CN113827710A - 一种基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗。本发明肿瘤全细胞疫苗，它是将肿瘤细胞置于含有乳酸的培养基中培养后，灭活制备而成。本发明基于乳酸刺激肿瘤细胞制备的全细胞疫苗，该疫苗不仅能够有效的被树突状细胞所吞噬，而且能促进DC的成熟，有较好的激活细胞免疫的潜能。经氢氧化铝‑高盐佐剂优化后，该疫苗能够有效的激活机体的体液免疫和细胞免疫，具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤全细胞疫苗，具体涉及一种基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗。
背景技术
癌症，比如肺癌是世界上最常见的恶性疾病，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。包括PD-1在内的新型单克隆抗体、手术及放化疗等针对肺癌的治疗手段虽然具有一定的效果，但总体治疗效果不理想，临床预后较差，5年生存率较低。绝大多数肺癌晚期患者最终死于复发和转移。基于此，癌症的临床治疗亟待新的治疗手段和药物，如何开发临床治疗效果更好、副作用更小、能改善长期预后的治疗方法是目前肺癌研究的重点和难点。
肿瘤疫苗主要包括肿瘤全细胞疫苗、多肽疫苗、RNA/DNA疫苗和DC疫苗等。肿瘤全细胞疫苗，是将自身或异体同种肿瘤细胞，经过物理因素(照射、高温)、化学因素(酶解)以及生物因素(病毒感染、基因转移等)的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性制备得到的疫苗，其能够提供一系列独特的肿瘤相关抗原，即同时传递多个已知或未知的肿瘤新生抗原(Neoantigen)，因此一次应用可以产生针对多种抗原的抗体，避免了抗原的丢失。目前，个体化治疗是肿瘤疫苗的重要发展方向，而肿瘤全细胞疫苗能够为个体化治疗提供全部所需的肿瘤新生抗原。研究表明，与DC疫苗、多肽疫苗和抗体疫苗相比，肿瘤全细胞疫苗具有更好的临床获益。肿瘤全细胞疫苗不用考虑MHC的个体差异，能同时激活CD4+和CD8+T淋巴细胞从而产生特异性的免疫应答，在诱导更强的抗肿瘤免疫效应的同时降低了肿瘤免疫逃逸的发生。据报道，目前已有多种疫苗进入临床研究阶段，例如肺癌Belagenpumatucel-L疫苗，它能增强树突状细胞的活化并抑制调节性T细胞(Treg)，已进入三期临床试验。另有报道，GVAX疫苗在黑色素瘤的患者中进入了I期临床试验。最新研究表明，利用个体化的肿瘤细胞疫苗治疗急性骨髓细胞白血病，患者生存期显著延长。
乳酸是人体正常的代谢产物，在一般的新陈代谢和运动中会不断产生乳酸，但其浓度保持相对稳定，在正常组织中细胞外的pH值趋于中性，人体非运动状态下乳酸浓度约为1-2mmol/L。然而在大多数实体瘤患者的癌组织中，乳酸的浓度显著升高，肿瘤细胞外的pH值可低至6.0-6.5，乳酸最高浓度能达到40mmol/L19。乳酸在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用，早在2015年我国学者王晖课题组就已经对其与肿瘤的关系进行了系统的阐述。研究表明乳酸能够抑制肿瘤浸润性淋巴细胞功能，改变肿瘤能量代谢，促进肿瘤转移，促进免疫逃逸和肿瘤血管的生成。此外，乳酸还能增加精氨酸酶在肿瘤相关巨噬细胞中的表达，从而增加该细胞的免疫抑制作用。
未见乳酸用于制备肿瘤全细胞疫苗的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤全细胞疫苗，该疫苗是肿瘤细胞LL2经乳酸诱导24h，X射线灭活、辅以高盐-氢氧化铝复合佐剂得到的，能够通过天然免疫途径参与DC的激活，并发挥抗肿瘤作用，具有很好的抗肿瘤理论研究价值和临床转化意义。
本发明的技术方案包括：
一种肿瘤全细胞疫苗，它是将肿瘤细胞置于含有乳酸的培养基中培养后，灭活制备而成。
优选地，所述含有乳酸的培养基中，乳酸的浓度是10～30mmol/L.
进一步优选地，所述含有乳酸的培养基中，乳酸的浓度是20mmol/L.
优选地，所述灭活方式是辐照灭活，优选用X线照射辐照灭活，照射剂量为50Gy。
优选地，所述疫苗中还添加有佐剂。
优选地，所述佐剂为高盐-氢氧化铝复合佐剂，所述高盐-氢氧化铝复合佐剂为氯化钠溶液与AI(OH)3凝胶混合制备而成，其中，氯化钠溶液与AI(OH)3凝胶的体积重量比为(3～6):1，优选为4.5：1；所述疫苗复合物中，氯化钠的浓度为3～4(w/v)，优选为3.6％(w/v)。
优选地，所述疫苗中，肿瘤细胞的浓度为1×106～1×108细胞/ml，优选为1×107细胞/ml.
优选地，所述细胞为肿瘤细胞LL2，其培养基为RPMI1640培养基，细胞培养时添加10％的胎牛血清和1％的抗生素，培养后采用RPMI1640培养基重悬。
本发明还提供了一种制备前述肿瘤全细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)取肿瘤细胞，置于含有乳酸的培养基中培养，采用培养基重悬；
2)灭活；
优选地，还包括步骤3)添加免疫佐剂。
本发明还提供了前述肿瘤全细胞疫苗在制备治疗肿瘤的药物中的用途；优选地，所述药物是治疗肺癌的药物。
本发明疫苗能够引起小鼠出现特异性体液免疫，能够激活小鼠DC细胞，增强DC对疫苗复合物的吞噬作用，体内实验也证明其可以有效抑制肿瘤生长，可以用于肿瘤，特别是肺癌的治疗，临床应用前景优良。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：给药后小鼠肿瘤的生长曲线
图2:优化后的肿瘤全细胞疫苗的增强lgG1特异性体液免疫
图3：肿瘤全细胞疫苗促进DC的吞噬和成熟，图A疫苗处理后的DC表面相关成熟标志物(CD80/CD86/MHC-II)表达量上调，图B DC细胞对疫苗处理后肿瘤细胞的吞噬作用增强。图C疫苗处理后DC中Tnf-α和Il-6的表达增多
具体实施方式
实施例一、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗的制备
1材料与方法
1.1肿瘤细胞为肿瘤细胞LL2
1.2主要试剂
细胞培养基：在RPMI1640培养基中加入10％的胎牛血清和1％的抗生素。RPMI1640培养基购于Gibco，胎牛血清购于Gibco，抗生素(penicillin-streptomycin solution)购于HyClon。
高盐-氢氧化铝：8％NaCI：AI(OH)3凝胶＝4.5：1，8％NaCI由纯水中加入8％的NaCI。AI(OH)3凝胶购于Invivogen，NaCI购于Sigma。
1.3肿瘤全细胞疫苗的制备
1.3.1肿瘤细胞LL2传代培养，无菌操作取肿瘤细胞LL2接种到培养基(加入10％的胎牛血清和1％的抗生素RPMI1640)里，置于37℃，5％CO2恒温细胞培养箱中培养48h，得到生长密度在80％左右的肿瘤细胞LL2。
1.3.2基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗制备：乳酸刺激肿瘤细胞LL2，将传代后的肿瘤细胞LL2重悬于含有20mmol/L的乳酸的培养基(加入10％的胎牛血清和1％的抗生素RPMI1640)中，置于CO2恒温细胞培养箱培养24h后收集细胞，离心弃上清后用PBS洗涤3次，用相应的无血清、无抗生素培养基重悬，使重悬后细胞浓度为2.22×107细胞/1ml(2.22×106细胞/100μl)。随后用220kV/40mA的X线照射辐照灭活(Rad source Rs2000BiologicalIrradiator)，照射剂量为50Gy，得基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗原液(细胞浓度为2.22×107细胞/1ml(2.22×106细胞/100μl))，可稀释得到基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗(细胞浓度为1×107细胞/1ml/(1×106细胞/100μl))。
1.3.3优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗制备：，将高盐-氢氧化铝复合佐剂按重量比5.5:4.5的比例加入到1.3.2制备得到的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗原液里，即得到优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗，其中NaCI终浓度为3.6％的高盐-氢氧化铝疫苗复合物，且细胞浓度为1×107细胞/1ml(1×106细胞/100μl)。
实施例二、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗的抗肿瘤作用研究
1材料与方法
1.1实验动物：40只6-8周龄的C57BL/6J小鼠
1.2主要实验试剂：生理盐水、3.6％高盐-氢氧化铝佐剂、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗(细胞浓度为1×107细胞/1ml/(1×106细胞/100μl))、优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗(即NaCI终浓度为3.6％的高盐-氢氧化铝疫苗复合物，且细胞浓度为1×107细胞/1ml(1×106细胞/100μl)))
疫苗采用实施例一制备的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗和优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗。
1.3实验方法
1.3.1小鼠肺癌皮下瘤模型建立
于实验的第0天，予每只小鼠皮下接种2×106肿瘤细胞LL2。在接种后的5-7天，观察发现，每只小鼠肿瘤体积大小约50mm3，此时，把40只小鼠随机分成A、B、C、D共4组，每组10只，以便后续的给药实验。
1.3.2给药
对A、B、C、D 4组小鼠肺癌皮下瘤模型在腋下及腹股沟多点皮下给药，一周两次。其中A组：生理盐水组；B、对照组：3.6％高盐-氢氧化铝佐剂；C、实验组：基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗；D、优化实验组：优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗。
1.3.3每三天记录一次小鼠的肿瘤生长，绘制小鼠肿瘤生长曲线。
2实验结果
根据小鼠给药后的肿瘤生长曲线(图1)，可以看出给药后第6天(即肿瘤细胞接种后的第13天)开始，小鼠肿瘤大小出现了差异，实验组C和优化实验组D肿瘤大小明显小于生理盐水组A和对照组B，第10天开始，出现明显差异，且时间越长，差异越大，说明基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗优化前后均能抑制小鼠皮下肿瘤生长，且优化后的疫苗对肿瘤生长有更明显的抑制作用。
实验结果说明，本发明两种疫苗可以有效抑制肿瘤，免疫效果优良，其中优化后的疫苗的效果更加显著。
实施例三、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗的抗肿瘤作用研究
1材料与方法
1.1实验动物：40只6-8周龄的C57BL/6J小鼠
1.2主要实验试剂：生理盐水、3.6％高盐-氢氧化铝佐剂、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗(细胞浓度为1×107细胞/1ml)、优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗(即NaCI终浓度为3.6％的高盐-氢氧化铝疫苗复合物，且细胞浓度为1×107细胞/1ml(1×106细胞/100μl))
疫苗采用实施例一制备的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗和优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗。
1.3实验方法
将40只小鼠随机分成A、B、C、D 4组，于实验的第0天，第14天，第21天，在腋下及腹股沟多点皮下给药。其中A组：生理盐水组；B、对照组：3.6％高盐-氢氧化铝佐剂；C、实验组：基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗；D、优化实验组：优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗。在每只小鼠免疫时加入10μg OVA，在实验的第28天用摘眼球采血法收集小鼠血液，收集的血清用于OVA抗原自包被ELISA检测血清中lgG1抗体滴度。
2实验结果
于第28天，用收集的血清做lgG1抗体滴度实验，结果如表1和图2。从表1中可以看出优化前后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗都可以加强以IgG1抗体为主的体液免疫反应。
表1血清滴定实验结果
| IgG1(dilute 20000X) | |
| Saline | 0.096666667 |
| Al/NaCl | 0.206666667 |
| Lactic acid | 0.966666667 |
| Al/NaCI-lactic acid | 1.32 |
实验结果说明，本发明两种疫苗可以加强以IgG1抗体为主的体液免疫反应，免疫效果优良。
实施例四、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗对DC的激活作用的机制研究
1材料与方法
1.1实验动物：6-8周龄的C57BL/6J小鼠
1.2主要实验试剂：GM-CSF、β-羟基乙醇、丙酮酸钠、IL-4、RPMI1640完全培养基、生理盐水、3.6％高盐-氢氧化铝佐剂、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗(细胞浓度为1×107细胞/1ml)、优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗(即NaCI终浓度为3.6％的高盐-氢氧化铝疫苗复合物，且细胞浓度为1×107细胞/1ml(1×106细胞/100μl))
疫苗采用实施例一制备的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗和优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗。
1.3实验方法
1.3.1DC的分离和培养
选用6-8周龄的C57BL/6J，采用颈椎脱位法处死小鼠，在超净工作台中取出小鼠的股骨和胫骨的骨髓细胞，在含有10ng/ml GM-CSF、500ng/mlβ-羟基乙醇、500ng/ml丙酮酸钠及10ng/ml IL-4的RPMI1640完全培养基中培养，隔天半量换液，并补足GM-CSF、β-羟基乙醇、丙酮酸钠及IL-4。第7天收集悬浮的和半贴壁的DC细胞进行后续实验。
1.3.2疫苗复合物对DC的激活
用生理盐水、高盐-氢氧化铝佐剂、基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗、优化后的基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗分别与DC混合培养24h后收集DC细胞，一部分细胞用于流式细胞术检测DC表面相关成熟标志物(CD80/CD86/MHC-II)变化。一部分细胞，提取RNA后通过RT-PCR检测Tnf-α和Il-6的表达情况变化。
1.3.3DC对疫苗复合物的吞噬作用增强
按上述分组，将肿瘤细胞进行PHK67染色，分别与DC以1：1的比例混合培养过夜。一部分使用流式细胞仪筛选出DC后，检测CD11c与PHK67双阳性细胞的百分比。
2实验结果
实验发现：将经乳酸刺激后的肿瘤细胞与DC混合培养24h后，利用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子的变化，发现DC成熟分子标志上调(如图3中图A)。同时将被不同浓度乳酸刺激后并辐照的LL2肿瘤细胞进行PHK67染色，再与DC混合培养过夜，使用流式细胞仪筛选出DC后，检测CD11c与PHK67双阳性细胞的百分比，可以发现随着乳酸浓度的增高，DC细胞对处理后肿瘤细胞的吞噬作用增强(如图3中图B)。将不同组疫苗与DC混合培养24h后收集DC细胞，提取RNA后通过RT-PCR检测，疫苗处理后DC中Tnf-α和Il-6的表达增多(如图3中图C)。
实验结果说明，本发明两种疫苗可以有效激活DC细胞，免疫效果优良。
综上，本发明疫苗基于乳酸的肿瘤全细胞疫苗可以有效诱导体液免疫，激活DC细胞，抑制肿瘤细胞，具有非常优良的免疫效果，临床应用前景优良。
Claims (10)
1.一种肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：它是将肿瘤细胞置于含有乳酸的培养基中培养后，灭活制备而成。
2.根据权利要求1所述的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述含有乳酸的培养基中，乳酸的浓度是10～30mmol/L。
3.根据权利要求2所述的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述含有乳酸的培养基中，乳酸的浓度是20mmol/L。
4.根据权利要求1所述的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述灭活方式是辐照灭活，优选用X线照射辐照灭活，照射剂量为50Gy。
5.根据权利要求1所述的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述疫苗中还添加有佐剂。
6.根据权利要求5所述的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述佐剂为高盐-氢氧化铝复合佐剂，所述高盐-氢氧化铝复合佐剂为氯化钠溶液与AI(OH)3凝胶混合制备而成，其中，氯化钠溶液与AI(OH)3凝胶的体积重量比为(3～6):1，优选为4.5：1；所述疫苗复合物中，氯化钠的浓度为3～4(w/v)，优选为3.6％(w/v)。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述疫苗中，肿瘤细胞的浓度为1×106～1×108细胞/ml，优选为1×107细胞/ml。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于：所述细胞为肿瘤细胞LL2，其培养基为RPMI1640培养基，细胞培养时添加10％的胎牛血清和1％的抗生素，培养后采用RPMI1640培养基重悬。
9.一种制备权利要求权利要求1～8任意一项所述的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)取肿瘤细胞，置于含有乳酸的培养基中培养，采用培养基重悬；
2)灭活；
优选地，还包括步骤3)添加免疫佐剂。
10.权利要求权利要求1～8任意一项所述的肿瘤全细胞疫苗在制备治疗肿瘤的药物中的用途；优选地，所述药物是治疗肺癌的药物。
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