TW202116339A - 防治球蟲病的植生素配方 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種防治球蟲的植生素配方，特別是公開了一種防治球蟲組合物及其用途。該防治球蟲組合物包含（a）有效量之印度艾萃取物；及（b）有效量之咸豐草萃取物。該防治球蟲組合物可進一步包含醫藥上可接受的載劑、賦形劑或載體，及/或動物飼料。本發明之防治球蟲組合物可用於製備在個體有需要時用以殺死球蟲卵囊、抑制球蟲卵囊芽孢化、減少孢子體入侵以及減少血便、或用於減輕、或治療球蟲病的藥物之用途。另外，本發明可提供一種包含有效量之印度艾萃取物和醫藥上可接受的載劑之防治球蟲配方，且該防治球蟲配方用於製備殺死球蟲卵囊、抑制球蟲卵囊芽孢化和減少孢子體入侵的藥物之用途。

Description

防治球蟲病的植生素配方
本發明是關於一種用於治療球蟲病的植生素配方，特別是一種包含混和印度艾和咸豐草的防治球蟲植生素配方。
球蟲病是一種主要的家禽類寄生蟲病，造成家禽業的巨大經濟損失。在球蟲亞綱下的艾美球蟲（Eimeria ）屬，其具孢子型態，為單細胞的寄生性原生動物，會感染魚類、爬行動物、鳥類和哺乳動物。雞容易被至少11種的艾美球蟲感染，其中，E. tenella 、E. necatrix 、E. brunetti 和E. maxima 的毒性較高，而E. acervulina 、E. praecox 和E. mitis 的毒性較低。艾美球蟲的感染通常是無症狀的，但在小雞或免疫受損的雞隻會表現出嚴重的臨床症狀，包括腹瀉、血便、脫水、下垂、精神萎靡、食慾不振、面色蒼白、羽毛鬆動和蜷縮。
艾美球蟲的生命週期具有細胞內、細胞外、無性和有性階段。當雞隻一被艾美球蟲感染，寄生蟲就會在雞隻中生長，並產生一個微小的卵（稱為卵囊），該卵囊會在雞隻的糞便中被傳播出去。在適當的溫度和濕度條件下，卵囊會在一到兩天內發育形成芽孢化的卵囊，其能夠感染其他雞隻。在此階段，卵囊包含八個子體（稱為孢子體），當卵囊被雞隻吃下去後每個孢子體都能進入雞隻的腸細胞。進入細胞後，孢子體會多次分裂產生後代（裂殖子）。每個裂殖子又可以進入到另外的腸細胞。此週期可能重複數次，並導致大量的腸細胞被破壞。最後，週期停止並產生性細胞（雄性和雌性）。雄性使雌性受精產生卵囊，卵囊從腸細胞破裂並隨著糞便被排出體外，而成千上萬個卵囊可能會在被感染雞隻的糞便中被傳播。因此，在擁擠或不衛生條件下飼養的家禽有高度風險被感染。
植物被認為是動物以及人類藥物的絕佳來源，其中菊科植物–咸豐草被宣稱為可治療球蟲病的防治球蟲藥草。在美國專利號 9,072,312 揭露了咸豐草和聚乙炔類化合物可用來預防和治療球蟲病。然而，雖然咸豐草及其活性化合物可以預防和治療球蟲病，但其預防和治療效果有時在骯髒的雞舍中是無效的。
本案提供一種防治球蟲組合物，其包含（a）一有效量之印度艾萃取物；（b）一有效量之咸豐草萃取物；以及（c）一醫藥上可接受之載劑、賦形劑或載體。
本案另提供一種防治球蟲組合物，其包含（a）一有效量之印度艾萃取物或粉末；以及（b）一有效量之咸豐草萃取物或粉末。
根據上述構想，其中該防治球蟲組合物包含（a）一有效量之印度艾萃取物；以及（b）一有效量之咸豐草萃取物；或（a）一有效量之印度艾萃取物；以及（b）一有效量之咸豐草粉末；或（a）一有效量之印度艾粉末；以及（b）一有效量之咸豐草萃取物；或（a）一有效量之印度艾粉末；以及（b）一有效量之咸豐草粉末。防治球蟲組合物可進一步包含一醫藥上可接受的載劑、賦形劑或載體。
根據上述構想，其中該防治球蟲組合物為口服劑型，包括錠劑、丸劑、軟膠囊、硬膠囊、顆粒劑、粉劑、濃縮物、溶液、模製球（molded balls）及其任何組合。
根據上述構想，其中該防治球蟲組合物可進一步包含一動物飼料、一非人類動物之飼料或食物。
根據上述構想，其中該動物飼料選自由家禽飼料、魚類食物、兩生類飼料、爬蟲類食物、鳥類飼料及非人類之哺乳類食物組成之群組。
根據上述構想，該印度艾萃取物與該咸豐草萃取物之比例，以約 0.0001：1.0 至 1.0：1.0 的比例存在。
根據上述構想，該印度艾萃取物的量為該防治球蟲組合物重量的 0.0001% 至 0.01% 。該印度艾的量約在 0.00005% 至 0.005%（w/w）或約在 0.001% 至 0.01%（w/w）的範圍內。
根據上述構想，該咸豐草萃取物的量為該防治球蟲組合物重量的 0.01% 至 0.1% 。該咸豐草的量約在 0.005% 至約 0.05% 的範圍內。
根據上述構想，該印度艾包含綠原酸（chlorogenic acid）。
本案另提供一種防治球蟲組合物，主要由或由（a）一有效量之印度艾萃取物或粉末；（b）一有效量之咸豐草萃取物或粉末；以及（c）一非人類動物之飼料或食物組成。
本案另提供一種防治球蟲組合物，主要由或由（a）一有效量之印度艾萃取物或粉末；以及（b）一有效量之咸豐草萃取物或粉末組成。
根據上述構想，該防治球蟲組合物為非水性液體（non-aqueous liquid）、水性液體（aqueous liquid）、懸浮液或粉末形式。
另一方面，本案提供一種防治球蟲組合物用於製備殺死球蟲卵囊和抑制球蟲卵囊芽孢化的藥物之用途。
另一方面，本案提供一種防治球蟲組合物用於製備在個體有需要時以殺死球蟲卵囊、抑制球蟲卵囊芽孢化、減少孢子體入侵和減少血便、或用於減輕、或治療球蟲病的藥物之用途。
另一方面，本案提供一種包含一有效量之印度艾萃取物和一醫藥上可接受的載劑的防治球蟲配方，該防治球蟲配方用於製備殺死球蟲卵囊、抑制球蟲卵囊芽孢化和減少孢子體入侵的藥物之用途。
本案之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效將可透過下述優選實施例結合圖式說明而使本領域具通常知識者瞭解其創作精神並據以實施，對於該實施例所做的任何簡單修改與變化，皆不脫離本發明之新穎觀念、精神與揭露範疇。
下述用於闡述一個或多個本發明實施例的圖式及其說明，係用以解釋本發明之基本原理。只要有可能，圖式中所使用之相同編碼係代表實施例中相同或相似的元件。
本說明書所使用的術語在本發明的前後文以及每個術語被特定使用的前後文，在所屬技術領域中具有其特定含義。這些用於描述發明內容的術語將在下面或說明書的其他地方討論，以提供實施者有關本發明描述的進一步引導。為了方便閱讀，這些術語可能會被特定標示，例如使用斜體和 / 或引號。這些特定標示並不影響術語所代表之範疇及含義；無論是否有特定標示，在同一前後文中，該術語的範圍及含義皆相同。應當理解，相同事物可以用多種方式來描述。因此，替代用語和同義詞可用於本文所討論的任何一種或多種術語，無論該術語是否有被詳細闡述或討論，都不會被賦予任何特別不同之意義。部分術語之同義詞於本文中有提供。一個或多個同義詞之說明不代表排除使用其他同義詞表述，本說明書中任一處所使用的例子，包括在此所討論的任何術語僅供說明用，無法用於限制本發明或任何例示性術語之範疇及意義。同樣的，本發明亦不局限於本說明書所給的各種不同實施例。
除非另有定義，這裡所使用的技術性及科學性術語，與本發明領域之具有通常技藝者所知相同。如有衝突，以本文件及其定義為主。
本文所使用的「約」、「大約」或「大致」等詞應實質上代表所述之數值或範圍的20%以內，較佳為10%以內，以及更佳者為5%以內。於本文所提供之數值為近似值，意即沒有明確表示下，可以被推斷出術語「約」、「大約」或「大致」。
約 0.00005% 至 0.005% 意即所有位於此範圍內之十萬分之一、萬分之一、千分之一、百分之一、十分之一以及整數之單位數量皆為本發明所揭露之部分。因此， 0.00005% 、 0.00006% 、 0.00007% . . . 0.00009% 、 0.0001% 、 0.0002% . . . 及 0.0009%、 0.001% 、 0.0011% . . . 及 0.0048 %、 0.0049 %、 0.005% 單位數量皆為本發明之具體實施例所包括之數量。
約 0.0001% 至 0.01% 意即所有位於此範圍內之萬分之一、千分之一、百分之一、十分之一以及整數之單位數量皆為本發明所揭露之部分。因此，0.0001% 、 0.0002% 、 0.0003% . . . 0.0009%、 0.001%、 0.0011% . . . 及 0.0098% 、 0.0099% 、 0.01% 單位數量皆為本發明之具體實施例所包括之數量。
約 0.005% 至 0.05% 意即所有位於此範圍內之千分之一、百分之一、十分之一以及整數之單位數量皆為本發明所揭露之部分。因此， 0.005% 、 0.006% 、 0.007% . . . 0.0099% 、 0.01%、 0.011% . . . 及 0.048% 、 0.049% 、 0.05% 單位數量皆為本發明之具體實施例所包括之數量。
約 0.01% 至 0.1% 意即所有位於此範圍內之百分之一、十分之一以及整數之單位數量皆為本發明所揭露之部分。因此，0.01% 、 0.02% 、 0.03% . . . 及 0.08%、 0.09% 、 0.1% 單位數量皆為本發明之具體實施例所包括之數量。
本文所述之「混合物」表示不同種類的任何組合或不同種類的混和。
本發明涉及包含咸豐草之抗球蟲活性的植生素配方。
咸豐草和印度艾萃取物的製備。
印度艾萃取物的製備：印度艾是從臺灣苗栗的校園中採集的。將全部約 1 公斤之整株乾燥植物於 10 公升之 100℃ 水中進行回流 2 小時。經移除水相後，將不可溶物質置於 10 公升水中再次進行回流 2 小時。將上述水溶液合併一起凍乾後得到粗產物（0.15 kg）。以綠原酸當作每批次之一致性的標誌，於取得該綠原酸後以1 H NMR 及13 C NMR 進行性質分析。
咸豐草萃取物的製備：使用上述之相似的方法來收集和處理咸豐草。將全部約 1 公斤之整株乾燥植物於 10 公升之 100℃ 水中進行回流 2 小時，並重複萃取一次。將上述水溶液合併一起凍乾後得到粗產物（0.12 kg）。以聚多炔糖苷（cytopiloyne）當作每批次之一致性的標誌，於取得該聚乙炔化合物（Polyacetylenic compounds）後以1 H NMR及13 C NMR進行性質分析。所得之純化合物可進一步衍生以提供數種本發明之其他聚乙炔化合物（美國專利號7,763,285 及 Kusano 等人（JP 2004083463），所有這些文獻內容透過引用整併至本文中）。
印度艾萃取物和咸豐草萃取物為以粉末形式使用。計算植物萃取物粉末的百分比方法為：植物粉末重量 / 植物粉末重量 ± 基本的雞隻飼料 = 植物粉末之百分比（%）。
本發明係有關於具防治球蟲特性之印度艾以及含有印度艾和咸豐草的配方。
實施例
材料與方法
化學品：沙利黴素（salinomycin）、磷酸鹽緩衝溶液（PBS）、 H&E 染色購買自 SIGMA-ALDRICH™，印度艾和咸豐草經沸水處理萃取後以不同比例混和供後續使用。
入侵分析：將牛腎上皮（MDBK, ATCC® CCL-22）細胞用含有 10% 胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和其餘營養物的 DMEM 培養液培養，並以每孔 2 × 105 細胞數／孔盤種入 24 孔盤之玻璃蓋玻片上。一天後，將細胞在含有沙利黴素（salinomycin）或含有特定劑量之植物萃取物和植物化學物質的 DMEM 培養液中先培養 0.5 小時，接著把新鮮的孢子體（2 × 105 ）加在培養液中再培養 4 小時。以大量磷酸鹽緩衝溶液（PBS）清洗後，將細胞固定並用 H & E 染色。用顯微鏡拍攝照片。藉由 100% ×（被孢子體入侵的細胞數/總細胞數）之公式求出入侵率（%）。
活性測試（Viability test）：將艾美球蟲孢子體與植物萃取物或沙利黴素（salinomycin）一起培養 4.5 小時。使用顯微鏡區分在孢子體下的活細胞和死細胞（圖3）。透過死細胞數除以總細胞數乘以 100% 計算存活率（%）。
芽孢化分析（Sporulation assay）：將艾美球蟲卵囊分別用磷酸鹽緩衝溶液（PBS）、沸騰處理（100°C 30 分鐘）或與指定劑量之植物萃取物培養 48 小時預處理。在芽孢化前，將卵囊與 2% 之重鉻酸鉀（potassium dichromate）培養 2 天。計算芽孢化的卵囊之百分比（%）。
碘化丙啶（PI）染色艾美球蟲的孢子體：艾美球蟲卵囊分別經磷酸鹽緩衝溶液（PBS）（1 小時）、沸騰處理（100°C 30 分鐘）或與指定劑量之植物萃取物培養 1 小時預處理。將卵囊以 PI 染色，再用磷酸鹽緩衝溶液（PBS）清洗後，使用顯微鏡觀察卵囊。
雞隻、飲食和實驗設計：雞齡 1 日之羅曼肉雛雞（Lohmann broiler chicks）係購自台中（台灣）孵化雞場。抵達時進行雞翅綁紮，以及稱重並隨機放在 Petersime 雛雞育雛單元（Petersime starter brooder units）中。孵化後 1 至 2 天，讓雞隻自由飲水和飲食。雞隻的飲食包括標準飲食（控制組）或標準飲食搭配特定劑量之印度艾、咸豐草或同時含有印度艾和咸豐草之植生素配方。分組後，將雞隻用管餵方式給予艾美球蟲卵囊使雞隻感染。測量和檢查雞隻之成長表現（體重和飼料轉換率）、病理學（血便和腸道型態檢定）和存活率（圖 4A）。所有雞隻都被飼養在機構的動物設施中，並根據機構的指引進行管理。
免疫組織化學染色法：分別從標準飲食（控制組）、標準飲食搭配印度艾、標準飲食搭配咸豐草或標準飲食搭配印度艾和咸豐草餵食14天之雞隻取出盲腸快速冷凍進行多個平行切片。將切片用 H&E 染色或抗胰島素抗體染色，搭配二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（diaminobenzidine tetrahydrochloride）顯影，然後進行影像分析。(Yang et al.Research in Veterinary Science (2015) 98:74-81 ).
統計分析：來自三個或更多個獨立實驗結果以平均值± 標準誤差（mean ± SE）呈現。數據以 ANOVA 分析是否有顯著差異， P 值小於 0.05 的差異被認為具有統計學意義。
結果
植物萃取物對艾美球蟲卵囊的存活、卵囊芽孢化和孢子體入侵的影響
為了研究印度艾萃取物、咸豐草萃取物和混和印度艾與咸豐草之萃取物的效果，分別觀察印度艾萃取物、咸豐草萃取物和混和印度艾與咸豐草之萃取物對艾美球蟲卵囊的直接殺傷性。以沸騰處理作為之正對照組，其藉由碘化丙啶（PI）染色顯示可有效殺死 30% 的艾美球蟲卵囊（沸騰處理，圖 1A）。印度艾萃取物直接殺死艾美球蟲卵囊的效果具有劑量依賴性（dose-dependent manner）（圖 1A，右圖）。咸豐草萃取物未能殺死艾美球蟲卵囊（圖 1B）。混和印度艾與咸豐草之萃取物可直接殺死艾美球蟲卵囊（圖 1C）。
測試植物萃取物對艾美球蟲卵囊芽孢化的影響。 70% 的艾美球蟲卵囊能夠在體外培養中形成孢子（PBS，圖 2A）。以連二亞硫酸鈉（SD）作為正對照組治療使艾美球蟲卵囊的芽孢化現象較以磷酸鹽緩衝溶液（PBS）治療之組別減少 40% （SD，圖 2A，右圖）。印度艾萃取物對減少艾美球蟲卵囊的芽孢化具有劑量依賴性（圖 2A）。咸豐草萃取物抑制對艾美球蟲卵囊的芽孢化也具有劑量依賴性（圖 2B）。混和印度艾與咸豐草之萃取物抑制艾美球蟲卵囊的芽孢化具有加乘效果（圖 2C）。
測試咸豐草萃取物對艾美球蟲孢子體入侵 MDBK 細胞的影響。根據楊等人的報告（Scientific Reports （2019）9：2896，），艾美球蟲孢子體可入侵 20% 的細胞（圖 3A，右圖）。50μg/ ml 的抗球蟲藥–沙利黴素（salinomycin）可將艾美球蟲孢子體的入侵率降低至 10% 。印度艾萃取物減少艾美球蟲孢子體的入侵效果具有劑量依賴性（圖 3A，右圖）。咸豐草萃取物減少艾美球蟲孢子體入侵 MDBK 細胞的效果亦具有劑量依賴性（圖 3B，右圖）。混和印度艾與咸豐草之萃取物減少艾美球蟲孢子體入侵細胞具有加乘效果（圖 3C，右圖）。數據顯示，混和印度艾與咸豐草之萃取物治療可以干擾艾美球蟲在生命週期中的卵囊、卵囊芽孢化和孢子體入侵細胞之階段。與單獨使用印度艾萃取物或咸豐草萃取物相比，混和印度艾與咸豐草之萃取物在抑制艾美球蟲卵囊芽孢化和艾美球蟲孢子體入侵方面更為有效。數據顯示印度艾和咸豐草具有不同的抗球蟲作用機制。
植物萃取物對被艾美球蟲感染雞隻的存活率、體重增加和飼料轉化率的影響
在體內試驗（in vivo）觀察印度艾萃取物、咸豐草萃取物和混和印度艾與咸豐草之萃取物的防治球蟲效果。將雞隻隨機分為 8 組，每天（第 1 天至第 14 天）以標準飲食餵食（第 1 組和第 2 組），以含有沙利黴素（salinomycin）之飼料餵食（第 3 組），分別以含特定劑量之植物萃取物的飼料餵食（第 4 組至第 8 組）（圖 4A）。
圖 4B 顯示以標準飲食餵養之雞隻在被艾美球蟲感染後之存活率從 100%（CTR，第1組）下降到 60%（Et，第 2 組）。以含有沙利黴素（salinomycin）之飼料餵養的被感染雞隻之存活率為 100%（第 3 組）。同樣地，以含有印度艾（AI）萃取物、咸豐草（BP）萃取物或混和印度艾與咸豐草之萃取物餵養之被感染雞隻的存活率均為 100%（第 4 組至第 8 組）。
表 1 顯示植物萃取物對被艾美球蟲感染雞隻在體重增加效果上的影響。根據圖 4B，於第 1 天、第 7 天和第 14 天測量雞隻的體重（BW），並在第 7 天和第 14 天計算體重增加量（BWG）。在第 7 天（艾美球蟲感染前），不同組別之雞隻體重的增加量相似（第 7天 的體重減去第 1 天的體重）。在第7天，以管餵方式給予第 2 組到第 8 組的雞隻艾美球蟲卵囊（1×104 ）使之感染，而控制組（第 1 組）之雞隻則給予 PBS。在第 14 天（艾美球蟲感染後），未感染且未用藥雞隻（第 1 組）、被感染且未用藥雞隻（第 2 組）、被感染且以沙利黴素（salinomycin）治療之雞隻（第 3 組）、被感染且以 0.01% 咸豐草萃取物治療之雞隻（第 4 組）、被感染且以混和 0.0001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物治療之雞隻（第 5 組）、被感染且以混和 0.001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物治療之雞隻（第 6 組）、被感染且以混和 0.01% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物治療之雞隻（第 7 組）、被感染且以 0.01% 印度艾萃取物治療之雞隻（第 8 組）的平均體重增加量（第 14 天的體重減去第 1 天的體重），分別為 88.84 公克、 50.80 公克、 56.33 公克、 61.98 公克、 62.91 公克、 64.65 公克、 67.66 公克和 59.78 公克。數據顯示，使用混和印度艾與咸豐草之萃取物比僅單獨使用其中一種之萃取物具有更好的體重增加效果。 表1
  體重增加  （公克）a P值b P值c 體重增加  （公克）a P值b P值c
組別 第7-第1天 第7-第1天 第7-第1天 第14-第1天 第14-第1天 第14-第1天
1 (n=15, 0) 28.91 ± 1.45     88.84 ± 1.95    
2 (n=15, 1x104 ) 28.55 ± 1.04 ＞ 0.05   50.80 ± 2.13 ＜ 0.001  
3 (n=15, 1x104 ) 27.64 ± 1.16 ＞ 0.05 ＞ 0.05 56.33 ± 3.15 ＜ 0.001 ＜ 0.01
4 (n=15, 1x104 ) 27.86 ± 1.57 ＞ 0.05 ＞ 0.05 61.98 ± 1.86 ＜ 0.001 ＜ 0.001
5 (n=15, 1x104 ) 28.96 ± 1.70 ＞ 0.05 ＞ 0.05 62.91 ± 2.83 ＜ 0.001 ＜ 0.05
6 (n=15, 1x104 ) 29.31 ± 1.77 ＞ 0.05 ＞ 0.05 64.65 ± 2.39 ＜ 0.001 ＜ 0.01
7 (n=15, 1x104 ) 29.99 ± 0.66 ＞ 0.05 ＞ 0.05 67.66 ± 1.96 ＜ 0.001 ＜ 0.001
8 (n=15, 1x104 ) 29.17 ± 1.93 ＞ 0.05 ＞ 0.05 59.78 ± 2.14 ＜ 0.001 ＜ 0.05
a ：重量增加（BWG）公式：第7天雞隻之重量或第14天雞隻之重量減去第1天雞隻之重量；第7-第1天代表第7天測得的體重增加量；第14-第1天代表第14天測得的體重增加量。b ：第1組與其他組之間的統計比較。c ：第2組與其他組之間的統計比較。
表 2 顯示植物萃取物對被艾美球蟲感染雞隻的飼料轉化率（FCR）之影響。在第 14 天（艾美球蟲感染後），控制組雞隻（第 1 組）、被感染且未用藥雞隻（第 2 組）、被感染且以沙利黴素（salinomycin）餵食之雞隻（第 3 組）、被感染且以 0.01% 咸豐草萃取物餵食之雞隻（第 4 組）、被感染且以混和 0.0001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物餵食之雞隻（第 5 組）、被感染且以混和 0.001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物餵食之雞隻（第 6 組）、被感染且以混和 0.01% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物餵食之雞隻（第 7 組）、被感染且以 0.01% 印度艾萃取物餵食之雞隻（第 8 組）的平均飼料轉換率分別為 2.24 、 3.38 、 3.05 、 2.60 、 3.01 、 3.04 、 2.88 和 2.96 。結果顯示，與單獨餵食沙利黴素（salinomycin）或以標準飲食餵養之組別相比，印度艾萃取物、咸豐草萃取物或混和印度艾與咸豐草之萃取物均可顯著改善艾美球蟲感染引起的體重減輕，並可大幅度地改善由艾美球蟲感染引起的飼料轉化率之增加。造成改善的部分原因可以歸因於植物萃取物的增重效果。 表2
組別 飼料轉換率
  飼料轉換率 P值a P值b 飼料轉換率 P值a P值b
  第7-第1天 第7-第1天 第7-第1天 第14-第1天 第14-第1天 第14-第1天
1 (n=15, 0) 2.10 ± 0.09     2.24 ± 0.05    
2 (n=15, 1x104 ) 2.20 ± 0.06 ＞ 0.05   3.38 ± 0.13 ＜ 0.001  
3 (n=15, 1x104 ) 2.42 ± 0.08 ＞ 0.05 ＞ 0.01 3.05 ± 0.13 ＜ 0.001 ＞ 0.05
4 (n=15, 1x104 ) 2.17 ± 0.08 ＞ 0.05 ＞ 0.05 2.60 ± 0.09 ＜ 0.001 ＜ 0.001
5 (n=15, 1x104 ) 2.27 ± 0.12 ＞ 0.05 ＞ 0.05 3.01 ± 0.12 ＜ 0.001 ＞ 0.05
6 (n=15, 1x104 ) 2.46 ± 0.14 ＞ 0.05 ＞ 0.05 3.04 ± 0.11 ＜ 0.001 ＞ 0.05
7 (n=15, 1x104 ) 2.16 ± 0.05 ＞ 0.05 ＞ 0.05 2.88 ± 0.10 ＜ 0.001 ＜ 0.01
8 (n=15, 1x104 ) 2.51 ± 0.17 ＞ 0.05 ＞ 0.05 2.96 ± 0.15 ＜ 0.001 ＞ 0.05
透過公式可得出不同組雞隻的飼料轉化率（FCR）：飼料攝取量（Kg）除以第7天或第14天增加的體重；第7-第1天代表第7天測得的體重增加量；第14-第1天代表第14天測得的體重增加量。a ：第1組與其他組之間的統計比較。b ：第2組與其他組之間的統計比較。
植物萃取物對被艾美球蟲感染雞隻糞便中卵囊排放量(on fecal oocyst excretion)的影響
表 3 顯示每組之糞便中卵囊排放量的情形。被艾美球蟲感染雞隻糞便中之艾美球蟲卵囊排放量是艾美球蟲繁殖的指標。圖 4B 中雞隻的每公克糞便卵囊數（OPG）於雞隻被艾美球蟲感染後的第 3 天至第 7 天計算。在未感染且未用藥之控制組雞隻中未檢測到糞便中有卵囊（第 1 組，表 3）。感染後的第 4 天，所有被艾美球蟲感染的組別中都首次檢測到糞便中有卵囊。其中，第 2 組在感染後第 7 天達到高峰值；餵食沙利黴素（salinomycin）的被感染雞隻（第 3 組）每公克糞便中的卵囊數比被感染且未用藥之雞隻（第 2 組）略少；分別以 0.01% 咸豐草萃取物、混和 0.0001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物、混和 0.001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物、混和 0.01% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物和 0.01% 印度艾萃取物餵養的受感染雞隻（第 4 組到第 8 組）的每公克糞便卵囊數明顯少於被感染且未用藥的雞隻（第 2 組）。數據顯示，與單獨使用印度艾萃取物和咸豐草萃取物相比，使用混和印度艾與咸豐草之萃取物可以降低更多的每公克糞便中的卵囊數。 表3
組別 感染後天數
  3 4 5 6 7
Ln(OPG±1) Ln(OPG±1) Ln(OPG±1) Ln(OPG±1) Ln(OPG±1)
1 (n=15, 0) 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
2 (n=15, 1x104 ) 0 ± 0 3.86 ± 0.04a 4.95 ± 0.02a 5.31 ± 0.06a 5.56 ± 0.02a
3 (n=15, 1x104 ) 0 ± 0 3.45 ± 0.16a,b 4.49 ± 0.02a,b 4.89 ± 0.01a,b 5.33 ± 0.01a,b
4 (n=15, 1x104 ) 0 ± 0 3.26 ± 0.15a,b 4.42 ± 0.05a,b 4.86 ± 0.02a,b 5.18 ± 0.02a,b
5 (n=15, 1x104 ) 0 ± 0 3.26 ± 0.15a,b 4.42 ± 0.01a,b 4.87 ± 0.03a,b 5.17 ± 0.01a,b
6 (n=15, 1x104 ) 0 ± 0 3.20 ± 0.10a,b 4.41 ± 0.03a,b 4.84 ± 0.03a,b 5.15 ± 0.01a,b
7 (n=15, 1x104 ) 0 ± 0 3.15 ± 0.28a,b 4.39 ± 0.02a,b 4.77 ± 0.02a,b 5.11 ± 0.01a,b
8 (n=15, 1x104 ) 0 ± 0 3.30 ± 0.17a,b 4.39 ± 0.02a,b 4.88 ± 0.03a,b 5.23 ± 0.01a,b
每組雞隻的每公克糞便卵囊數（OPG）值轉換為ln（x±1），且在常態分布下使用SAS系統的GLM程序進行變異數分析（ANOVA）(analyzed with ANOVA using the GLM procedure of SAS system under a normal distribution)。數字（n）表示每組雞隻的總數量。a ：第1組與其他組之間的統計比較。b ：第2組與其他組之間的統計比較。
植物萃取物對被艾美球蟲感染雞隻的腸道損傷之影響
表 4 顯示被艾美球蟲感染後第 7 天之雞隻的盲腸肉眼病變分數。觀察並評分圖 4B 中雞隻的盲腸肉眼病變。未被感染且未用藥的控制組雞隻（第 1 組，表 4）盲腸沒有病變（分數= 0）。被感染且未用藥的雞隻（第 2 組）在感染後第 7天 的平均盲腸肉眼病變分數為 4 分，顯示其腸道出現更多盲腸肉眼病變。餵食沙利黴素（salinomycin）的被感染雞隻的平均盲腸肉眼病變分數為 3.86 分（第 3 組）。分別以 0.01% 咸豐草萃取物、 混和 0.0001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物、混和 0.001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物、混和 0.01% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物和 0.01% 印度艾萃取物餵食的受感染雞隻（第 4 組到第 8 組），其盲腸肉眼病變分數顯著地低於被感染且未用藥的雞隻（第 2 組）。數據顯示，使用混和印度艾與咸豐草之萃取物降低腸道損傷的程度較其他任何單獨萃取物的效果還要大。 表4
組別 肉眼病變分數 平均分數 P值a P值b
0 1 2 3 4
1 (n=15, 0) 14/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0 ± 0    
2 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 0/15 0/15 10/15 4.00 ± 0.00 ＜ 0.0001  
3 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 0/15 1/15 6/15 3.86 ± 0.10 ＜ 0.0001 0.208
4 (n=15, 1x104 ) 0/15 1/15 3/15 4/15 1/15 2.56 ± 0.23 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
5 (n=15, 1x104 ) 0/15 5/15 3/15 4/15 0/15 2.14 ± 0.28 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
6 (n=15, 1x104 ) 0/15 5/15 3/15 4/15 0/15 1.92 ± 0.23 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
7 (n=15, 1x104 ) 0/15 6/15 1/15 2/15 0/15 1.56 ± 0.23 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
8 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 5/15 1/15 4/15 2.90 ± 0.26 ＜ 0.0001 ＜ 0.05
分數中的分子和分母表示在 5 個級別中（0 至 4）有盲腸肉眼病變的雞隻之數量。數字（n）表示每組雞隻的總數量。 在多項式變換後利用卡方檢定分析(analyzed by chi-square test after multinomial transformation)並以 P 值表示被感染有用藥之雞隻組和被感染未用藥之雞隻組（第 2 組）間的盲腸肉眼病變分數的差異。a ：第1組與其他組之間的統計比較。b ：第2組與其他組之間的統計比較。
表 5 顯示圖 4B 中被艾美球蟲感染後第 7 天之雞隻的盲腸顯微鏡檢病變分數。在顯微鏡下觀察球蟲引起的黏膜損傷，並根據雞隻的盲腸黏膜損傷之分佈和嚴重程度計算盲腸顯微鏡檢病變分數。
在未感染且未用藥之控制組雞隻（第 1 組）中未觀察到盲腸顯微鏡檢病變（分數= 0）。被感染且未用藥的雞隻（第 2 組）在被感染後的第 7 天盲腸有嚴重的顯微鏡檢病變（分數= 7.2），且盲腸中還有嚴重潰瘍、出血和絨毛減少的現象（數據未公開），且盲腸上皮內部出現卵囊、配子體和裂殖子（數據未公開）。與被感染且未用藥的雞隻（第 2 組）相比，餵食沙利黴素（salinomycin）的被感染雞隻（第 3 組）在盲腸的顯微鏡檢病變（分數= 6.29）上有輕微改善。然而，餵食咸豐草萃取物、混和印度艾與咸豐草之萃取物或單獨印度艾萃取物之被感染雞隻（第 4 組到第 8 組，表 5）的盲腸的顯微鏡檢病變顯著減少（分數為 4.78 至 5.80）。結果一致地，餵食咸豐草萃取物相較於控制組的飲食，可使得雞隻之潰瘍和出血狀況減少，且在雞隻盲腸中保留了更多的黏膜和絨毛（數據未公開）。餵食咸豐草萃取物之被感染雞隻也比餵食沙利黴素（salinomycin）的被感染雞隻和控制組飲食之雞隻的盲腸上皮內卵囊、配子和裂殖子的數量較少（數據未公開）。總體來說，咸豐草萃取物、混和印度艾與咸豐草之萃取物或單獨印度艾萃取物可明顯地減輕被艾美球蟲感染後雞隻的腸道病理現象。數據顯示，混和印度艾與咸豐草之萃取物降低腸道顯微損傷的程度較其他任何單獨萃取物的效果還要大。 表5
組別 顯微病變分數1 平均分數 P值2
  0 1 3 5 7   Pa Pb
1 (n=15, 0) 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0 ± 0 ＜ 0.0001  
2 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 0/15 0/15 4/15 7.20 ± 0.20 ＜ 0.0001  
3 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 0/15 0/15 2/15 6.29 ± 0.13 ＜ 0.0001 ＜ 0.05
4 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 0/15 4/15 1/15 4.78 ± 0.25 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
5 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 0/15 4/15 0/15 4.57 ± 0.14 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
6 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 2/15 2/15 0/15 3.83 ± 0.22 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
7 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 2/15 4/15 0/15 3.44 ± 0.26 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001
8 (n=15, 1x104 ) 0/15 0/15 0/15 0/15 3/15 5.80 ± 0.27 ＜ 0.0001 ＜ 0.05
1 ：顯微病變分數以分數（分子和分母）表示。分數中的分子和分母表示腸道樣本中顯微病變總和（0 至 4 個），其中每個腸道切成 5 個切片，每組觀察的腸道樣本數量乘以 5。(The numerator and denominator in a fraction represent the sum of microscopic lesions (0 to 4) in the gut samples, 5 section slides per gut, and the number of the examined gut samples multiplied by 5 per group.)2 ：在多項式變換後利用卡方檢定分析(analyzed with a chi-square test after multinomial transformation)並以 Pa 表示被感染有用藥之雞隻組和未感染未用藥之雞隻組（第 1 組）間的盲腸顯微病變分數之差異。同樣地，用 Pb 表示被感染有用藥之雞隻組和被感染未用藥之雞隻組（第 2 組）間的盲腸顯微病變分數之差異。
植物萃取物對被艾美球蟲感染雞隻的血便之影響
圖 5 顯示被艾美球蟲感染後第 7 天每個雞隻組別中血便的百分比。在未感染之控制組雞隻（CTR，第 1 組）中沒有血便。艾美球蟲感染引起 100% 的血便（第 2 組）。餵食沙利黴素（salinomycin）的被感染雞隻的血便百分比明顯降低（第3組）。分別以 0.01% 咸豐草萃取物、混和 0.0001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物、混和 0.001% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物、 混和 0.01% 印度艾與 0.01% 咸豐草之萃取物和 0.01% 印度艾萃取物（第 4 組至第 8 組）餵食的被感染雞隻和被感染且未用藥的雞隻（第 2 組）相比，血便百分比顯著降低。數據顯示，混和印度艾與咸豐草之萃取物降低血便現象的程度較其他任何單獨萃取物的效果還要大。
在不脫離本發明的精神及範圍內，對於本發明所屬技術領域的技術人員而言，可易於了解本發明之實施例替代方案，因此本發明之範圍應以申請專利範圍之內容為主，而不是以上述示例性實施例內容及其描述來定義。
圖 1A-C 為顯微照片（上圖）和長條圖（下圖）描述在體外試驗（in vitro）中含有印度艾（A. indica , AI）和咸豐草（B. pilosa, BP）或印度艾和咸豐草混合物的配方在對艾美球蟲（E.tenella , ET）卵囊活性的影響。該卵囊先用磷酸鹽緩衝溶液（PBS）（負對照組, NC）、沸騰處理（正對照組, PC）或是含印度艾的植物萃取物（1A）、含咸豐草的植物萃取物（1B）、同時含有印度艾和咸豐草的植物萃取物（1C）以指定劑量預處理 30 分鐘。接著以碘化丙啶（propidium iodide , PI）染色後，用螢光顯微鏡（左下圖）或光學顯微鏡（左上圖）觀察卵囊活性。明視野處顯示卵囊的數量。 PI-positive 之卵囊的百分比以平均值± 標準誤差（mean ± SE）表示，繪製成長條圖（右圖）；比例尺為 100μm 。
圖 2A-C 為顯微照片（上圖）和長條圖（下圖）描述在體外試驗（in vitro）中含有印度艾和咸豐草的配方或印度艾和咸豐草的混合物對艾美球蟲（ET）卵囊的活性和芽孢化的影響。該卵囊用磷酸鹽緩衝溶液（PBS）、卵囊芽孢化抑制劑–連二亞硫酸鈉（sodium dithionite, SD）或是含印度艾的植物萃取物（2A）、含咸豐草的植物萃取物（2B）、同時含有印度艾和咸豐草的植物萃取物（2C）以指定劑量預處理 48 小時，並以重鉻酸鉀誘導卵囊芽孢化 2 天。接著用顯微鏡（左圖）計數卵囊芽孢化的百分比，並繪製成長條圖（右圖）；比例尺為 200μm 。圖中箭號（↓）表示該卵囊已芽孢化，而箭頭（▼）表示該卵囊未芽孢化。
圖 3A-C 為顯微照片（左圖）和長條圖（右圖）描述在體外試驗（in vitro）中含有印度艾和咸豐草的配方或含有印度艾和咸豐草的混合物對艾美球蟲孢子體入侵的影響。將牛腎上皮（Madin–Darby bovine kidney, MDBK）細胞與沙利黴素（salinomycin, Sal）、含印度艾的植物萃取物 （3A）、含咸豐草的植物萃取物（3B）、同時含有印度艾和咸豐草的植物萃取物（3C）以指定劑量共同培養 0.5 小時，接著將孢子體加到 MDBK 細胞中 2 小時，洗淨後，將 MDBK 細胞用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin stain, H&E stain）並計算數量。被孢子體入侵的百分比（%）繪製成長條圖（右圖）。插圖代表被放大的區域。100x 和 40x （插圖）顯微鏡的比例尺分別為 10 μm 和 50 μm （插圖）。箭頭指被孢子體入侵的 MDBK 細胞。
圖 4A 為體內試驗（in vivo）之實驗步驟示意圖。未被治療的雞隻族群每天使用標準飲食，被治療的雞隻族群被餵食含有沙利黴素（salinomycin）、印度艾萃取物、咸豐草萃取物或混和印度艾和咸豐草之物。第 7 天以管餵方式給予雞隻磷酸鹽緩衝溶液（PBS）或是艾美球蟲已芽孢化的卵囊（1x104 ）。從感染後的第 1 天到第 7 天觀察每組雞隻的存活率。
圖 4B 為圖 4A 的每組雞隻存活率圖。雞隻被分為 8 組：第 1 組（G1）：未感染並以標準飲食餵養；第 2 組（G2）：被艾美球蟲染感並以標準飲食餵養；第 3～8 組（G3～G8）：被艾美球蟲染感並分別以沙利黴素（salinomycin）、咸豐草、咸豐草和不同劑量的印度艾的組合或單獨印度艾餵養。每組有 15 隻小雞並標示出 P 值。
圖 5 為圖 4A-B 中被艾美球蟲感後第 7 天的每個雞隻組別中之血便百分比長條圖。雞隻糞便在感染後的第 1 天到第 7 天即被分類。

Claims (16)

  1. 一種防治球蟲組合物，其包含： （a）一有效量之印度艾萃取物； （b）一有效量之咸豐草萃取物；以及 （c）一醫藥上可接受的載劑、賦形劑或載體。
  2. 如請求項 1 所述之防治球蟲組合物，其中該防治球蟲組合物為口服劑型。
  3. 如請求項 3 所述之防治球蟲組合物，其中該口服劑型選自錠劑、丸劑、軟膠囊、硬膠囊、顆粒劑、粉劑、濃縮物、溶液、模製球及其任何組合。
  4. 如請求項 1 所述之防治球蟲組合物，其中該防治球蟲組合物可進一步包含一動物飼料。
  5. 如請求項 4 所述之防治球蟲組合物，其中該動物飼料選自由家禽飼料、魚類食物、兩生類飼料、爬蟲類食物、鳥類飼料及非人類之哺乳類食物組成之群組。
  6. 如請求項 1 或 4 所述之防治球蟲組合物，其中該印度艾萃取物和咸豐草萃取物之比例，以0.0001：1.0 至 1.0：1.0 的比例存在。
  7. 如請求項 1 或 4 所述之防治球蟲組合物，其中該印度艾萃取物為該防治球蟲組合物重量的 0.0001% 至 0.01% 。
  8. 如請求項 6 或 7 所述之防治球蟲組合物，其中該咸豐草萃取物為該防治球蟲組合物重量的 0.01% 至 0.1%。
  9. 如請求項 1 所述之防治球蟲組合物，其中該印度艾萃取物包含綠原酸。
  10. 一種防治球蟲組合物，其包含： （a）一有效量之印度艾萃取物；以及 （b）一有效量之咸豐草萃取物。
  11. 如請求項 1 或 10 所述之防治球蟲組合物，其中該防治球蟲組合物為非水性液體、水性液體、懸浮液或粉末形式。
  12. 一種如請求項 1、請求項 6 - 8 或請求項 10 - 11 中任一項之防治球蟲組合物用於製備殺死球蟲卵囊和抑制球蟲卵囊芽孢化的藥物之用途。
  13. 一種如請求項 1 - 11 中任一項之防治球蟲組合物用於製備在個體有需要時以殺死球蟲卵囊、抑制卵囊芽孢化、減少孢子體入侵和減少血便的藥物之用途。
  14. 一種如請求項 1 - 11 中任一項之防治球蟲組合物用於製備在個體有需要時以減輕或治療球蟲病的藥物之用途。
  15. 一種包含一有效量之印度艾萃取物和一醫藥上可接受之載劑的防治球蟲配方用於製備殺死球蟲卵囊、抑制球蟲卵囊芽孢化和減少孢子體入侵的藥物之用途。
  16. 一種防治球蟲組合物，其主要由： （a）一有效量之印度艾萃取物； （b）一有效量之咸豐草萃取物；以及 （c）一非人類動物之飼料或食物組成。
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