TW202011956A

TW202011956A - 含４－乙醯基－安卓奎諾－ｂ之組合物用於製備抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長之藥物的用途

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Publication number: TW202011956A
Application number: TW107132825A
Authority: TW
Inventors: 黃俊智; 曾耀銘; 葉淇臺; 吳駿翃
Original assignee: 麗豐實業股份有限公司
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2020-04-01
Also published as: TWI734934B

Abstract

本發明係關於一種組合物用於製備抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)或其醫藥上可接受鹽及一醫藥上可接受載體，其中該藥物為腹腔內注射之劑型。。

Description

含4-乙醯基-安卓奎諾-B之組合物用於製備抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長之藥物的用途

本發明關於一種組合物用於製備抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長之藥物的用途，其中該組合物主要包含式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)。

癌症一般可以視為惡性腫瘤，是一種疾病。其特徵為惡性組織的不正常團塊，起因於過度地細胞分裂。癌症細胞不具有正常細胞生長之限制，會侵入與佔領正常留給其他細胞的範圍。癌症治療的種類包括化學治療、手術、放射線以及這些治療的結合。化學治療通常包括使用一個或多個抑制癌細胞生長的化合物。

腦癌膠質母細胞瘤(Glioblastoma，GBM)是成人中最致命的惡性腫瘤之一，平均發病率為10萬分之3.2，中位生存期約15個月，診斷出的年齡中位數為64歲，是最常見和高度侵略性的腦腫瘤。組織病理學上經由壞死和內皮細胞增生的程度來定義，GBM是高度神經膠質瘤(世界衛生組織(WHO)IV級)，其特徵在於對抗癌治療具有抗性，導致患者在診斷或開始治療後12個月內死亡。而且GBM的特徵為持續自我新生的潛能、增強的致瘤性和侵襲性、高轉移復發的可能性和對化學療法的抗性增加。由同步放射化學治療(CCRT)與DNA烷基化藥物(DNA alkylating agent)和temozolomide(TMZ)組成的當前抗GBM治療策略，受到疾病末期復發的困擾，並且僅延長中位生存期到估計的14.6個月，迫使具有高度抗GBM效果上新治療策略的試劑發現和/或開發。

本發明是基於發現式I化合物(4-乙醯基-安卓奎諾-B，4-acetyl-antroquinonol B，4-AAQB)或其醫藥上可接受鹽，其可用於抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長，甚至治療或預防腦癌轉移或復發。特定言之，本發明係提供一種用於抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長，甚至治療或預防腦癌轉移或復發之醫藥組合物，包括有效量之式I化合物，即4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體。

為了進一步了解在GBM中4-AAQB的治療相關性，本發明檢查了在U87MG和DBTRG05MG細胞中2.5μM到15μM 4-AAQB的影響和治療效果。本發明的藥物細胞毒性測定結果證實，與未處理的對照組細胞相比，用4-AAQB處理的U87MG和DBTRG05MG細胞存活性以劑量和時間依賴方式顯著地減少。由於癌細胞的致癌訊息和/或致癌性轉變相關且起因於遷移性、侵襲性和轉移性的表現型；本發明使用刮傷癒合測定評估了4-AAQB對GBM細胞遷移的影響。匯集的U87MG或DBTRG05MG單層貼附細胞被沿著中軸刮劃並加入含4-AAQB或載體的培養基，並且在24小時內監測傷口的閉合。與用5μM或10μM 4-AAQB處理的U87MG或 DBTRG05MG細胞相比，未處理的對照組細胞明顯地更快遷移到刮痕區域。使用transwell侵襲測定法，本實驗證實利用5μM或10μM 4-AAQB處理時，GBM細胞比未處理的對應組具有更小的侵襲性，其中與未處理的對照細胞相比，5μM或10μM 4-AAQB處理的U87MG細胞侵襲數量分別有52%(p<0.01)或70%(p<0.001)的減少。與未處理的對應組相比，5μM或10μM 4-AAQB處理的DBTRG05MG細胞侵襲數量分別減少35%(p<0.01)或48%(p<0.001)。為了歸納觀察到的細胞存活性、遷移性和侵襲性減少的潛在機制為其特徵，本發明評估4-AAQB對腦癌細胞內致癌蛋白質表現，並且觀察到5μM或10μM 4-AAQB以劑量依賴性方式顯著地調降了β-連環蛋白、波形蛋白(vimentin)和slug的蛋白質表現程度。這些結果說明在GBM細胞中4-AAQB透過GBM細胞活性和/或增生、遷移、侵襲進而阻止轉移的去活性能力。

由於未分化的腦癌膠質母細胞瘤幹細胞(GBM-SCs)與其餘癌細胞群相比，是具有增強的群聚性和腫瘤球體性形成效果的高度增生性、侵襲性和抗藥性細胞，並且涉及到腫瘤形成、治療反應的減少和復發性，所以本發明評估了在人類GBM細胞品系U87MG和DBTRG05MG中4 AAQB對這些癌症類似幹細胞表現型的影響。利用群聚形成測定法，本發明表明GBM細胞以4-AAQB的處理有劑量依賴性方式抑制GBM群聚的形成，如同本發明觀察到與未處理的細胞相比，用5或10μM 4-AAQB處理的U87MG細胞形成的群聚數量分別有39%(p<0.01)和8%(p<0.001)的減少。對於處理過的DBTRG05MG細胞與未處理的對應組相比，用5或10μM 4-AAQB處理後對於形成群聚的能力觀察到分別有58%(p<0.01) 和64%(p<0.001)的抑制。同樣地，本發明腫瘤球體形成測定的非依賴性錨定結果表明，用5μM或10μM 4-AAQB的處理顯著地降低了U87MG和DBTRG05MG細胞的腫瘤球體形成能力(79%到96%的減少，p<0.001)。這些發現證實了5和10μM 4-AAQB處理時，以西方墨點法的數據表示β-連環蛋白(β-catenin)和幹細胞標記(c-Myc和KLF4蛋白質)表現程度明顯的呈劑量依賴性方式調降。這些結果真的表明了4-AAQB有效地抑制了類似幹細胞表現型並且減弱了GBM細胞的自我新生能力，並且一致於β-連環蛋白和幹細胞特性(stemness)標記的顯著調降表現或明顯降低核定位。

由於有證據顯示了關鍵幹細胞特性(stemness)基因Nanog、Oct4和Sox2以β-連環蛋白直接地或間接地調控環境特異性和TCF1/TCF3的參與方式，而且β-連環蛋白核定位以小分子抑制物的阻斷顯著地增強幹細胞的重編程效果，因此本發明使用雙色免疫螢光染色評估4-AAQB對β-連環蛋白、Sox2和Oct4核定位的影響。本發明的研究結果表明了5或10μM 4-AAQB顯著減少U87MG和DBTRG05MG細胞中Sox2和Oct4的核表現和共同定位，並且用10μM 4-AAQB處理後這與同時降低β-連環蛋白和F-肌動蛋白(F-actin)的表現相關。這些數據證實了以前的結果，並且表明在GBM細胞中4-AAQB經由瓦解F-肌動蛋白調節基本細胞生物活性、多能性和癌症幹細胞(CSC)相關β-連環蛋白致癌性訊息的治療功效。

本發明係提供一種用於抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長之醫藥組合物為主，經實驗證實式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B對人類GBM細胞品系U87MG和DBTRG05MG中的可能性β-連環蛋白調解效果和治療影響。利用西方墨點檢測法，本發明表明在U87MG細胞中使用短暫干擾RNA(siRNA)於β-連環蛋白的蛋白質表現，其上游調節物p-GSK-3β和下游反應物TCF1/TCF7和LEF1，有類似於β-連環蛋白短暫靜默的抑制影響，用5和10μM 4-AAQB對U87MG和DBTRG05MG細胞的處理顯著地且劑量依賴性調降了β-連環蛋白、p-GSK-3、TCF1/TCF7、LEF1以及p-Stat3的表現。這些數據不僅證實了已表明的典型Wnt/β-連環蛋白和Stat3訊息傳遞傳遞路徑一致性，也說明4-AAQB在GBM細胞中經由瓦解CSC相關的致癌性β-連環蛋白/TCF-1/Stat3單一訊息傳遞路徑的治療效果。

此外，腹腔內注射4-AAQB顯著地且更有效地壓抑活體內GBM幹細胞誘導的腫瘤生長，考慮到未分化GBM-SCs的增強性腫瘤起始能力及對不良治療反應和腫瘤復發的涉及，本發明評估了經由不同傳遞路徑給予4-AAQB的影響，亦即腹腔內(i.p)注射或口服(p.o)。對於GBM細胞的這些類似CSC表現型，其使用從形成腫瘤球體的U87MG分離出單細胞溶液，目的是由活體內驗證本發明的活體外結果。皮下注射U87MG細胞造成所有15隻裸鼠的腫瘤形成並且在腫瘤細胞接種第7天後腫瘤生長到巨大尺寸足以用PBS、4-AAQB(i.p)或4-AAQB(p.o)處理。在處理期間沒有動物死亡並且全部都生長良好。本發明在實驗前後觀察3個處理組之間沒有體溫過低或體重顯著性差異，在胸腔或腹腔器官中也未發現任何轉移(數據未提供)。腫瘤生長曲線表示與4-AAQB(i.p)組的腫瘤平均尺寸相比，顯著地更小於4-AAQB(p.o)(163.6±78.4mm³對比196.4±108.9mm³，p=0.0095)或PBS處理對照組(163.6±78.4mm³對比307.0±231.4 mm³，p=0.0001)。同樣地，本發明的免疫螢光染色表示與經口管餵4-AAQB(p.o)的小鼠數據相比，腹腔內注射4-AAQB(i.p)顯著地降低TCF-1和β-連環蛋白兩者的核和細胞質膜表現，以及抑制兩者在異種移植衍生的GBM原發性培養中的核內共同定位。這些發現說明4-AAQB的治療，特別是腹腔內給予，有效地抑制腫瘤的生長。

為了確認GBM中Wnt/β-連環蛋白訊息的臨床相關性，本發明讀取並分析了癌症基因組圖譜(cancer genome atlas；TCGA)的低程度膠質瘤和膠質母細胞瘤(GBMLGG，n=1152)屬性群資料集(cohort dataset)。本發明觀察到在GBMLGG屬性群內所有4種組織學亞型的腦膠質腫瘤之中，亦即星形細胞瘤(Astrocytoma，n=196)、寡星形細胞瘤(Oligoastrocytoma，n=134)、寡樹突神經膠細胞瘤(Oligodendroglioma，n=195)和GBM(n=604)，GBM在其各種形式中表現出最差的存活率(p=0.000，對數等級檢定=475.2)，在罹患GBM(n=30)、治療過原發性GBM(n=20)和未治療過原發性(重新處理的)GBM(n=554)之後的100%死亡率分別為4.1、8.2和10年。此外本發明的分析顯示膠質瘤具有最差總體生存期的組織學亞型特徵在於最具異常表現的β-連環蛋白基因表現，如同通過罹患GBM(n=30)、治療過原發性GBM(n=20)和未治療過原發性(重新處理的)GBM(n=554)的患者所表明13.125的β-連環蛋白中位數表現，而星形細胞瘤、寡星形細胞瘤和寡樹突神經膠細胞瘤分別為12.80、12.69和12.70。與低程級的膠質瘤相比，這與GBM具有高程度、高度惡性和侵略性的特徵一致。平行分析中與具有高度β-連環蛋白表現的患者相比(n=349)，本發明觀察到在診斷後5年和10年的時間點分別有23.75%和18.75%低度表現β-連環蛋白的GBM患者(n=341)更有可能生存(p=3.57e-11；對數等級檢定=43.8)。這些數據不僅說明患者的生存期和β-連環蛋白表現程度之間的功能性關係，也還指出了一種對於β-連環蛋白過度表現在不良預後GBM患者中可能起因或至少參與的角色。

式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B可擁有一或多個對掌中心，因此具有各種立體異構物形式。本發明中提及之式I化合物包括所有此等異構物。式I化合物具有選擇性抑制癌症細胞生長的功效。由於其分子量極小，因此，可使用較低劑量的式I化合物及其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體，即可得到渴望的治療效果。本發明為一抑制癌細胞生長，甚至治療或預防癌症的藥物，係將一有效量之式I化合物及其醫藥上可接受鹽，用於抑制癌細胞、或投予所需之病患(此病患具有癌症、癌症的症狀或傾向於癌症的體質)以治癒、恢復、減輕、緩和、改變、治療、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或傾向於疾病的體質為目的。此處使用的「有效量(an effective amount)」指有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及其醫藥上可接受鹽，具有抑制或治療功效的量。有效量的改變是根據給藥的途徑、輔藥使用(excipient usage)以及與其他共同使用(co-usage)的活性藥劑。

本發明提供一種組合物用於製備抑制腦癌或腦癌幹細胞生長之藥物之用途，其中該組合物包含有效量之式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)

或其醫藥上可接受鹽，及一醫藥上可接受載體，其中該藥物為腹腔內注射之劑型。

在一實施例中，該組合物可治療或預防腦癌轉移或復發。

在一實施例中，式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.01μM至1000μM。

在另一實施例中，式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.5μM至1000μM。

式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B可擁有一或多個對掌中心，因此具有各種立體異構物形式。本發明中提及之式I化合物包括所有此等異構物。式I化合物具有選擇性抑制癌症細胞生長的功效。由於其分子量極小，因此，可使用較低劑量的式I化合物及其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體，即可得到所欲的治療效果。本發明為一抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長，甚至治療或預防該癌症的轉移或復發的醫藥組合物，係將一有效量之式I化合物及其醫藥上可接受鹽，用於抑制癌細胞、或投予所需之病患(此病患具有癌症、癌症的症狀或傾向於癌症的體質)以治癒、恢復、減輕、緩和、改變、治療、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或傾向於疾病的體質為目的。此處使用的「有效量(an effective amount)」指有效量之式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B及其醫藥上可接受鹽，具有抑制或治療功效的量。有效量的改變是根據給藥的途徑、輔藥使用(excipient usage)以及與其他共同使用(co-usage)的活性藥劑。

此處之「癌症」意指細胞腫瘤。癌症細胞具有自主生長(autonomous growth)的能力，即在不正常的狀態或條件下迅速增殖細胞生長。此處所指之癌症係包含所有種類之細胞不當增生(cancerous growth)或致癌過程(oncogenic processes)、轉移性的組織或惡性轉換之細胞、組織或器官(與組織病理學型態無關)或侵入階段。癌症的例子包括，但不限定於：癌症(carcinoma)與惡性肉瘤(sarcoma)，例如乳癌(breast cancer)、血癌(leukemia)、惡性肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphomas)、惡性骨肉瘤(osteosarcoma)、神經膠質瘤(glioma)、嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma)、肝惡性腫瘤(hepatoma)、黑色素瘤(melanoma)、腦癌(ovarian cancer)、皮膚癌(skin cancer)、大腸癌(colorectal cancer)、胃癌(gastric cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腎臟癌(renal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、睪丸癌(testicular cancer)、頭部與頸部的癌症(Head and neck cancer)、腦癌(brain cancer)、食道癌(esophageal cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、腎上腺皮質癌(adrenal cortical cancer)、肺癌(lung cancer)、支氣管癌(bronchus cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、子宮頸癌(cervical cancer)、肝癌(cervical or liver cancer)或未知起始位置的癌症。

在一實施例中，該式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B是以有機溶劑萃取牛樟芝菌絲體，並經矽膠管柱純化製備而得。

式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B是以有機溶劑萃取牛樟芝菌絲體(一真菌類)，並經矽膠管柱分離純化製備而得；或另以化學合成方法製備而得。例如：由「牛樟芝菌絲體萃取」指自較適成長程度之牛樟芝菌絲體所萃取出的牛樟芝菌絲體萃取物。為取得該牛樟芝菌絲體萃取物，可使用本技術領域中眾所周知的萃取技術，例如可將經乾燥與研磨之該牛樟芝菌絲體懸浮在一溶劑或者兩種或多種溶劑之混合液於一足夠長的時間；適合的溶劑的例子包括，但不限定為：水、甲醇、乙醇、二氯甲烷(methylene chloride)、三氯甲烷(chloroform)、丙酮(acetone)、醚類(ether)(例如乙醚(diethyl ether))與乙酸乙酯酯類(ethyl acetate)與己烷(hexane)。之後移除固體殘餘物(例如藉由過濾)得到該牛樟芝菌絲體萃取物溶液，其可經矽膠管柱純化製備得式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B。基本上，全世界近二十餘年在牛樟芝所含天然化合物的研究，除多醣體等大分子外，總共發表了七十八個小分子化合物，其中包括三十一個三萜類化合物且大都有相關藥理活性研究報告，尤其著重在該等之抗癌活性，惟三萜類化合物各別分子仍須在較高使用量，才能達到癌症臨床化學治療藥物的效果【Geethangili M and Tzeng YM,Review of pharmacological effects of Antrodia camphorata and its bioactive compounds，Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，Aug.17,2009；doi：10.1093/ecam/nep108】。

同時，本發明發現式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B顯著地抑制GBM細胞存活性、遷移性和侵襲性的潛能，而且同時壓抑β-連環蛋白、p-Stat3、波形蛋白(vimentin)和slug蛋白質的表現程度。在此必須再強調的是：式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B乃是牛樟芝所含各種天然化合物中，經實驗證實抑制腦癌症細胞株效果較優之少數牛樟芝所含天然化合物之一。

在使用本發明之組合物治療時，式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類可同時給藥或分開給藥，以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。此處所使用之「非口服」係指皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈內(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)、腹腔內(intraperitoneal)、蜘蛛膜下腔內(intrathecal)、疾病部位內(intraleaional)與頭顱內(intracranial)注射以及灌注技術。

本發明所使用式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B及/或其醫藥上可接受鹽類可與至少一種固體、液體或半液體狀之賦形劑或輔助劑一同形成適當的藥劑形式。其形式包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。藥錠一般所使用的載體(carrier)包括乳糖與玉米澱粉。一般也將潤滑劑(lubricating agent)，例如硬脂酸鎂(magnesium stearate)加至藥錠中。用於膠囊形式的稀釋劑(diluents)包括乳糖與經乾燥的玉米澱粉。當口服給藥為水性懸浮液或乳劑時，可懸浮或溶解有效成分(active ingredient)於與乳化或懸浮劑結合的油相(oily phase)。如果需要，可加入特定甜味、調味與著色劑。

本發明所使用式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類亦可配製成無菌注射成分(例如，水或油的懸浮液)，例如利用本技術領域中已知的技術使用適合的分散或增溼劑(例如Tween 80)與懸浮劑。無菌注射調劑也可以將無菌注射溶液或懸浮液加入無毒性非口服之稀釋劑或溶劑，例如1,3丁二醇(1,3-Butanediol)中。可使用的載具(vehicles)與溶劑包括甘露醣醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’s solution)與等滲透壓氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油常作為溶劑或懸浮媒介(例如合成的單-或雙-甘油酯(glycerides))。脂肪酸，例如油酸(oleic acid)與其甘油酯衍生物亦可用在注射劑的調製，其為天然藥學上可接受的油，例如橄欄油、蓖麻油(castor oil)，特別是於其聚氧乙基化的(polyoxyethylated)變化形式。這些油溶液或懸浮液也可包含一長鏈醇類稀釋劑或分散劑，或者羧基甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)或類似的分散劑。

本發明所使用式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類亦可根據此技術領域中所熟知的技術來配製成吸入成分。例如可製成鹽類溶液，利用苯甲醇(benzyl alcohol)或其他適合的防腐劑、增強生物可利用性(bioavailability)的吸附促進劑、碳氟化合物(fluorocarbon)或其他本技術領域中熟知的助溶或分散劑來配製。

用於醫藥組合物的載體必須是「可接受的」，其與配方的有效成分相容(以及較佳為具有穩定有效成分之能力)以及不對病患有害。例如，助溶劑(例如環狀糊精(cyclodextrins))(其與一個或多個萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的複合物)，為了有效成分的傳送而作為藥理學上的輔藥。其他載體的例子包括膠狀二氧化矽(colloidal silicon dioxide)、硬脂酸鎂、纖維素與烷基硫酸鹽(sodium lauryl sulfate)。

另外，由於抗癌劑如以高劑量投予病患易產生毒性。是以，本發明之醫藥組合物為含有安全有效量之式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B，用於抑制癌細胞生長，其中該安全有效量為0.01μM至1000μM，另一實施例為0.5μM至1000μM，另一實施例為0.5μM至50μM。施予個別病人的特定劑量是依所有可能存在因素而定，例如：所使用之特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、進食狀況、施用時間與路徑、排泄率、醫藥物質之組合、以及所欲治療之疾病的嚴重程度等。

圖1、β-連環蛋白的異常表現是GBM的特徵且與不良預後相關。(A)Kaplan-Meier圖根據組織學型態表示TCGA低度膠質瘤和膠質母細胞瘤屬性群的整體生存期(GBMLGG，n=1152)。(B)在TCGA的GBMLGG屬性群中β-連環蛋白的表現跨越不同神經膠質瘤和膠質母細胞瘤的組織學型態。(C)以RNAseq-illuminaHiSeq的基因表現在TCGA GBMLGG資料集中基於β-連環蛋白表現程度的Kaplan-Meier圖。

圖2、不同濃度的式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B對GBM細胞中的β-連環蛋白/TCF-1/Stat3單一訊息傳遞路徑的影響。(A)4-乙醯基-安卓奎諾-B的化學結構；C₂₆H₃₈O₇，462.58g/mol；(B)西方墨點測定法數據表示在人類GBM細胞品系U87MG中β-連環蛋白移除克隆體的移除效率；(C)用增加濃度的4-AAQB處理U87MG和DBTRG05MG細胞24小時，裂解並進行西方墨點法，表示β-連環蛋白、pGSK3β、TCF1/TCF7、LEF1和p-Stat3的劑量依賴性調降。β-肌動蛋白作為加載對照。siCTNNB1，直接特異性針對β-連環蛋白的短暫干擾RNA；WT，野生型。

圖3、不同處理時間的式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B抑制GBM細胞中β-連環蛋白、Sox2和Oct4的核定位結果圖。用Sox2(綠色)、Oct4(紅色)、β-連環蛋白(紅色)和F-肌動蛋白(綠色)抗體來免疫染色用或不用5或10μM 4-AAQB處理的U87MG和DBTRG-05MG細胞，然後圖像可視化和分析透過螢光顯微鏡進行。用5或10μM 4-AAQB處理在(A)U87MG或(B)DBTRG-05MG細胞中明顯地降低核內Sox2和Oct4的蛋白表現。DAPI作為核標記；(C)用10μM 4-AAQB處理後免疫組織化學表示減少β-連環蛋白和F-肌動蛋白的核內表現。原始放大倍數×200

圖4、式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B顯著地壓抑GBM細胞的存活性和致癌性效應。(A)4-AAQB對U-87MG和DBTRG-05MG細胞存活性的細胞毒性劑量依賴性影響；(B)照片圖像表示10μM 4-AAQB在24小時期間對U-87MG和DBTRG-05MG遷移的影響。(C)4-AAQB劑量依賴性地抑制侵襲的U-87MG和DBTRG-05MG細胞數量。(D)5μM和10μM 4-AAQB在DBTRG 05MG細胞中對β-連環蛋白、波形蛋白和slug蛋白質表現的影響。β-連環蛋白作為加載控制。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖5、式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B明顯地抑制U87MG和DBTRG-05MG細胞的類似幹細胞表現型。(A，B)4-AAQB的影響對於U87MG和DBTRG-05MG細胞形成群聚能力的代表性圖像和圖示。(C，D)4-AAQB定性地和定量地減少U87MG和DBTRG-05MG細胞形成腫瘤球體的能力。原始放大倍數=200x。(E)5或10μM 4-AAQB處理在DBTRG05MG細胞中對β-連環蛋白、c-Myc和KLF4蛋白表現的影響。β-連環蛋白作為加載控制。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖6、腹腔內的4-AAQB在活體內顯著地且更有效地壓抑GBM幹細胞誘導的腫瘤生長。(A)與對照組相比，腫瘤大小對時間曲線表示4-AAQB通過p.o或i.p路徑在U87MG腫瘤生長的抑制影響；(B)從活體內研究中獲得的腫瘤樣本照片；(C)口服和腹腔內給予4-AAQB對於TCF-1和β-連環蛋白的表現和定位在異種移植衍生的GBM原發性培養中的差異性影響。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖7、β-連環蛋白的異常表現是GBM的特徵並且與不良預後相關。根據組織學型態對TCGA低度膠質瘤和膠質母細胞瘤屬性群(GBMLGG，n=1152)的分析表示：(A)β-連環蛋白格外地更加表現，並且星形細胞瘤、寡星形細胞瘤和寡樹突神經膠細胞瘤相比，在未經治療的原發性GBM、GBM和治療後原發性的GBM下有更差的總體生存期相關；(B)β-連環蛋白格外地更加表現，並且星形細胞瘤、寡星形細胞瘤和寡樹突神經膠細胞瘤相比，在未經治療的原發性GBM、GBM下有更差的無復發生存期相關。

以下實施例僅用於解釋本發明，但本發明的保護範圍並不僅限以下實施例。為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，作詳細說明如下：

實施例一、式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B之製備

牛樟芝菌絲體3公斤以95%乙醇10公升加熱回流萃取四次，萃取液經過濾後濃縮，減壓乾燥得乙醇萃取物384公克，將乙醇萃取物懸浮於水以等量乙酸乙酯進行分配(partition)劃分，乙酸乙酯層經減壓濃縮可得乙酸乙酯層劃分部157.57公克及水層劃分部159.51公克。

上述乙酸乙酯層劃分部157.57公克以矽膠管柱(10cm i.d x 30cm)進行層析，依次以正己烷→正己烷-乙酸乙酯(10：1→10：2→10：3→10：4→10：5→1：1→1：2，v/v)→乙酸乙酯→甲醇每種比例各10L進行沖提，每1L收集成一劃分部。其中正己烷-乙酸乙酯(10：4)沖提之劃分部56-63(3.015g)，以逆相製備級管柱Tosoh ODS-80Ts(21.5mm x 300mm,10μm)進行層析，以H₂O-CH₃CN(20：80)為移動相，流速10ml/min進行層析，以265nm為檢測波長，管柱控溫40℃，可獲得4-乙醯基-安卓奎諾-B(131mg)。

實施例二、生物活性分析方法

1、冷凍細胞之活化

冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其他蛋白質)。冷凍的細胞快速解凍的方法為：將冷凍管由液氮或乾冰容器中取出，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在3分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管的外部，移入無菌操作台內。取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1：10~1：15)，混合均勻，放入CO₂培養箱培養。在解凍培養後隔日更換培養基。

2、人類癌症細胞之培養

人類GBM細胞品系U87MG和DBTRG-05MG獲自美國菌種中心(American Type Culture Collection；ATCC；Manassas，美國VA)。細胞培養在有補充10% FBS和1% penicillin/streptomycin(Life Technologies公司的Invitrogen品牌，Carlsbad，美國CA)的RPMI 1640，並培養在37℃且5%濕度的二氧化碳培養箱。細胞在95%匯集時繼代或每72小時更換培養基。為了藥物的細胞毒性測定，在不同的持續時間將細胞處理不同濃度的4 AAQB。

3、細胞藥物處理

所有實驗的細胞皆培養於含10%胎牛血清的培養液中，待細胞長到約八成滿時，將舊培養液抽乾並以PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝液)溶液清洗細胞後，加入10毫升不含血清之培養液。依實驗目的不同加入不同的藥物，於37℃恆溫培養箱中進行反應。

4、細胞毒性實驗(cytotoxicity)

在96孔盤中每孔接種3.5×10³個U87MG或DBTRG-05MG細胞。培養24小時後，用不同濃度的4-AAQB處理細胞。處理24或48小時後，處理過的細胞用PBS洗滌，再用10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid；TCA)固定1小時，用蒸餾水洗滌，並且將活細胞在室溫下孵育1小時於含0.4% SRB(w/v)的1%乙酸。藉由1%乙酸洗滌三次來除去未結合的染料並風乾此盤。附著的染料溶解於10mM Trizma鹼(Trizma base)，並且在微孔盤光譜測定儀中以570nm的波長讀取吸光度。

5、細胞群落分析(clonogenicity)

細胞群落分析在六孔盤的每一格中分別種600個細胞，培養液為McCoy5A加上10%胎牛血清。

6、西方墨點法(Western blot)

使用Bio-Rad Mini-Protean系統(Bio-Rad Laboratories股份有限公司，Hercules，美國CA)將10μg蛋白質樣本在10% SDS-PAGE凝膠中電泳並轉漬到polyvinylidene fluoride(PVDF)膜上。藉由含Tween 20的Tris緩衝食鹽水(Tris-buffered saline；TBST)中5%脫脂牛奶孵育膜1小時來封閉非特異性結合，然後用針對全部β-catenin(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、游離態β-連環蛋白(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、p GSK 3(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、GSK-3(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、TCF1/TCF7(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、LEF1(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、p-Stat3(1：1000，Santa Cruz公司)、Stat3(1：1000，Santa Cruz公司)、KLF4(1：1000，Santa Cruz公司)、c Myc(1：1000，Santa Cruz公司)、波形蛋白(vimentin)(1：1000，Cell Signaling Technology公司)、Slug(1：1000，Cell Signaling Technology公司)和β-肌動蛋白(1：500，Santa Cruz公司)的抗體在4℃隔夜。用一級抗體隔夜探測後，膜與根過氧化物酶(horseradish peroxidise，HRP)連接的二級抗體孵育1小時，然後用PBS洗滌三次。使用增強的化學發光(ECL)偵測系統(Thermo Fisher Scientific股份有限公司，Waltham，美國MA)偵測和顯影蛋白條帶訊息。使用ImageJ軟體定量蛋白條帶。

實施例三、生物活性測定之結果

一、式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B可抑制不同腦癌細胞之生長。

1、腫瘤球體形成測定法

對於腫瘤球體的產生，將U87MG和DBTRG-05MG細胞培養在用於人類胚胎幹細胞培養的HEScGROTM無血清培養基(Chemicon品牌，SCM020；Merck KGaA集團，Darmstadt，德國)，其補充10ng/mL hbFGF(Invitrogen品牌，Carlsbad，美國CA)、20ng/mL hEGF(Millipore品牌，Bedford，美國MA)、B27補充劑(Invitrogen品牌，Carlsbad，美國CA)，肝素(#07980；STEMCELL Technologies股份有限公司，卓昇有限公司，台北，台灣)和NeuroCultTM品牌NS-A增生補充劑(人類細胞用；#05753；STEMCELL Technologies股份有限公司，卓昇有限公司，台北，台灣)。細胞以1000個/mL/孔接種在6孔超低貼附盤(Corning股份有限公司的Corning品牌，美國NY)並培養7-10天。在倒立相位差顯微鏡下觀察、計數和拍攝非貼附的腫瘤球體(直徑

90μm)。

2、侵襲測定法

對於侵襲測定法，使用24孔盤Transwell系統；將3×10⁴個U87MG或DBTRG-05MG細胞在無血清培養基中接種到插入物的上層腔(BD Bioscience公司，8μm孔徑)，而將在下層腔中含有10% FBS的培養基當作化學吸引劑。培養24小時後丟棄培養基，接著濾膜上的GBM細胞用3.7%甲醛(formaldehyde)固定1小時，然後染色用結晶紫染料，並且使用棉花棒將位於插入物上層表面的細胞清除出來。在顯微鏡下進行遷移細胞的可視化和在濾膜底層表面上細胞總數的遷移能力評估。

3、傷口癒合的遷移測定法

GBM細胞品系U87MG或DBTRG-05MG，接種在6孔盤並且在5% CO₂空氣培養箱中培養48小時直到它們100%匯集。然後使用無菌200μL微量吸取的尖頭沿著貼附細胞的中軸製造出相似尺寸的刮痕傷口。在PBS洗滌以除去分離的細胞後，貼附的細胞以新的培養基在37℃的5% CO₂濕潤培養箱中培養使傷口閉合。在指定的時間點監視和拍攝傷口間隙的癒合/閉合。

實施例四、動物試驗方法

實驗動物

免疫缺陷小鼠由樂斯科生物科技股份公司購得(約4-6週大之NOD/SCID小鼠)，經馴養一週後，開始進行試驗。

細胞培養

選用的腫瘤細胞為ES2惡性腦癌細胞(ES-2細胞株是源自於對包含順鉑治療在內等化療藥物有高抵抗性且預後較差的腦癌細胞株)，為一貼附型之細胞株，且具很強的轉移能力。以培養液DMEM內含10%胎牛血清(FBS)，1%非必需氨基酸(NEAA)和1%抗生素(antibiotics)培養於37℃、5%二氧化碳之培養箱中，約3~4天繼代一次。

將細胞以0.05%胰蛋白酶(trypsin)-EDTA作用3~5分鐘，使呈懸浮狀態，加入含血清之培養基中和胰蛋白酶(trypsin)之作用，1000rpm、20℃、離心5分鐘。去除上清液，輕輕打散細胞沈澱，將細胞回溶於適當體積之培養液，混合均勻後，取少許細胞液，以血球計數器進行細胞計數。將細胞稀釋成每毫升含10⁷個細胞之濃度，取約0.15毫升分裝於 1.5毫升小離心管中。

藥物配製

以DMSO為溶劑，將式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B配置成每毫升250毫克之溶液，待完全溶解後，進行分裝，為原液(stock)，保存於4℃，取原液加入無菌之生理實驗水做500倍稀釋，混合均勻，即可進行腹腔注射。目前臨床標準化學療法用藥順柏則為針劑，其濃度分別為每毫升50毫克及每毫升5毫克，兩藥物皆取原液進行靜脈注射。

腫瘤細胞注射

注射腫瘤細胞的前一天，將小鼠以10倍稀釋的舒泰50(zoletil 50)及若朋(rompun)2%經1：1混合後，每隻小鼠腹腔注射0.25毫升進行麻醉，待其完全睡著後，進行放射線照射，以抑制其免疫力，照射劑量為0.75Gy。

小鼠以2.5%之異氟烷(isoflurane)進行麻醉，並將欲注射部位之毛髮剔除，注射前用75%酒精及優碘消毒注射部位，選用29G胰島素針進行ES2腫瘤細胞注射，注射時，先用鑷子將小鼠表皮拉起，再將ES2腫瘤細胞注射到皮下之處，注射細胞數為10⁶個，體積為0.1毫升，注射完畢後，確認細胞液無漏出，即可將小鼠移回籠中，待其甦醒，注意其保溫。持續觀察腫瘤生長狀況。

在標準實驗動物無特定病原體條件下飼養來自樂斯科生物科技股份有限公司(台灣，台北)的6到8週齡雌性NOD/SCID小鼠(n=15)。小鼠(5隻/處理組)在右側皮下接種在0.5ml PBS中的0.5×10⁶個U87MG細胞。當腫瘤達到平均大小

150mm³時在第7到10天間開始處理。處理組1包括每週三次腹腔內(i.p)注射在0.5ml PBS中的5mg/kg 4-AAQB長達4週；處理組2包括每週三次口服(p.o)管餵在0.5ml PBS中的5mg/kg 4-AAQB長達4週；而對照組注射PBS。使用卡尺每週兩次測量腫瘤生長，並且使用公式計算腫瘤體積(v)：v=(寬度)2×長度/2。最後的4-AAQB處理後再持續3週追蹤動物(即腫瘤接種後7週)，然後在處理組和對照組具有極度巨大腫瘤之下人道犧牲。小腫瘤的小鼠允許再持續8到12週。每項實驗進行腫瘤生長的評估並且使用第13版的Sigma plot(Stystat Software公司，美國CA)以Student's t檢定確定統計分析。p<0.05被認為是統計上顯著的。所有實驗動物程序被批准並進行均按照機構的實驗動物照護及使用委員會/小組(IACUC/P)批准方案LAC-2015-0386。

實施例五、動物試驗測定之結果

腫瘤大小測定

每週測量一次腫瘤大小，利用游標量尺測量腫瘤之最長徑和最短徑，為確保量測之準確度，實驗期間由同一人進行腫瘤大小的量測。腫瘤體積計算公式：最長徑為a、最短徑為b；腫瘤大小=(a×b²)/2，最後，將小鼠犧牲，取其腫瘤組織，拍照存檔，再以福馬林固定。腫瘤大小的變化以倍數計算製成圖表顯示。腫瘤大小改變倍數(fold change in tumor volume)=腫瘤大小(N)/腫瘤大小(N-1)。N為周數。

實驗結果

利用群聚形成測定法，本發明表明GBM細胞以4-AAQB的處理有劑量依賴性方式抑制GBM群聚的形成，如同本發明觀察到與未處理的細胞相比，用5或10μM 4-AAQB處理的U87MG細胞形成的群聚數量分別有39%(p<0.01)和8%(p<0.001)的減少。對於處理過的DBTRG05MG細胞與未處理的對應組相比，用5或10μM 4-AAQB處理後對於形成群聚的能力觀察到分別有58%(p<0.01)和64%(p<0.001)的抑制。同樣地，本發明腫瘤球體形成測定的非依賴性錨定結果表明，用5μM或10μM 4-AAQB的處理顯著地降低了U87MG和DBTRG05MG細胞的腫瘤球體形成能力(79%到96%的減少，p<0.001)。這些發現證實了5和10μM 4-AAQB處理時，以西方墨點法的數據表示β-連環蛋白(β-catenin)和幹細胞標記(c-Myc和KLF4蛋白質)表現程度明顯的呈劑量依賴性方式調降。這些結果真的表明了4-AAQB有效地抑制了類似幹細胞表現型並且減弱了GBM細胞的自我新生能力，並且一致於β-連環蛋白和幹細胞特性(stemness)標記的顯著調降表現或明顯降低核定位。

此外，腹腔內注射4-AAQB顯著地且更有效地壓抑活體內GBM幹細胞誘導的腫瘤生長，考慮到未分化GBM-SCs的增強性腫瘤起始能力及對不良治療反應和腫瘤復發的涉及，本發明評估了經由不同傳遞路徑給予4-AAQB的影響，亦即腹腔內(i.p)注射或口服(p.o)。對於GBM細胞的這些類似CSC表現型，其使用從形成腫瘤球體的U87MG分離出單細胞溶液，目的是由活體內驗證本發明的活體外結果。皮下注射U87MG細胞造成所有15隻裸鼠的腫瘤形成並且在腫瘤細胞接種第7天後腫瘤生長到巨大尺寸足以用PBS、4-AAQB(i.p)或4-AAQB(p.o)處理。在處理期間沒有動物死亡並且全部都生長良好。本發明在實驗前後觀察3個處理組之間沒有體溫過低或體重顯著性差異，在胸腔或腹腔器官中也未發現任何轉移(數據未提供)。腫瘤生長曲線表示與4-AAQB(i.p)組的腫瘤平均尺寸相比，顯著地更小於4-AAQB(p.o)(163.6±78.4mm³對比196.4±108.9mm³，p=0.0095)或PBS處理對照組(163.6±78.4mm³對比307.0±231.4mm³，p=0.0001)。同樣地，本發明的免疫螢光染色表示與經口管餵4-AAQB(p.o)的小鼠數據相比，腹腔內注射4-AAQB(i.p)顯著地降低TCF-1和β-連環蛋白兩者的核和細胞質膜表現，以及抑制兩者在異種移植衍生的GBM原發性培養中的核內共同定位。這些發現說明4-AAQB的治療，特別是腹腔內給予，有效地抑制腫瘤的生長。

Claims

一種組合物用於製備抑制腦癌細胞或腦癌幹細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)
或其醫藥上可接受鹽及一醫藥上可接受載體，其中該藥物為腹腔內注射之劑型。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物可治療或預防腦癌轉移或復發。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該式I化合物：4-乙醯基-安卓奎諾-B是以有機溶劑萃取牛樟芝菌絲體，並經矽膠管柱純化製備而得。
根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.01μM至1000μM。
根據申請專利範圍第6項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.5μM至1000μM。