CN103705914B - 一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103705914B CN103705914B CN201310665062.XA CN201310665062A CN103705914B CN 103705914 B CN103705914 B CN 103705914B CN 201310665062 A CN201310665062 A CN 201310665062A CN 103705914 B CN103705914 B CN 103705914B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vaccine
- protein
- preparation
- sample
- aluminium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌疫苗制剂及其制备方法。本发明的疫苗制剂免疫原性强，活性高，能够有效刺激机体产生高效的保护性免疫应答和良好的免疫保护作用，从而抵御金黄色葡萄球菌感染。本发明的制备方法保证了疫苗抗原四种组分的吸附均一性和稳定性，提高了生产效率，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌疫苗制剂及其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，以下简称金葡菌，有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性炎症为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。
随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)自1961年首次被发现以来，已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的医院内感染病原菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行且呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，又被称为“第一超级细菌”。
据美国CDC报道，美国平均每年MRSA严重感染人数约为9万人，致死病例约为2万人。中国2011年全国细菌耐药监测报告显示：临床MRSA检出率平均为60%，广泛耐药率超过40%。当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解决的感染性疾病，并位居首位。万古霉素是目前治疗MRSA感染的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的MRSA菌株相继出现，并在全球呈蔓延趋势，使MRSA感染面临“无药可治”的严峻挑战。
针对耐药金葡菌感染的严峻挑战，WHO于2011年提出“抵抗耐药菌”的“六点政策一揽子计划”，并强调未来重点支持创新性疫苗等免疫防控制品的研发。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的金黄色葡萄球菌疫苗制剂，用于预防和治疗金黄色葡萄球菌感染及因此引发的脓毒血症等相关感染性疾病。
在第一个方面，本发明的疫苗制剂包括SpA5蛋白，所述SpA5蛋白的序列选自SEQIDNO.1～4任一条序列。
优选地，所述疫苗制剂还包括MntC、mSEB和HI蛋白中的一种或多种。
在另一方面，本发明提供一种制备发明的疫苗制剂的方法，包括：将铝佐剂与疫苗抗原蛋白分开稀释后再混合和/或吸附。
本发明的疫苗制剂免疫原性强，活性高，能够有效刺激机体产生高效的保护性免疫应答和良好的免疫保护作用，从而抵御金黄色葡萄球菌感染。本发明的制备方法保证了疫苗抗原四种组分的吸附均一性和稳定性，提高了生产效率，降低了生产成本。
附图说明
图1、为实施例4中SDS-PAGE结果；M：蛋白质分子量标准；1：为实施例4中所配制不含磷酸铝佐剂的同浓度蛋白原液样品；2：为实施例1成品离心沉淀解离后取样样品；3：为实施例1成品离心后上清取样样品；4：为实施例2成品离心沉淀解离后取样样品；5：为实施例2成品离心后上清取样样品；6：为实施例3成品离心沉淀解离后取样样品；7：为实施例3成品离心后上清取样样品。
图2、为实施例6中SDS-PAGE结果；M：蛋白质分子量标准；1：80μgHI蛋白样品；2：120μgHI蛋白样品；3：160μgHI蛋白样品；4：SpA5（KKAA）不含佐剂样品；5：80μgSpA5（KKAA）样品；6：120μgSpA5（KKAA）样品；7：160μgSpA5（KKAA）样品。
图3、为实施例6中SDS-PAGE结果；M：蛋白质分子量标准；1：mSEB蛋白不含佐剂样品；2：80μgmSEB蛋白样品；3：80μgmSEB蛋白样品；4：160μgmSEB蛋白样品；5：MntC蛋白不含佐剂样品；6：80μgMntC蛋白样品；7：120μgMntC蛋白样品；8：160μgMntC蛋白样品。
图4、为实施例7中SDS-PAGE结果；M：为蛋白质分子量标准；1：随机取样1-离心上清取样样品；2：随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3：随机取样2-离心上清取样样品；4：随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5：随机取样3-离心上清取样样品；6：随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
图5、为实施例7中SDS-PAGE结果；M:为蛋白质分子量标准；1：随机取样4-离心上清取样样品；2：随机取样4-离心沉淀解离后取样样品；3：随机取样5-离心上清取样样品；4：随机取样5-离心沉淀解离后取样样品；5：随机取样6-离心上清取样样品；6：随机取样6-离心沉淀解离后取样样品。
图6、为实施例9中SDS-PAGE结果；1：HI蛋白吸附0.5小时后离心上清取样；2：HI蛋白吸附1小时后离心上清取样；3：HI蛋白吸附2小时后离心上清取样；4：HI蛋白吸附4小时后离心上清取样品；5：HI蛋白吸附8小时后离心上清取样；6：SpA5（KKAA）吸附0.5小时后离心上清取样；7：SpA5（KKAA）吸附1小时后离心上清取样；8：SpA5（KKAA）吸附2小时后离心上清取样；9：SpA5（KKAA）吸附4小时后离心上清取样品；10：SpA5（KKAA）吸附8小时后离心上清取样。
图7、为实施例9中SDS-PAGE结果；1：MntC蛋白吸附1小时后离心上清取样；2：MntC蛋白吸附2小时后离心上清取样；3：MntC蛋白吸附4小时后离心上清取样品；4：MntC蛋白吸附8小时后离心上清取样；5：mSEB蛋白吸附1小时后离心上清取样；6：mSEB蛋白吸附2小时后离心上清取样；7：mSEB蛋白吸附4小时后离心上清取样品；8：mSEB蛋白吸附8小时后离心上清取样。
图8、为实施例10中保存4周后SDS-PAGE结果；M:蛋白质分子量标准；1随机取样1-离心上清取样样品；2：随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3：随机取样2-离心上清取样样品；4：随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5：随机取样3-离心上清取样样品；6：随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
图9、为实施例10中保存8周后SDS-PAGE结果；M:为蛋白质分子量标准；1：随机取样1-离心上清取样样品；2：随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3：随机取样2-离心上清取样样品；4：随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5：随机取样3-离心上清取样样品；6：随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
图10、为实施例10中保存12周后SDS-PAGE结果；M:为蛋白质分子量标准；1：随机取样1-离心上清取样样品；2：随机取样1-离心沉淀解离后取样样品；3：随机取样2-离心上清取样样品；4：随机取样2-离心沉淀解离后取样样品；5：随机取样3-离心上清取样样品；6：随机取样3-离心沉淀解离后取样样品。
图11、实施例13的不同时间点各组雄性动物体重变化趋势。
图12、实施例13的不同时间点各组雌性动物体重变化趋势。
具体实施方式
在第一个方面，本发明提供一种疫苗制剂。
在一种实施方式中，本发明的疫苗制剂包括SpA5蛋白；在另一种实施方式中，本发明的疫苗制剂包括SpA5蛋白以及MntC、mSEB和HI蛋白中的一种或多种。
优选地，所述SpA5蛋白序列选自SEQIDNO.1～4任一条序列，即，SpA5蛋白可以是SpA5(KKAA)、SpA5(RRAA)、SpA5(KKVV)或SpA5(RRVV)；MntC蛋白序列如SEQIDNO.5所示；mSEB蛋白序列如SEQIDNO.6所示；HI蛋白序列如SEQIDNO.7所示。进一步优选地，本发明的疫苗制剂中，SpA5蛋白是SpA5(KKAA)或SpA5(RRVV)。
在一种优选的实施方式中，本发明的疫苗制剂中抗原由SpA5、MntC、mSEB和HI蛋白组成。各抗原的浓度范围是10-100μg/ml。优选地，各抗原的浓度是50μg/ml。
优选地，所述疫苗制剂中还包括佐剂，如铝佐剂（磷酸铝或氢氧化铝）。根据现有技术，本领域技术人员容易判断需要哪些试剂来制备疫苗制剂。
上述疫苗制剂为本发明人通过反向疫苗学技术、高通量免疫优势抗原组学技术、高效可溶蛋白表达及纯化技术及大量的动物免疫保护评价实验，从金黄色葡萄球菌全基因组2742个开放阅读框（ORFs）中筛选并鉴定出抗原性强、特异性保守性好、且具有良好保护作用的多个抗原分子。它们包括：α-溶血素（Hla）、铁离子表面决定蛋白B（IsdB）、金葡菌蛋白A（SpA）、肠毒素B（SEB）、锰离子结合蛋白C（MntC）。这些抗原在金黄色葡萄球菌感染致病、免疫逃逸的关键环节均发挥着重要作用。本发明人在对上述抗原的结构分析、分子融合设计、多组分选择、制剂配伍优化基础上，成功制备了含有上述抗原的重组金黄色葡萄球菌疫苗及其组合物。该疫苗在阻断金黄色葡萄球菌生存代谢途径、抑制粘附定植、控制毒素扩散、打破免疫逃逸等方面发挥着重要作用，从而有效的抵御了金黄色葡萄球菌的感染侵袭。
本发明的疫苗抗原组分复杂，抗原蛋白性质各异，直接使用单一抗原蛋白进行单组分疫苗制剂制备的难度较大，方法繁琐，免疫效果不佳，不利于疫苗的产业化制备。同时铝佐剂对不同抗原蛋白的吸附率良莠不齐，吸附均一性存在差异，从而导致疫苗接种剂量偏高，而免疫保护效果不好的现象；并且铝佐剂在制备过程中易发生理化性质的改变，从而导致疫苗制剂的免疫无效。
主要问题包含如下几个方面：①现有技术对于抗原与铝元素配比选择评价指标不统一，为追求达到较高的吸附率使用很高的铝元素量，这不利于受用者健康，并与WHO及《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》的相关要求不符，更不符合制药领域的发展趋势；②现有的制剂成分添加顺序为将抗原蛋白和佐剂分开稀释后吸附，再混合分装，对于单一抗原尚可，但制剂难度和成本会随着抗原组分数量的增加而上升；③为解决前述问题，有的方法提出将佐剂稀释后直接加入抗原，但是却无法保证多种抗原情况下的吸附均一性；④制剂领域缺乏科学严谨的制剂评价体系，现有的技术只针对佐剂的制备方法，而轻视制剂工艺，对于制剂工艺的评估指标仅关注吸附率，更对吸附的方式、吸附效率、吸附均一性及其检测方法、制剂工艺各种参数稳定性等方面完全忽视；⑤现有的组氨酸溶液，虽然对于组氨酸的浓度、pH等参数进行了研究，但是对于不同特性蛋白适用范围存在局限性，有的疫苗制剂工艺虽然加入了吐温等增溶剂，但是由于存在安全隐患等问题，美国FDA批准药物中，吐温的使用已不如以前普遍，而对于新增溶剂的选择却迟迟未见报道；⑥传统制剂工艺采用水平吸附混合的方式，缺乏对疫苗吸附新技术和新设备的创新和开发。
因此，当前有必要对现有的制备疫苗制剂的相关工艺进行改进和创新，能够有效解决上述抗原蛋白吸附率、多组分抗原吸附均一性、稳定性、吸附方式合理有效性等疫苗制备中的关键工艺瓶颈，使得疫苗制剂（尤其是多组分疫苗制剂）的制备工艺更加简便、稳定及高效，并有利于降低生产成本。
因此，在另一方面，本发明提供一种制备多组分疫苗的方法，所述方法将铝佐剂与疫苗抗原蛋白分开稀释后再混合和/或吸附，具体为：
方法1：将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的用疫苗稀释液稀释后的铝佐剂溶液混合，分别吸附后再将多种蛋白溶液混合均匀后分装；
①根据铝佐剂溶液铝元素浓度（5.3mg/ml）以及疫苗成品中铝元素终浓度（0.71mg/ml），计算所需铝佐剂溶液量并准确量取，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据所需体积计算所需蛋白量，准确量取所需单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的12.5%，充分混匀；
③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附1小时，环境温度控制在4℃-37℃范围内。
④吸附后再将四种组分蛋白溶液混合均匀即得。
方法2：将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，再将多种蛋白溶液混合后共同吸附后分装；
①根据铝佐剂溶液铝元素浓度（5.3mg/ml）以及疫苗成品中铝元素终浓度（0.71mg/ml），计算所需铝佐剂溶液量并准确量取，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据所需体积计算所需蛋白量，准确量取所需单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的12.5%，充分混匀；
③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，再将四种组分蛋白溶液混合，以14rpm转速，垂直混悬吸附1小时，环境温度控制在4℃-37℃范围内。
方法3：将多种疫苗抗原蛋白组分混合后使用疫苗稀释液稀释，混匀后与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，吸附后分装；
①根据铝佐剂溶液铝元素浓度（5.3mg/ml）以及疫苗成品中铝元素终浓度（0.71mg/ml），计算所需铝佐剂溶液量并准确量取，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据所需体积计算所需蛋白量，量取所需四种重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，将其加入到配制瓶中；疫苗稀释液，定容至疫苗制剂终体积的50%，充分混匀；
③将等体积的稀释后蛋白溶液与稀释后的佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附1小时，环境温度控制在4℃-37℃范围内。
优选地，所述垂直混悬方式可以用水平混悬方式替代。
优选地，稀释后铝佐剂溶液与稀释后疫苗抗原蛋白溶液的添加比例为1:1。
优选地，所述铝佐剂是磷酸铝或氢氧化铝佐剂。
优选地，所述抗原蛋白与铝元素质量比为1:1.98，吸附率即可达到90%～100%。
优选地，使用的疫苗稀释液为组氨酸缓冲液，包括组氨酸（优选浓度10mmol/L）、泊洛沙姆188（优选0.02%）、氯化钠（优选浓度0.9%），pH值优选为6.0。
本发明方法制备的疫苗制剂在4℃至37℃范围内，稳定性在8周以上。
本发明提供的方法的功效包括：
①针对现有制剂评价体系的缺乏和不完善，本发明对已有验证指标进行了科学的优化，除传统的吸附率外，还提出了质量配伍比、吸附效率、稳定性、均一性及其检测方式等指标，以及前述各项参数的稳定性，创新性的确立了以吸附率、吸附效率、质量配伍比、均一性、稳定性为主要指标的一整套制剂工艺评价体系，能够科学、准确、快速的评估制剂工艺的效果（注：吸附效率指达到目的吸附率、均一性等指标所用的最短时间）；
②本发明采用质量配伍比，可准确科学的描述吸附效率和铝元素用量，本发明在吸附率达到90%～100%情况下，抗原与铝元素质量比为1:1.98，远低于现有报道的1:45，这意味着吸附相同量的蛋白，使用铝元素量越低，有效的减少了铝元素的使用量，有利受用者健康，更符合WHO及《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》的相关要求；
③本发明采用的独特制剂工艺步骤，可有效降低实施多种抗原组分疫苗制剂制备的难度和成本；
④本发明采用的特有制剂工艺，可保证制剂的均一性及稳定性；
⑤对于疫苗稀释液，本发明优化了组氨酸缓冲体系及各种参数，并优选的加入了泊洛沙姆188作为助溶剂，增加了疫苗稀释液的适用范围的同时降低了副作用风险；
⑥对于现有的制剂方式和设备，本发明独创性的提出了垂直混悬的吸附方式和相应的垂直混悬设备，该设备已成功申请国家实用新型发明（授权专利号201220314436.4）。
综上所述，本发明通过各种改进和创新，将现有的制剂工艺进行优化及改进，减少了工艺流程，降低了工艺成本，提高了生产效率。通过研究制剂成分的工艺步骤、创新吸附工艺方式、以及调整疫苗稀释液组成配方等方式，提高了抗原蛋白吸附率和配伍比，有效保证了疫苗抗原蛋白各组分的吸附均一性，并防止铝佐剂在制剂过程中发生理化性质改变，降低铝元素使用量，提高生产效率，降低了生产成本。完善了现有工艺评价指标，使用了新的评价指标和相应检测方法，创新性的提出了一整套科学严谨的制剂评价体系，填补了制剂领域的一项重大空缺。
以下实施例中所使用的抗原蛋白与各种试剂如下：
1.抗原蛋白
重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白由重庆原伦生物科技有限公司、中国人民解放军第三军医大学提供；抗原蛋白包括本发明的SpA5(KKAA)、HI、mSEB和MntC四种。
2.试剂
SDS-PAGE、HPLC等所需试剂和仪器由重庆原伦生物科技有限公司提供；
疫苗蛋白稀释液：组氨酸（美国Merck公司，药用级）10mM、NaCl0.9%（四川科伦，注射用生理盐水）、泊洛沙姆188（美国Merck公司，药用级）0.01%、pH6.0，无热原；
PBS：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g（国产分析纯），磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.9g（国产分析纯），氯化钠(NaCl)8.0g（国产分析纯），氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.4；
磷酸铝佐剂（铝元素浓度5.3mg/ml）为美国GENERALCHEMICAL公司原装进口产品。
3.仪器
疫苗制剂使用的大型垂直混悬仪为自主知识产权，委托上海格氏公司生产。
4.菌株
金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；
实施例1：配制重组金黄色葡萄球菌四组分疫苗（1920ml）
①量取磷酸铝佐剂256ml，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液704ml，加入配制瓶中，总体积为960ml，充分混匀；
②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，因此，根据各抗原蛋白的初始浓度量取各蛋白：HI蛋白96ml，加入疫苗稀释液144ml；SpA5（KKAA）蛋白48ml，加入疫苗稀释液192ml；mSEB蛋白60ml，加入疫苗稀释液180ml；MntC蛋白60ml，加入疫苗稀释液180ml；分别将各蛋白及其对应的疫苗稀释液加入到各自的配制瓶中，充分混匀；
③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附1小时，环境温度控制在4℃-37℃范围内；
④吸附后再将四种蛋白溶液混合均匀后作为疫苗制剂。
实施例2：配制重组金黄色葡萄球菌四组分疫苗（1200ml）
①量取磷酸铝佐剂160ml，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液440ml，加入至配制瓶中，总体积为600ml，充分混匀；
②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml；根据该要求计算所需蛋白质体积并量取对应的蛋白溶液：HI蛋白60ml，加入疫苗稀释液90ml；SpA5（KKAA）蛋白30ml，加入疫苗稀释液120ml；mSEB蛋白37.5ml，加入疫苗稀释液112.5ml；MntC蛋白37.5ml，加入疫苗稀释液112.5ml；将各蛋白及对应体积的稀释液分别加入到各自的配制瓶中，充分混匀；
③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，再将四种蛋白溶液混合，以14rpm转速，垂直混悬吸附1小时，环境温度控制在4℃-37℃范围内。
实施例3：配制重组金黄色葡萄球菌四组分疫苗（600ml）
①量取磷酸铝佐剂80ml，将其加入到配制瓶中；量取疫苗稀释液220ml，加入至配制瓶中，总体积300ml，充分混匀；
②重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的终浓度为0.2mg/ml，单一组分重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白终浓度为0.05mg/ml，根据各蛋白的初始浓度计算所需各蛋白量：HI蛋白所用体积为30ml，SpA5（KKAA）蛋白所用体积为15ml，mSEB蛋白所用体积为18.75ml，MntC蛋白所用体积为18.75ml；量取对应体积的四种蛋白加入到配制瓶中，再量取疫苗稀释液217.5ml加入至配制瓶中，总体积300ml，充分混匀；
③将等体积的稀释后蛋白溶液与稀释后的佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附1小时，环境温度控制在4℃-37℃范围内。
实施例4：SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白磷酸铝佐剂吸附均一性与完全性
①分别从实施例1-3的疫苗制剂中取样1ml，4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40μl；
②补入与上清等体积的解离液（1MNa2CO3）至离心沉淀物中，重悬后于室温条件下，垂直混悬1小时，取样40μl；
③按照实施例3中配制方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液，磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足，充分混匀后取样40μl；
④向所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10μl上样；
⑤进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图1，结果显示：三种方法磷酸铝佐剂均能充分吸附蛋白，且吸附效果无显著差异，但是方法二、三制剂工艺步骤均较方法一简化，而如果多种抗原成分按照方法一进行制剂，每个抗原成分均需要吸附、混合仪器各一套，且不能共用，所需要的仪器设备是方法二、三的数倍。
实施例5：重组金黄色葡萄球菌疫苗质量配伍比的研究
①量取磷酸铝佐剂溶液720μl（铝元素浓度为5.3mg/ml），将其加入到配制瓶中，再加入疫苗稀释液6.48ml，充分混匀，等体积均分为12等分，每份600μl，含磷酸铝60μl，铝元素318μg；
②依据每个抗原蛋白使用剂量递增原则，分为80μg、120μg、160μg三组，4个抗原蛋白共计12组，根据每个蛋白浓度计算所需体积，以此加入对应容器中，再以疫苗稀释液定容至600μl；
③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附1小时，环境温度控制在4℃-37℃范围内。
实施例6：SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗质量配伍比
①将实施例5中12个样品，4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从各上清取样40μl；
②按照实施例20中配制方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液，磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足，充分混匀后取样40μl；
③将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10μl上样；
④进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图2、3，结果显示：对于蛋白HI、SpA5（KKAA）和MntC，318μg铝元素即可100%吸附160μg蛋白，而100%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1：1.9875；对于mSEB蛋白，318μg铝元可100%吸附80μg蛋白，90%吸附160μg，100%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1:3.975，90%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1：1.9875。故而可以认为对于重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白，90～100%吸附率蛋白铝元素质量配伍比为1：1.9875。
同时需要指出的是，如果对配伍比不加限定，仅仅描述体积，而忽略质量的话，蛋白铝元素配伍比将会更低，甚至达到1：1以下。
实施例7：SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗均一性
①将实施例3中吸附混匀完毕后的溶液中随机取样6个，取样位置和时间完全随机，每个样品取样1ml；
②4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40μl；
③补入与上清等体积的解离液至离心沉淀物中，重悬后室温条件下，垂直混悬1小时，取样40μl；
④将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10μl上样；
⑤进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图4、5，结果显示：所取样品的离心上清中均未见条带，离心沉淀解离后，条带位置、灰度、面积均相同，说明每个随机取样点佐剂所吸附的抗原蛋白量和种类完全相同，即为制剂工艺吸附均一性完全一致。
实施例8：重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白制剂吸附率与吸附效率
①量取磷酸铝佐剂溶液1.2ml（铝元素浓度为5.3mg/ml），将其加入到配制瓶中，再加入疫苗稀释液10.8ml，充分混匀，等体积均分为20等份，每份600μl，含磷酸铝60μl，铝元素318μg；
②依据每个抗原蛋白吸附时间倍增的原则，分为0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时，共20组，根据每个蛋白浓度计算所需体积，以此加入对应容器中，再以疫苗稀释液定容至600μl；
③将稀释后单一组分蛋白溶液与等体积的稀释后佐剂溶液加入至分装瓶中，以14rpm转速，垂直混悬吸附至设定时间后停止吸附并处理样品，环境温度控制在4℃-37℃范围内。
实施例9：SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗制剂吸附率与吸附效率
①将实施例8中20个样品，4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从各上清取样40μl；
②将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10μl上样；
③进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80v下电泳20分钟，再调至180v电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图6、7，结果显示：对于重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白，吸附2小时即可达到100%吸附率，吸附1小时可达到90%以上的吸附率，故而重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白90～100%吸附率的吸附效率为1小时。
实施例10：SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗稳定性
①将实施例3中吸附混匀完毕后的溶液按1ml每只进行分装，灌装至无菌2ml西林瓶中压盖密封后37℃保存；
②每4周随机取样3只，样品4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40μl；
③补入与上清等体积的疫苗解离液至离心沉淀物中，重悬后室温条件下，垂直混悬1小时，取样40μl；
④将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10μl上样；
⑤进行12%SDS-PAGE电泳，先在电压80V下电泳20分钟，再调至180V电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图8、9、10，结果显示：所取样品的离心上清中均未见条带，离心沉淀解离后，条带位置、灰度、面积均相同，说明每个随机取样点佐剂所吸附的抗原蛋白量和种类完全相同，除了再次证明了制剂的均一性外，还揭示了制剂的稳定性，包括吸附率的稳定性、均一性的稳定性、抗原蛋白的稳定性。
经试验结果验证，37℃的加速温度条件下，本发明的制剂稳定性至少可维持12周不变，再次证明了本制剂工艺的有效性和稳定性。
实施例11：不同组分疫苗的免疫效价和攻毒保护
选择SpA5（KKAA）作为候选抗原，与HI、MntC、mSEB进行单价、双价、三价及四价组合，制备成多组分疫苗，对小鼠进行进一步的动物免疫后抗体效价评估。取血清作ELISA检测，结果见表1。
然后进行攻毒保护实验（免疫及攻毒保护同实施例12），从V34到V39进行六轮实验，每组6周龄Balb/C小鼠(北京华阜康)20只。肌注免疫，蛋白量为每种组分30μg。攻毒试验的过程为：将各疫苗分别三次股四头肌肌注（0、14、21天）免疫；末次免疫后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射金黄色葡萄球菌MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×109CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果见表2。
表1：ELISA检测不同组分中各种蛋白免疫小鼠后抗体滴度
表2：不同组分疫苗免疫小鼠后的攻毒保护评价结果
结果说明单价组以SpA5（KKAA）的效果最好；在二价组中，有SpA5的免疫组都能大幅度提高生存率；有SpA5的三价组（mSEB+SpA5+MntC）又进一步提高了保护效果；而含SpA5的四组分疫苗对攻毒动物的免疫保护效果最佳。
实施例12、动物免疫程序的优化
为了让重组金黄色葡萄球菌疫苗更加适用于临床的需要，对确定的最终疫苗组分HI＋MntC+mSEB+SpA5(每种组分30μg)进行如下表的免疫程序优化。
使用动物同实施例11，每种疫苗免疫分组策略设疫苗蛋白稀释及实验组，每组30只，免疫程序如表3所示。
表3：免疫程序
攻毒保护效果如表4所示。
表4：不同免疫程序的动物攻毒保护效果
结果说明，第0、3、7天的免疫程序使攻毒后动物获得了最好的保护效果，也更有利于临床应用。通过此实验更进一步证实了四组分重组金黄色葡萄球菌疫苗的有效性。
实施例13、小鼠急性毒性试验
委托昭衍（苏州）新药研究中心有限公司进行，以下同。
1）供试品、佐剂对照、阴性对照品
①供试品
名称：重组金黄色葡萄球菌疫苗
浓度/含量：总抗原120μg/0.6mL，其中含HI：30μg/0.6mL；SpA5：30μg/0.6mL；MntC：30μg/0.6mL；mSEB：30μg/0.6mL。
②佐剂对照
名称：重组金黄色葡萄球菌疫苗佐剂对照品
提供单位：重庆原伦生物科技有限公司
批号：20130516
铝含量：0.72mg/mL。
③阴性对照
名称：氯化钠注射液
生产单位：江苏亚邦生缘药业有限公司
批号：12120104。
2）实验动物：ICR小鼠（SPF级，昭衍（苏州）新药研究中心有限公司）
数量：40只（每组20只，雌雄各半）
给药频率：单次给药
给药途径：肌肉注射给药
给药量：10mL/kg
表5：急性毒性试验分组及给药安排
注：本试验中供试品剂量组给予的总抗原量为6000μg/kg，是临床拟用剂量的3000倍。
3）试验结果
试验期间，各组动物均未出现死亡和濒死情况。各组动物临床观察均未见异常反应，与同期同性别阴性对照组相比，各组动物的体重与食量未见与给药相关的毒理学意义的规律性改变。结果见图11和12所示。
病理检查：所有动物安乐死后大体观察时未见与给药相关的明显异常改变；对所有动物进行大体解剖，仅可见阴性对照组两只雌性动物子宫（双侧）肿胀，为正常生理周期性改变。
实施例14、豚鼠的全身主动过敏试验
1）供试品、佐剂对照、阴性对照品同实施例13。
阳性对照
名称：人血白蛋白
批号：201206043
生产单位：上海生物制品研究所有限责任公司
选择理由：本品为已知的豚鼠致敏阳性物质。
2）实验方法
实验动物：Hartley豚鼠（SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司）
数量：24只（每组6只，雌雄各半）
给药方式：致敏肌肉注射给药，激发足部静脉注射给药。
表6：试验分组及给药安排
表7：给药剂量设计
注：供试品致敏的低、高剂量组分别为30μg/kg、300μg/kg，分别相当于临床拟用剂量的15倍和150倍。
3）实验结果：致敏期间，所有动物均未见异常反应
表8：激发后各组动物过敏反应情况总结
在本试验条件下，重组金黄色葡萄球菌疫苗以0.1剂/只（相当于临床拟用剂量的15倍）和1剂/只（相当于临床拟用剂量的150倍）（每剂总蛋白含量为120μg）肌肉注射致敏，并分别以0.2剂/只和2剂/只静脉注射激发，可导致豚鼠发生速发型过敏反应。此结果符合常规精制蛋白疫苗（如破伤风疫苗、白喉疫苗等）引起豚鼠过敏反应的特点。
实施例15、重复肌肉注射给予SD大鼠4周和恢复期4周的毒性试验
1）供试品、佐剂对照、阴性对照品同实施例13；
2）试验方法
实验动物：SD大鼠（SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司）
给药途径：肌肉注射
给药频率及周期：D1、D15、D22和D29每天给药1次，共4次。
表9：实验安排
a.临床拟用剂量为0.6mL/支/次/人，大鼠给药剂量单位为“剂/只”，1剂相当于临床1次接种剂量。
b.上表中给药容量为理论给药容量，实际给药容量保存在原始记录中。
c.前10只/性别/组用于4周给药后（D32）的解剖，后5只/性别/组用于4周恢复期结束后（D57）的解剖。
d.卫星组动物采血仅用于抗体和细胞因子等测定，获得的其他数据保留在原始资料中但不用报告。
3）试验结果
表10：临床观察（D1～D32）
1组为阴性对照组；2组为佐剂对照组；3组为供试品低剂量组；4组为供试品中剂量组；5组为供试品高剂量组
表11：动物临床观察（D32～D57）
1组为阴性对照组；2组为佐剂对照组；3组为供试品低剂量组；4组为供试品中剂量组；5组为供试品高剂量组
表12：雄性动物血细胞计数总结表（末次药后3天，D32）
1组为阴性对照组；2组为佐剂对照组；3组为供试品低剂量组；4组为供试品中剂量组；5组为供试品高剂量组
表13：雌性动物血细胞计数总结表（末次药后3天，D32）
1组为阴性对照组；2组为佐剂对照组；3组为供试品低剂量组；4组为供试品中剂量组；5组为供试品高剂量组
体温、T淋巴细胞亚群、血生化测定结果测定显示：与阴性对照组比，供试品各剂量组动物上述指标未见有毒理学意义的异常改变。
与阴性对照组比，雄性动物脏器重量、脏体比及脏脑比指标均未见与供试品相关毒理学意义的异常改变。
第57天时供试品各剂量组都能检测到各组组分的抗体。
表14：血清IgG抗体检测（HI）
表15：血清IgG抗体检测（MntC）
表16：血清IgG抗体检测（mSEB）
表17：血清IgG抗体检测（SpA5(KKAA)）
实施例16、重复肌肉注射给予食蟹猴4周和恢复期4周的毒性试验
1）供试品、佐剂对照、阴性对照品同实施例13。
2）试验方法
实验动物：食蟹猴（普通级，海南灵长实验动物开发有限公司）
给药途径：肌肉注射
给药频率及周期：D1、D15、D22和D29每天给药1次，共4次。
表18：实验安排
a.临床拟用剂量为0.6mL/支/次/人，猴给药剂量单位为“剂/只”，1剂相当于临床1次接种剂量；
b.上表中给药容量为理论给药容量，实际给药容量保存在原始记录中；
c.每组动物的前2只/性别/组用于末次给药后3天的解剖，后2只/性别/组用于4周恢复期结束后的解剖。
3）试验结果：
表19：临床观察（D1～D32）
体重、体温、T淋巴细胞亚群、血细胞、血生化测定结果测定显示：与阴性对照组相比，未见与供试品相关的毒理学意义的异常改变。
表20：ELISPOT结果（D18）
1组为阴性对照组；2组为佐剂对照组；3组为供试品低剂量组；4组为供试品低中量组；5组为供试品高剂量组
实施例17、重复肌肉注射给予SD大鼠生殖发育毒性试验
1）供试品、佐剂对照、阴性对照品同实施例13；
2）试验方法：
动物：SD大鼠（SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司）
表21：实验安排
注：每组前28只雌性动物用于正常分娩至泌乳期结束，后28只用于妊娠第20天（GD20）解剖进行胎仔检查。
给药频率与期限：雄鼠于交配前给药3次，分别在D1、D15和D22；雌鼠于交配前给药3次，分别在D1、D15和D22。雌雄鼠于雄鼠给药结束后1周开始同笼交配，雌鼠于妊娠第6天（GD6）给药1次。
3）试验结果
与阴性对照组比较，供试品各剂量组动物体重均未见有毒理学意义的异常改变。
与阴性对照组比较，供试品各剂量组动物食量均未见有毒理学意义的异常改变。
表22：亲代雌雄鼠生殖能力
亲代雄鼠检测指标：
表23：亲代雄鼠脏器重量和脏器系数
亲代雄鼠精子活动度和精子计数检查：与阴性对照组比较，供试品各剂量组雄鼠精子活动度、精子前向运动率、平均速率、直线运动速率、曲线运动速率、精子头侧摆幅度、鞭打频率、前向性、直线性、伸张度和附睾尾精子计数均未见统计学差异（P>0.05）。
亲代雄鼠精子形态学检查：与阴性对照组比较，供试品高剂量组动物精子无头畸形率、无钩畸形率、头不定形畸形率、无尾畸形率、折叠畸形率、卷尾畸形率、钩弯曲过度畸形率及其精子总畸形率均未见统计学差异（P>0.05）。
表24：亲代雌鼠（GD20剖检）剖宫产检查
表25：胎仔检查
与阴性对照组比较，供试品各剂量组胎仔外观畸形率和胎盘异常率均未见统计学差异（P>0.05）
表26：胎仔骨骼检查
| 阴性对照组(0剂/只) | 供试品高剂量组(3剂/只) | |
| 检查窝数 | 23 | 22 |
| 检查胎仔数 | 166 | 163 |
| 左侧中手骨 | 3.41±0.32 | 3.50±0.33 |
| 右侧中手骨 | 3.41±0.32 | 3.48±0.33 |
| 左侧中足骨 | 3.98±0.05 | 4.00±0.02 |
| 右侧中足骨 | 3.99±0.05 | 4.00±0.02 |
| 胸骨数 | 5.46±0.56 | 5.42±0.65 |
| 骶尾椎数 | 7.33±0.46 | 7.36±0.68 |
| 骨骼异常率(%) | 5.21±10.23 | 2.24±4.91 |
| 骨骼变异率(%) | 14.72±18.28 | 11.02±17.53 |
表27：胎仔内脏检查
| 阴性对照组(0剂/只) | 供试品高剂量组(3剂/只) | |
| 检查窝数 | 24 | 22 |
| 检查胎仔数 | 161 | 150 |
| 内脏异常率(%) | 0.60±2.92 | 0.76±3.55 |
| 内脏变异率(%) | 27.41±23.21 | 28.78±24.12 |
F1代仔鼠检测内容：
·F1代仔鼠存活情况；
·F1代仔鼠体重和性别比；
·F1代仔鼠外观畸形；
·F1代仔鼠身体发育指标检查；
·F1代仔鼠反射发育指标检查；
·与阴性对照组比较，供试品各剂量组F1代仔鼠各项指标均未见统计学差异（P>0.05）。
结果：
·对亲代雌雄鼠生育力、妊娠/哺乳雌鼠未见明显不良反应，
·未见胚胎-胎仔发育毒性和致畸性，
·对F1代仔鼠身体发育和反射发育指标未见明显影响。
实施例18、检测重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫大鼠后抗体血清介导的体外调理吞噬金黄色葡萄球菌的能力
抗体通过IgG(IgG1和IgG3)的Fc段与中性粒细胞表面的IgGFcR结合，IgM的Fc段通过激活补体系统与吞噬细胞表面的IgMFcR结合，促进中性粒细胞及吞噬细胞胞吞及杀灭细菌等颗粒性抗原的作用。
1、抗体来源：实施例15大鼠血清。
2、设备用具清单：
细胞培养箱，超净工作台，低速离心机，低温冷冻离心机，蛋白纯化仪，超低温冰箱；全温摇床（Thermo，Ilcermo481）；核酸蛋白分析仪（SmartSpecTMplusBD）；OD管(BD)；冷冻离心机（Thermoscientific,SORVAILST40RCentrifuge）。
3、试剂：
MH（A）细菌培养板；生理盐水；IMDM培养基；胎牛血清（Gibco）；含Ca2＋、Mg2 ＋的Hanks液（Gibco）；不含Ca2＋、Mg2＋的Hanks液；RPMI-1640培养液（Gibco）；二甲基甲酰胺（DMF）；无菌水；PBS。
4、操作程序
4.1HL-60细胞（人早幼粒白血病细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所）的培养和分化
将HL-60细胞于一次性细胞培养瓶中加入含20%胎牛血清的IMDM（Gibco）培养基培养，使HL-60细胞稳定生长。将成熟的HL-60细胞以4×105个/ml的浓度培养于含0.8％DMF的完全培养液（IMDM+20%FBS）中分化4天。
4.2MRSA252细菌工作种子批的制备：
4.2.1MRSA252细菌的培养与冻存
三线法接种细菌于MHA固体培养平板，做好标记，放入37摄氏度孵箱培养过夜。次日取出MHA固体培养平板，挑单菌落接种于装有20mlMHB培养基的摇瓶，编号并做好标记，放入温控摇床，设置温度为37摄氏度，转速为220/rpm。扩大培养6小时。定量浓度后按照菌液与50%甘油1:1比例保种，-70°冻存。
4.2.2冻存细菌工作稀释度的确定
取1支冻存的500μlMRSA252细菌工作种子，在37℃水浴中解冻，用调理吞噬缓冲液（含Ca2＋、Mg2＋的Hanks液）洗涤2次，12000r／min离心2min。用500μl的调理吞噬缓冲液悬浮菌体，5倍系列稀释为8个稀释度，每个稀释度取10μl菌悬液，分别加入96孔U底板的8个孔中（每孔预先加有20μl调理吞噬缓冲液），室温下700rpm/min振荡培养30min。
吸取预先用含Ca2＋、Mg2＋的Hanks液和不含Ca2＋、Mg2＋的Hanks液洗涤两次的HL-60分化细胞（浓度为4×105个／ml），每孔加入40μl，再加10μl补体，于37℃，5％CO2，700rpm/min条件下振荡培养45min，冰浴20min，在MHA平板上涂板。根据预实验结果，本实验选择理想菌落数（120CFU／Spot）即第五个稀释度为细菌工作稀释度。
4.3补体采集及筛选：
取青紫蓝系乳兔（第三军医大学动物实验中心），心脏采血获得补体，-70℃冻存。
取-70℃冻存的补体1支，于室温下解冻，56℃水浴中灭活30min，4℃保存待用。用含Ca2＋、Mg2＋的Hanks液和不含Ca2＋、Mg2＋的Hanks液洗涤2次HL-60分化细胞（1200r／min，离心5min），加入适量体积的调理吞噬缓冲液，将细胞浓度调整为1×107个/ml，室温保存待用。
取1支MRSA252细菌工作种子冻存物，5倍系列稀释为8个稀释度。期间再取同批次冷冻保存的补体1支，室温下融解，于前8孔中每孔加入10μl补体，并加入40μlHL-60分化细胞，后8孔每孔分别加入10μl上述灭活的补体和40μlHL-60分化细胞，于37℃，5％CO2，700rpm／min条件下振荡培养45min，冰浴20min后点样。次日计数存活菌落，计算该批次补体的非特异性杀伤率（Non-specifickilling，NSK）。补体的非特异性杀菌率（％）＝［（对照B-对照A）/对照A］×100％。其中对照A为MRSA和热灭活补体、HL-60细胞共同培育45min后存活的菌落数，对照B为MRSA和补体、HL-60细胞共同培育45min后存活的菌落数。根据本实验结果，本批次补体的非特异性杀伤率为39％，符合实验要求。
4.4调理吞噬试验：
4.4.1在56℃水浴中30min灭活所有待测血清，每孔20μl。对照孔不加血清，以20μl调理吞噬缓冲液代替。每孔加入HL-60细胞40μl，补体10μl，菌悬液10μl，于37℃，5％CO2，700rpm/min条件下振荡培养45min，冰浴20min后取10μl涂板。次日计数存活菌落。
4.4.2计数：对MHA培养板上的菌落数计数。
4.4.3统计方法：采用3个复板的平均菌落数计算每种抗体的杀菌率，组间比较采用t检验。
5、结果判定：
对照组为MRSA252和补体、HL-60细胞共同孵育后存活的菌落数。
实验组为MRSA252和抗体、补体、HL-60细胞共同孵育后存活的菌落数。
抗体的杀菌率=［（对照组-实验组）/对照组］×100％。
6、实验结果：
表28：重组金黄色葡萄球菌疫苗重复肌肉注射免疫大鼠血清杀菌抗体个体数据
注：“-”表示中和抗体检测结果判断为阴性。
本表剂量及动物号源于实施例15中的表9。
由表可看出疫苗免疫后的大鼠血清抗体有明显的杀菌活性。
实施例19：检测重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫食蟹猴后抗体血清介导的体外调理吞噬金黄色葡萄球菌的能力
抗体来源：实施例16食蟹猴血清；
实验方法同实施例18。
表29：重组金黄色葡萄球菌疫苗重复肌肉注射免疫食蟹猴血清杀菌抗体个体数据
注：“-”表示杀菌抗体检测结果判断为阴性。
本表剂量及动物号源于实施例16表18。
由表可看出疫苗免疫后的食蟹猴血清抗体有明显的杀菌活性。
实施例20、其它SpA5蛋白作为抗原的效果
1、将SpA5(KKAA)及SpA5(RRVV)按实施例3制成单价疫苗。
2、实验动物及分组：
使用雌性6周龄BALB/C小鼠（北京华阜康）。设疫苗稀释液、磷酸铝佐剂对照组、SpA5(KKAA)及SpA5(RRVV)四组，每组30只。
3、将各疫苗分别以30μg/100μl分三次股四头肌肌注（0、14、21天）免疫。
4、攻毒：末次免疫，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×109CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。
5、结果见表30。
表30：不同SpA5蛋白免疫小鼠后的攻毒保护能力
| 组别 | 10天后存活数（只） | 生存率 |
| 疫苗稀释液 | 4 | 13% |
| AlPO4 | 6 | 20% |
| SpA5(KKAA) | 11 | 37% |
| SpA5(RRVV) | 12 | 40% |
由表可知，SpA5（RRVV）的抗原性与SpA5(KKAA)相当，甚至更好。基于上述实验，本领域技术人员可以毫无疑义地知道，本发明的四种SpA5蛋白都可以作为疫苗抗原使用，实现本发明的目的。
Claims (12)
1.一种金黄色葡萄球菌疫苗制剂，包括SpA5蛋白，所述SpA5蛋白序列选自SEQIDNO.1～4中任一条。
2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中还包括MntC、mSEB和HI蛋白中的一种或多种，所述MntC蛋白序列如SEQIDNO.5所示，mSEB蛋白序列如SEQIDNO.6所示，HI蛋白序列如SEQIDNO.7所示。
3.根据权利要求2所述的疫苗制剂，其中，疫苗制剂的抗原成分由SpA5、MntC、mSEB和HI蛋白组成；各抗原的浓度范围是10-100μg/ml。
4.根据权利要求3所述的疫苗制剂，其中，所述各抗原的浓度是50μg/ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗制剂，还包括铝佐剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗制剂，其中，所述铝佐剂是磷酸铝佐剂或氢氧化铝佐剂。
7.一种制备如权利要求1-6任一项所述的疫苗制剂的方法，所述方法将铝佐剂与疫苗抗原蛋白分开稀释后再混合和/或吸附，具体为：
(1)将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的用疫苗稀释液稀释后的铝佐剂溶液混合，分别吸附后再将多种蛋白溶液混合均匀后分装；
(2)将单一疫苗抗原蛋白组分分别用疫苗稀释液稀释，分别与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，再将多种蛋白溶液混合后共同吸附后分装；或者
(3)将多种疫苗抗原蛋白组分混合后使用疫苗稀释液稀释，混匀后与等体积的稀释后铝佐剂溶液混合，吸附后分装。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述铝佐剂是磷酸铝或氢氧化铝佐剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，抗原蛋白与铝元素质量比为1:1.98。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述吸附方式为垂直混悬吸附或水平混悬吸附；混悬时间为1小时，温度为4℃-37℃。
11.根据权利要求7-10任一项所述的方法，其中，所述疫苗稀释液为组氨酸缓冲液，包括组氨酸、泊洛沙姆188、氯化钠，pH值为6.0。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述疫苗稀释液为：10mmol/L组氨酸、0.02％泊洛沙姆188、0.9％氯化钠，pH值为6.0。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310665062.XA CN103705914B (zh) | 2013-12-09 | 2013-12-09 | 一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310665062.XA CN103705914B (zh) | 2013-12-09 | 2013-12-09 | 一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103705914A CN103705914A (zh) | 2014-04-09 |
| CN103705914B true CN103705914B (zh) | 2016-04-20 |
Family
ID=50399500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310665062.XA Active CN103705914B (zh) | 2013-12-09 | 2013-12-09 | 一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103705914B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105999260B (zh) | 2016-05-13 | 2019-12-10 | 四川大学 | 氢氧化铝凝胶-氯化钠复合免疫佐剂及其制备方法和用途 |
| CN110343633A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-10-18 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法 |
| CN110295123A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-10-01 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法 |
| CN110256556A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-20 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌人免疫球蛋白及制备方法 |
| CN115105588B (zh) * | 2021-03-23 | 2024-03-15 | 成都威斯克生物医药有限公司 | 一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法及应用 |
| CN113069538B (zh) * | 2021-03-24 | 2023-05-23 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种制备重组金黄色葡萄球菌疫苗的方法 |
-
2013
- 2013-12-09 CN CN201310665062.XA patent/CN103705914B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Nontoxigenic protein A vaccine for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in mice;Hwan Keun kim et al,;《J.Exp.Med》;20100830;第207卷(第9期);第1863-1870页 * |
| Staphylococcus aureus Manganese Transport Protein C is a Highly Concerved Cell Surface Protein That Elicits Protective Immunity Against S.aureus and Staphylococcus epidermidis;Anderson et al;《J.Infect Dis》;20100402;第205卷;摘要部分 * |
| 参考赵莉群等，重组金黄色球菌肠毒素B蛋白疫苗的制备及免疫效果评价;赵莉群等;《中国优秀硕士论文全文数据库医药卫生科技辑》;20120415;全文 * |
| 金黄色葡萄球菌α－溶血素亚单位疫苗在小白鼠模型的免疫效力评价;张海燕等;《中国生物工程杂志》;20091231;第29卷(第11期);第17－22页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103705914A (zh) | 2014-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103705914B (zh) | 一种金黄色葡萄球菌疫苗及其制备方法 | |
| Macher et al. | Complement depletion in cryptococcal sepsis | |
| Sompolinsky et al. | Encapsulation and capsular types in isolates of Staphylococcus aureus from different sources and relationship to phage types | |
| SU1487802A3 (ru) | Способ получения липосом | |
| CN103695508B (zh) | 金黄色葡萄球菌hi重组蛋白的发酵和纯化工艺 | |
| CN104857524B (zh) | 使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物 | |
| CN102967710B (zh) | 小反刍兽疫抗体检测的竞争elisa试剂盒及其制备方法 | |
| CN110974958B (zh) | 一种抗pd-l1单克隆抗体的注射制剂 | |
| EP3101027A1 (en) | Staphylococcus aureus spa5 mutant, composition comprising mutant and preparation method and use thereof | |
| CN103694323A (zh) | 金黄色葡萄球菌MntC重组蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN103182076A (zh) | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法 | |
| Christodoulides et al. | Spirochetal lipoproteins and immune evasion | |
| CN114616324A (zh) | 包含调节性t细胞的组合物及其制备和使用方法 | |
| WO2023116374A1 (zh) | 带状疱疹疫苗组合物 | |
| CA3070016A1 (en) | Il-15 protein complex pharmaceutical composition and uses thereof | |
| CN101573135B (zh) | 犬莱姆病疫苗 | |
| CN106729623A (zh) | 一种包载重组抗肿瘤蛋白TmSm的mPEG‑PLGA纳米颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN103694321B (zh) | 金黄色葡萄球菌mSEB突变体及其制备方法和应用 | |
| CN103906760A (zh) | 用作抗原掩蔽剂的人乳铁蛋白衍生肽 | |
| Redd et al. | Circulating and storage neutrophils in septic neonatal rats treated with immune globulin | |
| CN106029683A (zh) | 一种抑制肿瘤转移和治疗白血病的多肽和多肽复合物、其制备方法及其应用 | |
| CA3104783A1 (en) | Antibody inducing immune tolerance, induced lymphocyte, and cell therapy agent therapeutic method using induced lymphocyte | |
| Manieson et al. | The use of polyazolidineammonium and dimethyl-sulfoxide antigen Yersinia pseudotuberculosis to obtain hyperimmune serum | |
| Young et al. | Infections in recipients of hematopoietic stem cell transplants | |
| CN101234089B (zh) | 碱性成纤维细胞生长因子脂质体疫苗及其制备方法和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160222 Address after: 611731 No. 99 Tian Xin Road, hi tech Zone, Sichuan, Chengdu Applicant after: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc. Applicant after: Third Military Medical University, Chinese People's Liberation Army Address before: Chongqing city Shapingba street 400038 gaotanyan No. 30 Applicant before: Chongqing Yuanlun Bio-Technology Co., Ltd. Applicant before: Third Military Medical University, Chinese People's Liberation Army |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |