CN101623277A - 芬维a胺及其活性衍生物的新用途及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及芬维A胺或其活性衍生物的新医药用途，具体涉及芬维A胺在制备用于清除或杀灭受试者肿瘤干细胞或用于治疗和/或预防其中以肿瘤干细胞为病灶的肿瘤疾病的药物中的用途。本发明还涉及芬维A胺或其活性衍生物与其它抗肿瘤药联合应用的新用途、包含所述芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药的药物组合物、筛选所述其它抗肿瘤药方法、使用所述芬维A胺或其活性衍生物清除或杀灭受试者肿瘤干细胞、尤其造血系统肿瘤干细胞的方法、以及使用所述芬维A胺或其活性衍生物联合其它抗肿瘤药清除或杀灭肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞和起源于肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞的肿瘤细胞的方法。

Description

芬维A胺及其活性衍生物的新用途及其药物组合物

技术领域

本发明涉及芬维A胺的新用途，具体涉及芬维A胺或其活性衍生物在制备用于清除或杀灭受试者肿瘤干细胞、尤其造血系统肿瘤干细胞或用于治疗和/或预防起源于肿瘤干细胞、尤其造血系统肿瘤干细胞的肿瘤疾病的药物中的用途。本发明还涉及芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药联合应用的新用途、包含所述芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药的药物组合物、筛选所述其它抗肿瘤药方法、使用所述芬维A胺或其活性衍生物清除或杀灭受试者肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞的方法、以及使用所述芬维A胺或其活性衍生物联合其它抗肿瘤药清除或杀灭肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞和起源于肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞的肿瘤细胞的方法。

背景技术

近几十年来，人们对干细胞生理特性的认识极大地推进了人类对个体发育及内环境平衡的研究，尤其促进对肿瘤起源与相关治疗方面的研究(例如参见Bonnet and Dick，1997)。已经在哺乳动物的多种组织系统中证实了干细胞的存在，如皮肤、小肠、中枢神经系统和造血系统(例如参见Blanpain等，2004)。干细胞被定义为一种具有自我更新能力、可分化为不同系别细胞的能力和长期增殖能力的细胞。由于肿瘤起源细胞与正常干细胞生理特征的相似性，人们将肿瘤起源细胞称为肿瘤干细胞，这一观点先后在造血系统、中枢神经系统和乳腺系统的肿瘤中得到了逐一的证实(例如参见Bonnet and Dick，1997、Cobaleda等，2000、Jordan等，2006)。

肿瘤干细胞同正常干细胞与传统意义上的肿瘤细胞有所区别。同正常干细胞群体相比，肿瘤干细胞群体具有自身独特的生理特性，如白血病干细胞表现了异常激活的NF-kB活性，高度地表达细胞表面分子抗原CD123、干扰素调节因子1(IRF-1)与DAP激酶等。有别于传统意义上的肿瘤细胞群体，肿瘤干细胞为其母体，具有无限自我更新能力与分化潜能。

在肿瘤相关研究和治疗中，越来越多的实验数据与临床资料表明：很多肿瘤在肿瘤发生发展上起源于为数不多的一小群细胞——肿瘤干细胞(例如参见Jordan等，2006)。肿瘤干细胞具有致瘤性能力，致使肿瘤细胞群体自我更新的优势与低分化的特性(例如参见Hope等，2004)。肿瘤干细胞最早发现于造血系统肿瘤白血病(例如参见Lapidot等，1994)。类似于正常的造血干细胞，白血病干细胞是占白血病细胞群体一小部分、位于分化程度较低的金字塔顶端、具有无限增殖潜能的细胞，能产生具有有限的增殖能力的白血病祖细胞及其下游不同分化程度的白血病细胞，最终导致白血病发生。因此，在肿瘤疾病的靶向治疗中，肿瘤干细胞已经成为备受关注的药物设计与筛选的靶点。

由于传统的抗肿瘤药物都是作用于肿瘤干细胞下游不同分化程度的肿瘤细胞，对于分化程度较低但具有无限增殖潜能的肿瘤干细胞非常不敏感，因此虽然大多数肿瘤患者都可以达到临床缓解，但不难想象由于缺乏有效的干细胞靶向药物而导致耐药和复发现象。例如，慢性粒细胞白血病(CML)是以CML干细胞为病因的造血系统肿瘤(例如参见Huntly and Gilliland，2004)，主要特征为基因异位而形成的BCR-ABL融合蛋白，从而表现了异常激活的酪氨酸激酶活性；基于此原理设计的酪氨酸激酶靶向抑制剂伊马替尼(imatinib，STI571，Gleevec)可有效的杀伤白血病细胞(例如参见Deininger等，2000)。但是很多慢粒患者长期用药后会产生耐药和复发，分子诊断发现几乎所有的病人体内都有BCR-ABL阳性细胞残留，这说明单独使用酪氨酸激酶靶向抑制剂伊马替尼不能清除所有的白血病细胞，尤其是白血病干细胞(例如参见Graham等，2002)。另外一个例子是急性粒细胞白血病(AML)，主要特征是髓系分化受阻而导致外周血充斥着大量没有功能的原始粒细胞，包括AML干细胞(例如参见Bonnet and Dick，1997)。由于传统的化疗药物如阿糖胞苷(Ara-C)主要是通过阻断DNA的复制而杀伤分裂期的细胞，所以对AML干细胞非常不敏感，临床上很难达到完全缓解(例如参见Guzman等，2002；Guan等，2003)。

考虑到这些现状，肿瘤治疗领域明显需要能特异性地杀伤肿瘤干细胞但对正常干细胞无明显影响的药物，这不仅能克服肿瘤耐药性和复发，同时对起源于肿瘤干细胞的肿瘤疾病起到预防和根疗作用。

令人惊讶的是，本发明人基于以下研究结果发现：芬维A胺或其活性衍生物能特异性地诱导较原始肿瘤细胞的凋亡，特别是处于静止期的CD34⁺CD38^-的白血病干细胞，而对生理特征与白血病干细胞较为相似的CD34⁺CD38⁺白血病祖细胞也有一定的杀伤力，但对正常造血干细胞无明显影响。同时本发明人发现，与该药物相关的联合用药方案可以达到更好的疗效。此外，本发明人还建立一个有效筛选能够与芬维A胺或其活性衍生物联合应用以诱导肿瘤、尤其造血系统肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤剂的方法。

发明内容

发明概述

本发明第一方面提供芬维A胺或其活性衍生物的新医药用途。

根据本发明的第一方面，本发明第二方面提供所述芬维A胺或其活性衍生物与其它抗肿瘤药联合的新医药用途。

根据本发明的第二方面，本发明第三方面提供用于所述新医药用途的药物组合物，其中包含所述芬维A胺或其活性衍生物和至少一种其它抗肿瘤药。

本发明第四方面提供筛选与所述芬维A胺或其活性衍生物联合应用于所述新医药用途的其它抗肿瘤药的方法。

本发明第五方面提供清除或杀灭肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞的方法，以及清除或杀灭肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞和起源于肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞的肿瘤细胞的方法。

发明详述

本发明人发现，芬维A胺或其活性衍生物、特别是芬维A胺，能特异性地诱导肿瘤干细胞的凋亡，但对正常干细胞无明显影响。具体对于造血系统肿瘤，本发明人发现芬维A胺能够特异性地诱导来自造血系统肿瘤患者标本中的CD34⁺CD38^-细胞亚群调亡，而对正常造血干细胞无明显影响，此外发现芬维A胺对CD34⁺CD38⁺白血病祖细胞也有一定的杀伤力。

本发明人还发现，芬维A胺或其活性衍生物、特别是芬维A胺，主要通过改变造血系统肿瘤干细胞和/或祖细胞的氧化还原态的平衡，致使这些较原始的、较多处于静止期的造血系统肿瘤干细胞和/或祖细胞胞内活性氧水平升高，超过其所能承受的抗氧化能力阈值，从而特异性诱导凋亡。

本发明人还发现，芬维A胺或其活性衍生物、特别是芬维A胺诱导造血系统肿瘤干细胞和/或祖细胞的凋亡过程，可由氧化应激反应、内质网应激反应、未折叠蛋白反应、蛋白酶体激活等分子事件来刻画。特别值得注意的是，该凋亡事件起始涉及应激反应相关转录因子HSF1和NRF2的活化及其调节靶基因的表达，从而介导了上游药物引发的活化氧信号向下游各种细胞应激反应的传递。

根据上述发现，本发明第一方面提供芬维A胺或其活性衍生物在制备用于清除或杀灭受试者肿瘤干细胞或用于治疗和/或预防起源于肿瘤干细胞的肿瘤疾病的药物中的用途。进一步地，本发明第一方面提供芬维A胺在制备用于治疗和/或预防其中清除或杀灭肿瘤干细胞有益于抑制肿瘤耐药性产生和复发的肿瘤疾病的药物中的用途。

根据本发明的芬维A胺是一种人工合成的全反式维甲酸衍生物，其化学名为N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺，俗称芬维A胺，CAS注册号65646-68-6，其可通过文献所述方法合成(US4190594)。

根据本发明的芬维A胺的活性衍生物指的是芬维A胺经人工修饰或生物代谢而形成的却依然保留甚至加强其生物活性的衍生形式总称，包括芬维A胺的活性代谢物如4-氧代-芬维A胺、芬维A胺的可能的溶剂合物、可能的前体药物以及可能的药学可接受的盐。其中，应该理解，溶剂合物、前体药物和药学可接受的盐具有本领域技术人员熟知的本领域通常的含义，具体参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第二十一版本，ISBN：9780781746731，出版日期：15-06-2005)。

根据本发明，优选使用芬维A胺或其可药用盐。

根据本发明的术语“受试者”为本领域技术人员公知，在本发明中特别地指哺乳动物、更特别地是人类受试者，他们因罹患本文所述疾病即肿瘤、尤其造血系统肿瘤而需要使用本发明的药物组合物或方法进行预防或治疗。

根据本发明的肿瘤包括造血系统肿瘤和实体瘤，相应地，肿瘤干细胞包括造血系统肿瘤干细胞和实体瘤干细胞。进一步地，根据本发明的造血系统肿瘤干细胞主要指来自造血系统肿瘤患者标本中的CD34⁺CD38^-细胞亚群，其表达CD34但不表达CD38。根据本发明的实体瘤干细胞指的是占实体瘤少数的具有广泛增殖与形成肿瘤能力的这一类细胞群体。根据本发明的造血系统肿瘤祖细胞主要是指来自造血系统肿瘤患者的CD34⁺CD38⁺细胞亚群，其表达CD34和CD38。

根据本发明的造血系统肿瘤包括但不限于白血病、恶性淋巴增殖性障碍。进一步地，所述白血病包括但不限于慢性髓细胞白血病(CML)、急性髓细胞性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。进一步地，所述恶性淋巴增殖性障碍包括但不限于淋巴瘤和多发性骨髓瘤(MM)；并且所述的淋巴瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及小细胞和/或大细胞的滤泡淋巴瘤。

根据本发明的实体瘤尤其指乳癌、结肠癌和通常的包括胃癌、肝细胞瘤在内的胃肠道癌；肺癌尤其是小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肾癌、间皮瘤、神经胶质瘤、皮肤鳞状细胞癌、头和颈癌、泌尿生殖癌、例如子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌或膀胱癌；何杰金氏病、类癌综合征或卡波西肉瘤。在本发明的优选实施方案中，待治疗的实体瘤疾病选自胃癌、乳癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、尤其是胃癌和卵巢癌。

在本发明优选的实施方案中，所述肿瘤是造血系统肿瘤，所述造血系统肿瘤中优选白血病。换言之，本发明第一方面优选提供芬维A胺或其活性衍生物在制备用于清除或杀灭受试者造血系统肿瘤干细胞或用于治疗和/或预防起源于造血系统肿瘤干细胞的造血系统肿瘤疾病的药物中的用途。进一步地，本发明第一方面提供芬维A胺或其活性衍生物在制备用于治疗和/或预防其中清除或杀灭造血系统肿瘤干细胞有益于抑制肿瘤耐药性产生和复发的造血系统肿瘤的药物中的用途。

根据本发明的“起源于肿瘤干细胞的肿瘤疾病”、“其中清除或杀灭肿瘤干细胞有益于抑制肿瘤耐药性产生和复发的肿瘤疾病”分别表示“肿瘤发生发展源于具有无限自我更新能力与多向分化潜能的肿瘤干细胞群体的肿瘤疾病”、“相比清除或杀灭肿瘤细胞的方法而滋生的肿瘤耐药性的产生与肿瘤的复发，清除或杀灭肿瘤干细胞能有效地、彻底地达到治愈的肿瘤疾病”；相应地，“起源于造血系统肿瘤干细胞的造血系统肿瘤”以及“其中清除或杀灭造血系统肿瘤干细胞有益于抑制肿瘤耐药性产生和复发的造血系统肿瘤”分别表示“造血系统肿瘤发生发展源于具有无限自我更新能力与多向分化潜能的造血系统肿瘤干细胞群体的造血系统肿瘤”、“相比清除或杀灭造血系统肿瘤的方法而滋生的肿瘤耐药性的产生与造血系统肿瘤的复发，清除或杀灭造血系统肿瘤干细胞能有效地、彻底地达到治愈的造血系统肿瘤”。

本发明人通过试验还发现，与芬维A胺相关的联合用药方案可以达到更好的效果。本发明的药物联合作用于造血系统肿瘤的试验表明，芬维A胺和至少一种其他抗肿瘤药联用可协同抑制造血系统肿瘤细胞增殖，协同诱导调亡，对正常对照的骨髓造血干细胞无明显毒副作用。芬维A胺主要作用于造血系统肿瘤干祖细胞亚群，而另一联用药物主要作用于造血系统肿瘤较成熟细胞亚群。例如，试验表明：芬维A胺和BCR-ABL酪氨酸激酶靶向抑制剂的联合、芬维A胺和常规化疗药物的联合、芬维A胺和蛋白酶体抑制剂的联合、芬维A胺与阿糖胞苷和MG132两种抗肿瘤药物联合、芬维A胺与伊玛替尼和MG132两种抗肿瘤药物联合均显示协同诱导肿瘤细胞的调亡。本发明的药物联合作用于实体瘤的试验也表明：芬维A胺和至少一种其他抗肿瘤药联用可协同抑制肿瘤细胞增殖，协同诱导调亡，例如芬维A胺与防己碱协同诱导胃癌细胞凋亡。

这里所述的“协同”是指在共同使用时药物产生的总联合作用大于单独使用每种药物时的作用总和。具体对于本发明，组合药物联合作用于肿瘤而达到协同疗效。对于造血系统肿瘤，这里强调的是芬维A胺主要作用于造血系统肿瘤干细胞和/或祖细胞亚群，也可以增强另一常规抗癌药物对造血系统肿瘤较成熟细胞亚群的杀伤能力。

基于上述发现，本发明第二方面提供芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药联合的新医药用途。具体而言，本发明第二方面提供芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药的联合在制备同时、顺次或分别施用以协同诱导受试者肿瘤细胞调亡以治疗和/或预防受试者肿瘤的药物中的用途。

同样基于上述发现，本发明第三方面提供药物组合物，包含治疗有效量的芬维A胺或其活性衍生物，和治疗有效量的至少一种其它抗肿瘤药，以及任选的药学可接受的载体，所述至少一种其他抗肿瘤药与芬维A胺或其活性衍生物同时、顺次或分别施用以协同诱导肿瘤细胞调亡。

用于本文的术语“其它抗肿瘤药”是指不同于芬维A胺或其活性衍生物的抗肿瘤药。所述至少一种其他抗肿瘤药包括但不限于细胞周期特异性的化疗药物、BCR-ABL酪氨酸激酶靶向抑制剂、蛋白酶体抑制剂和不同于前三类的常规化疗药物。

所述细胞周期特异性的化疗药物意指本领域技术人员熟知的一大类杀伤处于特定细胞周期阶段增殖期细胞的化学治疗药物，包括但不限于阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、羟基脲、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、甲氨蝶呤。对于本发明第二和第三方面的用途和药物组合物，细胞周期特异性的化疗药物优选使用阿糖胞苷，其作用机理是通过阻断DNA复制而杀伤增殖期细胞，可商购得自Sigma公司。

上述BCR-ABL酪氨酸激酶是由于染色体易位形成费城染色体(Philadelphia chromosome)而产生的融合基因BCR-ABL，其相应的编码融合蛋白具有异常酪氨酸激酶活性。BCR-ABL酪氨酸激酶靶向抑制剂能阻止该激酶异常增高的活性，从而导致Bcr-Abl阳性细胞的死亡，其包括但不限于伊玛替尼(imatinib)、达沙替尼(Dasatinib)和尼罗替尼(Nilotinib)。在本发明优选的实施方案中，使用伊马替尼与芬维A胺或其活性衍生物的联合用于本发明的新医药用途，或使用伊马替尼与芬维A胺或其活性衍生物连同药学可接受的载体制备药物组合物。本文所述伊马替尼的化学名为：4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-苯基]笨甲酰胺；可商购得自瑞士Novatis公司。

上述蛋白酶体抑制剂意指一类通过对泛素化-蛋白酶体通路阻断的抗肿瘤药物，包括但不限于bortezomib、BzLLLCOCHO和MG-132。对于本发明第二和第三方面的用途和药物组合物，优选使用蛋白酶体抑制剂bortezomib，其化学名为[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，可得自美国Millennium Pharmaceuticals公司。

上述作用机理不同于前三类的常规化疗药物意指癌症或肿瘤治疗领域常规意义上的杀伤处于各个细胞周期阶段的一系列化学治疗药物，包括但不限于去甲氧柔红霉素、长春新碱、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春地辛、三尖杉酯碱、依托泊苷、替尼泊苷、左旋门冬酰胺酶，优选去甲氧柔红霉素。

用于本文的“联合”意指本发明的芬维A胺或其活性衍生物和至少一种其他抗肿瘤药可以作为同一单元剂型的各组成部分、作为不同的单元剂型或作为同一治疗方案的组成部分施用。相应地，用于本文的术语“同时、顺次或分别”是指芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药可以作为同一单元剂型的各组成部分或作为不同的剂型同时施用，也可以作为不同的剂型或作为同一治疗方案的组成部分在不同的时间、以任意次序分别施用。

本发明的药物组合物可以通过本身已知的方式、例如通过常规的混合、制粒、包衣、溶剂或冻干方法制备成适合于口服给药、胃肠外给药或局部给药的剂型，选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂等。尽管理论上所有制剂形式的药物组合物都可以用于临床给药，但是本发明的含芬维A胺或其活性衍生物和至少一种其它抗肿瘤药的药物组合物优选口服给药。

本发明优选的口服给药的药物组合物可例如通过将活性成分与一种或多种固体载体混合、如果需要将所得混合物制粒，并且如果需要加工所得混合物或颗粒形成片剂或片芯，如果需要通过引入额外赋形剂进行。

本发明优选的口服给药的药物组合物还包括由明胶组成的硬胶囊以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇组成的软密封胶囊。在软胶囊中，活性成分优选溶解或悬浮在合适的液体赋形剂中，还可向其中加入稳定剂和清洁剂。

在本发明的药物组合物中，除了作为主药成分的芬维A胺或其活性衍生物和作为联合用药的至少一种其它抗肿瘤药外，还任选包含药学可接受的载体。术语“药学可接受的载体”包括药学领域熟知的药学可接受的载体或赋形剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包胶材料。就与其它成分的相容性和对患者无害的意义而言，各载体或赋形剂应当是“可接受的”。一些可用作药学可接受载体的实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡类；油类，例如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；乙二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和其它无毒性可配伍的用于药物制剂的物质。

本发明的药物组合物还可以含有辅助剂例如防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、调节渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂。另外，通过包含延缓吸收的成分，可以使药物剂型延长吸收。

本领域技术人员能够理解，尽管本发明上文提及的药物组合物中还包含药学可接受的载体，但是，当芬维A胺或其活性衍生物和至少一种其它抗肿瘤药作为药物用于人或动物时，它们也可以以其本身给予，即不加任何上述药学可接受的载体也能实现本发明。

对于本发明的药物联合的用途以及药物组合物而言，药学活性剂的剂量水平和施用的时程可以改变，当然将适合于每种特定情形下的个体需求。示例性的剂量范围对于芬维A胺或其活性衍生物为每日50或100mg至500mg或1000mg、2000或3000mg/m²体表面积，优选每日100mg/m²、200mg/m²或400mg/m²体表面积；对于其它抗肿瘤药，例如对于BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的剂量范围是每日200mg、400mg、600mg、800mg一次，或每日400mg两次，优选每日200mg、400mg、600mg一次，；例如对于化疗药物阿糖胞苷的剂量范围是每日静注0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg或2mg/kg体重，优选每日1mg/kg体重；例如对于蛋白酶体抑制剂bortezomib的剂量范围是单次注射0.7mg/m²、1.0mg/m²、1.3mg/m²，每周2次，优选单次注射1.0mg/m²，每周2次。

使用本发明的芬维A胺或其活性衍生物以及至少一种其它抗肿瘤药的联合和包含二者的药物组合物，其给药方案和剂量方案可根据多种因素选择，所述因素包括受试者的种类、物种、年龄、体重、性别和所治疗肿瘤/癌症类型；所治疗肿瘤/癌症的严重程度(即期)；给药途径；患者的肾和肝功能；和使用的具体化合物或其盐。可以使用一种给药/剂量方案，例如预防疾病、抑制(完全或部分)疾病或使该疾病发展停止。

基于上述本发明人的发现，本发明第四方面提供了体外筛选与芬维A胺或其活性衍生物联合显示协同诱导肿瘤细胞凋亡的其它抗肿瘤药的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使肿瘤细胞与(a)有效量的芬维A胺或其活性衍生物和(b)待选的其它抗肿瘤药相接触，测定细胞的凋亡；

2)使肿瘤细胞与(a)有效量的芬维A胺或其活性衍生物相接触，测定细胞的凋亡；

3)使肿瘤细胞与(b)待选的其它抗肿瘤药相接触，测定细胞的凋亡；和

4)结果分析：当步骤1)中所测的凋亡大于步骤2)和步骤3)中所测凋亡的总和，则判定所述待选的其它抗肿瘤药可以与芬维A胺或其活性衍生物联合协同诱导肿瘤细胞凋亡。

本发明第五方面提供了清除或杀灭受试者肿瘤干细胞的方法，其包括施用有效引起肿瘤干细胞死亡量的芬维A胺或其活性衍生物的步骤。进一步地，本发明提供清除或杀灭受试者造血系统肿瘤干细胞的方法，其包括施用有效引起所述干细胞死亡量的芬维A胺或其活性衍生物的步骤。换言之，任一项的方法即使用单独的芬维A胺或其活性衍生物清除或杀灭肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞的方法。

本发明第五方面还提供了清除或杀灭肿瘤干细胞和起源于肿瘤干细胞的肿瘤细胞的方法，其包括在施用有效引起肿瘤干细胞死亡量的芬维A胺或其活性衍生物的步骤之前、同时或之后，还包括施用至少一种治疗有效量的其它抗肿瘤药的步骤。进一步地，本发明提供清除或杀灭受试者造血系统肿瘤干细胞和起源于造血系统肿瘤干细胞的造血系统肿瘤细胞的方法，其包括在施用有效引起造血系统肿瘤干细胞死亡量的芬维A胺或其活性衍生物的步骤之前、同时或之后，还包括施用至少一种治疗有效量的其它抗肿瘤药的步骤。换言之，任一项的方法即使用芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药的联合以清除或杀灭肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞和起源于肿瘤、尤其造血系统肿瘤干细胞的肿瘤细胞的方法。

应该理解，对于本发明第四方面的筛选方法和第五方面的治疗方法而言，上述有关芬维A胺或其活性衍生物、肿瘤及其干细胞、造血系统肿瘤及其干细胞和祖细胞、实体瘤以及其他抗肿瘤药的一般定义及优选定义均适用。

此外，本发明还涵盖包含芬维A胺或其活性衍生物和至少一种其它抗肿瘤药的“药盒”，即通过将芬维A胺或其活性衍生物和至少一种其它抗肿瘤药分别配制在分离的单元制剂中，再将这些分离的单元制剂组合，形成药盒的形式。在此情况下，可以容易地将分离的单元制剂中的芬维A胺或其活性衍生物和至少一种其它抗肿瘤药在时间上同时、顺次或分别施用于受试者。

在本发明的具体实施例中，研究结果首先展示：与增殖期细胞相比，芬维A胺更为有效地诱导处于静止期白血病细胞的凋亡(见实施例1)，抑制原始的白血病细胞集落的形成(见实施例2)。同时芬维A胺可以特异性靶向作用CML、AML与ALL病人标本中分离出来的CD34⁺CD38^-白血病干细胞，而对正常的造血干细胞无明显影响(见实施例3、4)。此外本发明人还通过一系列实施例探讨了白血病细胞对芬维A胺的敏感性与细胞内ROS水平之间的关系(见实施例5)，探讨了参与芬维A胺诱导凋亡的分子事件(见实施例6)，找出了芬维A胺药物作用靶点(见实施例7)，总结芬维A胺诱导凋亡过程中引发相关事件的动态变化关系(见实例8)。在另外一系列实施例中，发明人还提供了几种与芬维A胺相关的药物联合治疗方案，如芬维A胺与阿糖胞苷联合用于治疗急性粒细胞白血病(见实施例9)，芬维A胺与伊马替尼联合用于治疗慢性粒细胞白血病(见实施例10)，芬维A胺与阿糖胞苷和MG132两种抗肿瘤药物联合治疗AML(见实施例11)，芬维A胺与伊玛替尼和MG132两种抗肿瘤药物联合治疗CML(见实施例12)，芬维A胺与防己碱联合用于胃癌(见实施例13)。最后，发明人提供芬维A胺活性衍生物在清除或杀灭白血病干细胞中的应用(见实施例14、15)，列举了芬维A胺的制剂(见制剂实施例)。

尽管本发明大多采用大量造血系统肿瘤临床标本进行实验，但是本领域技术人员清楚，采用大量标本进行的试验具有普遍代表性，并且通过本领域技术人员的知识可以容易地将这些试验所呈现出的有益效果扩展到人体临床应用。

附图说明

图1显示芬维A胺对增殖期与血清饥饿型静止期白血病细胞株HL60诱导凋亡、线粒体跨膜电位(MTP)以及胞内活性氧(ROS)水平的影响作用。(A)芬维A胺在增殖期与静止期HL60细胞中诱导的凋亡。凋亡采用ApoAlert Annexin V试剂盒由流式细胞仪测定。(B)Rh123与PI双染色方法检测芬维A胺对增殖期与静止期HL60细胞线粒体跨膜电位的影响。(C)利用氧化敏感性荧光燃料DCFH-DA检测芬维A胺对增殖期与静止期HL60细胞ROS的影响。

图2显示芬维A胺对原始CML细胞集落形成的影响作用。将从CML病人新鲜骨髓标本中分离得到的CD34⁺细胞分别接种于含有2μM与4μM芬维A胺的甲基纤维素半固体培养基中，培养14天后对粒-单系集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)与粒红巨核巨噬系混合集落形成单位(CFU-GEMM)进行鉴定并计数。

图3显示芬维A胺特异性靶向作用于更原始的CML干细胞与祖细胞亚群。(A)芬维A胺显著诱导CD34⁺CD38^-CML干细胞与CD34⁺CD38⁺CML祖细胞凋亡。(B)芬维A胺特异性靶向CML干细胞对正常造血干细胞没有影响。经芬维A胺处理后，用CD34-PE与CD38-APC抗体对从CML病人骨髓标本中富集到的CD34⁺细胞进行标记，CD34⁺CD38^-细胞为CML干细胞，CD34⁺CD38⁺细胞为CML祖细胞。其中7AAD与Annexin V抗体用于检测干细胞与祖细胞亚群的凋亡。同时用正常造血干细胞作为对照，检测方法同上。

图4显示芬维A胺能显著性地诱导包括AML和ALL在内的急性白血病原代静止期细胞凋亡。(A)CD34⁺白血病细胞的周期测定。(B)芬维A胺诱导的AML CD34⁺细胞与正常CD34⁺细胞的凋亡。

图5显示芬维A胺特异性杀伤更为原始的急性白血病干细胞与祖细胞。经芬维A胺处理后，用CD34-PE与CD38-APC抗体对从AML与ALL病人骨髓标本中富集到的CD34⁺细胞进行标记，CD34⁺CD38^-细胞为急性白血病干细胞，CD34⁺CD38⁺细胞为急性白血病祖细胞。其中7AAD与Annexin V抗体用于检测干细胞与祖细胞亚群的凋亡。

图6显示芬维A胺在白血病细胞系中诱导的凋亡作用同细胞内ROS的水平密切相关。(A)K562、HL60与NB4细胞内ROS的本底水平，用DCFH-DA染料检测。(B)K562、HL60与NB4细胞对芬维A胺的敏感性。细胞凋亡用Annexin-V与7AAD双染法的测定

图7显示芬维A胺增强在白血病细胞系中同氧化应激相关和内质网应激相关的基因表达。(A)经芬维A胺处理的NB4细胞中，氧化应激介导的凋亡的基因表达模式。(B)western验证了芬维A胺在NB4细胞中诱发的氧化应激介导的凋亡。(C)经芬维A胺处理的K562细胞表现出典型的内质网应激反应(ER stress)基因表达模式。(D)在芬维A胺处理的K562细胞中，内质网应激反应的标志分子XBP-1基因发生了剪切。该图为RT-PCR结果。

图8显示应激相关转录因子NRF2与HSF1以及它们调控的靶基因的有序调节参与了经芬维A胺诱导NB4细胞凋亡过程。(A)经1μM芬维A胺处理后，NB4核蛋白中NRF2与HSF1蛋白含量变化的western结果。^＊代表非特异结合条带。(B)免疫荧光显微镜技术展示了在经1μM芬维A胺处理的NB4细胞中NRF2与HSF1的核转运现象，标尺为5μM。(C)受NRF2(左图)与HSF1(右图)调节的潜在靶基因的表达模式。(D)染色质免疫沉淀(ChIP)与PCR技术验证了NRF2和HSF1与其靶基因的物理结合。Total：总产物；IgG：以IgG抗体为对照的ChIP结果。DNAJB6^＊：在DNAJB6非转录因子结合位点设计的引物。

图9显示应激相关转录因子NRF2与HSF1对氧化应激介导的NB4细胞凋亡的特征性表达谱影响。氧化应激表达谱数据由层次聚类(hierarchicalclustering)方法所得。图的左侧为转录因子结合位点(TFBS)信息，用红色标记。图的上方标注了各种应激条件，除芬维A胺在NB4细胞中诱导凋亡以外，其他应激反应的处理都低于致死阈值，可以代表细胞存活状态下的转录组应答模式。其中热激数据来源于Hela、成纤维细胞与K562细胞。内质网应激反应数据来源于经糖基化抑制剂衣霉素与硫氢基还原剂DTT处理的Hela细胞，及DTT处理的成纤维细胞。氧化应激来源于经H₂O₂或甲萘醌处理的Hela细胞与甲萘醌处理的成纤维细胞。

图10显示ROS的阻断与蛋白酶体活性的抑制对芬维A胺诱导的凋亡的影响。(A)在NB4细胞中，抗氧化剂抗坏血酸钠(Vc)阻断了芬维A胺诱导的凋亡。(B)芬维A胺与蛋白酶体抑制剂MG132协同诱导NB4细胞凋亡。

图11显示芬维A胺促进氧化应激与内质网应激基因在CML病人CD34⁺细胞中表达。CD34⁺细胞来源于CML病人新鲜骨髓标本。基因的调变由荧光实时定量RT-PCR技术检测。

图12芬维A胺诱导凋亡过程中动态事件变化情况。主要涉及的事件包括ROS水平升高、凋亡前CHOP表达变化、受NRF2与HSF1调节的潜在靶基因的表达模式变化情况。

图13芬维A胺与阿糖胞苷联合用药协同抑制AML细胞的生长。纵坐标表示达到不同抑制率(GI)以及相应协同指数(CI)所需要的单独各自药物剂量与合用药物剂量。

图14显示芬维A胺与伊马替尼联合用药对CML原始细胞集落形成的影响。CD34⁺细胞来源于CML病人新鲜骨髓标本，分别接种于含有0.25μM伊马替尼(S0.25)、4μM芬维A胺(H4)、或两药合用(H4S0.25)的甲基纤维素半固体培养基Methocult H4434中，培养14天后对单系集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)与粒红巨核巨噬系混合集落形成单位(CFU-GEMM)进行鉴定与计数.

图15显示芬维A胺与伊马替尼联合用药对CML干细胞与祖细胞及正常造血干细胞的影响。用CD34-PE和CD38-APC抗体对从CML病人新鲜骨髓标本中富集的CD34⁺细胞进行标记，将细胞分成CD34⁺CD38^-CML干细胞(LSC)与CD34⁺CD38⁺CML祖细胞(progenitors)两个群体，并对干细胞进一步用Annexin V与7AAD进行凋亡检测。正常造血干细胞的检测同上。

图16显示芬维A胺与伊马替尼联合用药对K562细胞中BCR-ABL激酶活性的影响情况。(A)芬维A胺与伊马替尼联合用药对BCR-ABL、磷酸化BCR-ABL与磷酸化STAT5蛋白表达量的影响。(B)凋亡标志分子Caspase 3酶原形式、Caspase 3剪切形式与PARP剪切形式在经芬维A胺、伊马替尼单独用药或联合用药的K562细胞中的表达。CON：未处理组；H：芬维A胺处理组；S：伊马替尼处理组；H+S：芬维A胺与伊马替尼两药合用处理组。

图17显示芬维A胺、阿糖胞苷与MG132三药合用协同诱导AML细胞凋亡。

图18显示芬维A胺、伊玛替尼与MG132三药合用协同诱导CML细胞凋亡。

图19显示芬维A胺与中草药抗肿瘤药物防己碱协同诱导胃癌细胞凋亡。(A、B)Rh123/PI双染法测定MKN45和SGC 7901细胞在加药处理后24小时和48小时的凋亡。(C、D)Annexin V/PI双染法测定MKN45及SGC7901凋亡率。

图20给出表1，该表总结了CML病人标本的基本信息。38例CML病人标本中，有31个为刚诊断的慢性期病人标本，5个伊玛替尼耐药病人标本，一个急变期病人，一个伊玛替尼耐药转加速期病人标本。

图21中给出表2，该表总结了芬维A胺对急性白血病标本和正常人标本中CD34⁺细胞凋亡的影响。其中包括25例AML病人标本，17例ALL病人标本与8例正常人标本。

图22中给出表3，该表显示了4-氧代-芬维A胺对静止期与增殖期白血病细胞活力的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，应当理解，本发明并不受这些实施例的具体描述的限制，本发明所要求的权利范围应当以所附的权利要求书为准。

A、材料和方法部分

1.细胞系、培养条件及药物处理

细胞系为(a)慢性粒细胞白血病(CML)急变期来源的细胞株K562(BCR-ABL阳性细胞株)、(b)急性髓系细胞白血病细胞株NB4和HL-60。

将各细胞培养于含有10％胎牛血清(PAA，Linz，Austria)的RPMI 1640培养基中，放置于37℃、含5％CO₂的、饱和湿度的细胞培养箱中培养。伊马替尼(Imatinib)由Novartis公司(Basel，Switzerland)提供，芬维A胺(fenretinide)购自Sigma公司(St Louis，MO)。分别用(i)0.25μM伊马替尼、(ii)4μM芬维A胺、以及(iii)0.25μM伊马替尼与4μM芬维A胺两药联用，将细胞处理24、48和72小时。

2.血清饥饿型静止期白血病细胞模型

将HL-60细胞分别培养于(i)含有10％胎牛血清、和(ii)不含血清的RPMI 1640培养基中，以获得增殖期与静止期的白血病细胞模型。检测药物反应性时，将血清饥饿型静止期白血病细胞和增殖期白血病培养于含有0.5％胎牛血清的培养基中，分别用1μM与2.5μM浓度的芬维A胺处理。同时设置两种化疗药物作为对照：(i)20μM去甲氧柔红霉素(IDA)、(ii)5μM阿糖胞苷(Ara-C)。

3.CD34⁺细胞的分离

经上海交通大学医学院论理委员会许可，根据赫尔辛基宣言，获得了38例CML病人、25例AML病人、17例ALL病人和5例非白血病捐献者的新鲜骨髓标本与8例正常人标本。用Ficoll(上海第二试剂公司，上海，中国)密度梯度离心方法从标本中分离出单个核细胞。CD34⁺细胞的分离参照相应手册使用Easy

人类CD34正选试剂盒(StemPro 34；GibcoBRL，Gaithersburg，MD)。所有分选的CD34⁺细胞样本经流式细胞仪检测，其纯度都在92-98％范围内。CD34⁺细胞培养于还含有细胞生长因子(PeproTech，伦敦，英国)的无血清培养基中(StemPro 34；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。其中所需生长因子为GM-CSF(200pg/mL)，G-CSF(1ng/mL)；SCF(200pg/mL)；LIF(50pg/mL)，MIP-1α(200pg/mL)和IL-6(1ng/mL)。

4.白血病干祖细胞的凋亡检测

原始的AML与CML细胞(CD34⁺分选得到的细胞)用CD34-PE与CD38-APC(Beckman Coulter，Fullerton，CA)标记，室温孵育15分钟，细胞用预冷的PBS清洗一次，再用200μl 1×结合缓冲液(10mMHEPES/NaOH，pH 7.4；140mM NaCl；2.5mM CaCl₂)重新混悬，加入5μLAnnexinV-FITC(BD Pharmingen，San Diego，CA)和7-氨基放线菌素(7-AAD，0.25mg/mL)(Molecular Probes，Eugene，OR)，室温孵育15分钟后，用流式细胞仪进行凋亡检测。

5.细胞系凋亡检测

2×10⁵细胞采用ApoAlert Annexin V-FITC凋亡试剂盒(BDBiosciences)进行凋亡检测.细胞用PBS清洗一次后，重悬于200μl 1×结合缓冲液，加入5μl AnnexinV-FITC、10μL PI，避光室温孵育15分钟，用流式细胞仪进行凋亡检测(LSRII，Becton Dickinson)。

6.线粒体跨膜电位(ΔΨm)的测定

亲脂性阴离子染料Rh123和PI双染检测细胞的线粒体跨膜电位(ΔΨm)的变化和线粒体膜的完整性。2×10⁵的细胞用PBS洗涤1次，加入Rh123至终浓度10μg/ml，在37℃下避光温育30min后离心洗去Rh123，加入碘化丙啶(PI)至终浓度为10μg/ml，于暗处4℃放置30min。经流式细胞仪进行检测。

7.活性氧(ROS)的检测

细胞内活性氧(ROS)水平用过氧化敏感性荧光探针2’，7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)进行测定(Molecular Probes)。细胞经芬维A胺处理3h后，收集2×10⁵细胞，用PBS洗涤1次，重新混悬于1ml含有10μMDCFH-DA的PBS中，37℃孵育30min，用PBS洗涤两次后，在530nm波长处用流式细胞仪进行荧光强度的测定。

8.免疫印记(Western blot)检测蛋白表达。

细胞总蛋白或核浆抽提蛋白用以下抗体进行Western blot检测：caspase 3(BD Pharmingen，San Diego，CA)、剪切形式的caspase-3，磷酸化BCR-ABL、磷酸化-STAT5和β-actin(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)、剪切形式的PARP和GADD153(Calbiochem，SanDiego，CA)、BCR-ABL和GRP78(Santa Cruz，CA)、NRF2(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)、HSF1(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)。

9.集落形成实验

将1000个CD34⁺细胞接接种于分别混有伊马替尼(0.25μM)、芬维A胺(2μM或4μM)及合用组药物(芬维A胺2μM+伊马替尼0.25μM，或芬维A胺4μM+伊马替尼0.25μM)的甲基纤维素半固体培养基(MethocultH4434；Stem Cell Technologies，Vancouver，BC，加拿大)中，放置于37℃、含5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养14天。然后进行集落分成粒-单系集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)与粒红巨核巨噬系混合集落形成单位(CFU-GEMM)，分别进行计数。细胞数大于50个的被视为一个集落。

10.细胞周期分析

收集1×10⁶细胞，用PBS洗涤2次，用预冷的75％乙醇进行固定，在4℃下过夜。将固定好的细胞用PBS洗涤2次，用0.5μg/ml RNaseA在37℃下孵育30分钟，重新混悬于500μl含有PI终浓度为10μg/ml的PBS中，用流式细胞仪进行周期检测，所得结果用cellFit软件分析。

10.统计分析。

使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，San Diego，CA)对数据进行统计分析。数据通过1-way ANOVA分析并随后通过Tukey posthoc检验。配对t检验用于两组显著性比较。

11.基因芯片杂交与数据挖掘

所用芯片是本实验室自制的，含有12,630个cDNA克隆，代表10,647条基因，用Generation III点样仪(Amersham Pharmacia Biosciences)制备完成。cDNA文库所含基因表达于血液细胞。总RNA用TRIzol(LifeTechnologies)提取，经RNEasy柱(Qiagen)进一步纯化。纯化的RNA用RNALabChip试剂盒(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)定量后进行标记反转。取30μg RNA样本用Superscript II逆转录酶进行(Life Technologies)逆转录，并在此过程中掺入Cy3-dCTP或Cy5-dCTP荧光染料。经标准程序杂交后，荧光信号用激光扫描器(Axon Instruments，Union City，CA)进行扫描。所得数据标准化后计算药物处理组RNA样本与内参的比值。为了避免假阳性并保留芯片表达数据中生物学上有意义的调变基因，本发明人提出一种基因筛选、基因聚类的分析方法，该方法是自主开发并获美国专利的自组织图平面展示技术的改进版(Xiao等，2003)(Methods and systemfor analysis and visualization of multidimensional data.US，Patent No：美国专利6897875)。

12.荧光实时定量RT-PCR

荧光实时定量RT-PCR使用SYBR Green I染料(Applied Biosystem，Foster City，CA)在荧光定量RT-PCR仪ABI7900热循环检测系统上进行。

13.抑制实验

在ROS的拮抗实验中，NB4细胞先经100μM抗氧化剂抗坏血酸钠(Sigma)预处理2h，然后用1μM芬维A胺处理24h，检测其凋亡变化。在蛋白酶体抑制实验中，NB4细胞分别由0.5μM芬维A胺和0.2μM蛋白酶体抑制剂MG132(Calbiochem)单用或合用处理48h，然后检测其凋亡。

14.免疫荧光技术

为了检测转录因子激活后在细胞内位置的变化，NRF2与HSF1用免疫荧光技术进行了检测。

15.染色质免疫共沉淀(ChIP)分析

使用NRF2与HSF1的抗体进行免疫共沉淀实验(ChIP)。沉淀下来的片段用荧光定量PCR技术验证由计算机预测出的基因启动子区域的潜在转录因子结合位点(transcription factor binding sites，TFBS)。

16.细胞活力测定

使用3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝(MTT)检测细胞的活力。

B、实施例部分

实施例1

芬维A胺更为有效地诱导白血病干细胞模型——处于静止期的白血病细胞的凋亡

有文献报道来源于AML的HL60细胞株在血清饥饿的情况下会发生增殖阻滞(例如参见Bello等，2005)。为了检测芬维A胺对增殖期与静止期细胞的作用，HL60细胞株被选作血清饥饿型静止期白血病细胞模型。

该模型HL60细胞在没有血清的1640培养基中培养48h，G0/G1期(静止期)细胞达到了59.9％。将血清饥饿型白血病细胞与增殖期细胞培养于0.5％胎牛血清的培养基中，用1μM和2.5μM芬维A胺处理，同时用化疗药物20μM去甲氧柔红霉素(IDA)和5μM阿糖胞苷(Ara-C)处理组作为对照。在增殖期HL60细胞中，1μM和2.5μM芬维A胺24h诱导凋亡的比例分别是11.8％与36.8％；而在血清饥饿型静止期HL60细胞中，芬维A胺诱导的凋亡分别是39.5％与52.7％。这暗示了血清饥饿型静止期白血病细胞对芬维A胺更敏感，尤其当芬维A胺的浓度为1μM时(p＜0.0001)(图1A)。相比较之下，化疗药物甲氧柔红霉素在增殖期与静止期HL60细胞中诱导的凋亡率分别分别为88.7％与29.1％，其诱导静止期细胞凋亡的能力显著降低(p＜0.000001)。Ara-C处理组的结果类似(p＜0.00001)。芬维A胺在多种肿瘤细胞中可以诱导细胞内ROS水平的增高，降低线粒体的跨膜电位，最终诱导了细胞的凋亡。在此我们用Rh123与PI双染法检测了增值期与静止期HL60细胞线粒体的跨膜电位的变化。与增殖期细胞相比，芬维A胺显著降低了静止期细胞的线粒体的跨膜电位，而化疗药物无论是去甲氧柔红霉素还是阿糖胞苷对静止期细胞的跨膜电位都基本无影响(图1B)。本发明人进一步研究了芬维A胺对细胞内ROS水平的影响。血清饥饿48h的静止期HL60细胞中的ROS本底水平下降了36％。经1μM或2.5μM芬维A胺处理3h的增殖期细胞ROS分别升高了1.77与2.6倍；而对于静止期的细胞，ROS的升高分别为3.83与4.3倍。芬维A胺在同等条件处理下，血清饥饿型白血病细胞胞内ROS水平要比增殖期细胞内ROS水平显著升高，不仅表现在ROS改变倍数上，还表现在ROS的最终水平上(图1C)。

实施例2

芬维A胺抑制原始的白血病细胞集落的形成

我们进一步对从38例CML病人骨髓标本中获得的原始CML细胞进行了集落形成实验，检测芬维A胺对该群体细胞集落形成的影响(表1)。首先，采用Easy

人类CD34阳性分选试剂盒进行CML CD34⁺细胞的分选，并将该细胞接接种于还含有2μM或4μM芬维A胺的甲基纤维素培养基中，分别观察芬维A胺对粒-单系集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)与粒红巨核巨噬系混合集落形成单位(CFU-GEMM)的影响。如图2所示，当芬维A胺浓度从2μM增加到4μM时，爆式红系集落形成单位的数量显著减少，其抑制率从24％±6％增加到66％±9％(p＜0.001)，而相对于红系而言，粒-单系集落形成单位的数量减少得没那么明显，2μM和4μM的芬维A胺对应的抑制率分别是19％±7％和36±9％(p＜0.05)。尤为值得注意的是由更为原始的祖细胞形成的集落——粒红巨核巨噬系混合集落形成单位，在芬维A胺处理组不能被检测到。

实施例3

芬维A胺特异性靶向作用于原始的CML细胞：CML干细胞及其祖细胞，而对正常造血干细胞没有影响。

白血病细胞被证明是一个具有等级结构的细胞群体(例如参见Bonnetand Dick，1997)。所以非常有必要找出芬维A胺所作用的群体。

将CML病人标本分离的细胞分成单个核细胞与CD34⁺细胞两个群体，其中CD34⁺细胞为较为原始的CML细胞，包含CML干细胞与祖细胞。故将CD34⁺细胞用抗体标记再细分为CD34⁺CD38^-CML干细胞与CD34⁺CD38⁺CML祖细胞，同时用7AAD与Annexin V标记检测其凋亡。结果显示，芬维A胺基本不能诱导单个核细胞凋亡。对CD34⁺CD38⁺CML祖细胞而言，芬维A胺的诱导凋亡呈剂量依赖性，2μM、4μM和6μM芬维A胺诱导的凋亡率分别为17.83％±6.01％、30.60％±4.93％和33.08％±9.43％。然而在CD34⁺CD38^-CML干细胞中，芬维A胺在较低的浓度就可以显著诱导凋亡。2μM、4μM和6μM芬维A胺诱导的凋亡率分别为60.58％±2.76％、63.75％±8.49％和62.83％±9.72％(图3A)。CML干细胞与祖细胞之间凋亡率差异显著(p＜0.001)。图3B分别显示了芬维A胺对白血病干细胞(LSC)与正常造血干细胞(HSC)的影响。该图的试验分别来自一代表样本，其他各4例CML样本与正常人标本与该结果一致。与未处理组相比，芬维A胺使白血病干细胞比例显著下降了80.3％，同时该群体细胞的凋亡率显著增高，为53.3％。而在正常造血干细胞组，芬维A胺基本没有改变其比例(减少5.36％)，同时细胞凋亡率为19.08％。该结果表明，芬维A胺可以特异性诱导CML干细胞与祖细胞的凋亡，但对正常造血干细胞的活力基本没有影响。

实施例4

芬维A胺特显著诱导原始的静止期AML与ALL急性白血病细胞凋亡，而对正常造血干细胞及其祖细胞没有影响。

因为肿瘤干细胞大部分处于静止期，所以传统的化疗药物对其非常不敏。从AML与ALL样本中分离的原代急性白血病细胞大多数都是静止期细胞，特别是CD34⁺群体(例如参见Guan and Hogge，2000)。为了验证对该静止期细胞对芬维A胺的敏感性，我们比较了芬维A胺对短期培养的原代白血病细胞与正常样本细胞的影响。首先我们对从原代白血病细胞中分离出来的CD34⁺细胞用PI染色后进行了DNA含量的分析。流式结果显示AML与ALL CD34⁺细胞大部分处于G0/G1期，表明白血病CD34⁺细胞表现出静止期特征(图4A)。然后对CD34⁺AML细胞与CD34⁺正常造血细胞用annexin-V FITC与7AAD双染法进行了凋亡检测(图4B)。在AMLCD34⁺细胞中，芬维A胺诱导了显著的凋亡，且该凋亡呈时间与剂量依赖性。与之相反，正常的CD34⁺造血细胞表现出一定程度的耐药。表2列出了芬维A胺对25例AML、17例ALL，与8例正常标本中CD34⁺群体的作用。5μM芬维A胺处理8h后，AML CD34⁺细胞的平均存活率为45.4％。然而AML样本间对芬维A胺的反应性差异比较大，最敏感的细胞存活率只有0.5％(AML#20)，而最耐受的细胞存活率为89.7％(AML#8)。芬维A胺浓度增加到7.5μM，AML CD34⁺细胞平均存活率下降到了12.2％。与之相似，ALL CD34⁺细胞经芬维A胺处理后也表现出剧烈的凋亡。5μM和7.5μM芬维A胺作用下的细胞平均存活率分别为58.0％和20.9％。为了验证芬维A胺是对肿瘤细胞特异性杀伤，本发明人还对正常造血细胞进行了细胞活性检测。结果发现当芬维A胺为5μM时，正常造血细胞的活力基本没受影响(97.1％)，而当芬维A胺浓度达到7.5μM时，细胞存活率下降到58.1％。所以，发明人认为芬维A胺在5μM以内为安全剂量，而且较正常的CD34⁺细胞而言，芬维A胺对AML与ALL CD34⁺细胞显示了特异性杀伤。

进一步，我们检测了芬维A胺对AML与ALL中处于高度静止期的CD34⁺CD38^-白血病干细胞和CD34⁺CD38⁺白血病祖细胞的作用。由于很难获得足够数量的正常人CD34⁺CD38^-细胞，这里所用的凋亡数据来源于正常人的CD34⁺细胞群体。同时本发明人用阿糖胞苷(Ara-C)与长春新碱(VCR)作为对照，来检测化疗药物诱导的白血病干细胞的凋亡，因为通常情况下肿瘤干细胞被认为是化疗药物耐受型。结果显示，芬维A胺在CD34⁺CD38^-急性白血病干细胞群体中比在CD34⁺CD38⁺急性白血病祖细胞群体中诱导了更多的凋亡，而对正常CD34⁺细胞基本没有影响(图5)。

实施例5

芬维A胺诱导白血病细胞系的凋亡能力与细胞内ROS升高的水平呈正相关

在很多肿瘤中，芬维A胺诱导的凋亡显示出一个共同的特征：ROS依赖性凋亡(例如参见Sun等，1999)。因此本发明探讨了细胞内的ROS水平与芬维A胺诱导的细胞凋亡之间的关系。本实验在一系列的白血病细胞系K562、HL60和NB4中展开。细胞内的ROS水平用荧光探针DCFH-DA来检测，不同浓度的芬维A胺诱导的细胞凋亡用annexin-V FITC与7AAD双染法检测。结果发现，NB4、HL60和K562细胞内的ROS水平为NB4＞HL60＞K562(图6A)，而有趣的是这些细胞对芬维A胺的敏感性也为NB4＞HL60＞K562.(图6B)。结果表明，芬维A胺诱导的细胞凋亡与细胞内ROS的水平呈正相关。

实施例6

在白血病细胞系中，芬维A胺诱导凋亡所发生的显著分子事件及与蛋白酶体抑制剂协同促凋亡的作用。

尽管芬维A胺诱导凋亡效应显著(例如参见Oridate等，1997)，但其分子机理尚不明晰。尤其是在芬维A胺诱导的氧化应激反应如何激活下游分子事件这一方面更是知之甚少。本发明人整合了基因芯片技术、robust数据挖掘工具与分子生物学技术，对芬维A胺在白血病细胞系中诱导的凋亡进行了全面的分析。NB4细胞株的转录组分析结果显示在芬维A胺诱导的凋亡的过程中，大量氧化应激事件在不同的时间与空间水平被激活，反应出一个典型的氧化应激介导凋亡的生物学过程。这些显著事件包括转录调控、核糖体机器、氧化应激反应、内质网应激反应(ER stress)、未折叠蛋白反应(UPR)、泛素化蛋白酶体系统与凋亡等(图7A)。相类似地，芬维A胺在K562细胞株中诱导凋亡的转录组表达谱也激活了内质网应激反应、UPR和蛋白酶体等相关基因(图7C)。最近有研究结果表明芬维A胺能够扰乱细胞内环境平衡，激活内质网应激反应，并最终导致凋亡。内质网应激反应是细胞的一种保护机制，用以抵抗外界各种刺激，包括氧化应激。为了证实转录组分析得到启示与相关的分子事件，本发明人进一步用RT-PCR实验验证内质网应激反应的标志分子XBP-1。在芬维A胺处理过的K562细胞中，XBP-1的剪切形式持续出现于各个时间点(图7D)。

转录组分析的结果促使本发明人对氧化应激介导的凋亡进行了更深入的生物信息学分析，包括对调变基因上游转录因子的预测。几十个预测的转录因子中包括两个应激应答转录因子：NRF2与HSF1，它们在氧化信号向下游事件传递的过程中起着重要作用。NRF2是本领域熟知的一个维持细胞氧化还原平衡的关键分子，可以激活抗氧化基因对抗氧化应激(例如参见Jaiswal，2004)。而HSF1通常情况下被认为是一个热激转录因子(例如参见Hayashida等，2006)，在特定的环境下也会被氧化应激激活(例如参见Ahn and Thiele，2003)。因此本发明人对这两个转录因子在芬维A胺诱导的凋亡中时间丰度与空间位置的变化做了进一步的研究。如图8A所示，经芬维A胺处理后，NB4核蛋白中NRF2与HSF1蛋白的含量在短时间内(小于6h)显著升高。NRF2被持续激活，而HSF1的激活只在24h以内。免疫荧光实验验证了这一结果，未经处理的细胞，NRF2与HSF1呈现弥散分布，而芬维A胺处理6h的细胞，两转录因子显著的聚集到细胞核中(图8B)。同样，NRF2入核的现象超过了24h，而HSF1的激活则在该时间点终止。此外，NRF2与HSF1在时间与空间水平的变化与其调控的靶基因变化非常一致(图8C)。NRF2的潜在靶基因上调持续到了药物处理的晚期，而HSF1的潜在靶基因上调持续到中期。为了检测这两个转录因子是否真的结合到了所预测的靶基因上，本发明人进行了染色质免疫沉淀实验(ChIP)。根据预测到的代表基因结合位点(图8C)，本发明人设计了相应的引物，以NRF2和HSF1特异性抗体拉下来的ChIP产物为DNA模板进行PCR验证。如图7D所示，预测的含有NRF2结合位点的基因如FTL、NQO1、TXNRD1、GCLM和GCLC在NRF2的ChIP产物中为阳性结果，而非相关基因如LRRC、AFIM和PAX7A在相同的产物中为阴性结果。尽管在未经芬维A胺处理的ChIP产物中也能检测到基底水平的NRF2结合基因，但处理组大多数预测基因的信号显著强于未处理组。同样HSF1的ChIP-PCR实验得到了相似的结果(图8D右侧)。值得注意的是，根据转录因子结合位点区域设计的引物在HSF1的ChIP产物中可以检测到目的基因，而非转录因子结合位点区域引物则没有信号，例如基因DNAJB6与DNAJB6^＊。综上所述，本发明人的实验结果表明在芬维A胺处理的早期ROS的累积激活了转录因子NRF2和HSF1，使得氧化应激的信号由其靶基因传递到了下游事件。NRF2的激活一直持续到晚期，而HSF1的激活则在中期末端结束。芬维A胺在白血病细胞中诱导的凋亡是应激应答转录因子有序地调节了大量应激应答基因回应氧化应激的结果。本发明人认为在芬维A胺诱导凋亡的过程中，这些氧化应激应答特征赋予细胞的是一种促凋亡而非促生存信号。为了验证上述观点，并评估NRF2与HSF1对上述特征性表达谱的潜在影响，本发明人比较了芬维A胺与三氧化二砷(ATO)介导的凋亡(例如参见Zheng等，2005)以及一系列非凋亡条件下的应激应答表达谱数据(例如参见Murray等，2004)。通过分级(hierarchical)聚类分析，整合基因组转录因子结合位点数据，图9展示了在凋亡与非凋亡条件下的应激应答转录组特征。该特征性表达谱可以被分成4大类。第一类基因的调变主要由于HSF1的激活，同时也表明在热激条件下该类基因的显著上调。值得注意的是HSF1在非凋亡条件的激活是持续的而非短暂的。第二类基因的调变比较复杂，可能是由于参与了多种应激应答转录因子的调节如CHOP与XBP1等，从图中可以看到多种转录因子的结合位点。这些基因涉及内质网应激反应与UPR，调变发生在氧化应激介导的凋亡的中期。第三类基因的调变发生在中晚期，与氧化还原信号直接相关，主要受NRF2与其辅助因子MAF调节。第四类基因的特征最明显，主要是编码蛋白酶体亚基的基因，受ELK1调节。综上所述，本发明的数据清晰的展示了经芬维A胺处理的NB4细胞应激应答转录组特征是一个典型的由氧化应激介导凋亡的表达谱特征。

ROS信号在芬维A胺诱导的凋亡早期可能是一个不可或缺的刺激。为了验证芬维A胺诱导凋亡的ROS依赖性，我们用抗氧化剂抗坏血酸钠抑制ROS的生成。实验表明，在NB4细胞中，抑制ROS的生成可以完全阻断芬维A胺诱导的凋亡(图10A)。

由于基因表达谱显示编码蛋白酶的基因在芬维A胺诱导的凋亡的过程中被显著上调，发明人推测蛋白酶体的激活可能是细胞的一种保护机制，与UPR偶联，降解大量未折叠或错误折叠的蛋白以减轻对内质网的压力(例如Meusser等，2005)。蛋白酶体的激活可能与促凋亡/凋亡级联反应相拮抗。为了验证这一设想，本发明人使用了蛋白酶体抑制剂GM132阻断蛋白酶体的活性。如图10B所示，低剂量的GM132(0.2μM)与低剂量的芬维A胺(0.5μM)在48h以内可显著诱导细胞的凋亡，这表明阻断蛋白酶体的活性可以促进芬维A胺诱导的凋亡。

实施例7

在芬维A胺处理的CML CD34⁺细胞中氧化应激、内质网应激相关的基因表达水平增强。

芬维A胺可以特异性杀伤原始的白血病干祖细胞(实施例3与实施例4)，同时在白血病细胞系中芬维A胺表现为ROS依赖性且大量氧化应激与内质网应激反应基因被上调(实施例5与实施例6)。因此非常有必要研究在白血病干祖细胞中芬维A胺是否表现为相同凋亡机制。本发明人参照经芬维处理的K562表达谱，用荧光实时定量RT-PCR技术检测了从CML病人标本中分离出的CD34⁺细胞在芬维A胺处理后氧化应激与内质网应激反应基因表达调变情况。如图11所示，用芬维A胺处理48h，CML CD34⁺细胞中，氧化应激与内质网应激反应基因被显著上调，这表明这些基因可能是芬维A胺药理学作用靶点。

实施例8

总结芬维A胺引发相关事件的动态变化关系

这里我们探讨芬维A胺诱导凋亡过程相关分子事件的动态变化关系。如FIG.12所示，细胞内ROS变化情况远比先前认识的复杂，呈现向左偏的钟形变化趋势(图中蓝线显示)。同预期期盼的一样，ROS早期快速升高积聚并于6小时内达到峰值，之后缓慢下降并维持同处理前两倍的水平。这种变化趋势不仅是芬维A胺生物作用机制的直接反映，也是引发下游分子应激反应的始发信号，如两个应激应答转录因子NRF2与HSF1激活并介导了各自所调控的靶基因的表达(图中青色与深紫色显示)。虽然这两类应激应答基因各自表达可以认为是细胞内抵御返防结果，但是它们协调性地有序表达(NRF2被持续激活与HSF1激活相对瞬时性)对芬维A胺诱导凋亡事件是起到促进作用，如促进凋亡前CHOP信号(图中淡紫色显示)。

实施例9

芬维A胺与阿糖胞苷联合用药协同抑制AML细胞的生长。

AML白血病细胞群体包括处于静止状态的AML白血病干祖细胞亚群和较成熟的增殖的粒细胞亚群。利用芬维A胺杀伤白血病肿瘤干祖细胞而对正常造血干祖细胞无影响的靶向治疗的优势，结合传统的化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)通过阻断DNA的复制而杀伤分裂期细胞能力，联合用药芬维A胺与阿糖胞苷，分别靶向作用于干祖细胞亚群与较成熟粒细胞亚群，以达到克服现阶段针对白血病的传统化疗耐药和复发目的。因此，我们检测了两药联用抑制AML细胞生长增殖的情况。

协同指数(Combination Index，CI)用于评估芬维A胺与阿糖胞苷两药联用在AML细胞U937中产生的生长抑制效应。协同指数的计算基于经典的isobologram公式：CI＝d1/D1+d2/D2，其中D1与D2为药物1或药物2单独用药达到一定生长抑制率(Growth Inhibition，GI)所需剂量，d1与d2为药物1和药物2合用要达到相同抑制率所需的各自剂量。CI＜1代表两药协同，CI＞1代表两药拮抗，CI＝1代表两药作用相加。如FIG.13所示，当生长抑制率GI大于30％时，CI值均小于1，这表明芬维A胺与阿糖胞苷合用显示了协同作用。如为取得65.47％的生长抑制率，单用芬维A胺的剂量为2.72μM，单用阿糖胞苷的剂量为0.091μM，而合用药组两药的剂量分别需要芬维A胺0.05μM，阿糖胞苷0.05μM，大幅度地低于单用情况。该联合用药策略显示了显著的协同效应与低毒性。无疑，联合用药芬维A胺与阿糖胞苷协同抑制AML细胞的生长，该方案为芬维A胺联合传统化疗药物的组合治疗白血病提供典范。

实施例10

芬维A胺与伊马替尼联合用药协同抑制原始CML细胞集落的形成，靶向CML干细胞及其祖细胞，在K562细胞中协同抑制BCR-ABL激酶活性。

对CML发病机制的深入认识，促使了高效靶向小分子药物伊马替尼(STI571，Gleevec)的诞生。伊马替尼可以特异性抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的活性，在CML临床治疗上取得了巨大成功，使慢性期CML病人的完全遗传学缓解到达近87％(例如参见Druker等，2006)。然而很多病人长期用药后还出现耐药和复发。一方面由于BCR-ABL激酶活性位点的突变影响了伊马替尼的结合(例如参见Shah等，2002)，另一方面是因为在较为原始的CML细胞中BCR-ABL激酶活性的抑制与凋亡的关系尚不明晰。几乎所以病人在持续服用伊马替尼的情况下，体内仍旧有BCR-ABL阳性的细胞残余。这表明，只抑制BCR-ABL激酶活性，不能杀伤所有的CML细胞，特别是CML干祖细胞(例如参见Graham等，2002)。本发明发现，新的用药方案，例如芬维A胺与伊马替尼联合用药，能更有效地治疗CML，克服伊马替尼联耐药与疾病复发。以下介绍了芬维A胺与伊马替尼联合用药在病人原代细胞中的合用效果，与以K562为模型两药协同机制的研究。

如实施例2所述，芬维A胺可以有效地抑制更为原始的CML祖细胞的集落形成。因此，本发明人进一步检测了芬维A胺与伊马替尼联合用药对从38例CML病人中分离的原代CML细胞集落形成的影响(表1)。将CML CD34⁺细胞分别接种于含有0.25μM伊马替尼，4μM芬维A胺，或两药合用的半固体培养基中，以检测药物对粒系集落形成单位(CFU-GM)，红系集落形成单位(BFU-E)与混合集落形成单位(GFU-GEMM)的生长的影响。如图14所示，两药合用组与单用要组相比，显著的抑制了CFU-GM与BFU-E集落的形成(p＜0.001)。GFU-GEMM被认为是更原始的细胞形成的集落，在芬维A胺处理组与两药合用组不能被检测到。

为了检测伊马替尼和芬维A胺是否对CD34+细胞亚群具有靶向作用的偏向性，本发明人用CD34与CD38抗体对这群细胞进行了细分。如图15所示，在CML干细胞(CD34⁺CD38^-)中，芬维A胺与合用组诱导的凋亡显著高于未处理组与伊玛替尼处理组(p＜0.001)，分别为53.3％和42.6％。而对正常造血干细胞的毒性分成小，芬维A胺与合用组诱导的凋亡分别只有19.08％和19.48％。

综合上述结果，本发明人可以得出芬维A胺与伊马替尼联合用药在原代CML细胞中所表现的协同作用，这种协同作用不仅体现在两种药物药效在同一群体细胞中的放大，更重要的是由于两种药物有效地作用于不同细胞群体。伊马替尼主要作用于下游分化了的CML细胞，而芬维A胺在我们的研究中被首次发现主要作用于CML干细胞及其祖细胞，而对正常的造血干细胞无影响。因此该协同策略为克服CML的耐药与复发提供了行之有效的临床治疗方案。

为了研究芬维A胺与伊玛替尼协同的潜在分子机理，本发明人用western技术检测了经芬维A胺、伊玛替尼单独处理和两药合用处理的K562细胞株中BCR-ABL、磷酸化-BCR-ABL、磷酸化-STAT5、酶原形式caspase3、剪切形式caspase3和剪切形式PARP.的表达量。如图16A所示，各处理组对BCR-ABL蛋白表达量并无影响，而对其磷酸化活性形式作用明显：伊马替尼对BCR-ABL磷酸化的抑制24h为50％，48h为85％，而两药合用组24h的抑制率为80％，48h为99％。STAT5的磷酸化活性也发生了相类似的改变。此外，Caspase3与PARP在两药合用组发生了最多的剪切(其活性形式)。(图16B)。总之，在K562细胞系中，芬维A胺与伊马替尼协同抑制了BCR-ABL的活性，并协同诱导了细胞的凋亡。

实施例11

芬维A胺、阿糖胞苷与GM132三药合用协同诱导AML细胞凋亡。

有两个现象促使我们进一步研究其他联合用药方案。如实施例6所述蛋白酶体抑制剂可以放大芬维A胺诱导白血病细胞凋亡的效应。此外，实施例8所述，芬维A胺与传统化疗药物联合用药可以协同抑制白血病细胞的生长(见实施例9)。这里我们将展示芬维A胺、阿糖胞苷与蛋白酶体抑制剂GM132三药合用诱导AML细胞系U937凋亡的协同效果。如图17所示，芬维A胺(1.5μM)与低剂量的阿糖胞苷(0.03μM)和MG132(0.2μM)单独用药在48h以内基本没有诱导凋亡(5％左右)，芬维A胺与MG132两药联用时凋亡率倍增，而三药合用其凋亡率接近35％，该凋亡率显著高于任意两种药物的组合。这表明芬维A胺、阿糖胞苷与GM132三药合用可以显著协同诱导AML细胞的凋亡。这里值得注意的是阿糖胞苷与MG132的剂量都低于临床用药水平，这意味着降低了药物的毒性。

实施例12

芬维A胺、伊玛替尼与MG132三药合用协同诱导CML细胞凋亡。在实例10中我们详细介绍了芬维A胺与伊玛替尼联合用药协同诱导CML细胞凋亡的现象与机理。与实施例11相似，我们在K562细胞加入MG132探讨其是否会进一步协同芬维A胺与伊玛替尼诱导的凋亡。如图18所示，药物处理48h，芬维A胺(4μM)、伊玛替尼(0.25μM)和低剂量的MG132(0.1μM)单独用药诱导的凋亡率分别为2.46％、12、08％和2.51％。芬维A胺与伊玛替尼两药联用的凋亡率为21.04％，而三药合用的凋亡率为31.66％，该凋亡率显著高于任意两种药物的组合。像这样将芬维A胺与多种抗肿瘤药物联用的治疗方案，CML的治疗提供了更广阔的前景。

实例13

芬维A胺与防己碱协同诱导胃癌细胞凋亡。

芬维A胺主要通过作用肿瘤细胞产生内质网压力，提高细胞内活性氧水平，从而启动一系列通路，激活凋亡通路，同时也激活包括NF-κB在内的通路，而NF-κB调控着许多炎症相关肿瘤的形成和发展。在多种抗肿瘤药物及抗炎药物中，我们筛选出与芬维A胺联用在诱导肿瘤细胞凋亡方面具有协同效果的药物防己碱(Tetrandrine)。与芬维A胺不同，防己碱是中草药粉防己中的主要有效成分，具有逆转多重耐药(MDR)、阻滞钙离子通道等作用。我们发现在胃癌细胞中4μM芬维A胺与4-5μM防己碱可以显著协同诱导细胞的调亡。图19A和19B分别展示了用Rh123/PI双染法检测的两药合用在MKN45与SGC 7901细胞系中的协同作用，在MKN45细胞中，药物处理48h，两药合用诱导的凋亡显著高于单用药诱导的凋亡(如，4μM芬维A胺、5μM防己碱和两药合用诱导的凋亡率分别是6.2％、15.8％和49.4％)同样在SGC 7901细胞中芬维A胺与防己碱合用也显示了明显的协同作用，如图19B所示。图19C与图19D分别为在MKN45与SGC7901细胞用Annexin V/PI双染法测定凋亡率，我们可以看到在合用组诱导的凋亡显著高于单用药组。

实施例14

4-氧代-芬维A胺更为有效地诱导血清饥饿型静止期白血病细胞的凋亡

HL60细胞在没有血清的1640培养基中培养48h，构建血清饥饿型静止期白血病模型(见实施例1)。将血清饥饿型白血病细胞与增殖期细胞培养于0.5％胎牛血清的培养基中，分别用0-10μM 4-氧代-芬维A胺分别处理24与48小时。用MTT方法检测4-氧代-芬维A胺对增殖期与静止期细胞的活力的影响。与芬维A胺结果相类似，较增值期白血病细胞而言，血清饥饿型静止期细胞对4-氧代-芬维A胺更敏感(表格3)。

实施例15

4-氧代-芬维A胺特异性靶向作用于原始的AML干细胞及其祖细胞。为了验证4-氧代-芬维A胺是否能像芬维A胺一样特异性杀伤原始的白血病细胞，我们AML骨髓标本中分离出CD34⁺细胞，分别用0-10μM 4-氧代-芬维A胺处理48h检测其凋亡。由此获得CD34⁺细胞的凋亡率。在用CD34-PE与CD38-APC抗体将CD34⁺细胞群体进行细分后，在CD34⁺CD38⁺AML祖细胞与CD34⁺CD38^-CML干细胞中，4-氧代-芬维A胺的诱导凋亡呈剂量依赖性，与芬维A胺的结果相类似(见实施例4)。由此表明，4-氧代-芬维A胺也是非常具有前景的白血病干细胞与祖细胞靶向药物。

C、制剂实施例

芬维A胺口服制剂

胶囊剂(1000粒，50mg/粒)

制备方法：将已经预热至80℃的水、甘油、对羟基苯甲酸乙酯(用适量95％以上的药用乙醇溶解)、明胶置浓缩锅内，在蒸汽压力不超过0.06Mpa，60±2℃的条件下，过滤，出料，备用。另在60℃以下的温度条件下，去芬维A胺、BHA加入适量植物油中，搅拌、混匀，再加入已过滤的蜂蜡和氢化豆油混合物，以及剩余的植物油，研磨，加入卵磷脂，搅拌、混匀。将此油料在丸制室中密封于上述备好的软质囊中制丸，定型，再在26-30℃和30-35℃、相对湿度均≤40％下低温烘丸二次，并用石油醚洗丸1-2次后，晒丸，整理，包装，塑封，即得。

参考文献：

美国专利文献

4190594    February 1980    Gander et al.

4665098    May 1987         Gibbs et al.

5464870    November 1995    Veronesi et al.

6352844    March 2002       Maurer et al.

6368831    April 2002       Maurer et al.

6733743    May 2004         Jordan.

6869795    March 2005       Bartelmez et al.

7169813    January 2007     Formelli.

7169819    January 200      Gupta et al.

其它文献：

1.Bonnet D，Dick JE：人急性髓性白血病按照起源于原始造血细胞的等级进行组织.Nat.Med.1997，3：730-737.

2.Blanpain C，Lowry WE，Geoghegan A，Polak L，Fuchs E：上皮干细胞niche中两个细胞群体的自我更新、多能性和存在.Cell 2004，118：635-648.

3.Cobaleda C，Gutierrez-Cianca N，Perez-Losada J，Flores T，Garcia-Sanz R，Gonzalez M，Sanchez-Garcia I：在人philadelphia阳性急性淋巴母细胞白血病中原始造血细胞是白血病转化的靶标.Blood 2000，95：1007-1013.

4.Jordan CT，Guzman ML，Noble M：肿瘤干细胞.N.Engl.J.Med.2006，355：1253-1261.

5.Hope KJ，Jin L，Dick JE：急性髓性白血病起源于分等级的具有不同自我更新能力的白血病干细胞类型.Nat.Immunol.2004，5：738-743.

6.Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，Murdoch B，Hoang T，Caceres-Cortes J，Minden M，Paterson B，Caligiuri MA，Dick JE：在移植入SCID小鼠中后引发人急性髓性白血病的细胞.Nature 1994，367：645-648.

7.Huntly BJ，Gilliland DG：来自过去的母细胞：从慢性髓细胞性白血病获得的干细胞生物学新启示.Cancer Cell 2004，6：199-201.

8.Deininger MW，Goldman JM，Melo JV：慢性髓性白血病的分子生物学.Blood 2000，96：3343-3356.

9.Graham SM，Jorgensen HG，Allan E，Pearson C，Alcorn MJ，Richmond L，Holyoake TL：来自慢性髓性白血病患者的原始的、静止的、Philadelphia阳性干细胞在体外对STI571不敏感.Blood 2002，99：319-325.

10.Guan Y，Hogge DE：来自急性髓细胞性白血病(AML)患者的原始造血祖先细胞的增殖状况.Leukemia 2000，14：2135-2141.

11.Guzman ML，Swiderski CF，Howard DS，Grimes BA，Rossi RM，Szilvassy SJ，Jordan CT：对原代人白血病干细胞的凋亡的优先诱导.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2002，99：16220-16225.

12.Guan Y，Gerhard B，Hogge DE：对来自急性髓性白血病(AML)患者的静止原始白血病祖先细胞的检测、分离和刺激.Blood 2003，101：3142-3149.

13.Lynas JF，Harriott P，Healy A，McKervey MA，Walker B：基于二和三肽基[α]-酮醛(乙二醛类)的蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制剂.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1998，8：373-378.

14.Xiao L，Wang K，Teng Y，Zhang J：自组织图结合成分平面展示用于微阵列数据分析.FEBS Lett.2003，538：117-124.

15.Bello RI，Gomez-Diaz C，Lopez-Lluch G，Forthoffer N，Cordoba-Pedregosa MC，Navas P，Villalba JM：双羟香豆素通过超氧化物依赖性机制解除HL-60细胞中血清撤回诱导的G0/1阻断.2005，69：1613-1625.

16.Sun SY，Li W，Yue P，Lippman SM，Hong WK，Lotan R：人癌症细胞中N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺诱导的细胞凋亡由不同机制介导.Cancer Res.1999，59：2493-2498.

17.Oridate N，Suzuki S，Higuchi M，Mitchell MF，Hong WK，LotanR：在宫颈癌细胞中活性氧参与N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺诱导的细胞凋亡.J.Natl.Cancer Inst.1997，89：1191-1198.

18.Jaiswal AK：Nrf2信号通路对抗氧化基因表达的协同激活.FreeRadic.Biol.Med.2004，36：1199-1207.

19.D′Autreaux B，Toledano MB：ROS作为信号分子：在ROS体内稳态中产生特异性的机制.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2007，8：813-824.

20.Hayashida N，Inouye S，Fujimoto M，Tanaka Y，Izu H，Takaki E，Ichikawa H，Rho J，Nakai A：一种被热休克蛋白抑制的、新的HSF1介导的死亡途径.EMBO J.2006，25：4773-4783.

21.Ahn SG，Thiele DJ：哺乳动物热休克因子1的氧化还原调节作用对Hsp基因活化和抵抗胁迫的保护作用是重要的.Genes Dev.2003，17：516-528.

22.Zheng PZ，Wang KK，Zhang QY，Huang QH，Du YZ，Zhang QH，Xiao DK，Shen SH，Imbeaud S，Eveno E，Zhao CJ，Chen YL，Fan HY，Waxman S，Auffray C，Jin G，Chen SJ，Chen Z，Zhang J：在视黄酸/三氧化二砷诱导的人早幼粒细胞白血病的细胞分化/细胞凋亡上对转录物组和蛋白质组的系统分析.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2005，102：7653-7658.

23.Murray JI，Whitfield ML，Trinklein ND，Myers RM，Brown PO，Botstein D：在培养的人细胞中对胁迫的多样和特异的基因表达反应.Mol.Biol.Cell 2004，15：2361-2374.

24.Meusser B，Hirsch C，Jarosch E，Sommer T：ERAD：实现破坏的长途.Nat.Cell Biol.2005，7：766-772.

25.Druker BJ，Guilhot F，O′Brien SG，Gathmann I，Kantariian H，Gattermann N，Deininger MW，Silver RT，Goldman JM，Stone RM，Cervantes F，Hochhaus A，Powell BL，Gabrilove JL，Rousselot P，ReiffersJ，Cornelissen JJ，Hughes T，Agis H，Fischer T，Verhoef G，Shepherd J，Saglio G，Gratwohl A，Nielsen JL，Radich JP，Simonsson B，Taylor K，Baccarani M，So C，Letvak L，Larson RA：对接受imatinib治疗慢性髓性白血病的患者的5年随访.N.Engl.J.Med.2006，355：2408-2417.

26.Shah NP，Nicoll JM，Nagar B，Gorre ME，Paquette RL，KuriyanJ，Sawyers CL：在慢性期和急变期慢性髓性白血病中多个BCR-ABL激酶结构域突变赋予对酪氨酸激酶抑制剂imatinib(STI571)的多克隆抗性.Cancer Cell 2002，2：117-125.

Claims (16)

1、芬维A胺或其活性衍生物在制备用于清除或杀灭受试者肿瘤干细胞或用于治疗和/或预防起源于肿瘤干细胞的肿瘤疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述起源于肿瘤干细胞的肿瘤疾病为其中清除或杀灭肿瘤干细胞有益于抑制肿瘤耐药性产生和复发的肿瘤疾病。

3.芬维A胺或其活性衍生物与至少一种其它抗肿瘤药的联合在制备同时、顺次或分别施用以诱导受试者肿瘤细胞调亡的药物中的用途。

4.药物组合物，其中包含治疗有效量的芬维A胺或其活性衍生物，治疗有效量的至少一种其它抗肿瘤药，以及任选的药学可接受的载体，所述至少一种其他抗肿瘤药与芬维A胺或其活性衍生物同时、顺次或分别施用以协同诱导受试者肿瘤细胞调亡。

5.一种体外筛选抗肿瘤药的方法，所述抗肿瘤药与所述芬维A胺或其活性衍生物联合以协同诱导肿瘤细胞凋亡，其包括以下步骤：

1)使肿瘤细胞与(a)有效量的芬维A胺或其活性衍生物和(b)待选的其它抗肿瘤药相接触，测定细胞的凋亡；

2)使肿瘤细胞与(a)有效量的芬维A胺或其活性衍生物相接触，测定细胞的凋亡；

3)使肿瘤细胞与(b)待选的其它抗肿瘤药相接触，测定细胞的凋亡；和

4)当步骤1)中所测凋亡的程度大于步骤2)和步骤3)中所测凋亡的总和，则判定所述待选的抗肿瘤药可以与所述芬维A胺或其活性衍生物联合协同诱导肿瘤细胞凋亡。

6.根据权利要求1-6的用途、组合物或方法，其中所述肿瘤包括造血系统肿瘤和实体瘤。

7、根据权利要求6的用途，其中所述造血系统肿瘤选自白血病和恶性淋巴增殖性障碍。

8、根据权利要求7的用途、组合物或方法，其中所述白血病选自急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病，且其中所述恶性淋巴增殖性障碍选自淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

9.根据权利要求8的用途、组合物或方法，其中所述淋巴瘤选自非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及小细胞和/或大细胞的滤泡淋巴瘤。

10.根据权利要求6的用途、组合物或方法，其中所述实体瘤选自胃癌、肺癌、卵巢癌和神经母细胞瘤。

11.根据权利要求3或4的用途或组合物，其中所述其它抗肿瘤药选自细胞周期特异性的化疗药物、BCR-ABL酪氨酸激酶靶向抑制剂、蛋白酶体抑制剂和不同于前三类的常规化疗药物。

12、根据权利要求11的用途或组合物，其中所述细胞周期特异性的化疗药物选自阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、羟基脲、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、甲氨蝶呤，优选阿糖胞苷。

13、根据权利要求11的用途或组合物，其中所述BCR-ABL酪氨酸激酶靶向抑制剂选自伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼，优选伊马替尼。

14、根据权利要求11的用途或组合物，其中所述蛋白酶体抑制剂选自bortezomib、BzLLLCOCHO和MG-132，优选bortezomib。

15、根据权利要求11的用途或组合物，其中所述常规化疗药物选自去甲氧柔红霉素、长春新碱、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春地辛、三尖杉酯碱、依托泊苷、替尼泊苷、左旋门冬酰胺酶，优选去甲氧柔红霉素。

16.根据前述权利要求之任一项的用途或组合物，其中所述芬维A胺的活性衍生物是4-氧代-芬维A胺。

Images