CN103520714A - 鸡球虫病三价活疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡球虫病三价活疫苗，由柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫三种艾美耳球虫分离、纯化、培养后的孢子化球虫卵囊采用烷化剂类化学诱变剂进行一级致弱、一级致弱株培养的小鸡所得卵囊采用物理诱变因素紫外线照射进行二级致弱得到的三种二级致弱株混合制成。进一步的，本发明还公开了上述鸡球虫病三价活疫苗的制备方法和用途。本发明的鸡球虫病三价活疫苗采用双重致弱，诱变率高、毒力低，免疫效果稳定。

Description

鸡球虫病三价活疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及到用于免疫由球虫导致的疾病的疫苗，属于免疫生物学与生物病理学领域。

背景技术

鸡球虫病是一种严重危害集约化养鸡业的原虫病，该病是由孢子虫纲、艾美耳科、艾美耳属的9种艾美耳球虫引起的。据报道，全世界每年因鸡球虫病造成高达30亿美元经济损失，在美国每年因球虫病造成的直接和间接经济损失约为6.4亿美元，而我国每年支出的抗球虫药物费用约为6-8亿元人民币，占鸡病全部防治费用的近三分之一，随着我国集约化养鸡业的迅速发展，这一数据还会急剧上升。

由于球虫是经口-粪的简单途径传播，常用消毒剂对其几乎没有杀灭作用。因此该病流行极为广泛，可以说凡是养鸡的地方就有球虫存在。

自20世纪40年代发现磺胺类药物具有抗球虫作用以来，家禽球虫病的防治一直主要依靠抗球虫药物，但艾美耳球虫对抗球虫药物的抗药性已严重影响了采用药物防治家禽球虫病的效果。同时，抗球虫药物的残留等潜在危害逐渐成为人们关注的焦点，已发现几种化学治疗药物残留在肉中，使得其不适于消费。日本已于2005年宣布禁止进口应用鸡球虫净的鸡；欧盟自2006年起在饲料中全面禁用抗生素类作为饲料添加剂，包括抗球虫药莫能菌素和盐霉素，从2010年开始全面禁用所有抗球虫药。因此，传统的以抗球虫药物预防为主的鸡球虫病的防控策略将逐渐过渡为采用免疫控制，即使用球虫病疫苗。

近20年间，我国对于鸡球虫病活卵囊疫苗的研究有了重大进展。至今，已有上海兽医研究所、北京农学院、齐鲁动物保健品公司和佛山市正典生物技术有限公司等多家研制单位的产品获得鸡球虫疫苗，球虫活苗是实际生产中唯一可替代抗球虫药物以控制球虫病的手段。鸡在低水平感染球虫时不会发病，经过3次左右生活史循环，鸡体可产生较好的保护性免疫力。市面上销售的球虫疫苗就是基于这个原理，球虫活疫苗分为强毒苗和弱毒苗。

强毒苗是直接从自然发生球虫病鸡的肠道内或粪便中分离出来的虫株，因致病力强且无耐药性，故为药物敏感株。疫苗的制作一般直接从自然发生球虫病肠道或者粪便中，运用饱和盐水漂浮法收集球虫混合卵囊，并采用单卵囊分离并增殖各种艾美耳球虫卵囊，按一定比例混合后配以适当的稳定剂组成的活疫苗。但是强毒球虫苗也存在一些无法避免的弊端：在疫苗接种至产生免疫力期间，不得使用任何抗球虫药，否则可能导致免疫效果不好；由于强毒苗毒力较强，使用不当也可能会引起球虫病的暴发；强毒苗中所含的球虫卵囊在水中沉降较快，易造成免疫不均匀，必须寻找较好的悬浮剂搭配使用；接种强毒球虫苗，可能将强毒球虫引入新鸡场。

弱毒疫苗是指通过人为方法减弱艾美耳虫株的致病性所得到的致弱虫株，可以降低对宿主的危害，并产生足够的免疫力。与强毒疫苗相比，这一类疫苗致病性较小，并具有较高的抗球虫效力和安全性。通常采用对亲代虫株反复传代和筛选，使虫株的内生发育周期缩短，形成了不同于亲本株生物学特性的早熟株，用来制取弱毒疫苗，但早熟株也有弊端，如免疫原性高，相应毒力较弱，无法产生较好的免疫力等。

由此可见，本领域还急需开发毒性低、对生物体影响小的鸡球虫病三价活疫苗。

发明内容

针对现有技术的需要，本发明公开了一种鸡球虫病三价活疫苗，通过采用双重致弱方法制成，所得到疫苗诱变率高、毒力低、性能稳定，并且其安全性高，毒力较弱，降低了对宿主的危害性。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

一种鸡球虫病三价活疫苗，由柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫三种艾美耳球虫分离、纯化、培养后的孢子化球虫卵囊采用烷化剂类化学诱变剂进行一级致弱、一级致弱株培养的小鸡所得卵囊采用物理诱变因素紫外线照射进行二级致弱得到的三种二级致弱株混合制成。

其中，柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫是三个国内主要球虫虫种的卵囊，其球虫虫种形态及生物学特性已经经过本领域广泛研究：柔嫩艾美耳球虫卵囊平均大小为22.6×19.0微米，外形为卵圆形，呈淡绿色，主要寄生部位为盲肠，孢子化时间约48小时，潜伏期为168小时；巨型艾美耳球卵囊平均大小为30.5×22.6微米，外观为卵形，呈黄褐色，主要寄生部位为小肠中断，孢子化时间约72小时，潜伏期为156小时；毒害艾美耳球虫卵囊平均大小为16.7×14.3微米，外观为长圆形，无色，主要寄生部位为小肠中断和盲肠，孢子化时间约48小时，潜伏期为168小时。

其中，所用烷化剂类化学诱变剂可以是疫苗领域任意可用的类型，通常由重铬酸钾、二甲基亚砜、氯化钠、碳酸氢钠、NTG、环磷酰胺加入到蒸馏水组成。

优选的，本发明所用烷化剂类化学诱变剂组成为重铬酸钾350-500g、二甲基亚砜10-20ml、氯化钠1-3g、碳酸氢钠1-3g、NTG5-10ml、环磷酰胺0.01-0.03mg、蒸馏水1500-2000ml。

通过采用上述化学诱变剂，能与核苷酸分子中的磷酸基、嘌呤、嘧啶基起烷化作用，或与DNA分子作用而造成DNA损伤。使鸟嘌呤N7位氮原子上发生烷基化或使β-糖苷键活化而造成脱嘌呤作用。

在本发明中，所用物理诱变因素紫外线照射，紫外光源15-20瓦，波长200-300nm，照射时间：230-300秒，其中卵囊悬液距离紫外光源25-30cm。

通过采用紫外线照射，紫外线照射引起的损伤分为直接和间接两种，直接损伤是照射直接对靶分子作用结果，主要是形成嘧啶二聚体妨碍DNA双链的正常拆开和复制。间接损伤是照射引起蛋白质合成抑制。

将上述以化学方法与物理方法进行双重致弱，使得本发明的疫苗在不改变球虫卵囊免疫原性的基础上降低了卵囊的致病性。

相应的，本发明提供了所述鸡球虫病三价活疫苗的制备方法，包括下述步骤：1)将柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫三种艾美耳球虫的球虫卵囊进行分离、纯化和培养得到孢子化卵囊；2)将步骤1)所得孢子化卵囊采用烷化剂类化学诱变剂进行化学致弱，经分离、收集后分别配制成卵囊悬浮液制成一级致弱株；3)将一级致弱株与鸡饲料混合喂给小鸡，宰杀小鸡从肠道收集卵囊，将收集到的三种卵囊分别用重铬酸钾溶液保存，经孢子化过程后离心分离；4)将步骤3)收集到的卵囊分别离心去除重铬酸钾，用重蒸水配成卵囊悬液，将卵囊悬液在流动状态下采用紫外线下照射；5)照射结束后，卵囊重新加入到重铬酸钾溶液中，即得二级致弱株；6)将三种二级双重致弱株分别进行孢子化卵囊计数，混匀并稀释即得一次、二次用双重致弱的三价球虫苗混悬液，将三种双重致弱三价球虫苗混悬液分别充分混匀后混合制成球虫三价活疫苗进行分装。

其中，所述步骤1)具体包括下述步骤：将生理盐水与粪便搅成混悬液；将混悬液经滤过后离心弃去上清液，向沉淀中加入饱和盐水充分混匀，离心所得沉淀物即为所需球虫卵囊；从病鸡的盲肠和小肠刮取内容物和粘膜，加入生理盐水后过滤纯化，然后采用生理盐水冲洗，离心洗涤后收集沉淀，所得沉淀物用胰酶和胆汁在水浴箱内消化，消化期间间歇摇动，离心洗涤后将沉淀物搅拌均匀加入到重铬酸钾溶液中，在28℃恒温培养箱内培养，间歇摇动，完成卵囊的孢子化。

其中所用的饱和盐水是指比重不低于1.18的氯化钠溶液；所用的粪便是指患有球虫病的鸡的粪便，生理盐水与粪便的混合比例不受到特别限制，优选的采用粪便与五倍于粪便体积的生理盐水；上述的滤过通常采用符合所需目的的网筛一次或多次过滤实现；离心通过将滤过液加入到离心管中在离心机中进行离心，离心速度可以由本领域技术人员根据需要选择，通常是在2000-3000rpm离心1-10min；上述的胰酶和胆汁采用动物疫苗领域所常用的浓度，即0.5-1.5％胰酶和4％-8％胆汁(用0.01M pH8.0PBS稀释)。

在上述过程中，离心的次数可以为一次或多次。

其中，步骤2)所用的化学致弱剂即为上述的烷化剂类化学诱变剂。

其中，步骤4)的卵囊悬液浓度为40-80万个卵囊/ml，所用物理诱变因素紫外线照射，紫外光源15-20瓦，波长200-300nm，照射时间：230-300秒，其中卵囊悬液距离紫外光源25-30cm，照射过程中卵囊悬液处于流动状态。

其中，步骤6)三种卵囊数量经计算配制需要量，分别准确移取计算得到的三种卵囊数量，混匀并适当稀释后，即得一次、二次用双重致弱的三价球虫苗混悬液。三种双重致弱三价球虫苗混悬液的混合比例，优选为根据每瓶羽份数换算得的混悬液量按1∶1∶1的比例混合制成球虫三价活疫苗进行分装。

其中，上述所用的重铬酸钾溶液为疫苗领域常用浓度，即2.5％的重铬酸钾溶液。

相应的，在上述基础上本发明还公开了所述鸡球虫病三价活疫苗用于鸡中诱导鸡应答反应的用途。

上述的剂量，用药途径等可以根据使用的方便采用拌料或饮水免疫均可，应用疫苗的频率也可根据需要进行选择，例如肉鸡3、8、16日龄，蛋鸡、种鸡于3、10、20日龄各进行一次口服免疫等；或者将虫苗加适量水稀释，拌入少量饲料内，然后逐步扩大拌料量至饲喂一顿的量，充分搅匀，以手捏不出水，放手即松散为宜。将拌有虫苗的饲料均匀散于一块或多块薄膜上，投喂已断食3小时的雏鸡；或者采用饮水免疫：免疫前一天根据免疫鸡数算好用水量，按0.3％比例加入悬浮剂羧甲基纤维素钠，搅拌混匀的悬浮液。次日，将虫苗倒入悬浮液中，搅拌混匀，放入饮水用具内，投喂已断水3小时的雏鸡。

与其他方式相比，由于饮水免疫的方式省工省时省钱，比于饲料中长期添加抗球虫药物大大减少了劳动量，可提高工效数倍或数十倍，能显著降低饲养成本，还避免了抗药性的产生和药残问题，因此优选采用此种方式和用量进行接种。

进一步的，为了确保鸡体在获得高效价体液免疫时提高鸡体细胞免疫水平，本发明的应用中还包括将所述鸡球虫病三价活疫苗与免疫激活剂联合使用。

通过上述联合应用，在致弱虫苗发挥特异性免疫的同时，辅以细菌免疫激活剂(通常为短小棒状杆菌)的非特异性免疫，从而产生协同作用。

上述免疫激活剂的使用方式可采用本领域已有方式，即将免疫激活剂用洁净蒸馏水充分溶解后，根据每瓶份数换算得的溶液进行分装，可得免疫激活剂半成品，将上述半成品入半成品库保存即可。

本发明的鸡球虫病三价活疫苗针对我国鸡球虫病发病规律与病型特点所开发，是一种天然生物免疫制剂，对鸡球虫病的保护率高，毒力低，安全无毒无公害，免疫效果好，有利于促进我国养鸡业生态环境的控制及疫病防治技术的提高和推广，将有效地提高肉、禽蛋品质，推动我国绿色生态农业和无公害养殖业的发展，对提高我国养殖业效益起到积极地促进作用。

具体实施方式

在下述实施例中申请人提供了一种本发明疫苗的具体制备过程，仅作为优选示例，不采用下述方法所采用的具体用量、时间、强度、温度等各种参数，采用其它方式亦可。

采用以下过程制备本发明的活疫苗：

1.将柔嫩、毒害、巨型三种艾美耳球虫分别进行分离、纯化、培养。

(一)球虫卵囊的分离：在1000ml开水中加食盐380g，充分搅拌得到比重约1.18的饱和盐水溶液。将粪便和5倍于粪便体积的生理盐水搅成混悬液，将粪便混悬液先经50目网筛滤过，然后经100-200目网筛滤过到第二个容器中，并将第二个容器中的滤过液倒入离心管中，离心(3000rpm，3min)，弃去上清液，向沉淀中加入10倍的饱和盐水充分混匀，离心(3000rpm，3min)，沉淀物即为所需卵囊。

(二)球虫卵囊的纯化：分别取病鸡的盲肠(柔嫩和毒害艾美耳球虫)和小肠中断(巨型艾美耳球虫)纵向剪开，刮取其内容物和粘膜，加入少量生理盐水。先经60目铜网筛滤过然后经80目-200目铜网筛滤过，逐步纯化。将滤液离心(2000rpm，10min)，反复用大量生理盐水冲洗，离心洗涤3次，收集沉淀，沉淀物用0.5-1.5％胰酶和4％-8％胆汁(用0.01M pH8.OPBS稀释)在41℃水浴箱内消化1-2小时，消化期间间歇摇动，离心(3000rpm，5min)洗涤3次，沉淀物搅拌均匀后置于10倍体积量的2.5％重铬酸钾溶液中，在28℃恒温培养箱内培养72-96h，保持所需湿度并间歇摇动，完成卵囊的孢子化。

当卵囊孢子化率达80％以上即可收集，然后将孢子化的卵囊液置4℃冰箱中保存备用。将上述分离、收集后的卵囊分别配制成适当含量的卵囊悬浮液备用。

2.构造一级致弱株

采用下述成分混合均匀作为化学致弱剂，

将柔嫩、毒害和巨型艾美耳球虫的孢子化卵囊采用化学诱变剂进行化学致弱，经分离、收集后分别配制成适当含量的卵囊悬浮液制成一级致弱株保存备用。

3.构造二级致弱株

将孵化出的SPF(无特定病原)小鸡在饲养房中饲喂到适宜日龄(根据需要可以进行选择，不受到限制)后，将柔嫩、毒害、巨型三种一级致弱株与粉碎、过筛后的鸡饲料混合，喂给SPF小鸡接种传代，并分组喂养。在适宜日龄宰杀小鸡从肠道有效部位收集卵囊，将收集到的三种卵囊分别用2.5％的重铬酸钾溶液保存，经过孢子化过程后进行离心分离，将收集到的卵囊分别离心去除重铬酸钾，然后用重蒸水配成浓度为40-80万个卵囊/ml的卵囊悬液，所用物理诱变因素紫外线照射，紫外光源15-20瓦，波长200-300nm，照射时间：230-300秒。为了保证有效照射，紫外线照射装置预开15min，卵囊悬液距离紫外光源25-30cm，照射过程中卵囊悬液处于流动状态。照射结束后，卵囊返回10倍量的2.5％重铬酸钾中，即为二级致弱株。

4.制备成球虫三价活疫苗

将柔嫩、毒害、巨型三种二级致弱株(即双重致弱株)分别进行孢子化卵囊计数，并根据两次免疫时三种卵囊数量的不同技术需要，经计算配制需要量，分别准确移取计算得到的三种卵囊数量，混匀并适当稀释后，即得一次、二次用双重致弱的三价球虫苗混悬液。双重致弱三价球虫苗混悬液分别充分混匀后，根据每瓶羽份数换算得的混悬液量按1∶1∶1的比例混合制成球虫三价活疫苗进行分装。

在制备得到上述疫苗后，申请人对3种艾美耳球虫与5代双重致弱株一些生物学特性，包括卵囊的形态特征、内生性发育速率(隐伏期)、致病性及药物敏感性(耐药性)等方面进行了广泛的比较研究，试验结果显示：烷化剂类化学诱变剂处理和物理诱变因素紫外线照射双重致弱并不影响E.tenella、E.necatrix、E.maxima卵囊的形态特征，但有效减慢了卵囊的内生性发育速率，使3种球虫卵囊的隐伏期延长了约5-8h。尤其是E.necatrix隐伏期远高于目前文献中所能达到的99h，由此可见双重致弱降低了球虫卵囊的致病性并恢复了耐药株对药物的敏感性，这些特性的改变是稳定的、可遗传的。

同时，申请人还对E.tenella强毒株与双重致弱株的免疫原性做了比较，证实二者的免疫原性未发生变化，均能激发雏鸡产生对球虫感染的高度免疫。双重致弱在不改变球虫卵囊免疫原性的基础上降低了卵囊的致病性，是一种优异的弱毒疫苗。

将上述制备的活疫苗与免疫激活剂成品联用，在致弱虫苗发挥特异性免疫的同时，辅以细菌免疫激活剂的非特异性免疫的配套协同作用，能够确保鸡体在获得高效价体液免疫时提高鸡体细胞免疫水平，从而降低球虫病的死亡率。

Claims (10)

1.一种鸡球虫病三价活疫苗，其特征在于将柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫三种艾美耳球虫分离、纯化、培养后的孢子化球虫卵囊采用烷化剂类化学致弱剂进行一级致弱、一级致弱株培养的小鸡所得卵囊采用物理诱变因素紫外线照射进行二级致弱得到的三种二级致弱株混合制成。

2.根据权利要求1所述的鸡球虫病三价活疫苗，其特征在于所用烷化剂类化学诱变剂由重铬酸钾、二甲基亚砜、氯化钠、碳酸氢钠、NTG、环磷酰胺加入到蒸馏水组成。

3.根据权利要求2所述的鸡球虫病三价活疫苗，其特征在于烷化剂类化学诱变剂组成为重铬酸钾350-500g、二甲基亚砜10-20ml、氯化钠1-3g、碳酸氢钠1-3g、NTG5-10ml、环磷酰胺0.01-0.03mg、蒸馏水1500-2000ml。

4.根据权利要求1所述的鸡球虫病三价活疫苗，其特征在于物理诱变因素紫外线照射光源为15-20瓦，波长为200-300nm，照射时间230-300秒。

5.鸡球虫病三价活疫苗的制备方法，其特征在于包括下述步骤：1)将柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫三种艾美耳球虫的球虫卵囊进行分离、纯化和培养；2)将步骤1)所得孢子化卵囊采用烷化剂类化学诱变剂进行化学致弱，经分离、收集后分别配制成卵囊悬浮液制成一级致弱株；3)将一级致弱株与鸡饲料混合喂给小鸡，宰杀小鸡从肠道收集卵囊，将收集到的三种卵囊分别采用重铬酸钾溶液保存，经孢子化过程后离心分离；4)将步骤3)收集到的卵囊分别离心去除重铬酸钾，用重蒸水配成卵囊悬液，将卵囊悬液在流动状态下采用物理诱变因素紫外线下照射；5)照射结束后，卵囊重新加入到重铬酸钾中，即得二级致弱株；6)将三种二级双重致弱株分别进行孢子化卵囊计数，混匀并稀释即得一次、二次用双重致弱的三价球虫苗混悬液，将三种双重致弱三价球虫苗混悬液分别充分混匀后混合制成球虫三价活疫苗进行分装。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)具体包括下述步骤：将生理盐水与粪便搅成混悬液；将混悬液经滤过后离心弃去上清液，向沉淀中加入饱和盐水充分混匀，离心所得沉淀物即为所需球虫卵囊；从病鸡的盲肠和小肠刮取内容物和粘膜，加入生理盐水后过滤纯化，然后采用生理盐水冲洗，离心洗涤后收集沉淀，所得沉淀物用胰酶和胆汁在水浴箱内消化，消化期间间歇摇动，离心洗涤后将沉淀物搅拌均匀加入到重铬酸钾溶液中，在28℃恒温培养箱内培养，间歇摇动，完成卵囊的孢子化。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)采用权利要求3所述的烷化剂类化学诱变剂。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)的卵囊悬液浓度为40-80万个卵囊/ml，紫外光源15-20瓦，波长200-300纳米的紫外线下照射230-300秒，其中卵囊悬液距离紫外光源25-30cm，照射过程中卵囊悬液处于流动状态。

9.权利要求1所述鸡球虫病三价活疫苗用于鸡中诱导鸡应答反应的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于还包括将所述鸡球虫病三价活疫苗与免疫激活剂联合使用。