CN110295123A - 重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中;发酵罐装有二代液体培养基45L,控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其他不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养值三小时时开始补加一级补液,当一级补液补完后开始补加葡萄糖,当OD值大于40后开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导4h培养结束,诱导过程中补加二级补液;结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。本发明提高蛋白产量的同时,提高了该蛋白的表达量,进一步的提高使用效率。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗领域,具体涉及重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法。
背景技术
金葡菌是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌,呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点,急需研制疫苗控制其感染与流行。
金葡菌有“嗜肉菌"的别称,作为革兰氏阳性菌的代表,是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性为特征,局部可引起皮肤和软组织等的化脓性感染,经久不愈;全身可导致急性肺炎、脓毒血症、心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎等严重感染及并发症,死亡率高达20%。同时,金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。
随着抗生素长期、广泛地使用,细菌耐药性问题日益突出,作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)自1961年被首次发现至今,目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的院內感染病原菌之一。同时,因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行,呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点,被称为“第一超级细菌”。
MRSA分为医院获得性MRSA(healthcare-associated MRSA,HA-MRSA)及社区获得性MRSA(community-associated MRSA,CA-MRSA)。
2009年,据美国CDC在《新英格兰医学杂志》报道,美国每年MRSA严重感染人数约为9万人,致死病例约为2万人。2010年12月中国“MRSA院内感染诊治策略新进展”会议资料显示,我国内地医院院内MRSA感染发生率约为8%,每例院内感染患者平均住院时间延长14天,花费增加6542元,全国每年因医院感染造成的直接损失超过150亿元。同时,由于抗生素的滥用,临床高度耐药性金葡菌,尤其是MRSA的分离检出率逐年上升。中国2011年全国细菌耐药监测报告显示,在全国129家三甲医院被检的273808株细菌中,金葡菌位列临床革兰阳性菌分离量首位,MRSA检出率占被检出金葡菌的60%,广泛耐药率超过40%。基于这种严峻形势,我国已将MRSA列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病,并位居首位。目前,万古霉素是治疗MRSA感染的最后一道防线,但随着2002年耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant staphylococcus aureus,VRSA)的相继出现,高度耐药性发展的MRSA和VRSA在全球呈蔓延趋势,使得临床金葡菌的感染面临“无药可治”的严峻挑战。
抗生素的研发速度远远跟不上细菌耐药性的发展速度,而安全有效的金葡菌疫苗将可成为预防金葡菌感染的有效手段。WHO于2011年提出了“抵抗耐药菌”的“六点政策一揽子计划”,并强调在未来重点支持创新性疫苗等免疫防控制品的研发。因此,加强对金葡菌感染的免疫防治研究,研制安全、有效的新型金葡菌疫苗将对有效控制金葡菌广泛感染及大规模爆发流行、大幅降低金葡菌院内感染的发病率及耐药性蔓延等方面具有重要的现实及战略意义。
但是现有的金葡菌疫苗的发酵效果较差,产量较小,不便于长期使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的重组金黄色葡萄球菌疫苗不能进行高密度的发酵,产量较少,使用效率较低,目的在于提供重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,解决重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵的问题。
本发明通过下述技术方案实现:
重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,包括以下步骤:
(1)蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中;接种量为菌种:一代培养基=1ml:1000ml,每个三角瓶装2.5L一代培养基,共两个三角瓶;放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种;
(2)发酵罐装有二代液体培养基45L,接种量为二代菌种:培养基=1ml:9ml;控制发酵罐参数为温度:32℃、100~800rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:20%~50%;控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其他不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养值三小时时开始补加一级补液,当一级补液补完后开始补加葡萄糖,当OD值大于40后开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导4h培养结束,诱导过程中补加二级补液;
(3)结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
进一步的,重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,所述一代培养基包括酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠,其中酵母提取物:胰蛋白胨:氯化钠=1g:2g:2g。
其中,将酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠混合后,在121℃下灭菌30min得到一代培养基。
优选的,重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,二代液体培养基包括酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾,其中酵母提取物:胰蛋白胨:氯化钠:磷酸氢二钾:磷酸二氢钾=1g:2g:1g:0.34g:0.14g。
其中,将酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠在罐子里面混合,并在121℃下灭菌30min;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾单独在121℃下灭菌30min,在接种前将其加入罐内。
优选的,重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,一级补液包括酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁;酵母提取物:胰蛋白胨:葡萄糖:硫酸镁=35g:30g:75g:24g。
其中,重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,酵母提取物和胰蛋白胨单独在121℃下灭菌30min后备用;葡萄糖单独在121℃下灭菌30min后与灭菌后的酵母提取物和胰蛋白胨溶液混合得到混合溶液;硫酸镁单独在121℃下灭菌30min后与混合溶液混合。
优选的,重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,二级补液包括酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖;酵母提取物:胰蛋白胨:葡萄糖=1g:3.25g:6.25g。
其中,酵母提取物和胰蛋白胨单独在121℃下灭菌30min后备用;葡萄糖单独在121℃下灭菌30min后与灭菌后的酵母提取物和胰蛋白胨溶液混合得到二级补液。
进一步的,重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,步骤(2)中补加的葡萄糖在121℃30min灭菌后得到。步骤(1)中蛋白工作种子批菌种为MntC或HI或mSEB或SpA5中的一种。
本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
1、本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,本发明有效的提高了蛋白产量,能更高效的制备金葡菌疫苗;
2、本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,本发明在提高蛋白产量的同时,提高了该蛋白的表达量,进一步的提高使用效率;
3、本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,本发明的制备方法能有效的减少对环境的污染,降低生产成本。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解,构成本申请的一部分,并不构成对本发明实施例的限定。在附图中:
图1为本发明HI发酵菌液检测电泳图;
图2为本发明MntC发酵菌液检测电泳图;
图3为本发明MntC发酵菌液检测电泳图;
图4为本发明mSEB发酵菌液检测电泳图;
图5为本发明SpA5发酵菌液检测电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
实施例1
如图1所示,本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,包括以下步骤:
(1)HI蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中;接种量为菌种:培养基=1:1000(ml:ml),每个三角瓶装2.5L LB液体培养基,共两个三角瓶;放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种;
(2)发酵罐装有二代液体培养基45L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:32℃、100~800rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:20%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其他不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养值三小时时开始补加一级补液,当一级补液补完后开始补加葡萄糖当OD值大于40后开始诱导,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导4h培养结束,诱导过程中补加二级补液。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
根据图1所示,HI菌液诱导0小时后破菌上清、诱导1小时后破菌上清、诱导3小时后破菌上清、诱导5小时后破菌上清的电泳图,以及诱导0小时后进行填料结合、诱导1小时后进行填料结合、诱导3小时后进行填料结合、诱导5小时后进行填料结合的电泳图。
图1为HI发酵检测电泳图;其中,泳道1:标准品、泳道2:诱导0h破菌上清样电泳、泳道3:诱导1h破菌上清样电泳、泳道4:诱导2h破菌上清样电泳、泳道5:诱导3h破菌上清样电泳、泳道6:诱导5h破菌上清样电泳、泳道7:诱导0h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道8:诱导1h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道9:诱导3h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道10:诱导5h破菌上清与填料结合填料电泳。
实施例2
(1)MntC蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中。接种量为菌种:培养基=1:1000(ml:ml),每个三角瓶装2.5L LB液体培养基,共两个三角瓶。放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
(2)发酵罐装有二代液体培养基45L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:32℃、100~800rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:20%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其他不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养值三小时时开始补加一级补液,当一级补液补完后开始补加葡萄糖当OD值大于40后开始诱导,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导4h培养结束,诱导过程中补加二级补液。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
根据图3所示,图3为MntC发酵检测电泳图;其中,泳道1:标准品、泳道3:诱导4h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道4:诱导3h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道5:诱导2h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道6:诱导1h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道7:诱导0h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道8:诱导前0.5h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道9:诱导前1.5h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道10:诱导前2.5h破菌上清与填料结合填料电泳;
图4为MntC菌液诱导4小时后、诱导3小时后、诱导2小时后、诱导1小时后,诱导0小时后,诱导前0.5小时、诱导前2.5小时的电泳图。
实施例3
(1)mSEB蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中。接种量为菌种:培养基=1:1000(ml:ml),每个三角瓶装2.5L LB液体培养基,共两个三角瓶。放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
(2)发酵罐装有二代液体培养基45L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:32℃、100~800rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:20%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其他不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养值三小时时开始补加一级补液,当一级补液补完后开始补加葡萄糖当OD值大于40后开始诱导,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导4h培养结束,诱导过程中补加二级补液。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
图4为mSEB发酵检测电泳图,其中,泳道1:标准品、泳道2:诱导前2h破菌上清样电泳、泳道3:诱导前1h破菌上清样电泳、泳道4:诱导0h破菌上清样电泳、泳道5:诱导1h破菌上清样电泳、泳道6:诱导2h破菌上清样电泳、泳道7:诱导前3h破菌上清样电泳、泳道8:诱导前4h破菌上清样电泳、泳道9:诱导前4.5h破菌上清样电泳。
实施例4
(1)SpA5蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中。接种量为菌种:培养基=1:1000(ml:ml),每个三角瓶装2.5L LB液体培养基,共两个三角瓶。放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
(2)发酵罐装有二代液体培养基45L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:32℃、100~800rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:20%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其他不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养值三小时时开始补加一级补液,当一级补液补完后开始补加葡萄糖当OD值大于40后开始诱导,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导4h培养结束,诱导过程中补加二级补液。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
图5为SpA5发酵检测电泳图,其中,泳道1:诱导0h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道2:诱导1h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道3:诱导2h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道4:诱导3h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道5:诱导4h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道6:诱导5h破菌上清与填料结合填料电泳、泳道8:标准品。
实施例5
在实施例1~4的基础上,所述一代培养基包括酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠,其中酵母提取物:胰蛋白胨:氯化钠=1g:2g:2g;并且将酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠混合后,在121℃下灭菌30min得到一代培养基。
二代液体培养基包括酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾,其中酵母提取物:胰蛋白胨:氯化钠:磷酸氢二钾:磷酸二氢钾=1g:2g:1g:0.34g:0.14g。并且将酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠在罐子里面混合,并在121℃下灭菌30min;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾单独在121℃下灭菌30min,在接种前将其加入罐内得到二代液体培养基。
一级补液包括酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁;酵母提取物:胰蛋白胨:葡萄糖:硫酸镁=35g:30g:75g:24g。酵母提取物和胰蛋白胨单独在121℃下灭菌30min后备用;葡萄糖单独在121℃下灭菌30min后与灭菌后的酵母提取物和胰蛋白胨溶液混合得到混合溶液;硫酸镁单独在121℃下灭菌30min后与混合溶液混合得到一级补液。
二级补液包括酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖;酵母提取物:胰蛋白胨:葡萄糖=1g:3.25g:6.25g。酵母提取物和胰蛋白胨单独在121℃下灭菌30min后备用;葡萄糖单独在121℃下灭菌30min后与灭菌后的酵母提取物和胰蛋白胨溶液混合得到二级补液。
并且补加的葡萄糖在121℃30min灭菌后得到。
实施例6
批次 | 发酵最终OD值 | 菌体产量 | 菌体产率 |
实施例1 | 44.8 | 4.09kg | 63.9g/L |
实施例2 | 50.8 | 4.29kg | 85.8g/L |
实施例3 | 44.8 | 7.96kg | 132.7g/L |
实施例4 | 60 | 5.05kg | 84.2g/L |
由上表可知,本发明的制备方法能大幅度的提高菌体的产量和产率,能有效的进行高密度发酵,并且得到的菌体质量较好,能广泛的长期使用,在提高蛋白的菌体产量的同时提高蛋白的表达量,减少对环境的污染,降低生产成本。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中;接种量为菌种:一代培养基=1ml:1000ml,每个三角瓶装2.5L一代培养基,共两个三角瓶;放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种;
(2)发酵罐装有二代液体培养基45L,接种量为二代菌种:培养基=1ml:9ml;控制发酵罐参数为温度:32℃、100~800rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:20%~50%;控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其他不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养值三小时时开始补加一级补液,当一级补液补完后开始补加葡萄糖,当OD值大于40后开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导4h培养结束,诱导过程中补加二级补液;
(3)结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,所述一代培养基包括酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠,其中酵母提取物:胰蛋白胨:氯化钠=1g:2g:2g;并且将酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠混合后,在121℃下灭菌30min得到一代培养基。
3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,二代液体培养基包括酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾,其中酵母提取物:胰蛋白胨:氯化钠:磷酸氢二钾:磷酸二氢钾=1g:2g:1g:0.34g:0.14g。
4.根据权利要求3所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,将酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠在罐子里面混合,并在121℃下灭菌30min;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾单独在121℃下灭菌30min,在接种前将其加入罐内。
5.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,一级补液包括酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁;酵母提取物:胰蛋白胨:葡萄糖:硫酸镁=35g:30g:75g:24g。
6.根据权利要求5所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,酵母提取物和胰蛋白胨单独在121℃下灭菌30min后备用;葡萄糖单独在121℃下灭菌30min后与灭菌后的酵母提取物和胰蛋白胨溶液混合得到混合溶液;硫酸镁单独在121℃下灭菌30min后与混合溶液混合。
7.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,二级补液包括酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖;酵母提取物:胰蛋白胨:葡萄糖=1g:3.25g:6.25g。
8.根据权利要求7所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,酵母提取物和胰蛋白胨单独在121℃下灭菌30min后备用;葡萄糖单独在121℃下灭菌30min后与灭菌后的酵母提取物和胰蛋白胨溶液混合得到二级补液。
9.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,步骤(2)中补加的葡萄糖在121℃30min灭菌后得到。
10.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗高密度发酵方法,其特征在于,步骤(1)中蛋白工作种子批菌种为MntC或HI或mSEB或SpA5中的一种。
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