JPWO2015178426A1

JPWO2015178426A1 - がん幹細胞の増殖抑制剤

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Publication number: JPWO2015178426A1
Application number: JP2016521132A
Authority: JP
Inventors: 晃栗崎; 瑩瑩王; 仁実高田; 久雄浴本
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; TMRC Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; TMRC Co Ltd
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2015-05-20
Publication date: 2017-04-20
Also published as: ES2928499T3; MX2016015092A; AU2015262349A1; EP3146978A4; KR20170005069A; TW201607531A; RU2016150116A3; RU2016150116A; US20170079942A1; US20200061007A1; EP3146978A1; CA2949640A1; CN114392252A; WO2015178426A1; EP3146978B1; CN106456770A

Abstract

既存の抗がん剤治療法に抵抗性を示すがん幹細胞の増殖抑制、アポトーシスを介して作用する増殖抑制剤を提供することを課題とする。レチノイドアゴニスト、好ましくはタミバロテン単剤あるいはこれとレキシノイドアゴニスト、好ましくはベキサロテンとの両剤を有効成分とするがん幹細胞の増殖抑制剤であり、また、種々の抗がん剤と併用することにより抗がん剤の効果を増強するがん幹細胞の増殖抑制剤である。

Description

本発明は、がん幹細胞の増殖抑制剤に関し、詳しくは既存の抗がん剤治療法に抵抗性を示すがん幹細胞の増殖抑制剤に関する。

医学の進歩の中でがんの治療は極めて進歩の早い領域であり、その治療法は多岐にわたっている。それにもかかわらず、厚生労働省の人口動態調査や世界保健機構の調査において、がんによる死亡者数は今後も増加すると予想されている。この原因の一つに、既存の抗がん剤治療に抵抗性を示すがん幹細胞の存在が注目されている。

がん細胞は、遺伝的変異の蓄積やがん細胞周囲の微小な環境変化等によって高い増殖能、浸潤能、転移能を持つようになるが、がん塊を構成しているがん細胞の全てがこれらの特徴を兼ね備えているわけではない。これらの特徴を持ち、がんを発生、進行させる能力の高い細胞は全体のごく一部であることが、近年、解ってきた（非特許文献１）。このような特徴を持つがん細胞は、自己複製能と多種類の細胞に分化しえる多分化能という幹細胞に共通してみられる２つの特徴を持っていることから、がん幹細胞と呼ばれている。これまでに、急性白血病、乳がん、大腸がん、脳腫瘍、前立腺がん、すい臓がん等のがん種においてその存在が確認されている。

また、近年、がん幹細胞が既存の抗がん剤治療法に抵抗性を示すことが明らかになってきた。例えば、急性白血病ではがん幹細胞が幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境にとどまり、細胞分裂が休止する休眠期（Ｇ_０期）に入り、この状態では抗がん剤の治療に耐性となっている。また、多くの固形がんの幹細胞はＰ糖たんぱく等の発現が高く、抗がん剤に対して耐性を示す。さらに、抗がん剤治療後のがん組織中に存在しているがん幹細胞の比率が治療前と比べて高まっていることが解っている。

これらのことは、抗がん剤治療後にがんが完治せずに再発する１つの大きな原因となっていると考えられ、がん幹細胞を標的とした治療剤の開発はがんを根治する重要な方法であることが解ってきた。これまでにもがん幹細胞を標的とする治療剤は、がんの増殖を抑制し、既存の抗がん剤の治療効果を増強することが報告されている。しかしながら、現在の臨床現場でがん幹細胞を標的とした治療剤は確立されておらず、その開発が望まれているのが現状である（非特許文献２）。そこで本発明者らは、がん幹細胞マーカーを用いて臨床的に応用可能ながん幹細胞を標的とした新治療剤の開発を目的に検討を行った（非特許文献３）。

Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００，３９８３−３９８８（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４５３，３３８−３４４（２００８）Ｍｏｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７，３３０−３３８（２００９）

しかしながら、既存の抗がん剤治療法に抵抗性を示すがん幹細胞をより効果的に増殖抑制することができるがん幹細胞の増殖抑制剤はなお強く望まれている。

そこで、本発明の目的は、既存の抗がん剤治療法に抵抗性を示すがん幹細胞の増殖を効果的に抑制することのできるがん幹細胞の増殖抑制剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために、がん幹細胞内情報伝達経路に着目して鋭意検討を行った。
即ち、がん幹細胞は、多くの細胞内情報伝達経路によって未分化状態が維持され、がんを維持する能力が保たれている。これらの情報伝達経路を阻害する物質はがん幹細胞の分化またはアポトーシスを誘導することによってがんの増殖を抑制することにより新規抗がん剤の標的になると考えられる。
そこで本発明者らは、レチノイドおよびレキシノイドを用いて、レチノイドおよびレキシノイドが発揮する増殖、生存、分化、アポトーシス等の生理学的作用の内、がん幹細胞に対する分化、アポトーシス等を含む増殖抑制作用を検討する中で、新規抗がん剤になりうると考えた。

がん幹細胞の増殖抑制作用を検討するにあたり、がん幹細胞はがん細胞の中で一部の集団であることから、がん幹細胞マーカーを指標として検討することとし、ヒトすい臓がん細胞は、各種がん幹細胞マーカーを発現しており、この細胞を用いて検討を行った。

その結果、レチノイドアゴニスト、特にはタミバロテン（Ａｍ−８０）単独、あるいはレキシノイドアゴニスト、特にはベキサロテンとの併用によりヒトすい臓がん細胞の細胞数、形態、幹細胞マーカーの発現を抑制することができることを見出した。また、レチノイド受容体（ＲＡＲ）及びレキシノイド受容体（ＲＸＲ）は、核内転写因子の一つであり、エピジェネティックスの作用を抑制する化合物や薬剤との相互作用が考えられることから、これら抑制化合物や作用機序の異なる分子標的薬を含む抗がん剤と併用したところ、がん幹細胞の劇的な増殖抑制作用が発現することを見出した。本発明はかかる知見に基づき完成するに至ったものである。

即ち、本発明は次の（１）〜（７）に関するものである。
（１）レチノイドアゴニストを有効成分とするがん幹細胞の増殖抑制剤である。

（２）前記レチノイドアゴニストがタミバロテン（Ａｍ−８０）である前記（１）記載のがん幹細胞の増殖抑制剤である。

（３）更に、レキシノイドアゴニストを有効成分とする前記（１）または（２）記載のがん幹細胞の増殖抑制剤である。

（４）前記レキシノイドアゴニストがベキサロテンである前記（３）記載のがん幹細胞の増殖抑制剤である。

（５）抗がん剤を含む前記（１）〜（４）のうちいずれかに記載のがん幹細胞の増殖抑制剤である。

（６）レチノイドアゴニストをヒト一個体あたり０．５〜２０ｍｇを含み、レチノイドアゴニストとレキシノイドアゴニストとを合計でヒト一個体あたり０．５〜５００ｍｇを含み、かつ、抗がん剤をヒト一個体あたり１．０〜１０００ｍｇを含む前記（５）記載のがん幹細胞の増殖抑制剤である。

（７）前記抗がん剤が、ＤＮＡ相互作用剤、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用剤、分子標的治療剤、エピジェネティックスの作用阻害剤およびホルモン剤からなる群から選ばれる前記（５）または（６）記載のがん幹細胞の増殖抑制剤である。

本発明によりレチノイドアゴニスト単独、あるいはレキシノイドアゴニストとの併用による投与によりがん幹細胞を減少させることが可能となる。また、更に抗がん剤を投与することにより腫瘍塊の嵩を減少させるか縮小させることができる。また、レチノイドアゴニストおよびレキシノイドアゴニストと抗がん剤とを同時に投与する方法も有用である。本発明により治療されるべきがんとしては、抗がん剤治療に抵抗性を示す急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫等の血液がん、すい臓がん、肝細胞がん、大腸がん等の消化器がん、肺がん、乳がん、前立腺がんおよび卵巣がん等である。

異なる濃度のＡｍ８０存在下でＰａｎｃ−１をＡｍ８０で１週間浮遊培養した際の細胞数の変化を示すグラフである。浮遊培養条件下、Ｐａｎｃ−１をＡｍ８０で処理した際のＡＬＤＨ陽性細胞数の減少を示すグラフである。浮遊培養条件下、Ｐａｎｃ−１をＡｍ８０で処理した際のＣＤ２４／ＣＤ４４／ＥＳＡ陽性細胞数の減少を示すグラフである。浮遊培養条件下、Ｐａｎｃ−１をＡｍ８０存在下で培養した際のすい臓組織分化マーカーの上昇を示すグラフである。ＭＩＡＰａｃａ２細胞をＡｍ８０とベキサロテンで１週間共処理した際の細胞増殖活性の抑制を示すグラフである。ＭＩＡＰａｃａ２細胞をＡｍ８０と５−ａｚａ−ｄＣで１週間共処理した際の細胞増殖活性の抑制を示すグラフである。ＭＩＡＰａｃａ２細胞をＡｍ８０とＳＡＨＡで１週間共処理した際の細胞増殖活性の抑制を示すグラフである。ＭＩＡＰａｃａ２細胞をＡｍ８０とＶＰＡで１週間共処理した際の細胞増殖活性の抑制を示すグラフである。ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０の細胞遊走能に及ぼす影響を示す顕微鏡写真である。ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０のがん転移抑制効果を示すグラフである。ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０の造腫瘍抑制効果を示すグラフである。ヌードマウスに移植したヒトすい臓がん幹細胞に対するＡｍ８０の抑制効果を示すグラフである。ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０の造腫瘍抑制効果を示す病理標本写真である。ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０と抗がん剤・ジェムシタビンとのｉｎｖｉｔｒｏ併用効果を示すグラフである。ヒトすい臓がん細胞／ヌードマウスに対するＡｍ８０と抗がん剤・ジェムシタビンとのｉｎｖｉｖｏ併用効果を示すグラフである。ヒトすい臓がん細胞／ヌードマウスに対するＡｍ８０とエピジェネティック阻害剤ＶＰＡとのｉｎｖｉｖｏ併用効果を示すグラフである。ヒト白血病細胞Ｋａｓｕｍｉ−１に対するＡｍ８０と５−ＡＺとの併用効果を示すイソボログラムである。ＭＣＦ−７細胞をＡｍ８０と５−ＡＺで９６時間共処理した際の細胞増殖活性の抑制を示すグラフである。ＬＮＣａＰ細胞をＡｍ８０と５−ＡＺで９６時間共処理した際の細胞増殖活性の抑制を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。
本発明のがん幹細胞の増殖抑制剤はレチノイドアゴニストを有効成分とするものである。本発明において、レチノイドアゴニストにはその薬剤学的に許容可能な有機又は無機の酸付加塩を含む。特に、好ましいレチノイドアゴニストとしてはタミバロテン（Ａｍ８０）を挙げることができる。

また、本発明のがん幹細胞の増殖抑制剤はレキシノイドアゴニストを好適に併用することができる。レキシノイドアゴニストもその薬剤学的に許容可能な有機又は無機の酸付加塩を含むものであり、特に好ましくはベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）を挙げることができる。

本発明のがん幹細胞の増殖抑制剤は各種抗がん剤と併用することにより抗がん剤の抗がん活性を増強する作用を有する。
本発明において、抗がん剤のＤＮＡ相互作用剤としては、アルキル化剤のシクロホスファミド、メルファラン、シスプラチン、カルボプラチン等が挙げられ、またＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤のカンプトテシン、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤のエトポシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン等が挙げられる。好ましくは、経口投与可能なシクロホスファミド、メルファラン、シスプラチン、カンプトテシン、ドキソルビシンが挙げられる。

抗がん剤の代謝拮抗剤としては、葉酸拮抗剤のメソトレキセートおよびトリメソトレキセート、ピリミジン拮抗剤の５−フルオロウラシル、５−ａｚａ−ｄＣ、アザシチジン、シタラビンおよびジェムシタビン、プリン拮抗剤のフルダラビンが挙げられる。好ましくは、経口投与可能なメソトレキセート、５−フルオロウラシル、５−ａｚａ−ｄＣ、アザシチジン、シタラビン、ジェムシタビン、フルダラビンが挙げられる。

抗がん剤のチューブリン阻害剤としては、好ましくは、パクリタキセル、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）が挙げられる。

抗がん剤の分子標的治療剤としては、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤のセレコキシブ、ロフェコキシブ、増殖因子シグナル阻害剤のエルロチニブ、イマニチブ等が挙げられる。好ましくは、経口投与可能なゲフィチニブ、イマニチブが挙げられる。

抗がん剤のエピジェネティック作用阻害剤としては、ＤＮＡメチル化阻害剤のアザシチジン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のバルプロ酸、ＳＡＨＡ（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ（ＦＫ２２８）が挙げられる。好ましくは、経口投与可能なアザシチジン、バルプロ酸、ＳＡＨＡ（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）が挙げられる。

抗がん剤のホルモン剤としては、リュープロライドアセテート、ゴセレリンアセテート、抗エストロゲン剤のタモキシフェン、抗アンドロゲン剤のフルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド等が挙げられる。好ましくは、経口投与可能なタモキシフェン、フルタミド、ビカルタミド、エンザルタミドが挙げられる。

抗がん剤の組み合わせとしては、例えば、パクリタキセル（あるいは、ドセタキセル）とシスプラチンとＴＳ−１との組み合わせ、ドセタキセルとオキザリプラチンとの組み合わせ、ドセタキセルと分子標的薬との組み合わせ等が挙げられるがこれらには限定されない。

本発明のがん幹細胞の増殖抑制剤は、有効量を経口、経直腸、局所、あるいは非経口的、静脈内又は腫瘍内への注射のいずれかにより投与することで、ヒトにおけるがん幹細胞およびがん塊の成長を効果的に阻害することができる。

本発明のがん幹細胞の増殖抑制剤は、錠剤、カプセル、丸剤、リポソーム等の固体またはゲル状、あるいは液状でもよい（ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙＨａｎｄｂｏｏｋｖｅｒｓｉｏｎ２，１５−３４（１９９４）参照）。

本発明のがん幹細胞の増殖抑制剤により治療するにあたり、治療されるがんのタイプにより適切ないかなる量とすることもでき、有効量を適用する方法は治療するがん幹細胞の存在割合により変化する。一例として、レチノイドアゴニストとレキシノイドアゴニストとを合計でヒト一個体あたり０．５〜５００ｍｇを含み、かつ、抗がん剤をヒト一個体あたり１．０〜１０００ｍｇを含むようにすることができる。また、レチノイドアゴニストは、好適にはヒト一個体あたり０．５〜２０ｍｇとすることができる。

本発明のがん幹細胞の増殖抑制剤は、好ましくは、レチノイドアゴニスト単独あるいはレキシノイドアゴニストとの併用に抗がん剤を同時に投与し、がん幹細胞を分化させ、アポトーシスに導いてがん細胞を増殖抑制または縮小させる。がん幹細胞の増殖を抑制するために、必要に応じて２週間〜２年間投与することができる。

以下に本発明を実施例に基づき説明する。なお、下記の実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではないことは勿論である。

〔実施例１〕
＜ヒトすい臓がん細胞スフェロイドに対するＡｍ８０の増殖抑制効果＞
ヒトすい臓がん細胞株を用いてＤＭＥＭ／Ｆ１２にＢ２７、２０ｎｇ／ｍＬＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ、及び４μｇ／ｍＬｈｅｐａｒｉｎを添加した培地で低接着ディッシュを用いて培養すると、細胞塊を形成し、浮遊状態で培養することが可能であり、いくつかのがん幹細胞マーカーと他のがんで報告されているマーカーが増加した状態で培養できる。まず、このがん幹細胞マーカー陽性細胞を含む細胞塊をＡｍ８０添加培地で１週間培養し、細胞塊の増殖やがん幹細胞マーカーの発現量への影響を解析した。その結果、タミバロテン（Ａｍ８０）の濃度依存的に細胞塊の増殖は抑制された。細胞塊の数が減少し、細胞数も濃度依存的に減少した（図１）。さらにこの細胞塊をＡｍ８０含有培地で合計２週間培養すると、よりいっそう細胞塊は小さくなり、細胞数が減少した。以上のことからＡｍ８０はすい臓がん幹細胞を含む細胞集団の増殖を抑制する作用をもつことが明らかとなった。

〔実施例２〕
＜ヒトすい臓がん細胞Ｐａｎｃ−１スフェロイドのＡＬＤＨ活性に対するＡｍ８０の抑制効果＞
実施例１に示すようにＡｍ８０は、すい臓がん細胞株の浮遊培養状態での細胞塊形成を抑制することから、その種となるがん幹細胞が減少している可能性が考えられた。造血幹細胞や前駆細胞などでは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）活性が高く、分化細胞では活性が低いことが知られている。そこでＡｍ８０を添加して１週間浮遊培養したすい臓がん細胞に、前駆体Ｂｏｄｉｐｙ−ａｍｉｎｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ，ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性で代謝されて生成されるＢｏｄｉｐｙ−ａｍｉｎｏａｃｅｔａｔｅの蛍光陽性細胞数をフローサイトメトリーで定量解析した。その結果、Ａｍ８０を添加して培養すると、濃度依存的にＡＬＤＨ活性が低下し、がん幹細胞量が減少する可能性が示された（図２）。

〔実施例３〕
＜ヒトすい臓がん細胞Ｐａｎｃ−１スフェロイドに存在するＣＤ２４＋／ＣＤ４４＋／ＥＳＡ＋細胞に対するＡｍ８０の抑制効果＞
Ａｍ８０を添加して１週間浮遊培養したすい臓がん細胞を、タンパク質レベルで各種がん幹細胞表面マーカーの発現を蛍光標識した１次抗体を用いてフローサイトメトリーで解析したところ、特に、ＣＤ２４＋／ＣＤ４４＋／ＥＳＡ＋陽性細胞の存在率がＡｍ８０添加により有意に発現減少することが確認された。特に１０μＭのＡｍ８０存在下ではＣＤ２４＋／ＣＤ４４＋／ＥＳＡ＋陽性細胞の存在率が半減した。すなわちＡｍ８０はがん幹細胞を減少させる可能性が示唆された（図３）。

〔実施例４〕
＜ヒトすい臓がん細胞スフェロイドに対する分化マーカー増強効果＞
次に、Ａｍ８０を添加して１週間浮遊培養したすい臓がん細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、すい臓組織特異的な分化マーカーに対するプライマーで定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、Ｐｄｘ１やグルカゴンなどの遺伝子発現がＡｍ８０の濃度依存的に上昇する様子が観察された。このことからＡｍ８０ががん幹細胞を含む細胞集団の分化を促進している可能性が示唆された（図４）。

〔実施例５〕
＜ヒトすい臓がん細胞ＭＩＡ−Ｐａｃａ２スフェロイドに対するＡｍ８０とベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ）との併用における細胞増殖活性への影響＞
がん幹細胞マーカー陽性細胞を含むＭＩＡ−Ｐａｃａ２細胞塊をＡｍ８０（１０ｎＭ−１μＭ）とベキサロテン添加培地で１週間浮遊培養後、ＭＴＴ試薬（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加してさらに３時間培養した後に、細胞塊の細胞増殖活性への影響を４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定して解析した。その結果、Ａｍ８０とベキサロテンの濃度依存的にゆるやかに細胞塊の細胞増殖活性が抑制された（図５）。

〔実施例６〕
＜ヒトすい臓がん細胞ＭＩＡ−Ｐａｃａ２スフェロイドに対するＡｍ８０とＤＮＡメチル阻害剤・５−ａｚａ−ｄＣとの併用における増殖活性への影響＞
がん幹細胞マーカー陽性細胞を含むＭＩＡ−Ｐａｃａ２細胞塊をＡｍ８０（１０ｎＭ−１μＭ）と５−ａｚａ−ｄＣ添加培地で１週間浮遊培養後、ＭＴＴ試薬（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加してさらに３時間培養した後に、細胞塊の細胞増殖への影響を４５０ｎｍの吸光度を測定して解析した。その結果、Ａｍ８０と５−ａｚａ−ｄＣの濃度依存的に細胞塊の細胞増殖活性が抑制された（図６）。

〔実施例７〕
＜ヒトすい臓がん細胞ＭＩＡ−Ｐａｃａ２スフェロイドに対するＡｍ８０とヒストンデアセチラーゼ阻害剤・ＳＡＨＡとの併用における増殖抑制への影響＞
がん幹細胞マーカー陽性細胞を含むＭＩＡ−Ｐａｃａ２細胞塊をＡｍ８０（１０ｎＭ−１μＭ）とＳＡＨＡ添加培地で１週間浮遊培養後、ＭＴＴ試薬（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加してさらに３時間培養した後に、細胞塊の細胞増殖活性への影響を４５０ｎｍの吸光度を測定して解析した。その結果、Ａｍ８０とＳＡＨＡの濃度依存的に細胞塊の細胞増殖活性がゆるやかに抑制された（図７）。

〔実施例８〕
＜ヒトすい臓がん細胞ＭＩＡ−Ｐａｃａ２スフェロイドに対するＡｍ８０とヒストンデアセチラーゼ阻害剤・バルプロ酸（ＶＰＡ）との併用における増殖抑制への影響＞
がん幹細胞マーカー陽性細胞を含むＭＩＡ−Ｐａｃａ２細胞塊をＡｍ８０（６．３ｎＭ〜１００ｎＭ）とＶＰＡ添加培地で１週間浮遊培養後、ＭＴＴ試薬（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加してさらに３時間培養した後に、細胞塊の細胞増殖への影響を４５０ｎｍの吸光度で測定した。その結果、Ａｍ８０とＶＰＡは、相乗的な細胞塊の細胞増殖阻害活性を示した（図８）。

〔実施例９〕
＜ヒトすい臓がん幹細胞に対するＡｍ８０の細胞遊走能への影響＞
膵臓がん幹細胞を含むすい臓がん細胞を磁気抗体ビーズでＣＤ１３３陽性細胞と陰性細胞とに分離後、１μＭのＡｍ８０を添加しボイデンチャンバーで培養し、膜裏側に遊走する細胞を観察した。その結果、Ａｍ８０はＣＤ１３３陽性細胞のがん幹細胞画分において顕著に細胞遊走能を抑制した（図９）。

〔実施例１０〕
＜ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０のがん転移抑制効果＞
膵臓がん幹細胞を含むすい臓がん細胞（１×１０^６個）をヌードマウスの膵臓に移植し、１か月後肝臓へ転移し形成した腫瘍の大きさ（Ｔｕｍｏｒｖｏｌｕｍｅ）を測定した。Ａｍ８０は３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙで１か月間投与した。その結果、コントロールと比較してすい臓がんの転移を抑制することができた（図１０）。

〔実施例１１〕
＜ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０の造腫瘍抑制効果＞
膵臓がん幹細胞を含むすい臓がん細胞（１×１０^６個）をヌードマウスの皮下に移植し、２週間後、腫瘍を形成が確認されたマウスに対して、Ａｍ８０を３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙで１か月間投与した（ＤａｙｓａｆｔｅｒＡｍ８０ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。その結果、体重（Ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）に対する影響は見られないが（Ａ）、コントロールと比較してすい臓がんの増殖を体内で抑制することができた（Ｂ）（図１１）。

〔実施例１２〕
＜ヌードマウスに移植したヒトすい臓がん幹細胞に対するＡｍ８０の抑制効果＞
膵臓がん幹細胞を含むすい臓がん細胞（１×１０^６個）をヌードマウスの皮下に移植し、２週間後、腫瘍を形成が確認されたマウスに対して、Ａｍ８０を３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙで１か月間投与した。その後、腫瘍を取出し、トリプシン処理し、抗ＣＤ１３３抗体を用いてすい臓がん幹細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した結果、Ａｍ８０はコントロールと比較してすい臓がん幹細胞を体内で抑制する作用を持っていることが分かった（図１２）。

〔実施例１３〕
＜ヒトすい臓がん細胞に対するＡｍ８０の造腫瘍抑制効果＞
膵臓がん幹細胞を含むすい臓がん細胞（１×１０^６個）をヌードマウスの皮下に移植し、２週間後、腫瘍を形成が確認されたマウスに対して、Ａｍ８０を３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙで１か月間投与した。それぞれの腫瘍の病理標本を作製し、細胞組織形態を評価してみた結果、Ａｍ８０を投与しなかったコントロール群と比較してすい臓がん組織の形態が分化型を示すことが分かった（図１３）。

〔実施例１４〕
＜ヒトすい臓がん細胞に対する抗がん剤・ジェムシタビンとＡｍ８０の併用効果＞
ヒトすい臓がん細胞を浮遊培養状態でジェムシタビン（１０ｎＭ）を加えて１週間培養した後、さらにＡｍ８０を添加して１週間浮遊培養し、細胞塊の数（Ｎｕｍｂｅｒｏｆｃｏｌｏｎｉｅｓｆｏｒｍｅｄ）をカウントした。その結果、Ａｍ８０が抗がん剤処理後のすい臓がん細胞に対してもｉｎｖｉｔｒｏでスフェア形成抑制効果を持つことが分かった（図１４）。

〔実施例１５〕
＜ヒトすい臓がん細胞に対する抗がん剤・ジェムシタビンとＡｍ８０の併用効果＞
膵臓がん幹細胞を含むすい臓がん細胞（１×１０^６個）をヌードマウスの皮下に移植し、２週間後、腫瘍を形成が確認されたマウスに対して、Ａｍ８０を３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙで毎日投与し、ジェムシタビンを５０ｍｇ／ｋｇで３日おきに１か月間投与した（ＤａｙｓａｆｔｅｒＡｍ８０ａｎｄＧｅｍｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。その結果、コントロール（Ａｍ８０およびジェムシタビン非投与）やジェムシタビン単独投与と比較して、Ａｍ８０とジェムシタビンの同時投与はすい臓がんの増殖を体内でより強く抑制することが分かった（図１５）。ここで、Ｇｅｍはジェムシタビンを表す。

〔実施例１６〕
＜ヒトすい臓がん細胞に対するエピジェネティック阻害剤ＶＰＡとＡｍ８０の併用効果＞
膵臓がん幹細胞を含むすい臓がん細胞（１×１０^６個）をヌードマウスの皮下に移植し、２週間後、腫瘍を形成が確認されたマウスに対して、Ａｍ８０を３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙで毎日投与し、ＶＰＡを５００ｍｇ／ｋｇで３日おきに１か月間投与した（ＤａｙｓａｆｔｅｒＡｍ８０ａｎｄＶＰＡｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。その結果、コントロール（Ａｍ８０およびＶＰＡ非投与）やＶＰＡ単独投与、Ａｍ８０単独投与と比較して、Ａｍ８０とＶＰＡの同時投与はすい臓がんの増殖を体内でより強く抑制することが分かった（図１６）。
〔実施例１７〕
＜ヒトすい臓がん細胞ＭＩＡ−Ｐａｃａ２／ヌードマウスに対するＡｍ８０とＤｏｃｅｔａｘｅｌ（ＤＸＬ）との併用における増殖抑制への影響＞
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕヌードマウス（４匹／群、対照群のみ５匹）にがん幹細胞マーカー陽性細胞を含むヒトすい臓がん細胞ＭＩＡ−Ｐａｃａ２の腫瘍片を背側部皮下にトロカー針を用いて移植した。腫瘍体積が１００−２００ｍｍ^３に達した時点から投与を開始した。Ａｍ８０は２ｍｇ／ｋｇを１回／日、連日２１日間経口投与し、ＤＸＬは、５ｍｇ／ｋｇを１日目より４日間隔で３回、静脈内投与した。併用群は各単剤と同じ用量、投与法で投与し、投与終了翌日（２２日目）まで腫瘍径を測定した。腫瘍の長径及び短径の測定値から長径×短径^２／２の式から腫瘍体積（ｍｍ^３）を求めた。なお、対照群には生理食塩液を１日目より４日間隔で３回、腹腔内投与した。その結果、Ａｍ８０とＤＸＬとの併用は各単剤の効果を上回る相乗的な細胞増殖阻害活性を示した。結果を下記表１に示す。

〔実施例１８〕
＜ヒト白血病細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１に対するＡｍ８０とＤＮＡメチル化阻害剤・アザシチジン（５−ＡＺ）との併用における増殖抑制への影響＞
がん幹細胞マーカー陽性細胞を含むヒト白血病細胞株Ｋａｓｕｍｉ−１を２０％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて培養し、Ｉｓｏｂｒｏｇｒａｍを用いてＡｍ８０と５−ＡＺとの併用による増殖抑制作用を検討した。それぞれのＩＣ５０値は１．０μＭ、８．４μＭであった。これらの濃度を１．０とした時の併用効果の比率を求めて両軸の１．０を結んだ直線上の場合は相加効果を示し、直線より下側の場合には相乗効果を示す。Ａｍ８０と５−ＡＺの併用は、増殖抑制作用において相乗効果を示した（図１７）。

〔実施例１９〕
＜ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７に対するＡｍ８０とＤＮＡメチル化阻害剤・５−ＡＺとの併用における増殖抑制への影響＞
がん幹細胞マーカー陽性細胞を含むヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７を２％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて培養し、Ａｍ８０と５−ＡＺとの併用による増殖抑制作用を検討した。９６時間の暴露によるそれぞれのＩＣ５０値は１μＭ、２０μＭであったので、Ａｍ８０は公比２で０．１２５μＭから１μＭの濃度範囲で、また、５−ＡＺは公比２で２．５μＭから２０μＭの濃度範囲での増殖抑制作用を検討した。併用の場合には、これらの濃度を用いて増殖抑制作用を検討した。Ａｍ８０と５−ＡＺの併用は、増殖抑制作用において相乗効果を示した（図１８）。

〔実施例２０〕
＜ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７／ヌードマウスに対するＡｍ８０とＤｏｃｅｔａｘｅｌ（ＤＸＬ）との併用における増殖抑制への影響＞
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕヌードマウス（５匹／群）にがん幹細胞マーカー陽性細胞を含むヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７の腫瘍片を背側部皮下にトロカー針を用いて移植した。腫瘍体積が１００−２００ｍｍ^３に達した時点から投与を開始した。Ａｍ８０は１ｍｇ／ｋｇを１回／日、連日２１日間経口投与し、ＤＸＬは、３．５ｍｇ／ｋｇを１日目より４日間隔で３回、静脈内投与した。併用群は各単剤と同じ用量、投与法で投与し、投与終了翌日（２２日目）まで腫瘍径を測定した。腫瘍の長径及び短径を、キャリパーを用いて測定し、長径×短径^２／２の式から腫瘍体積（ｍｍ^３）を求めた。なお、対照群には生理食塩液を１日目より４日間隔で３回、腹腔内投与した。その結果、増殖の遅いヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７に対して、Ａｍ８０とＤＸＬとの併用は各単剤の効果を上回る相乗的な細胞増殖阻害活性を示した。結果を下記表２に示す。

〔実施例２１〕
＜ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰに対するＡｍ８０とＤＮＡメチル化阻害剤・５−ＡＺとの併用における増殖抑制への影響＞
がん幹細胞マーカー陽性細胞を含むヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰを１０％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて培養し、Ａｍ８０と５−ＡＺとの併用による増殖抑制作用を検討した。９６時間の暴露によるそれぞれのＩＣ５０値は２μＭ、２５μＭであったので、Ａｍ８０は公比２で０．１２５μＭから１μＭの濃度範囲で、また、５−ＡＺは公比２で１．５６μＭから１２．５μＭの濃度範囲での増殖抑制作用を検討した。併用の場合には、これらの濃度を用いて増殖抑制作用を検討した。Ａｍ８０と５−ＡＺの併用は、増殖抑制作用において相乗効果を示した（図１９）。

〔実施例２２〕
＜ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰ／ヌードマウスに対するＡｍ８０とＤｏｃｅｔａｘｅｌ（ＤＸＬ）との併用における増殖抑制への影響＞
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕヌードマウス（４匹／群）にがん幹細胞マーカー陽性細胞を含むヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰの腫瘍片を背側部皮下にトロカー針を用いて移植した。腫瘍体積が１００−２００ｍｍ^３に達した時点から投与を開始した。Ａｍ８０は１ｍｇ／ｋｇを１回／日、連日２１日間経口投与し、ＤＸＬは、５ｍｇ／ｋｇを１日目より４日間隔で３回、静脈内投与した。併用群は各単剤と同じ用量、投与法で投与し、投与終了翌日（２２日目）まで腫瘍径を測定した。腫瘍の長径及び短径を、キャリパーを用いて測定し、長径×短径^２／２の式から腫瘍体積（ｍｍ^３）を求めた。なお、対照群には生理食塩液を１日目より４日間隔で３回、腹腔内投与した。その結果、ヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰに対して、Ａｍ８０とＤＸＬとの併用は各単剤の効果を上回る相乗的な細胞増殖阻害活性を示した。結果を下記表３に示す。

レチノイドアゴニスト・タミバロテン（Ａｍ−８０）単剤あるいはレキシノイドアゴニスト・ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）両剤を併用するとヒトすい臓がん幹細胞のマーカー発現及び増殖を抑制し、また、種々の抗がん剤と併用することにより抗がん剤の効果を増強することが確かめられた。更に、各種がんに対して、Ａｍ８０と種々の抗がん剤を併用することにより、抗がん剤の効果を増強することが確かめられた。

Claims

レチノイドアゴニストを有効成分とするがん幹細胞の増殖抑制剤。
前記レチノイドアゴニストがタミバロテン（Ａｍ−８０）である請求項１記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
更に、レキシノイドアゴニストを有効成分とする請求項１または２記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
前記レキシノイドアゴニストがベキサロテンである請求項３記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
抗がん剤を含む請求項１〜４のうちいずれか一項記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
レチノイドアゴニストをヒト一個体あたり０．５〜２０ｍｇを含み、レチノイドアゴニストとレキシノイドアゴニストとを合計でヒト一個体あたり０．５〜５００ｍｇを含み、かつ、抗がん剤をヒト一個体あたり１．０〜１０００ｍｇを含む請求項５記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
前記抗がん剤が、ＤＮＡ相互作用剤、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用剤、分子標的治療剤、エピジェネティックスの作用阻害剤およびホルモン剤からなる群から選ばれる請求項５または６記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。