JPH0948797A - 家禽コクシジウム症ワクチン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 家禽のコクシジウム症を防御するのに有効な
ワクチン用免疫原性タンパク質及びこれをコードするＤ
ＮＡを提供すること。 【解決方法】 Ｅｉｍｅｒｉａ種由来の相対モノマー分
子量約３７，０００の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
の免疫反応及び／又は抗原決定基を１つ以上有するタン
パク質、このタンパク質をコードするＤＮＡ。これらの
タンパク質及びＤＮＡをワクチン又はベクターワクチン
として使用することによって、コクシジウム症から家禽
を有効に保護できる。
ワクチン用免疫原性タンパク質及びこれをコードするＤ
ＮＡを提供すること。 【解決方法】 Ｅｉｍｅｒｉａ種由来の相対モノマー分
子量約３７，０００の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
の免疫反応及び／又は抗原決定基を１つ以上有するタン
パク質、このタンパク質をコードするＤＮＡ。これらの
タンパク質及びＤＮＡをワクチン又はベクターワクチン
として使用することによって、コクシジウム症から家禽
を有効に保護できる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫リンパ球を刺
激し得るＥｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ由来の
タンパク質に関する。本発明は更に、該タンパク質の全
て又は抗原として有意な部分をコードする核酸配列、該
核酸配列を含む組換えベクター、該組換えベクターで形
質転換される宿主細胞又は微生物、及び家禽コクシジウ
ム症の予防ワクチンに関する。
激し得るＥｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ由来の
タンパク質に関する。本発明は更に、該タンパク質の全
て又は抗原として有意な部分をコードする核酸配列、該
核酸配列を含む組換えベクター、該組換えベクターで形
質転換される宿主細胞又は微生物、及び家禽コクシジウ
ム症の予防ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】コクシジウム症は、Ａｐｉｃｏｍｐｌｅ
ｘａ亜門Ｅｉｍｅｒｉａ属の細胞内原生動物寄生虫であ
る多くのコクシジウム種の１種以上に感染して生ずる疾
病である。本明細書では、家禽とは、卵又は食肉源とし
て役立ち、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョ
ウ、ホロホロチョウ、キジ、ハト及びクジャクのような
商業的に重要な種類を包含する飼育鳥類であると定義す
る。
ｘａ亜門Ｅｉｍｅｒｉａ属の細胞内原生動物寄生虫であ
る多くのコクシジウム種の１種以上に感染して生ずる疾
病である。本明細書では、家禽とは、卵又は食肉源とし
て役立ち、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョ
ウ、ホロホロチョウ、キジ、ハト及びクジャクのような
商業的に重要な種類を包含する飼育鳥類であると定義す
る。
【０００３】ニワトリコクシジウム症は幾つかの異なる
Ｅｉｍｅｒｉａ種、即ちＥｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕ
ｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、
Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｍ
ｉｔｉｓ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ及び
Ｅ．ｈａｇａｎｉによって発症することが知られてい
る。しかしながら、最後の２種についてはその存在を疑
う人たちもいる。これらのＥｉｍｅｒｉａ種に僅かでも
感染すると、再感染防御免疫が得られる。
Ｅｉｍｅｒｉａ種、即ちＥｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕ
ｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、
Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｍ
ｉｔｉｓ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ及び
Ｅ．ｈａｇａｎｉによって発症することが知られてい
る。しかしながら、最後の２種についてはその存在を疑
う人たちもいる。これらのＥｉｍｅｒｉａ種に僅かでも
感染すると、再感染防御免疫が得られる。
【０００４】種によってニワトリへの病原作用は異な
り、ニワトリの種類もある役割を果たす。例えば、ブロ
イラー用のニワトリは、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ又は
Ｅ．ｍａｘｉｍａのような寄生虫が、食物消化に重要な
役割を果たす小腸の広域部分に寄生するため、寄生虫に
よって大きな打撃を受ける。
り、ニワトリの種類もある役割を果たす。例えば、ブロ
イラー用のニワトリは、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ又は
Ｅ．ｍａｘｉｍａのような寄生虫が、食物消化に重要な
役割を果たす小腸の広域部分に寄生するため、寄生虫に
よって大きな打撃を受ける。
【０００５】Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａはヨーロッパ及
びＵＳＡのブロイラー用鶏舎の寝わらで発見される最も
一般的な種の一つである。Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａは
高い生殖能力を有する。また体重増加を著しく抑制し、
飼料要求を高め、上方小腸に大きな病変を生ずるために
病原性であるとみなされている。
びＵＳＡのブロイラー用鶏舎の寝わらで発見される最も
一般的な種の一つである。Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａは
高い生殖能力を有する。また体重増加を著しく抑制し、
飼料要求を高め、上方小腸に大きな病変を生ずるために
病原性であるとみなされている。
【０００６】生活環中（表１も参照されたい）、Ｅｉｍ
ｅｒｉａ寄生虫は幾つかの段階を経る。ニワトリが地面
での給餌中に又は埃の吸入によって胞子形成オーシスト
として知られる感染期の寄生虫を経口接種すると生活環
が開始する。胞子形成オーシストの壁は機械的粉砕作用
と化学作用との組み合わせによって砂嚢及び腸管で破壊
され、４個のスポロシストが放出される。このスポロシ
ストが十二指腸内に入ると、胆汁や消化酵素にさらされ
て、スポロシスト１個当たり２個のスポロゾイトが放出
される。
ｅｒｉａ寄生虫は幾つかの段階を経る。ニワトリが地面
での給餌中に又は埃の吸入によって胞子形成オーシスト
として知られる感染期の寄生虫を経口接種すると生活環
が開始する。胞子形成オーシストの壁は機械的粉砕作用
と化学作用との組み合わせによって砂嚢及び腸管で破壊
され、４個のスポロシストが放出される。このスポロシ
ストが十二指腸内に入ると、胆汁や消化酵素にさらされ
て、スポロシスト１個当たり２個のスポロゾイトが放出
される。
【０００７】
【表１】
【０００８】スポロゾイトは可動性で、適切な宿主上皮
細胞を探し、そこに侵入して生殖する。上皮細胞が感染
した後、寄生虫は生活環のシゾント期に入り、シゾント
１個当たり８〜１６個、更には２００個を超えるメロゾ
イトを生成する。一旦シゾントから放出されたメロゾイ
トは自由に別の上皮細胞に感染する。２〜５回のこのよ
うな無性生殖サイクルの後に、細胞内メロゾイトは成長
して、雌性即ち大配偶子母細胞及び雄性即ち小配偶子母
細胞として知られる有性形態となる。小配偶子母細胞か
ら放出された小配偶子による大配偶子母細胞の受精後
に、周りに嚢子壁を生じた接合体が形成される。新たに
形成されたオーシストは糞に混じって感染ニワトリの体
外に出る。
細胞を探し、そこに侵入して生殖する。上皮細胞が感染
した後、寄生虫は生活環のシゾント期に入り、シゾント
１個当たり８〜１６個、更には２００個を超えるメロゾ
イトを生成する。一旦シゾントから放出されたメロゾイ
トは自由に別の上皮細胞に感染する。２〜５回のこのよ
うな無性生殖サイクルの後に、細胞内メロゾイトは成長
して、雌性即ち大配偶子母細胞及び雄性即ち小配偶子母
細胞として知られる有性形態となる。小配偶子母細胞か
ら放出された小配偶子による大配偶子母細胞の受精後
に、周りに嚢子壁を生じた接合体が形成される。新たに
形成されたオーシストは糞に混じって感染ニワトリの体
外に出る。
【０００９】温度や湿度の環境条件が適切で、大気中に
十分な酸素があれば、オーシストは胞子形成して、新た
な宿主に感染する感染期に入り、疾病が広がる。従っ
て、寄生虫をトリからトリに移動させるのに中間宿主は
不要である。
十分な酸素があれば、オーシストは胞子形成して、新た
な宿主に感染する感染期に入り、疾病が広がる。従っ
て、寄生虫をトリからトリに移動させるのに中間宿主は
不要である。
【００１０】Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫がニワトリ消化管に
感染すると、体重増加が抑制され、飼料要求が増し、卵
の生産が停止し、場合によっては死に至ることがあり得
る。この寄生虫のために、家禽の集約生産の増加は重大
な損害を伴っていた。実際、コクシジウム症は経済的に
最も重大な寄生虫病となった。オランダでは、家禽農家
が毎年被る損害は数百万ギルダーである。１９８６年度
の損害は約１３００万ギルダーであった。同じ年の米国
での損害は３億ドルであった。
感染すると、体重増加が抑制され、飼料要求が増し、卵
の生産が停止し、場合によっては死に至ることがあり得
る。この寄生虫のために、家禽の集約生産の増加は重大
な損害を伴っていた。実際、コクシジウム症は経済的に
最も重大な寄生虫病となった。オランダでは、家禽農家
が毎年被る損害は数百万ギルダーである。１９８６年度
の損害は約１３００万ギルダーであった。同じ年の米国
での損害は３億ドルであった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】これまでに、コクシジ
ウム症防御のために幾つかの方法が使用されてきた。化
学療法剤が登場する前は、寝わらを機械で除去すると共
に消毒薬を用いて衛生状態を改善することが最も慣用的
な方法であった。しかしながら、通常疾病を媒介するの
に十分なオーシストが残存していた。
ウム症防御のために幾つかの方法が使用されてきた。化
学療法剤が登場する前は、寝わらを機械で除去すると共
に消毒薬を用いて衛生状態を改善することが最も慣用的
な方法であった。しかしながら、通常疾病を媒介するの
に十分なオーシストが残存していた。
【００１２】良好な管理に加えて、飼料又は飲み水にコ
クシジウム増殖阻止剤を導入することにより、疾病防御
にある程度は成功した。このような薬剤は、一部にはコ
クシジウム薬剤耐性株が生ずるために、年々効能が低下
することが判明した。更には、食肉中に残留して食肉を
消費に適さないものとする化学療法剤があることが判明
した。
クシジウム増殖阻止剤を導入することにより、疾病防御
にある程度は成功した。このような薬剤は、一部にはコ
クシジウム薬剤耐性株が生ずるために、年々効能が低下
することが判明した。更には、食肉中に残留して食肉を
消費に適さないものとする化学療法剤があることが判明
した。
【００１３】７種全てのＥｉｍｅｒｉａに由来するオー
シストを含む生ワクチンをニワトリに投与して疾病を免
疫学的に防御しようとする試みがなされた。投与される
オーシストは早熟系由来のものである。このような早熟
系は、ニワトリに野生集団のＥｉｍｅｒｉａ種を接種
し、感染の結果として排出される正に最初の寄生虫を収
集することによって得られる。収集した寄生虫をニワト
リに戻し、サイクルを数回繰り返す。場合によっては、
腸での無性生殖サイクルが少ない早熟系寄生虫が生成さ
れる。従って、このような系は免疫原性を保持してお
り、宿主ニワトリの腸での寄生虫発生が減少し、結果的
に被害も少なくなる。
シストを含む生ワクチンをニワトリに投与して疾病を免
疫学的に防御しようとする試みがなされた。投与される
オーシストは早熟系由来のものである。このような早熟
系は、ニワトリに野生集団のＥｉｍｅｒｉａ種を接種
し、感染の結果として排出される正に最初の寄生虫を収
集することによって得られる。収集した寄生虫をニワト
リに戻し、サイクルを数回繰り返す。場合によっては、
腸での無性生殖サイクルが少ない早熟系寄生虫が生成さ
れる。従って、このような系は免疫原性を保持してお
り、宿主ニワトリの腸での寄生虫発生が減少し、結果的
に被害も少なくなる。
【００１４】この種のワクチンの欠点は、生きたニワト
リで製造する必要があり、生殖能力も低いので製造コス
トがかかることである。
リで製造する必要があり、生殖能力も低いので製造コス
トがかかることである。
【００１５】遺伝子工学の到来によって、効果的なワク
チンの新たな製造方法が得られた。これらの方法を用い
て、ある病原性微生物の抗原性タンパク質をコードする
ＤＮＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ又はＳａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ種のような宿主微生物中にクローニング
すると、その結果、タンパク質がワクチン中に導入可能
なほどに十分高いレベルで発現された。このようにして
産生されたタンパク質の利点は、非感染性であり、製造
コストが比較的安価なことである。このようにして、肝
炎ウイルス、単純疱疹ウイルス及び口蹄疫ウイルスのよ
うな幾つかのウイルスに対するワクチンが製造された。
チンの新たな製造方法が得られた。これらの方法を用い
て、ある病原性微生物の抗原性タンパク質をコードする
ＤＮＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ又はＳａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ種のような宿主微生物中にクローニング
すると、その結果、タンパク質がワクチン中に導入可能
なほどに十分高いレベルで発現された。このようにして
産生されたタンパク質の利点は、非感染性であり、製造
コストが比較的安価なことである。このようにして、肝
炎ウイルス、単純疱疹ウイルス及び口蹄疫ウイルスのよ
うな幾つかのウイルスに対するワクチンが製造された。
【００１６】コクシジウム症ワクチンを遺伝子工学で製
造しようとする試みがなされた。ヨーロッパ特許出願第
３３７ ５８９号は、Ｂ型Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌ
ｌａタンパク質の単離やこのタンパク質の新規発現ベク
ター内への挿入、及びこの発現ベクターを用いた適切な
宿主の形質転換を記載している。ＰＣＴ出願ＷＯ９２／
０４４６１号は、「ｍＲＮＡルート」又は「核ＤＮＡル
ート」を用いて抗原性タンパク質を産生する微生物の構
築を記載している。このように、製造されて配列決定さ
れたＥ．ｔｅｎｅｌｌａ及びＥ．ｍａｘｉｍａ由来の抗
原もある。ワクチン内に導入するための抗原のこの種の
方法での製造は単に、異種生物中に抗体を生じさせ得る
抗原の選択に依存している。このアプローチは必ずし
も、最も防御的な抗原の選択をもたらすものではない。
造しようとする試みがなされた。ヨーロッパ特許出願第
３３７ ５８９号は、Ｂ型Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌ
ｌａタンパク質の単離やこのタンパク質の新規発現ベク
ター内への挿入、及びこの発現ベクターを用いた適切な
宿主の形質転換を記載している。ＰＣＴ出願ＷＯ９２／
０４４６１号は、「ｍＲＮＡルート」又は「核ＤＮＡル
ート」を用いて抗原性タンパク質を産生する微生物の構
築を記載している。このように、製造されて配列決定さ
れたＥ．ｔｅｎｅｌｌａ及びＥ．ｍａｘｉｍａ由来の抗
原もある。ワクチン内に導入するための抗原のこの種の
方法での製造は単に、異種生物中に抗体を生じさせ得る
抗原の選択に依存している。このアプローチは必ずし
も、最も防御的な抗原の選択をもたらすものではない。
【００１７】Ｈ．Ｓ． Ｌｉｌｌｅｈｏｊ（Ｖｅｔ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．， １３，
３２１−３３０，１９８６）によれば、コクシジウム
に感染したニワトリの感染防御免疫の発生は種特異的Ｔ
細胞応答の発生によるものであろうと考えられ得る。
Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．， １３，
３２１−３３０，１９８６）によれば、コクシジウム
に感染したニワトリの感染防御免疫の発生は種特異的Ｔ
細胞応答の発生によるものであろうと考えられ得る。
【００１８】Ｅｉｍｅｒｉａシゾントの４２時間の発生
段階から非常に免疫原性のタンパク質を単離できること
が今回知見された。驚くべきことに、このタンパク質は
Ｅｉｍｅｒｉａの細胞内に発見され、既知の異種乳酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と高い配列相同性を有するよ
うに思える。
段階から非常に免疫原性のタンパク質を単離できること
が今回知見された。驚くべきことに、このタンパク質は
Ｅｉｍｅｒｉａの細胞内に発見され、既知の異種乳酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と高い配列相同性を有するよ
うに思える。
【００１９】
【課題を解決するための手段】従って、本発明では、モ
ノマー分子量が約３７ｋＤのＥｉｍｅｒｉａ乳酸デヒド
ロゲナーゼの免疫反応及び／又は抗原決定基を１つ以上
有するタンパク質を提供する。
ノマー分子量が約３７ｋＤのＥｉｍｅｒｉａ乳酸デヒド
ロゲナーゼの免疫反応及び／又は抗原決定基を１つ以上
有するタンパク質を提供する。
【００２０】とりわけ乳酸ヒドロゲナーゼはＥｉｍｅｒ
ｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａに由来する。
ｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａに由来する。
【００２１】本発明の第２の態様により、精製Ｅｉｍｅ
ｒｉａ乳酸デヒドロゲナーゼの全て又は実質的な部分、
特に免疫活性部分をコードする核酸配列を提供する。こ
のような核酸配列を発現制御配列に作動可能に結合する
と組換え核酸分子が得られ得る。この核酸分子を適切な
ベクターに挿入すると、核酸配列を発現し得る組換えベ
クターとなる。
ｒｉａ乳酸デヒドロゲナーゼの全て又は実質的な部分、
特に免疫活性部分をコードする核酸配列を提供する。こ
のような核酸配列を発現制御配列に作動可能に結合する
と組換え核酸分子が得られ得る。この核酸分子を適切な
ベクターに挿入すると、核酸配列を発現し得る組換えベ
クターとなる。
【００２２】先に定義したような組換えベクター又は核
酸配列を使用して、適切な宿主細胞又は生物を形質転換
することができる。このような形質転換した宿主細胞又
は生物を使用して、家禽コクシジウム症の予防ワクチン
内に導入するための刺激タンパク質を産生してもよい。
あるいは、形質転換した宿主細胞又は生物自体をワクチ
ン内に導入してもよい。
酸配列を使用して、適切な宿主細胞又は生物を形質転換
することができる。このような形質転換した宿主細胞又
は生物を使用して、家禽コクシジウム症の予防ワクチン
内に導入するための刺激タンパク質を産生してもよい。
あるいは、形質転換した宿主細胞又は生物自体をワクチ
ン内に導入してもよい。
【００２３】一般に、「タンパク質」という用語は、生
物活性を有するアミノ酸分子鎖を指す。タンパク質は特
定の長さを有するものではなく、必要とあれば例えばグ
リコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化に
よりｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏ改変することが
できる。従って、とりわけペプチド、オリゴペプチド及
びポリペプチドが上記定義に包含される。
物活性を有するアミノ酸分子鎖を指す。タンパク質は特
定の長さを有するものではなく、必要とあれば例えばグ
リコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化に
よりｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏ改変することが
できる。従って、とりわけペプチド、オリゴペプチド及
びポリペプチドが上記定義に包含される。
【００２４】本発明では特に、配列番号２に示すアミノ
酸配列を有し、ＬＤＨ活性又はその免疫活性部分を有す
るタンパク質、及びその生物機能等価物又は変異体を提
供する。
酸配列を有し、ＬＤＨ活性又はその免疫活性部分を有す
るタンパク質、及びその生物機能等価物又は変異体を提
供する。
【００２５】本明細書に特に開示するタンパク質の生物
機能等価物又は変異体とは、例えば１個以上のアミノ酸
の欠失、挿入及び／又は置換によって上記アミノ酸配列
から誘導されるタンパク質であるが、Ｅｉｍｅｒｉａ抗
原の１個以上の免疫原決定基は保持している。即ち前記
変異体は、宿主動物で免疫応答を誘発し得るエピトープ
を１つ以上有する。
機能等価物又は変異体とは、例えば１個以上のアミノ酸
の欠失、挿入及び／又は置換によって上記アミノ酸配列
から誘導されるタンパク質であるが、Ｅｉｍｅｒｉａ抗
原の１個以上の免疫原決定基は保持している。即ち前記
変異体は、宿主動物で免疫応答を誘発し得るエピトープ
を１つ以上有する。
【００２６】本明細書に包含される特定のタンパク質で
は、個々のＥｉｍｅｒｉａ寄生虫又は株の間に自然変異
が存在し得ると理解されよう。これらの変異は全配列中
の１つもしくは複数のアミノ酸の相違によって又は該配
列でのアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加によ
って示され得る。本質的に生物活性も免疫活性も変えな
いアミノ酸置換は、例えばＮｅｕｒａｔｈ等が「Ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載している。関
連するアミノ酸の間のアミノ酸置換、即ち進化中に頻繁
に生じた置換はとりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇ
ｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａ
ｌである（Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ．Ｄ．， Ａｔｌａｓ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅ
ｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．， １９７８， ５巻，補遺３を参照されたい）。
他のアミノ酸置換にはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅ
ｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓ
ｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒ
ｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ
及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、
Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速高感度タンパク
質比較法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４
１，１９８５）及び同種タンパク質間の機能類似性の決
定法を開発した。得られるタンパク質が免疫反応性を保
持している限り、本発明の実施態様のこのようなアミノ
酸置換は本発明の範囲内である。
は、個々のＥｉｍｅｒｉａ寄生虫又は株の間に自然変異
が存在し得ると理解されよう。これらの変異は全配列中
の１つもしくは複数のアミノ酸の相違によって又は該配
列でのアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加によ
って示され得る。本質的に生物活性も免疫活性も変えな
いアミノ酸置換は、例えばＮｅｕｒａｔｈ等が「Ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載している。関
連するアミノ酸の間のアミノ酸置換、即ち進化中に頻繁
に生じた置換はとりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇ
ｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａ
ｌである（Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ．Ｄ．， Ａｔｌａｓ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅ
ｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．， １９７８， ５巻，補遺３を参照されたい）。
他のアミノ酸置換にはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅ
ｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓ
ｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒ
ｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ
及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、
Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速高感度タンパク
質比較法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４
１，１９８５）及び同種タンパク質間の機能類似性の決
定法を開発した。得られるタンパク質が免疫反応性を保
持している限り、本発明の実施態様のこのようなアミノ
酸置換は本発明の範囲内である。
【００２７】更には、本明細書に特記するタンパク質の
免疫原性断片又はその機能変異体も本発明に包含され
る。
免疫原性断片又はその機能変異体も本発明に包含され
る。
【００２８】本明細書で使用する「断片」という用語
は、本発明の核酸配列又はタンパク質のサブ配列を含む
ＤＮＡ又はアミノ酸配列を指す。この断片は、Ｅｉｍｅ
ｒｉａ抗原の免疫原決定基を１つ以上有するポリペプチ
ドであるか又はこれをコードする。使用可能な免疫原性
ポリペプチド断片の決定方法を以下に記載する。断片は
とりわけ、ＤＮＡの場合は制限エンドヌクレアーゼを、
ポリペプチドの場合はプロテアーゼを用いて前駆体分子
を酵素開裂することによって産生され得る。他の方法に
は、断片の化学合成又はＤＮＡ断片によるポリペプチド
断片の発現が含まれる。
は、本発明の核酸配列又はタンパク質のサブ配列を含む
ＤＮＡ又はアミノ酸配列を指す。この断片は、Ｅｉｍｅ
ｒｉａ抗原の免疫原決定基を１つ以上有するポリペプチ
ドであるか又はこれをコードする。使用可能な免疫原性
ポリペプチド断片の決定方法を以下に記載する。断片は
とりわけ、ＤＮＡの場合は制限エンドヌクレアーゼを、
ポリペプチドの場合はプロテアーゼを用いて前駆体分子
を酵素開裂することによって産生され得る。他の方法に
は、断片の化学合成又はＤＮＡ断片によるポリペプチド
断片の発現が含まれる。
【００２９】エピトープを含む本発明のタンパク質の適
切な免疫原性ポリペプチド断片は、研究中の完全ポリペ
プチドの部分配列と対応する一連の部分重複ペプチドを
合成して、ペプチドと抗体との反応性を調べるいわゆる
ペプスカン法に基づく、特許出願ＷＯ第８６／０６４８
７号、Ｇｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．等のＰｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１， ３９９８−４
００２， １９８４、Ｇｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．等の
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １０２，２５９
−２７４， １９８７に記載の方法によって知見され得
る。
切な免疫原性ポリペプチド断片は、研究中の完全ポリペ
プチドの部分配列と対応する一連の部分重複ペプチドを
合成して、ペプチドと抗体との反応性を調べるいわゆる
ペプスカン法に基づく、特許出願ＷＯ第８６／０６４８
７号、Ｇｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．等のＰｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１， ３９９８−４
００２， １９８４、Ｇｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．等の
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １０２，２５９
−２７４， １９８７に記載の方法によって知見され得
る。
【００３０】更には、ポリペプチドの幾つかの領域及び
上記アミノ酸配列は、未だ不明のエピトープとの構造的
一致や理論的考察に基づき指定されたエピトープであり
得る。これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７
８， ３８２４−３８２８， １９８１）による親水性
基準と、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７， ４５−１４
８， １９８７）による二次構造特徴との組合わせに基
づく。
上記アミノ酸配列は、未だ不明のエピトープとの構造的
一致や理論的考察に基づき指定されたエピトープであり
得る。これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７
８， ３８２４−３８２８， １９８１）による親水性
基準と、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７， ４５−１４
８， １９８７）による二次構造特徴との組合わせに基
づく。
【００３１】必要であり得るＴ細胞エピトープは理論的
な根拠、例えばＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５， １０５９−６２， １９８
７）を用いて誘導され得る。
な根拠、例えばＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５， １０５９−６２， １９８
７）を用いて誘導され得る。
【００３２】本発明では更に、Ｅｉｍｅｒｉａの上記タ
ンパク質をコードする単離精製した核酸配列を提供す
る。これらの核酸配列の一つを配列番号１に示す。遺伝
暗号の縮重によりコドン中の塩基置換が可能であり、そ
の結果尚同一のアミノ酸をコードする他のコドンとする
ことができ、例えばアミノ酸であるグルタミン酸のコド
ンがＧＡＴ及びＧＡＡの両方であることは当業界ではよ
く知られている。従って、配列番号２に示すアミノ酸配
列を有するタンパク質の発現のために、核酸配列が配列
番号１に示す核酸配列とは異なるコドン組成を有し得る
ことは明白である。
ンパク質をコードする単離精製した核酸配列を提供す
る。これらの核酸配列の一つを配列番号１に示す。遺伝
暗号の縮重によりコドン中の塩基置換が可能であり、そ
の結果尚同一のアミノ酸をコードする他のコドンとする
ことができ、例えばアミノ酸であるグルタミン酸のコド
ンがＧＡＴ及びＧＡＡの両方であることは当業界ではよ
く知られている。従って、配列番号２に示すアミノ酸配
列を有するタンパク質の発現のために、核酸配列が配列
番号１に示す核酸配列とは異なるコドン組成を有し得る
ことは明白である。
【００３３】本発明の核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）技術を含む組換えＤＮＡ技術によりＥｉｍ
ｅｒｉａ株から単離して増幅させてもよいし、当業界で
公知の技術によりｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成してもよ
い。
応（ＰＣＲ）技術を含む組換えＤＮＡ技術によりＥｉｍ
ｅｒｉａ株から単離して増幅させてもよいし、当業界で
公知の技術によりｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成してもよ
い。
【００３４】本発明の核酸配列を、該核酸配列と自然界
で元々会合も結合もしていない複製可能な種々のＤＮＡ
配列に連結していわゆる組換えベクターを生成し、これ
を適切な宿主の形質転換に使用することができる。有用
な組換えベクターは好ましくはプラスミド、バクテリオ
ファージ、コスミド又はウイルスに由来する。
で元々会合も結合もしていない複製可能な種々のＤＮＡ
配列に連結していわゆる組換えベクターを生成し、これ
を適切な宿主の形質転換に使用することができる。有用
な組換えベクターは好ましくはプラスミド、バクテリオ
ファージ、コスミド又はウイルスに由来する。
【００３５】本発明の核酸配列をクローニングするため
に使用され得る特定のベクター又はクローニングビヒク
ルは当業界では公知であり、とりわけプラスミドベクタ
ー（例えばｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及び
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド）、バクテリオファー
ジ（例えばλｇｔ−Ｗｅｓ、カロン２８及びＭ１３由来
のファージ）、又はウイルスベクター（例えばＳＶ４
０、アデノウイルスもしくはポリオーマウイルス）が含
まれる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ， Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．
Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編）， Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ
ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ
ｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， １９８８； Ｌｅ
ｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．等， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏ
ｌ．， １１０， １−２４， １９９０も参照された
い）。本発明の組換えベクターの構築に使用すべき方法
は当業者には公知であり、とりわけＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ． 等のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， １９８９に記載されている。
に使用され得る特定のベクター又はクローニングビヒク
ルは当業界では公知であり、とりわけプラスミドベクタ
ー（例えばｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及び
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド）、バクテリオファー
ジ（例えばλｇｔ−Ｗｅｓ、カロン２８及びＭ１３由来
のファージ）、又はウイルスベクター（例えばＳＶ４
０、アデノウイルスもしくはポリオーマウイルス）が含
まれる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ， Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．
Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編）， Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ
ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ
ｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， １９８８； Ｌｅ
ｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．等， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏ
ｌ．， １１０， １−２４， １９９０も参照された
い）。本発明の組換えベクターの構築に使用すべき方法
は当業者には公知であり、とりわけＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ． 等のＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， １９８９に記載されている。
【００３６】例えば、遺伝子及び所望のクローニングビ
ヒクルの両方を相補的ＤＮＡ末端の生成と同じ制限酵素
を用いて切断したときには、本発明の核酸配列のクロー
ニングベクター内への挿入は容易に達成され得る。
ヒクルの両方を相補的ＤＮＡ末端の生成と同じ制限酵素
を用いて切断したときには、本発明の核酸配列のクロー
ニングベクター内への挿入は容易に達成され得る。
【００３７】あるいは、一本鎖ＤＮＡを消化するか又は
適切なＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖末端に充填す
ることにより、ブラント末端内に生成される制限部位を
改変する必要があり得る。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼのような酵素を用いてブラント末端連結を行うことが
できる。
適切なＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖末端に充填す
ることにより、ブラント末端内に生成される制限部位を
改変する必要があり得る。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼのような酵素を用いてブラント末端連結を行うことが
できる。
【００３８】所望とあれば、リンカーをＤＮＡ末端上に
連結して制限部位を生成することができる。このような
リンカーには、制限部位配列をコードする特異的オリゴ
ヌクレオチド配列が含まれ得る。制限酵素で開裂したベ
クターや核酸配列を更にホモポリマーテーリングで改変
してもよい。
連結して制限部位を生成することができる。このような
リンカーには、制限部位配列をコードする特異的オリゴ
ヌクレオチド配列が含まれ得る。制限酵素で開裂したベ
クターや核酸配列を更にホモポリマーテーリングで改変
してもよい。
【００３９】本明細書で使用する「形質転換」とは、使
用する方法の如何を問わず、例えば直接の取り込みであ
れ形質導入であれ、異種核酸配列を宿主細胞内に導入す
ることを指す。異種核酸配列は自律複製で維持してもよ
いし、あるいは宿主ゲノム内に組み込んでもよい。所望
とあれば、組換えベクターに指定の宿主と適合し得る適
切な制御配列を備えてもよい。これらの配列は、挿入さ
れた核酸配列の発現を調節し得る。微生物の他に、多細
胞生物に由来する細胞培養物も宿主として使用され得
る。
用する方法の如何を問わず、例えば直接の取り込みであ
れ形質導入であれ、異種核酸配列を宿主細胞内に導入す
ることを指す。異種核酸配列は自律複製で維持してもよ
いし、あるいは宿主ゲノム内に組み込んでもよい。所望
とあれば、組換えベクターに指定の宿主と適合し得る適
切な制御配列を備えてもよい。これらの配列は、挿入さ
れた核酸配列の発現を調節し得る。微生物の他に、多細
胞生物に由来する細胞培養物も宿主として使用され得
る。
【００４０】本発明の組換えベクターは好ましくは、所
望の形質転換細胞の選択に使用され得るマーカー活性
（例えばｐＢＲ３２２のアンピシリン及びテトラサイク
リン耐性、ｐＵＣ８のアンピシリン耐性やβ−ガラクト
シダーゼのα−ペプチド）を１つ以上含んでいる。
望の形質転換細胞の選択に使用され得るマーカー活性
（例えばｐＢＲ３２２のアンピシリン及びテトラサイク
リン耐性、ｐＵＣ８のアンピシリン耐性やβ−ガラクト
シダーゼのα−ペプチド）を１つ以上含んでいる。
【００４１】適切な宿主細胞は、ポリペプチドをコード
する核酸配列によって又は該核酸配列を含む組換えベク
ターによって形質転換することができ、また所望とあれ
ば該核酸配列によってコードされる上記ポリペプチドを
発現するために使用され得る微生物又は細胞である。宿
主細胞は、原核生物起源（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及
びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のような細菌）か、真核生
物起源［例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのような酵母又は昆虫、植物もしくは哺乳動
物細胞のようなより高等真核生物細胞（ＨｅＬａ細胞及
びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含
む）］であり得る。昆虫細胞には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９細胞系が含まれる
（Ｌｕｃｋｏｗ等， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６， ４７−５５， １９８８）。真核生物クローニン
グ系での本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関
する情報は、Ｅｓｓｅｒ， Ｋ．等のＰｌａｓｍｉｄｓ
ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ， １９８６に記載されている。
する核酸配列によって又は該核酸配列を含む組換えベク
ターによって形質転換することができ、また所望とあれ
ば該核酸配列によってコードされる上記ポリペプチドを
発現するために使用され得る微生物又は細胞である。宿
主細胞は、原核生物起源（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及
びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のような細菌）か、真核生
物起源［例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのような酵母又は昆虫、植物もしくは哺乳動
物細胞のようなより高等真核生物細胞（ＨｅＬａ細胞及
びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含
む）］であり得る。昆虫細胞には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９細胞系が含まれる
（Ｌｕｃｋｏｗ等， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６， ４７−５５， １９８８）。真核生物クローニン
グ系での本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関
する情報は、Ｅｓｓｅｒ， Ｋ．等のＰｌａｓｍｉｄｓ
ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ， １９８６に記載されている。
【００４２】一般に、本発明で有用な組換えベクターの
構築のためには原核生物が好ましい。Ｅ． ｃｏｌｉ
Ｋ１２株が、特にＤＨ５ａ又はＭＣ１０６１株がとりわ
け有用である。
構築のためには原核生物が好ましい。Ｅ． ｃｏｌｉ
Ｋ１２株が、特にＤＨ５ａ又はＭＣ１０６１株がとりわ
け有用である。
【００４３】発現のために本発明の核酸配列が発現ベク
ター内に導入される。即ち、該配列が発現制御配列に作
動可能に結合される。このような制御配列にはプロモー
ター、エンハンサー、オペレーター、インデューサー、
リボソーム結合部位等が含まれ得る。従って、本発明で
は、上記で同定されたＥｉｍｅｒｉａタンパク質をコー
ドする核酸配列が発現制御配列に作動可能に結合されて
おり、形質転換宿主細胞内で中に含まれるＤＮＡ配列を
発現し得る組換えベクターを提供する。
ター内に導入される。即ち、該配列が発現制御配列に作
動可能に結合される。このような制御配列にはプロモー
ター、エンハンサー、オペレーター、インデューサー、
リボソーム結合部位等が含まれ得る。従って、本発明で
は、上記で同定されたＥｉｍｅｒｉａタンパク質をコー
ドする核酸配列が発現制御配列に作動可能に結合されて
おり、形質転換宿主細胞内で中に含まれるＤＮＡ配列を
発現し得る組換えベクターを提供する。
【００４４】勿論、クローニングベクターの選択された
部位に挿入されるヌクレオチド配列は、形質転換宿主が
Ｅｉｍｅｒｉａタンパク質抗原の免疫原決定基を少なく
とも１つ以上有するポリペプチドを生成するのであれ
ば、所望のポリペプチドの実際の構造遺伝子の部分では
ないヌクレオチドを含み得るし、又は所望のタンパク質
の完全構造遺伝子の断片のみを含み得ると理解すべきで
ある。
部位に挿入されるヌクレオチド配列は、形質転換宿主が
Ｅｉｍｅｒｉａタンパク質抗原の免疫原決定基を少なく
とも１つ以上有するポリペプチドを生成するのであれ
ば、所望のポリペプチドの実際の構造遺伝子の部分では
ないヌクレオチドを含み得るし、又は所望のタンパク質
の完全構造遺伝子の断片のみを含み得ると理解すべきで
ある。
【００４５】宿主細胞が細菌の場合、使用され得る有用
な発現制御配列には、Ｔｒｐプロモーター及びオペレー
ター（Ｇｏｅｄｄｅｌ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， ８， ４０５７， １９８０）；ｌａｃプ
ロモータ及びオペレーター（Ｃｈａｎｇ等， Ｎａｔｕ
ｒｅ， ２７５， ６１５， １９７８）；外膜タンパ
ク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ．及びＩｎ
ｏｕｇｅ， Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．， １， ７７１−
７７５， １９８２）；バクテリオファージλプロモー
ター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ， Ｅ．等， Ｎ
ｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１， ４６７７
−４６８８， １９８３）；α−アミラーゼ（Ｂ． ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）プロモータ及びオペレーター、終結配
列並びに選択された宿主細胞と適合し得る他の発現増強
及び制御配列が含まれる。宿主細胞が酵母の場合、有用
な発現制御配列の例には例えばα−交配因子が含まれ
る。昆虫細胞では、バキュロウイルスのポリヒドリン又
はｐ１０プロモーターが使用され得る（Ｓｍｉｔｈ，
Ｇ．Ｅ．等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３，
２１５６−６５， １９８３）。宿主細胞が哺乳動物
源の場合、有用な発現制御配列の例にはＳＶ−４０プロ
モーター（Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ．Ｗ．等，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ， ２２２， ５２４−５２７， １９８３）又はメ
タロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，
Ｒ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９６， ３９−４２，
１９８２）又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌ
ｍｙ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ， ８２， ４９４９−５３， １９８
５）が含まれる。あるいは、Ｅｉｍｅｒｉａ中に存在す
る発現制御配列を適用してもよい。遺伝子発現を最大に
するために、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒの文献（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，
４７３， １９７９）も参照されたい。
な発現制御配列には、Ｔｒｐプロモーター及びオペレー
ター（Ｇｏｅｄｄｅｌ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， ８， ４０５７， １９８０）；ｌａｃプ
ロモータ及びオペレーター（Ｃｈａｎｇ等， Ｎａｔｕ
ｒｅ， ２７５， ６１５， １９７８）；外膜タンパ
ク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ．及びＩｎ
ｏｕｇｅ， Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．， １， ７７１−
７７５， １９８２）；バクテリオファージλプロモー
ター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ， Ｅ．等， Ｎ
ｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１， ４６７７
−４６８８， １９８３）；α−アミラーゼ（Ｂ． ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）プロモータ及びオペレーター、終結配
列並びに選択された宿主細胞と適合し得る他の発現増強
及び制御配列が含まれる。宿主細胞が酵母の場合、有用
な発現制御配列の例には例えばα−交配因子が含まれ
る。昆虫細胞では、バキュロウイルスのポリヒドリン又
はｐ１０プロモーターが使用され得る（Ｓｍｉｔｈ，
Ｇ．Ｅ．等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３，
２１５６−６５， １９８３）。宿主細胞が哺乳動物
源の場合、有用な発現制御配列の例にはＳＶ−４０プロ
モーター（Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ．Ｗ．等，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ， ２２２， ５２４−５２７， １９８３）又はメ
タロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，
Ｒ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９６， ３９−４２，
１９８２）又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌ
ｍｙ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ， ８２， ４９４９−５３， １９８
５）が含まれる。あるいは、Ｅｉｍｅｒｉａ中に存在す
る発現制御配列を適用してもよい。遺伝子発現を最大に
するために、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒの文献（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，
４７３， １９７９）も参照されたい。
【００４６】従って、本発明は更に、上述の核酸配列又
は組換え核酸分子又は組換えベクターを含み、核酸配列
の発現によってＥｉｍｅｒｉａタンパク質を産生し得る
宿主細胞を包含する。
は組換え核酸分子又は組換えベクターを含み、核酸配列
の発現によってＥｉｍｅｒｉａタンパク質を産生し得る
宿主細胞を包含する。
【００４７】Ｅｉｍｅｒｉａ感染に対する家禽の免疫感
作は、免疫学的に適した状況で本発明のタンパク質をい
わゆるサブユニットワクチンとしてトリに投与すること
によって達成され得る。本発明のサブユニットワクチン
は、場合によっては医薬的に許容可能なキャリヤーの存
在下で、純粋形態のタンパク質を含み得る。タンパク質
は場合によって非関連タンパク質と共有結合させること
ができ、これは融合生成物の精製で有利となり得る。例
はβ−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロキモシ
ン、血液凝固因子Ｘａ等である。
作は、免疫学的に適した状況で本発明のタンパク質をい
わゆるサブユニットワクチンとしてトリに投与すること
によって達成され得る。本発明のサブユニットワクチン
は、場合によっては医薬的に許容可能なキャリヤーの存
在下で、純粋形態のタンパク質を含み得る。タンパク質
は場合によって非関連タンパク質と共有結合させること
ができ、これは融合生成物の精製で有利となり得る。例
はβ−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロキモシ
ン、血液凝固因子Ｘａ等である。
【００４８】これらのタンパク質を用いた感染防御免疫
の産生能力が低い場合もある。小さな断片をキャリヤー
分子に接合して、免疫原性を生ずることが好ましい。こ
の目的のための適切なキャリヤーは、高分子［例えば天
然ポリマー（アオガイヘモシアニン、アルブミン、毒素
のようなタンパク質）、ポリアミノ酸（ポリリシン、ポ
リアラニン）のような合成ポリマー、又はサポニンのよ
うな両親媒性化合物のミセル］である。あるいは、これ
らの断片をポリマー、好ましくは線状ポリマーとして提
供してもよい。
の産生能力が低い場合もある。小さな断片をキャリヤー
分子に接合して、免疫原性を生ずることが好ましい。こ
の目的のための適切なキャリヤーは、高分子［例えば天
然ポリマー（アオガイヘモシアニン、アルブミン、毒素
のようなタンパク質）、ポリアミノ酸（ポリリシン、ポ
リアラニン）のような合成ポリマー、又はサポニンのよ
うな両親媒性化合物のミセル］である。あるいは、これ
らの断片をポリマー、好ましくは線状ポリマーとして提
供してもよい。
【００４９】必要とあれば、ワクチンで使用すべき本発
明のタンパク質は、例えばグリコシル化、アシル化、ア
ミド化、カルボキシル化又はリン酸化によりｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ改変することができる。
明のタンパク質は、例えばグリコシル化、アシル化、ア
ミド化、カルボキシル化又はリン酸化によりｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ改変することができる。
【００５０】新たに開発されたワクチン種は、本発明の
タンパク質をコードするＤＮＡが医薬的に許容可能な形
態で、例えば組織内に放つことのできる「弾丸」形態で
投与されるワクチンである。プラスミドで又はＳＶ４０
ウイルス由来のような適切な真核生物プロモーター配列
と組み合わせて提供されるならば、この裸（ｎａｋｅ
ｄ）ＤＮＡをワクチンとして使用することができる。こ
のようにして、このＤＮＡをゲノムＤＮＡ内に導入し
て、抗原をその場で発現させることができる。
タンパク質をコードするＤＮＡが医薬的に許容可能な形
態で、例えば組織内に放つことのできる「弾丸」形態で
投与されるワクチンである。プラスミドで又はＳＶ４０
ウイルス由来のような適切な真核生物プロモーター配列
と組み合わせて提供されるならば、この裸（ｎａｋｅ
ｄ）ＤＮＡをワクチンとして使用することができる。こ
のようにして、このＤＮＡをゲノムＤＮＡ内に導入し
て、抗原をその場で発現させることができる。
【００５１】サブユニットワクチンに代わるものが生ワ
クチンである。本発明の核酸配列は、組換え微生物が尚
複製して、挿入された核酸配列によってコードされるポ
リペプチドを発現でき、感染した宿主トリで免疫応答を
誘発できるように、組換えＤＮＡ技術によって微生物
（例えば細菌又はウイルス）中に導入される。
クチンである。本発明の核酸配列は、組換え微生物が尚
複製して、挿入された核酸配列によってコードされるポ
リペプチドを発現でき、感染した宿主トリで免疫応答を
誘発できるように、組換えＤＮＡ技術によって微生物
（例えば細菌又はウイルス）中に導入される。
【００５２】本発明の好ましい実施態様は、上述の異種
核酸配列を含み、組換えベクターウイルスに感染した宿
主細胞又は宿主トリでＤＮＡ配列を発現し得る組換えベ
クターウイルスである。「異種」という用語は、本発明
の核酸配列が元来ベクターウイルス内に存在しないこと
を示す。
核酸配列を含み、組換えベクターウイルスに感染した宿
主細胞又は宿主トリでＤＮＡ配列を発現し得る組換えベ
クターウイルスである。「異種」という用語は、本発明
の核酸配列が元来ベクターウイルス内に存在しないこと
を示す。
【００５３】その上、本発明は更に、核酸配列の発現に
よってＥｉｍｅｒｉａタンパク質を産生し得る、組換え
ベクターウイルスに感染した宿主細胞又は細胞培養物を
包含する。
よってＥｉｍｅｒｉａタンパク質を産生し得る、組換え
ベクターウイルスに感染した宿主細胞又は細胞培養物を
包含する。
【００５４】例えば、よく知られたｉｎ ｖｉｖｏ相同
組換え技術を使用して、本発明の異種核酸配列をベクタ
ーウイルスのゲノム内に導入することができる。
組換え技術を使用して、本発明の異種核酸配列をベクタ
ーウイルスのゲノム内に導入することができる。
【００５５】まず、ベクターゲノムの挿入領域、即ち感
染又は複製に必要とされるようなベクターの主要機能を
損なわずに異種配列の取り込みに使用され得る領域に対
応するＤＮＡ断片を、標準的なＤＮＡ組換え技術に従っ
てクローニングベクター内に挿入する。挿入領域は多数
の微生物で報告されている（例えばヨーロッパ特許第８
０，８０６号、ヨーロッパ特許第１１０，３８５号、ヨ
ーロッパ特許第８３，２８６号、ヨーロッパ特許第３１
４，５６９号、ＷＯ８８／０２０２２号、ＷＯ８８／０
７０８８号、米国特許第４，７６９，３３０号及び米国
特許第４，７２２，８４８号）。
染又は複製に必要とされるようなベクターの主要機能を
損なわずに異種配列の取り込みに使用され得る領域に対
応するＤＮＡ断片を、標準的なＤＮＡ組換え技術に従っ
てクローニングベクター内に挿入する。挿入領域は多数
の微生物で報告されている（例えばヨーロッパ特許第８
０，８０６号、ヨーロッパ特許第１１０，３８５号、ヨ
ーロッパ特許第８３，２８６号、ヨーロッパ特許第３１
４，５６９号、ＷＯ８８／０２０２２号、ＷＯ８８／０
７０８８号、米国特許第４，７６９，３３０号及び米国
特許第４，７２２，８４８号）。
【００５６】第二に、所望とあれば、第１段階で得られ
た組換えベクター分子内に存在する挿入領域内に欠失を
導入することができる。これは例えば、第１段階の組換
えベクター分子の適切なエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化
又は制限酵素処理によって達成され得る。
た組換えベクター分子内に存在する挿入領域内に欠失を
導入することができる。これは例えば、第１段階の組換
えベクター分子の適切なエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化
又は制限酵素処理によって達成され得る。
【００５７】第三に、異種核酸配列が、第１段階の組換
えベクターに存在する挿入領域内に、即ち該組換えベク
ターから欠失させたＤＮＡの代わりに挿入される。挿入
領域のＤＮＡ配列は、ベクターゲノムとの相同組換えが
生ずるように適切な長さを有するべきである。その後、
適切な細胞に野生型ベクターウイルスを感染させるか、
又は適切なベクターＤＮＡ配列に隣接する挿入領域を含
むために、その対応する領域とベクターゲノムとの間で
組換えを生ずる組換えベクターの存在下において、細胞
をベクターゲノムＤＮＡで形質転換させることができ
る。これで、後代組換えベクターが細胞培養物中に生成
し得、これを例えばハイブリダイゼーション、異種核酸
配列と共に組み込まれた遺伝子によってコードされる酵
素活性の検出、又は組換えベクターによって免疫学的に
発現される抗原性異種ポリペプチドの検出によって、例
えば遺伝子型又は表現型で選択することができる。
えベクターに存在する挿入領域内に、即ち該組換えベク
ターから欠失させたＤＮＡの代わりに挿入される。挿入
領域のＤＮＡ配列は、ベクターゲノムとの相同組換えが
生ずるように適切な長さを有するべきである。その後、
適切な細胞に野生型ベクターウイルスを感染させるか、
又は適切なベクターＤＮＡ配列に隣接する挿入領域を含
むために、その対応する領域とベクターゲノムとの間で
組換えを生ずる組換えベクターの存在下において、細胞
をベクターゲノムＤＮＡで形質転換させることができ
る。これで、後代組換えベクターが細胞培養物中に生成
し得、これを例えばハイブリダイゼーション、異種核酸
配列と共に組み込まれた遺伝子によってコードされる酵
素活性の検出、又は組換えベクターによって免疫学的に
発現される抗原性異種ポリペプチドの検出によって、例
えば遺伝子型又は表現型で選択することができる。
【００５８】次いで、この組換え微生物を免疫感作のた
めに家禽に投与することができる。その後この微生物は
しばらくその状態を維持するか又は被接種動物の体内で
複製し、本発明の挿入された核酸配列によってコードさ
れるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏ発現して被接種動物
の免疫系を刺激する。本発明の核酸配列を組み込むため
の適切なベクターは、ウイルス［例えばワクシニアウイ
ルス（ヨーロッパ特許第１１０，３８５号、ヨーロッパ
特許第８３，２８６号、米国特許第４，７６９，３３０
号及び米国特許第４，７２２，８４８号）もしくは家禽
痘瘡ウイルス（ＷＯ８８／０２０２２号）のような痘瘡
ウイルス、ＨＶＴ（ＷＯ８８／０７０８８号）もしくは
マレック病ウイルスのようなヘルペスウイルス、アデノ
ウイルス又はインフルエンザウイルス］か、細菌（例え
ばＥ． ｃｏｌｉ又は特異Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種）に
由来し得る。この種の組換え微生物では、宿主動物で合
成されるポリペプチドは表面抗原として暴露され得る。
これに関連して、ＯＭＰタンパク質又は例えばＥ． ｃ
ｏｌｉの繊毛タンパク質又は微生物によって認識される
合成シグナル及びアンカー配列とポリペプチドとの融合
が考えられる。所望とあればより大きな全体の一部とし
てのＥｉｍｅｒｉａポリペプチドを免疫感作すべき動物
内に放出することも可能である。これらの場合では全
て、１つ以上の免疫原性産物が発現して、種々の病原体
及び／又は所定の病原体の種々の抗原を防御することも
可能である。
めに家禽に投与することができる。その後この微生物は
しばらくその状態を維持するか又は被接種動物の体内で
複製し、本発明の挿入された核酸配列によってコードさ
れるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏ発現して被接種動物
の免疫系を刺激する。本発明の核酸配列を組み込むため
の適切なベクターは、ウイルス［例えばワクシニアウイ
ルス（ヨーロッパ特許第１１０，３８５号、ヨーロッパ
特許第８３，２８６号、米国特許第４，７６９，３３０
号及び米国特許第４，７２２，８４８号）もしくは家禽
痘瘡ウイルス（ＷＯ８８／０２０２２号）のような痘瘡
ウイルス、ＨＶＴ（ＷＯ８８／０７０８８号）もしくは
マレック病ウイルスのようなヘルペスウイルス、アデノ
ウイルス又はインフルエンザウイルス］か、細菌（例え
ばＥ． ｃｏｌｉ又は特異Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種）に
由来し得る。この種の組換え微生物では、宿主動物で合
成されるポリペプチドは表面抗原として暴露され得る。
これに関連して、ＯＭＰタンパク質又は例えばＥ． ｃ
ｏｌｉの繊毛タンパク質又は微生物によって認識される
合成シグナル及びアンカー配列とポリペプチドとの融合
が考えられる。所望とあればより大きな全体の一部とし
てのＥｉｍｅｒｉａポリペプチドを免疫感作すべき動物
内に放出することも可能である。これらの場合では全
て、１つ以上の免疫原性産物が発現して、種々の病原体
及び／又は所定の病原体の種々の抗原を防御することも
可能である。
【００５９】本発明のベクターワクチンは、組換え細菌
又は本発明の核酸配列を含む組換えベクターに感染した
宿主細胞を培養し、その後組換え細菌もしくはベクター
を含む細胞及び／又は細胞内で増殖した組換えベクター
ウイルスを場合によっては純粋な形態で収集し、場合に
よっては凍結乾燥形態のワクチンとすることにより製造
され得る。
又は本発明の核酸配列を含む組換えベクターに感染した
宿主細胞を培養し、その後組換え細菌もしくはベクター
を含む細胞及び／又は細胞内で増殖した組換えベクター
ウイルスを場合によっては純粋な形態で収集し、場合に
よっては凍結乾燥形態のワクチンとすることにより製造
され得る。
【００６０】本発明の組換えベクターで形質転換した宿
主細胞は、前記核酸配列によってコードされるポリペプ
チドの発現に好ましい条件下で培養することもできる。
ワクチンは、未精製培養物の試料、細胞溶解物又は宿主
細胞抽出物を用いて製造することができるが、他の実施
態様では、用途によってより精製された本発明のポリペ
プチドからワクチンが生成される。生成したポリペプチ
ドを精製するために、本発明の組換えベクターで形質転
換した宿主細胞を適量で培養し、生成したポリペプチド
を上記細胞から又はタンパク質が分泌される場合は培地
から単離する。培地中に分泌されたポリペプチドは、標
準的な技術（例えば塩分画、遠心分離、限外濾過、クロ
マトグラフィー、ゲル濾過又は免疫親和性クロマトグラ
フィー）によって単離精製することができるが、細胞内
ポリペプチドは、まず細胞を収集し、この細胞を例えば
超音波処理又はフレンチプレスのような機械的破砕手段
によって破砕し、次いでポリペプチドを他の細胞内成分
と分離することによって単離することができ、そしてポ
リペプチドからワクチンを生成する。細胞破砕は化学的
（例えばＥＤＴＡもしくはトリトンＸ１１４のような洗
剤）又はリゾチーム消化のような酵素手段でも達成され
得る。
主細胞は、前記核酸配列によってコードされるポリペプ
チドの発現に好ましい条件下で培養することもできる。
ワクチンは、未精製培養物の試料、細胞溶解物又は宿主
細胞抽出物を用いて製造することができるが、他の実施
態様では、用途によってより精製された本発明のポリペ
プチドからワクチンが生成される。生成したポリペプチ
ドを精製するために、本発明の組換えベクターで形質転
換した宿主細胞を適量で培養し、生成したポリペプチド
を上記細胞から又はタンパク質が分泌される場合は培地
から単離する。培地中に分泌されたポリペプチドは、標
準的な技術（例えば塩分画、遠心分離、限外濾過、クロ
マトグラフィー、ゲル濾過又は免疫親和性クロマトグラ
フィー）によって単離精製することができるが、細胞内
ポリペプチドは、まず細胞を収集し、この細胞を例えば
超音波処理又はフレンチプレスのような機械的破砕手段
によって破砕し、次いでポリペプチドを他の細胞内成分
と分離することによって単離することができ、そしてポ
リペプチドからワクチンを生成する。細胞破砕は化学的
（例えばＥＤＴＡもしくはトリトンＸ１１４のような洗
剤）又はリゾチーム消化のような酵素手段でも達成され
得る。
【００６１】本発明のポリペプチドに対する抗体又は抗
血清は、受動免疫療法、診断イムノアッセイ及び抗イデ
ィオタイプ抗体の生成で使用可能である。
血清は、受動免疫療法、診断イムノアッセイ及び抗イデ
ィオタイプ抗体の生成で使用可能である。
【００６２】上記で特性分析したＥｉｍｅｒｉａタンパ
ク質を使用して、ポリクローナル、モノ特異的、及びモ
ノクローナルな抗体を産生することができる。ポリクロ
ーナル抗体が所望される場合、ポリクローナル血清の産
生処理技術は当業界で公知である（例えばＭａｙｅｒ及
びＷａｌｔｅｒ．（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）。免疫原に
対するモノ特異的抗体は、Ｈａｌｌ等の方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ， ３１１， ３７９−３８７， １９８４）の変
形によってポリ特異的抗血清から親和性精製することが
できる。本明細書で使用するモノ特異的抗体とは、関連
抗原との均一結合特性を有する単一抗体種又は多重抗体
種であると定義する。本明細書で使用する均一結合と
は、抗体種が特異的な抗原又はエピトープに結合する能
力を指す。
ク質を使用して、ポリクローナル、モノ特異的、及びモ
ノクローナルな抗体を産生することができる。ポリクロ
ーナル抗体が所望される場合、ポリクローナル血清の産
生処理技術は当業界で公知である（例えばＭａｙｅｒ及
びＷａｌｔｅｒ．（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）。免疫原に
対するモノ特異的抗体は、Ｈａｌｌ等の方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ， ３１１， ３７９−３８７， １９８４）の変
形によってポリ特異的抗血清から親和性精製することが
できる。本明細書で使用するモノ特異的抗体とは、関連
抗原との均一結合特性を有する単一抗体種又は多重抗体
種であると定義する。本明細書で使用する均一結合と
は、抗体種が特異的な抗原又はエピトープに結合する能
力を指す。
【００６３】本発明のＥｉｍｅｒｉａタンパク質に反応
性のモノクローナル抗体は、当業界で公知の技術（Ｋｏ
ｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２
５６， ４９５−４９７， １９７５）により近交マウ
スを免疫感作することにより産生され得る。ハイブリド
ーマ細胞は、ダルベッッコ改良イーグル培地のような適
切な細胞培地中ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプ
テリン中での増殖によって選択される。好ましくはＭａ
ｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天技術（Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ， Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，
（編）， Ａｃｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２７６，
１９７３）を用いて、抗体を産生するハイブリドーマを
クローニングする。適切な培地内の培養プレートの個々
のウェルに離散したコロニーを移す。適切な免疫原でス
クリーニングして、抗体産生細胞を同定する。免疫陽性
ハイブリドーマ細胞を当業界で公知の技術により維持す
る。特異的抗モノクローナル抗体は、ハイブリドーマを
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養するか又は当業界で公知の手順に
よりハイブリドーマを注射した後にマウスで腹水を調製
することにより産生される。
性のモノクローナル抗体は、当業界で公知の技術（Ｋｏ
ｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２
５６， ４９５−４９７， １９７５）により近交マウ
スを免疫感作することにより産生され得る。ハイブリド
ーマ細胞は、ダルベッッコ改良イーグル培地のような適
切な細胞培地中ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプ
テリン中での増殖によって選択される。好ましくはＭａ
ｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天技術（Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ， Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，
（編）， Ａｃｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２７６，
１９７３）を用いて、抗体を産生するハイブリドーマを
クローニングする。適切な培地内の培養プレートの個々
のウェルに離散したコロニーを移す。適切な免疫原でス
クリーニングして、抗体産生細胞を同定する。免疫陽性
ハイブリドーマ細胞を当業界で公知の技術により維持す
る。特異的抗モノクローナル抗体は、ハイブリドーマを
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養するか又は当業界で公知の手順に
よりハイブリドーマを注射した後にマウスで腹水を調製
することにより産生される。
【００６４】抗イディオタイプ抗体は、予防することが
望ましい病原体の抗原の「内部像」を保有する免疫グロ
ブリンであり、ワクチンでは免疫原として使用され得る
（Ｄｒｅｅｓｍａｎ等， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉ
ｓｅａｓｅ， １５１， ７６１， １９８５）。抗イ
ディオタイプ抗体の産生技術は当業界では公知である
（ＭａｃＮａｍａｒａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２
６， １３２５， １９８４）。
望ましい病原体の抗原の「内部像」を保有する免疫グロ
ブリンであり、ワクチンでは免疫原として使用され得る
（Ｄｒｅｅｓｍａｎ等， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉ
ｓｅａｓｅ， １５１， ７６１， １９８５）。抗イ
ディオタイプ抗体の産生技術は当業界では公知である
（ＭａｃＮａｍａｒａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２
６， １３２５， １９８４）。
【００６５】本発明のワクチンは、従来の能動免疫計画
で投与することができ、即ち製剤と適合し得るような方
法で、予防に効果的なような量、即ち抗原又は抗原を発
現し得る組換え微生物を免疫感作すると、家禽でビルレ
ントＥｉｍｅｒｉａ寄生虫の攻撃に対する免疫が生ずる
量を１回又は繰り返し投与する。免疫とは、ワクチン接
種後のニワトリ集団で、ワクチン接種していないグルー
プに比べて、有意なレベルの防御が生じることと定義す
る。
で投与することができ、即ち製剤と適合し得るような方
法で、予防に効果的なような量、即ち抗原又は抗原を発
現し得る組換え微生物を免疫感作すると、家禽でビルレ
ントＥｉｍｅｒｉａ寄生虫の攻撃に対する免疫が生ずる
量を１回又は繰り返し投与する。免疫とは、ワクチン接
種後のニワトリ集団で、ワクチン接種していないグルー
プに比べて、有意なレベルの防御が生じることと定義す
る。
【００６６】本発明のポリペプチドを含むワクチンで
は、防御が増すこと以外に、被感染動物から排出される
オーシストの数も減少する。排出されたオーシストは群
れの中の他の動物に感染する。排出されるオーシストの
数が減少すれば、その後感染する動物の数も減り、更に
は感染負荷（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｌｏａｄ）も低下す
る。
は、防御が増すこと以外に、被感染動物から排出される
オーシストの数も減少する。排出されたオーシストは群
れの中の他の動物に感染する。排出されるオーシストの
数が減少すれば、その後感染する動物の数も減り、更に
は感染負荷（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｌｏａｄ）も低下す
る。
【００６７】更には、ワクチンは寄生虫自体に作用せず
とも、疾病頻度を下げ得る。これは、疾病症状が寄生虫
によって放出された物質によって引き起こされる場合に
とりわけそうである。このような物質に対するワクチン
は、寄生虫を攻撃せずに症状を緩和させる。
とも、疾病頻度を下げ得る。これは、疾病症状が寄生虫
によって放出された物質によって引き起こされる場合に
とりわけそうである。このような物質に対するワクチン
は、寄生虫を攻撃せずに症状を緩和させる。
【００６８】生ウイルスベクターワクチンでは、ニワト
リ１羽当たりの投与量は１０5−１０8ｐｆｕであり得
る。本発明の通常のサブユニットワクチンは、本発明の
タンパク質を１μｇ〜１ｍｇ含んでいる。このようなワ
クチンは皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口又
は鼻腔内に投与することができる。
リ１羽当たりの投与量は１０5−１０8ｐｆｕであり得
る。本発明の通常のサブユニットワクチンは、本発明の
タンパク質を１μｇ〜１ｍｇ含んでいる。このようなワ
クチンは皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口又
は鼻腔内に投与することができる。
【００６９】その上、ワクチンは更に水性媒質又は含水
懸濁液を、活性及び／又は貯蔵寿命を増すためにしばし
ば他の成分と混合して含み得る。これらの成分は塩、ｐ
Ｈ緩衝液、安定剤（例えばスキムミルク又はカゼイン水
解物）、乳化剤、免疫応答を改善するためのアジュバン
ト（例えば油、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウ
ム、サポニン、ポリアニオン及び両性物質）並びに防腐
剤であり得る。
懸濁液を、活性及び／又は貯蔵寿命を増すためにしばし
ば他の成分と混合して含み得る。これらの成分は塩、ｐ
Ｈ緩衝液、安定剤（例えばスキムミルク又はカゼイン水
解物）、乳化剤、免疫応答を改善するためのアジュバン
ト（例えば油、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウ
ム、サポニン、ポリアニオン及び両性物質）並びに防腐
剤であり得る。
【００７０】本発明のポリペプチドを含むワクチンは更
に、Ｅ． ｍａｘｉｍａの他の免疫原性タンパク質又は
他のＥｍｅｒｉａ種の免疫原性タンパク質を含み得る。
このような組み合わせワクチンは、家禽の群れで寄生虫
負荷（ｐａｒａｓｉｔｉｃｌｏａｄ）を低下させ、コク
シジウム症の予防レベルを高める。
に、Ｅ． ｍａｘｉｍａの他の免疫原性タンパク質又は
他のＥｍｅｒｉａ種の免疫原性タンパク質を含み得る。
このような組み合わせワクチンは、家禽の群れで寄生虫
負荷（ｐａｒａｓｉｔｉｃｌｏａｄ）を低下させ、コク
シジウム症の予防レベルを高める。
【００７１】本発明のワクチンが更に、多価ワクチン製
造のために、家禽の他の病原体に関連する免疫原（例え
ばマレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウ
イルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢ
Ｖ）、ニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）、レオウイルス、ト
リレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョ
ウ鼻気管炎ウイルス又は大腸菌の抗原）を含み得るか又
はこれらの免疫原をコードする核酸配列を含み得ること
は明白である。
造のために、家禽の他の病原体に関連する免疫原（例え
ばマレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウ
イルス（ＮＤＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢ
Ｖ）、ニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）、レオウイルス、ト
リレトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョ
ウ鼻気管炎ウイルス又は大腸菌の抗原）を含み得るか又
はこれらの免疫原をコードする核酸配列を含み得ること
は明白である。
【００７２】
【実施例】本発明を以下の実施例により説明する。
【００７３】実施例１ 寄生虫の取り扱い Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ（Ｈｏｕｇｈｔ
ｏｎ株）及びＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ（Ｗｅｙ
ｂｒｉｄｇｅ株）寄生虫を、コクシジウムの不在下に飼
育したニワトリに意図的に感染させた後で回収した。感
染後（ｐ．ｉ．）４日目及び５日目に、Ｅ．ａｃｅｒｖ
ｕｌｉｎａオーシストを糞便物質から分離した。 ｐ．
ｉ．７日目にＥ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストを盲腸から
収穫した。
ｏｎ株）及びＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ（Ｗｅｙ
ｂｒｉｄｇｅ株）寄生虫を、コクシジウムの不在下に飼
育したニワトリに意図的に感染させた後で回収した。感
染後（ｐ．ｉ．）４日目及び５日目に、Ｅ．ａｃｅｒｖ
ｕｌｉｎａオーシストを糞便物質から分離した。 ｐ．
ｉ．７日目にＥ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストを盲腸から
収穫した。
【００７４】オーシストを３０℃で７時間強曝気してス
ポロゾイト形成し、部分的にスポロゾイト形成されたオ
ーシストを得た。初期にＡ．Ｎ．Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ
ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ １１０，（１９９３），２２３−２３０に記
載のようにして、４８時間スポロゾイト形成したオーシ
ストからスポロシスト及びスポロゾイトを放出させた。
ポロゾイト形成し、部分的にスポロゾイト形成されたオ
ーシストを得た。初期にＡ．Ｎ．Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ
ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ １１０，（１９９３），２２３−２３０に記
載のようにして、４８時間スポロゾイト形成したオーシ
ストからスポロシスト及びスポロゾイトを放出させた。
【００７５】細胞内期のＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａを得
るために、５週齢のニワトリに、１０8スポロゾイト形
成Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストを感染させた。
４２時間後に十二指腸から細胞内寄生虫を収穫した。そ
のために、接種後４２時間ニワトリから放血させ、胃と
メッケル憩室の間で十二指腸を取り出した。組織を洗浄
し、約１ｃｍ3の小片に切断した。該小片を、１０ｍｇ
／ｍｌのグルコースを含むカルシウム／マグネシウム非
含有ハンクスＢＳＳ（ＣＭＦ−ハンクス液）に懸濁し
た。ＥＤＴＡ（３５〜３７℃のＣＭＦハンクス液中の２
ｍＭ ＥＤＴＡ）中で１０分間インキュベートして上皮
細胞を基質から放出させた。４回のインキュベーション
の上清をプールし、７５０ｇで１０分間遠心して細胞を
ペレット化した。次いで、細胞内寄生虫（栄養体も存在
したが、以後「シゾント」と称す）をサポニン溶解（Ｃ
ＭＦ−ハンクス液中の０．１％サポニン中、室温で１５
分）及び機械的剪断により宿主細胞から放出させた。
るために、５週齢のニワトリに、１０8スポロゾイト形
成Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストを感染させた。
４２時間後に十二指腸から細胞内寄生虫を収穫した。そ
のために、接種後４２時間ニワトリから放血させ、胃と
メッケル憩室の間で十二指腸を取り出した。組織を洗浄
し、約１ｃｍ3の小片に切断した。該小片を、１０ｍｇ
／ｍｌのグルコースを含むカルシウム／マグネシウム非
含有ハンクスＢＳＳ（ＣＭＦ−ハンクス液）に懸濁し
た。ＥＤＴＡ（３５〜３７℃のＣＭＦハンクス液中の２
ｍＭ ＥＤＴＡ）中で１０分間インキュベートして上皮
細胞を基質から放出させた。４回のインキュベーション
の上清をプールし、７５０ｇで１０分間遠心して細胞を
ペレット化した。次いで、細胞内寄生虫（栄養体も存在
したが、以後「シゾント」と称す）をサポニン溶解（Ｃ
ＭＦ−ハンクス液中の０．１％サポニン中、室温で１５
分）及び機械的剪断により宿主細胞から放出させた。
【００７６】シゾントをペレット化し、４５％Ｐｅｒｃ
ｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）を介して遠心（２０分、７００ｇ、４℃）した
後、宿主物質から分離した。シゾントの乾燥ペレットを
後で使用するまで−７０℃で貯蔵した。
ｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）を介して遠心（２０分、７００ｇ、４℃）した
後、宿主物質から分離した。シゾントの乾燥ペレットを
後で使用するまで−７０℃で貯蔵した。
【００７７】トリトンＸ１１４抽出 トリトンＸ１１４抽出を行ってシゾントの親水性タンパ
ク質画分を得た。手順は、初期にＣ．Ｂｏｒｄｉｅｒ
（１９８１）によりＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５６巻、第４号
（２月）１６０４−１６０７ページに記載のものを使用
した。
ク質画分を得た。手順は、初期にＣ．Ｂｏｒｄｉｅｒ
（１９８１）によりＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５６巻、第４号
（２月）１６０４−１６０７ページに記載のものを使用
した。
【００７８】ＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１
５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１ｍｌ当たり１０8
〜１０9のＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａシゾントを、ミク
ロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）（Ｂｒａｎｓｏｎ 音波
処理装置、ポジション ７）を用いて氷上で±３×２０
秒間音波処理した。ＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）及び
ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ（最終濃度：共に０．０２ｍｇ
／ｍｌ）を加えた（ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼストック：
５ｍＭのＭｇＣｌ2中２ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ、２ｍ
ｇ／ｍｌのＲＮアーゼ）。
５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１ｍｌ当たり１０8
〜１０9のＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａシゾントを、ミク
ロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）（Ｂｒａｎｓｏｎ 音波
処理装置、ポジション ７）を用いて氷上で±３×２０
秒間音波処理した。ＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）及び
ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ（最終濃度：共に０．０２ｍｇ
／ｍｌ）を加えた（ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼストック：
５ｍＭのＭｇＣｌ2中２ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ、２ｍ
ｇ／ｍｌのＲＮアーゼ）。
【００７９】懸濁液中の音波処理シゾントに、予備縮合
したトリトンＸ１１４を、最終濃度１０％（ｖ／ｖ）で
加え、十分に混合してタンパク質を溶解した。抽出不能
な物質を４℃で２０分間１２，０００ｇで遠心してペレ
ット化した。可溶画分をスクロースクッション〔ＴＢＳ
中６％スクロース、０．０６％（ｖ．ｖ）ＴＸ１１４〕
上に重層し、４０℃で１０分間インキュベートし、室温
で１０分間４００ｇでスピンした。親水性画分を再び同
一手順で抽出した。
したトリトンＸ１１４を、最終濃度１０％（ｖ／ｖ）で
加え、十分に混合してタンパク質を溶解した。抽出不能
な物質を４℃で２０分間１２，０００ｇで遠心してペレ
ット化した。可溶画分をスクロースクッション〔ＴＢＳ
中６％スクロース、０．０６％（ｖ．ｖ）ＴＸ１１４〕
上に重層し、４０℃で１０分間インキュベートし、室温
で１０分間４００ｇでスピンした。親水性画分を再び同
一手順で抽出した。
【００８０】親水性画分を後で使用するまで−７０℃で
貯蔵した。ＢＣＡ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）
アッセイを用いて総タンパク質濃度を測定した。
貯蔵した。ＢＣＡ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）
アッセイを用いて総タンパク質濃度を測定した。
【００８１】Ｐｒｅｐ−ｃｅｌｌ分画 親水性タンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝系中、還元条
件下に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてその相対分子量に関
してさらに分離した。そのために、いわゆるＰｒｅｐｃ
ｅｌｌにおける分離用電気泳動を用いた。
件下に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてその相対分子量に関
してさらに分離した。そのために、いわゆるＰｒｅｐｃ
ｅｌｌにおける分離用電気泳動を用いた。
【００８２】材料： Ｐｒｅｐｃｅｌｌカラム（３７ｍｍ ＩＤ）を備えたＰ
ｒｅｐｃｅｌｌ装置（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｓ） Ｐｒｅｐｃｅｌｌ用透析膜（カットオフ ６ｋＤ） パワーサプライ（ＥＰＳ ６００ Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 還元性試料緩衝液：６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ６．８；１０％グリセロール；２％ＳＤＳ；０．０
１％ブロモフェノールブルー（Ｍｅｒｃｋ）；０．１３
Ｍ ＤＴＴ（ジチオトレイトール、Ｍｅｒｃｋ） 電気泳動緩衝液／溶離緩衝液：２５ｍＭのＴｒｉｓ、１
９２ｍＭのグリシン、０．１％ＳＤＳ ｐＨ８．６ 方法及び結果：全ての手順を４℃で実施した。親水性タ
ンパク質の分画には、製造業者のプロトコルに従い、但
し０．１％のＳＤＳを加え、Ｐｒｅｐｃｅｌｌの３７ｍ
ｍ管（６ｃｍまで充填）中、４％のスタッキングゲル／
９％の分離ゲル（ポリアクリルアミド）を用いた。
ｒｅｐｃｅｌｌ装置（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｓ） Ｐｒｅｐｃｅｌｌ用透析膜（カットオフ ６ｋＤ） パワーサプライ（ＥＰＳ ６００ Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 還元性試料緩衝液：６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ６．８；１０％グリセロール；２％ＳＤＳ；０．０
１％ブロモフェノールブルー（Ｍｅｒｃｋ）；０．１３
Ｍ ＤＴＴ（ジチオトレイトール、Ｍｅｒｃｋ） 電気泳動緩衝液／溶離緩衝液：２５ｍＭのＴｒｉｓ、１
９２ｍＭのグリシン、０．１％ＳＤＳ ｐＨ８．６ 方法及び結果：全ての手順を４℃で実施した。親水性タ
ンパク質の分画には、製造業者のプロトコルに従い、但
し０．１％のＳＤＳを加え、Ｐｒｅｐｃｅｌｌの３７ｍ
ｍ管（６ｃｍまで充填）中、４％のスタッキングゲル／
９％の分離ゲル（ポリアクリルアミド）を用いた。
【００８３】−７０℃で保存しておいたＴＸ１１４抽出
物の親水性相を解凍し、親水性タンパク質（ラン１回当
たり約８ｍｇ）を還元性試料緩衝液（総容量は±６ｍｌ
であった）に希釈し、３分間１００℃で沸騰させ、注射
器に取り付けた細口管を用いて４％スタッキングゲル表
面に装填した。
物の親水性相を解凍し、親水性タンパク質（ラン１回当
たり約８ｍｇ）を還元性試料緩衝液（総容量は±６ｍｌ
であった）に希釈し、３分間１００℃で沸騰させ、注射
器に取り付けた細口管を用いて４％スタッキングゲル表
面に装填した。
【００８４】Ｐｒｅｐｃｅｌｌをパワーサプライに接続
し、最大４０ｍＡ、５００Ｖで電気泳動を開始した。
し、最大４０ｍＡ、５００Ｖで電気泳動を開始した。
【００８５】約６時間後、トラッキング染料がセルから
溶出したときに、画分（画分容量±２．５〜３ｍｌ；流
量０．６ｍｌ／分）の回収を開始した。３．５ｍｌのプ
ラスチックチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中で画分を一
晩回収した（±１００画分）。
溶出したときに、画分（画分容量±２．５〜３ｍｌ；流
量０．６ｍｌ／分）の回収を開始した。３．５ｍｌのプ
ラスチックチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中で画分を一
晩回収した（±１００画分）。
【００８６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターンブロッ
ト法による分析のために、画分試料を採取した。画分を
−７０℃で貯蔵した。
ト法による分析のために、画分試料を採取した。画分を
−７０℃で貯蔵した。
【００８７】この精製法により、以下に示す分析物か
ら、以下のようなほぼ純粋なタンパク質を含む画分を得
た。
ら、以下のようなほぼ純粋なタンパク質を含む画分を得
た。
【００８８】アミノ酸配列 Ｍｒ＝約３７ｋのほぼ純粋なバンド（ＥＡＳＣ２と称
す）を含むＰｒｅｐｃｅｌｌｒｕｎ ＣＯＣ９３１４６
１２の選択された画分をプールし、アセトン沈殿させて
濃縮し、１２％ＰＡＡゲル上をランさせた。ゲルは間も
なく非変性クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染
色プロトコル（染色：２０％メタノール／０．５％酢酸
中の０．２％ＣＢＢ中、周囲温度で２０分；脱色：３０
％メタノール中６０分）により染色された。
す）を含むＰｒｅｐｃｅｌｌｒｕｎ ＣＯＣ９３１４６
１２の選択された画分をプールし、アセトン沈殿させて
濃縮し、１２％ＰＡＡゲル上をランさせた。ゲルは間も
なく非変性クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染
色プロトコル（染色：２０％メタノール／０．５％酢酸
中の０．２％ＣＢＢ中、周囲温度で２０分；脱色：３０
％メタノール中６０分）により染色された。
【００８９】染色された３７ｋＤバンドを切り出した。
ＥＡＳＣ２トリプシン消化産物の選択されたＨＰＬＣ精
製ペプチドの内部アミノ酸配列を決定した（全て、Ｅｕ
ｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、 Ｔ
ｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより実施した）。
ＥＡＳＣ２トリプシン消化産物の選択されたＨＰＬＣ精
製ペプチドの内部アミノ酸配列を決定した（全て、Ｅｕ
ｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、 Ｔ
ｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより実施した）。
【００９０】トリプシンペプチドのアミノ酸配列は、Ｇ
ＷＩＫＱＥＥＶＤＤＩＶＱＫ（配列番号：２ アミノ酸
２１２−２２５参照）であった。
ＷＩＫＱＥＥＶＤＤＩＶＱＫ（配列番号：２ アミノ酸
２１２−２２５参照）であった。
【００９１】このペプチドのこのコード配列はクローン
のＤＮＡ配列を決定した後でも検出された。
のＤＮＡ配列を決定した後でも検出された。
【００９２】実施例２ ウサギでのモノ特異的抗体の調製 予め予防接種したＳＰＦウサギの血清を、ウエスターン
ブロットした種々の発育期のＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
抗原及びＥ．ｃｏｌｉタンパク質のブロット上でスクリ
ーニングした。抗体を産生させるために「陰性」のウサ
ギを選択した。
ブロットした種々の発育期のＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
抗原及びＥ．ｃｏｌｉタンパク質のブロット上でスクリ
ーニングした。抗体を産生させるために「陰性」のウサ
ギを選択した。
【００９３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＥＡＳＣ２（３
７ｋＤ）を含むＰｒｅｐｃｅｌｌｒｕｎ画分を選択し
て、プールし、Ａｍｉｃｏｎｃｅｌｌ（ＹＭ１０フィル
ター）を用いて３．５ｍｌに濃縮した（±３×）。
７ｋＤ）を含むＰｒｅｐｃｅｌｌｒｕｎ画分を選択し
て、プールし、Ａｍｉｃｏｎｃｅｌｌ（ＹＭ１０フィル
ター）を用いて３．５ｍｌに濃縮した（±３×）。
【００９４】４週間隔で、ウサギを、ＧＮＥ（８×０．
２５ｍｌ ｉ．ｃ．、１ｍｌ ｉ．ｐ．）中の濃縮抗原で
２回免疫感作した。２回目の免疫感作後２週間してか
ら、ウサギを出血させ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕ
ｌｉｎａ ｅｎ ｔｅｎｅｌｌｌａスポロゾイト及び４２
時間シゾントについてウエスターンブロット法で血清を
テストした。図１は、両種のスポロゾイト抗原に対する
モノ特異的抗血清の免疫検出結果を示している。抗体
は、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ（レーンＡ１）及びＥ．
ｔｅｎｅｌｌａ（レーンＢ１）のいずれにおいても約３
７ｋＤの寄生虫産物を認識したことが判明した。免疫感
作する前の同一ウサギの対照血清は、これらのバンド
（レーンＡ／Ｂ２）を認識しなかった。タンパク質は、
該２種のシゾント期にも存在する（図示せず）。
２５ｍｌ ｉ．ｃ．、１ｍｌ ｉ．ｐ．）中の濃縮抗原で
２回免疫感作した。２回目の免疫感作後２週間してか
ら、ウサギを出血させ、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕ
ｌｉｎａ ｅｎ ｔｅｎｅｌｌｌａスポロゾイト及び４２
時間シゾントについてウエスターンブロット法で血清を
テストした。図１は、両種のスポロゾイト抗原に対する
モノ特異的抗血清の免疫検出結果を示している。抗体
は、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ（レーンＡ１）及びＥ．
ｔｅｎｅｌｌａ（レーンＢ１）のいずれにおいても約３
７ｋＤの寄生虫産物を認識したことが判明した。免疫感
作する前の同一ウサギの対照血清は、これらのバンド
（レーンＡ／Ｂ２）を認識しなかった。タンパク質は、
該２種のシゾント期にも存在する（図示せず）。
【００９５】実施例３ Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ ＴＸ１１４親水性画分及び
ＥＡＳＣ２によるニワトリの予防接種 シゾント物質のＴＸ１１４親水性相を分離し、４℃で
０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．３）に対して十分に透析
した。
ＥＡＳＣ２によるニワトリの予防接種 シゾント物質のＴＸ１１４親水性相を分離し、４℃で
０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．３）に対して十分に透析
した。
【００９６】ＥＡＳＣ２ ３７ｋＤタンパク質を含む選
択された画分を４℃で３×５リットルの０．０１Ｍ Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．３）に対して十分に透析した。
択された画分を４℃で３×５リットルの０．０１Ｍ Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．３）に対して十分に透析した。
【００９７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に種々の濃度の試料を
ＣＢＢで染色し、染色強度とＢＳＡの基準試料とを比較
して、ワクチン調製物中のタンパク質の濃度を評価し
た。
ＣＢＢで染色し、染色強度とＢＳＡの基準試料とを比較
して、ワクチン調製物中のタンパク質の濃度を評価し
た。
【００９８】容量を較正して、精製タンパク質について
は±５μｇのタンパク質／用量、及び親水性画分全体に
ついては約１５μｇ／用量を得た。
は±５μｇのタンパク質／用量、及び親水性画分全体に
ついては約１５μｇ／用量を得た。
【００９９】これらを初回抗原刺激及び追加免疫予防接
種用のアリコート量として−７０℃で貯蔵した。冷凍ワ
クチン調製物を解凍した。
種用のアリコート量として−７０℃で貯蔵した。冷凍ワ
クチン調製物を解凍した。
【０１００】各１５ｍｌのワクチンに、アジュバントと
して、１ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）量中
３．２ｍｇのＱｕｉｌ Ａ Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓ
ｅｃｔｏｒを加えた。
して、１ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）量中
３．２ｍｇのＱｕｉｌ Ａ Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓ
ｅｃｔｏｒを加えた。
【０１０１】ワクチンをぐるぐるかきまわして十分に混
合し、０．７５ｍｌを、４〜６週齢のコクシジウムのい
ない白色レグホンニワトリに皮下注射した。
合し、０．７５ｍｌを、４〜６週齢のコクシジウムのい
ない白色レグホンニワトリに皮下注射した。
【０１０２】ワクチンは、１５０μｇのＱｕｉｌ Ａ／
用量を含んでいた。
用量を含んでいた。
【０１０３】図２は、 ワクチンとしてニワトリに注射
したＥＡＳＣ２（レーン１）及び４２時間ＴＸ１１４親
水性画分（レーン２）のクーマシーＢＢ染色ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを示している。
したＥＡＳＣ２（レーン１）及び４２時間ＴＸ１１４親
水性画分（レーン２）のクーマシーＢＢ染色ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを示している。
【０１０４】初回抗原刺激の４週間後に、ニワトリを同
一用量を用いて同一経路により追加免疫した。追加免疫
ワクチンは、冷凍抗原ストックから新たに調製した。
一用量を用いて同一経路により追加免疫した。追加免疫
ワクチンは、冷凍抗原ストックから新たに調製した。
【０１０５】対照ニワトリに、ＰＢＳ中１５０μｇのＱ
ｕｉｌ Ａ／用量を接種した。各グループは１４羽のニ
ワトリから構成した。
ｕｉｌ Ａ／用量を接種した。各グループは１４羽のニ
ワトリから構成した。
【０１０６】追加免疫予防接種の１１日後に、全てのニ
ワトリに、水中１５％スクロース１ｍｌ中の２４０のＥ
ｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ Ｈスポロゾイト形
成オーシストを経口接種した。
ワトリに、水中１５％スクロース１ｍｌ中の２４０のＥ
ｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ Ｈスポロゾイト形
成オーシストを経口接種した。
【０１０７】ニワトリを１ケージ当たり２羽ずつ入れ
た。チャレンジ後の４〜８日間に採取した糞便試料中で
オーシスト排出数を評価した。
た。チャレンジ後の４〜８日間に採取した糞便試料中で
オーシスト排出数を評価した。
【０１０８】表２は、この実験の結果を示している。オ
ーシスト排出数は、対照動物の排出数に基づくオーシス
ト％として表す。
ーシスト排出数は、対照動物の排出数に基づくオーシス
ト％として表す。
【０１０９】データ分布が正常でない場合には、スチュ
ーデントのＴテスト又はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのテ
ストを用いてオーシスト数のＬＯＧに基づいてデータの
統計的評価を行った。
ーデントのＴテスト又はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのテ
ストを用いてオーシスト数のＬＯＧに基づいてデータの
統計的評価を行った。
【０１１０】ｐ＜０．０５であれば、差は有意であると
見なした。
見なした。
【０１１１】この表は、ＴＸ１１４画分もＥＡＳＣ２
Ｐｒｅｐｃｅｌｌ精製画分も、チャレンジ後のオーシス
ト排出数において統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）
を誘発することを示している。
Ｐｒｅｐｃｅｌｌ精製画分も、チャレンジ後のオーシス
ト排出数において統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）
を誘発することを示している。
【０１１２】Ｐｒｅｐｃｅｌｌ精製によって、ＴＸ１１
４ワクチンが誘発する保護が改善されるようであった。
４ワクチンが誘発する保護が改善されるようであった。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】ワクチンとして４２時間シゾントの全抽出
物のみを用いた別の実験では、有意なオーシスト減少は
誘発され得なかった（結果は示さず）。
物のみを用いた別の実験では、有意なオーシスト減少は
誘発され得なかった（結果は示さず）。
【０１１５】第２の実験では、０．２及び２μｇ／用量
という２つの異なる濃度のＰｒｅｐｃｅｌｌ精製ＥＡＳ
Ｃ２を用いた。免疫感作及びチャレンジについて同一プ
ロトコルに従って実施した後、１グループ当たり１０羽
のニワトリにおけるオーシスト排出数の減少として保護
を測定し、ＰＢＳ／Ｑｕｉｌ Ａを接種したグループと
比較した。
という２つの異なる濃度のＰｒｅｐｃｅｌｌ精製ＥＡＳ
Ｃ２を用いた。免疫感作及びチャレンジについて同一プ
ロトコルに従って実施した後、１グループ当たり１０羽
のニワトリにおけるオーシスト排出数の減少として保護
を測定し、ＰＢＳ／Ｑｕｉｌ Ａを接種したグループと
比較した。
【０１１６】表３は、２つのＥＡＳＣ２予防接種グルー
プに対する対照の平均オーシスト排出数％を要約したも
のである。この表は、ＥＡＳＣ２が、２μｇ／用量の用
量で統計的に有意な差を示す用量依存的保護を行ったこ
とを示している。
プに対する対照の平均オーシスト排出数％を要約したも
のである。この表は、ＥＡＳＣ２が、２μｇ／用量の用
量で統計的に有意な差を示す用量依存的保護を行ったこ
とを示している。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】実施例４ ＥＡＳＣ２又はＴＸ１１４親水性タンパク質で予防接種
した後の免疫刺激 上記の両保護実験において、Ｔ−リンパ球の増殖及び血
清抗体のような免疫特性刺激についてニワトリを検定し
た。
した後の免疫刺激 上記の両保護実験において、Ｔ−リンパ球の増殖及び血
清抗体のような免疫特性刺激についてニワトリを検定し
た。
【０１１９】血清抗体：ワクチン構成成分を認識する抗
体は、４２時間ＴＸ１１４親水性画分で予防接種したグ
ループからの血清においてのみ検出され、精製ＥＡＳＣ
２で予防接種したグループでは検出されなかった。
体は、４２時間ＴＸ１１４親水性画分で予防接種したグ
ループからの血清においてのみ検出され、精製ＥＡＳＣ
２で予防接種したグループでは検出されなかった。
【０１２０】リンパ球の増殖：抗原刺激後のリンパ球の
増殖をリンパ球刺激テスト（ＬＳＴ）でテストした。
増殖をリンパ球刺激テスト（ＬＳＴ）でテストした。
【０１２１】方法：チャレンジ前に、各グループのニワ
トリ全てから末梢血球を採取した。
トリ全てから末梢血球を採取した。
【０１２２】周囲温度で７分間６４ｇで全血液３ｍｌを
遠心して末梢血白血球（ＰＢＬ）を分離した。ＲＰＭＩ
１６４０（Ｄｕｔｃｈ改変）中にバフィーコートを回
収し、２回洗浄した。細胞濃度を、１ｍｌのＲＰＭＩ
１６４０当たり１×１０7細胞に調整した。用いたＲＰ
ＭＩ １６４０（Ｄｕｔｃｈ改変）に、ピルビン酸ナト
リウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン
２００ Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン２００μｇ／
ｍｌを追加した。
遠心して末梢血白血球（ＰＢＬ）を分離した。ＲＰＭＩ
１６４０（Ｄｕｔｃｈ改変）中にバフィーコートを回
収し、２回洗浄した。細胞濃度を、１ｍｌのＲＰＭＩ
１６４０当たり１×１０7細胞に調整した。用いたＲＰ
ＭＩ １６４０（Ｄｕｔｃｈ改変）に、ピルビン酸ナト
リウム（１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン
２００ Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン２００μｇ／
ｍｌを追加した。
【０１２３】９６ウエルの丸底組織培養プレートに、
３．０％ニワトリ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む０．
０５ｍｌの細胞懸濁液、０．０５ｍｌの「刺激性抗原」
懸濁液及び０．０５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０を接種
し、５％ＣＯ2雰囲気下に４１℃で６４時間培養した。
次いで、１８．５ＫＢｑの３−Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｂｅｋｅｎｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）を各ウエルに
加え、８時間後、９６ウエルｌｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｂｅ
ｓｔｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｎｏｒｗａｙ）を用い、細
胞をガラス線維フィルター（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｎｏｒｗ
ａｙ Ｂｌｕｅｍａｔ）上に集めた。フィルターをシン
チレーション液（ＬＫＢ ＢｅｔａＳｃｉｎｔ）で飽和
し、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ １２０５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ／ＬＫＢ Ｓｗｅｄｅｎ）中で計数した。
３．０％ニワトリ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む０．
０５ｍｌの細胞懸濁液、０．０５ｍｌの「刺激性抗原」
懸濁液及び０．０５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０を接種
し、５％ＣＯ2雰囲気下に４１℃で６４時間培養した。
次いで、１８．５ＫＢｑの３−Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｂｅｋｅｎｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）を各ウエルに
加え、８時間後、９６ウエルｌｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｂｅ
ｓｔｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｎｏｒｗａｙ）を用い、細
胞をガラス線維フィルター（Ｓｋａｔｒｏｎ Ｎｏｒｗ
ａｙ Ｂｌｕｅｍａｔ）上に集めた。フィルターをシン
チレーション液（ＬＫＢ ＢｅｔａＳｃｉｎｔ）で飽和
し、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ １２０５（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ／ＬＫＢ Ｓｗｅｄｅｎ）中で計数した。
【０１２４】「刺激性抗原」としてＥ．ａｃｅｒｖｕｌ
ｉｎａシゾントを用いたが、これは、ミクロチップを備
えたＢｒａｎｓｏｎ音波処理装置を用い、ポジション
６で、３×２０秒間音波処理し、中間冷却（ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｏｌｉｎｇ）し、−７０℃で貯蔵
した。抗原を使用前に解凍し、刺激に用いる濃度に合う
ように希釈した。全グループのＰＢＬを３．１０5の
Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａシゾントで刺激した。
ｉｎａシゾントを用いたが、これは、ミクロチップを備
えたＢｒａｎｓｏｎ音波処理装置を用い、ポジション
６で、３×２０秒間音波処理し、中間冷却（ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｏｌｉｎｇ）し、−７０℃で貯蔵
した。抗原を使用前に解凍し、刺激に用いる濃度に合う
ように希釈した。全グループのＰＢＬを３．１０5の
Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａシゾントで刺激した。
【０１２５】刺激指数（ＳＩ）〔刺激していない対照の
１分当たりのカウント（ｃｐｍ）で除した刺激培養体の
ｃｐｍ数〕のＬＯＧに基づいてスチューデントのＴテス
トを用いて統計的評価を行った。ｐ＜０．０５であれ
ば、差は有意であると見なした。
１分当たりのカウント（ｃｐｍ）で除した刺激培養体の
ｃｐｍ数〕のＬＯＧに基づいてスチューデントのＴテス
トを用いて統計的評価を行った。ｐ＜０．０５であれ
ば、差は有意であると見なした。
【０１２６】結果：表４は、上記のＥＡＳＣ２ワクチン
をＴＸ１１４親水性画分と比較した最初の実験及びＥＡ
ＳＣ２ワクチンの２種の用量に関する第２の実験からの
グループの平均Ｓ．Ｉ．を示す。
をＴＸ１１４親水性画分と比較した最初の実験及びＥＡ
ＳＣ２ワクチンの２種の用量に関する第２の実験からの
グループの平均Ｓ．Ｉ．を示す。
【０１２７】全ての抗原又は用量が、チャレンジしたと
きに末梢血において検出可能な有意な正のＴ細胞応答を
誘発させたことが判明した。
きに末梢血において検出可能な有意な正のＴ細胞応答を
誘発させたことが判明した。
【０１２８】しかし、どちらの実験においても、Ｐｒｅ
ｐｃｅｌｌ純粋ＥＡＳＣ２ワクチンの用量を多くすると
（２又は５μｇ／用量）、極めて高いＴ細胞刺激を誘発
した。Ｔ細胞刺激のランキングは、チャレンジ後のオー
シスト排出数の減少と相関していた。
ｐｃｅｌｌ純粋ＥＡＳＣ２ワクチンの用量を多くすると
（２又は５μｇ／用量）、極めて高いＴ細胞刺激を誘発
した。Ｔ細胞刺激のランキングは、チャレンジ後のオー
シスト排出数の減少と相関していた。
【０１２９】
【表４】
【０１３０】実施例５ クローニング実験 Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストのスポロゾイト形
成 ６０ｍｌの１０-4Ｍ 亜ジチオン酸ナトリウム中の５＊
１０8Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストの懸濁液を
遠心した後、ペレットを１００ｍｌの滅菌水で１回洗浄
した。細胞を５００ｍｌの２％重クロム酸カリウムに再
懸濁し、次いで、強曝気の影響下に３０℃で７時間イン
キュベートした。次いでオーシストを遠心して回収し、
２００ｍｌの滅菌水で３回洗浄した。
成 ６０ｍｌの１０-4Ｍ 亜ジチオン酸ナトリウム中の５＊
１０8Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストの懸濁液を
遠心した後、ペレットを１００ｍｌの滅菌水で１回洗浄
した。細胞を５００ｍｌの２％重クロム酸カリウムに再
懸濁し、次いで、強曝気の影響下に３０℃で７時間イン
キュベートした。次いでオーシストを遠心して回収し、
２００ｍｌの滅菌水で３回洗浄した。
【０１３１】ＲＮＡの分離 ＲＮＡの分離（Ｐａｓｔｅｒｎａｋ Ｊ．ら，Ｍｏｌ．
＆ Ｂｉｏｃｈ．Ｐａｒ．３，１３３−１４２，１９８
１）のために、１０ｍＭのＴｒｉｓアセテート（ｐＨ
７．６）、７５ｍＭの酢酸ナトリウム、１％ＳＤＳ、２
ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ
及び１０ｍＭのバナジルリボヌクレオシド複合体を含む
緩衝液２．８ｍｌ中に細胞ペレットを入れた。１３ｇの
ガラスビーズ（φ０．５ｍｍ）の存在下に、６０秒間
（最大）ぐるぐるかきまわしてオーシストを破壊した。
全抽出物に５ｍｌのフェノールを加え、混合物をさらに
６０秒間ぐるぐるかきまわした。遠心後、上清液をピペ
ットで除去し、等量のフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。２．
５容量のエタノールを加えた後、ＲＮＡを沈降させ、得
られた沈降物を８００ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６（Ｔ10Ｅ0.1）に溶解した
後、生成物を等量のフェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２５：２４：１）でさらに２回、クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽
出し、次いでエタノールで沈降させた。ポリＡ+−ＲＮ
Ａを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー
（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）にかけて分離した。
５＊１０8オーシストから約１００μｇのポリＡ+−ＲＮ
Ａを分離した。
＆ Ｂｉｏｃｈ．Ｐａｒ．３，１３３−１４２，１９８
１）のために、１０ｍＭのＴｒｉｓアセテート（ｐＨ
７．６）、７５ｍＭの酢酸ナトリウム、１％ＳＤＳ、２
ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ
及び１０ｍＭのバナジルリボヌクレオシド複合体を含む
緩衝液２．８ｍｌ中に細胞ペレットを入れた。１３ｇの
ガラスビーズ（φ０．５ｍｍ）の存在下に、６０秒間
（最大）ぐるぐるかきまわしてオーシストを破壊した。
全抽出物に５ｍｌのフェノールを加え、混合物をさらに
６０秒間ぐるぐるかきまわした。遠心後、上清液をピペ
ットで除去し、等量のフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。２．
５容量のエタノールを加えた後、ＲＮＡを沈降させ、得
られた沈降物を８００ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６（Ｔ10Ｅ0.1）に溶解した
後、生成物を等量のフェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２５：２４：１）でさらに２回、クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽
出し、次いでエタノールで沈降させた。ポリＡ+−ＲＮ
Ａを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー
（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）にかけて分離した。
５＊１０8オーシストから約１００μｇのポリＡ+−ＲＮ
Ａを分離した。
【０１３２】ｃＤＮＡの合成 ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いてポリＡ+−ＲＮＡをｃＤＮ
Ａに変換した。このために、２５μｇのポリＡ+−ＲＮ
Ａを９０ｍｌの水に溶解し、最終濃度１０ｍＭの水酸化
メチル水銀を加えて２０℃で５分間変性させた後、β−
メルカプトエタノールを最終濃度４５ｍＭで加え、混合
物を２０℃でさらに３分間インキュベートした。４ｍｇ
のオリゴ（ｄＴ）１５、１５０ＵのＲＮａｓｉｎ
（Ｒ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、３０ｍＭ
のＫＣｌ、４ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２
ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭの各ｄＮＴＰ及び３０００Ｕ
ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む緩衝液１９０ｍｌ中で酵素反
応を実施した。３７℃で１時間インキュベートした後、
１０ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し
た。等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２５：２４：１）で抽出した後、最終濃度２Ｍ
の酢酸アンモニウム及び２．５容量のエタノールを加え
て、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを沈降させた。酵素Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩとＲＮアーゼＨ（Ｇｕｂｂｌｅｒ
Ｕ．ら，Ｇｅｎｅ ２５，２６３−２６９，１９８３）
との組合わせ作用により、第２鎖（ｓｅｃｏｎｄ ｓｔ
ｒｉｎｇ）が合成された。ペレットを、２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ（ｐＨ７．６）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１００ｍＭ
の（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．６ｍＭのβ−ＮＡＤ、１６Ｕ
のＲＮアーゼ Ｈ、２００ＵのＤＮＡ−ポリメラーゼＩ
及び２０ＵのＤＮＡ−リガーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む
緩衝液９６０μｌに溶解した。１２℃で１時間、次いで
２２℃で１時間インキュベートした後、等量のフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２
４：１）を加えて反応を停止し、エタノールで沈降させ
た。
Ａに変換した。このために、２５μｇのポリＡ+−ＲＮ
Ａを９０ｍｌの水に溶解し、最終濃度１０ｍＭの水酸化
メチル水銀を加えて２０℃で５分間変性させた後、β−
メルカプトエタノールを最終濃度４５ｍＭで加え、混合
物を２０℃でさらに３分間インキュベートした。４ｍｇ
のオリゴ（ｄＴ）１５、１５０ＵのＲＮａｓｉｎ
（Ｒ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、３０ｍＭ
のＫＣｌ、４ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２
ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭの各ｄＮＴＰ及び３０００Ｕ
ＭＭＬＶ逆転写酵素を含む緩衝液１９０ｍｌ中で酵素反
応を実施した。３７℃で１時間インキュベートした後、
１０ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し
た。等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２５：２４：１）で抽出した後、最終濃度２Ｍ
の酢酸アンモニウム及び２．５容量のエタノールを加え
て、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを沈降させた。酵素Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩとＲＮアーゼＨ（Ｇｕｂｂｌｅｒ
Ｕ．ら，Ｇｅｎｅ ２５，２６３−２６９，１９８３）
との組合わせ作用により、第２鎖（ｓｅｃｏｎｄ ｓｔ
ｒｉｎｇ）が合成された。ペレットを、２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ（ｐＨ７．６）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１００ｍＭ
の（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．６ｍＭのβ−ＮＡＤ、１６Ｕ
のＲＮアーゼ Ｈ、２００ＵのＤＮＡ−ポリメラーゼＩ
及び２０ＵのＤＮＡ−リガーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む
緩衝液９６０μｌに溶解した。１２℃で１時間、次いで
２２℃で１時間インキュベートした後、等量のフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２
４：１）を加えて反応を停止し、エタノールで沈降させ
た。
【０１３３】先ずｃＤＮＡを改変する目的に適合したベ
クター中でｃＤＮＡをクローン化した。３０ｍＭの酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．６）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍ
ＭのＺｎＳＯ4及び２１ＵのＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃ
ｌｅａｓｅを含む緩衝液１００μｌにｃＤＮＡ（５μ
ｇ）を溶解した。３７℃で３０分間インキュベートした
後、最終濃度１０ｍＭのＥＤＴＡ及び最終濃度２５ｍＭ
のＴｒｉｓを加えて反応を停止した。フェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で
抽出した後、混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム
上で脱塩した。溶離液（１２５μｌ）に、最終濃度５０
ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、最終濃度２．５ｍＭの
ＥＤＴＡ、最終濃度５ｍＭのＤＴＴ、最終濃度０．５ｍ
ＭのＳ′−アデノシルメチオニン、及び１００ＵのＥｃ
ｏＲＩ−メチラーゼを加えた。３７℃で３０分間インキ
ュベートした後、６５℃で３０分間加熱して反応を停止
し、その後で、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００
ｍＭのＭｇＣｌ2及び５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．
５）を含む溶液１／１０容量を加え、同時に最終濃度１
ｍＭの各ｄＮＴＰ及び１２．５ＵのクレノウＤＮＡ−ポ
リメラーゼも加えた。２２℃で６０分間インキュベート
した後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（２５：２４：１）を加えて反応を停止し
た。５００μｌのイソプロパノールと共に３５０μｌの
Ｈ2Ｏ及び５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）を加えて上清液を沈降させた。１００ｍｌのＨ2Ｏ
に溶解後、ペレットをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０上で脱
塩し、溶離物をエタノールで沈降させた。ペレットを２
４μｌのＨ2Ｏに溶解した後、２μｇのＥｃｏＲＩリン
カー、最終濃度３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、最終濃度１０ｍＭのＭｇＣｌ2、最終濃度１０ｍ
Ｍのジチオトレイトール、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ、最
終濃度０．１ｍｇ／ｍｌのゼラチン及び１０ＵのＴ４Ｄ
ＮＡ−リガーゼを加えて５０μｌで連結反応を実施し
た。４℃で１６時間インキュベートし、加熱（７０℃で
１５分間）した後で反応を停止し、その後、１００ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、２．５ｍＭのＤＴＴ及び５
００ＵのＥｃｏＲＩを含む緩衝液２１０μｌ中、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断を実施した。３７℃
で９０分間インキュベートした後、等量のフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：
１）で抽出して反応を停止した。最終濃度３００ｍＭの
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を加えた後、２．５容量
のエタノールで上清液を沈降させ、Ｂｉｏｇｅｌ Ａ１
５Ｍカラムを用いてｃＤＮＡ及びリンカーを分離した。
エタノールでｃＤＮＡを沈降させた後、沈降物を、１０
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ
７．６）に溶解した。次いで、ｃＤＮＡ分子をλファー
ジＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローン化
した。
クター中でｃＤＮＡをクローン化した。３０ｍＭの酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．６）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍ
ＭのＺｎＳＯ4及び２１ＵのＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃ
ｌｅａｓｅを含む緩衝液１００μｌにｃＤＮＡ（５μ
ｇ）を溶解した。３７℃で３０分間インキュベートした
後、最終濃度１０ｍＭのＥＤＴＡ及び最終濃度２５ｍＭ
のＴｒｉｓを加えて反応を停止した。フェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で
抽出した後、混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラム
上で脱塩した。溶離液（１２５μｌ）に、最終濃度５０
ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、最終濃度２．５ｍＭの
ＥＤＴＡ、最終濃度５ｍＭのＤＴＴ、最終濃度０．５ｍ
ＭのＳ′−アデノシルメチオニン、及び１００ＵのＥｃ
ｏＲＩ−メチラーゼを加えた。３７℃で３０分間インキ
ュベートした後、６５℃で３０分間加熱して反応を停止
し、その後で、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００
ｍＭのＭｇＣｌ2及び５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．
５）を含む溶液１／１０容量を加え、同時に最終濃度１
ｍＭの各ｄＮＴＰ及び１２．５ＵのクレノウＤＮＡ−ポ
リメラーゼも加えた。２２℃で６０分間インキュベート
した後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール（２５：２４：１）を加えて反応を停止し
た。５００μｌのイソプロパノールと共に３５０μｌの
Ｈ2Ｏ及び５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）を加えて上清液を沈降させた。１００ｍｌのＨ2Ｏ
に溶解後、ペレットをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０上で脱
塩し、溶離物をエタノールで沈降させた。ペレットを２
４μｌのＨ2Ｏに溶解した後、２μｇのＥｃｏＲＩリン
カー、最終濃度３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、最終濃度１０ｍＭのＭｇＣｌ2、最終濃度１０ｍ
Ｍのジチオトレイトール、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ、最
終濃度０．１ｍｇ／ｍｌのゼラチン及び１０ＵのＴ４Ｄ
ＮＡ−リガーゼを加えて５０μｌで連結反応を実施し
た。４℃で１６時間インキュベートし、加熱（７０℃で
１５分間）した後で反応を停止し、その後、１００ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、２．５ｍＭのＤＴＴ及び５
００ＵのＥｃｏＲＩを含む緩衝液２１０μｌ中、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断を実施した。３７℃
で９０分間インキュベートした後、等量のフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：
１）で抽出して反応を停止した。最終濃度３００ｍＭの
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を加えた後、２．５容量
のエタノールで上清液を沈降させ、Ｂｉｏｇｅｌ Ａ１
５Ｍカラムを用いてｃＤＮＡ及びリンカーを分離した。
エタノールでｃＤＮＡを沈降させた後、沈降物を、１０
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ
７．６）に溶解した。次いで、ｃＤＮＡ分子をλファー
ジＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローン化
した。
【０１３４】Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａシゾントのＥＡ
ＳＣ２タンパク質画分に対する抗体を含むｃＤＮＡバン
ク（２＊１０5ｐｆｕ）をスクリーニングすると、６個
の陽性ファージクローンが現れた。これらの抗体を、１
×Ｔｒｉｓ塩（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１：２０００希釈
し、フィルターと共に室温で２時間インキュベートし
た。次いで各フィルターを、５０ｍｌの１×Ｔｒｉｓ塩
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で各１０分ずつ４回洗浄し
た。２回目の抗体のインキュベーションの場合には、ヤ
ギ−抗ウサギ抗体とアルカリホスファターゼとの結合体
（１×Ｔｒｉｓ塩＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０％
ＦＣＳに１：７５００希釈した）を用い、室温で３０分
間インキュベートした後、最初の抗体インキュベーショ
ンの後に記載されているようにしてフィルターを洗浄し
た。０．３３ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム
及び０．１７ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェートを溶解した、１００ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ2（ｐＨ９．６）中で発色反応を実施した。室温
で３０分間インキュベートした後、フィルターを評価し
た。免疫陽性クローンをプラーク精製し、製造業者（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコルに従い、ｉｎ ｖｉ
ｖｏで切り出して取り出した。標準プロトコル（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ Ｔ．ら，前掲）に従って配列決定するため
に、得られたｉｎ ｖｉｖｏ切り出しクローンからプラ
スミドＤＮＡを分離した。部分配列情報から、全てのク
ローンが相同であり、最大のクローンからヌクレオチド
配列が完全に決定されることが示された。ｐＢＬＵＥ
ＥＡＳＣ２と称されるこのクローンは、１５６６ｂｐの
挿入体を含んでいた。
ＳＣ２タンパク質画分に対する抗体を含むｃＤＮＡバン
ク（２＊１０5ｐｆｕ）をスクリーニングすると、６個
の陽性ファージクローンが現れた。これらの抗体を、１
×Ｔｒｉｓ塩（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１：２０００希釈
し、フィルターと共に室温で２時間インキュベートし
た。次いで各フィルターを、５０ｍｌの１×Ｔｒｉｓ塩
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で各１０分ずつ４回洗浄し
た。２回目の抗体のインキュベーションの場合には、ヤ
ギ−抗ウサギ抗体とアルカリホスファターゼとの結合体
（１×Ｔｒｉｓ塩＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１０％
ＦＣＳに１：７５００希釈した）を用い、室温で３０分
間インキュベートした後、最初の抗体インキュベーショ
ンの後に記載されているようにしてフィルターを洗浄し
た。０．３３ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム
及び０．１７ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェートを溶解した、１００ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ2（ｐＨ９．６）中で発色反応を実施した。室温
で３０分間インキュベートした後、フィルターを評価し
た。免疫陽性クローンをプラーク精製し、製造業者（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコルに従い、ｉｎ ｖｉ
ｖｏで切り出して取り出した。標準プロトコル（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ Ｔ．ら，前掲）に従って配列決定するため
に、得られたｉｎ ｖｉｖｏ切り出しクローンからプラ
スミドＤＮＡを分離した。部分配列情報から、全てのク
ローンが相同であり、最大のクローンからヌクレオチド
配列が完全に決定されることが示された。ｐＢＬＵＥ
ＥＡＳＣ２と称されるこのクローンは、１５６６ｂｐの
挿入体を含んでいた。
【０１３５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１６７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：アイメリアアセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａ
ｃｅｒｖｕｌｉｎａ） 発育期：シゾント 直接起源： クローン：ＥＡＳＣ２ １ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２８０．．１２６９ 他の情報：／機能＝“アイメリアラクテートデヒドロゲ
ナーゼ”（Ｅｉｍｅｒｉａ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１..５１ 他の情報：／標識＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１６２４..１６７９ 他の情報：／標識＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：４５..５４ 他の情報：／標識＝ＥｃｏＲＩ−リンカー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１６２１..１６３０ 他の情報：／標識＝ ＥｃｏＲＩ−リンカー 配列
ｃｅｒｖｕｌｉｎａ） 発育期：シゾント 直接起源： クローン：ＥＡＳＣ２ １ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２８０．．１２６９ 他の情報：／機能＝“アイメリアラクテートデヒドロゲ
ナーゼ”（Ｅｉｍｅｒｉａ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１..５１ 他の情報：／標識＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１６２４..１６７９ 他の情報：／標識＝ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：４５..５４ 他の情報：／標識＝ＥｃｏＲＩ−リンカー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１６２１..１６３０ 他の情報：／標識＝ ＥｃｏＲＩ−リンカー 配列
【０１３６】
【化１】
【０１３７】
【化２】
【０１３８】
【化３】
【０１３９】配列番号：２ 配列の長さ：３３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１４０】
【化４】
【０１４１】
【化５】
【図１】Ｐｒｅｐ−ｃｅｌｌ精製ＥＡＳＣ２タンパク質
（レーン１）又は予備免疫対照血清（レーン２）に対す
る抗血清でプローブしたＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
（Ａ）及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（Ｂ）スポロゾイトタン
パク質のウエスターンブロット。マーカーは、分子量較
正（ｋＤ）を示している。
（レーン１）又は予備免疫対照血清（レーン２）に対す
る抗血清でプローブしたＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
（Ａ）及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（Ｂ）スポロゾイトタン
パク質のウエスターンブロット。マーカーは、分子量較
正（ｋＤ）を示している。
【図２】Ｐｒｅｐ−ｃｅｌｌ精製ＥＡＳＣ２タンパク質
（レーン１）又はＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ４２時間シ
ゾントのＴＸ１１４親水性画分（レーン２）のクーマシ
ーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーンＭ
は、分子量較正マーカー（ｋＤ）を含んでいる。
（レーン１）又はＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ４２時間シ
ゾントのＴＸ１１４親水性画分（レーン２）のクーマシ
ーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーンＭ
は、分子量較正マーカー（ｋＤ）を含んでいる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年１０月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐｒｅｐ−ｃｅｌｌ精製ＥＡＳＣ２タンパク質
（レーン１）又は予備免疫対照血清（レーン２）に対す
る抗血清でプローブしたＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
（Ａ）及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（Ｂ）スポロゾイトタン
パク質の（電気泳動後の）ウエスターンブロットを示す
写真である。マーカーは、分子量較正（ｋＤ）を示して
いる。
（レーン１）又は予備免疫対照血清（レーン２）に対す
る抗血清でプローブしたＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ
（Ａ）及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａ（Ｂ）スポロゾイトタン
パク質の（電気泳動後の）ウエスターンブロットを示す
写真である。マーカーは、分子量較正（ｋＤ）を示して
いる。
【図２】Ｐｒｅｐ−ｃｅｌｌ精製ＥＡＳＣ２タンパク質
（レーン１）又はＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ４２時間シ
ゾントのＴＸ１１４親水性画分（レーン２）のクーマシ
ーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動結果を示す写真である。レーンＭは、分子
量較正マーカー（ｋＤ）を含んでいる。
（レーン１）又はＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ４２時間シ
ゾントのＴＸ１１４親水性画分（レーン２）のクーマシ
ーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動結果を示す写真である。レーンＭは、分子
量較正マーカー（ｋＤ）を含んでいる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:90） (72)発明者 アーノルダス・ニコラース・フエルミユー レン オランダ国、5431・ハー・ハー・クイク、 コルホエンデルフエルト・34
Claims (15)
- 【請求項１】 相対モノマー分子量が約３７，０００の
Ｅｉｍｅｒｉａ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の免疫
反応及び／又は抗原決定基を１つ以上有するタンパク
質。 - 【請求項２】 Ｅｉｍｅｒｉａ種がＥｉｍｅｒｉａ ａ
ｃｅｒｖｕｌｉｎａである請求項１に記載のタンパク
質。 - 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列の少なく
とも一部分又はその生物機能等価物を含んでいることを
特徴とする請求項１に記載のタンパク質。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれか一項に記載の
タンパク質をコードする核酸配列。 - 【請求項５】 核酸配列が、配列番号１に示すＤＮＡ配
列の少なくとも一部分を含んでいることを特徴とする請
求項４に記載の核酸配列。 - 【請求項６】 前記核酸配列の発現を可能とする発現制
御配列に作動可能に結合した請求項４又は５に記載の核
酸配列を含む組換え核酸分子。 - 【請求項７】 請求項４又は５に記載の核酸配列を含む
組換えベクター。 - 【請求項８】 核酸配列が発現制御配列に作動可能に結
合していることを特徴とする請求項７に記載の組換えベ
クター。 - 【請求項９】 請求項４もしくは５に記載の核酸配列、
請求項６に記載の組換え核酸分子、又は請求項７もしく
は８に記載の組換えベクター分子で形質転換された宿主
細胞又は微生物。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の宿主細胞を培養する
ことからなる請求項１から３のいずれか一項に記載のタ
ンパク質の発現方法。 - 【請求項１１】 請求項１から３のいずれか一項に記載
のタンパク質、請求項６に記載の組換え核酸分子、請求
項７もしくは８に記載の組換えベクター又は請求項９に
記載の宿主細胞もしくは微生物を、医薬的に許容可能な
キャリヤーと共に含んでなることを特徴とする家禽コク
シジウム症の予防ワクチン。 - 【請求項１２】 請求項９に記載の感染宿主細胞を培養
し、組換えベクターを収集し、該組換えベクターを免疫
活性を有する医薬品中に配合する段階からなるコクシジ
ウム症ワクチンの製造方法。 - 【請求項１３】 請求項１から３のいずれか一項に記載
のタンパク質又は請求項１０に記載の方法で製造したタ
ンパク質を、免疫活性を有する医薬品中に配合すること
からなるコクシジウム症ワクチンの製造方法。 - 【請求項１４】 請求項１から３のいずれか一項に記載
のタンパク質と免疫反応性の抗体又は抗血清。 - 【請求項１５】 請求項１１に記載のワクチンをトリに
投与することからなる家禽コクシジウム症の予防方法。
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