CN101642566A - 一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种经紫外线和钴60γ－射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，它的制备方法是：取样；增殖卵囊；利用紫外线和钴60γ－射线照射子代卵囊；紫外线和钴60γ－射线照射剂量的确定；获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)早熟株卵囊；以第3步中紫外线和钴60γ－射线处理后的球虫卵囊为亲本，进行鸡球虫早熟选育；混合。它能大大缩短早熟选育所用时间，提高选育的效率，短时间内即可获得大量的商品化早熟致弱虫株。
Description
技术领域：
本发明涉及一种兽用疫苗的制备方法，尤其是一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法。
背景技术：
鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫中的一种或多种寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的一种以肠炎、血痢为主要特征的疾病，多发于3月龄以内的仔鸡，以15-50日龄的雏鸡最易感染，发病率高达100％，病死率为20％-30％，严重者可达80％，是危害养鸡业的重要疾病之一。
目前，对该病的防治主要有药物防治和疫苗控制两种方法，其中药物防治是通过在饲料或饮水中加入预防或治疗量的抗球虫药来达到防治的目的。常用的抗球虫药有：妥曲珠利、地克珠利、氨丙琳、盐霉素、莫能霉素、磺胺喹唖啉、磺胺氯吡嗪等。但长期使用药物防治会造成抗药株的产生。通过免疫方法对鸡球虫病进行防治已是大势所趋。目前国内外已研制开发的鸡球虫疫苗有强毒株疫苗、弱毒株疫苗和基因工程苗等，其中，强毒株疫苗以美国的混合卵囊球虫疫苗Coccivac为代表，它在1-10日龄通过饮水或饲料给鸡接种少量含有8种球虫的混合卵囊，通过鸡群繁殖后把子代卵囊播撒到垫料上，使鸡群反复感染而不断增强免疫力。但这种强毒虫株疫苗问世40多年来并没有在商品肉鸡广泛使用，主要原因是其存在两大缺陷：一是存在于虫苗中的各球虫株都是完全致病性的；二是由于鸡群摄入卵囊量的不一致，结果有的鸡感染太轻，不足以产生免疫力，有的鸡摄入卵囊过多而引起发病。
由于活的强毒株疫苗未经致弱，如果免疫量不准确或免疫接种经鸡传代后卵囊的数量越来越多，有可能导致球虫病的爆发，于是致弱疫苗应运而生。目前对强毒株球虫的致弱方法主要有三种：理化致弱法、鸡胚传代致弱法和早熟卵囊选育法。
理化致弱法是通过对卵囊进行冷却、加热、超声、离子辐射等物理处理，而使之减毒。
鸡胚传代致弱不引起出血，对组织损伤小，以此致弱虫株免疫的鸡对强毒株的攻击有良好的保护作用。但鸡胚传代致弱有四大缺点：(1)致弱性能相对不稳定，当在鸡体内传代时毒力有可能返强；(2)通过鸡胚致弱获得大量商品化致弱球虫卵囊比较困难；(3)鸡胚传代致弱，随着代数的增加虫体的免疫原性就会逐渐减少或丧失；(4)最主要的局限性在于流行最广的巨型、堆型和早熟艾美尔球虫虽然可以在鸡胚内发育，但卵囊生长不良，因此通过鸡胚传代生产全价致弱疫苗就受到了限制。
早熟卵囊选育法致弱的虫株，其致病力的减弱是由于第2代裂殖体没有完全分化或在成熟时变得非常小，利用这些致弱虫株制成球虫疫苗能够诱导机体产生免疫力。这种虫苗能防治发病，而不是抵抗感染，尽管用苗后鸡群仍有卵囊排出，但鸡群的球虫病确实得到了预防和控制。此外，目前人们正努力开发球虫基因疫苗，尝试用纯化的抗原来免疫鸡以获得保护。虽然近几年基因工程球虫疫苗制备技术已经取得了进步，但离实际应用的目标还很遥远。
发明内容：
本发明的目的是提供一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，它能大大缩短早熟选育所用时间，提高选育的效率，短时间内即可获得大量的商品化早熟致弱虫株。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：本发明的制备方法是：(一)、取样：在偏远山区散养鸡中采集七种鸡艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)样品；
(二)、增殖卵囊：利用单卵囊分离技术得到七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的纯化卵囊，分别接种生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊；
(三)、利用紫外线和钴60γ-射线照射子代卵囊：一种方法是：将七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的子代卵囊置于254nm紫外线下照射；另一种方法是：将七种艾美尔球虫的子代卵囊置于钴60γ-射线下照射；第三种方法是：将七种艾美尔球虫的子代卵囊先置于钴60γ-射线下照射，然后再置于254nm紫外线下照射；第四种方法是：先将卵囊置于254nm紫外线下照射，然后再置于钴60γ-射线下照射。最后将经各种方法处理后的卵囊放在2.5％重铬酸钾溶液中，放入28℃恒温箱中，培养48小时；
(四)、紫外线和钴60γ-射线照射剂量的确定：以紫外线和钴60γ-射线照射后1-60％的球虫卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以1-20％的球虫卵囊存活为适宜的照射剂量；以1-10％的球虫卵囊存活为较适宜的照射剂量；以1-5％的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量，以1-3％的球虫卵囊存活为最适宜的照射剂量；以1-2％的球虫卵囊存活为最佳的照射剂量；
(五)、获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)早熟株卵囊：以第3步中紫外线和钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育出柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株；
(六)、以第3步中紫外线和钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，进行鸡球虫早熟选育，若无法获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的早熟株，可以重复第3步中的方法，然后再进行各虫种的早熟选育，如此反复，直到获得七种鸡艾美尔球虫的早熟株；
(七)、混合，将上述四种(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)致弱的鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
紫外线和钴60γ-射线照射剂量为：以紫外线和钴60γ-射线照射后1~60％的球虫卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以1~20％的球虫卵囊存活为适宜的照射剂量；以1~10％的球虫卵囊存活为较适宜的照射剂量；以1~5％的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量，以1~3％的球虫卵囊存活为最适宜的照射剂量；以1~2％的球虫卵囊存活为最佳的照射剂量。
本发明先将鸡球虫卵囊在紫外线和钴60γ-射线下照射，然后再进行早熟选育，经3-4代的早熟选育就可以得到各个虫种(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)的早熟株，大大缩短了早熟选育所用时间，提高了选育的效率，为短时间内获得大量的商品化早熟致弱虫株提供了一个切实可行的方法。
具体实施方式：
具体实施方式一：在偏远山区散养鸡中采集鸡球虫样品，利用单卵囊分离技术得到四种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)的纯化卵囊，分别接种给生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊。将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液倒入平皿，悬液深2mm，置于254nm紫外线下照射30-60s。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2.5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述经紫外线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株。将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式二：采用具体实施方式一的方法收集子代卵囊；将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60γ-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy；将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2.5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述经钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株；将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式三：采用具体实施方式一的方法收集子代卵囊；将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60γ-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy；然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254nm紫外线下照射30-60s。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2.5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株；将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式四：采用具体实施方式一的方法收集子代卵囊；将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254nm紫外线下照射30-60s，悬液深2mm；然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60γ-射线下照射，照射剂量为1-2KGy。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2.5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株；将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式五：采用具体实施方式一的方法收集子代卵囊；将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60γ-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2.5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
将上述早熟选育得到的球虫卵囊孢子化后，口服接种给生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊，将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液再置于钴60γ-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy。这些卵囊经孢子化后再根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式六：采用具体实施方式一的方法收集子代卵囊；将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254nm紫外线下照射30-60s，悬液深2mm。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2.5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
将上述得到的球虫卵囊孢子化后口服接种给生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊，再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254nm紫外线下照射30-60s，悬液深2mm；这些卵囊经孢子化后再根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式七：采用具体实施方式一的方法收集子代卵囊；将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60γ-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy；然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254nm紫外线下照射30-60s。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的2.5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
将上述早熟选育得到的球虫卵囊孢子化后口服接种给生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊，将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液再置于钴60γ-射线下照射，悬液深2mm，照射剂量为1-2KGy；然后将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液再置于254nm紫外线下照射30-60s。这些卵囊经孢子化后再根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
具体实施方式八：采用具体实施方式一的方法收集子代卵囊；将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于254nm紫外线下照射30-60s，悬液深2mm；然后再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60γ-射线下照射，照射剂量为1-2KGy。
将处理后的卵囊放入置有10倍体积的5％重铬酸钾溶液的培养皿中，溶液深度约2.5mm，放入28℃恒温箱中，培养48小时。
以上述处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
将上述得到的球虫卵囊孢子化后口服接种给生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊，将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液再置于254nm紫外线下照射30-60s，悬液深2mm；再将四种艾美尔球虫的子代卵囊悬液置于钴60γ-射线下照射，照射剂量为1-2KGy。这些卵囊经孢子化后再根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，进行柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟选育。
如此反复直到获得四种鸡艾美尔球虫的早熟株。
将早熟选育获得的四种鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
本具体实施方式具有以下积极效果：将自然分离的鸡球虫强毒株直接进行早熟选育，一般每个虫种都需要选育20代左右才能获得其早熟株。若先将鸡球虫卵囊在紫外线和钴60γ-射线下照射，然后再进行早熟选育，经3-4代的早熟选育就可以得到各个虫种(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)的早熟株，大大缩短了早熟选育所用时间，提高了选育的效率，为短时间内获得大量的商品化早熟致弱虫株提供了一个切实可行的方法。
Claims (2)
1、一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，其特征在于它的制备方法是：(一)、取样：在偏远山区散养鸡中采集七种鸡艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)样品；
(二)、增殖卵囊：利用单卵囊分离技术得到七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的纯化卵囊，分别接种生长在无球虫环境下的雏鸡，收集子代卵囊；
(三)、利用紫外线和钴60γ-射线照射子代卵囊：一种方法是：将七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的子代卵囊置于254nm紫外线下照射；另一种方法是：将七种艾美尔球虫的子代卵囊置于钴60γ-射线下照射；第三种方法是：将七种艾美尔球虫的子代卵囊先置于钴60γ-射线下照射，然后再置于254nm紫外线下照射；第四种方法是：先将卵囊置于254nm紫外线下照射，然后再置于钴60γ-射线下照射。最后将经各种方法处理后的卵囊放在2.5％重铬酸钾溶液中，放入28℃恒温箱中，培养48小时；
(四)、紫外线和钴60γ-射线照射剂量的确定：以紫外线和钴60γ-射线照射后1-60％的球虫卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以1-20％的球虫卵囊存活为适宜的照射剂量；以1-10％的球虫卵囊存活为较适宜的照射剂量；以1-5％的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量，以1-3％的球虫卵囊存活为最适宜的照射剂量；以1-2％的球虫卵囊存活为最佳的照射剂量；
(五)、获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)早熟株卵囊：以第3步中紫外线和钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，根据鸡球虫早熟选育致弱的原理，选育出柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫的早熟株；
(六)、以第3步中紫外线和钴60γ-射线处理后的球虫卵囊为亲本，进行鸡球虫早熟选育，若无法获得七种艾美尔球虫(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫)的早熟株，可以重复第3步中的方法，然后再进行各虫种的早熟选育，如此反复，直到获得七种鸡艾美尔球虫的早熟株；
(七)、混合，将上述四种(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)致弱的鸡艾美尔球虫的孢子化卵囊按比例混合即得到鸡球虫病四价(柔嫩艾美尔球虫、堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫)活疫苗。
2、根据权利要求1所述的一种经紫外线和钴60γ-射线照射并经早熟选育获得的鸡球虫病疫苗的制备方法，其特征在于紫外线和钴60γ-射线照射剂量为：以紫外线和钴60γ-射线照射后1-60％的球虫卵囊存活为基本适宜的照射剂量；以1-20％的球虫卵囊存活为适宜的照射剂量；以1-10％的球虫卵囊存活为较适宜的照射剂量；以1-5％的球虫卵囊存活为非常适宜照射剂量，以1-3％的球虫卵囊存活为最适宜的照射剂量；以1-2％的球虫卵囊存活为最佳的照射剂量。
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2009
- 2009-06-25 CN CN200910148185A patent/CN101642566A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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