CN104968357B - 用于预防及治疗球虫病的咸丰草及聚炔类化合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于在一动物内预防、抑制及/或治疗球虫病的组合物，该组合物包含一有效量的咸丰草、其一活性成分或一由其分离出的活性化合物。

Description

用于预防及治疗球虫病的咸丰草及聚炔类化合物

技术领域

本发明涉及球虫病的预防、抑制及治疗，且特别关于用于抗球虫病的植物及植物性化合物。

背景技术

球虫病为家禽的一种主要寄生虫疾病，且造成家禽养殖业者巨大的经济损失。由球虫病所造成的损失包含肉鸡的死亡、吸收不良、饲料利用率低下及生长率降低，以及暂时性蛋鸡产蛋量降低。经估计，球虫病于英国造成家禽养殖业者每年6,100万美元的损失。据推测，每年的全球损失将达到24亿美元。

艾美球虫属为一种球虫亚纲，其属于产孢、单细胞及绝对原生动物。也就是说，它们必须于动物细胞内才能存活及繁殖。艾美球虫为一种肠道寄生虫，并可感染鱼类、爬虫类、鸟类、哺乳类。值得注意的是，鸡只易受至少11种的艾美球虫感染。对于鸡只而言，柔嫩艾美球虫(E.tenella)、毒害艾美球虫(E.necatrix)、布氏艾美球虫(E.brunetti)及巨型艾美球虫(E.maxima)为毒性较强者，而堆型艾美球虫(E.acervulina)、早熟艾美球虫(E.praecox)及和缓艾美球虫(E.mitis)则为毒性较弱者。艾美球虫感染通常无症状，但对于年幼及免疫功能低下的动物则显示出严重的临床症状，如腹泻、血便、脱水、下垂、精神萎靡、丧失食欲、苍白、羽毛杂乱以及挤成一团。

艾美球虫的生命周期包含胞内、胞外、无性及有性阶段。一旦鸡只被艾美球虫感染后，此寄生虫会于鸡只体内发育并产生微小的虫卵(称为卵囊)，其会随着粪便排出体外。于适当的温度及湿度条件下，卵囊会于一至二天内发育成可感染其他鸡只的芽孢化卵囊。于此阶段的卵囊含有八个小体(称为孢子体)，当卵囊被吞食后，每一个孢子体可进入鸡只肠内的细胞中。当孢子体进入细胞后，可分裂多次以生成一些或许多的子代(裂殖子)。所产生的数目取决于球虫的种类。每一个裂殖子后续可进入其他的肠细胞。此循环可重复数次。由于此循环的倍增，大量的肠细胞会被破坏。最终，循环停止并产生生殖细胞(雄配子细胞及雌配子细胞)。雄配子细胞使雌配子细胞受精以生成卵囊，卵囊从肠细胞中破裂而出，并进入粪便中。数以千计的卵囊可进入受感染鸡只的粪便中。因此，若家禽被饲养于拥挤或不卫生的环境中，将有极高风险被感染。

目前使用疫苗接种及化学疗法来预防及治疗球虫病。减毒活疫苗被用于预防球虫感染，其优点在于在鸡肉中不会有残留的抗生素。然而，球虫疫苗的跨种类保护无法令人满意。相较之下，最被广泛使用的化合物是离子载体抗生素，孟宁素(monensin)、甲基盐霉素(narasin)、盐霉素(salinomycin)、马杜霉素(maduramicin)、山度霉素(semduramicin)及拉沙里菌素(lasalocid)，其可预防艾美球虫属的第一代裂殖体的发育。然而，近来已有对抗生素产生抗药性的艾美球虫品系被分离出来。再者，残留在鸡肉中的抗生素也造成公共健康的忧虑。因此，研究及发展新颖且安全的抗球虫药剂在实务上相当重要。对于人类及动物医药而言，植物被视为是极佳的来源。咸丰草(一种菊科植物)被认为是可用于多种疾病的民俗医药。

发明内容

在一方面，本发明关于一种用于在有需求的动物内预防、抑制及/或治疗球虫病的组合物。该组合物包含一有效量的咸丰草、其一活性成分或一由其分离出的活性化合物。

在另一方面，本发明关于一种用于在一动物内预防及/或治疗球虫病及/或增强生长的组合物，该组合物包含一动物饲料以及一有效量的化合物，该化合物包含一种具有以下化学结构的聚炔类化合物：

其中

R₁为H或CH₃；

R₂为单醣；

R₃为H或COCH₂COOH；

m＝3或4；

n＝0或1；

o＝1或2；及

p＝1或2。

在又一方面，本发明关于一种组合物，其包含：(a)一动物饲料；及(b)一用于在有需求的动物内预防及/或治疗球虫病及/或增强生长的有效量的咸丰草、其一活性成分或一经分离的化合物，其包含一具有以下化学结构的聚炔类化合物：

其中

R₁为H或CH₃；

R₂为单醣；

R₃为H或COCH₂COOH；

m＝3或4；

n＝0或1；

o＝1或2；及

p＝1或2。

本发明是基于无意间发现天然存在的聚炔类化合物可有效用于在有需求的动物内预防及/或治疗球虫病及/或促进生长。

该聚炔类化合物可为式(I)的纯化合物：

于此式中，R₁为H、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₃-C₂₀环烷基、C₃-C₂₀环烯基、C₁-C₂₀杂环烷基、C₁-C₂₀杂环烯基、芳基或杂芳基；R₂为单醣残基；R₃为H或C₁-C₁₀烷基；m为2、3或4；n为0、1、2或3；o为0、1、2、3或4；及p为1、2、3或4。

术语“纯化合物”是指一种具有至少80％纯度(如95％或99％)的化合物。如式(I)，上述聚炔类化合物的子集合中，R₁为C₁-C₁₀烷基(如甲基)、R₂为葡萄哌喃糖；R₃为H或C₁-C₁₀烷基；m为4；n为0；o为2；及p为1。

术语“烷基”是指饱和、直链或支链的非芳香族的烃基部分，例如CH₃、-CH₂-或支链的(CH₃)₂CH₂-。术语“烯基”是指直链或支链的非芳香族的烃基部分，其具有至少一个双键，例如CH₂＝CH-或-CH＝CH-。术语“炔基”是指直链或支链的非芳香族的烃基部分，其具有至少一个三键，例如CH≡C-或-C≡C-。术语“环烷基”是指饱和的非芳香族的环烃基部分，例如环己基。术语“环烯基”是指非芳香族的环烃基部分，其环中含有至少一个双键，例如环己烯基。术语“杂环烷基”是指饱和的非芳香族环基部分，其具有至少一个环杂原子(如O、N或S)，例如4-四氢哌喃基。术语“杂环烯基”是指非芳香族的环基部分，其环中具有至少一个环杂原子及至少一双键，例如哌喃基。术语“芳基”是指具有至少一个芳香环的烃基部分。芳基部分的实例包含苯基、伸苯基、联苯基、萘基、伸萘基、芘基、蒽基及菲基。术语“杂芳基”是指具有至少一个芳香环的部分，而该芳香环含有至少一个杂原子。杂芳基部分的实例包含呋喃基、伸呋喃基(furylene)、茀基、吡咯基、噻吩基、恶唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、异喹啉基及吲哚基。

本文所提及的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基及杂芳基包含经取代及非经取代的部分。于环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基及杂芳基上的取代基实例包含但不限于C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₃-C₂₀环烷基、C₃-C₂₀环烯基、C₁-C₁₀烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、胺基、C₁-C₁₀烷胺基、C₁-C₂₀二烷胺基、芳胺基、二芳胺基、杂芳胺基、二杂芳胺基、C₁-C₁₀烷磺酰基、芳磺酰基、杂芳磺酰基、C₁-C₁₀烷磺酰胺基、芳磺酰胺基、杂芳磺酰胺基、C₁-C₁₀烷亚胺基、芳亚胺基、C₁-C₁₀烷磺酰亚胺基、芳磺酰亚胺基、羟基、卤基、硫基、C₁-C₁₀烷硫基、芳硫基、胺硫酰基、甲脒基、胍基、脲基、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、酰基、硫酰基、酰氧基、羧基、酰胺基、胺甲酰基及羧基以及羧酸酯。于烷基、烯基及炔基上的取代基实例包含所有前述取代基，除了C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基及C₂-C₁₀炔基以外。环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基及杂芳基也可彼此互相稠合。

于该聚炔类化合物的子集合中，R₁为C₁-C₁₀烷基(如甲基)；R₂为葡萄糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、古洛糖残基或H；R₃为H；m为4、n为0、o为2而p为1。聚炔类化合物可作为医药组合物中的纯化合物或作为咸丰草萃取物中的组成分而施予至个体。

在更一方面，本发明的特征为一种用于在有需求的动物内预防及/或治疗球虫病及/或促进生长的方法，此通过将一有效量的咸丰草制备物施予至有需求的个体而达成。此咸丰草制备物可通过下列方式制得：于升高的温度下(如50℃或100℃)，在水中搅拌经研磨的咸丰草植物，藉此形成悬浮液，接着收集前述悬浮液的上清液。可使用醇类(如正丁醇)进一步萃取该上清液，藉此提供浓缩的制备物。前述咸丰草制备物包含一种或多种如上述式(I)的聚炔类化合物。举例而言，其包含聚多炔糖苷：

上述聚炔类化合物不仅包含该化合物本身，并且包含其盐类、前药及溶剂化物(如果适用的话)。此种盐类例如可通过聚炔类化合物上的负电荷取代基(如羧酸根)与阳离子间的相互作用来形成。合适的阳离子包含但不限于钠离子、钾离子、镁离子、钙离子及铵阳离子(如四甲基铵离子)。同样地，聚炔类化合物上的正电荷取代基(如胺基)可和负电荷的相对离子形成盐类。合适的相对离子包含但不限于氯、溴、碘、硫酸根、硝酸根、磷酸根或乙酸根。前药的实例包含酯类及其它医药可接受衍生物，其于施予至个体后可提供上述的化合物。溶剂化物指聚炔类化合物与医药可接受溶剂之间形成的复合物。医药可接受溶剂的实例包含水、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯及乙酸。

前述聚炔类化合物可包含一个或多个非对称中心或一非芳香族的双键，因此其可存在外消旋物及外消旋混合物、单一镜像异构物、个别非镜像异构物、非镜像异构物的混合物及顺式或反式异构形式，前述所有异构形式皆由本发明所思及。

同样包含在本发明的范畴内的是包含咸丰草萃取物的组合物，其包含一种或多种上述聚炔类化合物，可用于在有需求的动物内预防及/或治疗球虫病及/或促进生长，以及此种组合物于制造上述用途的药物的用途。

搭配以下较佳实施例的说明及随附的图式，将可更加明了前述及其他方面，虽然其中可能存在着变化及修饰，但仍不背离本发明的新颖概念的精神及范畴。

以下图式用于阐述本发明的一个或多个实施例，并搭配书面说明，可用以解释本发明的原理。在可能的情况下，于图式中所用到的相同编号指实施例中的相同或相似的元件。

附图说明

图1显示咸丰草粉末及饲粮配方的制备物。咸丰草的照片(A)、风干的咸丰草的照片(B)及磨碎的咸丰草的过筛部分的照片(C)。

图2显示BPP对于鸡只的生长及饲料转换率的影响。(A)一日龄鸡只可自由饮水及进食(对照饲粮、5％、10％、15％及20％的BPP饲粮)。(A)测量鸡只的体重及不同饲粮的消耗量。(B)食物转换率是得自增加的重量对所消耗的饲粮的比例。括号中的数字代表鸡只数目。图2C-2D显示喂食不同BPP量的饲料后的鸡只外观及粪便，其中左侧为对照组，而右侧为饲料中添加5％BPP补充品。

图3显示BPP对于鸡只的存活率(图3A)、病鸟外观(图3B)及临床症状(图3C)的影响。以对照饲粮喂食一日龄鸡只14天，于第14天时，将这些鸡只以媒剂(CTR)或柔嫩艾美球虫(ET)感染，并另外再以对照饲粮(CTR及ET组)以及含有6mg/kg马杜霉素(ET+Mad)或5％、或1％或0.5％的BPP(ET+BPP)的饲粮喂食7天。在将鸡只牺牲后，解剖其盲肠并将之固定以进行苏木素及曙红-Y染色。盲肠出血性损伤的代表性图片(图3D)及病理组织分析(图3E)如图所示。

图4显示聚多炔糖苷对于鸡只的病鸟外观及临床症状的影响。以对照饲粮喂食一日龄鸡只14天，于第14天时，将鸡只以媒剂(CTR)或柔嫩艾美球虫(ET)感染，并另外再以对照饲粮(CTR及ET组)及含有45μg/kg聚多炔糖苷的饲粮(ET+CP)喂食7天。观察病鸟外观(图4A)、血便(图4B)以及在低倍率(图4C)和高倍率(图4D)下观察盲肠的病理状况。

图5显示聚多炔糖苷对于鸡只的粘膜病理的影响。将与图4相同鸡只的盲肠以10％褔尔马林进行固定，并以石蜡包埋(图5A)。将切片以苏木素及曙红-Y进行染色(图5B-5C)。拍摄盲肠切片的影像，并检测粘膜严重程度(图5B)及发炎程度(图5C)。图5D显示聚多炔糖苷的化学结构。

具体实施方式

于本发明文中及提及术语的特定段落中，本说明书中所使用的术语一般具有其于该领域的通常意义。用于描述本发明的特定术语于下文或说明书中某处说明，以对关于本发明的描述的实施者提供额外的导引。为了方便阅读，某些术语可能以突出显示的方式表现，例如以斜体及/或引号表示。以该等突出方式表现时并不影响术语的范畴及意义；无论其是否被以突出方式表现，术语的范畴及意义在相同的上下文中皆相同。可理解的是，同一事物可利用一种以上的方式来表达。因此，其他表达及同义词可用于描述任一个或多个本文所述的术语，且无论术语是否有于本文中被说明或讨论，术语都不会被赋予任何特别的重要性。本文提供某些术语的同义词，当一个或多个同义词被提及时，并不代表排除使用其他同义词。于本说明书中任一处所使用的实例，包含于此所讨论的任何术语，仅作为举例的目的，而不应以任何方式局限本发明或任何例示性术语的范畴及意义。相同地，本发明也不局限于本说明书所提供的各种实施例。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术性及科学性术语对于本发明所属技术领域的技术人员而言皆具有其所能理解的相同意义。若有冲突时，则以包含定义的本文件为主。

本文所使用的“约”、“大约”或“近乎”一般表示在所述的数值或范围的20％以内，较佳为10％以内，且更佳为5％以内。于本文所提供的数字化数量为近似值，意指若术语“约”、“大约”或“近乎”没有被明确提到时，其仍可被推知。

球虫寄生虫可感染动物的肠道，而该等寄生虫的感染即为常见的球虫病。球虫病通常为艾美球虫或同形球虫(Isospora)属的原生动物所造成的肠道粘膜急性入侵及破坏，而感染的特征为腹泻、发烧、食欲不振、体重减轻、消瘦且有时会致死。球虫病对于牛、绵羊、山羊、猪、家禽还有兔子而言是一种严重的疾病，其肝脏及肠可被感染。此疾病于狗、猫及马中则较少被诊断出，但其仍可造成临床上的不适。艾美球虫为顶复门寄生虫(Apicomplexanparasite)的一属，其包含可造成家禽的球虫疾病的多个种类。

本文所使用的术语“成分”是指存在于咸丰草中具有生物活性的植物性化合物，其具有抗球虫病及/或生长增强的功效。植物成分或活性成分指对于身体有显著的医药作用的成分。

动物饲料指给予家畜及宠物(伴侣动物)的食物。

本文所使用的术语“纯化合物”是指具有至少80％的纯度(如95％或99％)的化合物。

术语“治疗”是指施予有效量的咸丰草或其植物性化合物(如聚炔类化合物，例如聚多炔糖苷)至一个体，该个体患有球虫病或疑似有此疾病的症状或倾向，其目的在于治愈、缓解、舒缓、修补、改善或预防球虫病、其症状或其倾向。

如本文所使用，咸丰草或化合物的“有效量”或“足够量”是指该数量具有治疗性的效果而可用于增强生长及/或抑制、预防或治疗本文所述的特定疾病、病症、病状或副作用的症状。例如，“有效量”可能是指在接受治疗的个体上提供治疗性或所欲功效所需的数量。如本技术领域的技术人员所知，有效剂量会因为施药途径、赋形剂的使用以及与其他疗法共用时的可能性而有所变化。

本发明是关于发现来自自然界的新颖且安全的抗球虫化合物。本发明关于发现咸丰草于家禽(如鸡只)的生长及艾美球虫感染上的功效。

首先制备咸丰草粉末，接着混合不同比例的咸丰草粉末以配制鸡只饲粮。经测试咸丰草在鸡只生长表现上的优点，发现10％或更少的BPP可增强鸡只的生长及饲料转换。以鸡只存活率、分泌的卵囊及肠道损伤来评估咸丰草对鸡只球虫病的疗效。经发现，BPP有效降低经艾美球虫感染后的死亡率、临床症状及分泌的卵囊。整体来说，咸丰草经证实有利于鸡只的生长，且在对抗鸡只球虫病方面具有疗效。数据显示咸丰草具有治疗艾美球虫感染的潜力。

聚炔类化合物

聚炔类化合物(如聚多炔糖苷)可分离自咸丰草。首先将整株咸丰草植物磨碎，接着置于热水中搅拌。在移除不可溶的物质后(如通过过滤、倾析或离心)，对所得的上清液进行液相层析法(如高压液相层析法)或其他适用方法以提供纯的聚炔类化合物。所得的纯化合物可进一步进行衍生以提供数种本发明的其他聚炔类化合物(美国专利号7,763,285及Kusano等人(JP2004083463)，其所有内容皆以引用方式并入本文中作参考)。

前述的聚炔类化合物也可以传统方法制备。以下三个反应方案是用于阐述本发明的聚炔类化合物的合成方式。

方案1

将丁烷-1,2,4-三元醇(i)与丙酮反应以形成被保护的1,2,4-三元醇化合物(ii)，其可快速转化成碘基衍生物(iii)。接着将化合物(iii)与乙炔基三甲基硅烷于碱性条件下(如n-BuLi)反应，以得到(4-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)丁-1-炔基)三甲基硅烷(iv)。接着以酸(如乙酸)处理化合物(iv)，接着通过与2-溴葡萄哌喃糖进行偶合反应以得到加成物(v)。化合物(v)可进一步以氟化钾处理以得到2-苯基-4H-色烯-4-酮(vi)。

方案2

将1-溴丙-1-炔(vii)与溴化乙炔基镁反应以得到戊-1,3-二炔(viii)，将其进一步转化成庚-1,3,5-三炔(ix)。化合物(ix)可于碱性条件下(如n-BuLi)，于添加碘基化合物(如I₂)后，快速地转化成1-碘庚-1,3,5-三炔(x)。

方案3

方案3显示使得自方案1的乙炔衍生物(vi)与得自方案2的1-碘庚-1,3,5-三炔(x)之间进行偶合反应而形成四炔化合物(xi)。将保护基团移除则可得到2β-D-葡萄哌喃糖基氧基-1-羟基十三烷基-5,7,9,11-四炔的聚炔类化合物，其为本发明的一种化合物。

适于合成合适化合物的合成化学转化方法记载于例如R.Larock的ComprehensiveOrganic Transformations(VCH出版；1989)；T.W.Greene及P.G.M.Wuts的ProtectiveGroups in Organic Synthesis(第三版，John Wiley and Sons(1999))；L.Fieser及M.Fieser的Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis(John Wiley andSons(1994))；以及L.Paquette,ed.的Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis(John Wiley and Sons(1995))以及其后续版本中。

本发明的特征为对有需求的个体施予有效量的一种上述聚炔类化合物或一包含此化合物的咸丰草制备物的方法。

用于口服施用的组合物可为任何口服可接受的剂型，包含胶囊、锭剂、乳剂以及水性悬浮液、分散液及溶液。作为片剂时，常用的载剂包含乳糖及玉米淀粉。通常也添加润滑剂，例如硬脂酸镁。以胶囊形式进行口服施用时，常用的稀释剂包含乳糖及干燥玉米淀粉。当以水性悬浮液或乳剂进行口服施用时，该活性成分可与乳化剂或悬浮剂结合，以悬浮或溶解于油相中。若有需要，也可添加某些甜味、调味或增色剂。

咸丰草植物是从台湾的中央研究院院区内收集取得。将全部近乎10kg的干净且压碎的植物于40L的水中进行回流两小时。在移除水相后，再将不可溶的物质置于25L的水中回流两小时。将合并的水溶液(近乎65L)于真空中蒸发以得到残留物，之后将该残留物悬浮于1.0L的水中，并以1.0L的正丁醇萃取三次。先将正丁醇区分(fraction)以真空旋转蒸发器于减压下进行蒸发，接着冻干以得到聚多炔糖苷的粗产物(37.7g)。

接着将该粗产物以RP-18硅胶管柱及CH₃OH/H₂O梯度溶剂系统进行层析，以得到次区分BPB1、BPB2、BPB3及BPB4。将70％CH₃OH洗提出的BPB3部分以半制备型HPLC及CH₃OH/H₂O溶剂系统进行进一步分层，得到聚多炔糖苷，并以¹H NMR及¹³C NMR进行性质分析。

¹H NMR(500MHz,CDOD₃)δ1.78(2H,q,J＝6.8Hz),1.98(3H,s),2.58(2H,t,J＝6.8Hz),3.19(1H,dd,J＝9.1,7.8Hz),3.30(1H,m),3.34(1H,m),3.59(2H,m),3.65(1H,dd,J＝12.0,6.5Hz),3.75(1H,p,J＝6.8Hz),3.85(1H,dd,J＝12.0,1.7Hz),4.32(1H,d,J＝7.8Hz)；¹³C NMR(125MHz,CDOD₃)δ3.8,16.1,31.4,60.0,60.9,61.8,62.4,62.6,64.9,65.8,66.2,71.5,75.2,77.9,81.6,104.8。

在一方面，本发明是关于一种用于在有需求的动物内预防、抑制及/或治疗球虫病的组合物，该组合物包含一有效量的咸丰草、其一活性成分或一由其分离出的活性化合物。

在另一方面，本发明是关于一种用于在有需求的动物内预防及/或治疗球虫病及/或增强生长的组合物，该组合物包含一动物饲料以及一有效量的化合物，该化合物包含一种具有以下化学结构的聚炔类化合物：

其中：

R₁为H或CH₃；

R₂为单醣；

R₃为H或COCH₂COOH；

m＝3或4；

n＝0或1；

o＝1或2；及

p＝1或2。

可在使用前于一动物饲料中添加该咸丰草、其活性成分或由其分离出的活性化合物而制备该组合物。该组合物的剂型可选自于由口服剂型、胶囊剂型、塞剂剂型及非经肠胃的剂型所组成的群组。该组合物可进一步包含动物饲料，例如鸡只饲料。

在本发明的另一实施例中，该组合物包含该动物饲料及0.0005％～15％(w/w)的咸丰草(如咸丰草粉末)。

在本发明的另一实施例中，该咸丰草可为粉末形式。

在本发明的另一实施例中，该活性成分或该由其分离出的活性化合物包含一具有以下化学结构的聚炔类化合物：

其中

R₁为H或CH₃；

R₂为单醣；

R₃为H或COCH₂COOH；

m＝3或4；

n＝0或1；

o＝1或2；及

p＝1或2。

该聚炔类化合物可选自于由下列化合物所组成的群组：

以及

在本发明的另一实施例中，将该动物施予不少于45μg/kg体重的聚炔类化合物剂量。该动物可为非人类的动物。该动物可选自于由鱼类、鸟类、爬虫类及非人类的哺乳类动物所组成的群组。

在又一方面，本发明是关于一种组合物，其包含：(a)一动物饲料；及(b)一用于在一有需求的动物内预防及/或治疗球虫病及/或增强生长的有效量的咸丰草、其一活性成分或一经分离的化合物，其包含一具有以下化学结构的聚炔类化合物：

其中

R₁为H或CH₃；

R₂为单醣；

R₃为H或COCH₂COOH；

m＝3或4；

n＝0或1；

o＝1或2；及

p＝1或2。

在本发明的一实施例中，该动物饲料选自于由家禽类饲料、鱼类食物、爬虫类食物、鸟类饲料及非人类的哺乳类动物食物所组成的群组。例如，该动物饲料可为鸡只饲料。该化合物可分离自咸丰草。

在本发明的另一实施例中，该组合物包含该动物饲料及聚多炔糖苷，其比例为每公斤的该动物饲料有0.01mg～3g的聚多炔糖苷。该组合物可包含该动物饲料及不超过15％(w/w)的咸丰草及/或不少于0.0005％(w/w)的咸丰草。

在另一方面，本发明是关于一种用于在一有需求的非人类的动物内预防及/或治疗球虫病及/或促进生长的组合物，该组合物包含一动物饲料以及一有效量的咸丰草及/或一由其分离出的活性化合物。

该动物可为非人类的动物，例如鸡只。该组合物也可用于促使鸡只的体重及饲料转换率的增加。该球虫病包含艾美球虫感染。

在本发明的另一实施例中，该活性化合物包含以下化学结构：

在本发明的另一实施例中，该组合物包含该动物饲料以及不超过15％(w/w)或不超过10％(w/w)的咸丰草及/或不少于0.0005％(w/w)的咸丰草。该组合物可包含该动物饲料以及介于0.0005％～15％(w/w)或0.0005％～10％(w/w)或0.0005％～5％(w/w)或0.0005％～1％(w/w)的范围的咸丰草含量，或介于0.5％～5％(w/w)或0.5％～1％(w/w)或不超过1％(w/w)的咸丰草含量。

该动物可被施予0.5mg至15,000mg/kg体重的剂量范围的咸丰草。

咸丰草可为粉末形式。计算咸丰草粉末(BPP)百分比的方法如下：咸丰草粉末重量/咸丰草粉末重量+基本的鸡只饲料＝BPP的百分比(％)。

0.0005％～15％(w/w)的范围表示所有位于此范围内的万分之一、千分之一、百分之一、十分之一及整数单位的数量皆作为本发明的一部分而特别公开。因此，0.0001％、0.0002％、0.0003％...0.001％、0.002％、0.003％...0.01％、0.02％、0.03％...0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％及1％、2％、3％、4％...13％、14％以及15％的单位数量皆包含在本发明的实施例中。

在本发明的另一实施例中，该组合物包含一动物饲料及聚多炔糖苷，其中聚多炔糖苷对动物饲料的比例为每公斤的动物饲料有0.01mg～3g的聚多炔糖苷。该动物可被施予每公斤体重0.001mg～3mg的聚多炔糖苷。0.01mg～3g的范围表示所有位于此范围内的百分之一、十分之一及整数单位的数量皆作为本发明的一部分而特别揭露。因此，0.01mg、0.02mg、0.03mg...0.1mg、0.2mg、0.3mg...0.998g、0.999g、1g...1.98g、1.99g、2g...2.8g、2.9g及3g的单位数量皆包含在本发明的实施例中。

该动物可包含经艾美球虫感染的鸡只。前述组合物也可用于减少鸡只死亡率、临床症状及分泌的卵囊。前述化合物可包含聚多炔糖苷。

于再一方面，本发明是关于一种组合物，其包含：a)一动物饲料；及b)一用于在一有需求的动物内预防及/或治疗球虫病及/或增强生长的有效量的咸丰草或一经分离的化合物，该化合物具有以下化学结构：

其中

R₁为H或CH₃；

R₂为单醣；

R₃为H或COCH₂COOH；

m＝3或4；

n＝0或1；

o＝1或2；及

p＝1或2。

该经分离的化合物可经由化学合成或分离自咸丰草。于本发明的一实施例中，该经分离的化合物包含以下化学结构：

实例

以下提供根据本发明实施例的例示性器具、设备、方法及其相关结果，然其并非用于限制本发明的范畴。于实例中所使用的标题或副标题是为了便于阅读的目的，而不应以任何方式来限制本发明的范畴。再者，于本文所提及与公开的某些理论，无论其对或错，皆不应以任何方式来限制本发明的范畴，只要可根据本发明而能够实现，则不需考量任何特定理论或作用机制。

实例1

材料及方法

化学物质

马杜霉素、PBS、苏木素及曙红-Y购自Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)。咸丰草经阴干后磨碎成粉末。将该粉末与特定鸡只饲粮混合。以HPLC来评估每一批次咸丰草粉末的品质控管。

鸟类、饲粮及实验设计

将台中鸡场(台湾)所孵育的一日龄Lohmann肉鸡的雏鸡于送达后立刻绑翅标示、秤重并随机放置于Petersime初始孵卵器单元中。于孵化后的1及2天，给予鸡只自由饮水及饲粮。该饲粮通过将基础饲粮(鸡只饲料，台糖公司)与单独载体(对照饲粮)或特定剂量的咸丰草粉末(BPP饲粮)混合而配制。于聚多炔糖苷的实验中，该动物每天被施予45μg的经分离的聚多炔糖苷。于分组后，将艾美球虫卵囊管喂给鸡只，并测量及检测生长表现(体重及饲料转换)、病理(血便及肠道形态测定)及存活率。所有鸡只皆根据中央研究院动物管理及使用委员会的标准于动物房内维持及处理。

免疫组织化学染色

将从鸡只取得的胰腺的多组平行切片进行快速冷冻，其中该等鸡只被给予对照饲粮及BPP饲粮达14天。将该等切片以苏木素及曙红或抗胰岛素抗体染色，并以二胺基联苯胺四盐酸盐呈色，接着进行影像分析。可参考Chang等人(2007)所发表的「Cytopiloyne,apolyacetylenic glucoside,prevents type1diabetes in nonobese diabetic mice」(JImmunol178(11):6984-6993)，此文献的全部内容也并入于本文中作参考。

统计分析

三次或更多次独立实验的结果以平均值±S.E.呈现。数据以ANOVA分析。P值低于0.05的差异被认为具有统计显著性。

结果

咸丰草粉末的制备及含有咸丰草粉末的鸡只饲粮的配制

为了制备咸丰草粉末，采集咸丰草的整株植物并洗净。将植物阴干3天，并磨碎成粉末(图1)。以筛网将咸丰草粉末(BPP)过筛，并作为配制用材料。将正常的鸡只饲粮(对照饲粮)与特定数量的BPP(占总重量(正常饲粮及BPP的数量)的5％、10％、15％及20％)混合来配制BPP饲粮。

BPP对于生长表现及饲料转换的影响

为了评估BPP饲粮对于雏鸡的生长及饲料转换的影响，让1日龄鸡只每日自由食用对照饲粮或BPP饲粮14天，并测量体重及饲料消耗量。相较于给予正常饲粮者，给予5％BPP饲粮的鸡只的生长稍微较佳，给予10％BPP饲粮的鸡只的生长情况与摄食正常饲粮者相同，而给予15％BPP饲粮及20％BPP饲粮的鸡只生长则较摄食正常饲粮者稍微差一些(图2A)。出乎意料地，BPP饲粮的饲料转换情形优于对照饲粮(图2B)。

BPP对于血中白血球的影响

为了评估BPP饲粮对于白血球的影响，让1日龄鸡只每日自由食用对照饲粮或BPP饲粮14天，再进行白血球组成的测量。我们发现5％的BPP饲粮并不会影响鸡只血液中的白血球组成(表1)。表1显示鸡只血液中的白血球组成。给予一日龄鸡只对照饲粮(CTR)及含有5％BPP(5％BPP)的饲粮14天，收集该等鸡只的血液以进行分析。每组鸡只的数量标示于括号内。

表1

BPP对于经艾美球虫感染的鸡只的存活率及临床上的影响

由于咸丰草被认为可用于治疗原生动物及细菌性感染，我们测试了咸丰草是否可保护鸡只抵抗球虫病。为此目的，我们以媒剂及艾美球虫卵囊感染7日龄的鸡只。给予该等鸡只对照饲粮、混有马杜霉素(一种市售的抗球虫药)的对照饲粮以及10％BPP饲粮。一如预期，我们发现未被艾美球虫感染的鸡只在感染后7日的存活率为100％。对照之下，感染艾美球虫的鸡只于感染后7日仅有60％存活(图3A)。然而，以6mg/kg剂量的马杜霉素及50g/kg剂量的10％BPP治疗时，可使被艾美球虫感染的鸡只的存活率增加30％(图3A)。每组鸡只的体重如表2所示，可见经艾美球虫感染后21天，体重从171.1g降至132.5g。然而，经马杜霉素及BPP治疗者的体重则分别从132.5g增加至145.4g及154.3g(表2)。总的来说，数据显示BPP和马杜霉素一样对于鸡只抵抗艾美球虫上具有疗效。表2显示被艾美球虫感染或未被感染的鸡只体重。以对照饲粮喂食一日龄鸡只14天。于第14天，以媒剂(CTR)或柔嫩艾美球虫(ET)感染鸡只，并再以对照饲粮(CTR及ET组)及含有6mg/kg马杜霉素(ET+Mad)或50g/kg的BPP(ET+BPP)的饲粮喂食7天。测量体重，每组鸡只的数量标示于括号内。

接着，我们检查被艾美球虫感染或未被感染的鸡只的临床症状。未被艾美球虫感染的鸡只没有出现“病鸟外观”，如下垂、精神萎靡及羽毛杂乱(图3B)。对照之下，被艾美球虫感染的鸡只则出现典型的“病鸟外观”(图3B)。相似地，给予混有马杜霉素及BPP饲粮的鸡只并没有明显的病鸟外观(图3B)。于感染艾美球虫的鸡只中可观察到血便及腹泻的情形(图3C)。对照之下，以马杜霉素及BPP治疗者则有降低血便及腹泻的情形(图3C)。

表2

也对经感染后7日的鸡只的肠道损伤进行检验。经艾美球虫卵囊感染的鸡只的盲肠可观察到出血性损伤(图3D)。对照之下，以马杜霉素及BPP治疗者则可缓和出血性损伤的严重程度(图3D)。同样地，组织染色资料显示，经艾美球虫感染的鸡只肠道中的绒毛数量及腺窝深度有所减少(图3E)。经艾美球虫感染的鸡只有出现肠道发炎(图3E)。对照之下，如同以马杜霉素治疗者，BPP治疗也增加了艾美球虫感染的该等鸡只的肠道中的绒毛数量及腺窝深度(图3E)。值得注意的是，BPP降低肠道发炎的效果优于马杜霉素(图3E)。

卵囊的分泌是评估抗球虫药功效的重要指标，因此我们分析从该等经艾美球虫感染的鸡只中所分泌的卵囊数量。我们发现，经马杜霉素及BPP治疗者可减少一半该等经感染鸡只中所分泌的卵囊数量(表3)。BPP对于减少卵囊分泌功效的数据与BPP对于舒缓临床症状的结果相符。表3显示该等经或未经艾美球虫感染的鸡只的粪便中所分泌的卵囊。以对照饲粮喂食一日龄鸡只14天。于第14天，将该等鸡只以媒剂(CTR)或柔嫩艾美球虫(ET)感染，并以对照饲粮(CTR及ET组)以及含有6mg/kg马杜霉素(ET+Mad)或50g/kg的BPP(ET+BPP)的饲粮再喂食7天。分析该等鸡只的粪便中所分泌的卵囊数量(每克粪便中的卵囊数量)。每组鸡只的数量标示于括号内。

总的来说，结果显示于饲料中添加特定部分的BPP可有助于鸡只的生长。更重要的是，BPP可预防及治疗鸡只的球虫病，此可由存活率、病鸟外观及临床症状(例如血便、腹泻及肠道损伤)所证实。

表3

实例2

图4显示聚多炔糖苷对于病鸟外观及鸡只的临床症状的影响。以对照饲粮喂食一日龄鸡只14天。于第14天，将鸡只以媒剂(CTR)或柔嫩艾美球虫(ET)感染，并以对照饲粮(CTR及ET组)以及含有45μg/kg聚多炔糖苷的饲粮(ET+CP)再喂食7天。观察病鸟外观(图4A)、血便(图4B)以及在低倍率(图4C)和高倍率(图4D)下观察盲肠的病理状况。

图5显示聚多炔糖苷对于鸡只的粘膜病理上的影响。将与图4相同鸡只的盲肠以10％福尔马林进行固定，并以石蜡包埋(图5A)。将切片以苏木素及曙红-Y进行染色(图5B-5C)。拍摄盲肠切片的影像，并测量粘膜严重程度(图5B)及发炎程度(图5C)。图5D显示聚多炔糖苷的化学结构。

实例3

为了预防、抑制及/或治疗球虫病，将一组合物施予动物，其包含一有效量的咸丰草、其一活性成分或一由其分离出的活性化合物。可将咸丰草、其一活性成分或一由其分离出的活性化合物添加至动物饲料中。咸丰草的该活性成分或活性化合物可由咸丰草植物中萃取而得。

可将咸丰草粉末、其一活性成分或一由其分离出的活性化合物制备成胶囊形式。可将该组合物制备为塞剂剂型。可添加医药可接受的载剂以制备合适的剂型。

咸丰草包含至少以下的聚炔类化合物A、A’、B、B’、C及C’：

以及

可将本说明书中所公开的所有特征依任何组合方式而组合，且本说明书中所公开的每一个特征都可能被其他具有相同、相等或相似目的的特征所取代。因此，除非有明确的相反陈述，否则本说明书所公开的每一个特征皆仅为相等或相似特征的上位系列中的一个实例。

此外，经由上述的说明，本技术领域的技术人员可易于了解本发明的必要特征，且可在不脱离本发明的精神和范畴的情形下进行各种变更与修饰以适应各种不同的用途及情况。因此，其他实施例也包含于以下的申请专利范围中。

Claims (11)

1.一种组合物在制造用于在一有需求的动物内预防、抑制及/或治疗球虫病的药物的用途，其特征在于，所述组合物包含：(a)一动物饲料；及(b)一有效量的咸丰草或一由其分离出的活性化合物，所述活性化合物包含一具有以下化学结构的聚炔类化合物：

，

其中

R₁为H或CH₃；

R₂为单醣；

R₃为H或COCH₂COOH；

m=3或4；

n=0或1；

o=1或2；及

p=1或2。

2.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该组合物的剂型选自于由口服剂型、塞剂剂型及非经肠胃的剂型所组成的群组。

3.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该聚炔类化合物选自于由

、

及

所组成的群组。

4.根据权利要求 3 所述的用途，其特征在于：其中该动物以一不少于 1 µg/kg 体重的剂量被施予该聚炔类化合物。

5.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该组合物包含动物饲料以及0.0005%~ 15% (w/w)的咸丰草。

6.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该咸丰草为粉末形式。

7.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该动物饲料包含一鸡饲料。

8.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该动物选自于由鱼类、鸟类、爬虫类及非人类的哺乳类动物所组成的群组。

9.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该动物饲料选自于由家禽类饲料、鱼类食物、爬虫类食物、鸟类饲料及非人类的哺乳类动物食物所组成的群组。

10.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该组合物包含该动物饲料及聚多炔糖苷，其比例为每公斤的该动物饲料有 0.01 mg ~ 3 g 的聚多炔糖苷。

11.根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：其中该组合物通过在使用前于动物饲料中添加该咸丰草或该由其分离出的活性化合物而制备。

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