CN109260645B - 一种去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，所述方法是利用乳酸菌对农药等有害物质的专一吸附性，且处理过程中可能会释放一部分降解农药的酶，将菌体细胞和植物来源的黄酮类提取物在一定条件下混合，充分吸附和降解，再离心沉淀去除菌体及其表面附着农药。其有益效果在于，去除率高，成本低，全程无有害物质参与，保障产物的安全性；处理过程温和，能最大程度的保留植物提取物的活性；工艺简单，适合大规模生产应用；无有机溶剂，环保，无二次污染。

Description

一种去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法
技术领域
本发明属于有害物质去除技术领域，更具体地，涉及一种去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法。
背景技术
中国是全球最大的农药使用国，我国的农药使用量正以每年4.9%的速度增加。我国水田施用的农药量是 1.74 kg/ha，陆地上农药施用量则是 1.31 kg/ha，经济作物施用量 1.38kg/ha，蔬菜的用量是 3.82 kg/ha，茶园施用量是 1.54 kg/ha，果园施用量 3.49kg/ha；在2011 年我国农药施用后的损失量达4.39×103 t，其中水稻作物总损失的农药占14.84%，陆地粮食作物中占 33.31%，经济作物占 10.47%，蔬菜占26.37%，茶园占1.08%，果园占13.93%。
农药残留是指使用农药中产生的部分衍生物和降解、转化、代谢反应中的有毒产物及其杂质。其自身毒性较高且自然降解较慢，使用不当则会对生态环境以及人类健康造成很大的危害。现代医学研究证明，我国使用的农药品种大多数属有毒有机物，对哺乳动物的神经、生殖、内分泌、免疫和必血管系统有明显的毒副作用。
农药可以从土壤或者水环境迁移到动植物体内，进而残留在植物来源的提取物中。降低植物来源提取物中农药残留的现有技术为：1物理法，是利用提取物中残留农药的不稳定性、吸附性等物理特性来减少其含量，常用的方法是活性炭吸附，树脂层析，这些去除农药的操作复杂但效果不显著，且选择性差，方法适用性小。2化学法，化学法即是通过化学反应来降低农药残留，譬如，超声法，微波法，紫外法水解法，氧化法，光解法等，一般需要特殊的反应条件，且过程中常有不需要的副产物，这些副产物可能是有毒害的物质，进而造成二次污染，另外对产品质量产生不同程度的负面影响。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供一种去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，是利用乳酸菌对农药等有害物质有专一吸附性，且处理过程中可能会释放一部分降解农药的酶的原理，将菌体细胞和目标提取物在一定条件下混合，充分吸附和降解，再离心沉淀去除菌体及其表面附着的农药的方法。所述方法包含如下步骤：
S1：将活化后的乳酸菌于发酵培养基中扩大培养24~48h，得发酵液再于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，收集沉淀细胞；
S2：用已灭菌的pH为6.0~7.0的磷酸缓冲液或生理盐水重新悬浮步骤S1中细胞，搅拌均匀后于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，去上清液，反复2~3次；
S3：将步骤S2中沉淀后的细胞进行预处理，4000~6000 r/min转速下离心5~10min，取沉淀再用无菌水洗涤2~3次，收集得菌体细胞；所述预处理是酸处理，热处理，氯化钠处理中的一种或几种；
S4：将步骤S3中菌体细胞用50~100倍体积的无菌水重悬，制成5×106～109 CFU/ml浓度的菌悬液；
S5：将植物来源黄酮类提取物溶于10~100倍体积溶剂中，得稀释液；
S6：将步骤S4中菌悬液和S5中稀释液按体积1：1混合后于30~40℃温育4~6h，4000~6000rpm离心10min，收集滤液，40~60℃浓缩干燥，得去除残留农药的植物来源黄酮类提取物。
进一步，所述扩大培养是将活化后的乳酸菌制成浓度为104～106 CFU/ml的菌悬液，取5~10mL接种于发酵培养基中，30~40℃摇床培养，其中摇床的转速为100~200rpm，得发酵液。
进一步，所述乳酸菌为为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌中的一种或多种。
进一步，所述发酵培养基为MRS培养基，组分为：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰 0.25 g，水 1000 mL，pH为 6.2~6.6。
进一步，所述预处理是酸处理，热处理，氯化钠处理中的一种或多种，一定程度上改变细胞壁上的蛋白质性质，促使肽或蛋白质与多糖之间发生美拉德反应，从而使细胞的肽聚糖层减少交联，形成没有规律的细胞壁结构，增加了细胞孔径，提供了更多的吸附位点。此外，预处理的过程，还可能会释放一部分降解农药的酶类。
进一步，所述酸处理是在2~4 mol/L的盐酸溶液中处理60~90 min。
进一步，所述热处理是在100℃水浴10~15min。
进一步，所述氯化钠处理是在1~5mol/L氯化钠溶液中，500~1000W超声处理5~10min。
进一步，所述S5中溶剂为无菌水或40%乙醇溶液。
进一步，所述残留农药为氨基甲酸酯类，有机氯类，有机磷类的一种或多种。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
1.去除率高，成本低，工艺简单，适合大规模生产应用。
2.无有害物质参与，保障产物的安全性。
3.属于专一性物理吸附，能最大程度的保留植物源黄酮提取物的活性。
4.环保，无二次污染。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所使用的培养基的配制：
a活化培养基：胨化乳15g，酵母浸粉5g，磷酸二氢钾2g，葡萄糖10g，番茄浸出粉2.5，吐温80 1mL，调节pH为6.8，灭菌备用。
b发酵培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，水 1000 mL，pH为 6.2~6.6，灭菌备用。
本发明采用以上黄酮类提取物作为处理对象，但类似的黄酮类提取物均可采用此方法。以下实施例中所使用的银杏黄酮提取物的制备：
银杏叶洗净干燥，粉碎机打粉过100目，加入 20 倍（V/W）的 75%乙醇，用 40%NaOH调节乙醇溶液 pH至9.5，80℃回流提取2次，每次2h。趁热过滤，合并2次的滤液。（趁热用布氏漏斗真空减压抽滤，滤液收集。第一次得到的滤渣再用相同工艺提取抽滤一次）用浓盐酸调节提取液pH至3.5。静置48h，过滤，取沉淀，用适量水洗至洗出液呈中性，60℃真空减压干燥得干膏。干膏用粉碎机粉碎（过100目）得银杏叶提取物干膏粉。合并两次滤液，用浓盐酸调节提取液 pH 至 3.5。静置 48h，过滤，取沉淀，水洗至洗出液至中性，减压浓缩，60℃真空减压干燥得干膏。干膏用粉碎机粉碎（过100目）得银杏黄酮提取物。
实施例1：
去除银杏黄酮提取物中残留农药的方法，包括如下步骤：
S1：将嗜酸乳杆菌接种于活化培养基，37℃培养24h，调制成浓度为106 CFU/ml的菌悬液；
S2：取步骤S1中菌悬液5mL接种于发酵培养基中，37℃摇床培养，其中摇床转速为200rpm，得发酵液；
S3：取步骤S2中发酵液1000ml于4℃，6000rpm离心3min沉淀，收集沉淀细胞；
S4：用已灭菌生理盐水重新悬浮步骤S3中细胞，搅拌均匀后于4℃，6000rpm离心3min沉淀，弃上清液，去除反复3次；
S5：沉淀细胞预处理，即将细胞于2mol/L的盐酸溶液中处理90 min 后，，6 000 r/min，于4℃离心5 min，取沉淀再用无菌水洗涤2次；
S6：将预处理后的菌体细胞用2000mL的无菌水重悬，制成5×107CFU/ml浓度的菌悬液；
S7：将1kg添加有1mg多菌灵，1mg异狄氏剂，1mg甲胺磷，1mg 666的银杏黄酮提取物溶于2000mL水中，得稀释液；
S8：将步骤S4中菌悬液和S5中稀释液按体积1：1混合后于37℃温育4h，6000rpm离心10min，收集滤液，40℃浓缩干燥，得去除残留农药的银杏黄酮类提取物。
S9：利用高效液相色谱法对去除农药后黄酮类提取物中各种农药含量进行定量检测，计算去除率。具体见表1。
表1
多菌灵 异狄氏剂 甲胺磷 666
去除后 0.02 0.01 0 0
去除率 98% 99% 100% 100%
实施例2：
去除银杏黄酮提取物中残留农药的方法，包括如下步骤：
S1：将嗜酸乳杆菌接种于活化培养基，37℃培养48h，调制成浓度为109 CFU/ml的菌悬液；
S2：取步骤S1中菌悬液5mL接种于发酵培养基中，37℃摇床培养，其中摇床转速为200rpm，得发酵液；
S3：取步骤S2中发酵液1000ml于4℃，6000rpm离心5min沉淀，收集沉淀细胞；
S4：用已灭菌生理盐水重新悬浮步骤S3中细胞，搅拌均匀后于4℃，6000rpm离心5min沉淀，弃上清液，去除反复3次；
S5：沉淀细胞预处理，即将细胞于1mol/L氯化钠溶液中，500W超声处理5min；
S6：将预处理后的菌体细胞用2000mL的无菌水重悬，制成5×109CFU/ml浓度的菌悬液；
S7：将1kg添加有1mg多菌灵，1mg异狄氏剂，1mg甲胺磷，1mg 666的银杏黄酮提取物溶于2000mL水中，得稀释液；
S8：将步骤S4中菌悬液和S5中稀释液按体积1：1混合后于37℃温育4h，6000rpm离心10min，收集滤液，40℃浓缩干燥，得去除残留农药的银杏黄酮提取物。
S9：利用高效液相色谱法对去除农药后银杏黄酮提取物中各类农药含量进行定量检测，计算去除率。具体见表2。
表2
多菌灵 异狄氏剂 甲胺磷 666
去除后 0 0 0 0.01
去除率 100% 100% 100% 99%

Claims (7)

1.一种去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：S1：将活化后的乳酸菌于发酵培养基中扩大培养24~48h，得发酵液再于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，收集沉淀细胞；S2：用已灭菌的pH为6.0~7.0的磷酸缓冲液或生理盐水重新悬浮步骤S1中细胞，搅拌均匀后于4℃，4000~6000rpm离心3~5min沉淀，去上清液，反复2~3次；S3：将步骤S2中沉淀细胞进行预处理再离心沉淀，收集菌体细胞；S4：将步骤S3中预处理后的菌体细胞用50~100倍体积的无菌水重悬，制成5×106～109 CFU/ml浓度的菌悬液；S5：将植物来源黄酮类提取物溶于10~100倍体积溶剂中，得稀释液；S6：将步骤S4中菌悬液和S5中稀释液按体积1：1混合后于30~40℃温育4~6h，4000~6000rpm离心10min，收集滤液，40~60℃浓缩干燥，得去除残留农药的植物来源黄酮类提取物；所述发酵培养基为MRS培养基，组分为：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰 0.25 g，水 1000 mL，pH为 6.2~6.6；所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌；所述农药为多菌灵、异狄氏剂、甲胺磷和六六六的混合物。
2.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，其特征在于，所述扩大培养是将活化后的乳酸菌制成浓度为104～106 CFU/ml的菌悬液，取5~10mL接种于发酵培养基中，30~40℃摇床培养，其中摇床的转速为100~200rpm，得发酵液。
3.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，其特征在于，所述预处理是酸处理，热处理，氯化钠处理中的一种或一种以上。
4.根据权利要求3所述去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，其特征在于，所述酸处理是在2~4 mol/L的盐酸溶液中处理60~90 min 后，4000~6000 r/min，于4℃离心5~10 min，取沉淀再用无菌水洗涤2次。
5.根据权利要求3所述去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，其特征在于，所述热处理是在100℃水浴10~15min。
6.根据权利要求3所述去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，其特征在于，所述氯化钠处理是在1~5mol/L氯化钠溶液中，500~1000W超声处理5~10min。
7.根据权利要求1所述去除植物来源黄酮类提取物中残留农药的方法，其特征在于，所述S5中溶剂为无菌水或40%乙醇溶液。
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