200µg/ml).

Il grafico in figura 5, che riporta i risultati del saggio, mostra che l’estratto à ̈ in grado di ridurre fortemente vitalità cellulare in maniera dosaggio dipendente.

Gli effetti sulla vitalità cellulare sono stati testati anche su cellule di mesotelio non trasformate, HMC, verso le quali l’estratto oggetto dell’invenzione ha dimostrato una minore citotossicità rispetto alle linee tumorali (figure 6A – 6C).

5. Saggio di vitalità e proliferazione cellulare WST, comparazione tra l’efficacia citototossica dell’estratto dell’invenzione e della cinaropicrina.

La citotossicità à ̈ stata valutata saggio WST: il saggio prevede l’impiego di sali di tetrazolio solubili in acqua (WSTs Water solubleTetrazoliumsalts), e sfrutta la capacità delle deidrogenasi mitocondriali di scindere l’anello tetrazolico della molecola di WST di colore giallo (sale di tetrazolio) per dare un sale di formazano arancione. La quantità di formazano prodotta a seguito del trattamento delle cellule con le sostanze in esame à ̈ misurata allo spettrofotometro ed à ̈ proporzionale al numero di cellule vive. WST-1 ed in particolare WST-8 (2-(2-metossi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio), sono vantaggiosi rispetto all’MTT poiché si riducono al di fuori delle cellule, in combinazione con PMS come mediatore di elettroni, per produrre formazano solubile in acqua. Infine, i saggi WST: (1) possono essere letti direttamente (a differenza dell’MTT che necessita di una fase di solubilizzazione), (2) e danno un segnale più efficace dell’MTT, e (3) diminuiscono la tossicità per le cellule (a differenza dell’MTT il quale produce formazano insolubile che si accumula all'interno delle cellule).

Sono stati effettuati i seguenti saggi WSTs:

6.1 Saggio WST-1 sulla linea cellulare DU145 con 50, 100 e 200 µg/ml di estratto di Cynara scolymus a 24-48-72 ore riportato in figura 9

6.2 Saggio WST-1 sulla linea cellulare DU145 a 24 e 48 ore con 0-100-200-300-400-500-600 µg/ml d’estratto di Cynara scolymus (cinaropicrina =1.361%)che inibisce in modo dose e tempo dipendente la vitalità nelle DU-145. La figura 7, che riporta il saggio, mostra anche il contenuto in cinaropicrina, espresso sia in µg/ml che in µM, dell’estratto saggiato alle concentrazioni 100µg/ml; 200µg/ml; 300µg/ml; 400µg/ml; 500µg/ml; 600µg/ml (comprendente, rispettivamente, 0.47µM; 0.94 µM; 1,41µM; 1,88 µM; 2,35 µM e 2,82; di cinaropicrina).

6.3 Saggio WST-1 sulla linea cellulare DU145 a 24 e 48 ore con cinaropicrina 0-10-20-30-40-50-60 µM inibisce in modo dose e tempo dipendente la vitalità nelle DU-145. I risultati sono riportati nella figura 8.

Appare evidente, paragonando le figure 7 e 8 che l’estratto saggiato à ̈ oltre 40 volte più efficace della cinaropicrina.

7. Saggi di vitalità cellulare in co-trattamento con chemioterapici

Linee cellulari MSTO211H e NCI-H2052 sono state utilizzate per valutare gli effetti dell’associazione estratto di Cynara scolymus farmaco antitumorale.

Il saggio riportato nelle figure 10 Ã ̈ stato realizzato con ATPliteâ„¢assay (Perkin Elmer) secondo le istruzioni del produttore.

Ci si riferisce ad una soluzione di acqua per soluzioni iniettabili ed etanolo ad una concentrazione di 1:1 utilizzata negli stessi volumi usati per i trattamenti.

Reagenti:

Pemetrexed (Alimta, Lilly) diluito secondo le istruzioni del produttore.

7.1 Associazione estratto di Cynara spp. e pemetrexed con ATPliteâ„¢assay La figure 10 riportano le curve di vitalità per MSTO211H dopo 72h di trattamento con pemetrexed e pemetrexed in associazione con estratto di Cynara spp. nel pannello A à ̈ riportato il trattamento con l’estratto a dose non citotossica (6 µg/ml) e pemetrexed per le cellule MSTO211H, nel pannello B il trattamento con l’estratto a dose non citotossica (6 µg/ml) e con pemetrexed (varie concentrazioni) per le cellule NCI-H2052 e nel pannello C il trattamento con l’estratto a dose non citotossica (6 µg/ml) e con pemetrexed (varie concentrazioni) per le cellule non trasformate HMC. In ascissa sono riportate le concentrazioni del composto saggiato, in ordinata la vitalità cellulare espressa in percentuale.

La figure 10 A e B mostrano come il trattamento con l’estratto sensibilizzi le linee tumorali al trattamento con il pemetrexed. Nella curva con il doppio trattamento à ̈ evidente come solo una concentrazione di pemetrexed di 10µM sia sufficiente ad abbattere la vitalità cellulare delle linee testate. È interessante notare che, nella linea non tumorale, l’estratto ha un effetto protettivo verso il pemetrexed.

7.2 Valutazione vitalità cellulare con saggio WST-1

I saggi sono stati effettuati in parallelo con dosi variabili di cinaropicrina al posto dell’estratto, per paragonare l’efficacia dell’estratto e della cinaropicrina.

La figura 10 riporta i dati ottenuti incubando cellule DU145 con cisplatino (pannello A) doxorubicina (pannello B) e taxolo (pannello C) con il solo veicolo (cntr), con due diverse concentrazioni di estratto di Cynara scolymus (abo-1) con solo farmaco e con due diverse concentrazioni di estratto di Cynara scolymus (abo-1) in associazione con il farmaco.

L’estratto utilizzato negli esperimenti riportati in figura 11 aveva un contenuto dello 0,181% in cinaropicrina. La figura riporta quindi le concentrazioni di cinaropicrina con 100 e 200 µg/ml di estratto, pari a, rispettivamente, 0,18 e 0,36 µg/ml di cinaropicrina.

La figura 11 mostra l’associazione tra concentrazioni crescenti di estratto di Cynara Scolymus (cinaropicrina =1.361%) e cisplatino a concentrazione fissa 15 µg/ml e la figura 12 mostra l’associazione tra estratto di Cynara Scolymus (cinaropicrina =1.361%) e doxorubicina a concentrazione fissa 2 µg/ml.

La figura riporta i valori anche per il trattamento con solo estratto (nero) o solo farmaco (bianco).

Le figure 13, e 14, analoghe alle figure 11 e 12, mostrano i risultati degli stessi esperimenti effettuati con cinaropicrina al posto dell’estratto dell’invenzione, e dimostrano come l’estratto sia estremamente più efficace della cinaropicrina.

La figura 14 mostra quindi l’associazione tra cinaropicrina a concentrazioni crescenti e cisplatino a concentrazione fissa 15 µg/ml e la figura 14 mostra l’associazione tra cinaropicrinae doxorubicina a concentrazione fissa 2 µg/ml.

La figura riporta i valori anche per il trattamento con sola cinaropicrina (nero) o solo farmaco (bianco).

8. Saggio di woundhealing

Il saggio di wound healing (figura 16) à ̈ semplice, poco costoso, e uno dei primi metodi sviluppati per studiare la migrazione direzionale cellulare in vitro. Questo metodo imita la migrazione cellulare durante la cicatrizzazione in vivo. Il passaggio di base comporta la creazione di una "ferita" in un monostrato di cellule, e il successivo monitoraggio di una specifica zona delle “ferita†attraverso l’acquisizione di immagine all'inizio e ad intervalli regolari durante la migrazione cellulare necessaria per la chiusura della “ferita†. Le cellule MSTO211H coltivate ad una confluenza del 95% sono state seminate in piastre di tessuto da 6 pozzetti e la “ferita†(o solco) à ̈ stata realizzata con una punta per pipetta sterile da 10-microlitri per rimuovere le cellule. Sono state effettuate miocrografie digitali dopo le ferite nei tempi indicati. L’istogramma finale mostra l'efficienza di chiusura del solco (numero quantificazione delle cellule%) trattate con veicolo o ABO 1 ai tempi indicati.

9. Saggio per valutare l’induzione di apoptosi

Vedere figure ( 26- 27)

9.1 Western blotting

È stata eseguita la stessa tecnica descritta nel punto 1.1 e sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: anti-beta actina (A-2228, SIGMA), anti-caspase-3 (31A1067, Alexis), anti-caspase-7 (#9492, Cell Signaling) e anti-PARP (#9542S, Cell Signaling).

9.2 Analisi FACS, colorazione PI e PI/Annessina V

Al fine di determinare l'effetto dell’estratto dell’invenzione sul ciclo cellulare, à ̈ stata effettuataun’analisi FACS.

Per la colorazione con ioduro di propidio (PI), le cellule sono state seminate in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 10<4>cellule/ml. Dopo 24 h, le cellule tumorali sono state trattate con concentrazioni indicate dell’estratto dell’invenzione per diversi intervalli di tempo. Sono state raccolte le cellule in sospensione e quelle adese, lavate in PBS, fissate con etanolo ghiacciato (70% v / v) e conservate a -20 °C. Per l'analisi, le cellule sono state lavate in PBS 1X e sospese in una soluzione di PBS 1Z, PI (25 mg / ml) e RNasi A (200 mg/ml).

Per la doppia colorazione PI/annessina V, le cellule trattate sono state raccolte e risospese in tampone di legame (HEPES pH 7,4, CaCl2 2,5 mM, NaCl 140 mM). Aliquote di cellule sono state incubate per 15 mincon Annessina V FITC e PI (5 mg/mL) (Invitrogen).

Durante tutte le analisi FACS, sono stati analizzati10<5>eventi per ciascun campione. Le analisi di citometriadi flusso sono state effettuate su un citometro di flusso GuavaEasyCyte 8HT (Millipore).

Come si vede dalla figura 25, l’estratto dell’invenzione induce apoptosi in cellule MSTO211H, come determinato dalla colorazione dell’Annessina V, in modo tempo e dose dipendente.

11. Saggio su Glutatione

La variazione dello stato redox cellulare, provocata dalla variazione del rapporto tra glutatione ridotto ed ossidato, determina la glutationilazione di STAT3 impedendone la sua fosforilazione in tirosina e conseguentemente la sua attivazione (Butturini E et al. PLoSOne.2011;6(5):e20174.).

11.1 Analisi intracellulare del GSH.

La concentrazione intracellulare del GSH à ̈ stata valutata mediante un metodo colorimetrico. L’estratto cellulare, deproteinizzato mediante acido tricloroacetico al 10%, à ̈ stato trattato con ditionitrobenzene (DTNB) e la quantità di TNB, che si libera in seguito alla reazione con GSH, à ̈ stata valutata analizzando la assorbanza a 412 nm.

11.2 Glutationilazione di STAT3

Lo STAT3 à ̈ stato immunoprecipitato incubando per tutta la notte l’estratto proteico cellulare con un anticorpo anti-STAT3. Le proteine ottenute sono state separate mediante SDS-PAGE in condizioni non riducenti e trasferite su membrana PVDF. Lo STAT3 glutationilato à ̈ stato riconosciuto con un anticorpo anti-GSH.

I dati riportati nelle figure 24 e 25 dimostrano che la cinaropicrina abbassa la concentrazione intracellulare di GSH (Figura 24) e che la variazione dello stato redox induce la glutationilazione di STAT3 impedendone la sua fosforilazione (Figura 25). Il ripristino dei valori fisiologici di GSH, mediante pre-trattamento con glutatione etilen estere, reverte la capacità della cinaropicrina di inibire la fosforilazione di STAT3.

12. Trapianto di cellule tumorali trattate o non trattate con l’estratto dell’invenzione

Descrizione del primo esperimento di engrafment.

Le cellule MSTO211H sono state trattate con carciofo alla concentrazione di 50 µg/ml per 24 ore. Una sospensione di 2 x 10<6>di cellule in PBS /Matrigel (BD Biosciences) à ̈ stata raccolta e inoculata nel fianco destro di topi nudi femmine di 4 settimane. Il volume dei tumori à ̈ stato monitorato due volta la settimana fino al 21° giorno. I topi sono stati sacrificati e le masse espiantate.

13. Trapianto di cellule tumorali in topi e trattamento conCynarascolymus e pemtrexed

Descrizione del secondo studio di engraftment.

Le cellule sono state espanse prima dell’impianto e valutate per la loro vitalità e contaminazione, quindi sono state contate e risospese in PBS alla concentrazione di 20 x10<6>/ml. Alla sospensione à ̈ stato aggiunto il Matrigel per ottenere una concentrazione finale di 10x10<6>cellule/ml di PBS Matrigel 1/1. Le cellule MSTO sono state inoculate sottocute in 48 topi.

Quando il tumore raggiungeva il volume medio di 60 mm3, i topi venivano collocati in 8 gruppi composti da 6 animali per ciascun gruppo e ricevevano diversi trattamenti.

Due gruppi ricevevano carciofo in acqua da bere per 7 giorni alla settimana lungo un periodo di tre settimane; gli altri gruppi ricevevano Pemetrexed per via intraperitoneale per 5 giorni/la settimana un periodo di 3 settimane.

I gruppi sono stati così schematizzati nella tabella 5 sotto:

n° linea n° via volume trattam. A inizio via regime T rattam animali cellulare cellule trattam. somministraz. trattam. B Gruppo1 6 MSTO 2x10<6>sc 0.2ml Estratto (matrigel) Cynara 20pg/ml Gruppo 6 MSTO 2x10<6>sc 0.2ml Estratto 2 (matrigel) Cynara 50pg/ml Gruppo 6 MSTO 2x10<6>sc 0.2ml Estratto 3 (matrigel) Cynara 750pg/m Gruppo 6 MSTO 2x10<6>sc 0.2ml

4 (matrigel)

Gruppo 6 MSTO 2x10<6>sc 0.2ml Pemetrexed dopo IP 5 gg Estratto 5 (matrigel) (100mg/kg) comparsa di Cynara tumore seguito 20pg/ml Gruppo 6 MSTO 2x10<6>sc c.2ml Pemetrexed dopo IP 5 gg Estratto 6 (matrigel) (100mg/kg) comparsa di Cynara tumore seguito 50pg/ml Gruppo 6 MSTO 2x10<6>se 0.2ml Pemetrexed dopo IP 5 gg Estratto 7 (matrigel) (100mg/kg) comparsa di Cynara tumore seguito 75pg/ml Gruppo 6 MSTO 2x10<6>sc 0.2ml Pemetrexed dopo IP 5 gg

8 (matrigel) (100mg/kg) comparsa di

tumore seguito

SC= sotto cutaneo

trattam= trattamento

somministraz= somministrazione

IP= Intra Peritoneale

OS= orale

Alla comparsa della progressione tumorale (ossia quando il tumore raggiungeva i 60 mm3) il trattamento iniziava con Abo1 e Pemetrexed somministrato come segue: Pemetrexed alla dose di 100 mg/Kg in 88 ml/topo per 5 giorni consecutivi per via intraperitoneale) carciofo estratto nell’acqua da bere alle concentrazioni di 25, 50 e 75 microgrammi/ml e misurati a giorni alterni per un periodo di 3 settimane.

I topi sono stati monitorati giornalmente per valutare eventuali segni, il peso corporeo era monitorato bi settimanalmente.

Alla fine dell’esperimento (42 giorni dopo l’inoculo),le masse tumorali erano raccolte e fissate in formalina al 10% (dopo 24hrs trasferite in etanolo al 70%).

I diametri tumorali erano misurati bi settimanalmente con il caliperMitutoyo.

BIBLIOGRAFIA

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- Niu G. et al. Mol Cancer Res, 6 (7); 1099-105: 2008

-Turkson J. Jove R. “STAT proteins: novel molecular targets for cancer drug discovery†Oncogene.2000 Dec 27;19(56):6613-26

-Yu.H. et al “STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3†Nature Reviews Cancer 9, 798-809 (November 2009)

Claims (26)

1. RIVENDICAZIONI 1. Estratto di Cynara spp. per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.
2. 2. Estratto di Cynara spp. secondo la rivendicazione 1, in cui detto estratto à ̈ di Cynara Cardunculus, Cynara boetica, Cynara cornigera, Cynara cyrenaica, Cybarahumilis, Cynara siriaca, Cynara algarbiensis, Cynara aurantica o una loro miscela.
3. 3. Estratto secondo la rivendicazione 2 in cui detto estratto à ̈ di Cynara Cardunculus s. l..
4. 4. Estratto secondo la rivendicazione 3 in cui detto estratto à ̈ di Cynara cardunculus subsp. scolymus, Cynara cardunculus subsp. cardunculus, Cynara cardunculus subsp. flavescens o una loro miscela.
5. 5. Estratto secondo la rivendicazione 4 in cui detto estratto à ̈ di Cynara Cardunculus, sottospecie scolymus.
6. 6. Estratto di Cynara spp. secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui detto estratto à ̈ un estratto secco liofilizzato, o fluido di foglie di Cynara o di capolini o di miscele di entrambe le parti.
7. 7. Estratto di Cynara spp. secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 per uso nella prevenzione e/o nella terapia di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3 in associazione con uno o più composti ad attività antitumorale e/o antiinfiammatoria.
8. 8. Estratto di Cynara spp. secondo la rivendicazione 7 in cui detta associazione à ̈ realizzata mediante somministrazione concomitante o sequenziale di detto estratto con detti uno o più composti ad attività antitumorale e/o con detti uno o più composti ad attività antiinfiammatoria.
9. 9. Estratto di Cynara spp. secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7 o 8 in cui detti uno o più composti ad attività antitumorale sono scelti nel gruppo comprendente: cisplatino, doxorubicina, pemetrexed, metotrexato, vinorelbina, gemcitabina e taxolo.
10. 10. Estratto di Cynara spp. secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 in cui detto stato patologico à ̈ uno stato patologico tumorale scelto nel gruppo comprendente: cancro alla prostata, mieloma multiplo, leucemia, linfoma, melanoma, carcinoma delle ovaie, carcinoma delle cellule renali, adenocarcinoma pancreatico, cancro ai polmoni, tumore cerebrale, eritroleucemia, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, cancro al colon, mesotelioma.
11. 11. Estratto di Cynara spp. secondo la rivendicazione 10 in cui detto tumore cerebrale à ̈ glioma, menangioma cerebrale, midolloblastoma, in cui detto linfoma à ̈ la sindrome di Sezary, il linfoma di Burckitt correlato ad EBV, il linfoma HSV Samiri-dipendente, il linfoma cutaneo correlato a cellule T; in cui detta leucemia à ̈ leucemia dipendente da HTLV-I leucemia linfocitica cronica (CLL), leucemia mielogena acuta (AML), leucemia megariocitica, leucemia a grandi linfociti granulari (LGL)
12. 12. Estratto di Cynara spp. secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui detta condizione patologica à ̈ un tumore resistente al trattamento con chemioterapici che non inibiscono STAT3.
13. 13. Estratto di Cynara spp. secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui detta condizione di tipo infiammatorio à ̈ una infiammazione causata da infezioni virali quali infezioni da H pylori, infezioni da virus dell’epatite B, infezioni da HPV (human papilloma virus), infezioni da virus Epstein-Barr.
14. 14. Composizione comprendente come principio attivo un estratto di Cynara spp. come definito nelle rivendicazioni da 1 a 6, e un veicolante e/o diluente e/o eccipiente per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3.
15. 15. Composizione secondo la rivendicazione 14 ulteriormente comprendente, come principio attivo, uno o più composti ad attività antitumorale e/o antiinfiammatoria.
16. 16. Composizione secondo la rivendicazione 14 o 15 in cui detti uno o più composti ad attività anti tumorale sono scelti nel gruppo comprendente: cisplatino, doxorubicina, pemetrexed, metotrexato, vinorelbina, gemcitabina e taxolo.
17. 17. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 16 in cui detta condizione patologica à ̈ una condizione patologica tumorale scelta nel gruppo comprendente: cancro alla prostata, mieloma multiplo, leucemia, linfoma, melanoma, carcinoma delle ovaie, carcinoma delle cellule renali, adenocarcinoma pancreatico, cancro ai polmoni, tumore cerebrale, eritroleucemia, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, cancro al colon, mesotelioma.
18. 18. Composizione secondo la rivendicazione 17 in cui detto tumore cerebrale à ̈ glioma, menangioma cerebrale, midolloblastoma, in cui detto linfoma à ̈ la sindrome di Sezary, il linfoma di Burckitt correlato ad EBV, il linfoma HSV Samiri-dipendente, il linfoma cutaneo correlato a cellule T; in cui detta leucemia à ̈ leucemia dipendente da HTLV-I leucemia linfocitica cronica (CLL), leucemina mielogena acuta (AML), leucemia megariocitica, leucemia a grandi linfociti granulari (LGL)
19. 19. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 18, in cui detta condizione patologica à ̈ un tumore resistente al trattamento con chemioterapici che non inibiscono STAT3.
20. 20. Composizione secondo la rivendicazione 14 o 15 in cui detta condizione di tipo infiammatorio e/o pretumorale à ̈ una infiammazione causata da infezioni virali quali infezioni da H pylori, infezioni da virus dell’epatite B, infezioni da HPV (human papilloma virus), infezioni da virus Epstein-Barr.
21. 21. Kit per la somministrazione concomitante o sequenziale di estratto Cynara spp. e uno o più composti ad attività antitumorale e/o uno o più composti ad attività antiinfiammatoria per uso nella prevenzione e/o nel trattamento di una condizione patologica di tipo infiammatorio e/o pretumorale e/o tumorale caratterizzata da un’attivazione costitutiva o anomala del fattore trascrizionale STAT3, comprendente una o più aliquote di un estrattodi Cynara spp. come definito nelle rivendicazioni da 1 a 6, e una o più aliquote di uno o più composti con attività antitumorale e/o una o più aliquote di uno o più composti con attività antiinfiammatoria.
22. 22. Kit secondo la rivendicazione 21, in cui detti uno o più composti ad attività antitumorale sono scelti nel gruppo comprendente: cisplatino, doxorubicina, pemetrexed, metotrexato, vinorelbina, gemcitabina e taxolo.
23. 23. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 21 e 22, in cui detta patologia à ̈ una patologia tumorale scelta nel gruppo comprendente: cancro alla prostata, mieloma multiplo, leucemia, linfoma, melanoma, carcinoma delle ovaie, carcinoma delle cellule renali, adenocarcinoma pancreatico, cancro ai polmoni, tumore cerebrale, eritroleucemia, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, cancro al colon, mesotelioma.
24. 24. Kit secondo la rivendicazione 23 in cui detto tumore cerebrale à ̈ glioma, menangioma cerebrale, midolloblastoma, in cui detto linfoma à ̈ la sindrome di Sezary, il linfoma di Burckitt correlato ad EBV, il linfoma HSV Samiri-dipendente, il linfoma cutaneo correlato a cellule T; in cui detta leucemia à ̈ leucemia dipendente da HTLV-I leucemia linfocitica cronica (CLL), leucemina mielogena acuta (AML), leucemia megariocitica, leucemia a grandi linfociti granulari (LGL)
25. 25. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detta condizione patologica à ̈ un tumore resistente al trattamento con chemioterapici che non inibiscono STAT3.
26. 26. Kit secondo la rivendicazione 21 o 22 in cui detta condizione di tipo infiammatorio e/o pretumorale può essere una infiammazione causata da infezioni virali (come noto in letteratura) quali infezioni da H pylori, infezioni da virus dell’epatite B, infezioni da HPV (human papilloma virus), infezioni da virus Epstein-Barr.