CN106244498A - 一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，乳酸菌菌种经培养后离心清洗，添加氯化钠水溶液，乳酸菌菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号：CGMCC No.10574，在乳酸菌菌体中添加氯化钠溶液，一方面能够减少低温对菌体的伤害；另一方面能够抑制乳酸菌的生长；菌种容易控制，方便易得；生产成本低，安全无危害，净化农药残留效果好。
Description
发明领域
本发明涉及一种果蔬农药的净化菌剂，具体地说，涉及一种果蔬农药净化菌剂的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
食品安全是消费者最为关注的焦点之一，我国从2015年开始实施新食品法，对食品安全问题格外严厉。然而，为保证果蔬产量，种植中使用农药不能避免，如2014年洋葱中农药残留噻虫嗪事件，引起了质检总局的高度重视，至今仍是输日洋葱的监控项目。果蔬类产品，属于消费者日常生活中必备的食品，有些甚至清洗后直接食用，若果蔬表面有农药残留或残留过量，很容易对食用者造成伤害。大多数农药属于脂溶性化合物，仅仅靠水清洗并不能很好的清除。随着检测技术的发展和各国在食品安全研究方面的突破，各国都加大了对农药残留降解的研究。氨基甲酸酯类农药是果蔬种植中常用的杀虫剂，虽然多数属低毒农药，但对人体和环境仍然有害。为保护果蔬的生长，需要喷洒氨基甲酸酯类药物，因此果蔬表面很容易残留农药，若清除不干净被误食，可以引起头痛、头晕、恶心、呕吐、腹痛、流口水、视物不清，重度中毒还出现肌肉震颤、昏迷、大小便失禁等。目前对氨基甲酸酯类农药残留的降解研究已有报道，多偏重于芽孢杆菌，虽也能达到降解的目的，但芽孢杆菌研究不透明，一些对人有毒，若用于清除果蔬表面农药，可能带来新的危害。目前，在市场上已有一些果蔬类农残净化菌剂的商品，但生产和市场主要掌握在国外大型生物公司，价格高，且多未被国内权威机构认可。国内净化菌剂起步较晚，受生产成本、培养条件、检测手段和消费者认知的制约，还未推广普及。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种果蔬农药净化菌剂的制备方法，生产本菌剂成本低、工艺简单、无毒和不破坏果蔬表面、并具有稳定安全的优点。
为解决以上问题，本发明采用以下技术方案：一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
乳酸菌菌种经培养后离心清洗，添加氯化钠水溶液。
一种优化方案，乳酸菌菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号：CGMCC No.10574。
进一步地，乳酸菌菌种的培养包括：
无菌接种：取冰箱4℃保藏的乳酸菌菌种在超净台接种到细菌培养基，培养温度37℃，转速120转/分钟摇床培养3天，得种子。
进一步地，乳酸菌菌种的培养还包括：
发酵培养：将培养好的种子超净台全部接种到发酵培养基，无菌搅拌均匀，温箱中培养，温度为37℃培养2天，降低温度到30℃培养1天，得菌液。
进一步地，细菌培养基包括：
酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾2g、0.5mL吐温80，121℃高压灭菌35min。
进一步地，发酵培养基包括：
酵母膏10g、蛋白胨10g、玉米浆40g、蔗糖10g、碳酸钙粉5g，调pH到6.5，121℃高压灭菌35min后冰箱4℃保藏。
进一步地，乳酸菌菌种的离心清洗包括：
将培养好的菌液装入离心管，4℃，3000转/分离心10分钟，弃去上层溶液，留用下层菌液。
进一步地，乳酸菌菌种的离心清洗还包括：
将下层菌液中加入等体积纯水，涡混均匀，4℃，3000转/分离心10分钟，弃去上层溶液，留用下层菌液。
进一步地，离心清洗后的乳酸菌菌体中添加相同重量的1mol/L的氯化钠水溶液，并冰箱-10℃保藏。
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。
本发明采用以上技术方案，具有以下优点：
采用以上培养基，成分简单，可溶于水，有利于后处理提取，减少提取成本；其中，酵母膏、蛋白胨和玉米浆均可为菌种10574提供碳氮源；蔗糖提供速效碳源；玉米浆提供微量元素和宽松的培养环境；碳酸钙粉能够中和发酵产生的酸度，发酵菌种10574的后期培养更有利；pH 6.5为给菌种提供一个微酸的环境，利于消毒杀菌和乳酸菌10574的生长。
经试验后发现：37℃的培养温度在发酵初期可以加速菌种10574菌体繁殖生长；培养2天后将温度降低到30℃，可以有效控制发酵的节奏，提高菌体的产量。
加水可以将残留的发酵液除去，清洗菌体，过多的发酵培养基残留会减弱菌剂对果蔬表面农药的清除效果；
经试验后发现：在乳酸菌菌体中添加氯化钠溶液，一方面能够减少低温对菌体的伤害；另一方面能够抑制乳酸菌的生长。
菌种容易控制，方便易得；生产成本低，安全无危害，净化农药残留效果好。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
附图1为灭多威和速灭威的对照TIC色谱图(100μg/kg)；
附图2为本发明中灭多威和速灭威经菌剂清除后的基质色谱图。
具体实施方式
实施例1，一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
a、选取乳酸菌菌种：取冰箱4℃保存的菌种10574，放入超净台上，静置2小时，乳酸菌菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号：CGMCC No.10574；
b、细菌培养基(种子培养基)：酵母膏7.5g，蛋白胨7.5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾2g，0.5mL吐温80，定容到1000mL，以100mL分装入500mL三角瓶，121℃高压灭菌35min；
c、发酵培养基：酵母膏10g，蛋白胨10g，玉米浆40g，蔗糖10g，碳酸钙粉5g，用水定容到1000mL，搅拌均匀，调pH到6.5，装入3000mL三角瓶，121℃高压灭菌35min后冰箱4℃保藏；
经试验后发现：采用以上培养基，成分简单，可溶于水，有利于后处理提取，减少提取成本；其中，酵母膏、蛋白胨和玉米浆均可为菌种10574提供碳氮源；蔗糖提供速效碳源；玉米浆提供微量元素和宽松的培养环境；碳酸钙粉能够中和发酵产生的酸度，发酵菌种10574的后期培养更有利；pH 6.5为给菌种提供一个微酸的环境，利于消毒杀菌和乳酸菌10574的生长。
d、无菌接种：取冰箱4℃保藏的菌种10574在超净台接种到细菌培养基，培养温度37℃，转速120转/分钟摇床培养3天得种子；
e、发酵培养：将步骤d培养好的种子超净台全部接种到发酵培养基(3000mL三角瓶中)，无菌搅拌均匀，温箱中培养，温度依次为37℃培养2天，降低温度到30℃培养1天得菌液；
经试验后发现：37℃的培养温度在发酵初期可以加速菌种10574菌体繁殖生长；培养2天后将温度降低到30℃，可以有效控制发酵的节奏，提高菌体的产量。
f、将步骤e培养好菌液装入100mL离心管，4℃，3000转/分离心10分钟，弃去上层溶液，留用下层菌液；
g、在步骤f所得下层菌液中加入等体积纯水(菌液∶纯水＝1∶1)，涡混均匀，4℃，3000转/分离心10分钟，弃去上层溶液，留用下层菌液；
加水可以将残留的发酵液除去，清洗菌体，过多的发酵培养基残留会减弱菌剂对果蔬表面农药的清除效果；
h、收集步骤g乳酸菌菌体，称取重量，添加相同重量的1mol/L的氯化钠水溶液，冰箱-10℃保藏；
经试验后发现：在乳酸菌菌体中添加氯化钠溶液，一方面能够减少低温对菌体的伤害；另一方面能够抑制乳酸菌的生长。
检验：将步骤h所得菌液放置室温1小时，以1％的投料比(质量比)添加菌液到灭多威和速灭威混合溶液中(100μg/kg)，同时做空白对照。两小时后将反应液离心，上清液过滤膜后经液相色谱质谱检测含量，结果经乳酸菌处理后，灭多威和速灭威在质谱上未出现提取离子峰，色谱图如附图2，说明已经被菌剂完全处理。空白对照色谱图见附图1。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：乳酸菌菌种经培养后离心清洗，添加氯化钠水溶液。
2.如权利要求1所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于：乳酸菌菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号：CGMCCNo.10574。
3.如权利要求1所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，乳酸菌菌种的培养包括：
无菌接种：取冰箱4℃保藏的乳酸菌菌种在超净台接种到细菌培养基，培养温度37℃，转速120转/分钟摇床培养3天，得种子。
4.如权利要求1所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，乳酸菌菌种的培养还包括：
发酵培养：将培养好的种子超净台全部接种到发酵培养基，无菌搅拌均匀，温箱中培养，温度为37℃培养2天，降低温度到30℃培养1天，得菌液。
5.如权利要求1所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，细菌培养基包括：
酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾2g、0.5mL吐温80，121℃高压灭菌35min。
6.如权利要求1所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，发酵培养基包括：
酵母膏10g、蛋白胨10g、玉米浆40g、蔗糖10g、碳酸钙粉5g，调pH到6.5，121℃高压灭菌35min后冰箱4℃保藏。
7.如权利要求1所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，乳酸菌菌种的离心清洗包括：
将培养好的菌液装入离心管，4℃，3000转/分离心10分钟，弃去上层溶液，留用下层菌液。
8.如权利要求7所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，乳酸菌菌种的离心清洗还包括：
将下层菌液中加入等体积纯水，涡混均匀，4℃，3000转/分离心10分钟，弃去上层溶液，留用下层菌液。
9.如权利要求1所述的一种果蔬农药残留净化菌剂的制备方法，其特征在于，离心清洗后的乳酸菌菌体中添加相同重量的1mol/L的氯化钠水溶液，并冰箱-10℃保藏。
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