CN103830211A - 一种β-catenin蛋白抑制剂-姜黄素在肝癌治疗方面的应用 - Google Patents

Abstract

β-catenin蛋白是Wnt通路的重要组成部分，β-catenin蛋白的过度表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，本发明提供了一种化合物姜黄素是有效的Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，能够应用于舍有内源性激活的Wnt/β-catenin信号通路的癌症治疗药物的制备中。

Description

一种β-catenin蛋白抑制剂-姜黄素在肝癌治疗方面的应用

技术领域

本发明涉及一种信号传导系统抑制剂化合物在制备治疗肝癌药物方面的应用。 

背景技术

据WHO统计，全世界恶性肿瘤每年发病1100多万人，病死800多万人，发达国家肿瘤年发病率高于300/10万。WHO不久前在日内瓦发表最新《世界癌症报告》说，到2020年，全球癌症发病率可能此现在增长50％以上，新增肿瘤患者将达2000万人。肝癌是一种恶性程度高、浸润和转移性强且先天性耐药的癌症，严重危害人类健康。在男性肿瘤中，其发生率和死亡率分别位于第五位和第二位；在女性中，分别位于第七位和第六位。 

Wnt信号通路在调节胚胎发育过程中的肝脏细胞增殖及成人肝脏基本功能方面起着重要作用，但其异常激活会使β-catenin积聚入核、进而激活下游靶基因而导致肝癌的发生与发展。 

β-catenin蛋白的过度表达与肝癌的发生、发展及预后密切相关：β-catenin过度表达可出现于58.4％与HBV相关的HCC中，并和肿瘤大小、组织分化程度等因素有关。β-catenin基因(即CTNNB1)突变促进肝癌发生，此突变类型大部分是发生在外显子3的错义突变，且与 β-catenin的磷酸化及泛素化有关，发生在这个区域的突变将导致β-catenin稳定性增加进而积聚入核。肝细胞腺瘤的基因型-表型相关分析显示，只有12％的腺瘤发生β-catenin突变，但在由腺瘤进展来的HCC中β-catenin突变占到46％，这显示了β-catenin促进癌前病变进展到HCC。在转基因小鼠模型发生肝脏肿瘤实验中，β-catenin聚集在细胞核，并有c-myc及TGF-β过表达。 

当Wnt蛋白与其受体结合后，通过一系列胞质蛋白的相互作用使得β-catenin在胞质内累积进而入核与转录因子TCF/LEF共同作用激活下游靶基因的转录，如cyclinD1、c-myc、VEGF等，这些基因多数是参与细胞增生与凋亡的基因，这些基因的过度表达与肝癌的发生相关。因此阻断β-catenin信号通路的异常激活可能是治疗肝癌的一种新途径：以下我们将讨论近年来靶向攻击Wnt通路有成功希望的三个主要区域：(1)受体/配体相互作用：在特定肿瘤中，Wnt信号通路是通过自分泌机制而激活的。特定的肿瘤细胞系已经显示出表达高水平的特异Wnt蛋白，因此可以使用Wnt抑制剂如Dkks或sFRP来抗肿瘤细胞增殖。(2)细胞质中信号部件：Wnt通路最上游的细胞内部件是受体的胞内部分。LRP5/6的磷酸化在启动Wnt信号级联反应上起着关键性作用，Dvl家族蛋白在β-catenin降解复合体的破坏中起关键作用，CK1家族成员在Dvl的磷酸化及激活、LRP5/6及β-catenin的磷酸化中起正性作用，然而，其不同亚型在调节Wnt中起相反作用：CK1δ有助于LRP5/6 的磷酸化，CK1ε磷酸化Dvl，这都会激活Wnt通路；而CK1α则磷酸化β-catenin起抑制作用。因此，可适当选择CK1调节因子来调控Wnt信号通路。相似的是，GSK-3β在降解复合体中起着至关重要的作用，在Wnt信号极度活跃的环境下，能够加强GSK-3β活性的分子将有利于阻断Wnt通路而用于治疗。(3)细胞核信号部件：进入细胞核后，β-catenin与转录因子TCF/LEF家族成员相互作用来促使靶基因表达。与TCF/LEF相互作用并替代Groucho等阻遏物，同时招募各种活化剂例如CBP、p300、BCL9等。这些活化剂在驱使β-catenin介导的转录中起关键作用，并因此成为潜在的治疗靶标。ICG-001显示能选择性干扰β-catenin/TCF和CBP之间的相互作用。本发明使用小分子物质姜黄素能减少肝癌细胞中β-catenin蛋白的过度表达抑制下游基因cyclinD1、 

c-myc、VEGF。 

发明内容

β-catenin基因(即CTNNB1)突变促进肝癌发生，β-catenin在胞质内累积进而入核与转录因子TCF/LEF共同作用激活下游靶基因的转录，如cyclinD1、c-myc、VEGF等，这些基因多数是参与细胞增生与凋亡的基因，这些基因的过度表达促进了肝癌的发生。在这项专利申请的内容中，我们用一系列生物实验证明了姜黄素(一种β-catenin蛋白小分子抑制剂)能够显著抑制肝癌细胞BEL-7402、QGY-7703的生长。 

在体外实验中姜黄素能抑制肝癌细胞的生长，促进其凋亡，并呈剂量依赖性。姜黄素能降低胞质蛋白β-catenin的水平。PCR法显示姜黄素能减少下游靶基因c-myc、VEGF、cyclinD1的表达。因此我们认为EGCG是一种治疗肝癌的新方法。 

本发明主要解决的技术问题是提供了一种β-catenin信号传导系统抑制剂化合物在制备治疗肝癌药物方面的应用。 

附图说明

图1为姜黄素的分子式。 

图2为上述实施例1的结果：经不同浓度的姜黄素处理48h后，BEL-7402、QGY-7703细胞生长受到不同程度的抑制，随药物浓度的增大，抑制率逐渐增高，呈现剂量依赖性关系。工作浓度为5、10、20、40、80μmol/L的姜黄素处理BEL-7402、QGY-7703细胞48h后的抑制率分别为6.7％±3.3％、15.1％±2.7％、35.5％±5.9％、57.2％±3.1％、85.2％±4.3％和8.3％±1.5％、14.5％±1.9％、35.4％±2.5％、55.8％±4.5％、89.3％±2.2％。 

图3为上述实施例2的结果：BEL-7402细胞在培养瓶中贴壁生长，呈多角形，在姜黄素作用下，它们生长速度减慢，形态发生改变，部分细胞变圆，脱壁。用10、20、40、80μmol/L姜黄素处理作用48h后，其凋亡率分别为8.2％、11.8％、14.9％、39.2％、58.4％和8.6％、15.7％、 17.9％、28.8％、50.3％，呈现浓度依赖性。 

图4为上述实施例2的结果：QGY-7703细胞在培养瓶中贴壁生长，呈多角形，在姜黄素作用下，它们生长速度减慢，形态发生改变，部分细胞变圆，脱壁。用10、20、40、80μmol/L姜黄素处理作用48h后，其凋亡率分别为8.2％、11.8％、14.9％、39.2％、58.4％和8.6％、15.7％、17.9％、28.8％、50.3％，呈现浓度依赖性。 

图5为上述实施例3的结果：经不同浓度的姜黄素处理48h后，BEL-7402、QGY-7703细胞中β-catenin蛋白的表达受到不同程度的抑制，随药物浓度的增大，表达量逐渐减少，呈现剂量依赖性关系。工作浓度为10、20、40、80μmol/L的姜黄素处理BEL-7402、QGY-7703细胞48h后β-catenin蛋白的表达量。 

图6为上述实施例4的结果：经不同浓度的姜黄素处理48h后，BEL-7402、QGY-7703细胞中c-myc、VEGF、cyclinD1基因的表达受到不同程度的抑制，随药物浓度的增大，表达量逐渐减少，呈现剂量依赖性关系。工作浓度为10、20、40、80μmol/L的姜黄素处理BEL-7402、QGY-7703细胞48h后c-myc、VEGF、cyclinD1基因的表达量。 

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。 

实施例1：MTT法测定姜黄素对BEL-7402、QGY-7703细胞增殖的 影响：设对照组和加用姜黄素组(5、10、20、40、80μmol/L姜黄素)，取对数生长期细胞，常规胰酶消化后用含10％胎牛血清RPMI1640培养液制成单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100μL(含约5＊103个细胞)，待细胞贴壁后去培养液并加药，每组设4个复孔，另设4个调零孔(不加细胞，只加100μL培养液)，继续培养48h。吸掉培养基并用PBS100μL洗2遍，然后每孔加入含MTT10μL的培养液100ul，4h后终止培养，弃上清液，每孔加入150μL的溶解液，置水平摇床上震荡10min，在酶标仪(Tecan F200)上测490nm波长的吸光度(OD)值。结果见附图2 

实施例2：流式细胞仪检测姜黄素诱导BEL-7402、QGY-7703细胞凋亡：取对数生长期细胞，常规胰酶消化后用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液制成单细胞悬液，计数后种于六孔板中，每孔约含2＊10⁵个细胞，待细胞贴壁后去培养液并加药，分别加入2mL含有0、10、20、40、80μmol/L姜黄素的培养液，培养48h后，用不含EDTA的胰酶消化离心收集细胞，用冷的PBS洗涤细胞两次。然后用400μL1×Annexin V结合液悬浮细胞，在细胞悬液中加入5μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后避光孵育15min，后加入10μL PI染色液避光孵育5min，在1h内用流式细胞仪(Accuri C6)检测。姜黄素诱导BEL-7402 细胞凋亡结果见附图3姜黄素诱导QGY-7703细胞凋亡结果见附图4。 

实施例3：Western blot分析：BEL-7402、QGY-7703分别接种于六孔培养板中(约2×105/孔)，姜黄素处理48小时后提取蛋白并使用BCA试剂盒蛋白定量。制胶加样品和mark液后通电：70V，40min，后改为110V，1小时。转移蛋白质到PVDF膜，按要求浸泡膜后由下至上逐张叠放、精准对齐：3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸。插入电极，打开电泳仪开关调至100V，65min，封闭1h。洗涤后加入一抗β-catenin4℃过夜后加入二抗孵育1h。最后使用ECL发光试剂盒，目标蛋白在暗室中显影。结果见附图5。 

实施例4：RT-PCR分析：Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，重复测定3次，计算A260nm/A280nm，比值在1.8～2.0的RNA标本用于反转录。琼脂糖凝胶电泳检测样品的完整性，总RNA按说明书进行逆转录反应合成cDNA，逆转录产物cDNA用于RT PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3min，进入循环扩增阶段：94℃30s55℃30s72℃1min，30个循环，最后在72℃保存5min，结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测。2％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物cDNA条带与β-actin内参条带的吸光度值的比值作为mRNA的相对表达。结果见附图6。 

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或 直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。 

Claims (1)

1.Wnt/β-catenin信号通路系统抑制剂化合物-姜黄素在制备治疗肝癌药物方面的应用，姜黄素的分子式见图1。 

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