KR20000016430A - 종양항원단백질, 그의 유전자 및 종양항원펩티드 - Google Patents

Abstract

서열번호 : 1 의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 그 아미노산서열 중 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실 또는 부가된 변이 단백질을 코드하는 DNA (단, 이 단백질 및 변이 단백질은 그 세포내 분해에 의해, 주요조직 적합유전자 복합체 (MHC) 클래스 I 항원과 결합할 수 있는 펩티드단편으로, 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 발생할 수 있는 것임), 이 DNA를 유효성분으로 함유하는 의약, 이 DNA를 갖는 발현플라스미드, 이 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 DNA를 발현하여 생산되는 종양항원단백질 및 종양항원펩티드.

Description

종양항원단백질, 그의 유전자 및 종양항원펩티드

생체에 의한 종양의 배제에는 면역계, 특히 T 세포가 중요한 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다. 실제로, 인체의 종양국소에는 종양세포에 대하여 상해활성을 나타내는 임파구의 침윤을 볼 수 있고 (Arch. Surg.,126:200-205, 1990), 흑색종(melanoma)로부터는 자기의 종양세포를 인식하는 세포상해성 T 세포 (CTL) 가 비교적 용이하게 분리되어 있다 (Immunol.Today,8:385,1987,J.Immunol.138:989, 1987, Int.J.Cancer,52:52-59,1992 등). 또, T 세포 이식에 의한 흑색종 치료의 임상결과도 종양배제에서의 T 세포의 중요성을 시사하고 있다 (J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994).

자기의 종양세포를 공격하는 CTL 이 표적으로 하는 분자에 대해서는 오랜동안 불명확하였는데, 최근의 면역학 및 분자생물학의 진보로 점점 명확해졌다. 즉, CTL 은, T 세포수용체 (TCR)을 이용하여, 종양항원펩티드가 주요조직 적합 유전자복합체 (MHC) 클래스 I 항원에 결합한 복합체를 인식하여 자기의 종양세포를 공격하고 있는 것이 명확해졌다.

이러한 종양항원펩티드는 종양항원단백질이 세포내에서 합성된 후, 프로테오솜에 의해 세포질내에서 펩티드로 분해됨으로써 생성된다. 한편, 소포체로 형성된 MHC 클래스 I 항원은, 상기의 종양항원펩티드를 결합하고, 시스골디를 거쳐 성숙측의 트랜스골디로 이동하여 세포표면에 발현한다 (임상면역,27(9):1304-1042, 1995).

이와 같은 종양항원단백질로서는, 1991 년에 T.Boon 들이 처음으로 MAGE 라고 명명한 단백질을 인체 흑색종 세포로부터 확인하고 (Science,254:1643-1647, 1991), 또 그 후, 약간의 종양항원단백질이 다시 흑색종 세포로부터 확인하였다.

지금까지 확인된 종양항원단백질은, T.Boon 등의 총설 (J.Exp.Med,183,725∼729,1996) 에 기술되어 있는 바와 같이, 이하의 4 개의 카테고리로 나눌 수 있다.

첫 번째의 카테고리에 함유되는 종양항원단백질은, 정상조직에서는 정소에서만 발현되고 있고, 종양조직에서는 흑색종, 두경부암, 비소세포성폐암, 방광암 등에 발현되는 일군의 단백질이다. 이 카테고리의 종양항원단백질로서는, 상기의 MAGE, 그 12 종류 이상의 유사한 패밀리를 형성하는 단백질군 (J.Exp.Med.,178:489-495,1993), BAGE (Immunity,2:167-175, 1995) 및 GAGE (J.Exp.MED.,182:689-698, 1995) 가 있고, 모두 흑색종 세포로부터 확인되었다.

그러나, 이 카테고리의 종양항원단백질은, 흑색종에서는 고발현되어 있는 것도 있지만, 그 이외 종류의 종양에서는 그 종양환자 중 10 %부터 30 % 정도로밖에 발현되어 있지 않아, 여러 가지 종양의 치료나 진단에 넓게 응용할 수는 없다.

두 번째의 카테고리에 함유되는 종양항원단백질은, 정상조직에서는 멜라노사이트, 망막에서만 발현되어 있고, 종양조직에서는 흑색종에서만 발현을 볼 수 있는 일군의 단백질이다. 이들의 조직 특이적인 단백질은 종양세포의 흑색종에 심하게 발현되어 있기 때문에, 흑색종에 특이적인 종양항원단백질로서 기능하고 있다. 이 카테고리의 종양항원단백질로서는, 티로시나제 (J.Exp.Med.,178:489-495,1993), MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515,1994), gp100 (J.Exp.Med.,179:1005-1009, 1994), gp75 (J.Exp.Med.,181:799-804, 1995) 가 있고, 이들의 유전자는 모두 흑색종 세포로부터 클로닝되어 있다. 또, 별도 Melan-A (J.Exp.Med.,180:35,1994) 가 확인되었는데, MART-1 과 동일한 분자이었다.

그러나, 이 카테고리의 종양항원단백질은, 흑색종 이외의 종양에서는 발현되어 있지 않기 때문에, 널리 종양의 치료나 진단에 응용할 수 없다.

세 번째의 카테고리에 함유되는 종양항원단백질은, 종양 특이적인 돌연변이에 의해 새로운 CTL 에 인식되는 종양항원펩티드가 발생하게 되는 일군의 단백질이다. 이 카테고리의 종양항원단백질로서는, 돌연변이된 CDK4 (Science,2691281-1284, 1995), β-카테닌(β-catenin) (J.Exp.Med.,183:1185-1192,1996), MUM-1 (Proc.Natl.Acad.Sci,USA,92:7976-7980,1995) 가 있다. CDK4, β-카테닌에서는, 하나의 아미노산 변이에 의해, 펩티드의 MHC 클래스 I 항원 결합 친화성이 증가되어, T 세포에 인식되게 된다. MUM-1 에서는, 돌연변이에 의해, 통상적으로 번역되지 않은 인트론부위가 번역됨으로써 발생하는 펩티드가 T 세포에 인식되어 있다. 그러나, 이들의 돌연변이의 빈도는 낮기 때문에, 넓게 종양의 치료나 진단에 응용할 수 없다.

네 번째의 카테고리에 함유되는 종양항원단백질은, 정상세포에도 광범하게 발현되고 있는데, CTL 에 인식되는 단백질인 P15 (J.Immunol,154:5944-5955, 1995) 가 흑색종 세포로부터 확인되었다.

지금까지 알려져 있는 종양항원단백질 또는 종양항원펩티드는 이하와 같이 확인되었다.

먼저, 이들을 확인할 때에, 종양세포 및 이 세포를 공격하는 CTL (통상, 종양세포와 동일한 환자의 임파구에서 수립되는) 의 세트를 준비한다. 이어서, 이 세트의 세포를 이용하여 종양항원펩티드를 직접 확인하거나, 또는 종양항원단백질을 코드하는 유전자를 결정하여 다시 그 대응하는 종양항원펩티드를 확인함으로써 행하여진다.

즉, 종양항원펩티드를 직접 확인하는 방법으로서는, 종양 세포의 MHC 클래스 1 항원에 결합되어 있는 종양항원펩티드를 산성 조건하에서 추출하여, 고속 액체 크로마토그래피로 분리된 여러 가지의 펩티드를, MHC 클래스 I 항원을 발현하고 있으나, 종양항원단백질은 발현하고 있지않은 세포 (예를 들면, 동일환자의 B 세포 등) 에 펄스하여, CTL 의 반응을 조사함으로써 종양항원펩티드를 확인하고, 다시 질량 분석법 등을 이용하여 서열을 결정하는 방법이다. 이 방법에 의해, 흑색종 세포로부터 gp100 과 동일분자의 Pme117 유래의 종양항원펩티드가 확인하였다 (Science,264:716-719, 1994).

또, 종양항원단백질을 코드하는 유전자를 결정하여 다시 이 대응하는 종양항원펩티드를 확인하는 방법으로서는, 분자생물학적 수법을 이용하여 종양항원단백질을 코드하는 유전자를 클로닝하는 방법이 있다. 종양세포로부터의 cDNA를 조제하여, 그 cDNA를 종양항원단백질을 발현하고 있지않은 세포 (예를 들면 COS 세포 등) 에 MHC 클래스 I 항원 유전자와 함께 트랜스펙트하여 일시적으로 발현시키고, 이에 대하는 CTL 의 반응성에 의한 스크리닝을 반복하여 행하여, 종양항원단백질을 코드하는 유전자를 단리한다. 이 방법에 의해, 상기의 MAGE, 티로시나제, MART-1, gp100, gp75 의 유전자가 클로닝되었다.

이 종양 항원 유전자의 정보에서 실제로 MHC 클래스 I 항원에 결합하여 제시되어 있는 종양항원펩티드를 추정, 확인하기 위해 다음과 같은 방법을 이용한다. 먼저, PCR, 엑소뉴클레아제, 제한효소 등에 의해 여러 가지 크기의 종양항원단백질을 코드하는 유전자의 단편을 제작하여, MHC 클래스 I 항원 유전자와 함께 종양항원단백질을 발현하고 있지 않은 세포 (예를 들면 COS 세포 등) 에 트랜스펙트하여 일시적으로 발현시켜, CTL 의 반응성에 의해 종양항원펩티드를 함유하는 영역을 한정한다. 그 후, 펩티드를 합성하고, MHC 클래스 I 항원은 발현하여 종양항원단백질을 발현하고 있지않은 세포에 펄스하여, CTL 의 반응을 조사하는 등에 의해 종양항원펩티드를 확인한다 (J.Exp.Med.,176:1453, 1992, J.Exp.Med.,179:24,759,1994). 또, HLA-A1, -A0201, -A0205, -A11, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602 등의 MHC 의 형에 대해서는, 결합하여 제시되는 펩티드의 서열의 규칙성 (모티브) 이 판명되고 있고 (Immunogenetics,41:178-228, 1995), 이를 참고로 하여 종양항원펩티드의 후보를 조사하여, 그 펩티드를 합성하여 상기와 동일한 방법으로 확인하는 방법도 이용된다 (Eur.J.Immunol.,24:759,1994, J.Exp.Med.,180:347,1994).

또, 종양에서 고발현되고 있는 종양항원단백질은, 한편으로, 정상조직에도 발현되어, 이 종양항원단백질에서 유래하는 면역반응이 과잉으로 일어남으로써, 자기면역질환을 일으키고 있는 것으로도 생각되고 있다. 예를 들면, 화학요법제와 IL-2를 병용하여 흑색종의 치료를 행한 경우, 백반증상의 출현을 볼 수 있다는 보고 (J.Clin.Oncol.,10:1338-1343, 1992) 가 있다. 이것은, 흑색종에 발현하는 종양항원단백질의 단편 (펩티드단편이라 함) 과 MHC 클래스 I 항원의 복합체에 대하여 CTL 또는 항체가 유도, 생산되어, 정상조직인 피부조직에 작용하는 것으로 자기면역질환과 같은 증상인 백반증상이 출현했기 때문으로 생각된다.

본 발명은 항종양면역을 활성화시키기 위한 의약, 자기면역질환을 치료하기 위한 의약, 및 종양 또는 자기면역질환의 진단에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 신규한 종양항원단백질, 그의 신규한 유전자, 신규한 종양항원펩티드 등에 관한 것이다.

도 1 은 실시예 2 의 노던 블로트 혼성화의 결과를 나타낸 전기영동의 사진이다.

도 1 의 a) 중 KE-4, KE-3, TE-8 및 TE-9 는 식도암 세포주를, Kuma-1은 두경부암세포주를, HSC-4 는 구강암세포주를, Bec-1 은 B 세포주를, KMG-A 는 담낭암세포주를, R-27 은 유암세포주를, KIM-1, KYN-1 및 HAK-3 은 간암세포주를, 그리고 M36 및 M37 은 흑색종 세포주를, 각각 나타낸다.

상기와 같이 기지의 종양항원단백질은 모두, 한정된 종양에서밖에 발현되고 있지 않거나, 또는 많은 종류의 종양에서 발현되어 있어도 그 종양환자중의 소수에밖에 발현되고 있지 않기 때문에, 여러 가지 종양의 치료나 진단에 폭넓게 응용할 수 있는 것은 아니다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 기지의 종양항원단백질 또는 그 단편 (이하, 펩티드단편 또는 종양항원펩티드라 함)을 이용하여 실시할 수 있는 종양의 치료나 진단과 다르게, 편평상피암 등을 포함하는 폭넓은 종양에 응용할 수 있는 것, 또는 응용가능한 종양이 한정되어 있어도 그 종양환자중 많은 사람에게 응용할 수 있는 것, 또는 그 종양의 치료나 진단을 보완하면서 각종 종양에 응용할 수 있는 종양항원단백질 또는 그 대응하는 종양항원펩티드 등을 제공하는 것에 있다.

또한, 편평상피암은, 인체의 암에서 가장 많이 볼 수 있는 암의 하나이다. 특히, 식도암이나 폐암에서의 편평상피암은 현재의 화학요법이나 방사선요법에 비교적 저항성을 나타내는 것이 알려져 있다. 그 점에서도 종양항원단백질 또는 그 대응하는 종양항원펩티드 등을 이용한 특이적 면역요법의 개발이 기대되고 있다.

또, 종양항원단백질에서 유래하는 특이적 면역이 과잉으로 야기되어 자기면역질환이 발증한 경우에는, 종양항원단백질을 코드하는 유전자의 발현을 방해하는 안티센스 DNA·RNA 나 종양항원펩티드의 안타고니스트 등을 이용하여, 면역반응을 특이적으로 차단하는 치료법이 기대된다.

본 발명자들은, 각종 종양, 특히 편평상피암 등의 치료나 진단에 폭넓게 응용할 수 있는 종양항원단백질 또는 이에 대응하는 종양항원펩티드 등을 얻기 위해, 흑색종 이외의 종양으로 부터의 종양항원단백질의 확인을 시도하였다.

즉, 본 발명자 들은 식도암 유래의 편평상피암 세포주 KE-4 (이하, 식도암 세포주 KE-4, 또는 단순히 KE-4 라 함) 를 수립하여, 또 이 KE-4에서 발현하는 MHC 클래스 I 항원인 HLA-A2601 에 구속성의 종양항원펩티드를 인식하는 CTL (이하, KE-4CTL 이라 함)을 수립하였다 (Cancer.Res.,55:4248-4253, 1995).

계속하여, 선유아 (線維牙)세포주 VA-13 세포에, KE-4 로 제작한 cDNA 유전자총합체의 재조합 플라스미드와 HLA-A2601cDNA 의 재조합 플라스미드를 동시에 트랜스펙트하여, 그 트랜스펙턴트에 KE-4CTL을 작용시켜, KE-4CTL 이 활성화되었는지를 IFN-γ 의 생산량으로 측정하여 스크리닝하였다. 그 결과, 흑색종 이외의 종양세포에서 처음으로, 본 발명의 종양항원단백질을 코드하는 신규인 유전자를 클로닝하는 것에 성공하였다.

즉, 본 발명의 요지는,

(1) 서열번호 : 1 의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 그 아미노산서열 중 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실 또는 부가된 변이 단백질을 코드하는 DNA (단, 이 단백질 및 변이 단백질은 그 세포내 분해에 의해, MHC 클래스 I 항원과 결합할 수 있는 펩티드단편으로, 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 발생할 수 있는 것임),

(2) 서열번호 : 2 의 염기서열로 이루어지는 DNA, 또는 그 DNA 와 엄중한 조건하에서 혼성화하는 DNA 변이체 (단, 이 DNA 및 DNA 변이체가 발현되어 생산되는 단백질은, 그 세포내 분해에 의해, MHC 클래스 I 항원과 결합될 수 있는 펩티드단편으로 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 발생할 수 있는 것임),

(3) 상기 (1) 또는 (2) 기재의 DNA를 유효성분으로 함유하는 의약,

(4) 상기 (1) 또는 (2) 기재의 DNA를 갖는 발현 플라스미드,

(5) 상기 (4) 기재의 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체,

(6) 상기 (1) 또는 (2) 기재의 DNA를 발현하여 생산되는 종양항원단백질,

(7) 상기 (6) 기재의 단백질의 일부로 이루어지는 펩티드로, MHC 클래스 I 항원과 결합하여 T 세포에 의해 인식될 수 있는 종양항원펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 그 유도체,

(8) 서열번호 : 1 의 아미노산서열의 제 749 번 ∼ 제 757 번, 제 736 번 ∼ 제 744 번, 제 785 번 ∼ 제 793 번, 또는 제 690 번 ∼ 제 698 번의 아미노산서열의 전부 또는 일부를 갖는 펩티드인, 상기 (7) 기재의 종양항원펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 그 유도체,

(9) 상기 (6) 기재의 종양항원단백질, 상기 (7) 또는 (8) 기재의 종양항원펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 의약,

(10) 상기 (6) 기재의 종양항원단백질, 또는 상기 (7) 또는 (8) 기재의 종양항원펩티드에 특이적으로 결합하는 항체,

(11) 서열번호 : 2 의 염기서열로 이루어지는 DNA 의 코딩서열 또는 5' 비코딩서열 중의 DNA 단편과 상보적인 서열을 갖는 8 염기 이상으로 이루어지는 DNA 또는 그 DNA 에 대응하는 RNA, 또는 이들의 화학적 수식체에 관한 것이다.

본 발명의 DNA 는, 신규인 종양항원단백질을 코드하는 것으로, 서열번호 : 1 의 아미노산서열을 갖는 단백질, 또는 그 아미노산서열 중 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환, 결실 또는 부가된 변이단백질을 코드하는 DNA (단, 이 단백질 및 변이단백질은 그 세포내분해에 의해, MHC 클래스 I 항원과 결합할 수 있는 펩티드단편으로, 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 발생할 수 있는 것임), 또는 서열번호 : 2 의 염기서열로 이루어지는 DNA, 또는 그 DNA 와 엄중한 조건하에서 혼성화하는 DNA 변이체 (단, 이 DNA 및 DNA 변이체가 발현하여 생산되는 단백질은, 그 세포내분해에 의해, MHC 클래스 I 항원과 결합할 수 있는 펩티드단편으로, 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 발생시킬 수 있는 것임) 가 예시된다.

본 명세서에서, "아미노산서열 중 1 또는 복수의 아미노산잔기가 치환 또는 부가된 변이단백질" 이란, 인위적으로 제작한 소위 개변단백질이나, 단백질을 코드하는 DNA 에 일반적으로 보이는 다형, 변이나 수식반응 등에 의해 얻어지는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 단백질을 의미하고, 이 변이 단백질을 코드하는 DNA 는, 예를 들면, Molecular Cloning:A Laboratory Manual 제 2 판 제 1 - 3 권 Sambrook, J. 등 편저, Cold Spring Harber Labolatoru Press 출판 New York 1989년에 기재의 방법, 예를 들면 부위특이적변이유발이나 PCR 법 등으로 제조할 수 있다. 또한, 여기에서 치환, 결실 또는 부가되는 아미노산잔기의 수는, 상기의 부위특이적 변이유발 등의 공지된 방법에 의해 치환, 결실 또는 부가할 수 있는 정도의 수를 가르킨다.

본 명세서에서, "DNA 와 엄중한 조건하에서 혼성화하는 DNA 변이체" 란, 예를 들면 상술의 Molecular Cloning 에 기재된 방법으로 얻을 수 있다. 여기에서 "엄중한 조건" 이란, 예를 들면, 6×SSC (20×SSC는, 333 mM 시트르산 나트륨, 333mM NaCl을 나타냄), 0.5% SDS 및 50% 포름아미드를 함유하는 용액중에서 42 ℃ 로 혼성화시킨 후, 0.1 ×SSC, 0.5% SDS 의 용액중에서 68 ℃ 로 세정하는 조건, 또는, 문헌[나가야마 외 편저, 바이오실험 일러스트레이티드 ② 유전자해석의 기초, p.148-151, 슈쥰샤, 1995년] 에 기재된 조건 등을 가르킨다. 본 명세서에서는, 이와 같은 혼성화하는 DNA 가 발현되어 생산되는 단백질은, 이 단백질을 구성하는 일부의 펩티드 단편이 MHC 클래스 I 항원과 결합하여 T 세포에 의해 인식되는 펩티드 부분을 함유한다.

본 명세서에서, "세포내 분해에 의해, MHC 클래스 I 항원과 결합될 수 있는 펩티드단편으로, 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 발생시킬 수 있는 단백질 및 변이 단백질" (이하, 이들의 단백질을 종양항원단백질이라 하는 경우가 있음) 이란, 이 단백질 또는 변이 단백질의 일부의 아미노산서열로 이루어지는 부분 펩티드가 MHC 클래스 I 항원과 결합가능하고, MHC 클래스 I 항원과 결합하여 세포표면에 제시된 경우, 이 펩티드단편과 MHC 클래스 I 항원의 복합체에 대하여, 특이적으로 결합가능한 T 세포가 결합하여 T 세포에 시그날을 전달할 수 있다. 이와 같은 펩티드부분을 함유하는 단백질 또는 변이 단백질을 의미한다. 또한, 여기에서 말하는 결합이란 비공유결합을 의미한다.

펩티드단편이 MHC 클래스 I 항원에 결합하여 T 세포에 인식되는 것을 확인하는 방법으로서는, 예를 들면, 펩티드단편을 적당한 세포에 내인성이 발현시키거나, 또는 외부로부터 가함으로써 (펄스하는) MHC 클래스 I 항원에 결합시킴으로써 세포표면에 펩티드단편을 제시시키고, 이어서, 이 팹티드제시 세포에 대하여 종양항원단백질 특이적인 T 세포를 작용시켜, 이 T 세포가 산출하는 사이트카인을 측정하는 방법 등이 있다. 또, 펩티드 제시 세포에 대한 T 세포의 상해활성을 측정하는 방법으로,⁵¹Cr 로 표식한 펩티드 제시세포를 이용하는 방법 (Int.J.Cancer,58:317(1994)) 도 사용할 수 있다. 여기에서, 인식하는 T 세포로서는, CTL을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 DNA 는 의약의 유효성분으로 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 DNA를 유효성분으로 함유하는 "의약" 은, 예를 들면, 본 발명의 DNA를 종양환자 등에게 투여함으로써 종양을 치료 또는 예방할 수 있다. 본 발명의 DNA를 투여하면 세포내에서 종양항원단백질이 고발현되고, 종양항원펩티드가 MHC 클래스 I 항원과 결합하여, 세포표면에 고밀도로 제시됨으로써, 종양 특이적 CTL 이 체내에서 효율적으로 증식하게 되어, 이로써, 종양의 치료 또는 예방이 달성된다. 본 발명의 DNA를 투여하여 세포내에 도입하는 방법으로서는, 바이러스벡터에 의한 방법 및 그 외의 방법 (닛케이사이언스, 1994년 4월호, 20-45면, 월간약사,36(1), 23-48(1994), 실험의학증간,12(15), (1994) 및 이들의 인용문헌 등) 의 어느 방법도 적용할 수 있다.

바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 예를 들면 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련바이러스, 헤르페스바이러스, 왁시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 본 발명의 DNA를 혼합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중에서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 왁시니아바이러스 등을 이용한 방법이 특히 바람직하다.

그 외의 방법으로서는, 발현 플라스미드를 직접 근육내에 투여하는 방법 (DNA 왁친법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 엘렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 왁친법, 리포솜법이 바람직하다.

본 발명의 DNA를 실제로 의약으로 작용시키기 위해서는, DNA를 직접 체내에 도입하는 in vivo 법, 및 인체로부터 어떤 종류의 세포를 채집하여 체외에서 DNA를 이 세포에 도입하여 그 세포를 체내로 되돌리는 ex vivo 법이 있다 (닛케이 사이언스, 1994년 4월호, 20-45 면, 월간약사,36(1), 23-48(1994), 실험의학증간,12(15), (1994), 및 이들의 인용문헌 등). in vivo 법이 보다 바람직하다.

in vivo 법으로 투여하는 경우에는, 치료목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육내 등에 투여할 수 있다. in vivo 법으로 투여하는 경우에는, 예를 들면, 액제 등의 제제형태를 취할 수 있는데, 일반적으로는 유효성분인 본 발명의 DNA 를 함유하는 주사제 등으로 되고, 필요에 따라, 관용의 담체를 더하여도 된다. 또, 본 발명의 DNA를 함유하는 리포솜 또는 막융합 리포솜 (센다이바이러스(HVI)-리포솜 등) 에서는, 현탁제, 동결제, 원심분리농축 동결제 등의 리포솜제제의 형태로 할 수 있다.

제제 중의 본 발명의 DNA 의 함량은, 치료목적의 질환, 환자의 년령, 체중 등에 의해 적당히 조정할 수 있는데, 통상, 0.0001 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 0.001 ㎎ ∼ 10 ㎎ 의 본 발명의 DNA를, 몇일 내지 몇 개월에 1 회 투여하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 DNA를 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해, 종양항원단백질을 대량으로 제조하는 것이 가능하다.

본 발명의 DNA를 발현하여 종양항원단백질을 생산하기 위해서는, 예를 들면, 상술의 Molecular Cloning 등의 많은 서적이나 문헌에 근거하여 실시할 수 있다. 발현시킨 DNA 의 상류에, 전사를 제어하는 프로모터 서열 (예를 들면, trp,lac,T7, SV40 초기 프로모터) 등의 제어유전자를 부가하여, 적당한 벡터 (예를 들면 pSV-SPORT1 등) 에 혼합함으로서, 숙주세포내에서 복제하여, 기능하는 발현 플라스미드를 제작한다. 다음에 발현 플라스미드를 적당한 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 얻는다. 숙주세포로서는, 대장균 등의 원핵생물, 효모와 같은 단세포진핵생물, 곤충, 동물 등의 다세포 진핵생물의 세포 등을 들 수 있다. 또, 숙주세포로의 유전자 도입으로서는, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 전기펄스법 등이 있다. 형질전환체는, 적당한 배지에서 배양함으로써 목적으로 하는 단백질을 생산한다. 이상과 같이 하여 얻어진 종양항원단백질은 일반적인 화학적 방법으로 단리정제할 수 있다.

본 명세서에서, 본 발명의 종양항원단백질의 세포내분해에 의해 발생할 수 있는, "MHC 클래스 I 항원과 결합할 수 있는 펩티드단편으로 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편", 즉 "종양항원펩티드" 는, 예를 들면 이하와 같이 하여 결정할 수 있다.

먼저, PCR, 엑소뉴클레아제, 제한효소 등에 의해 여러 가지 크기의 종양항원단백질을 코드하는 DNA 의 단편을 제작한 후, 상술한 바와 같이 발현 벡터에 삽입하여, 종양 항원을 제시하는 MHC 클래스 I 항원을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드와 함께 종양항원단백질을 발현하고 있지 않은 (예를 들면 COS 세포 등) 에 트랜스펙트하여 일시적으로 발현시키고, CTL 의 반응성에 의해 종양항원펩티드를 함유하는 영역을 한정한다. 그 후, 그 영역내의 여러 가지의 펩티드를 합성하여, 종양 항원을 제시하는 MHC 클래스 I 항원은 발현하는데 종양항원단백질을 발현하고 있지 않은 세포에 펄스하여, CTL 의 반응을 조사하는 것 등으로 종양항원펩티드를 고정한다 (J.Exp.Med.,176:1453, 1992, J.Exp.Med.,179(24)759, 1994).

또, HLA-A1, -A0201, -A0205, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602 등의 MHC 의 형태에 대해서는, 결합하여 제시되는 항원 펩티드의 서열의 규칙성 (모티브) 이 판명되어 있고, 이것을 참고로 하여 종양항원단백질을 코드하는 DNA 로부터 종양항원펩티드의 후보를 조사하여, 그 펩티드를 합성하여 상기와 동일한 방법으로 확인하는 방법도 이용된다 (Eur.J.Immunol.,24:759, 1994, J.Exp.Med.,180:347, 1994).

그러나, MHC 에는 클래스 I 항원 이외에 클래스 Ⅱ 항원도 존재하는 것, 및 종양항원단백질이 마크로퍼지 등의 항원 제시 세포에 넣어져 분해됨으로써 발생할 수 있는 특정의 종양항원펩티드와 이 MHC 클래스 Ⅱ 항원과의 결합체는, 종양 특이적인 헬퍼 T 세포를 활성화하는 것이 알려져 있다 (J. Immunol.,146:1708-1704, 1991).

본 발명의 신규인 종양항원단백질 유전자의 클로닝의 성공에 따라, 상기와 같이 MHC 클래스 Ⅱ 항원과 결합하는 종양항원펩티드에 대해서도 결정할 수 있다. 구체적으로는, MHC 클래스 Ⅰ 항원의 경우와 동일하게, T 세포와의 반응성에 근거하는 항원 펩티드의 결정법, 또는 항원 펩티드의 모티브에 관한 공지된 지견 등에 근거하여 결정하는 것이 가능하다.

이와 같이 하여 결정되는 종양항원펩티드는, 통상의 펩티드화학에서 알려져 있는 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, ["Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1996, "The Proteins", Vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976, "펩티드합성" 마루젠(주), 1975, "펩티드합성의 기초와 실험" 마루젠(주), 1985] 등에 기재되어 있는 방법 등을 들 수 있다. 즉, C 말단부위의 구조에 의해 액상법, 고상법의 어느 하나를 선택하여 합성할 수 있고, 그 중에서도, 액상법이 보다 바람직하다. 즉, 아미노산의 관능기를 적당한 보호기로 적당히 보호 및 탈보호를 행하여, 아미노산을 한 개의 잔기 또는 수개의 잔기씩 결합시킴으로써 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 아미노산의 관능기의 보호기에 대해서는, 예를 들면 상술의 펩티드화학에 대하여 기재하는 서적 등에 기재되어 있다.

본 명세서에서, 종양항원펩티드란, 서열번호 : 1 로 나타나는 아미노산서열을 갖는 단백질, 또는 이미 정의한 그 변이단백질의 어느것에서나 얻어지는 펩티드단편으로 정의할 수 있다. 이하, 서열번호 : 1 의 아미노산서열로 나타나는 단백질 유래의 종양항원펩티드 및 그 유도체에 대하여 보다 구체적으로 설명하는데, 이 설명은 변이 단백질유래의 종양항원펩티드에도 적용할 수 있는 것임은 알 수 있을 것이다.

서열번호 : 1 로 나타나는 단백질의 세포냐 분해에 의해 얻어지는 종양항원펩티드로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 서열번호 :1 의 아미노산서열의 제 749 번 ∼ 제 757 번, 제 736 번 ∼ 제 744 번, 제 785 번 ∼ 제 793 번, 제 690 번 ∼ 698 번의 아미노산서열의 전부 또는 일부를 갖는 종양항원펩티드를 들 수 있다. 바람직하게는, 9 개의 아미노산잔기로 이루어진 것으로, 예를 들면, 서열번호 : 1 의 제 749 번 ∼ 제 757 번, 제 736 번 ∼ 제 744 번, 제 785 번 ∼ 제 793 번, 제 690 번 ∼ 698 번의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가 특히 바람직하다. 또한, 본 명세서에서, 종양항원펩티드를 표시할 때에, 예를 들면, 서열번호 : 1 의 제 749 번 ∼ 제 757 번의 아미노산서열로 이루어지는 펩티드를, 간단히 "749 ∼ 757" 과 같이 생략하는 경우가 있다.

본 명세서에서, "종양항원펩티드의 유도체" 란, 상기의 종양항원펩티드와 기능적으로 동등한 특성을 갖는 것으로, 이 펩티드 중의 일부의 아미노산잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체, 및 이 펩티드 또는 이 펩티드의 일부의 아미노산잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체의 아미노기 또는 카르복실기를 수식한 유도체를 의미한다. 구체적으로는, 서열번호 : 1 의 아미노산서열의 제 749 번 ∼ 제 757 번, 제 736 번 ∼ 제 744 번, 제 785 번 ∼ 제 793 번, 또는 제 690 번 ∼ 제 698 번의 아미노산서열의 전부 또는 일부를 갖는 본 발명의 종양항원펩티드에 있어서, 제 749 번 ∼ 제 757 번, 제 736 번 ∼ 제 744 번, 제 785 번 ∼ 제 793 번, 또는 제 690 번 ∼ 제 698 번의 아미노산서열 중의 일부의 아미노산잔기를 치환, 결실하거나, 다른 아미노산잔기를 부가한 유도체가 예시된다.

상기 펩티드 중의 일부의 아미노산잔기를 치환, 결실 또는 부가한 유도체로서는, 바람직하게는, 종양항원펩티드 중에서 CTL 과의 결합에 관여하는 에피토프 영역은 그 대로로서 MHC 클래스 I 항원과의 결합에 관여하는 아미노산잔기가 치환, 결실 또는 부가된 유도체를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 그 유도체로 하나의 아미노산잔기만을 치환한 것을 들 수 있다 (Immunol.84:298-303, 1995). 흑색종의 종양항원단백질인 gp100 의 항원 펩티드에 있어서는, MHC 클래스 I 항원과의 결합부위의 아미노산을 치환함으로써, MHC 클래스 I 항원으로 결합하게 되고, 또한, 흑색종 환자의 말초혈 임파구를 in vivo 로 자극한 경우, 항원 펩티드에 특이적인 CTL 이 보다 강하게 유도되는 것이 보고되어 있다 (J.Immunol.,157:2539-2548, 1996).

이와 같은 유도체는, 시판의 펩티드 합성기로 용이하게 합성가능하고, 합성된 유도체의 MHC 클래스 I 항원과의 결합친화성은, 이 유도체와 방사성 동위원소로 표식된 표준 펩티드와의 MHC 클래스 I 항원으로의 결합의 경합저해조합에 의해, 무세포계로 용이하게 측정할 수 있다 (R.T.Kubo 외, J.Immunol.,152:3913, 1994). 따라서, 제작한 여러 가지의 펩티드유도체를 이 조합에 이용함으로써, CTL 유도활성을 갖는 펩티드유도체를 용이하게 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 펩티드유도체는, CTL 과의 결합성은 그대로 유지하면서, MHC 클래스 I 항원에 의해 강하게 결합가능하기 때문에, 더욱 유용한 종양항원펩티드로 적용할 수 있다.

아미노기의 수식기로서는, 예를 들면 아실기를 들 수 있고, 구체적으로는 탄소수 1에서 6 의 알카노일기, 페닐기로 치환된 탄소수 1 부터 6 의 알카노일기, 탄소수 5부터 7 의 시클로알킬기로 치환된 카르보닐기, 탄소수 1부터 6 의 알킬술포닐기, 페닐술포닐기 등을 들 수 있다.

카르복실기의 수식기로서는, 예를 들면 에스테르기 및 아미드기를 들 수 있고, 에스테르기의 구체예로서는, 탄소수 1부터 6 의 알킬에스테르기, 페닐기로 치환된 탄소수 0부터 6 의 알킬에스테르기, 탄소수 5부터 7 의 시클로알킬에스테르기 등을 들 수 있고, 아미드기의 구체예로서는, 아미드기, 탄소수 1부터 6 의 알킬기 하나 또는 2 개로 치환된 아미드기, 페닐기로 치환된 탄소수 0부터 6 의 알킬기 하나 또는 2 개로 치환된 아미드기, 아미드기의 질소원자를 함유하여 5부터 7 원고리의 아자시클로알칸을 형성하는 아미드기 등을 들 수 있다.

본 명세서에서, "항체" 는, 예를 들면, [Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. 외 편저, Cold Spring Harber Laboratory Press 출판 New York 1989 년] 등에 기재된 방법으로 용이하게 제작된다. 즉, 종양항원단백질 또는 종양항원펩티드를 이용하여 통상의 방법으로 적당히 동물을 면역함으로써, 종양항원단백질, 종양항원펩티드를 인식하는 항체, 나아가서는 활성을 중화하는 항체를 용이하게 제작할 수 있다. 항체의 용도로서는, 친화성 크로마토그래피, cDNA 유전자총합체의 스크리닝, 면역학적진단법, 의약 등을 들 수 있다. 면역학적진단법은, 면역 블로팅법(immunoblotting), 방사면역측정법 (RIA), 효소면역측정법 (ELISA), 형광 또는 발광측정법 등으로 적당히 선택할 수 있다.

본 명세서에서, "서열번호 : 2 의 염기서열로 이루어지는 DNA 의 코딩서열 또는 5' 논코딩서열 중의 단편 DNA 와 상보적인 서열을 갖는 8 염기 이상으로 이루어지는 DNA 또는 그 DNA 에 대응하는 RNA" 란, 2 개 사슬의 DNA 의 안티센스 사슬의 DNA 또는 그 안티센스사슬의 DNA 에 대응하는 RNA 로서 8 염기 이상의 것 (이하, 안티센스올리고누클레오티드라 함)을 말한다.

이 안티센스올리고누클레오티드는, 예를 들면 본 발명의 종양항원단백질을 코드하는 유전자의 염기서열을 근거로 하여 DNA 로서 제조하거나 또는 이 DNA를 안티센스용으로 발현 플라스미드에 혼합함으로써 RNA 로 제조할 수 있다.

이 안티센스올리고누클레오티드는, 본 발명의 유전자인 서열번호 : 2 의 염기서열로 이루어지는 DNA 의 코딩서열, 5' 논코딩 서열의 어느 부분의 DNA 단편과 상보적인 서열이어도 되지만, 바람직하게는 전사개시부위, 번역개시부위, 5' 비번역영역, 엑손과 인트론과의 경계영역 또는 5' CAP 영역에 상보적 서열인 것이 바람직하다.

상기 "DNA 또는 이 DNA 에 대응하는 RNA" 의 "화학적수식체" (이하, 안티센스올리고누클레오티드의 화학적 수식체라 함) 으로서는, DNA 또는 RNA 의 세포내로의 이행성 또는 세포내에서의 안정성을 높일 수 있는 화학적 수식체를 나타내고, 예를 들면, 포스포로티오에티트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포트리에스테르, 알킬포스포나이트, 알킬포스포아미데이트 등의 유도체 ("Antisense RNA and DNA" WILEY-LISS간 1992 P.1-50)을 들 수 있다. 이 화학적 수식체는, 동 문헌 등에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 안티센스올리고누클레오티드 또는 그 화학적 수식체를 이용하여, 종양항원단백질을 코드하는 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 종양항원단백질의 과잉발현이 자기면역질환의 원인인 경우에는, 이 방법으로 종양항원단백질의 생산량을 줄임으로써, CTL 에 의한 상해를 경감시킴과 동시에 CTL 의 증식을 억제하게 되어 자기면역질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

안티센스올리고누클레오티드 또는 그 화학적 수식체를 그 대로 투여하는 경우에는, 이 안티센스올리고누클레오티드의 바람직한 길이로서는, 예를 들면 8 ∼ 200 염기의 것을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 25 염기를 들 수 있으며, 특히 바람직하게는 12 ∼ 25 염기의 것을 들 수 있다.

또, 안티센스올리고누클레오티드를 발현 플라스미드에 혼합하는 경우에는, 이 안티센스올리고누클레오티드의 바람직한 길이로서는, 예를 들면 100 염기 이상을 들 수 있고, 바람직하게는 300 ∼ 1000 염기를 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 500 ∼ 1000 염기를 들 수 있다.

안티센스올리고누클레오티드를 발현 플라스미드에 혼합한 후 세포에 도입하는 방법으로서는, 예를 들면 문헌[실험의학, 12 권, 1994 년]에 서술되어 있는 방법을 들 수 있고, 리포솜이나 재조합 바이러스 등을 이용한 방법을 들 수 있다. 안티센스올리고누클레오티드의 발현 플라스미드는 통상의 발현벡터를 이용하여 프로모터의 뒤에 역방향으로, 즉 본 발명의 유전자가 3'부터 5' 의 방향으로 전사되도록, 본 발명의 유전자를 연결하는 것만으로 간단히 제작할 수 있다.

안티센스올리고누클레오티드 또는 안티센스올리고누클레오티드의 화학적 수식체를 그 대로 투여하는 경우, 안정화제, 완충제, 용매 등과 혼합하여 제제한 후, 항생물질, 항염증제, 마취약 등과 동시에 투여하여도 된다. 이렇게 하여 작성된 제제는 여러 가지 방법으로 투여가능하다. 투여는 연일 또는 몇일부터 몇주간 간격으로 이루어지는 것이 바람직하다. 또, 이와 같은 빈번한 투여를 피하기위해 서방성의 미니펠렛 제제를 작성하여 환부근처에 이식하는 것도 가능하다. 또는 삼투성 펌프 등을 이용하여 환부에 연속적으로 투여하는 것도 가능하다. 통상 투여량은 작용부위에서의 농도가 0.1 mM-10 ㎛ 가 되도록 조제한다.

본 발명의 종양항원단백질 및 종양항원펩티드 및 기능적으로 동등한 특성을 갖는 이들의 유도체는, 단독 또는 2 종 이상을 조합하여 이용할 수 있고, 이들을 유효성분으로 함유하는 의약은, 세포성 면역이 효과적으로 성립되도록 면역 보강제와 함께 투여하거나, 입자상의 제형으로 하여 투여할 수 있다. 즉, 종양항원단백질이나 종양항원펩티드를 생체에 투여하면, 항원제시세포의 MHC 클래스 I 항원에 종양항원펩티드가 고밀도로 제시되어, 종양 특이적 CTL 이 효율적으로 증식된다. 면역 보강제로서는, 문헌 (Clin. Microbiol.Rev.,7:277-289, 1994) 에 기재된 것 등을 응용할 수 있다. 또, 제형으로서는, 리포솜제제, 직경 수㎛ 의 비즈에 결합시킨 입자상의 제제, 지질을 결합시킨 제제 등 외인성의 항원 펩티드를 MHC 클래스 I 항원으로 효율적으로 항원제시시킬 수 있는 투여법이 이용된다. 또, 종양항원 펩티드를 펄스한 수상(樹狀) 세포나 마크로퍼지 등의 항원제시세포나 종양항원단백질을 코드하는 DNA를 도입한 세포를 투여하는 방법도 생각할 수 있다. 제제중의 본 발명의 종양항원단백질 및 종양항원펩티드의 투여량은, 치료목적의 질환, 환자의 년령, 체중 등으로 적당히 조정할 수 있는데, 통상 0.0001 ㎎ ∼ 1000 ㎎, 바람직하게는 0.001 ㎎ ∼ 1000 ㎎ 이고, 이를 몇일 내지 몇 개월에 1 회 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 종양항원펩티드를 이용하는 in vitro 에서의 말초혈 임파구로부터의 CTL 의 유도방법이, 하기와 같이 예시된다.

상기 편평상피암을 갖는 식도암 환자 유래의 말초혈 임파구를 in vitro 로 배양하고, 배양액에 본 발명의 종양항원펩티드로서, 예를 들면, "736 ∼ 744", "749 ∼ 757", "788 ∼ 793", "690 ∼ 698" 의 서열을 갖는 펩티드를 10 ㎍/㎖ 이 되도록 더하여, 말초혈 임파구를 자극한다. 1 주간의 간격을 두어 3 회의 자극을 반복한다. 3 회째의 자극으로부터 1 주간후, 말초혈 임파구를 회수하여, [D.D.Kharkevitch 외 편저, Int.J.Cancer,58:317(1994)] 에 기재된 방법에 따라, 세포상해활성을 측정함으로써, 본 발명의 종양항원펩티드의 CTL 의 유도활성이 발견되었다.

본 발명의 종양 또는 자기면역질환의 진단방법으로서는, 종양항원단백질 또는 종양항원펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 종양조직표본에서 종양항원단백질을 검출하는 방법, 혈중 또는 조직중의 종양항원단백질 또는 종양항원단백질에 대한 항체의 존재를 검출하는 방법 등을 들 수 있다. 검출방법으로서는, 면역조직화학법, 면역 블로팅법, 방사면역측정법 (RIA), 산소면역측정법 (ELISA), 형광 또는 발광측정법 등에서 적당히 선택할 수 있다. 또, 항체를 이용하여 종양항원단백질을 검출함으로써, 종양의 조기발견, 재발발견이 가능해지고, 또 종양항원단백질, 종양항원펩티드 또는 이들을 코드하는 DNA를 이용한 의약의 적응가능한 종양환자의 선택이 가능해진다.

이하, 본 발명의 일례로서 실시예로 본 발명을 더욱 상세히 설명하는데, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 조금도 한정되지 않는다.

참고예 1

식도암 세포주에 대한 세포상해성 T 세포 (CTL) 주의 수립

문헌[나까오 외 편저, Cancer Res., 55:4248-4252(1995)] 의 기재에 따라, 조직형이 편평상피암에 분류되는 식도암 세포주 KE-4 에 대한 CTL을 환자의 말초혈단핵구세포로부터 수립하여, KE-4CTL 로 명명하여 실험에 사용하였다. 식도암 세포주 KE-4 및 KE-4CTL 은, 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1 쵸메 1 방 3 고, 공업기술원 생명공학공업기술연구소에, 각각 수탁번호 FERM BP-5955 및 FERM BP-5954 로 기탁되어 있다 (기탁일 : 모두 평성 9년 5월 23일). 또, 상술의 나까오 등의 보고에 따라, KE-4 의 HLA 클래스 I 분자의 타이핑을 행하여, HLA-A2402, -A2601, -B54, -B60, -Cw1, -Cw3 인 것을 확인하였다.

참고예 2

HLA-A2601 cDNA 및 HLA-A2402 cDNA 의 조제

KE-4 로부터, 문헌[나까오 외 편저, Cancer Res.,55:4248-4252(1995)] 의 기재에 따라, HLA-A2601 의 cDNA를 발현벡터 pCR3 (INVITROGEN 사제) 에 혼합한 재조합 플라스미드를 제작하였다. 또 동일한 방법에 의해, HLA-A2402 에 대해서도 재조합 플라스미드를 제작하였다.

참고예 3

KE-4 유래 cDNA 유전자총합체의 제작

KE-4 로부터 mRNA 정제 시스템 (팔마시아바이오테크사 제조)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라, 전체 RNA 획분의 분리 및 oligo(dT) 칼럼에 의한 poly(A+)mRNA 의 조제를 행하였다. mRNA에서 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템 (GIBCO BRL사 제조)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라, 양단에 NotI 어댑터와 SalI어댑터를 연결한 cDNA를 제작한 후, 이 cDNA를 발현 벡터의 플라스미드 pSV-SPORT1(GIBCO BRL사 제조) 의 제한효소 NotI 및 Sal1 의 절단부위에 결찰하여 재조합 플라스미드를 얻었다. 이 재조합 플라스미드를 진페르사 (Bio-Rad사 제조)를 이용하여 25 ㎌, 2.5 ㎸ 의 조건에서, 전기 펄스에 의해 대장균의 엘렉트로믹스 DH10B/p3^TM셀 (GIBCO BRL 사 제조) 에 도입하여, 안피시린 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 배지 (1% 박토-트립톤(bacto-trypton), 0.5% 이스트 추출물, 0.5% Nacl, pH7.3)에서 재조합 플라스미드가 도입되어 있는 형질전환체를 선택하였다.

참고예 4

인터페론-γ 의 정량

인터페론-γ (IFN-γ) 의 정량은 효소결합면역흡착검사(ELISA) 로 행하였다. 96 웰마이크로플레이트에 고층화항체로서 항인체IFN-γ마우스 모노크로날 항체를 흡착시켜, 소혈청의 알부민으로 비특이적결합을 블록한 후, 검체 중의 IFN-γ를 항체에 결합시켰다. 다음에 검출항체로서 항인체 IFN-γ 토끼의 폴리크로날항체를 결합시키고, 다시 알칼리포스파다제를 표식한 항 토끼 면역 글로부린이나 항체를 결합시킨 후, 발색기질로서 파라니트로페닐 포스페이트를 반응시키고, 1N NaOH를 등량 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 흡광도 (405 ㎚)을 측정하였다. 이것을 스탠다드의 IFN-γ 로 수득된 값과 비교함으로써 정량하였다.

실시예 1

신규인 종양항원단백질 유전자의 스크리닝

참고예 3 에 나타낸 형질전환체의 약 100 개의 풀로부터의 재조합 플라스미드 DNA 의 회수는 이하와 같이 행하였다. 즉, 안피시린 (50 ㎍/㎖) 을 함유하는 LB 배지가 들어간 96 웰 U 저마이크로플레이트에 웰당 100 개의 형질전환체를 더하여 배양한 후, 그 일부를 웰당 0.25 ㎖ 의 TYGPN 배지(F.M.Ausubel 외 편저, CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley ＆ Sons, Inc) 가 들어간 다른 96 웰 U 저마이크로플레이트로 옮겨 37 ℃에서 48 시간 배양하여, 남은 LB 배지의 마이크로플레이트는 동결보존하였다. TYGPN 배지에서 배양한 형질전환체의 재조합 플라스미드 DNA 는, 마이크로플레이트에서 알칼리 용해법 (F. M. Ausubel 외 편저, CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley ＆ Sons, Inc.) 으로 조제하였다. 이소프로판올 침전으로 회수한 재조합 플라스미드 DNA 는, 50 ㎕ 의 20 ng/㎖ RNase를 함유하는 10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.4 용액으로 현탁하였다.

선유아세포주의 VA-13 세포 (이화학연구소 세포개발은행, Ann. Med. Exp. Biol.Fenn.,44:242-254, 1996) 로, 리포펙틴법에 의해 이하와 같이 KE-4c DNA 의 재조합 플라스미드와 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드를 더블 트랜스펙트하였다. 즉, VA-13 세포를 96 웰 평저마이크로플레이트에 웰당 7000 개를 더하여, 100 ㎕ 의 10% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배양액으로 2 일간 배양하였다. 리포펙틴 시약 (GIBCO BRL사 제조)를 이용하여, 형질전환체 약 100 개분의 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드 25 ㎕ 과 참고예 2 에 나타낸 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드 10 ㎕ (200 ng) 와 약 35 배로 희석하거나 리포펙틴시약 35 ㎕ 의 혼합액 70 ㎕ 의 30 ㎕를 VA-13 세포에 더하여 더블트랜스펙트로 하였다. 트랜스펙턴트는 2 점씩 준비하였다. 5 시간 후, 이 트랜스펙턴트에 200 ㎕ 의 10 % FCS를 함유하는 배양액을 더하고, 다시 72 시간, 37 ℃에서 배양한 후, 배양액을 제거하고, 웰당 10000 개의 KE-4CTL을 더하여 100 ㎕ 의 10 % FCS 와 25 U/㎖ 의 IL-2를 함유하는 배양액으로 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 배양액을 회수하고, IFN-γ를 ELISA 로 측정하였다.

높은 IFN-γ 생산이 보인 4 군에 대해서는, 해당되는 동결보존되어 있었던 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드에 의한 형질전환체 약 100 개의 풀을 이용하여 다시 이하와 같이 스크리닝을 행하였다. 즉, 형질전환체의 풀을 안피리신 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천배지의 플레이트에 뿌려 콜로니를 얻어, 각 군 200 콜로니, 합계 800 콜로니에 대하여 웰당의 형질전환체가 1 종류가 되는 조건에서 상기와 동일한 방법으로 배양하고, KE-4c DNA 의 재조합 플라스미드 DNA를 조제하였다. 또한 상기와 동일한 방법으로 VA-13 세포로의 KE-4c DNA 의 재조합 플라스미드와 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드의 더블 트랜스펙트를 행하여, 계속하여 KE-4CTL 과의 혼합배양을 행하고, KE-4CTL 이 반응하여 생산된 배양액 중의 IFN-γ 의 정량을 행하여 양성의 플라스미드를 선택하였다. 이 조작으로 KE-4c DNA 재조합 플라스미드 클론이 선택되고, 6DI로 명명하였다. 6DI에 대해서는. 다시 한번, 동일한 조작을 반복하여 KE-4CTL 세포에 의한 IFN-γ 의 생산량을 참고예 4 의 방법으로 정량하였다. 그 결과를 이하의 표 1 에 나타낸다.

표적세포	KE-4CTL 이 생산한 IFN-γFID(pg/㎖)
VA-13 세포	0
VA-13 세포＋HLA－A2601	1.8
VA-13 세포＋6DI	4.3
VA-13 세포＋HLA－A2601＋6DI	24.0
VA-13 세포＋HLA－A02011)	0.9
VA-13 세포＋HLA－A0201＋6DI1)	3.0
1):비교를 위해 다른 타입의 HLA를 트랜스펙트한 경우 (트랜스펙트한 DNA 량, HLA-A2601, HLA-A0201 이 200 ng, 6DI가 100 ng 일 때의 데이터)

실시예 2

노던 혼성화에 의한 종양항원단백질 유전자발현의 해석

여러 가지의 세포주에서, RNAzol B (TEL-TEST, INC. 사제)를 이용하여 RNA를 조제하였다. 5 ㎍ 의 RNA를 포름아미드, 포름알데히드 존재하에서 변성시키고, 아가로스 전기영동을 행한 후, Hybond-N+ 나일론멤브레인 (Amersham사제) 에 전사, 고정하였다. 정상조직의 RNA 에 대해서는, mRNA를 고정한 시판의 멤브레인 (CLONTECH사 제조)를 이용하였다. 멀티프라임 DNA 라벨링시스템 (Amersham 사 제조) 에 의해, 실시예 1에서 클로닝한 재조합 플라스미드 6DI의 삽입서열부분을³²P 로 표식하여 DNA 프로브를 제작하고, 공지의 방법 (나까야마 외 편저, 바이오실험 일로스트레이티드 ② 유전자 해석의 기초, p.148-151, 슈쥰샤, 1995년) 에 따라, 멤브레인 상의 RNA 에 혼성화시킨 후, 오토레이디오그래피에 의해, 본 발명의 종양항원단백질 유전자의 mRNA를 검출하였다. 다음으로, 이 유전자의 mRNA 의 검출에 이용한 멤브레인을, 0.5% 도데실황산나트륨수용액 중에서 끓여 프로브를 벗긴 후, 세포에서 항상적으로 발현되고 있는 β-액틴을 프로브로서, 동일한 방법으로 노던 혼성화를 행하여, mRNA를 검출하여 내부 표준으로 하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 이들의 결과로부터, 본 발명의 종양항원단백질 유전자의 mRNA 는, 각종 암세포 및 정상조직에서 광범하게 발현되고 있고, 전장은 약 2.5 kb 인 것이 명확해졌다 (도 1).

실시예 3

종양항원단백질을 코드하는 전장의 cDNA 클론의 클로닝과 염기서열의 결정

참고예 3 에 나타낸 KE-4 유래 cDNA 유전자총합체를 암피실린 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천배지의 플레이트에 뿌려 콜로니를 얻은 후, Hybond-N+ 나일론멤브레인 (Amersham사 제조) 에 첨부의 프로토콜에 따라, 콜로니의 DNA를 전사, 고정하였다. 실시예 2에서 사용한 것과 동일한 6DI 프로브를 이용하여, 실시예 2 와 동일한 조건에서 혼성화와 오토레이디오그래피를 행하여, 종양항원단백질 유전자의 cDNA 가 혼합된 재조합 플라스미드를 갖는 형질전환체의 콜로니를 선택하였다. 또한, 선택된 복수의 콜로니에서 재조합 플라스미드를 회수하여, 제한효소 NotI 및 Sa1I로 처리한 후, 아가로스 전기영동에 의해 혼합된 cDNA 의 길이를 확인하였다. 약 2.5 kb 의 cDNA 가 혼합된 재조합 플라스미드를 선택하고, 이를 K3 이라 명명하였다. 이 플라스미드 K3 에 대하여 DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing 키트 (파킨엘마사 제조)를 사용하여, cDNA 부분의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을, 서열표의 서열번호 : 2 에 나타낸다. 이 cDNA 의 전장은 2527 염기대(對)이었다. 서열번호 : 2 의 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 (800 아미노산)을, 서열번호 : 1 에 나타낸다.

해석결과, 서열번호 : 2 의 염기서열은, 흑색종 유래의 기지의 종양항원단백질의 유전자와는 상동성은 없고, 다른 유전자이었다. WWW Entrez 데이터베이스를 사용하여, 서열번호 : 2 에 기재된 염기서열의 검색을 행한 결과, 본 발명의 염기서열의 일부분이, WashU-Merck EST Project 에 의해 해독되고, GENBANK 에 등록되어 있는 기능불명의 3 종류의 유전자서열, Accession No.R89163, R62890, R00027 과 90 % 이상의 높은 상동성을 나타내는 것이 명확해졌다. No.R89163 은 서열 1893∼2267번, R62890 은 서열 2018 ∼ 2389 번, R00027 은 서열 2024 ∼ 2510 번에 상당한다. 그러나, 이들의 서열은 본 발명의 염기서열의 개시코돈에서 3' 측의 염기서열이기 때문에, 아미노산서열을 결정할 수 없다.

또한, 상기의 염기서열결정 후, 플라스미드 K3을 E.coli JM109 에 도입하여, 본 발명의 신규인 종양항원단백질 cDNA를 함유하는 보존용의 형질전환체인 E.coli JM109(K3)를 조제하였다. E.coli JM109(K3) 는, 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1쵸메 1 방 3 고, 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되어 있다 (기탁일 : 평성 9년 5월 22 일: 기탁번호: FERM BP-5951).

또한, 정상 인체조직 (말초혈 임파구) 의 cDNA 유전자총합체 (GIBCO BRL 사 제조)를 상기와 동일하게 스크리닝된 바, 약 2.5 kb 의 cDNA 가 혼합되어 재조합 플라스미드가 클로닝되어, 이 cDNA 의 염기서열을 결정한 바, 서열번호 : 2 의 염기서열의 제 812 번 (정상인체조직에서의 제 812 번은 "T" 임) 가 다른 것 이외에는 동일한 cDNA 가 단리되었다. 따라서, 본 발명의 종양항원단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 전장이 유전자는, 암세포와 정상인체조직에서, 대략 동일한 유전자가 발현되어 있는 것이 시사되었다.

다음에, 실시예 1 과 동일한 방법으로, 신규인 종양항원단백질 유전자의 cDNA 가 혼합된 재조합 플라스미드 K3 와, HLA-A2601 의 cDNA 가 혼합된 재조합 플라스미드를 VA-13 세포에 더블트랜스펙트한 세포를 표적세포로서, KE-4CTL 이 반응하여 생산된 IFN-γ 량을, 참고예 4 의 방법으로 정량하였다. 그 결과를 이하의 표 2 에 나타냈다.

표적세포	KE-4CTL 이 생산한 IFN-γFID(pg/㎖)
VA-13 세포＋HLA－A2601＋K3	1439
VA-13 세포＋HLA－A02012)＋K3	10
1)VA-13세포에 각각의 HLA를 트랜스펙트한 세포에 대한 KE-4 CTL 이 생산한 IFN-γ량 (백그라운드)을 뺀 값2):비교를 위해 다른 타입의 HLA를 트랜스펙트한 경우 (트랜스펙트한 DNA 량, HLA-A2601, HLA-A0201 이 200 ng, 6DI가 100 ng 일 때의 데이터)

실시예 4

종양항원펩티드의 확인

실시예 1에서 클로닝된 신규인 종양항원단백질 유전자의 부분 cDNA 가 혼합된 재조합 플라스미드 6DI에서, 킬로-시퀀스(Kilo-Sequence) 용 딜리션 키트(Deletion Kit, 다까라슈조샤 제조)를 이용하여, 첨부의 프로토콜에 따라, 종양항원단백질 유전자의 cDNA 가 여러 가지 길이로 결실된 플라스미드를 얻었다. 이들의 플라스미드를 대장균의 일렉트로막스(ElectroMax) DH10B/p3^TM셀 (GIBCO BRL사 제조) 에 도입하여, 한천배지의 플레이트상에서 배양하여, 무작위로 50 개의 콜로니를 선택하였다. 이 콜로니에서 플라스미드 DNA를 조제하여, 전기영동을 이용함으로써, 적당한 길이의 플라스미드를 갖는 5 개의 클론을 선택하였다.

실시예 1 에 기재의 방법에 의해, VA-13 세포로 HLA-A2601 cDNA 와 상기 플라스미드 DNA를 더블트랜스펙트하고, 계속하여, 이 트랜스펙턴트와 KE-4CTL을 혼합배양하여, 참고예 4 에 기재의 방법에 따라, 배양액 중의 IFN-γ를 정량하였다. 이 결과, 서열번호 : 2 의 염기서열의 2253 번째 이후가 결실된 플라스미드의 트랜스펙턴트에는, KE-4CTL 로부터의 IFN-γ 유도활성을 볼 수 없었다. 따라서, 서열번호 : 1 의 아미노산서열의 739 번째 근방 이후의 서열을 갖는 펩티드에 KE-4CTL 로부터의 IFN-γ 유도활성이 있는 것으로 예상되었다.

다음으로, 서열번호 : 1 의 아미노산서열의 730 번째 이후를 3 아미노산씩 어긋나게 하여 10 아미노산잔기의 펩티드를 21 종류 합성하였다. 이들의 펩티드를, HLA-A2601 cDNA를 트랜스펙트한 VA-13 세포에 펄스하여 항원제시시킨 것 이외에는 상기와 동일한 방법으로, 배양액 중의 IFN-γ를 정량하였다. 이 결과, 서열번호 : 1 의 "736 ∼ 745", "748 ∼ 757", "784 ∼ 793" 의 아미노산서열을 갖는 펩티드에 IFN-γ 유도활성이 보였다.

또한, 이들 3 종류의 펩티드에 대하여, 보다 강한 IFN-γ 유도활성을 갖는 펩티드를 확인하기 위해, N 말단 또는 C 말단을 1 아미노산 짧게한 9 아미노산잔기의 펩티드를 합성하여, 동일하게 IFN-γ 유도활성을 측정한 바, 서열번호 : 1 의 "736 ∼ 744", "749 ∼ 757", "785 ∼ 793" 의 아미노산서열을 갖는 펩티드에 의해 강한 IFN-γ 유도활성이 보였다. 그 결과를 표 3 에 나타냈다.

펄스한 세포	펩티드	KE4-CTL세포가 생산한 IFN-γ량(pg/㎖)
VA-13/A26011)	「736∼744」	203
VA-13/A02012)	「736∼744」	44
VA-13/A2601	「749∼757」	183
VA-13/A0201	「749∼757」	89
VA-13/A2601	「785∼793」	394
VA-13/A0201	「785∼793」	102
1) VA-13 세포에 HLA-A2601 cDNA를 트랜스펙트한 경우2) 대조로서 VA-13 세포에 다른 HLA-A0201 cDNA를 트랜스펙트한 경우

표 3에서, 이들의 펩티드가 종양항원펩티드로서 기능하는 것이 시사되었다.

또, HLA 분자에 결합되어 제시되는 항원 펩티드의 서열에는 규칙성 (모티브) 이 있는 것이 알려져 있고, HLA-A24 의 경우, 9 아미노산잔기로 이루어지는 항원 펩티드 중, 2 번째가 티로신, 9번째가 이소로이신, 로이신 또는 페닐알라닌이 모티브로 되는 것이 알려져 있다 (Immunogenetics,41:178-228, 1995).

따라서 서열번호 : 1 에 기재된 아미노산서열에서, 상기 모티브에 상당하는 "690 ∼ 698" 의 아미노산서열을 갖는 펩티드를 합성하였다. 그리고, HLA-A2402 cDNA를 트랜스펙트한 VA-13 세포에 펄스하여, 상기와 동일한 방법으로, KE-4CTL 로부터의 IFN-γ 유도활성을 조사하였다. 결과를 표 4 에 나타냈다.

펄스한 세포	펩티드	KE4-CTL세포가 생산한 IFN-γ량(pg/㎖)
VA-13	「690∼698」	157
VA-13/A24021)	「690∼698」	269
VA-13/A02012)	「690∼698」	166
1) VA-13 세포에 HLA-A2402 cDNA를 트랜스펙트한 경우2) 대조로서 VA-13 세포에 다른 HLA-A0201 cDNA를 트랜스펙트한 경우

표 4에서, 「690∼698」의 펩티드가, 종양항원펩티드로서 기능하는 것이 시사되었다.

실시예 5

종양항원펩티드에 의한 말초혈 임파구로부터의 CTL 의 유도

실시예 3에서 나타난 종양항원펩티드를 이용하여, KE-4 의 유래인 암환자의 말초혈 임파구를 in vitro 로 자극하여 항원특이적인 CTL을 유도할 수 있는 것이 검토되었다. 사용한 종양항원펩티드는, 상기 실시예 3에서 얻어진 「736∼744」, 「749∼757」, 「690∼698」의 서열을 갖는 펩티드이다. 상기 암환자 유래의 말초혈에서 피콜법으로 임파구를 분리하여 동결보존하였던 말초혈 임파구를 해동하여, 24 구멍의 플레이트에 약 2×10⁶세포/구멍이 되도록 옮겨, 10% FCS 와 IL-2(100 U/㎖)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배양액에 상기 종양항원펩티드를 10 ㎍/㎖ 가 되도록 더하여, 말초혈 임파구를 자극하였다. 1 주간후, X 선대조 (50 Gy) 한 약 1× 10⁵개의 말초혈 임파구와 함께 상기 종양항원펩티드를 10 ㎍/㎖ 더하여, 2 회째의 자극을 행하였다. 다시 1 주간후, 3 회째의 자극을 동일하게 반복하였다.

「736∼744」, 「749∼757」의 서열을 갖는 펩티드에 대해서는 3 회째의 자극으로부터 1 주간후, 말초혈 임파구를 회수하여, [D.D.Kharkevitch 외 편저, Int.J.Cancer,58:317(1994)] 에 기재의 방법에 따라,⁵¹Cr 로 표식된 KE-4 및 HLA-A 로커스가 A2402 및 A2 인 식도암 세포주 KE-3을 표적세포로, 세포상해활성을 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타냈다.

효과세포	표적세포	상해활성(%)
「736∼744」로 자극한 말초혈 임파구	KE-4	22.1
	KE-3	3.7
「749∼757」로 자극한 말초혈 임파구	KE-4	35.9
	KE-3	24.2

「736∼744」의 서열을 갖는 펩티드로 자극한 경우에는, KE-4 는 강하게 상해되었지만, 음성대조의 KE-3 은 상해되지 않았던 것으로부터, KE-4 특이적인 CTL 이 유도되고 있는 것이 나타났다. 또, 「749∼757」의 서열을 갖는 펩티드로 자극한 경우에는, KE-3 에 대한 비특이적인 세포상해활성이 보였지만, KE-4 에 대하여 보다 강한 세포상해활성이 보였기 때문에, KE-4 특이적인 CTL 이 유도되고 있는 것이 시사되었다.

「690∼698」의 서열을 갖는 펩티드에 대해서는, 3 회째의 자극 후, 말초혈 임파구를 회수하여, 10% FCS, 50% AIM-V (GIBCO BRL사 제조), IL-2(100U/㎖)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양을 계속하였다. 그 후, 상기와 동일한 방법으로,⁵¹Cr 로 표식된 KE-4, 및 VA-13 세포를 표적세포로 세포상해활성을 측정하였다. 또, HLA-A 로커스가 A24 의 호모인 건강인의 말초혈 임파구를 분리하여, 동일한 방법으로⁵¹Cr 로 표식된 KE-4, 및 HLA-A 로커스가 A2601 의 호모인 폐암세포주의 QG-56 세포를 표적세포로서, 세포상해활성을 측정하였다. 결과를 표 6 에 나타냈다.

효과세포	표적세포	상해활성(%)
「690∼698」로 자극한 암환자 말초혈 임파구	KE-4	24.7
	VA-13	13.8
「690∼698」로 자극한 건강인 말초혈 임파구	KE-4	17.7
	QG-56	11.5

암환자 말초혈 임파구 및 건강인 말초혈 임파구를 「690∼698」의 서열을 갖는 펩티드로 자극함으로서, 음성대조인 VA13 세포, QG56 세포에 대한 비특이적인 세포상해활성이 보였는데, KE-4 에 대하여 보다 강한 세포상해활성이 보였다. 이상의 결과로부터, KE-4 특이적인 CTL 이 유도되고 있는 것이 시사되었다.

본 발명에 의해 종양항원단백질 및 종양항원펩티드를 이용한 항종양면역을 활성화하기 위한 의약, 자기면역질환을 치료하기 위한 의약, 및 종양항원단백질을 코드하는 DNA 등을 함유하는 의약을 제공할 수 있고, 또 종양 또는 자기면역질환의 진단방법을 제공할 수 있다.

[서열표]

서열번호 : 1

서열길이 : 800 아미노산

서열형 : 아미노산

토폴로지 : 직쇄상

서열종류 : 펩티드

기원 :

생물명 : 인체 (Homo sapiens)

조직종류 : 식도암 조직

서열의 특징

특징을 나타내는 기호 : 펩티드

존재위치 : 1..800

특징을 결정한 방법 : P

서열번호 : 2

서열길이 : 2527 염기쌍

서열형 : 핵산

사슬수 : 이중사슬

토폴로지 : 직쇄상

서열종류 : cDNA 내지 mRNA

하이포테티컬서열 : 없음

안티센스 : 없음

기원 :

생물명 : 인체 (Homo sapiens)

조직종류 : 식도암 조직

서열의 특징

특징을 나타내는 기호 : 5' UTR

존재위치 : 1..38

특징을 결정한 방법 : E

특징을 나타내는 기호 : CDS

존재위치 : 39..2438

특징을 결정한 방법 : E

특징을 나타내는 기호 : 3' UTR

존재위치 : 2439..2506

특징을 결정한 방법 : E

특징을 나타내는 기호 : polyA 위치

존재위치 : 2507..2527

특징을 결정한 방법 : E

Claims (11)

1. 서열번호 : 1 의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 그의 아미노산서열 중 1 이상의 아미노산잔기가 치환, 결실 또는 부가된 변이 단백질을 코드하는 DNA (단, 이 단백질 및 변이 단백질은 그 세포내 분해에 의해, 주요조직 적합 유전자 복합체(MHC) 클래스 I 항원과 결합할 수 있고, 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 생성할 수 있다).
2. 서열번호 : 2 의 염기서열로 이루어지는 DNA, 또는 그 DNA 와 엄중한 조건하에서 혼성화하는 DNA 변이체 (단, 이 DNA 및 DNA 변이체의 발현에 의해 생산되는 단백질은, 그 세포내 분해에 의해, MHC 클래스 I 항원과 결합될 수 있고, 그 결합상태에서 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드단편을 생성할 수 있다).
3. 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA 를 유효성분으로 함유하는 의약.
4. 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA 를 갖는 발현 플라스미드.
5. 제 4 항의 발현 플라스미드로 형질전환된 형질전환체.
6. 제 1 항 또는 제 2 항의 DNA 의 발현에 의해 생산되는 종양항원단백질.
7. 제 6 항의 단백질의 일부로 이루어지는 펩티드로, MHC 클래스 I 항원과 결합하여 T 세포에 의해 인식될 수 있는 종양항원펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 그 유도체.
8. 서열번호 : 1 의 아미노산서열의 제 749 번 ∼ 제 757 번, 제 736 번 ∼ 제 744 번, 제 785 번 ∼ 제 793 번, 또는 제 690 번 ∼ 제 698 번의 아미노산서열의 전부 또는 일부를 갖는 펩티드인, 제 7 항의 종양항원펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 그 유도체.
9. 제 6 항의 종양항원단백질, 제 7 항 또는 제 8 항의 종양항원펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 갖는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 의약.
10. 제 6 항의 종양항원단백질 또는 제 7 항 또는 제 8 항의 종양항원펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
11. 서열번호 : 2 의 염기서열로 이루어지는 DNA 의 코딩서열 또는 5' 비코딩서열의 DNA 단편과 상보적인 서열을 갖는 8 염기 이상으로 이루어지는 DNA, 그 DNA 에 대응하는 RNA, 또는 이들의 화학적 수식체.