HU212505B - Process for the preparation of recombinant coccidiosis vaccines - Google Patents

Process for the preparation of recombinant coccidiosis vaccines Download PDF

Info

Publication number
HU212505B
HU212505B HU892814A HU281489A HU212505B HU 212505 B HU212505 B HU 212505B HU 892814 A HU892814 A HU 892814A HU 281489 A HU281489 A HU 281489A HU 212505 B HU212505 B HU 212505B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
dna
proteins
cells
antibodies
Prior art date
Application number
HU892814A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT52963A (en
Inventor
Werner Altenburger
Mary-Helen Binger
Richard Antony Chizzonite
Richard Allen Kramer
Peter Thomas Lomedico
Stephen J Mcandrew
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HUT52963A publication Critical patent/HUT52963A/hu
Publication of HU212505B publication Critical patent/HU212505B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/455—Eimeria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehérje, azt kódoló DNS szekvencia, a DNS szekvenciát magábanfoglaló rekombináns vektor, azzal transzformált gazdaszervezet, a fenti fehérjét tartalmazó rekombináns kokcidiózis vakcinák és a fenti fehérjék elleni anti-testek előállítására.
A kokcidiózis az Eimeria nemzetséghez tartozó intracelluláris protozoa paraziták által előidézett baromfibetegség. A kokcidiózis a nagy intenzív baromfitenyésztő intézményekben járványos méretű megbetegedés és kemoterápiás szerekkel történő kezelése magában az Amerikai Egyesült Államokban évi több, mint 100 millió dollárt vesz igénybe. A kokcidiózis-ellenes gyógyszerekkel szembeni rezisztencia kialakulása újabb és újabb szerek kifejlesztését igényli. Ismeretes ugyanakkor, hogy új gyógyszerek kikísérletezése és bevezetése egyre költségesebb és egyre kevésbé engedélyeznek gyógyszermaradványokat az állati takarmányokban.
A természetes kokcidiózis fertőzéssel szembeni védő immunitás bőséges irodalommal rendelkezik. Kisszámú életképes oociszta több héten át naponta történő szabályozott beadása szokásos körülmények között virulens dózisnak megfelelő fertőzéssel szemben teljes immunitást biztosít [Rose et al., Parasitology 73: 25 (1976); Rose et al., Parasitology 88: 199 (1984)]. A fertőzéssel szemben megszerzett rezisztencia alapján lehetőség nyílik fiatal csirkék számára immunitást biztosító és ezáltal a kémiai kokcidiosztatikumokat kiküszöbölő vakcina előállítására. A Sterwin Laboratories, Opelika, Alabama, (Amerikai Egyesült Államok) ezt az elvet alkalmazta CoccivacR elnevezésű készítménye kifejlesztésénél.
Murray és tsai a 167 443 sz. európai közrebocsátási iratban kokcidiózis vakcina készítése céljából Eimeria tenella sporozoitáiból vagy sporulázott oocisztáiból legalább 15 polipeptidet tartalmazó extraktumokat állítottak elő, amelyek közül sok a sporozoita felületéhez kapcsolódott. Az ily módon nyert extraktumok csirkébe befecskendezve a virulens E. tenella sporulázott oociszta orális beadása után kialakult vakbélsüléseket csökkentették. Újabb irodalmi helyen (Schenkel és tsai; 4 650 676 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) E. tenella merozoiták elleni monoklonális anti-testek termelését írták le. A fenti anti-testek felhasználásával Schenkel és tsai számos olyan antigént azonosítottak, amelyek ellen az anti-testek irányultak. Az E. tenella sporozoitákat a fenti anti-testekkel elő-inkubálva, majd az ily módon kezelt sporozoitákat csirkék vakbelébe juttatva Schenkel és tsai azt találták, hogy a vakbél-sérülések a kezeletlen sporozoita kontrollal összehasonlítva bizonyos mértékben csökkentek.
A rekombináns DNS technológiák terén elért fejlődés további megközelítést - az ún. alegység vakcinákat - tett lehetővé. A jelenleg használatos rekombináns DNS eljárások alkalmazása segítségével megfelelő DNS hordozóba vagy vektorba specifikus DNS szekvenciákat iktatnak be és az ily módon kialakított rekombináns DNS molekulák a gazdasejtekben replikálódni képesek. Vektorként gyakran alkalmaznak kör alakú kettősszálú DNS molekulákat (ún. plazmidokat) és az ilyen rekombináns DNS formák előállításához olyan restrikciós endonukleáz enzimeket használnak, amelyek a DNS-t specifikus bázis szekvencia helyeken felhasítani képesek. Amennyiben a restrikciós enzim a plazmidban és a beiktatandó idegen DNS szegmensében a hasítást végrehajtotta, a két DNS molekula a ligáz nevű enzim által kovalens módon összekapcsolható. Az ilyen rekombináns DNS molekulák előállítására Cohen és tsai (4 237 224 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), Collins és tsai (4 304 863 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és Maniatis és társai (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory) általános módszereket közöltek. Minthogy a fenti irodalmi helyek a technika állását kimerítően ismertetik, kitanításuk a jelen szabadalmi leírás részét képezi.
A fentiek szerint előállított rekombináns DNS molekulák azonban csak számos körülmény betartása esetén használhatók fel a beiktatott gén-szekvencia által meghatározott termék előállítására. Elsőszámú követelmény, hogy a rekombináns molekula a gazdasejttel kompatíbilis és ezáltal a gazdasejtben autonóm replikálódásra képes legyen. Újabban végzett kutatások szerint gazdaszervezetként Escherichia coli-t alkalmaznak, mert ez a szervezet a rekombináns plazmidok széles skálájával kompatíbilis. A felhasznált vektor/gazdasejt rendszertől függően a rekombináns DNS molekulát transzformáció, transzdukció vagy transzfekció útján juttatják a gazdaszervezetbe.
A rekombináns plazmidok jelenléte a gazdasejtekben előnyösen plazmid marker aktivitások (pl. antibiotikum rezisztencia) felhasználásával mutatható ki. így valamely ampicillin-bontó enzim termelését kódoló plazmidot tartalmazó gazdaszervezet az átalakulatlan sejtek közül oly módon választható ki, hogy a gazdaszervezetet ampicillin-tartalmú táptalajon tenyésztik. Az antibiotikum rezisztencia markerek továbbá olyan esetekben hasznosíthatók, amikor a plazmid egy második antibiotikum-bontó aktivitást olyan helyen kódol, ahol a kiválasztott restrikciós endonukleáz a hasítást elvégzi és az idegen génszekvencia beiktatható. A megfelelő rekombináns plazmidokat tartalmazó gazdasejteket az jellemzi, hogy az első antibiotikummal szemben rezisztensek, ugyanakkor a másodikkal szemben érzékenyek. A rekombináns plazmidnak a gazdasejtbe történő beiktatása és a módosított gazdasejt izolálása önmagában még nem biztosítja jelentős mennyiségű kívánt gén-termék keletkezését. Ehhez arra van szükség, hogy az idegen génszekvencia a DNS transzkripcióhoz a plazmidban levő szignál tartománnyal megfelelő kapcsolatban fuzionáljon (ún. „promotor”). Alternatív módon az idegen DNS saját promotorját hordozhatja, feltéve hogy azt a gazdaszervezet felismeri. A promotor eredetétől függetlenül olyan DNS szekvencia, amely az RNS polimeráz kapcsolódását irányítja és ezáltal elősegíti
HU 212 505 Β a DNS transzkripcióját a messenger RNS-hez (mRNS).
Nagy mennyiségű mRNS képződését eredményező körülmények között a kívánt géntermék végső termelése attól függ, hogy az mRNS-nek a fehérjéhez történő transzlációja mennyire hatékony. Utóbbi folyamat az mRNS-hez való riboszomális kötődés hatékonyságától függ. E. coli-ban az mRNS-en levő riboszóma-kötődési hely iniciálási kodont (AUG) és felfelé haladó ShineDalgamo (SD) szekvenciát tartalmaz. Ez a szekvencia 3-9 nukleotidokat és az AUG kodontól számított 3-11 nukleotidokat tartalmaz és az E. coli 16S riboszóma RNS (rRNS) 3' végét kiegészíti [Shine and Dalgamo: Natúré 254, 34 (1975)]. Az mRNS-hez való riboszomális kötődést az mRNS-ben levő SD szekvencia és a 16S rRNS 3'-végződés szekvenciája közötti bázispár képzés megkönnyíti. A génkifejezés maximalizálása vonatkozásában Roberts és Lauer közleményére hivatkozunk [Methods in Enzymology 68, 473 (1979)].
Alternatív kifejezési rendszert a lacZ operon alapján lambda fág vektorokkal kombinálva fejlesztettek ki (Huynh és tsai: DNS Cloning: Volume I, D. M. Glover, Ed.). Ebben a rendszerben a béta-galaktozidáz strukturális génjét az annak kifejezését szabályozó indukálható promotorral együtt a fág vektorba építették be. A béta-galaktozidáz génje 3' végén levő egyedülálló klónozó hely a fehérjét kódoló tartományt tartalmazó mRNS vagy genom DNS fragmens cDNS másolatának beillesztésekor génfuziót eredményez.
A béta-galaktozidáz gén kifejezése béta-galaktozidáz 114 kD-t és a cDNS inzert által kódolt karboxi-terminális polipeptidet tartalmazó fúziós peptid termelését eredményezi abban az esetben ha az inzert egy nyitott leolvasó keretet tartalmaz ugyanabban a regiszterben, mint a béta-galaktozidáz leolvasó kerete. Valamely monoklonális vagy poliklonális antiszérum által felismert terméket eredményező gént tartalmazó fág ily módon a könyvtár (géntár) immunológiai screenelése, majd a fúziós fehérje azt követő indukciója útján azonosítható; utóbbi művelet során a lacZ represszor inaktiválásához béta-D-tio-galaktopiranozidot (IPTG) alkalmaznak. A fenti kifejezési vektor-rendszer egyesíti a fág-rendszer hatékonyságát (DNS „becsomagolása” és
E. coli sejtekbe történő bevitele útján) a β-galaktozidázzal szemben stabil polipeptid fúzióval.
A vakcina al-egység megközelítés értelmében az egész fertőző szervezet al-egységét immunológiailag releváns összefüggésben juttatják a gazdaállatba. Az al-egység a parazitából nyert tisztított fehérje, valamely rekombináns fehéije vagy heterológ rendszerben kifejezett fehérje fragmens, egyetlen neutralizáló determinánst tartalmazó szintetikus peptid vagy valamely vírusos vektor által bevitt fehérje (pl. vakcina) lehet. A gazda immunrendszer az al-egységre specifikus módon reagál anélkül, hogy a teljes parazitával érintkezésbe került volna. A fertőző szervezet virulens dózisával érintkezve a gazda immunrendszer sikeres védekezést alakít ki, éspedig kizárólag a vakcina al-egység által kapott instrukció alapján, amellyel korábban érintkezésbe hozták.
Az irodalom szerint kokcidiózissal szemben megszerzett rezisztencia kialakulásában keringő anti-testek, az intesztinális epitheliumban kiválasztott IgA [Davis és tsai: Immunology 34; 879 (1978)] és sejtek által közvetített immunrendszer [Giambroni és tsai: Poultry Science 59; 38 (1980)] szerepet játszanak. Ezzel kapcsolatban az alábbi irodalmi helyekre hivatkozunk: P. S. Davis: Avian Immunology; Μ. E. Rose, Ed., British Poultry Science, Ltd., Edenberg, 361-385 (1981). Az immunrendszer különböző részeinek bekapcsolódása miatt teljes és hosszan tartó védelem biztosítása céljából a természetes fertőzési folyamatok specifikus részeinek utánzására lehet szükség. Ezek az aspektusok az alábbiak: a védelem kialakításául szolgáló helyet fertőzésnek teszik ki; antigént feldolgozó sejtek irányítása céljából gyulladásos reakciót idéznek elő; megfelelő parazita antigént juttatnak be és adott esetben megfelelő membrán konfigurációban MHC determinánsokkal kapcsolják össze.
Találmányunk valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó tisztított fehérjék vagy azok fragmensei előállítására vonatkozik.
Találmányunk tárgya közelebbről eljárás valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehérje előállítására, amely felületi antigén látszólagos molekulatömege kb. 28, 37, 120 vagy nagyobb, mint 200 kilodalton és amely az American Type Culture Collection (ATCC) intézménynél HB 9707-9712 számon letétbe helyezett egy vagy több monoklonális anti-testhez specifikusan kötődik. A fenti fehérjék közül példálódzó jelleggel a 15., 17., 19. és 21. ábrán feltüntetett aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjékre és ezek funkcionális ekvivalenseire hivatkozunk. Funkcionális ekvivalensnek olyan fehérjéket tekintünk, amelyek a fent említett aminosav-szekvenciákból addíció, törlés, beiktatás és aminosav-helyettesítés által leszármaztatható aminosav-szekvenciákkal rendelkeznek, azzal a feltétellel, hogy ezek a fehéijék valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát megtartják. A fenti fehérjék baromfi kokcidiózissal szemben történő immunizálására használhatók fel.
Találmányunk továbbá a fent említett fehérjék elleni anti-testek - különösen monoklonális anti-testekre, pl. a HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 és HB 9712 számon letétbe helyezett monoklonális anti-testek - előállítására vonatkozik.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás a fent említett fehéijéket kódoló DNS-szekvenciák; a fenti DNSszekvenciákat tartalmazó rekombináns vektorok, különösen a fenti DNS-szekvenciák kompatíbilis gazdaszervezetekben történő kifejezésének irányítására képes rekombináns vektorok; és a fenti rekombináns vektorokkal transzformált gazdaszervezetek, különösen a fenti rekombináns vektorokban levő, fent említett fehérjét kódoló DNS szekvenciák kifejezésére képes transzformált gazdaszervezetek előállítására.
Találmányunk tárgya eljárás valamely Eimeria te3
HU 212 505 Β nella felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehérje előállítására oly módon, hogy
a) a fenti fehérjét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet a DNS szekvencia kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk; és
b) a fehérjét vagy fragmensét a tenyészetből izoláljuk. A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti fehérjét kódoló DNS szekvencia előállítására oly módon, hogy nukleotidokat a fentiekben leírt fehérje aminosav szekvenciája által meghatározott szekvenciában ismert módszerekkel polimerizálunk, vagy mRNS-t Eimeria sporulázó oocisztákból vagy merozoitákból izolálunk és a fenti DNS szekvencia szintézisében templátként ismert módszerekkel alkalmazunk.
A találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns vektor előállítására oly módon, hogy a fenti eljárással előállított DNS szekvenciát valamely vektorba ismert módszerekkel működőképesen építünk be.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás a fent említett transzformált gazdaszervezet előállítására, oly módon, hogy valamely gazdaszervezetet egy találmányunk szerinti fehérjét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó rekombináns vektorral önmagukban ismert módszerekkel transzformálunk.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás baromfi kokcidiózissal szemben történő megvédésére szolgáló vakcina előállítására, amely egy vagy több találmányunk szerinti fehérjét és fiziológiai szempontból alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.
Találmányunk tárgya eljárás továbbá baromfi kokcidiózissal szemben történő megvédésére alkalmas vakcina előállítására, amely valamely találmányunk szerinti fehérjét kódoló DNS szekvenciát vagy fragmensét tartalmazó és a DNS szekvencia vagy fragmens kifejezésére képes vírusos vektort és fiziológiai szempontból alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás baromfi megvédésére kokcidiőzissal szemben oly módon, hogy a kokcidiózis veszélyének kitett fiatal szárnyasnak valamely találmányunk szerinti vakcina hatékony mennyiségét adjuk be.
Találmányunk jobb megértése és részletesebb ismertetése céljából az alábbi leírásra és a csatolt ábrákra hivatkozunk. Az ábrák magyarázata a következő:
Az 1. ábrán E. tenella sporozoita ELISA felhasználásával kapott eredményeket mutatunk be. Az immun egér szérum (MS 107-2; Δ) és kontroll egérszérum (X) hígításait 4xl04 élő tisztított sporozoitával inkubáljuk. A sporozoitákhoz kötött specifikus anti-testeket peroxidáz-konjugált anti-egér IgG anti-test és o-feniléndiamin peroxidáz szubsztrátum segítségével mutatjuk ki. Az OD492 nm értékeket Titertek MultiscanR lemezleolvasóban olvassuk le.
A 2. ábrán E. tenella sporozoitákból nyert szolubilizált fehérjékkel végzett „Western biot assay” eredményeit mutatjuk be. A szolubilizált sporozoita fehérjéket 12,5%-os gélben reduktív SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel választjuk el, nitrocellulóz membránokra visszük át és az egyes anti-testekkel reagáltatjuk. Az egyes anti-testek által felismert specifikus fehérjéket peroxidáz-konjugált IgG anti-testtel és 4-klór-l-naftol peroxidáz szubsztrátummal tesszük láthatóvá. Az egyes csíkokkal reakcióba hozott anti-testeket a csík tetején tüntetjük fel.
A 3. ábrán E. tenella sporozoitákból és merozoitákból, valamint E. acervulina sporozoitákból szolubilizált fehérjéken végzett „Western biot assay” eredményeit tüntetjük fel. Különböző monoklonális anti-testeket és szérumokat nitrocellulózhoz kötött Eimeria fehérjékkel inkubálunk és láthatóvá teszünk, a 2. ábrával kapcsolatban leírt módon. Az alábbi monoklonális anti-testeket alkalmazzuk; 3A5 (1), 20C6 (2), 7D1 (3), 13A6 (4), 6A5 (5) és az Eimeria fehérjékkel nem reagáló kontroll anti-test. Szérumként egér No. 107-2 immun szérumot (7) és kontroll szérumot (8) alkalmazunk.
A 4. ábra baloldali részében E. tenella sporozoiták 125I-jelzett felületi fehérjéivel végzett immunokicsapásos meghatározás eredményeit tüntetjük fel. A sporozoita felületi fehérjéit az IODEGEN vagy IODOBEADS módszerrel jelezzük, szolubilizáljuk, majd 12,5%-os SDS poliakrilamid gélben végrehajtott elektroforézissel autoradiográfia útján tesszük láthatóvá. A 4. ábra jobboldali részén élő sporozoitákkal immunizált egerekből nyert szérummal végrehajtott l25I-jelzett sporozoita felületi fehérje immunolecsapásos módszer eredményeit mutatjuk be. Immun egér szérumokat (105-1, 105-2, 105-3, 107-1, 107-2 és 107-3) és kontroll egérszérumot (kontroll) 125I-sporozoita felületi fehérjékkel inkubálunk és az immun komplexeket agarózhoz kapcsolt anti-egér anti-testtel fogjuk be. Az immun komplexeket Laemmli minta pufferrel szolubilizáljuk, 12,5%-os gélben végzett SDS-gélelektroforézissel szolubilizáljuk és autoradiográfiával tesszük láthatóvá. „M” jelentése a standard marker fehérje molekulatömege, kilodaltonban.
Az 5. ábrán ,25I-sporozoita felületi fehérjék monoklonális anti-testekkel végrehajtott immunolecsapásának eredményeit tüntetjük fel. Az egyes anti-testek által megkötött l25I-fehérjék azonosítását a 4. ábrával kapcsolatban leírtak szerint végezzük el. A felhasznált specifikus sporozoita monoklonális anti-testeket és kontroll anti-testeket (kontroll) az egyes gél-pályák tetején tüntetjük fel. A standard marker fehérjék molekulatömegét kilodaltonban adjuk meg.
A 6. ábrán levegőn szárított E. tenella sporozoita tárgy lemez-készítménynek különböző monoklonális anti-testeinek felhasználásával készített fázis kontraszt mikrográfokat és immunofluoreszcensz színezett minta mikrográfokat mutatunk be. Az A-, B-, C- és D-panel baloldalán intakt megnyújtott sporozoitákat bemutató fázis kontraszt mikrográfokat tüntetünk fel, ahol is PRB = nagy hátsó fénytörő test; ARB = kis elülső fénytörő test; és A = a hátsó fénytörő testtel szemben elhelyezkedő csúcs végződés. Az A-, B-, C- és D-panel jobboldalán monoklonális 14C3 anti-testekkel (felületi antigénekre specifikus), 6A5 anti-testekkel (felületi és fény törő test fehéqékre specifikus), 11D2 anti-testekkel (sporozoita csúcsvégződésekre specifikus), illetve
HU 212 505 B kontroll anti-testekkel kezelt tárgylemezeket mutatunk be. A készítményekhez kötődött anti-testeket rodaminkonjugált anti-egér anti-testekkel lokalizáljuk és Leitz Dialux 22r mikroszkóp felhasználásával epifluoreszcenciával tesszük láthatóvá. Valamennyi mikrográf 630-szoros nagyítású.
A 7. ábrán intracelluláris sporozoiták anti-test színezését és a kifejlődő parazitákat mutatjuk be, csirkevese-sejtekben. A csirkevese-sejteket sporozoitákkal megfertőzzük, majd a sejteket a fertőzés után megjelölt időpontokban anti-test színezésnek vetjük alá. A tenyészeteket fixálás előtt a jelenlevő extracelluláris sporozoiták eltávolítása céljából mossuk. Fáziskontraszt és a megfelelő immunofluoreszcensz mikrográfok elkészítéséhez a feltüntetett módon 7D4, 8A2, 7B2 és 15A3 anti-testeket alkalmazunk. A készítményekhez kötődött anti-testeket rodamin-konjugált anti-egér anti-testekkel lokalizáljuk és epifluoreszcenciával tesszük láthatóvá. Valamennyi mikrográf 630-szoros nagyítású.
A 8. ábrán intracelluláris sporozoiták anti-test színezését és a kifejlődő parazitákat mutatjuk be, csirkevese-sejtekben. Monoklonális 14B1 és 19D6 anti-testek, immun csirkeszérum és fluoreszcens második antitestek felhasználásával a megadott időpontokban fázis kontraszt mikrográfokat és megfelelő immunofluoreszcensz mikrográfokat készítünk.
A 9. ábrán intracelluláris sporozoita fejlődésnek antisporozoita anti-testek által történő semlegesítését mutatjuk be. Tisztított E. tenella sporozoitákat 40 ’C-on egy órán át kontroll anti-testekkel (X) vagy 7D4 (Q), 8 A2 (o), 14B1 (·) vagy 6A5 () anti-sporozoita anti-testekkel elő-inkubálunk, majd MDBK sejttenyészetekkel megfertőzünk A sporozoitákat táptalajjal (Δ) vagy kokcidiózis ellenes gyógyszerrel (lasalocid; *) elő-inkubáljuk.
A fertőzés után az intracelluláris sporozoiták kifejlődését oly módon mérjük, hogy a sejttenyészetekbe 3H-uracilt építünk be. Minthogy a lasalocid a sporozoiták intracelluláris kifejlődését gátolja, a fenti gyógyszerrel előkezelt tenyészetek csupán minimális 3H-uracil beépülést mutatnak.
A 10. ábrán 65 Kd-béta-galaktozidáz fúziós fehérje minták vagy más feltüntetett minták SDS-poliakrilamid gél elektroforézis/,, Western Biot analízis eredményeit tüntetjük fel. A „Western Biot analízis” elvégzése során patkány vagy egér anti-béta-galaktozidáz antitestet (A-panel) vagy összegyűjtött monoklonális 7D1, 7D4 és 20C6 anti-testeket (B-panel) alkalmazunk, kecske anti-egér HPOD konjugátummal együtt. Mindkét panelben az egyes pályák jelenése a következő: (1) béta-galaktozidáz; (m) előszínezett markerek, amelyek molekulatömegét az A-panel bal oldalán kD-ben adjuk meg; (2) teljes sejtüledék fehérje; (3) a sejtüledékből ultrahangos kezeléssel felszabadított fehérje; és (4) a sejtüledék ultrahangos kezelése után guanidin-hidrokloriddal szolubilizált fehétje.
All. ábrán a pEV/2-4 plazmidot vázlatosan ábrázoljuk; ez egy 65 kD fehérje kifejezési plazmid, amely a Xm2-4 fágból származó 1,7 kb EcoRL DNS inzertet tartalmaz. A különböző restrikciós enzim helyeket az inzertben az EcoRI helyhez viszonyítva tüntetjük fel;
idetartozik a PstI (P, bp 53 és 776), KpnI (K, bp 202), BstNI (B, bp 584, 1303 és 1412) és Sau3A (S, bp 1017 és 1439).
A 12. ábrán a pEV3-SEQ térképét tüntetjük fel, amely a megjelölt helyeken a pEV-vrf3 EcoRI és Sáli helyei közé beiktatott poli-linkert tartalmaz. A szaggatott nyíllal jelölt CGGTCGACTCGAGCCA szintetikus oligonukleotidot láncvégződéses DNS szekvencia analízis során printerként alkalmazzuk.
A 13. ábrán a monoklonális 6A5 anti-test által felismert fehérjéket kódoló cDNS kiónok restrikciós térképét tüntetjük fel. Az 1,1 kb cDNS Maxam-Gilbert DNS szekvencia analíziséhez felhasznált restrikciós endonukleáz helyeket mutatjuk be. A zárójelben feltüntetett EcoRI hely a 0,9 kb cDNS végén található. A térkép felett levő vonal a DNS szekvencia alapján várható nyitott leolvasó keretet mutatja be, a betöltött potenciális szignál peptiddel. A térkép alatt levő vonalak a láncvégződéses szekvencia analízishez felhasznált exoffl törléseket jelzik.
A 14. ábrán a monoklonális 6A5 anti-test által felismert 20 kD fehérjét kódoló 1,1 kb cDNS molekula nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel.
A 15. ábrán a 14. ábra szerinti feltétjének az ábra szerinti nukleotid szekvencia alapján várható aminosav szekvenciáját tüntetjük fel.
A 16. ábrán a 7D1, 7D4 és 20C6 monoklonális anti-testek által felismert 65 kD fehérjét kódoló 1,7 kb cDNS molekula nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel.
A 17. ábrán a 16. ábra szerinti fehérje aminosav szekvenciáját tüntetjük fel, amely az ábra szerinti nukleotid szekvencia alapján várható és amelyet a kifejezett 65 kD fehérjéből termelt triptikus peptidek szekvencia analízise igazolt. A teljes aminosav szekvenciában a fenti peptidek közül néhánynak megfelelő tartományokat aláhúztuk. A fenti peptidek meghatározott szekvenciái fölé vonalat húztunk.
A 18. ábrán a 8A2 monoklonális anti-test által felismert 28 kD fehérjét kódoló 1,1 kb cDNS molekula nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel.
A 19. ábrán a 18. ábra szerinti fehérjének az ábrán levő nukleotid szekvencia alapján várható aminosav szekvenciáját tüntetjük fel.
A 20. ábrán a 7B2 monoklonális anti-test által felismert fehérjét kódoló 3,2 kb cDNS molekula nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel.
A 21. ábrán a 20. ábra szerinti fehérjének az ábrán levő nukleotid szekvencia alapján várható aminosav szekvenciáját tüntetjük fel.
A 22. ábrán az immunoaffinitással tisztított 65 kD fehérje SDS poliakrilamid gél elektroforetikus analízisének eredményét tüntetjük fel. A gélt „Coomassie blue” festéssel és „Western biot analysis” segítségével tettük láthatóvá. A 2. és 4., illetve a 3. és 5. pálya két készítményből nyert tisztított fehérjét tartalmaz. Az 1. és 6. pálya marker fehérjék keverékét tartalmazza, amelyek molekulatömegét az ábra bal- és jobboldalán tüntetjük fel.
A 23. ábrán a 65 kD fehérje triptikus hidrolizátumának béta-merkapto-etanollal redukált (A panel) és re5
HU 212 505 Β dukálatlan (B-panel) HPLC eluálásos profilját tüntetjük fel; a 215 ιημ mellett mért abszorpciót az oszlop retenciós idő függvényében ábrázoljuk.
A 24. ábrán a kokcidiális antigéneket a vírus vakcinába kódoló gének rekombinálására felhasznált bázis vektor négy elemének restrikciós térképét mutatjuk be. Ezek az elemek a 7,5 K promotor elemet (a és b, baloldalon) a TK lótuszt (a és b, jobboldalon), a pUC8 plazmid egy részét (c) és a M13tgl31 poliklónozó helyét (d) tartalmazzák. A vírusos 7,5K és TK promotorok transzkripciójának iránya balról jobb felé húzódik (azaz a BglII-től az EcoRI restrikciós helyig a poli-linkerben).
A 25. ábrán 8A2 monoklonális anti-test által felismert Eimeria antigén N-végcsoportját tüntetjük fel. Ezt (A) a 24. ábra szerinti vektor poli-linker elemében levő AUG transzlációs start kodont tartalmazó szerkezetből fejeztük ki és (B) a maláriás 190 kD vezető (leader) szegmensével (első 34 aminosav) és a 24. ábra szerinti klónozó vektor poli-linkerével (következő 13 aminosav) fuzionáltuk. A fehéije érési folyamata során a N-végcsoporton levő első 19 aminosav a kettősponttal megjelölt helyen lehasítható.
Az ábrákon a nukleotidokat standard egybetűs rövidítésekkel, míg az aminosavakat standard egy- vagy hárombetűs rövidítésekkel jelöljük. A fenti rövidítések értelmezése standard biokémiai kézikönyvekben található, lásd pl. Lehninger, Principles of Biochemistry, (1984), kiadó: Worth Publishers, Inc., New York 96, 798. oldal.
A leírásban használt egyes kifejezések értelmezése a következő:
A „20 kD fehérje” kifejezés rekombináns vagy szintetikus fehérjét jelöl, amelynek látszólagos molekulatömege SDS poliakrilamid gél elektroforézis szerint kb. 20 kilodalton és amely a monoklonális 6A5 anti-testhez specifikusan kötődik. Ez az anti-test az SDS gélen kb. 28 kilodalton molekulatömegű Eimeria felületi antigénnel (Eimeria fehéije teljes extraktumából) szintén specifikusan reagál. Ez az antigén a sporozoita fejlődési szakaszban van jelen. A fenti fehérjét kódoló cDNS molekula nukleotid szekvenciáját és az ennek alapján várható aminosav szekvenciáját a 14., illetve 15. ábrán tüntetjük fel.
A „65 kD fehérje” kifejezés rekombináns vagy szintetikus fehérjét jelöl, amelynek látszólagos molekulatömege SDS poliakrilamid gél elektroforézis szerint kb. 65 kilodalton és amely a 7D1, 7D4 és 20C6 monoklonális anti-testekhez specifikusan kötődik. Ezek az anti-testek az Eimeria extraktumokból nyert, SDS gélekben kb. 120 kilodalton látszólagos molekulatömegű felületi antigénnel szintén specifikusan reagálnak. Ez az antigén a sporozoita, skizont és merozoita fejlődési szakaszokban van jelen. A fenti fehérjét kódoló cDNS molekula nukleotid szekvenciáját és az ennek alapján várható aminosav szekvenciát a 16., illetve 17. ábrán tüntetjük fel.
A „28 kD fehérje” kifejezés rekombináns vagy szintetikus fehérjét jelöl, amelynek látszólagos molekulatömege SDS poliakrilamid gél elektroforézisben kb. 28 kilodalton és amely monoklonális 8A2 anti-testhez specifikusan kötődik. Ez az anti-test az SDS gélekben kb. 37 kilodalton látszólagos molekulatömegű Eimeria felületi antigénnel szintén specifikusan reagál. Ez az antigén a sporozoita, skizont és merozoita fejlődési szakaszokban van jelen. A fenti fehérjét kódoló cDNS molekula nukleotid szekvenciáját és az ennek alapján várható aminosav szekvenciát a 18., illetve 19. ábrán tüntetjük fel.
A „45 kD fehéije” kifejezés rekombináns vagy szintetikus fehérjét jelöl, amelynek látszólagos molekulatömege SDS poliakrilamid gél elektroforézis szerint kb. 45 kilodalton és amely monoklonális 7B2 antitesthez specifikusan kötődik. Ez az anti-test az ADS gélekben 200 kilodaltonnál nagyobb molekulatömegű Eimeria felületi antigénnel szintén specifikusan kötődik. Ez az antigén a sporozoita fejlődési szakaszban van jelen. A fenti fehérjét kódoló cDNS molekula nukleotid szekvenciáját és az ennek alapján várható aminosav szekvenciáját a 20., illetve 21. ábrán tüntetjük fel.
A „valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehéije” kifejezés egy vagy több olyan tartományt vagy epitópot tartalmazó fehérjékre vonatkozik, amely(ek) immunológiailag kompetens gazdaszervezetben immunválasz kiváltására és/vagy valamely kiegészítő anti-testhez való specifikus kötődésre képes(ek).
A genetikus kód degenerálódása miatt sok olyan potenciális nukleotid szekvencia ismeretes, (funkcionális ekvivalensek) amelyek a 15., 17., 19. és 21. ábrán feltüntetett aminosav szekvenciák kódolására képesek. Megjegyezzük, hogy a találmányunk szerinti, vektorokba beillesztett DNS szekvenciák és fragmensek nukleotid szekvenciái olyan nukleotidokat is magukban foglalhatnak, amelyek a tényleges strukturális géneknek nem részei, azzal a feltétellel, hogy a fentemlített szekvenciákat és fragmenseket tartalmazó rekombináns vektorok valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehérje vagy fragmens termelését megfelelő gazdaszervezetben irányítani képesek.
Ismeretesek továbbá fehérjék olyan aminosavszubsztitúciői, amelyek a biológiai és immunológiai aktivitásokat számottevően nem befolyásolják. Ilyen aminosav-szubsztitúciók pl. Neurath és tsai: „The Proteins”, kiadó: Academic Press, New York (1979) c. művében kerültek ismertetésre; különösen a 14. oldalon levő 6. ábrára hivatkozunk. A leggyakrabban megfigyelhető aminosav-helyettesítések az alábbiak: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, SEr/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly és fordítva.
A fenti és azokhoz hasonló funkcionálisan ekvivalens nukleotid szekvencia-variációk és aminosav-helyettesítések találmányunk oltalmi körébe tartoznak, azzal a feltétellel, hogy a változtatás során kialakított fehéijék valamely Eimeria felületi antigén egy vagy
HU 212 505 B több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát megtartják.
A „fragmens” kifejezés valamely találmányunk szerinti cDNS vagy fehérje al-szekvenciáját tartalmazó DNS szekvenciát vagy fehérjét jelöl. Az ilyen fragmensek nagyobb molekulák enzimatikus hasításával állíthatók elő, éspedig DNS esetében restrikciós endonukleázok és fehérjék esetében proteázok felhasználásával. A találmányunk szerinti fragmensek körét azonban semmiképpen sem korlátozzuk az enzimes hasítással képezett termékekre, hanem a fragmensek olyan anyagokat is magukban foglalnak, amelyek végcsoportjai nem felelnek meg az enzimes hasítási pontoknak. Az ilyen fragmensek pl. a leírásban meghatározott szekvencia adatok felhasználásával végzett kémiai szintézisekkel alakíthatók ki. DNS fragmensek kiegészítő DNS (cDNS) szintézissel is előállíthatók izolált messenger RNS-ből (mRNS). Fehérjefragmensek továbbá az azokat kódoló DNS fragmensek kifejezésével is előállíthatók. A fenti fehérjefragmensek találmányunk szempontjából abban az esetben hasznosak, ha valamely immunoreaktív és/vagy antigén determináns kialakításához elegendő számú aminosav-maradékot tartalmaznak. Általában legalább 7 vagy 8 maradék szükséges. A továbbiakban ismertetésre kerülő módon a fragmensek immunoreaktívvá tétele céljából szükség lehet a fragmensek valamely immunogén hordozó molekulához történő kapcsolására.
A találmányunk szerinti fehérjék önmagukban ismert módszerekkel állíthatók elő pl. rekombináns DNS metodika útján, kémiai szintézissel vagy Eimeria készítményekből történő izolálással.
A találmányunk szerinti fehérjék előállításához szükséges DNS a 14., 16., 18. és 20. ábrán közölt nukleotid szekvencia információ felhasználásával kémiai úton szintetizálható. A fenti kémiai szintézis bármely ismert módszerrel elvégezhető, azonban a Matteucci és tsai által leírt szilárd foszforamidit hordozós módszer [J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] különösen előnyösen alkalmazható.
Alternatív módon a cDNS Eimeria mRNS-ből is előállítható. A messenger RNS Eimeria sporuláló oocisztákból vagy merozoitákból szokásos standard módszerekkel izolálható. Ezek az mRNS minták felhasználhatók kettősszálú cDNS termelésére (lásd Maniatis és tsai fent idézett közleménye). Ez a cDNS megfelelő klónozó vektorba beiktatható, amely felhasználható E. coli transzformálására cDNS könyvtár termelése céljából.
A cDNS könyvtár a találmányunk szerinti klónozott gének vagy fragmensek próbaként történő felhasználásával screenelhető. A fenti gének vagy fragmensek radioaktív jelzéssel láthatók el pl. „nick-translation” útján, Pol I DNS polimeráz felhasználásával, a négy dezoxiribonukleotid jelenlétében, amelyek közül az egyik az alfa-helyzetben 32P-t tartalmaz. (Maniatis és tsai: fent idézett műve, 109. oldal).
Bár a példákban mRNS forrásként Eimeria tenella-t alkalmaztunk, e faj klónozott génjei felhasználhatók próbaként gének izolálására más Eimeria fajokból, tekintettel a különböző fajok DNS szekvenciáinak homológiájára.
A találmányunk szerinti Eimeria géneket azonosítás és izolálás után olyan megfelelő kifejezési hordozóba illesztjük be, amely a beillesztett génszekvenciák transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemekkel rendelkezik. Az előnyösen felhasználható klónozó hordozóanyagok kromoszómás, nem-kromoszómás és szintetikus DNS szekvenciák szegmenseiből állhatnak, így pl. különböző ismert baktériumos plazmidok, fág DNS, plazmid és fág DNS kombinációk (pl. fág DNS felhasználásával módosított plazmidok) vagy más kifejezési kontroll szekvenciák vagy élesztőplazmidok szegmenseiből. A felhasználható klónozó hordozók a szakember által jól ismertek és csupán példálódzó - tehát nem-korlátozó - jelleggel az alábbiakat soroljuk fel: pEV-vrf plazmidok (peV-vrfl, -2 és -3); SV40; adenovfrus; élesztő; lambda gt-WES-lambda B; Charon 4Aés 28; lambda-gt-11-lambda B; M13-leszármaztatott vektorok pl. pUC8,9, 18 és 19, pBR313, 322 és 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUBllO; pMB9; colEl; pSClOl; pml21; RSF2124; pCRl vagy RP4.
Az Eimeria gének könnyen illeszthetők a klónozó vektorba abban az esetben, ha a géneket és kívánt klónozó hordozót egyazon restrikciós enzim vagy enzimek hasította, illetve hasították; ez esetben ugyanis kiegészítő DNS végcsoportok alakulnak ki. Abban az esetben, ha ez nem végezhető el a kialakított hasítási végek módosítására lehet szükség, éspedig tompa végződések képzése céljából egyszálú DNS-sé történő visszaalakítás vagy ugyanezzel az eredménnyel az egyszálú végcsoportokba megfelelő DNS polimeráz betöltése útján. A fenti módszer segítségével tompa végződésű ligálást megfelelő enzimmel (pl. T4 DNS ligáz) végezhetünk el. Áltematív módon bármely kívánt hely kialakítható nukleotid szekvenciáknak (linkerek) a DNS végcsoportokra való ligálása útján. A fenti linkerek restrikciós helyeket felismerő szekvenciákat kódoló specifikus oligonukleotid szekvenciákat tartalmazhatnak. A hasított vektor és az Eimeria gének továbbá homopolimer farokképzéssel is módosíthatók [lásd Morrow: Methods in Enzymology 68: 3 (1979)].
A jelen találmányunk értelmében felhasználható számos klónozó hordozó egy vagy több olyan marker aktivitást tartalmaz, amelyek a kívánt transzformáns kiválasztásához felhasználhatók, így pl. ampicillin és tetraciklin rezisztencia pBR322-ben, ampicillin rezisztencia és béta-galaktozidáz aktivitás pUC8-ban és ampicillin rezisztencia pEV-vrf2-ben. Azon gazdasejtek, amelyekbe ilyen vektorokat beleillesztettek, lényegesen egyszerűbben választhatók ki abban az esetben, ha a gazdasejt a vektor által bevitt aktivitással egyébként nem rendelkezik.
Megjegyezzük, hogy a klónozó vektor kiválasztott helyén beillesztet Eimeria gének nukleotid szekvenciái olyan nukleotidokat is tartalmazhatnak, amelyek a tényleges strukturális géneknek nem részei. Alternatív módon a gén a teljes „vad-típusú” génnek csupán egy részét tartalmazhatja. Találmányunk szempontjából
HU 212 505 Β csupán arra van szükség, hogy a klónozó hordozóba beillesztett gén fragmensek képesek legyenek megfelelő gazdaszervezetben valamely Eimeria felületi antigén legalább egy immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó polipeptid vagy fehérje termelésének irányítására.
A megfelelő gazdaszervezet kiválasztását az irodalomból ismert számos tényező befolyásolja. Ezek közé tartoznak pl. az alábbiak; a kiválasztott vektorral való kompatibilitás, a hibrid plazmid által kódolt fehérjék toxicitása, a kívánt fehérje kinyerésének egyszerűsége, kifejezési jellemzők, biológiai biztonság és költségek. Az adott gazdaszervezet megválasztásánál az összes fenti tényezőt megfelelően súlyozva vesszük figyelembe. Megjegyezzük, hogy nem minden gazdaszervezet egyformán hatékony meghatározott rekombináns DNS molekula kifejezésére.
A találmányunk szempontjából előnyösen felhasználható egysejtű gazdaszervezetek közül példálódzó azaz nem-korlátozó - jelleggel az alábbiakat soroljuk fel: növényi, emlős vagy élesztősejtek és baktériumok, pl. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus és Actinomyces. Különösen előnyös a Casadaban és tsai által leírt [J. Mól. Bioi. 138, 179 (1980)] Escherichia coli MC1061 törzs. Ez a törzs felhasználható vagy a pRK248cIts plazmidot tartalmazó bármely más E. coli K12 törzs alkalmazható. A más E. coli K12 törzsekben felhasználható pRK248cIts plazmid az American Tfype Culture Collection intézménytől szerezhető be, deponálási szám ATCC 33 766. Az E. coli MC1061 törzs is hozzáférhető, deponálási szám ATCC 53 338.
A rekombináns klónozó vektor többfajta módszerrel vihető be a gazdaszervezetbe. Az adott kiválasztott vektor (gazdasejt rendszertől függően az átvitel transzformáció, transzdukció vagy transzfekció útján végezhető el. Az ily módon módosított gazdasejt ezután tenyészthető és a fehérje kifejezési tennék a tenyészetből izolálható.
A találmányunk szerinti Eimeria fehérjéket termelő kiónok a fehérjékre specifikus, megfelelően jelzett anti-testek felhasználásával azonosíthatók. Az előnyös monoklonális anti-testek standard módszerekkel állíthatók elő.
Eimeria tenellából nyert antigén fehérjék felhasználhatók állatok (pl. egér, patkány, ló, birka, sertés, nyúl stb.) immunizálására, mielóma sejtekkel fuzionálható, anti-testeket termelő szomatikus sejtek előállítása céljából.
Az anti-test termelésére potenciálisan képes szomatikus sejtek (különösen B sejtek) mielóma sejtvonallal fuzionálni képesek. Az ilyen szomatikus sejtek állatok nyirokcsomóiból, lépéből és perifériás véréből nyerhetők. Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint egérlépsejteket alkalmazunk, részben azért, mert ezek a sejtek egér mielómavonalakkal viszonylag magas százalékban stabilan fuzionálnak. Találmányunk céljaira azonban patkány, nyúl, béka vagy más sejtek is felhasználhatók.
Hibridóma termelő fúziós eljárásokban történő felhasználásra [Köhler és Milstein, Eur. J. Immunoi. 6: 511 (1976); Shulman és tsai: Natúré 276 269 (1978); Volk és tsai J. Virol. 42: 220 (1982)] limfocita tumorokból fejlesztettek ki specializált mielóma sejtvonalakat. Ezeket a sejtvonalakat három ok miatt fejlesztették ki. Az első ok a fuzionált hibridómák kiválasztásának megkönnyítése a nemfuzionált és hasonlóság szempontjából meg nem határozott módon ön-szaporodó mielóma sejtek közül. E célból általában olyan enzimhiányos mielómákat alkalmazunk, amelyek a hibridómák növekedését elősegítő bizonyos szelektív táptalajokon nem képesek növekedni. A második ok a limfocita tumorsejtek azon inherens képességében rejlik, hogy saját anti-testjeik termelésére képesek. A monoklonális módszerek alkalmazásának célja olyan korlátlan élettartamú fuzionált hibrid sejtvonalak előállítása, amelyek a hibridóma szomatikus sejtkomponensének genetikai szabályozása mellett a kívánt egyetlen antitestet termelik. A tumorsejt anti-testeknek a hibridómák által történő termelésének kiküszöbölése céljából olyan mielóma sejtvonalakat alkalmazunk, amelyek könnyű vagy nehéz immunoglobulin láncok termelésére nem képesek vagy anti-test kiválasztási mechanizmusukban hiányos mielóma sejtvonalakat alkalmazunk. A fenti sejtvonalak kiválasztásának harmadik oka, hogy hatékony fúzióra kitűnően alkalmasak.
Fuzionált sejthibridek termelésére sok mielóma sejtvonal felhasználható, pl. [P3/X63-Ag 8, P3/NSI/1Ag 4-1, SP2/O-Ag-14 és S194/5. XXO. BU. 1.]. A P3/X63-Ag 8 és P3/NSI/l-Ag 4-1 sejtvonalakat Köhler és Milstein [Eur. J. Immunoi. 6, 511, (1976)] írták le. Shulman és tsai [Natúré 276, 269 (1978)] a Sp2/OAgl4 mielómavonalat fejlesztették ki. Az SÍ94/5. XXO. BU. 1 vonalról Trowbridge számolt be [J. Exp. Med. 148: 313 (1979)]. A jelen szabadalmi leírás példájában a PAI-O egér sejtvonalat [egy nem-Ig-termelő P3/X63-Ag 8 al-klón] alkalmazzuk.
Anti-test termelő lép vagy nyirokcsomó sejtek és mielóma sejtek hibridjeinek képzésénél alkalmazott módszerek során szomatikus sejteket mielóma sejtekkel általában 10:1 arányban keverünk össze (bár ez az arány kb. 20:1 és kb. 1:1 között változhat) a sejtmembránok fúzióját elősegítő anyag(ok) (kémiai, vírusos vagy elektromos szerek) jelenlétében. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy a fúziós eljárás során a szomatikus és mielóma sejtek forrásaként ugyanazt az állatfajt alkalmazzuk. A fúziós módszerek az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre: Kohler és Milstein: Natúré 256: 495 (1975) és Eur. J. Immunoi. 6: 511 (1976); Gefter és tsai: Somatic Cell Génét. 3: 231 (1977); és Volk és tsai: J. Virol. 42: 220 (1982). A fenti szerzők fúziót elősegítő szerként Senday vírust és polietilénglikolt (PEG) alkalmaztak. A jelen szabadalmi leírás példájában ismertetett fúziós eljárásnál PEG-et alkalmazunk.
Minthogy a fúziós eljárások életképes hibrideket nagyon alacsony gyakorisággal termelnek (pl. amenynyiben szomatikus sejtek forrásaként lépsejteket alkalmazunk, lxlO5 lépsejt nagyjából csupán egyetlen hibridet termel), a fuzionált sejthibrideket a többi fuzioná8
HU 212 505 Β latlan sejt közül - különösen a fuzionálatlan mielóma sejtek közül - megfelelő módon ki kell választani. Ezenkívül a kívánt anti-testet termelő hibridómákat a keletkező egyéb fuzionált sejthibridek közül megfelelő hatékony módszertel ki kell mutatni.
A fuzionált sejthibridek kiválasztását általában oly módon végezzük el, hogy a sejteket olyan táptalajon tenyésztjük, amely a hibridómák növekedését elősegíti, az egyébként végtelenül osztódó mielóma sejtek növekedését azonban gátolja. (A fúziónál felhasznált szomatikus sejtek in vitro tenyészetekben hosszabb időn át nem életképesek és ezért nem okoznak nehézségeket). A jelen szabadalmi leírás példájában hipoxantin foszforibozil transzferáz hiányos (HPRT-negatív) mielóma sejteket alkalmazunk. A fenti sejtek közül történő kiválasztást hipoxantin/aminopterin/timidin(HAT) táptalajban végezzük el; ebben a táptalajban ugyanis a fuzionált sejthibridek a lépsejtek HPRT-pozitív genotípusa következtében túlélést mutatnak. Ezenkívül különböző olyan genetikus hiányosságokat (pl. gyógyszer-érzékenység stb.) mutató mielóma sejtek is alkalmazhatók, amelyek a genotipikusan kompetens hibridek növekedését elősegítő táptalajokban kiválaszthatók. A fuzionált sejthibridek szelektív tenyésztése néhány hetet vesz igénybe. A tenyésztés elején a kívánt anti-testet termelő hibrideket későbbi klónozás és szaporítás céljából azonosítani kell. Az anti-testet a kapott hibridek kb. 10%-a termeli, bár ez az arány gyakran 1% és 30% között változik. Az anti-testet termelő hibrideket számos standard meghatározási módszerrel mutathatjuk ki; ezek közé tartoznak az enzimekkel összekapcsolt immunológiai és radioimmunológiai módszerek. A fenti eljárások az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre [Kennet és tsai (szerkesztők); Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, 376-384. oldal, Plenum Press, New York (1980)]. A jelen szabadalmi leírás példájában számos kimutatási módszert ismertetünk.
Amennyiben a kívánt fuzionált sejthibrideket kiválasztottuk és az egyes anti-test termelő sejtvonalakba klónoztuk, minden egyes sejtvonal két standard módszer valamelyikével szaporítható. A hibridóma sejtek szuszpenzióját hisztokompatíbilis állatba fecskendezhetjük be. A befecskendezett állat a fuzionált sejthibrid által termelt specifikus monoklonális anti-testet kiválasztó tumorokat fejleszt ki. Az állat sejtnedveinek (pl. szérum vagy aszcitikus folyadék) összegyűjtésével a monoklonális anti-testek magas koncentrációban nyerhetők. A másik módszer szerint az egyes sejtvonalak laboratóriumi tenyésztő berendezésekben in vitro szaporíthatók. Valamely egyetlen specifikus monoklonális anti-testet magas koncentrációban tartalmazó táptalaj tenyészet dekantálással, szűréssel vagy centrifugálással dolgozható fel.
Az E. coli-ban termelt Eimeria fehéijék a citoplazmában vagy zárványtestekben maradnak. A fehérjék felszabadítása céljából a külső membrán feltörésére van szükség. Ezt a műveletet előnyösen ultrahangos kezeléssel vagy más mechanikus feltörő módszerrel (pl. francia nyomáscella vagy Gaulin-féle homogenizátor) végezhetjük el.
A sejtek továbbá kémiai vagy enzímatikus módszerekkel is feltörhetők. Minthogy a sejtmembrán integritásához gyakran kétértékű kationokra van szükség, megfelelő kelátképző szerek (pl. EDTA vagy EGTA) kellőképpen feltörik a sejtet és ily módon megkönnyítik a fehérjéknek a sejtekből történő kiáramlását. Megfelelő enzimek (pl. lizozim) ugyanezt az eredményt biztosítják. A fent említett enzim ugyanis a sejtfal peptidoglikán vázát hidrolizálja.
A sejtek továbbá ozmotikus sokk alkalmazásával is feltörhetők. Ennek során a sejteket előbb hipertóniás oldatba helyezik, ez vízvesztést és zsugorodást idéz elő. A sejteket ezután hipotóniás „sokkoló” oldatba helyezik, ennek hatására a víz gyorsan a sejtekbe áramlik és a kívánt fehérjéket kiszorítja.
A sejtekből kiszabadított Eimeria fehérjék különböző sókkal (pl. nátrium- vagy ammónium-szulfát) történő lecsapással, ultraszűréssel vagy a szakember által ismert módszerekkel koncentrálhatók. A további tisztítást szokásos fehérjetisztítási módszerekkel végezhetjük el, amelyek közül példálódzó - nem korlátó jelleggel az alábbiakat soroljuk fel: gélszűrés, ioncserélő kromatográfia, preparatív lemez-gél vagy függönyelektroforézis, izoelektromos fókuszálás alacsony hőmérsékleten szerves oldószerrel végzett frakcionálás vagy ellenáramú megoszlás. A tisztítást azonban előnyösen az alábbiakban ismertetésre kerülő immunaffinitásos kromatografálássa! hajthatjuk végre.
A találmányunk szerinti fehéijék vagy fragmenseik továbbá megfelelő módszerekkel (pl. kizárásos szilárdfázisú szintézis, részlegesen szilárdfázisú módszerek, fragmens kondenzáció vagy oldatban végzett klasszikus szintézisek) kémiailag is szintetizálhatók. A szilárdfázisú szintézisek előnyösen végezhetők el a Merrifield által leírt módon [J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)].
A fenti szintézist alfa-amino-végcsoportján védett aminosavakkal hajtjuk végre. A labilis oldalláncot tartalmazó trifunkcionális aminosavak megfelelő csoportokkal védhetők, amelyek a peptid kialakítása közben gátolják a kémiai reakciók lejátszódását a nemkívánt helyen. Az alfa-amino-védőcsoport szelektív eltávolítása után a kívánt reakció az amino-végcsoporton utólag lejátszódik. Az alfa-amino-védőcsoportot olyan körülmények között kell lehasítani, hogy az oldalláncon levő védőcsoportok a molekulában megmaradjanak.
A felhasználható alfa-amino-védőcsoportok a többlépcsős peptidszintézisek kémiájából jól ismertek. Idetartoznak az aciltípusú védőcsoportok (pl. formil-, trifluor-acetil- vagy acetilcsoport), aromás uretántípusú védőcsoportok [pl. benziloxikarbonil-csoport) (Cbz) és helyettesített benziloxi-karbonil-csoportok], alifás uretán védőcsoportok [pl. tercier butoxikarbonil- (Boc), izopropoxikarbonil-, ciklohexilkarbonil-csoport] és alkiltípusú védőcsoportok (pl. benzil- vagy trifenil-metilcsoport). Védőcsoportként előnyösen Boc alkalmazható. T\r esetében oldallánc-védőcsoportként pl. tetrahidropiranil-, tercier-butil-, tritil-, benzil-, Cbz-, 4-brómCbz- vagy 2,6-diklór-benzil-csoport alkalmazható. A Tyr előnyös védőcsoportja a 2,6-diklór-benzil-csoport. Az Asp oldallánc védőcsoportja előnyösen benzil-, 2,69
HU 212 505 Β diklór-benzil-, metil-, etil- vagy ciklohexilcsoport lehet. Az Asp előnyös oldallánc-védőcsoportja a ciklohexilcsoport. Thr és Ser esetében oldallánc védőcsoportként előnyösen acetil-, benzoil-, tritil-, tetrahidropiranil-, benzil-, 2,6-diklór-benzil és Cbz-csoport alkalmazható. Thr és Ser esetében védőcsoportként előnyösen benzilcsoport használható. Az Arg oldallánc-védőcsoportja nitro-, Tos-, Cbz-, adamantiloxikarbonil-, vagy Boc-csoport, előnyösen Tos-csoport lehet. A Lys oldallánc aminocsoportja Cbz, 2-klór-Cbz-, Tos- vagy Boc-csoporttal - előnyösen 2-klór-Cbz-csoporttal védhető meg. Az oldallánc-védőcsoport megválasztása az alábbi szempontok szerint történik: az oldallánc-védőcsoport a kapcsolás folyamán változatlan maradjon és az amino-végcsoport védőcsoportjának lehasításánál vagy a kapcsolási körülmények között ne hasadjon le, ugyanakkor azonban az oldallánc-védőcsoport a kívánt peptid szintézisének befejezése után olyan körülmények között legyen lehasítható, amelyek a célpeptid szerkezetet nem változtatják meg.
A szilárdfázisú szintézist a karboxi-végcsoporton általában oly módon hajtjuk végre, hogy az alfa-aminocsoporton védett (védett oldalláncot tartalmazó) aminosavat megfelelő szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. A kiindulási anyagot klór-metilezett vagy hidroxi-metil gyantához kapcsolva észterkötés alakul ki és a kapott célpeptid a C-végcsoporton szabad karboxilcsoportot tartalmaz. Alternatív módon járhatunk el oly módon, hogy benzhidril-amin vagy p-metil-benzhidril-amin gyantát alkalmazunk; ez esetben amidkötés alakul ki és a kapott célpeptid a C-végcsoporton karboxamid-csoportot tartalmaz. Ezek a gyanták kereskedelmi forgalomban beszerezhetők és előállításukat Stewart és tsai írták le „Solid Phase Peptide Synthesis” (2. kiadás, Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984).
Az oldalláncban Tos-csoporttal és alfa-amino-csoportján Boc-csoporttal védett Arg C-terminális aminosavat különböző aktiválószerek [pl. diciklohexilkarbodiimid (DCC), Ν,Ν'-diizopropilkarbodiimid vagy karbonildiimidazol] felhasználásával kapcsoljuk a benzhidril-amin gyantához. A gyantahordozóhoz történő kapcsolódás után az alfa-amino-védőcsoportot trifluorecetsavval (TFA) vagy sósavval dioxánban 0 C és 25 *C közötti hőmérsékleten eltávolítjuk. Metionin (Met) bevitele után a lehetséges S-alkilezés visszaszorítása céljából a TFA-hoz dimetil-szulfidot adunk. Az alfa-amino-védőcsoport eltávolítása után visszamaradó védett aminosavakat a kívánt peptidszekvencia kialakítása céljából lépésenként kapcsoljuk.
A kapcsoló reakcióknál különböző aktiválószereket alkalmazhatunk, pl. DDC-t, Ν,Ν'-diizopropilkarbodiimidet, benzotriazol-l-il-oxi-trisz-(dimetil-amino)foszfónium-hexafluorofoszfátot (BOP) és DCC-hidroxibenzotriazolt (HOBt). Minden védett aminosavat fölöslegben alkalmazunk (>2,5 ekvivalens) és a kapcsolásokat dimetil-formamidban, metilén-kloridban vagy ezek elegyeiben hajthatjuk végre. A kapcsolási reakció teljesséválását minden lépésben ninhidrin-reakcióval követjük nyomon [Kaiser és tsai; Anal. Biochem. 34, 595 (1970)]. Amennyiben a kapcsolás nem tökéletes, a kapcsolási reakciót megismételjük. A kapcsolási reakciókat automatikusan Vega 250, „Applied Biosystems” szintetizátoron vagy más kereskedelmi forgalomban levő berendezésen végezhetjük el. A célpeptid teljes felépítése után a peptid gyantáról a védőcsoportokat TFA/ditioetán rendszerrel eltávolítjuk, majd megfelelő reagenssel (pl. folyékony hidrogén-fluoriddal) 0 °C-on egy-két óra alatt a peptidet a gyantáról lehasítjuk és az összes oldallánc-védőcsoportot eltávolítjuk.
A szilárdhordozón lejátszatott „oldallánc az oldallánchoz” ciklizációk ortogonális védőrendszerek alkalmazását teszik szükségessé, amelyek a savas aminosavak (pl. Asp) és bázikus aminosavak (pl. Lys) oldalláncában levő funkciós csoportok szelektív lehasítását lehetővé teszik. E célból Asp oldallánca esetében 9-fluorenil-metil-csoport (OFm) és Lys oldallánca esetében
9-fluorenil-metoxikarbonil-csoport (Fmoc) alkalmazható védőcsoportként. A fenti esetekben a Boc-védett peptidgyanta oldallánc-védőcsoportjait piperidinnel dimetil-formamidban szelektíven távolítjuk el. Aciklizációt szilárd hordozón különböző aktiválószerek [pl. DCC, DCC/HOBt vagy BOP] alkalmazásával végezzük el. AHF-reakciót a fentiekben leírt módon ciklizált peptidgyantán hajtjuk végre.
A szintetikus fehérjéket a korábbiakban a rekombináns módon termelt fehérjékkel kapcsolatban leírt módon tisztíthatjuk.
Az Eimeria fehérjék továbbá E. tenella vagy más Eimeria fajok membránfehéije extraktumaiból is kinyerhetők immunokicsapásos vagy immunoaktivitásos kromatográfiával. Ezek a módszerek - mint már említettük - teljes vad-típusú fehérjéket eredményezhetnek. Ezek a fehérjék bizonyos esetekben nagyobbak a rekombináns DNS-módszerekkel termelt fehérjéknél. Az e célra felhasznált monoklonális anti-testek, a korábbiakban ismertetett módon, antigénként szintetikus vagy természetes Eimeria fehéijék felhasználásával termelhetók.
A szükséges immonureaktív és/vagy antigén determinánsokat tartalmazó hasznos fehérjeként továbbá ezek olyan anti-testjei vagy fragmensei alkalmazhatók, amelyek a találmányunk szerinti fehérjék aktív determinánsával vagy determinánsaival szemben anti-idiotipikusak. Az ilyen anti-idiotipikus anti-testek más olyan anti-testek ellen alakíthatók ki, amelyek a találmányunk szerinti fehérjék determinánsaira specifikusak (tehát az anti-idiotipikusan anti-testek anti-antitestek). Előnyösen monoklonális anti-idiotipikus anti-testek alkalmazhatók. Az ilyen anti-testek vakcina formájában az Eimeria fehérjék felhasználásával azonos módon adhatók be.
Egy vagy több találmányunk szerinti Eimeria fehérjét és anti-idiotipikus anti-testet fiziológiailag elfogadható hordozót tartalmazó vakcina formájában készíthetünk ki. Hordozóként pl. 0,01-0,1 M semleges pH értékű foszfát-pufferek vagy fiziológiás konyhasó-oldat alkalmazható.
Kokcidiózissal szembeni fokozott immunitás kétféleképpen alakítható ki. Az egyik módszer értelmében a vakcinához adjuvánst vagy immunopotenciátort adunk.
HU 212 505 Β
A másik módszer szerint a találmányunk szerinti fehérjét nagyobb készítmény formájában (pl. térhálósított komplexként vagy hordozómolekulához konjugálva) adjuk be az immunizálandó állatnak.
Az állatok beoltása során alkalmazható adjuvánsok példáiként nem-korlátozó jelleggel az alábbi anyagokat soroljuk fel: Adjuváns 65 (ez mogyoróolajat, mannid-monooleátot és alumínium-monosztearátot tartalmaz); ásványi gélek pl. alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát és alumínium-oxid; felületaktív anyagok, pl. hexadecil-amin, oktadecil-amin, lizolecitin, dimetil-dioktadecil-ammónium-bromid, N,Ndioktadecil-N,N'-bisz(2-hidroxi-metil)-propándiamin, metoxi-hexadecil-glicerin és pluronikus poliolok; polianionok pl. pirán, dextrán-szulfát, poli IC, poliakrilsav és carbopol; peptidek, pl. muramil-dipeptid, dimetil-glicin és tuftsin; valamint olajemulziók. A fehétjék továbbá liposzómákba vagy más mikrohordozókba beépítve is adagolhatók.
A liposzómákba vagy más mikrohordozókba történő beépítéssel olyan készítményeket állítunk elő, amelyekből a fehérjék hosszabb idő alatt szabadulnak fel. E célra továbbá szivattyúk (pl. Alza szivattyú) is felhasználhatók.
A találmányunk szerinti fehérjék immunogenicitása
- különösen kisebb fragmensek esetében - térhálósítással vagy immunogén hordozó molekulához történő kapcsolással fokozható (utóbbiak olyan makromolekulák, amelyekhez a találmányunk szerinti fehérjék és fehérjeffagmensek kovalens módon kapcsolhatók és a gazdaállatban önmaguk is képesek immunológiai reakció kiváltására). Térhálósításra vagy a hordozó molekulához történő konjugálásra azért lehet szükség, mert a kis fehérjefragmensek bizonyos esetekben hapténként viselkednek (ezek olyan molekulák, amelyek az anti-testhez specifikusan kötődni képesek, azonban anti-test termelésre képtelenek, azaz nem immunogének). Amennyiben az ilyen fragmenseket immunogén hordozómolekulához konjugáljuk, a fragmenseket az ún. „hordozóhatás” révén immunogénné tesszük.
Hordozómolekulákként pl. fehérjék és természetes vagy szintetikus polimer anyagok alkalmazhatók pl. polipeptidek, poliszacharidok, lipopoliszacharidok stb. Hordozóként előnyösen használható a „Quil A” nevű glikozid [lásd Morein és tsai: Natúré 308, 457 (1984)]. Különösen előnyösnek bizonyultak a fehérje hordozómolekulák, amelyek közül példálódzó - nem-korlátozó
- jelleggel az alábbiakat említjük meg: emlős szérumproteinek, pl. kulcslyukkagyló homocianin, humán vagy szarvasmarha gamma-globulin, humán vagy szarvasmarha vagy nyúl szérumalbumin, vagy a fenti fehérjék metilezett vagy egyéb származékai. Egyéb fehérjehordozók kiválasztása a szakember kötelező tudásához tartozik. Előnyösen alkalmazhatók olyan fehérjehordozók, amelyek idegenek a gazdaállat számára, amelyben az Eimeria fehérjék ellen anti-testek termelését idézzük elő; ez azonban nem kötelező jellegű követelmény.
A hordozó molekulához történő kovalens kapcsolást az irodalomból jólismert módszerekkel végezzük el; az adott módszer kiválasztása a hordozó molekula jellegétől függ. Amennyiben immunogén hordozómolekulaként valamely fehérjét alkalmazunk, a találmányunk szerinti fehérjék vagy fragmensek kapcsolását pl. vízoldható karbodiimidek (mint pl. diciklohexilkarbodiimid vagy glutáraldehid) felhasználásával végezhetjük el. A fenti kapcsolószerek továbbá felhasználhatók a fehérjék és fragmensek egymással történő térhálósítására, külön hordozómolekula alkalmazása nélkül. A fehérjébe vagy fehéijefragmens aggregátumba történő térhálósítás is fokozhatja az immunogenitást.
Megfelelő mennyiségű találmányunk szerinti vakcina beadásával baromfi E. tenella fertőzéssel szemben megvédhető. Az E. tenella antigének elleni monoklonális anti-testek E. acervulinával és E. maximával in vitro kereszt-reakcióba lépnek és ez arra utal, hogy a felsorolt fajokkal szemben is védelmet biztosítanak. A fehérjék vagy fehérjefragmensek hatékony dózisa a vakcinával kezelt állat testtömegére vonatkoztatva kb.
10-50 gg/kg testtömeg; az előnyös dózis kb. 2550 gg/kg testtömeg. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy az indító oltás után egy és néhány hét közötti időtartam alatt emlékeztető oltást alkalmazunk. Többszöri emlékeztető oltás adható be. Az emlékeztető oltás dózisa általában kb. 5-50 gg/kg, előnyösen kb. 2050 gg/kg testtömeg. Az oltás standard módszerekkel adható be, pl. szubkutáns, intradermális, intramuszkuláris, orális, anális úton vagy a tojáson keresztül.
A találmányunk szerinti kokcidiális antigéneket oly módon juttathatjuk fiatal madarak immunrendszerébe, hogy az antigéneket kódoló géneket baktériumokba (pl. E. coli vagy Salmonella) vagy vírusokba (pl. himlővírus vagy herpesz vírus) klónozzuk és az élő vektor rendszereket orálisan, befecskendezéssel vagy más szokásos módon adjuk be a madaraknak. Carbit és tsai [Vaccines, (1987), Cold Spring Harbor Laboratory, 6871. oldal] E. Coli, míg Clements [Pathol. Rés. 6, 137 (1987)] Salmonella felhasználását írták le. Moss és tsai [Ann. Rév. Immunoi. 5, 305 (1987)] rekombináns himlővírusok felhasználásával vírusos vektor-rendszerek alkalmazását ismertették.
A himlővírus egy fajtája (tehénhimlő vírus) segítségével kokcidális antigének bevitele a sejttenyészetbe és az állatokba kipróbálható. Analitikai szempontból a tehénhimlő vírus hatékonyabb mint himlővírushordozóként ugyancsak felhasználható baromfi himlővírus. Ennek oka, hogy a tehénhimlő vírus gyorsabban szaporodik a madárvírusnál és gazdaszervezet tartománya nem korlátozódik csirkesejtekre. A tehénhimlő vírus genomba nagymennyiségű heterológ DNS illeszthető be a vírus érettségének és ragályosságának gátlása nélkül [Smith és tsai Gene 25, 21 (1983)]. A többszörös heterológ géneknek a vírus felhasználásával történő beillesztése és kifejezése a fertőzött állatokban kifejezetten antigének elleni anti-test termelését idézi elő [Perkus és tsai Science 229, 981 (1985)].
A rekombináns tehénhimlő vírusok termelésére felhasználható módszerek a baromfihimlő vagy herpeszvírus rendszerekre ismert rutinszerű eljárásokra köny11
HU 212 505 Β nyen adaptálhatók. A fenti rekombináns vírusok különösen előnyösen alkalmazhatók hordozóként kokcidiózis-ellenes vakcinákban, minthogy a beoltott baromfi a kokcidiális antigénnel és a vírus hordozóval szemben egyaránt immunitást fejleszt ki (azaz a fenti vakcinák kettős értékűek). A fentiekben tárgyalt vakcinák felhasználhatósága tovább fokozható olyan módon, hogy a hordozóvírusba további géneket illesztünk be. így pl. baromfihimlő vírusba a kokcidiális antigén génnel együtt Newcastle betegség vírusos genomja illeszthető be és ilymódon egyetlen vakcina segítségével a Newcastle-betegség kokcidiózis és baromfihimlő ellen egyaránt immunitás biztosítható.
A találmányunk szerinti élő vektor vakcinák beadását számos önmagukban ismert módszerrel végezhetjük el. így pl. baromfi madárhimlő vírussal szembeni beoltására ismert „szúrásos” módszert alkalmazhatjuk. Ennek lényege, hogy a szárnyszövetet a vakcinába mártott éles tűvel megszúrjuk. A tű csúcsa közelében rendszerint nyílás helyezkedik el - hasonlóan a varrógéptűhöz - és ez hordozza a vakcinacseppet. Alternatív módon az élő vakcinákat szubkutáns vagy intradermális úton a számyszövetbe vagy más helyre fecskendezhetjük.
A rekombináns élő vektor vakcinákat továbbá az ivóvízhez adhatjuk vagy a beoltandó csirkékre permetezhetjük. A rekombináns élő vektor vakcinák továbbá a takarmánnyal, előnyösen védőkapszulába zárva [Balancou és tsai: Natúré 322, 373 (1986)] adagolható vagy a tojásba juttatható. Utóbbi módszer esetében a vírusos vakcinákat közvetlenül a csirkeembrióba fecskendezzük [Sharma: Avian Dis. 25, 1155 (1985)].
Példa
A példában a szilárd keverékben levő szilárd anyagokra, folyékony elegyekben levő folyadékokra és folyadékokban levő sziláid anyagokra megadott százalékos értékek tömeg/tömeg, térfogat/térfogat illetve tömeg/térfogat %-ban értendők.
1. Eimeria antigének elleni monoklonális anti-testek készítése
1.1. Parazita készítmény
E. tenella, E. acervulina, E. brunetti, és E. maxima sporozoitáit sporulázó oocisztákból standard módszerekkel izoláljuk. A sporulázott oocisztákat desztillált vízzel és 20%-os fehérítő oldattal, majd desztillált vízzel mossuk. Az oocisztákat szövethomogenizátorban feltörjük és az oldhatatlan anyagot - beleértve a sporocisztákat - centrifugálással elválasztjuk. Az üledékben levő felszabadított sporocisztákat és más anyagokat 0,25% tripszint és csirkeepét tartalmazó Hang-féle sóoldatban (pH 8) újra szuszpendáljuk, majd 2 órán át 40 ‘C-on inkubáljuk. Az oldatot 10% magzati szarvasmarhaszérumot (FBS) tartalmazó RPMI-1640 táptalajjal történő kétszeri mosással eltávolítjuk, majd PBS-el pH 7,4 értéken kétszer mossuk.
A sporozoitákat ezután metrazimid gradiensen tisztítjuk [Wisher és tsai Parasitiology 88, 515 (1984)]. A sporozoitákat 2 ml PBS-ben (pH 7,0) újra szuszpendáljuk, majd 1 ml szuszpenziót 15 ml metrizamid gradiens fölé rétegezünk. A gradiens 5-5 ml 12%-os, 18%-os és 24%-os PBS-ben készült metrizamid oldatból áll (pH 7,0). A sporozoitákat 900xg mellett 40 percen át végzett centrifugálással kicsapjuk. A tisztított sporozoitákat a 18%-os és 24%-os metrizamid közötti határfelületről izoláljuk oly módon, hogy a csövecske oldala felől 21 gauge tűt illesztünk be és a sporozoitákat ampullába szívatjuk fel.
A tisztított sporozoitákat PBS-el (pH 7,0) háromszor mossuk és az immunizációs valamint fertőzési vizsgálatokhoz, a 125I-el történő jelzéshez, immunofluoresszencia vizsgálatokhoz vagy SDS-poliakrilamid gél elektroforézishez [Laemli: Natúré 227, 680 (1970)] és „Western blotting” vizsgálatokhoz azonnal felhasználjuk.
E. tenella merozoitáit az alábbiakban a 6.2.3. bekezdésben leírt módon izoláljuk. Az immunizációhoz a tisztított merozoitákat használjuk fel, amelyeket SDSpoliakrilamid gél elektroforézishez és „Western blotting” vizsgálatokhoz Laemli minta pufferben szolubilizálunk.
7.2. Immunizáció nőstény Balb/c egeret (Charles River, Wilmington, Mass) tisztított élő sporozoitákkal és alábbi séma szerint immunizálunk:
1. nap lxlO7 sporozoita intravénásán (i. v.)
7. nap 6xl06 sporozoita intraperitoneálisan (i. p.) 85. nap 6xl06 sporozoita i. p.
120. nap 3xlO7 sporozoita i. p.
244. nap elő-fúziós immunizációs emlékeztető oltás
1. nap 5xlO6 sporozoita i. v. 6xl06 sporozoita i. p.
2. nap ugyanaz mint az 1. napon
5. nap hiperimmun splenociták és mielómasejtek fúziója.
Minden egér szérumában az anti-sporozoita antitesteket tisztított sporozoita fehérjékkel ELISA segítségével meghatározzuk. A tesztet szolubilizált sporozoita fehérjékkel végzett „Western blotting” meghatározással, 12sI-jelzett sporozoita felületi fehérjékkel végzett immunolecsapással és tisztított sporozoitákkal végrehajtott immunofluorsszenciával végezzük el. Az előfúziós immunizációs emlékeztető oltáshoz a legmagasabb sporozoita anti-test reaktivitást mutató egeret (107-2 egér) választjuk ki (lásd 1. ábra, a fenti antiszérum ELISA analízise). Az egeret az 5. napon leöljük és a splenociták kipreparálása céljából a lépet eltávolítjuk.
1.3. Sejttenyészet és sejtfúziók
A fúzió előtt két nappal naive egérből teljes táptalajban [Iscove által módosított Dulbecco-táptalaj (IMDM, Gibco), amely 10% FBS-t, 2,0 mM glutamint és 100 μΜ 2-merkapto-etanoIt, valamint HAT-ot (100 μΜ hipoxantin, 0,4 μΜ aminopterin és 16 μΜ timidin) tartalmaz] splenocita tápláló sejteket készítünk. A de St. Groth és tsai eljárásának [J. Immunoi. Methods 35, 1 (1980)] módosításával 108 lépsejtet 108 PAI-0 egér mielóma sejttel fuzionálunk. Hibridómák készítésére alkalmas bármely más mielóma sejt is fel12
HU 212 505 Β használható. A fenti mielóma sejtek száma ismert és meghatározása a szakember kötelező tudásához tartozik.
A sejteket összekeverjük, centrifügálással ülepítjük és 1,0 ml 35 térfogat/térfogat%-os IMDM-ben készített polietilénglikolban enyhe állandó keverés közben 37 ’C-on egy percen át újra szuszpendáljuk. Ezután 37 ’C-on 3 percen keresztül inkubáljuk, majd a sejteket újra ülepítjük és 10 ml IMDM+HAT keverékben enyhe kevergetés közben újra szuszpendáljuk. A sejteket teljes táptalaj+HAT keverékkel lxlO6 sejt/ml értékre hígítjuk, majd 24 mélyedést tartalmazó mikrotiter lemezekre öntjük (1 ml/mélyedés), amelyek 1 ml teljes táptalajban 5xl05 splenocita tápláló sejtet tartalmaznak.
A hibridóma felülúszókat anti-sporozoita anti-testekre tisztított sporozoitákkal ELISA segítségével teszteljük. A meghatározást sporozoita fehérjékkel, „Western blotting módszerrel”, l25I-jelzett sporozoita felületi fehérjékkel végzett immunolecsapással, valamint tisztított sporozoitákkal és sporozoita-fertőzött sejtekkel végzett immunofluoreszcenciával hajtjuk végre. A hidridómákat korlátozott hígítással klónozzuk.
1.4. Sporozoita ELISA mélyedést tartalmazó U-fenekű PVC lemez minden mélyedésébe 4xl04 tisztított sporozoitát helyezünk; a lemezt előzetesen 1% BSA-t tartalmazó PBS-el (pH 7,0) blokkoltuk. A sporozoitákat lOOOxg mellett 5 percen át végzett centrifügálással a mélyedések aljára lecsapjuk. A sporozoitákat 100 μΐ hígított antiszérumban vagy hibridóma felülúszóban újra szuszpendáljuk és 2 órán át szobahőmérsékleten állandó keverés mellett inkubáljuk. A sporozoitákat ezután a megnemkötött anti-test eltávolítása céljából 1% PSA-t tartalmazó PBS-el (pH 7,0) mossuk.
A sporozoitákhoz kötött specifikus anti-test kimutatása céljából az újra szuszpendált sporozoitákhoz 100 μΐ peroxidáz-konjugált kecske anti-egér IgG-t adunk és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A sporozoitákat mossuk és a megkötött anti-testet oly módon tesszük láthatóvá, hogy szobahőmérsékleten 30 percig szubsztrátum-oldatot [o-feníléndiamin, 0,4 mg/ml 0,1 M citrát pufferben, pH
4,5, 0,12% hidrogénperoxid] adunk hozzá. A reakciót 50 mM nátrium-metabiszulfitot tartalmazó 2,5 M kénsav hozzáadásával leállítjuk. A megkötött anti-test mennyiségét a szubsztrátum színének leolvasásával határozzuk meg (OD4gg mellett; OD = optikai sűrűség).
A sejtfúzióból szélesztett összesen 480 mélyedés közül 432 pozitív hibridóma növekedést mutatott. Ezek közül 358 hibridóma a primer sporozoita ELISA-ban anti-test termelésre pozitívnak bizonyult. A fenti eredeti szülő hibridóma sejtek expanziója és átvitele során 104 elpusztult van anti-test termelése leállt és ilymódon ezek a későbbi sporozoita ELISA és „Western biot” screening során negatívnak bizonyultak. A sporozoita ELISA 205 olyan hibridomát azonosított, amelyek 10X háttér szinten anti-testet termeltek.
1.5. Sporozoita fehérjék „Western blotting meghatározása
Tisztított sporozoitákat [kb. 5xl07 sporozoita/ml/gél] Laemmli-féle mintapufferben szolubilizálunk, SDS-poliakrilamid-gél elektroforézissel 12,5%-os gélben vagy 7,5-20% gradiens gélben Laemmli, lásd fent) szétválasztunk és elektroforetikus úton mikrocellulóz lapokra átvisszük. A lapokat 3%os zselatin pufferben (3% zselatin, Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M nátrium-klorid) blokkoljuk, csíkokra vágjuk és a csíkokat hígított antiszérummal vagy hibridóma felülúszóval 4 ’C-on, 12 órán át, 1%-os BSA pufferben (1% BSA, 50 mM nátrium-foszfát, pH 6,5, 0,5 M nátrium-klorid, 0,05% Tween-20), reagáltatjuk. A csíkokat PBS-el (ph 7,4, 0,05% Tween-20) mossuk és specifikusan kötött anti-testet peroxidázkonjugált anti-egér/anti-testtel mutatjuk ki. A megkötött anti-testeket oly módon tesszük láthatóvá, hogy szobahőmérsékleten 30 percig szubsztrátumoldatot [30 mg, 10 ml jéghideg metanolban és 50 ml trisz-HCl-ben (pH 7,5) oldott 4-klór-l-naftolt, 0,15 M nátrium-kloridot és 0,015% végső koncentrációban hidrogén-peroxidot tartalmaz] adunk hozzá. A reakciót desztillált vízzel történő alapos mosással fejezzük be.
A sporozoita ELISA-ban pozitív anti-testek közül 160 a szolubilizált sporozoita fehérjék felhasználásával végzett „Western blotting” analízis szerint is pozitívnak bizonyult.
A „Western biot analízis” (lásd 2. ábra) azt mutatja, hogy a monoklonális anti-testek 3 fajta reaktivitás-modell valamelyikének felelnek meg:
(a) amelyek egyetlen Eimeria fehérjéhez (pl. 11A1 és
11D1) kötődnek;
(b) amelyek 2 vagy 3 fehérjéhez (pl. 6A5 és 20C6) kötődnek; és (c) amelyek több fehérjéhez (pl. 11A5, 13A6, és 14B5) kötődnek.
Az anti-testeket továbbá E. tenella merozoita és E. acervulina sporozoita fehérjék felhasználásával végzett „Western biot analízis” segítségével jellemezzük (3. ábra). Számos anti-test (beleértve 3A5, 13A6, 7D1 és 20C6) az E. tenella és E. acervulina sporozoitákból valamint E. tenella merozoitákből izolált fehérjéket felismerik. Más anti-testek (pl. 6A5) fajokra és szakaszokra specifikusak és csak az E. tenella sporozoitákból nyert fehérjékhez kötődnek.
Néhány anti-testtel kapott eredményeket az 1. táblázatban foglalunk össze. Az anti-testek specifikusságát (a) azon fehérje vagy fehérjék eredete és nagysága alapján, amely(ek)hez az anti-testek a gélben kötődnek, valamint (b) az anti-testek által lecsapott 125I-jelzett Eimeria tenella fehérjék nagysága szerint (jobboldali oszlop) mutatjuk be. Az anti-testeket a táblázatban továbbá izotípus segítségével jellemezzük:
HU
I. táblázat
WESTERN BLOT ANALÍZIS
Anti- test Izotf- pus Eimeria fehérje (gél nagyság kDban) Lecsapolt fehérje nagysága (kD)
Tenella Acer- vulina Maxi- ma
Spz Mrz Spz Spz
7B2 G2a >200 - - - -
7D4 G, 120 120 120 - 110
7D1 G| 120 120 120 N. D. 110
2OC6 G. 120 120 120 N. D. 110
3A5 M 120 120 120 17 120
19D6 g3 180 180 - - 120
8A2 G2a 37 37 - - 37
6A5 G2b 28/26 - - - 25
14B5 N. D. >150 N. D. N. D.
15B3 N. D. >150 N. D. N. D.
14B1 g3 6 6 - - 24/17
12B2 g3 28/26 - - - 24/17
15A3 G, 28/6 - - - 17/15/6
15C4 M 28/26 - - - 105/15/ 6
12C3 g3 28 - N. D. N. D. 25
5B6 g3 - N. D. 6
3C4 M m m m - 70
16D2 M m m m - 70/85
13A6 M m m m - 110
11B6 g3 m m m - 105
12A3 g3 m m m - 24/17
12D4 G, m N. D. N. D.
„Spz” és ,ΛΙγς a sporozoita illetve merozoita szavak rövidítését jelenti;
„G” és „M” az IgG-re illetve IgM-re vonatkozik;
,jn” azt jelzi, hogy az anti-testek több fehérjéhez kötődnek, amelyek nagysága 24 és >200 kD közötti érték;
,J4. D. = az értéket nem határoztuk meg.
1.6. i25I-jelzett sporozoita felületi fehérjék immunolecsapása
Tisztított sporozoiták felületi fehérjéit 125I-al jelezzük a IODOGEN módszer szerint (Pierce Chemical Co.) vagy IODOBEAD felhasználásával (Pierce Chemical Co.). Az utóbbi eljárás során négy IODOBEADet 0,2 M nátrium-foszfát-oldattal (pH 7,5) háromszor mosunk és 1-3 mCi 125I-Na-t adunk hozzá, majd szo505 B 2 bahőmérsékleten 5 percen át inkubáljuk. Tisztított sporozoitákat (3xl08) 200 μΐ PBS-ben (pH 7,0) a reakcióampullához adunk és az inkubálást 15 percen át folytatjuk. Az inkubálás végén fenil-metánszulfonil-fluoridot (PMSF) adunk hozzá; a végső koncentráció 0,5 mM.
A sporozoitákat az inkubációs elegyből 12 OOOxg mellett 30 percen át végzett centrifugálással kinyerjük és 1 ml, 2%-os nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) vagy 1%-os Triton Χ-100-t tartalmazó PBS-oldatban (pH 7,0) szolubilizáljuk. Az oldhatatlan anyagot centrifugálással (12 OOOxg, 3 perc) eltávolítjuk. A szolubilizált sporozoita fehérjéket 3 liter PBS-el szemben (pH 7,0) 4 ’C-on dializáljuk, a maradék szabad 125I-t 2500 molekulatömegű membrán alkalmazásával távolítjuk el. A 125I-jelzett sporozoita fehérjéket (tipikusan l,5xl08 cpm épül be a fehérjébe) felhasználásig 4 ’C-on tároljuk. A TCA lecsapható radioaktivitás általában a teljes raidoaktivitás 95%-a feletti érték. A 125I-jelzett sporozoita fehérjék SDS poliakrilamid-gél elektroforetikus analízisét a 4. ábra baloldali részén tüntetjük fel.
Az immunolecsapást oly módon végezzük el, hogy 250 μΐ 125I-jelzett sporozoita fehéijéhez (lxlO5 cpm) I pufferben (0,25% NP-40, 10 mM trisz HC1, pH 7,5, 0,15 M nátrium-klorid) 300 μΐ hibridóma felülúszót vagy hígított antiszérumot adunk. Az inkubálást 16 órán át 4 ’C-on végezzük el, majd agarózhoz kapcsolt kecske anti-egér IgG (Sigma Chemical Co.) 50%-os szuszpenziójából 100-200 μΐ-t adunk hozzá. Az elegyet forgó keverőberendezésben szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A szemcséket 12 OOOxg mellett egy percen át végzett centrifugálással ülepítjük, majd pufferrel (0,1% SDS, 0,5% NP-40, 0,2% nátrium-deoxikolát, 10 mM PMSF, 10 mM trisz-HCl, pH 8,5 0,15 M nátrium-klorid) háromszor mossuk.
A szilárd fázisú anti-testekhez kötött 12JI-jelzett fehérjéket felszabadítjuk, 2x60 μΐ Laemmli puffer minta puffer hozzáadásával denaturáljuk, majd 95 ’C-on 3 percen át melegítjük. Az immunolecsapott 125I-jelzett sporozoita fehérjéket 12,5%-os gélben SDS poliakrilamid gél elektroforézissel elválasztjuk és autoradiográfia segítségével láthatóvá tesszük.
Az immun egér szérummal végzett immunolecsapásos meghatározás eredményeit a 4. ábra jobboldali részén tüntetjük fel. A sporozoita ELISA szerint pozitív hibridóma anti-testek közül 74 az immunolecsapásos meghatározás szerint is pozitívnak bizonyult. A hibridóma anti testek az 5. ábra szerint két csoportba sorolhatók: egyrészük csak egy fehérjét csap le (pl. 3C4, 6A5, 7D4, 8A2, 11D2, és 20C6), mások két vagy több fehérjét csapnak le (pl. 12B2, 15A3, 15C4 és 19D6).
1.7. Tisztított sporozoitákkal végzett immunofluoreszcensz meghatározás
Sporozoitákat (lxlO3) PBS-ben (pH 7,0) nyolckamrás lemezekhez (Láb Tek) adunk és levegőn 12 órán át 37 ’C-on szárítunk. A lemezeket 10%-os normál kecske szérummal 2 órán át 37 ’C-on blokkoljuk.
HU 212 505 Β
Minden kamrához hígított antiszérumot vagy hibridóma felülúszót adunk és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A lemezeket mossuk és rodamin-konjugált anti-egér anti-testet (PBS-ben hígított, pH 7,0, 0,3% Triton X-100) egy órán át szobahőmérsékleten hozzáadunk. A lemezeket mossuk, majd a megkötött anti-testet a fluoreszcenciával tesszük láthatóvá.
A legtöbb anti-test a felületi membránnal és/vagy a levegőn szántott sporozoiták fénytörő testjeivel specifikus immunfluoreszcenciát mutat (6. ábra, A és B panel). Néhány anti-test a sporozoita csúcsvégződését intenzíven színezi és a sporozoita maradék felületet csak enyhén festi meg (6. ábra C panel). A levegőn szántott tisztított sporozoitákat a 6. ábra A, B, C és D paneljének baloldali részén mutatjuk be. A tisztított sporozoiták épek és megnyújtottak és szembetűnően nagy hátsó fénytörő testet (PRB) és kisebb elülső fénytörő testet (ARB) mutatnak. A sporozoiták (A) csúcsvégződése a hátsó fénytörő testtel szemben helyezkedik el. A készítmények továbbá intakt (ép) sporocisztákkal (B panel baloldali lemez) és megtört sporociszta membránokkal enyhén szennyezettek.
1.8. ELISA, „ Western Biot”, immunolecsapás és immunofluoreszcencia eredmények összefoglalása 55 monoklonális anti-testtel a fenti analízisek során kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
Monoklonális anti-test analízisek összefoglalása
Anti- test E. tenella Spz.® WESTERN BLOT IFAe Immu- nole- csapás'
Ala- csony Spz. E. acervu- lina Spz.c E. tenella Mz.d
3C4 M1 - 60-80
11B6 M1 + + + 1,2,4 105
12A5 M1 - - - 1 -
14D4 M1 + + + 1,3,4 66
15B6 M1 1,4,7 20-24
17A5 M* + + 1 150/83
18B6 M1 + + + - 25/20 66/60
19C6 M1 + + + 1,2 25/20
20A2 M1 + + + 5 66/60
20B4 M1 + + + 1,4 86/60
11C4 M2 + - 1,6 -
12A3 M2 - - - 1,4,7 22/24
13A6 M2 + + + 1,5 110
14B6 M2 1,4,7 105- 120
14D1 M2 - 120
Anti- test E. tenella Spz.® WESTERN BLOT IFAe Immu- nole- csapás'
Ala- csony Spz. E. acervu- lina Spz.c E. tenella Mz.d
9B2 M3 + + + 5 66/45
12B1 M3 + - - 6 26-28
14C6 M3 - - - 105
15C4 M3 + - - 6 105
16D2 M3 - 60-80
20C3 M3 + + + 3 14-17
3A5 120 + + + 3 -
6A4 120 - -
7D1 120 + + 1,2,4 110
7D4 120 + + 5,1 110
10A6 120 + - - 1,2,6 105
11D2 120 - - - 4, 1,2 105
14A1 120 - - - 6,1 110
17B6 120 - - - 1,6,7 120
17C6 120 - - 8,1 105
19D6 120 + - - 3 120
20C6 120 + + + 1,2 110
10A5 >150 - - 7,5 105
11A6 >150 - - - 3 -
7B2 >200 + - >200
1 IBI >150, 200 - - - 1,7,6 27
11D4 120/24 + - - 1 27
11D6 120/24 + - - 1,8,2 25
12C3 120/24 + - - 2 -
15B2 120/24 + + + 3 -
15A3 90/10- 14 + - - 1,6 28/14- 17
14C3 60 - - - 1,4 6
14A5 120/6 - - - 1,3,6 6
8A2 37 + + - 1,4 37
6A5 28, 1014 + - - 1,6
11A1 24 + - - 1,6 5—
11C1 24 + - - - -
12B2 24 + - - 1,5 24/120
12C6 24 + - - - -
16B1 24 + - - l,4j 6/14— 17
HU 212 505 Β
Anti- test E. tenella Spz.a WESTERN BLOT IFAe Immu- nole- csapásf
Ala- csony Spz. E. acervu- lina Spz.c E. tenella Mz.d
18D5 24 + - - 1.6 48/25/6
20C4 24 1,3 5/14- 17
14B1 <6 + - - 1,6 20-24
10A2 - - 1,2,4 6/105
5B6 - 1,6 6/17/5
a = A feltüntetett értékek „Western biot” meghatározás során az anti-testek által felismert E. tenella sporozoita (Spz.) fehérjék vagy 40-150 kD (Ml), 120 és 80-150 kD (M2) és 25 és 40-150 kD (M3) molekulatömegű felismert fehéijék csoportjainak molekulatömegei.
b = A „Western biot meghatározást az E. tenella sporozoita (Spz) szokásos mennyiségének egyötödével végezzük el. A pozitív reakciót mutató anti-testek ennek megfelelően magasabb affinitásúak.
c = A „Western biot” reaktivitást E. acervulina sporozoita fehérjékkel (Spz) szemben mutatjuk be.
d = A „Western biot reaktivitást E. tenella merozoita (Mz) fehérjékkel szemben mutatjuk be.
e = Levegőn szárított E. tenella sporozoiták közvetett meghatározása céljából immunofluoreszcensz megfestő vizsgálatok eredményét az alábbiak szerint adjuk meg: (1) felület; (2) csúcs; (3) foltos felület; (4) fényes felület; (5) világos felület; (6) diffúz felület; (7) fénytörő test és (8) pettyes festés.
f = Az immunolecsapásos meghatározás (Immunoppt) során az anti-testek által befogott 1251-jelzett E. tenella sporozoita fehéijék molekulatömegét adjuk meg.
Az előnyös 7D4, 7D1, 20C6, 8A2, 6A5 és 7B2 monoklonális anti-testeket az ezeket kiválasztó hibridóma sejtek formájában az Americal Type Culture Collection 12 301 Parklawn Drive Rockville Maryland (Amerikai Egyesült Államok) intézménynél, A Budapest Szerződés előírásainak megfelelően, HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 és HB 9712 számon helyeztük letétbe 1988. 05. 05-én.
1.9. Irt vitro fertőzéses meghatározások
Primer csirkevese-hámsejtek Dórán és tsai módszerével [J. Protozool. 25, 544 (1978)] izolálunk és nagykamrás Lab-Tek lemezekben 40-50%-os egybeolvadásig tenyésztünk. Csirkevese-hámsejtek helyett MDBK (Madin-Darby szarvasmarhasejteket, ATTC-CCL 22) is alkalmazunk.
A sejteket 50 000 vagy 200 000 tisztított sporozoitával beoltjuk. A fertőzés után 16 órával a sejt monorétegeket a sejtekbe be nem hatolt sporozoiták eltávolítása céljából többször mossuk. A beoltott sejttenyészetek egyes képviselőit 100%-os metanolban (szobahőmérsékleten, 5 percen át) a fertőzés utáni 3., 16., 24., 48., 64., 96. és 120. órában fixáljuk. A rögzített lemezeket
1%-os, PBS-ben készített BSA-ban (pH 7,0) 4 °C-on az immunofluoreszcenciás feldolgozásig tároljuk. A különböző anti-testekkel végzett festések eredményeit a 7. ábrán tüntetjük fel.
A fertőzés utáni 3. és 24. óra között a rögzített tenyészetek intracelluláris sporozoitákat mutatnak (7. ábra, 7D4 a 3. órában és 8A2 a 19. órában). A továbbiakban a sporozoiták csak fénytörő testekké degenerálódnak (7D4, 60 óra). Az intracelluláris sporozoiták felületét és csúcsvégződését a 7D4 anti-test fényesre színezi 7. ábra, 7D4 3. óra); ez az anti-test azonban a fertőzött sejtek felületét nem festi meg.
A sporozoiták degenerálódása 24 óra múlva megkezdődik és skizontok alakulnak ki, amelyek a következő 48 órában megérnek. A 7D4 anti-test a degenerálódó sporozoitákkal továbbra is reagál, az éretlen skizontokkal azonban nem lép reakcióba (7. ábra, 7D4, 60. óra). A skizontok megérése után azonban a 7D4 a skizonton belüli szerkezetekkel reagálni kezd (7. ábra, 7D4, 100. óra). Ezek a szerkezetek a kifejlődő merozoiták és a 7D4 anti-test az érett és felszabadított merozoiták felületi antigénjével továbbra is reagál (7. ábra, 7D4, 120. óra).
Ennek megfelelően a 7D4 az E. tenella sporozoitákban és merozoitákban jelenlevő 120 kD membrán antigént azonosít. Ez az antigén a parazita fejlődés skizont szakasza folyamán nem fejlődik ki egészen addig, amíg a skizonton belül éretlen merozoiták ki nem fejlődnek.
A 14B1 anti-test reaktivitásának típusa a 7D4 antitestéhez hasonló, éspedig az intracelluláris sporozoiták felületét és csúcsát megfesti (8. ábra, 14B1, 16 óra) és az intracelluláris sporozoita közvetlen közelében a citoplazmát diffúzán megfesti. A 14B1 által elismert antigén az érett skizonton belül az éretlen merozoita csúcsvégződésén (8. ábra, 14B1, 100 óra) és az érett felszabadított merozoiták csúcsvégződésén (8. ábra 14B1, 120 óra) van jelen. A 7D4 és 14B1 anti-testek hasonló megfestést eredményeznek, azonban a fenti anti-testek fehérjéinek molekulatömege nagymértékben eltérő, éspedig kb. 120 illetve 6 kD.
Bár a 7D4 és 14B1 anti-test a parazita fejlődés legtöbb szakaszával reagál, más anti-testek csak a felületi antigénekkel (7. ábra 15A3) vagy az intracelluláris sporozoiták fénytörő testével (7. ábra 7A2) reagálnak, míg a parazita skizont vagy merozoita fejlődés szakaszával nem lépnek reakcióba.
Fertőzéses meghatározással két egyedülálló antitestet (8A2 és 19D6) azonosítunk. A 8A2 anti-test a sporozoiták felületén levő 37 kD fehérjével (7C ábra, 8A2, 19 óra), a fejlődő skizon minden szakaszában (7C ábra, 8A2, 120 óra) és a felszabadított merozoiták felületén (7C ábra, 8A2, 120 óra) reagál. A 7D4 és 14B1 anti-testek által felismert fehéijékkel ellentétben a 37 kD fehérje a parazita intracelluláris fejlődés teljes folyamatában szintetizálódik.
A 19D6 anti-test nemcsupán a 180 kD sporozoita felületi fehérjével, hanem a sporozoita által fertőzött sejt citoplazmájában levő feltétjével is reagál (8. ábra, 19D6, 3 óra). A 19D6 anti-test által felismert citoplaz16
HU 212 505 Β ma fehérjét a sporozoita a sejtfertőzés után bocsáthatja ki, minthogy a fehérje az éretlen skizont fejlődés szakasz alatt eltűnik és az érett skizontban valamint a felszabadított merozoitákban ismét megjelenik (8B ábra, 19D6,120 óra).
E. tenella fertőzést túlélő csirkékből nyert szérum anti-testek az intracelluláris sporozoiták csúcsvégződését és felületét a 7D4 anti-testhez hasonló módon festik (8B ábra, immun csirke szérum, 3 óra), azonban az intracelluláris sporozoiták fénytörő testjeit nem festik meg.
Sporozoiták által fertőzött csirkevesesejtekkel végzett immunofluoreszcencia vizsgálatok olyan antigéneket azonosítanak, amelyek (a) a sporozoitával szemben specifikusak (azaz a 7B2 illetve 6A5 anti-testek által felismert >200 és 28 kD fehérjék), (b) az intracelluláris parazita valamennyi szakaszában előfordulnak (pl. a 8A2 által felismert 37 kD fehéije) és (c) sporozoitákkal és merozoitákkal szemben specifikusak, azonban skizonttal szemben nem (pl. a 7D4 illetve 14B1 anti-testek által felismert 120 illetve 6 kD fehérjék).
1.10. In vitro sporozoita semlegesítési vizsgálatok
Schmatz és tsai [J. Protozool. 33, 109 (1986)] módszerének módosításával MDBK sejteket tripszinizálunk és 1 % FBS-el kiegészített minimális esszenciális táptalajon (Gipco) 7,5x104 sejt/ml sűrűség mellett szuszpendálunk. A mikrotiter lemez minden mélyedéséhez (a sejttenyészetet 96 mélyedésbe töltjük) 1,5x1ο4 sejtet adunk és 40 C-on 48 órán át inkubáljuk. A tisztított sporozoitákat anti-testtel 1 órán át 40 ’C-on előkezeljük vagy a sejt monoréteggel történő fertőzés előtt kezeletlenül hagyjuk. Az anti-testeket (sejttenyészet felülúszó, aszcitikus folyadék vagy antiszérum) PBS-el szemben (pH 7,0) extenzíven dializáljuk, 56 ’C-on 30 percen át hővel inaktiváljuk és felhasználás előtt sterilen szűrjük.
Közvetlenül fertőzés után minden mélyedéshez 5 pCi/ml végső koncentrációban [5,6]-3H-uracilt adunk. A fertőzés után 19 órával a táptalajt eltávolítjuk és a tenyészeteket PBS-el egyszer mossuk. A sejteket tripszin-LDTA-val 40 ’C-on 15 percen át felszabadítjuk, majd üvegszálas szűrőkön összegyűjtjük. A szűrőket szárítjuk, szcintillációs folyadékba helyezzük (READY-SOLVR, New England Nuclear) és a megkötött radioaktivitást megszámláljuk. Az anti-testeknek a sporozoiták behatolását és/vagy kifejlődését gátló hatását oly módon határozzuk meg, hogy a kezeletlen sporozoitákkal fertőzött sejtekbe épült radioaktivitást összehasonlítjuk az anti-testtel kezelt sporozoitákkal fertőzött sejtek megfelelő értékeivel.
A sporozoitákat kontroll anti-testekkel, pufferrel vagy lasalociddal (kokcidiosztatikus gyógyszer) is előinkubáljuk. A lasalocid teljesen gátolja a sporozoiták kifejlődését az MDBK sejteken belül és nagymértékben csökkenti a 3H-uracil beépülését.
Az eredményeket a 9. ábrán tüntetjük fel. Látható, hogy a 7D4 (□ ), 8A2 ( o ) és 14B1 ( ·) anti-testek szignifikáns mértékben gátolják a 3H-uridin beépülését a fertőzött MDBK tenyészetekbe. A 6A5 anti-test ( ) kevésbé hatékony, azonban bizonyos gátlást mutat. A pufferrel ( Δ) és kontroll-anti-testtel (X) történő kezelés nem eredményez gátlást, míg a lasalocid (* ) lényegében teljes gátlást idéz elő.
2. cDNS kifejezési könyvtár felépítése
2.1. Sporulázó oociszták készítése hetes csibék (Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, New Jersey, USA) vakbelét madaranként 50 000 E. tenella sporulázott oocisztával történő fertőzés után 7 nappal eltávolítjuk és Waring-féle keverőben desztillált vízzel egy percen át őröljük. A térfogatot desztillált vízzel 1 literre egészítjük ki, majd 3 g/liter mennyiségben pepszint (Sigma Chemical Co., St. Luois, Missuori, USA) adunk hozzá. A pH-t tömény sósavval 2,0 értékre állítjuk be, majd az elegyet keverés közben 39 ’C-on 2-3 órán át vagy egyetlen oociszta szuszpenzió megfigyeléséig keverjük. Az emésztés után a pH-t 10η nátrium-hidroxi-oldattal 8,0 értékre állítjuk be és 3 liter desztillált vizet adunk hozzá. Az elegyet egy éjjelen át ülepedni hagyjuk. A felülúszót eltávolítjuk és a csapadékot vízzel addig mossuk, amíg a felülúszó átlátszóvá válik. Az oocisztákat oly módon sporuláztatjuk, hogy a desztillált vízzel képezett szuszpenzión szobahőmérsékleten levegőt fuvatunk át. A sporulázást az RNS készítmény előállításához 24 óra múlva leállítjuk.
2.2. Sporulázó mRNS oociszta izolálása
Maniatis és tsai guanidinium/cézium-kloridos módszerének (fentidézett közlemény 196. oldal) módosításával teljes RNS-t készítünk. Az oocisztákat PBS-el (0,15 M nátrium-klorid 20 mM nátrium-foszfát pH 7,9) mossuk és enyhe keverés közben 10 ml oldatban [ez 5 M guanidin-izotiocianátot, 50 mM trisz-HCIt, 10 mM etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA), 0,5% szakozik (nátrium-N-lauroil-szarkozin, Sigma Chemical Company) és 0,1 M béta-merkapto-etanolt tartalmaz; pH 7,4] újraszuszpendáljuk és 5 μΐ habzásgátló A-t (Union Carbide, Danbury, Connecticut, USA) vagy más habzásgátlót adunk hozzá. A sejtszuszpenziót addig homogenizáljuk, amíg mikroszkopikusan jó oociszta feltörést tapasztalunk.
Az oldhatatlan sejtmaradványokat alacsony sebességgel végzett centrifugálással elválasztjuk, a homogenizátumot 4 aliquot részre osztjuk és 12 ml-es polikarbonát csövekben 1,2 ml, 5,7 M CsCl-t, és 0,1 M EDTA-t tartalmazó (pH 7,5) oldat fölé lélegezzük. A csövecskéket percenkénti 40 000 fordulat mellett Beckman SW 50.1 rotorban 17 órán át 15 ’C-on centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, a csövecskék falát megszárítjuk és az üledéket 1,25 ml oldatban [10 mM triszHC1, 1 mM EDTA, 1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), pH 7,5] 200 pg/ml proteináz K (Boehringer-Mannheim) jelenlétében újra szuszpendáljuk. Az inkubálást 37 ’C-on 30 percen át végezzük, majd az oldatot fenollal háromszor extraháljuk. A végső vizes fázisban levő RNS-t etanollal háromszor lecsapjuk, majd 1 ml vízben oldjuk.
Poliadenilezett [poli(A)+] RNS-t oly módon készí17
HU 212 505 Β tünk el, hogy kb. 2 mg teljes RNS-t Maniatis és tsai által leírt módon (lásd fent idézett közlemény 197. oldal) oligo(dT)-cellulóz oszlopon (Pharmacia Fine Chemicals) vezetünk át. A poli(A)+ RNS-t etanollal kétszer lecsapjuk és 200 μΐ vízben oldjuk. Kitermelés kb. 26 pg (a 260 nm mellett mért optikai sűrűségből számítva).
2.3. Merozoiták készítése
E. tenella merozoitákat 50 fertőzött csirke (3 hetes Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, NH) vakbeléből, a madarak 50 000 fenti sporulázott oocisztával történő megfertőzése után 5 nappal izolálunk. A vakbelet eltávolítjuk és foszfáttal pufferezett nátrium-kloridoldattal (PBS) mágneses keverő alkalmazása mellett 15 percen át mossuk. A hámmaradványokat kis sebességgel végzett centrifugálással (50xg) részlegesen eltávolítjuk és a nyers merozoitákat 2000xg mellett 4 ’Con 10 percen át végzett centrifugálással kinyerjük. Az üledéket lízing pufferben [8,29 g/liter ammónium-klorid, 0,372 g/liter Na2EDTA, 1,0 g/liter kálium-karbonát, pH 7,6] újra szuszpendáljuk és jégen 30 percen át inkubáljuk. A merozoitákat centrifugálással összegyűjtjük, PBS-ben egyszer mossuk és 1,0 g fonott nylonszálat (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, Illionis, USA) tartalmazó, választótölcsérben levő oszlopon átvezetjük. A merozoitákat a korábbiakban leírt módon centrifugálással összegyűjtjük és az RNS izolálásához szárazjégen megfagyasztjuk, vagy a „Western biot analízis” számára dietilaminoetilcellulózban (DEAE, Whatman DE52, Whatman, Clifton, New Jersey, USA) továbbtisztítjuk.
A DEAE cellulózban történő tisztításához kb. lxlO9 merozoitát PBS-ben 10 ml térfogatú oszlopra viszünk fel és PBS-el eluáljuk. A merozoitákat az áthaladó folyadék első 100 ml-es részletéből nyerjük ki; az ily módon kapott merozoiták vörösvérsejtektől és más sejtmaradványoktól gyakorlatilag mentesek.
2.4. Merozoita mRNS izolálása
1χ109-1χ101θ organizmust tartalmazó fagyasztott merozoita üledéket 1 mM ditiotreitet (DTT) és 300 egység RNasint (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA) tartalmazó 10 ml TEL/SDS pufferben [0,2 M Trisz HCI, 0,1 M LiCl, 25 mM EDTA, 1 tömeg/térfogat% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), pH 8,8] felengedünk és teflonnal bélelt szövethomogenizátorban 10-12 ütéssel homogenizálunk. Az oldhatatlan maradványokat hidegen 3000 g mellett végzett centrifugálással választjuk el. A felülúszó folyadékot fenol, kloroform és izoamil-alkohol 24:24:1 térfogat/térfogatarányú, TEL pufferrel egyensúlyba hozott elegyével kétszer extraháljuk.
A vizes fázist 37 ’C-on 30 percen át 100 pg/ml proteináz K-val emésztjük és azonos térfogatú, 1:1 térfogatarányú fenil-kloroform eleggyel újra extraháljuk, majd a nukleinsavat 2 térfogatrész etanollal szárazjégen egy órán át vagy -20 ’C-on egy éjszakán keresztül történő kezeléssel lecsapjuk. Az üledéket 10 OOOxg mellett egy órán át végzett centrifugálással lecsapjuk, majd TE-ben (10 mM trisz, pH 7,5, 2 mM EDTA) újra szuszpendáljuk és 4 ml CsCl párnán (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA) 20 órán át 15 ’C-on 150 OOOxg mellett végzett centrifugálással átfonjuk. Az RNS üledéket 0,2 M kálium-acetátból 2,5 térfogat etanollal újra lecsapjuk. Az ily módon kapott teljes RNS-t a poli(A)+ RNS feldúsítása céljából Maniatis által leírt módon (lásd fentidézett közlemény 197. old.) oligo-dT-cellulózon egyszer átvezetjük. 5xl09 merozoitából nyert 1,9 mg teljes RNS mintegy 20 pg poli(A)+RNS-t tartalmaz.
2.5. Oociszta és merozoita cDNS szintézise és fág vektorokba történő beillesztése 6 pg sporulázó oociszta poli(A)+RNS-ből, Gubler és tsai által leírt módon [Gene 25, 263 (1983)] kettősszálú cDNS-t szintetizálunk; a kiegészítő szál szintetizálása céljából az oligo(dT)primer és RNase H (BRL) és E. coli DNS polimeráz I (New England Biolabs) megnyújtásához fordított transzkriptászt (BRL) alkalmazunk. A kettősszálú DNS-en ezután T4 DNS polimerázzal (BRL) tompa véget alakítunk ki és EcoRI linkereket (GGAATTCC, Collaborative Research) adunk hozzá, EcoRI metilázzal (New England Biolabs), a gyártó előírásainak megfelelően végzett kezelés után.
Az ily módon elkészített cDNS-t EcoRI-val emésztjük, majd a Xgtl 1-ben (Stratagene Cloning Systems, San Diego, California, USA) Huynh és tsai által leírt módon (DNS Cloning Vol. I: A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington, D. C., 49-78 oldal, kiadó D. Glover) könyvtárat készítünk. Az EcoRI cDNS ffagmenseket ezután EcoRI által emésztett defoszforilezett Xgtll karokká (Stratagene Cloning Systems) ligáljuk és a kapott DNS-t a gyártó előírásainak megfelelően GigapackR kit (Stratagene Cloning Systems) segítségével fágba csomagoljuk.
A kapott könyvtárat Y1O88 gazdasejteken (ATCC No. 37 195) végzett szélesztéssel bővítjük. A rekombinánsok százalékos mennyiségét a kék és színtelen plakkok arányából X-gal lemezeken (Maniatis, fent idézett műve, 24. oldal) izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid (IPTG, Sigma Chemical Co.) jelenlétében határozzuk meg; ez az érték kb. 90%.
Poli(A)+ RNS merozoita kettősszálú cDNS kópiát lényegében a fentiekben leírt módon szintetizáljuk. A könyvtár megszerkesztésénél felhasznált kettősszálú cDNS a denaturáló gélbe történő vándorlás alapján [Bailey et al., Anal. Biochem. 70, 75 (1976)] mintegy 200-4500 bázispárt (bp) tartalmaz.
A merozoita cDNS-t a fentiekben leírtak szerint metilezzük és EcoRI linkerekhez ligáljuk azzal a változtatással, hogy a CCGAATTCGG linkereket (Collaborative Research) alkalmazunk. Az EcoRI-val végzett emésztés után a cDNS-eket Biogel A-50M-ben frakcionálva a fölös mennyiségű linkermolekulákat és a kb. 300 bp-nél kisebb cDNS-eket eltávolítjuk. (Lásd Huynh és tsai fent említett közleménye.)
A cDNS-eket Xgtl 1 karokhoz ligáljuk, és a DNS-t a fent ismertetett módon fágokba csomagoljuk. A mint18
HU 212 505 Β egy 50 000 fágot tartalmazó könyvtárat Y1088 gazdasejteken történő szélesztéssel bővítjük. X-gal lemezeken IPTG jelenlétében végzett plakk analízis kb. 90% rekombinánst mutatott ki.
3. cDNS könyvtárak immunológiai screenelése
A Xgtll merozoita cDNS kifejezési könyvtárat Y1090 sejteken (ATCC 37 197) mintegy 10 000 plakk (150 mm lemez sűrűség mellett szélesztjük. Hat ilyen lemezt 42 C-on 3,5 órán át inkubálunk, a béta-galaktozidáz fúziós fehérje kifejezése céljából 10 mM IPTGben előzetesen áztatott nitrocellulóz szűrőket rétegezünk föléje, majd 4-5 óra és egy éjjel közötti időtartamon át 37 ’C-on inkubáljuk. A szűrőket a lemezekről eltávolítjuk és TBS-el (20 mM törzs, pH 8,0, 0,15 M NaCl) szakaszosan többször mossuk. A nem-specifikus fehérjekötődési helyeket oly módon blokkoljuk, hogy TBS-ben 20%-os magzati borjú szérummal (FCS) forgó rázatóberendezésen 4 ’C-on 2-4 órán át inkubáljuk.
Merozoita antigénekkel ismert módon reakcióba lépő kilenc monoklonális anti-test (jelük: 7D4, 7D1, 20C6, 13A6, 200, 11B6, 3A5, 13A1 és 15B2) aszcitikus folyadékát összegyűjtjük, 100 ml végső térfogatban 20% FCS és 0,15 M nátrium-klorid értékre állítjuk be és Petri-csészékben elhelyezett szűrőkre felvisszük; minden Petri-csésze két szűrőt tartalmaz. A szűrőket a primer monoklonális anti-test gyűjteménynyel 4 ’C-on egy éjjelen át forgó rázatógépen inkubáljuk. A meg nem kötött anti-testet oly módon távolítjuk el, hogy a szűrőket TBS-el szobahőmérsékleten 5-6szor mossuk. A megkötött anti-testet oly módon mutatjuk ki, hogy a szűrőket kecske anti-test torma peroxidáz (HPOD) konjugátummal (Boehringer-Mannheim), inkubáljuk, majd a színt 3 mg/ml 4-klór-l-naftol (Bio Rád) és 0,018% hidrogénperoxid felhasználásával, Hawkes és tsai által leírt módon [Anal. Biochem. 119, 142 (1982)] kifejlesztjük.
A kezdeti magas sűrűségű screenen azonosított pozitív plakkokat ugyanazon monoklonális anti-test fürdő felhasználásával második sreenben tisztítjuk. Minden pozitívot a gyűjteményből származó egyes monoklonális sejtekhez rendelünk a pozitívok többrácsos elrendezésben történő szélesztése útján; minden pozitívot IPTG-vel indukálunk, majd nitrocellulózra visszük át és a gyűjteményből származó monoklónok egyikével inkubáljuk. A Xm2-4 jelzésű azonosított egyik pozitív fágot a gyűjteményben levő nyolc anti-test közül három (7D1, 7D4 és 20C6) felismerte.
A sporulázó oociszta cDNS könyvtár screeneléséhez hasonló módszereket alkalmazunk, az alábbi változtatásokkal: a kezdeti screeneléshez a 6A5, 7B2, 15A3, és 20C6 anti-testeket tartalmazó monoklonális anti-testek gyűjteményét alkalmazzuk; a második screenelésnél a 7B2-t, 15A3-at, 20C6-ot és 8A2-t használunk; a harmadik screenelésnél 15A3-at, 7B2-t és 20C6-ot alkalmazunk; és az inkubációs puffer 0,05% Tween-20-at [polioxietilén (20)-szorbitán-monolaurát] is tartalmaz. A fenti módon a 6A5, 8A2 illetve 7B2 monoklonális anti-testek által felismert, XS1-3, XS1-4 és XS1-7; XS2-1, XS2-4 és XS2-5; illetve XS3-1 jelzésű plakkokat az oociszta cDNS könyvtár azonosította. A 6A5 anti-testtel reagáló fágtermelő fehérjéből készített DNS-t EcoRI-val történő emésztéssel és agaróz gélben végzett elektroforézissel elemezzük (Maniatis és tsai fentemlített műve, 150. old). A talált három különböző inzert nagysága mintegy 1150, 890 és 615 bp.
4. Eimeria gének kifejezése E. coli-ban
AXS1-7 és XS1-3 fágokból származó 1,1 kb illetve 0,9 kb EcoRI DNS-molekulákat izoláljuk és a pEVvrfl, pEV-vrfl2, és pEV-vrf3 jelzésű három változó leolvasókeret kifejezési vektor mindegyikének az EcoRI helyére beillesztjük [a felépítést Crowl és tsai által leírt módon végezzük el; Gene 38, 31 (1985)]. Az inzerteket mindkét lehetséges orientációban tartalmazó plazmidokat Mandel és tsai által leírt módon [J. Mól. Bioi. 53, 159 (1970)] a pRK248cIts kompatíbilis plazmidot tartalmazó E. coli MCI061 törzsbe transzformáljuk [Bemard és tsai: Methods in Enzymology 68, 482 (1979)]. Az MC1061 törzs és a pRK248cIts plazmid az American Type Culture Collection intézménynél ATCC 53 338 számon 1985. 11. 26-án illetve 33 766 számon deponálva lett [Gene (Amst.) 5, 59-76 (1979)].
A baktérium transzformánsokat 30 ’C-on M9 táptalajon (Maniatis fentidézett műve 68. oldal) 0,5% glükóz és 0,5% kazaminsavak jelenlétében tenyésztjük, majd a XPL promotor transzkripciója céljából 42 ’C-on 0,5 optikai sűrűség (550 πιμ) mellett kezeljük (lásd Crowl és tsai fentidézett műve). Ezután 2-3 órán át inkubáljuk, majd 1 ml-es mintákat veszünk és a mintákban levő sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejt-üledéket Crowl és tsai fentidézett módszere szerint kezeljük és a lizátumot Laemmli által leírt módon [Natúré 227, 680 (1970)] nátrium-dodecilszulfát (SDS) poliakrilamid-gél elektroforézisnek vetjük alá. Elektroforézis után a gélben levő fehérjéket „Coomassie brilliant blue” színezékkel megfestjük vagy „Western biot analisis” céljából nitrocellulóz membránra visszük át [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979); Burnetti, Anal. Biochem. 112, 195 (1981)]; a kimutatáshoz 6A5 monoklonális anti-testet és kecske anti-egér HPOD konjugátumot alkalmazunk.
Az analízis azt mutatja, hogy a pEV-vrf 1 vektorban az egyik orientációban levő 0,9 kb cDNS molekula egy 20 kD fehérjét termel, amely a 6A5 anti-testtel reagál. Az 1,1 kb molekulával nem figyeltünk meg kifejezést, valószínűleg azért, mert utóbbi 5' nem-kódoló szekvenciákat tartalmaz. A fenti fehérje hozamának optimalizálása céljából különböző kifejezési vektorokat vizsgáltunk meg. Azt találtuk, hogy az előnyösen alkalmazható táptalaj literenként (±10%) 6,0 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 4,0 g dikálium-hidrogén-foszfátot, 5,0 g ammónium-szulfátot, 3,5 g magnézium-szulfátheptahidrátot, 21,0 g élesztő extraktumot, 3,5 g Bacto Triptont, 1,0 ml LB625 habzásgátlót, 25 g glükózt, 70 mg tiamin-hidrokloridot, 2,5 ml vitamin-oldatot [GIBCO MÉM (100X) vitamin-oldat] és 1,0 ml nyom19
HU 212 505 Β elemeket tartalmaz. Az LB625 habzásgátló a Union Carbide cég terméke; ez etilén- és polipropilén-oxidból álló lineáris polimer, amelynek viszkozitása 37,8 ’C-on 625 „Saybolt” Univerzális másodperc.
A vitamin-oldat (a fermentlé egy literére számítva) 0,25 mg D-kalcium-pantotenátot, kolin-kloridot, fólsavat, nikotinimidet, piridoxál-hidrokloridot továbbá tiamin-hidrokloridot, valamint 0,50 mg i-inozitot és 0,025 mg riboflavint tartalmaz. A fermentlé egy literére vonatkoztatva az alábbi mennyiségű nyomelemek vannak jelen; 2,7 mg vas(III)klorid-hexahidrát, 0,8 mg cinkszulfát-heptahidrát, 0,8 mg réz(II)szulfát-pentahidrát, 0,7 mg kobalt(II)klorid-hexahidrát, 0,7 mg dinátrium-molibdenát-dihidrát, 0,2 mg bórsav és 0,5 mg mangán(II)szulfát-monohidrát.
A λπι2-4 fág által kifejezett immunoreaktív fehérje jellegét először Y1090 sejtekkel történő fertőzés során izolált lizogénben, a növekedést lehetővé tevő (37 ’C) és lehetővé nem tevő (42 ’C) hőmérsékleten végzett differenciális növekedéssel vizsgáljuk. A fenti lizogén által szintetizált fehéijék „Western biot” analízise céljából 50 ml-es tenyészetet 30 ’C-on LB táptalajon (Maniatis és tsai fentidézett közleménye, 69. oldal) 0,5 optikai sűrűségig (550 mft) tenyésztünk, majd a fág replikációjának beindítása céljából a hőmérsékletet 42 ’C-ra emeljük. Az inkubálást 42 ’C-on 15 percig végezzük, majd 10 mM koncentrációig IPZG-t adunk hozzá és az inkubálást 37 ’C-on 30 percen át folytatjuk. A sejteket 4 ’C-on végzett centrifugálással összegyűjtjük és Laemmli minta pufferben [0,125 M trisz, pH 6,8,1 tömeg/térfogat% SDS, 1,4 M béta-merkaptoetanol, 0,01% tömeg/térfogat% brómfenol-kék, 20 térfogat/térfogat% glicerin] öt percen keresztül végrehajtott forralással lizáljuk.
1,0 ml-nek megfelelő tenyészetet elektroforézissel 12,5%-os SDS-poliakrilamid gélben újraoldunk, majd elektroforézis segítségével nitro-cellulózra visszük át és a Xm2-4 fágot azonosító három monoklonális antitest (7D1, 7D4 és 20C6) gyűjteményével megvizsgáljuk. A „Western biot” kifejlesztése az indukált lizogénben (10. ábra, B panel, 2. pálya) jelenlevő, 150 kD-nál nagyobb fúziós fehérjét jelez. A béta-galaktozidázra specifikus anti-test a fenti nagy molekulatömegű fehérjével is reagál és kb. 114 kD nagyságú fehérjét ad; ez önmagában a béta-galaktozidáz várt nagysága (lásd 10. ábra, A panel, 2. pálya).
A Xm2-4 DNS fágot EcoRI-val emésztve egy
1,7 kb DNS molekulát nyerünk. Ezt a molekulát a pEV-VRFl, 2 és 3 plazmidokat tartalmazó, EcoRI-linearizált plazmid gyűjteménybe szub-klórozzuk (Crowl és tsai fentidézett műve) és a fentiekben ismertetett módon pRK248cIts plazmidot tartalmazó E. coli MC1061 törzzsé transzformáljuk. A transzformánsokat az immunoreaktív fehérje hővel indukált kifejezésére screeneljük, a három monoklonális anti-test gyűjteményének felhasználásával; ezek a Xm2-4 lizogénben levő fúziós fehérjével reagálnak. Az immunoreaktív rekombináns fehérjét továbbá az E. coli lizátum „Westem-blot” analízisével jellemezzük, a gyűjteményben levő három monoklonális anti-test egyikének (7D4) felhasználásával. Azt találtuk, hogy valamennyi pozitív telep a várt 1,7 kb inzertet tartalmazó plazmid DNS-t tartalmaz és indukció során kb. 65 kD fehérje szintézisét irányítja (SDS-poliakrilamid-gél elektroforetikus elemzéssel történő meghatározás szerint).
Azt találtuk, hogy a 65 kD fehérje kifejezése a táptalaj és az indukciós körülmények változásaival szemben viszonylag nem érzékeny. A fehérjét a felülúszóból a sejtüledék ultrahangos feltörése után kvatitatíven kinyerjük.
A rekombináns fehérje termeléséhez az 1,7 kb inzertet tartalmazó kifejezési vektort alkalmazzuk; ezt vázlatosan all. ábrán tüntetjük fel. Ezt a plazmidot a XcI857 számára lizogén MC1061 gazdasejtekben szaporítjuk. AXfág lizogének kialakítására ismert standard módszereket alkalmazzuk (lásd Arber és tsai: Cold Spring Harbor Monograph, Lamlda II, 1983, Hendrix és tsai, Eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, 450. oldal). A szaporítást 30 ’C-on végezzük el és ily módon a plazmidban a PL promotort represszált állapotban tartjuk.
Mintegy 1,1 kb-nek megfelelő sporulázó oociszta cDNS szegmens által kódolt 28 kD fehérjét hasonló módszerekkel fejezünk ki. Ez a fehérje specifikusan kötődik a 8A2 monoklonális anti-testhez. A mintegy 1,2 kbnek megfelelő sporulázó oociszta cDNS által kódolt 45 kb fehérje kifejezését is elvégezzük. Ez a fehérje specifikusan kötődik a 7B2 monoklonális anti-testhez.
5. DNS-szekvencia analízis
A DNS plazmidnak 1 ml telített egyéj szakás tenyészetekből kis mennyiségben történő izolálását Bimbóim és tsai módszerével [Nucleic Acids Research 7. 1513 (1979)] végezzük el. E módszer segítségével analitikai célokra kis mennyiségű DNS-t izolálunk baktériumos telepekből. Nagyobb mennyiségű plazmid DNS-t egy literes tenyészetek felhasználásával cézium-kloridos centrifugálás segítségével standard módszerekkel készítünk (Maniatis és tsai fentidézett közleménye, 93. oldal).
A sporulázó oociszta könyvtár cDNS-einek DNS szekvenciáit Maxam és tsai kémiai hasításos módszerével [Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] és Sanger és tsai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] láncvégződéses módszerével, kétszálú DNS plazmidokra Smith és tsai által [Cell /0, 753 (1979)] és Wallace és tsai által [Gene 16, 21 (1981)] történő módosítással határozzuk meg. A láncvégződéses módszer során a G-C kompressziós változások kiküszöbölése céljából a dGTP-t 7-diaza-dGTP-vel helyettesítjük [Barrés tsai: Biotechniques 4, 428 (1986)].
A szekvencia analízis megkönnyítése céljából a XS1-7 1,1 kb EcoRI molekuláját a pEV3-SEQ plazmidra visszük át. (12. ábra); utóbbi a pEV-vrf3 EcoRI helyéhez legközelebb álló poli-linker. A BamHI és KpnI helyeken a plazmid linearizálásához a fenti polilinkert alkalmazzuk, az exonukleáz ΠΙ-al végzett egyirányú törlések előidézése céljából [Henikoff, Gene 28, 351 (1984)]. A törlések Maxam-Gilbert szekvenciálásánál a 3'-vég jelzéséhez a poli-linkerben levő Xbal
HU 212 505 B helyet alkalmazzuk, míg a Sanger szekvenciáláshoz a primer CGGTCGACTCGAGCCA-t használjuk. Ezt a prímért 5' végén (y-32P/ATP/ICN) és polinukleotid kináz felhasználásával 32P-jelezzük (Maniatis és tsai fentidézett művében leírt módon, 122. oldal).
A 13. ábrán a Maxam-Gilbert szekvenciáláshoz felhasznált 1,1 kb EcoRI molekulában levő restrikciós helyeket tüntetjük fel. A 0,9 kb molekulában levő EcoRI helyek helyzetét is bemutatjuk, minthogy ezeket is felhasználjuk. Az exonukleáz III által végzett törlések végpontjait is feltüntetjük. Ezeket a Xbal helyről a pEV3-SEQ poli-linker Xbal helyéről Maxam-Gilbertmódszerrel vagy primer kiterjesztéssel (12. ábra) a Sanger módszerrel szekvenciáljuk. Mindkét esetben a teljes cDNS állomást a fenti két módszerrel vagy azok valamelyikével szekvenciáljuk. A DNS magas G-C tartalma következtében a Maxam-Gilbert reakciók a 8%-os és 15%-os poliakrilamid-karbamid gélekben általában frakcionálódnak.
A primer kiterjesztést oly módon végezzük el, hogy
1,5 pg poli(A)+ RNS-t 2 pmól az 5' végén jelzett GAGGTCTGCCAl I l i GC szintetikus oligonukleotid primercel 42 ’C-on 60 percen át inkubálunk. Az inkubálást 50 mM Tris-HCl-ben [pH 8,0, 8 mM MgSO4, 0,1 M NaCl, 2 mM ditiotreit, 2-2 mM deoxinukleotidtrifoszfát (dNTP, Pharmacia Fine Chemicals) 20 egység RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) és 20 egység AMW fordított transzkriptáz (Pharmacia, Piscataway, NJ, FPLCpure)] végezzük el. A termékeket a szekvencia-analízishez felhasznált 8%-os poliakrilamid-karbamid gélekkel, 32P-jelzett Hpall által emésztett pBR322 DNS (mint molekulanagyság marker) segítségével analizáljuk.
A szekvencia analízis elvégzése céljából a gélről a primer termékeket eluáljuk és Maxam és tsai fentemlített kémiai hasításos módszerével analizáljuk vagy a kiterjesztéses reakcióban a ddNTP-eket alkalmazzuk [Tolan és tsai: J. Bioi. Chem. 259, 1127 (1984); Graves és tsai: J. Bioi. Chem. 261, 11 409 (1986)]. A reakciókat 8%-os poliakrilamid-karbamid gélekben analizáljuk.
Az 1,1 kb cDNS molekula nukleotid szekvenciáját a 14. ábrán tüntetjük fel. Ebben a nagyobb molekulában a 0,9 kb molekula szekvenciája a 188 bázistól a 1082 bázisig terjed. A fenti nukleotid szekvencia nyitott leolvasó keretű analízise alapján várható aminosav-szekvenciát a 15. ábrán tüntetjük fel. A 15 ábrán feltüntetett várható aminosavszekvencia helyességét a következőképpen bizonyítjuk.
A 15. ábrán szereplő 41—54 és 145-164 maradéknak megfelelő aminosav-szekvenciájú szintetikus polipeptideket készítünk. Mindkét fenti polipeptiddel szembeni nyúl anti-szérumokat használunk „Western biot” analízisben teljes sporozoita fehérjék és a 0,9 kb cDNS-t kifejező E. coli transzformáns lizátumok esetében. Mindkét „Western biot” analízisben a két polipeptid elleni anti testek fehérjékhez kötődnek.
A 65 kD fehérjét a fág Xm2-4-ben kódoló 1,7 kb inzert nukleotid szekvenciáját hasonló módszerekkel határozzuk meg; az eredményeket a 16 ábrán tüntetjük fel. A fenti DNS szekvencia által kódolt fehérje várható aminosav szekvenciáját a 17. ábrán tüntetjük fel. Ezt a szekvenciát a kifejezett 65 kD fehérje tripszines emésztése során termelt polipeptidek aminosav szekvencia analízise igazolja. A fenti peptidek néhány képviselője aminosav szekvenciájának megfelelő összaminosav szekvenciákat a 17. ábrán aláhúztuk.
Az lett volna várható, hogy az 1,7 kb molekula DNS szekvenciájának nyitott leolvasó kerete kódolja majd a kb. 33,349 daltonnak megfelelő fehérjét. A fenti DNS fragmens kifejezési terméke azonban az SDS gélekben kb. 65 kD látszólagos molekulatömeggel vándorol. A várt és tapasztalt fehérjenagyság közötti eltérés okát nem ismerjük. Ezt a fehérjét a továbbiakban „65 kD” fehérjének nevezzük.
A 8A2 monoklonális anti-test által felismert 28 kD fehérjét kódoló cDNS molekula nukleotid és várt aminosav szekvenciáját hasonlóképpen határozzuk meg; az eredményeket a 18. és 19. ábrán tüntetjük fel.
Hasonlóképpen meghatároztuk az 1,2 kb 7B2 cDNS nukleotid szekvenciáját és várt aminosavszekvenciáját. Minthogy folyamatos nyitott leolvasó keretet találtunk és a sporozoitákból immunolecsapással izolált fehérje 200 kD értéknél nagyobb, a könyvtárat nagyobb cDNS-ekre screeneltük, próbaként 1,2 kb cDNS felhasználásával. Ilyen módon egy 3,2 kb cDNS-t kapunk, amelynek nukleotid szekvenciáját és várt aminosav szekvenciáját a 20. illetve 21. ábrán tüntetjük fel.
6. 65 kD fehérje tisztítása és jellemzése
6.1. Fehérjetisztítás
A pEV/2-4 kifejezési vektort tartalmazó E. coli MCI061 (pRK248cíts) magas sejtsűrűségű fermentációját l,5xM-9 táptalajon 10 literes fermentorban végezzük el; a hőmérsékletet standard módon a fentiekben leírtak szerint változtatjuk és a tenyésztést a növekedést biztosító hőmérsékleten kb. 4 órán át folytatjuk. A sejttömeget az indukció után 5 órával összegyűjtjük és ily módon 500 g sejttömeget kapunk.
g pasztaszerű E. coli sejttömeget 500 ml 10 mM trisz HCl-ben (5 mM EDTA, pH 7,8) egyenletesen szuszpendálunk és 2 órán át 2-8 ’C-on keverünk. A szuszpenziőt 7000 psi nyomáson Gaulin-féle homogenizátoron (APV Gaulin, Everett, Massachusetts, USA) vezetjük át. A sejtlizátumot Sorvall RC-5 centrifugán 24 000 g mellett 1 órán át centrifugáljuk és az üledéket kidobjuk. A felülúszóhoz szilárd ammónium-szulfátot adunk (végső koncentráció 80%). A felülúszót 2 órán át 4 ’C-on állni hagyjuk, majd 24 000 g mellett egy órán át centrifugáljuk. Az üledéket 20 mM kálium-foszfátban (pH 6,8) oldjuk, majd centrifugáljuk és a felülúszót 20 mM kálium-foszfáttal (pH 6,8) szemben dializáljuk.
Pharmacia üvegoszlopot (átmérő 3 cm, hosszúság 10 cm) NuGel P-DE 20013 (200 Angtrom, 40-60 pm, gyenge ioncserélő, Separation Industries, Metuchen, NJ) kovasav hordozóval megtöltünk. A gélt 20 mM kálium-foszfáttal (pH 6,8) egyensúlyba hozzuk. A mintát felvisszük (10 ml/perc) kiegyensúlyozó pufferral mossuk és 0,4 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM kálium-foszfáttal (pH 6,8) eluáljuk. Az oszlopffakció21
HU 212 505 B kát a 65 kD fehérje kimutatása céljából 7D4 anti-testtel „Western biot” analízisnek vetjük alá.
A 65 kD fehérje további tisztításához immunoaffinitás oszlopot alkalmazunk. Az oszlop adszorbensét oly módon készítjük el, hogy 7D4 monoklonális antitesteket NuGel P-polialdehidR (500 Angström, 4060 μηη, Separation Industries, Metuchen, New Jersey, USA) szilikagél hordozón immobilizálunk. Az immobilizációs eljárást a következőképpen végezzük el: 10 g polialdehid hordozót 0,1 M kálium-foszfátban és 0,1 M nátrium-kloridban (pH 6,8) szuszpendálunk és ezzel az oldattal mosunk, majd 8 mg/ml fehéijekoncentráció mellett 20 ml monoklonális 7B4 anti-testeket tartalmazó Ehrlenmeyer lombikba visszük át (fehérjekoncentráció 8 mg/ml). A szuszpenzióhoz 4 mg nátrium-cianobór-hidridet adunk. Az elegyet 4 ‘C-on 16 órán át enyhén rázatjuk. A gélt szűrjük és 0,1 M kálium-foszfátot és 0,1 M nátrium-kloridot tartalmazó oldattal (pH 6,8) mossuk. Az összegyűjtött szűrleteket meg nem kötött anti-testekre megvizsgáljuk. A megkötési sűrűség 8 mg/g hordozó. A nemkapcsolt aktivált helyeket oly módon blokkoljuk, hogy a gélt 20 ml M etanol-aminban szuszpendáljuk (pH 7,5). A szuszpenzióhoz 4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet adunk, majd 4 ”C-on 16 órán át keverjük. A gélt összegyűjtjük és hideg kapcsoló pufferral alaposan mossuk.
Az immunoaffinitás kromatográfia elvégzése céljából az oszlopot (1 cmxlO cm) immobilizált 7D4 antitesttel töltjük meg és 0,1% Triton Χ-100-at tartalmazó hideg foszfáttal pufferolt nátrium-klorid oldattal (PBS) egyensúlyba hozzuk. A NuGel P-DE 200** oszlopról nyert, a 65 kD fehérjét tartalmazó összegyűjtött frakciókat 0,1% Triton Χ-100-t tartalmazó PBS-el kétszer hígítjuk és 10 ml/perc átfolyási sebességgel az oszlopra felvisszük. A gélt ezután a meg nem kötött anyag eltávolítása céljából PBS-el mossuk. Az adszorbeálódott immunreaktív anyagot pufferrel (0,3 M ecetsav, 0,1 M nátrium-klorid, pH 2,7) eluáljuk. A fehérjét ezután YM 10 membrán (Amicon, Div. W. R. Grace and Co. Danvers, Massachusetts, USA) felhasználásával Amicon StricellR berendezésben betöményítjük.
A termék tisztaságát Laemmli által leírt módon [Natúré 227, 680 (1970)] meghatározzuk. A gélt Coomassie kékkel megfestjük. „Western biot” analízist ugyancsak elvégzünk, kecske anti-egér torma peroxidos konjugátummal képezett 7D4 monoklonális antitest felhasználásával. Az eredményeket a 22. ábrán tüntetjük fel. A 2., 3., 4. és 5. pálya két készítményből származó tisztított fehérjét tartalmaz. Az 1. és 6. pálya marker fehérjék keverékét tartalmazza, amelyek molekulatömegét az ábra bal- és jobboldalán tüntetjük fel. Minden pályán 10 μg fehérjét futtatunk.
A 22. ábrából látható, hogy a tisztított fehérje az SDS gélben vándorol, a fősáv látszólagos molekulatömege kb. 65 kD, míg a kisebb sávok nagyobb és kisebb mobilitást mutatnak.
6.2. Izoelektromos pont meghatározása μg tisztított 65 kD fehérjét az LKB Instruments, Gaithersburg, Maryland, USA cég által rendelkezésünkre bocsátott előre kialakított izoelektromos fókuszáló gélben izoelektromos fokuszálásnak vetünk alá. Ismert izoelektromos ponttal rendelkező standard fehérjék keverékét egyidejűleg futtatjuk. A gélt a gyártó cég útmutatása alapján 3,5-9,5 pH gradiens mellett kb. 2 órán át 50 mAés 1500 V mellett futtatjuk.
Az elektrofokuszálás befejezése után a gélt a fehérjesávok kimutatása céljából Coomassie blue színezékkel megfestjük. A tisztított fehérje izoelektromos pontját ezután oly módon határozzuk meg, hogy mérjük a sáv helyzetét a pH gradiensen belül, a fehérje standardok helyzetére vonatkozóan. A fentiek alapján a fehérje izoelektromos pontja 4,6.
6.3. Aminosav összetétel analízis
Az aminosav összetétel elemzését az oszlop után végzett fluoreszcencia reakcióval Pan és tsai által leírt módon végezzük el [Methods of Protein Microcharacterization, 1986, Shively, ed., The Humana Press, 105— 119. oldal]. A 3 μg 65 kD fehérjét tartalmazó mintákat 4% tioglikolsavat tartalmazó 6 n sósavban 100 °C-on 20-24 órán át vákuumban hidrolizáljuk és az elemzéshez a hidrolizátum 10%-át használjuk fel. A cisztein értékeket perhangyasavas oxidáció után határozzuk meg. Az eredményeket a 3. táblázatban tüntetjük fel.
3. táblázat
A 65 kD fehérje aminosav összetétel analízise
Aminosav Mól %
Asp 6,06
Thr 6,07
Ser 7,27
Glu 18,24
Pro 5,35
Gly 16,76
Ala 11,71
Cys 4,45
Val 4,88
Met 2,08
He 2,17
Leu 3,22
Tyr 2,20
Phe 2,13
His 1,07
Lys 2,72
Arg 3,61
Trp ND
ND = nem határoztuk meg.
6.4. N- és C-terminális szekvencia analízis
200 pikomól fehérjét (aminosavösszetétel-analízissel történő meghatározás alapján) N-terminális analízisnek vetünk alá [Hewick és tsai: J. Bioi. Chem. 265, 7990 (1981) és egy Applied Biosystems modell 470A
HU 212 505 Β szekvenciátor (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Califomia, USA)]. Az ily módon meghatározott N-terminális szekvencia a következő:
M-N-K-N-S-7-L-G-G-F-7-S-M-Q-E-S-P-P-P. A kérdőjellel megjelölt helyeken levő aminosav-maradékok identitása bizonytalan, minthogy a PTH-Cys kinyerése alacsony és a cisztein-maradékok diszulfid kötésekben szerepelhetnek [Hawick és tsai: J. Bioi. Chem. 256, 7990(1981)].
A C-terminális analízist 1200 pikomól 65 kD fehérjén karboxipeptidáz Y által elvégzett, időben nyomonkövetett emésztéssel hajtjuk végre [Hayashi: Methods in Enzymology 47, 84 (1977)]. Karboxipeptidáz Y-t (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 0,8 μg/35O μΐ koncentrációban 0,05 M nátrium-acetát pufferben (pH 5,9) alkalmazunk és a minta aliquot részeket 0, 2, 5, 10, 20 illetve 30 perc után vesszük le az analízis céljaira. Az aliquot részeket a további reakció leállítása céljából sósavval megsavanyítjuk és a fentiekben leírt aminosav analízisnek vetjük alá. Az analízis szerint a C-végcsoportban levő aminosav szekvencia valószínűleg (Met, Trp)-Ala-Ser. Azt találtuk, hogy a triptofán a metioninnal együtt növekedik, azonban a Trp mennyisége a fluoreszcamin analizátorban nehezen határozható meg, minthogy fluoreszcaminnal csupán alacsony reaktivitást mutat. Ennek következtében a fenti analízismódszer segítségével a Trp és Met viszonylagos helyzete bizonyossággal nem határozható meg.
6.5. Triptikus pepiid analízis
A 65 kD fehérjét kódoló cDNS nukleotid szekvenciája alapján várható aminosav szekvencia meghatározása céljából a fehérje egy részét tripszinnel (Cooper Biomedical, Philadelphia, Pennsylvania, USA) emésztjük és a kapott peptidek szekvenciáját az alábbiak szerint meghatározzuk.
A triptikus emésztést 37 ’C-on egy éjjelen át 148 μg fehérjén 0,2 M ammónium-hidrogén-karbonátban (pH 8) 1:30 arányú (tömeg vagy mól/enzim) szubsztrátum arány mellett végezzük el. Az ilyen módon képezett peptideket Waters HPLC rendszerben, Altex ultraszferikus 250x4,6 mm C-18 oszlop (Beckman Instruments, Fullerton, CA) felhasználásával, 0,1% (alap) trifluor-ecetsavban 0-55% emelkedő acetonitril gradiens szerint választjuk el. Az emésztett anyagot PHLC szétválasztás előtt a pepiidben levő biszulfid-kötések felhasítása céljából béta-merkaptoetanollal 37 ’C-on 30 percen át redukáljuk. Az oszlopon áthaladó anyagot laboratóriumi adat-ellenőrző detektor (Laboratory Data Control, Rivera Beach, Florida, USA) felhasználásával 215 ιημ mellett követjük nyomon. A HPLC oszlopot 8 fő csúcsra bontjuk fel (lásd 23A ábra).
Minden csúcsot előbb aminosav-analízisnek vetünk alá, a peptidek mennyiségének és összetételének meghatározása céljából. Ezután a HPLC oszlopról származó legtöbb peptid csúcs szekvenciáját „Applied Biosystems Model 470A” gázfázisú szekvenciáié felhasználásával, automatizált Edman lebontással meghatározzuk. A feniltiohidantoin (PTH) aminosav származékokat Altex ultraszferikus C-18 oszlop felhasználásával Waters HPLC rendszerbe [Hawke és tsai: Anal. Biochem. 120, 302 (1982)] vagy .Applied Biosystems Model 120 A on-line” PTH aminosav analizátorban azonosítjuk.
A fenti peptidek néhány képviselőjének aminosav szekvenciáját a 17. ábra aláhúzott tartományaiban tüntetjük fel. Az egyes peptidek számát (ez a HPLC csúcsok számának felel meg) a megfelelő szekvencia mellett bekeretezzük. A peptid szekvenciákban levő bizonyos maradékok identitásával kapcsolatos bizonytalanságot az adott helyen feltüntetett kérdőjelek jelzik, bár a peptidek aminosav összetétel analízise azt mutatja, hogy a várható szekvencia megjelölt helyein aminosavak a peptidben ténylegesen jelen vannak. Néhány peptidmaradék identitásával kapcsolatos bizonytalanságot az okozza, hogy a triptofán a fluoreszcaminnal alacsony reaktivitást mutat.
A teljes 65 kD fehérje N- végcsoportjának megfelelő 6 peptid N-végcsoportján 4 maradékot tartalmaz, amelyeket a kifejezési plazmidban a nukleotidok kódolnak. A 8 peptid analízise során talált aminosav szekvencia a 3 peptid aminosav szekvenciájához hasonló, azonban a 4 C-terminális maradékok hiányzanak és ez feltehetően a tökéletlen triptikus emésztés eredménye. Az 5 pepiidet nem szekvenciáljuk, minthogy e peptid aminosav összetétel analízise alapján a 6 peptiddel azonos azzal a különbséggel, hogy az N-végcsoport első 3 aminosav maradékát nem tartalmazza.
A triptikus emésztéssel nyert termék HPLC analízisét a fentiek szerint végezzük el azzal a különbséggel, hogy az előzetes merkapto-etanolos redukciót elhagyjuk. Az ily módon nyert eluált profilban a 4., 7. és 8. csúcs hiányzik (23B ábra). Ez a megfigyelés arra utal, hogy a fenti cisztein tartalmú fehérjék valószínűleg a redukálatlan fehérjében diszulfid-kötések kialakításában vettek részt.
7. Baromfi immunizálás
7.1. 65 kD antigén felhasználása
Immunizációs kísérletsorozatot hajtunk végre annak megállapítása céljából, hogy a tisztított rekombináns 65 kD fehérje megvédi-e a csirkéket az Eimeria tenella sporulázó oociszták által előidézett fertőzéssel szemben. A kísérletek során 1-21 napos Leghom csirkéket (Avian Services, Frenchtown, New Jersey, USA) tiszta szobában tartunk; a madarak gondozását olyan személyzet végzi, akik a fertőzés időpontjáig más madarakkal nem érintkeztek. A madarakat elektromosan fűtött ketrecekben tartjuk, majd 3 vagy 4 hetes korukban más ketrecekbe visszük át.
A madarak a kísérlet alatt gyógyszert nem tartalmazó broiler indítótápot és vizet ad libitum kapnak. Az állatokat az oocisztákkal történd fertőzés idején másik épületbe visszük át és a kísérletek befejezéséig itt tartjuk. A madarak klinikai állapotát a fertőzés előtt hetente legalább háromszor és az immunizálás után naponta vizsgáljuk. Az állatokat 3 vagy 4 hetes korukban szárnyukra helyezett szalaggal egyenként azonosítjuk,
HU 212 505 Β majd véletlen kiválasztás alapján a különböző tesztcsoportokba beosztjuk.
Immunogén anyagként immunoaktivitás kromatográfiával több sarasban tisztított 65 kD fehérjét alkalmazunk. Az immunogén anyag különböző részletei kb. 0,3-50 endotoxin egység/gg fehérje nagyságrendben mutatnak baktériumos endotoxin aktivitást, amelyet az United States Pharmacopeia, 21. javított kiadás, 1985, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md., 1165-1167. oldalon leírtak szerint határoztuk meg. A fehérjét felhasználás előtt 0,02 M dikáliumhidrogén-foszfát pufferben (pH 6,8) oldjuk, majd szükség esetén ugyanezzel a puffénál hígítjuk.
Kontrollként szarvasmarha szérum albumint (BSA, Pentex) alkalmazunk. Minthogy a felhasznált immunogén pirogén aktivitást mutathat, a felhasznált immunogén anyagban jelenlevő pirogén aktivitás által előidézett nem-specifikus hatásokra való tekintettel valamennyi BSA kontrolihoz a fentivel hozzávetőlegesen azonos mennyiségű aktivitást adunk. A pirogén aktivitást nem-transzformált E. coli lizátum alakjában adjuk a BSA-hoy. A nem transzformált E. coli lizátumot oly módon készítjük el, hogy E. coli-t ultrahangos kezeléssel feltörünk, majd az anyagot 0,45 μ millipore szűrőn átszűrjük.
A kontroll BSA vagy Eimeria antigén hígított mintáit azonos térfogatú adjuvánssal elegyítjük, majd az adagolás előtt 18 gauge tűkkel felszerelt üvegfecskendő segítségével alaposan összekeverjük. Primer és emlékeztető oltásként Freund-féle teljes illetve nemteljes adjuvánst alkalmazunk. Mindkét adjuvánst a GIBCO cégtől (Grand Island, New York, USA) szereztük be.
A primer immunizálást a madarak 4 hetes korában, a test hátsó részén a nyak alján szubkutáns módon végezzük el. Néhány madár 6 hetes korában emlékeztető oltásokat kap. A befecskendezett anyag térfogata mintegy 0,4-2,4 ml. Nagyobb térfogatok esetében a dózist két injekció formájában adjuk be. A madarakat az utolsó beoltás után két vagy három héttel 25 000 vagy 50 000 sporulázott E. tenella oocisztával orálisan megfertőzzük. A fertőzés után hét nappal a túlélő állatokat leöljük, felboncoljuk és a durva sérüléseket megvizsgáljuk. A kísérlet folyamán elpusztult valamennyi madarat felboncoljuk. A diagnózis megállapítása céljából a bélsérüléseket az alábbi skála alapján értékeljük:
= normális;
= enyhe fertőzöttség;
= közepes fertőzöttség;
= súlyos fertőzöttség = pusztulás.
A kapott eredményeket minden madárcsoportban mint átlagos fertőzöttségi fokot fejezzük ki. A madarakat a fertőzés idején és utána 7 nappal lemérjük. Néhány madarat BSA-val vagy kokcidiális antigénnel nem oltunk be, hanem fertőzött vagy nemfertőzött beoltatlan kontrollként kezelünk.
Két fenti kísérletek során kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze:
4. táblázat
Csirkék szubkutáns immunizálásának hatása; a madarakat tisztított rekombináns 65 kD antigénnel egyszer vagy kétszer oltjuk be
Madarak száma Kezelés® Dózis (gg) Sérülés pont- száma6 Súlygyarapodás/vesztésc(g)
4 hetes 6 hetes
korban
1. kísérlet
10 IUC - - 2,8 -25
8 Antigén 3,15 - 2,4 -44
10 Antigén 12,25 - 2,5 -10
6 BSA 17,5 - 3,0 +40
10 UUC - - 0 +107
10 IUC - - 2,9 -40
8 Antigén 3,15 1,6 2,0® -15
10 Antigén 17,5 13,2 1,8e +5
8 BSA 12,25 13,2 2,5 -13
10 UUC - - 0 +87
2. kísérlet
8d IUC - - 2,6 -11
10 Antigén 4 - 2,2 +65
10 Antigén 20 - 2,0 +19
9 Antigén 100 - 2,9 +14
10 BSA 100 - 2,4 -7
10 IUC - - 2,5 +15
10 Antigén 4 4 2,1 +35
10 Antigén 20 20 2,0 +74
8 Antigén 100 100 2,1 +81
10 BSA 100 100 2,4 +69
4 UUC - - 0 -3
a Az IUC, Antigén, BSA és UUC jelölések az oocisztával fertőzött nem-immunizált kontrollra, tisztított 65 kD fehérjére, szarvasmarha szérum albuminra és nem fertőzött nem-immunizált kontrollra vonatkoznak.
b Az 1. kísérlet során az egyetlen immunizációval kezelt madarakat 3 hét elteltével 50 000 sporulázott E. tenella oocisztával megfertőzünk; az emlékeztető oltással védett madarakat két hét elteltével 25 000 oocisztával fertőzzük meg. A 2. kísérlet során az oociszta fertőzés időpontja azonos, azonban az egyszeresen beoltott és emlékeztető oltással kezelt madarakat egyaránt 25 000 oocisztával fertőzzük meg. Minden kísérletnél fertőzött nem immunizált kontrollt is alkalmazunk; ezeket a madarakat 7 nappal leölésük előtt, azonos életkorban, azonos számú sporulázott oocisztával megfertőzzük. Az eredményeket a korábbiakban közölt 0-4 skála alapján értékeljük.
c A madarak fertőzés időpontjában és 7 nappal a fertőzés után mért testtömegének különbsége.
d Ez a csoport eredetileg 9 madárból állt, egy csirke azonban 1 hét után elpusztult.
e PS0.05, az IUC-hez viszonyítva.
HU 212 505 Β
A 4. táblázat adatai igazolják, hogy a 65 kD fehérével végzett beoltás hatására a sérüléspontok száma a fertőzött nem-immunizált kontrolihoz viszonyítva csökken. Az 1. kísérlet során emlékeztető oltásokban részesített két madárcsoport (lásd a táblázat alatti „e” lábjegyzet) statisztikusan szignifikáns mértékben alacsonyabb sérüléspontot mutat. Más esetekben a sérüléspontok csökkenése nem olyan nagy, a beoltott madarak súlygyarapodása azonban általában minden esetben javul.
További kísérletet végzünk annak megállapítása céljából, hogy a 3. beoltás tovább javítja-e a védelmet. A kísérlet során 8 madárból álló csoportokat alkalmazunk, éspedig fertőzött vagy nemfertőzött, oltásban nem részesült kontrollt vagy BSA-val vagy a merozoita fehéijével 3 és 5 hetes korban vagy 3, 5 és 7 hetes korban beoltott állatokat. Az első két beoltást Freundféle adjuvánssal végezzük el. A 3. beoltást Freund-féle nem teljes adjuvánssal szubkutáns úton hajtjuk végre.
Minden madarat az utolsó beoltás után két héttel 25 000 sporulázott E. tenella oocisztával orálisan megfertőzünk. Az állatok testtömegét a fertőzés időpontjában és a fertőzés után 7 nappal megméijük. Az állatokat a fertőzés után 7 nappal leöljük és a vakbélsérüléseket meghatározzuk. A kapott eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.
5. táblázat
Csirkék szubkutáns immunizálásának hatása; a madarakat tisztított rekombináns 65 kD antigénnel kétszer vagy háromszor oltjuk be
Kezelés1 Dózis (pg) Sérülés pont- számb Súlygyarapodás /veszteség’ (g)
3 hetes 5 hetes 7 hetes
korban
IUC - - - 2,13 +59
Antigén 4 4 - 1,75 +122
Antigén 4 4 - 2,88 +128
Antigén 20 20 - 1,88 +87
Antigén 20 20 - 1,88 +69
BSA 20 20 - 3,13 +106
BSA 20 20 - 2,38 +131
UUC - - - 0 +131
IUC - - - 2,25 +23
Antigén 4 4 4 2,25 +91
Antigén 20 20 20 2,25 +86
BSA 20 20 20 1,75 +178
a = Az IUC, Antigén, BSA és UUC rövidítések az oocisztával fertőzött nem-immunizált kontrollra, tisztított 65 kD fehérjére, szarvasmarha szérum albuminra és nem fertőzött nem-immunizált kontrollra vonatkoznak.
b = A madarakat az utolsó beoltás után két héttel vagy leöléstik előtt 7 nappal 25 000 sporulázott E. tenella oocisztával megfertőzzük (fertőzött nem-immunizált kontroll). A kétszeres és háromszoros immunizációs kísérletekhez kontrollként 7 és 9 hetes korban fertőzött madarakat alkalmazunk. Az eredményeket a korábbiakban ismertetett 0-4 skála szerint értékeljük.
c = A fenti értékek a madarak fertőzés időpontjában és 7 nappal a fertőzés után mért testtömegének különbségét jelentik.
Az 5. táblázat adataiból kitűnik, hogy a 3. oltás nem javítja az immunitást. A kezeletlen fertőzött kontrolihoz vagy BSA-val beoltott madarakhoz viszonyított kisebb vakbélsérülés-pontszám arra utal, hogy az antigén nagyobb védelmet biztosít.
További kísérletet végzünk annak meghatározására, hogy a szubkutáns befecskendezéstől eltérő adagolási mód esetében jobb eredményeket kapunk-e. A vizsgálat során 65 kD fehérjét két dózisban, 3-3 alkalommal, kéthetes időközben adunk be intradermális, szubkutáns, intramuszkuláris, orális illetve anális úton 8 db háromhetes Leghom-csirkéből álló csoportok madarainak. Az utolsó immunogén kezelés után két héttel a madarakat 25 000 sporulázott Eimeria tenella oocisztával orálisan fertőzzük. A madarakat a fertőzés után egy héttel leöljük és a vakbélsérülések pontszámát meghatározzuk.
A szubkutáns injekciókat a fentiekben leírt módon adjuk be. Az intramuszkuláris injekciókat a bal comb külső oldalán mélyen fecskendezzük be. Az intradermális injekciók beadása a jobb szárny elülső oldalán történik. Az orális adagolást 5 cm hosszúságú 18 gauge golyóhegyű tűvel végezzük el, az inoculumot a madár begyébe juttatjuk. Az anális adagolást 5 cm hosszúságú, 18 gauge, olívaolajba mártott hegyű tűvel végezzük, amelyet teljes hosszúságában a végbélnyílásba juttatunk. A madarakat az orális és anális beadagolás után néhány percen át álló illetve megfordított helyzetben tartjuk, az inokulum kilökődésének megakadályozása céljából.
A szubkutáns készítményt a korábbiakban a primer befecskendezésre felhasznált Freund-féle teljes adjuvánssal valamint az emlékeztető injekció kapcsán ismertetett Freund-féle nem teljes adjuvánssal adagoljuk. Az egyéb úton történő adagolás esetén felhasznált készítmény a megadott koncentrációban tartalmaz fehérjét, 0,02 M dikálium-hidrogén-foszfát pufferben (pH 6,8).
A kapott eredményeket a 6. táblázatban foglaljuk össze.
6. táblázat kD antigénnel, különböző adagolási módokkal végzett beoltás hatása csirkére
Kezelési mód1 Dózis (mg) Sérülési pontszám11 Súlygyarapodás/veszteségc (g)
3 hetes 5 hetes /he- tes
korban
IUC - - - 2,9 +58
Anti- gén/SC 5 5 5 2,3 +66
Anti- gén/SC 25 25 25 2,8 +68
BSA/SC 25 25 25 2,8 +47
Anti- gén/IM 5 5 5 2,3 +33
HU 212 505 Β
Kezelési mód* Dózis (mg) Sériilési pontszám1’ Súlygyarapodás/veszteségc (g)
3 hetes 5 hetes 7 hetes
Anti- gén/IM 25 25 25 2,3 +72
Anti- gén/A 5 5 5 2,5 +53
Anti- gén/A 25 25 25 2,6 +50
Anti- gén/O 5 5 5 l,8d +67
Anti- gén/O 25 25 25 2,5 +87
Anti- gén/ID 5 5 5 2,1 +26
Anti- gén/ID 25 25 25 l,9d + 114
UUC - - - 0 +114
a = Az IUC, Antigén, BSA és UUC jelölések oocisztákkal fertőzött nem-immunizált kontrollra, tisztított 65 kD fehérjére, szarvasmarha szérumalbuminra illetve nemfertőzött nem-immunizált kontrollra vonatkoznak. Az SC, IM, A, O és ID jelölések a szubkutáns, intramuszkuláris, anális, orális illetve intradermális adagolási módokra vonatkoznak.
b = A madarakat az utolsó beoltás után két héttel vagy leölésük előtt 7 nappal (fertőzött nem-immunizált kontroll) 25 000 sporulázott E. tenella oocisztával megfertőzzük. A kontrollmadarakat 9 hetes korukban fertőzzük meg. A pontszámokat a korábbiakban megadott 0-4 skála alapján értékeljük.
c = A madarak fertőzés időpontjában és a fertőzés után 7 nappal mért testtömegének különbsége.
d = P<0,05, IUC-hez viszonyítva.
A 6. táblázatból látható, hogy a legalacsonyabb vakbélsérülés-pontszámot abban az esetben kapjuk, ha a madarakat 5 gg antigénnel orálisan vagy 25 gg antigénnel intradermálisan immunizáljuk. Ezek az eredmények statisztikusan szignifikánsak. Az egyéb adagolási módok és más dózisok alkalmazása esetén a sérülési pontszám szintén alacsonyabb és ez a védő hatásra utal. A fenti módokon és az IUC-vel kezelt madarak pontszáma közötti különbségek azonban statisztikusan nem szignifikánsak.
A fenti kísérletek során nem figyeltünk meg dózissal lineáris reagálásokat és ez feltehetően a 65 kD antigén készítményekben levő eltérő nyomelemszennyezés- és/vagy pirogén-tartalomnak vagy egyéb tényezőknek tudható be.
7.2. Tehénhimlő vektorral végzett beoltás
Abból a célból, hogy a csirkéknek a találmányunk szerinti E. tenella antigénekkel történő immunizálását hatékonnyá tegyük, a 6A5 monoklonális anti-test által felismert 20 kD fehérjét kódoló 1,1 kb cDNS-t (14. ábra) és a 8A2 monoklonális anti-test által felismert kD fehérjét kódoló 1,1 kb cDNS molekulát (18. ábra) tehénhimlő vírusra klónozzuk, és az alábbiakban ismertetésre kerülő módon csirkékbe beoltjuk.
7.2.1. A vektor elkészítése
Valamennyi rekombináns vírusos timidin kináz (TK) lókuszba történő homológ rekombináción alapul [lásd Mackett és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415 (1982)]. A TK lókuszt a vakcina vírus (VV) HindlII J fragmensnek megfelelően térképezzük fel [Hruby et al., J. Virol. 43, 403 (1982)] és e fragmens egy részét szekvenciáljuk [Weir és tsai: J. Virol. 46, 530(1983)].
A rekombinációs vektor kialakítása céljából a VV HindlII J fragmenst pUC8-ba szubklónozzuk (24a. ábra). Ezt a szerkezetet Hpall-vel hasítjuk. A fragmenseket E. coli DNS polimeráz Klenow fragmenssel (Klenow) kezeljük és Hindni-al újrahasítjuk és a vírusos TK gént tartalmazó darabot alacsony olvadóponton agarózból izoláljuk. Az izolált fragmenst a HindHI-ba és a pUC8 vektor tompavégű (SÍ kezelés) EcoRI helyére ligáljuk. (24b ábra jobboldali rész). Ezután a HindlII helyet oly módon távolítjuk el, hogy a HindlHal emésztett DNS-t Klenow-val kezeljük és a vektor fragmenst újra ligáljuk. A VV promotor (7,5K promotor jelű) beillesztése céljából a vektort Clal-el és EcoRl-val hasítjuk.
A VV 7,5K promotor a vírus egyik legkisebb Sáli fragmensében helyezkedik el [Venkatesan és tsai: Cell 25, 805 (1981)]. A megfelelő fragmenst M13mp8-ba klónozzuk. Kiválasztunk egy olyan kiónt, amelyben a transzkripció iránya az M13mp8 EcoRI helye felé mutat (24a ábra baloldali rész). A DNS-t Scal-el és Smalel hasítjuk, BglII linkereket adunk hozzá és a DNS-t újra ligáljuk (24b ábra). A vírusos promotor szegmenst tartalmazó EcoRI-AccI fragmenst az M13 szerkezetből izoláljuk és a fentiekben leírt módon pUC8-TK7,5 Kx vektort eredményező módon pUC8-TK fragmensbe ligáljuk. Ezt az új vektort BglII-el és EcoRIval emésztjük.
Több klónozó hellyel rendelkező vektort oly módon hozunk létre, hogy a fend szerkezetbe valamely megfelelő poli-linkert illesztünk be. E célra az M13tgl31-ben (Amersham) levő poli-linkert választjuk (24d ábra). A poli-linker fragmenst oly módon izoláljuk, hogy a DNS fágot BglII-el és EcoRI-val emésztjük és a fragmenst a pUC8-TK 7,5KX szerkezetbe illesztjük be; ily módon az idegen antigénnel W-be rekombinálható végső bázis vektorhoz jutunk (24c ábra), amely a pUC8-TK7,5K.
A 8A2 monoklonális anti-testhez kötődő 28 kD fehérjét kódoló EcoRI fragmens nem tartalmazza a fehérje N-géncsoportjának szekvenciáját. A fehérje eredeti start kodonja és leader szekvenciája hiányzik.
A hiányzó tartományok pótlása céljából két különböző szerkezetet készítünk el és tesztelünk kifejezésre. Az első szerkezetben egy keretben levő start kodont képezünk oly módon, hogy a pUC8-TK-7,5K rekombináláshoz a bázis vektorban a poli-linker egy részét töröljük (24c ábra). A vektort EcoRI-vel és Smal-vel
HU 212 505 Β emésztjük, a poli-linker egy részét töröljük (24d ábra), majd újra ligáljuk. A fenti művelettel az Sphl restrikciós helyben levő ATG kodont az EcoRI fragmensen levő oociszta fehérje kódoló tartomány részére helyes leolvasó keretbe helyezzük. A művelet sikerességét az új poli-linker fragmens szekvenciálásával igazoljuk. A fenti szerkezet által kódolt fehérje várható N-terminális aminosav-szekvenciáját a 25A ábrán tüntetjük fel.
Abból a célból, hogy ne csupán a start kodon, hanem a hiányzó leader szekvencia DNS szekvenciáját is pótoljuk, az EcoRI fragmenst valamely maláriás antigén leader szekvenciája mögé helyes leolvasó keretbe helyezzük. A leader szekvencia izolálásához felhasznált maláriás antigénként az Ro-33 jelzésű 190 kD fehéijét alkalmazzuk [Certa és tsai: EMBO J. 6, 4137 (1987)]. Megjegyezzük azonban, hogy a fenti célra más leader szekvenciák (pl. kokcidiális leader szekvenciák) is alkalmazhatók.
A leader szekvenciát tartalmazó DNS fragmensek izolálása céljából az Ro-33 DNS-t Dral-el emésztjük. A PvuII és HindlII restrikciós enzimek felismerési helyeit tartalmazó fragmenst izoláljuk és HindlII-al emésztjük. Az eredeti pUC8-TK-7,5K vektor szerkezetet (24c ábra) Sall-el hasítjuk, Klenow-val kezeljük, majd HindlII-al emésztjük. Az izolált Dral-Hindül maláriás antigén leader fragmenst ebbe a vektor fragmensbe klónozzuk. Az P. falcipárum 190 kD fehérje és a 8A2 antitest által felismert és EcoRI fragmens által kódolt E. tenella antigén közötti fúziós fehérje kifejezéséhez a fenti szerkezetet alkalmazzuk. A fentemlített fúziós fehérje várható N-terminális aminosav-szekvenciáját a 25B ábrán tüntetjük fel.
A 28 kD fehérjét kódoló EcoRI fragmenst a bázis vektorban levő poli-linker EcoRI helyére kódoljuk (24c ábra). A fragmenst helyes orientációban tartalmazó szerkezeteket szaporítjuk és a tehénhimlő vírusba történő rekombináláshoz felhasználjuk.
A iniciációs helynek a fragmens transzláció céljához a bázis vektorba történő beépítésénél alkalmazott módszer következtében (lásd fent) a rekombináns tehénhimlő vírus által kifejezendő génre két különböző N-terminális szekvencia várható (25. ábra). Az első szerkezet esetében (25A ábra) az eredeti szekvenciához csupán 3 további aminosav adódik hozzá (Met, Arg, Trp), a második szerkezetben azonban a 190 kD maláriás antigén leader szekvenciájából leszármaztatható összesen 47 aminosav a 8A2 monoklonális anti-test által felismert polipeptid Ngéncsoportjával fuzionál (25B ábra). A leader szekvencia potenciális hasítási helyén végzett feldolgozással az addicionális aminosavak közül 19-et eltávolítunk és ily módon Val-lal, Thr-el, His-el kezdődő érett fehérjét nyerjük.
A 6A5 monoklonális anti-test által felismert 20 kD fehérjét kódoló EcoRI fragmens a teljes szekvenciát tartalmazza. Ezt a fragmenst a fent ismertetett módon további manipuláció nélkül klónozzuk a VV vektor EcoRI helyébe.
A kokcidiális antigéneket kódoló fenti géneket rekombináns vírusok szelektálására használatos kétlépéses eljárással rekombináljuk egy WR tehénhimlő törzsbe.
Az első lépés során CV1 majomsejteket I. táptalajban [Eagle-féle minimális eszenciális táptalaj (MÉM), 5% magzati szarvasmarha szérum (FCS; Amimedcég), penicillin/streptomicin (100 egység/ml illetve 100 pg/ml) és 2 mM glutamin; valamennyi reagenst a Gibco cégtől szereztük be] 8 cm2-es tenyészlemezeken 80-90%-os egybeolvadásig tenyésztünk. A táptalajt eltávolítjuk és 0,2 ml vírus szuszpenzióval helyettesítjük, amely 0,1 plakk-képző egység (pfu)/sejt koncentrációban hőmérsékletre érzékeny ts N7 tehénhimlő vírustörzset tartalmaz [Drillen és tsai: Virology 131, 385 (1983)]. A lemezeket szombahőmérsékleten egy órán át állni hagyjuk, majd minden lemezhez 2 ml I táptalajt adunk és a lemezeket 2 órán át 33 ’C-on (vírus növekedését lehetővé tevő hőmérsékleten) inkubáljuk, CO2 inkubátorban [Kieny és tsai: Nature 312, 163 (1984)].
A fenti inkubációs időszak befejeződése előtt másfél órával DNS-tartalmú kalcium-foszfát csapadékot készítünk. Ez HeBS puffért (280 mM nátrium-klorid,
1,5 mM nátrium-hidrogén-foszfát, 50 mM HEPES) 200 ng tisztított Wr tehénhimlő törys vírus DNS-t és 2 ng tisztított kokcidiális, antigén-gént magábanfoglaló plazmid DNS-t tartalmaz, 0,55 ml össztérfogatban. Minden DNS-t μΐ TE-pufferben adunk hozzá (10 mM trisz-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA). A kapott oldathoz enyhe rázogatás közben 0,55 ml 250 mM kalcium-klorid-oldatot csepegtetünk. Az elegyet szobahőmérsékleten 20 percen át állni hagyjuk.
A táptalajt 2 órás inkubáció után a tenyészlemezekről leszívatjuk és 0,25 ml fenti DNS-tartalmú kalciumcsapadékkal helyettesítjük és szobahőmérsékleten egy órán át állni hagyjuk. Ezután minden lemezhez 2 ml I táptalajt adunk és a lemezeket 5%-os CO2 inkubátorban 39,5 ’C-on 2 órán át inkubáljuk (Kieny és tsai fent idézett közleménye). A ts n7 vírus ezen hőmérsékleten nem képes replikálódni és ily módon olyan vírusokat szelektálunk, amelyek legalábbis a ts7 lókuszban rekombinálódnak. Minthogy a kalcium-foszfát a sejtnövekedést gátolja, a táptalajt 2 órás inkubálás után eltávolítjuk és a sejteket 1 ml PBS-el enyhe rázogatás közben háromszor mossuk. A végső PBS oldatot leszívatjuk és minden lemezhez 2 ml I közeget adunk. Az inkubálást 39,5 ’C-on CO2 inkubátorban 2 napon át folytatjuk.
A tenyészetlemezeket a táptalajjal és sejtekkel együtt 2 napos inkubálás után rövid ideig -30 ’C-os térbe helyezzük, majd felengedjük, a még odatapadt sejteket a lemez aljáról lekaparjuk és a szuszpenziót a fentiekben leírt módon ultrahanggal kezeljük. A második szelekciós lépéshez az ily módon nyert homogenizátumot használjuk fel.
Ennél a lépésnél 8 cm2-es tenyészlemezekben növekvő humán 143B TK sejtek (ATCC CRL 8303) közel egybefüggő pályáját eltávolítjuk és 0,2 ml hígítatlan homogenizátumra vagy PBS-el 1:5 vagy 1:30 arányban hígított homogenizátumra cseréljük le. A TK sejtek fertőzését szobahőmérsékleten 1 órán át végezzük.
Inkubálás után a sejtekhez 2 ml félszilárd II táptalajt [I táptalaj nem-esszenciális aminosavakkal (GIB27
HU 212 505 Β
CO; rendelési szám 043-1140)], esszenciális vitaminokkal (GIBCO; rendelési szám 042-1120) és 1% agarózzal együtt, 0,1 mg/ml bróm-deoxiuridin tartalommal (BUdR, Sigma Chemical Co) adunk. A lemezeket 37 ’C-on széndioxid-inkubátorban 16-24 órán át inkubáljuk. A sejtekre fenti komponenseken kívül 0,2% semleges vöröst tartalmazó félszilárd II. táptalaj második réteget helyezünk és a lemezeket további 16-24 órán át inkubáljuk. Tisztán látható színtelen plakkok jelennek meg és a vírust egyedi klőnok formájában oly módon nyerjük ki, hogy a plakk-tartományt Pasteur pipettával átszúrjuk (plakk-tisztítás). Az ily módon izolált vírust a fentiek szerint CV1 sejteken tenyésztjük és 143 tk* sejteken második és harmadik plakk-tisztításnak vetjük alá. Ezeket a plakk-tisztftott vírusokat a fentiekben leírt módon tenyésztjük és tisztítjuk.
A kokcidiális antigéneknek a rekombináns vírus által történő kifejezése céljából rekombináns vírussal fertőzött CV1 sejteket centrifugán (Hettich Mikrorapid K, 100%, 20 ‘C-on 3 percen át) kiülepítünk és az üledéket PBS-el kétszer mossuk, újracentrifugáljuk és PBS-ben újra szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót mikroszkópüveg tárgylemezre (Flow) visszük fel és száradni hagyjuk. A második módszer értelmében CV1 sejteket közvetlenül mikroszkóp tárgylemezeken (Miles Lab-Tek 4808) növesztünk, a sejteket a vírussal megfertőzzük és 1-2 napon át inkubáljuk. A sejteket a növekedési PBS-el növekedési táptalajmentesre mossuk és a tárgylemezeken szobahőmérsékleten száradni hagyjuk. A sejtek rögzítése céljából a tárgylemezeket legalább 1 órán át -30 ‘C-on acetonba mártjuk és szobahőmérsékleten száradni hagyjuk.
PBS-ben hígított anti-kokcidiális antigén monoklonális anti-testeket a mikroszkóp tárgylemezekre rétegezzük oly módon, hogy a sejteket a folyadék egyenletesen befedje. A tárgylemezeket 37 ’C-on 1 órán át nedves kamrában tartjuk, majd PBS-el többször mossuk. A tárgylemezekre megszáradás nélkül szintén PBS-el hígított második anti-testet (FITC jelzett kecske anti-egér IgG, Nordic) rétegezünk majd a tárgylemezeket 37 ’C-on 1 órán át nedves kamrába helyezzük és ily módon az anti-testeket reagálni hagyjuk. A tárgylemezeket PBS-el néhányszor mossuk, majd teljesen megszáradni hagyjuk. A tárgylemezre néhány csepp 20 térfogat/térfogat% glicerint tartalmazó vizet pipettázunk és tetejére fedőüveget (Menzel 24x60) helyezünk. A sejtkészítmény fluoreszcenciáját mikroszkópon UV-fény alatt követjük nyomon (Zeiss ICM 405, F10 vagy Planapo 63 objektív).
A Wr vírustörzs csaknem valamennyi sejttípusban multiplikálható (Drillen és tsai: J. Virology 28, 843 (1978)] és multiplikációja plakk-képződésen keresztül közvetlenül megfigyelhető. Nagy vírus-készletek előállításához azonban a legtöbb esetben csirke embrió, fibroblaszt (CEF) sejteket alkalmazunk.
A CEF sejteket oly módon nyeljük, hogy 11 napos embriókat a tojásokból izolálunk, a végtagoktól megszabadítjuk, kis darabkákra vágjuk és 0,25%-os tripszin-oldatban (Difco) szobahőmérsékleten 2 órán át újraszuszpendáljuk. A kapott szuszpenziót 1 térfogat I táptalajjal hígítjuk és sejtszitán (Bellco, 150 mesh) átszűrjük, majd a sejteket kiülepítjük. (Hermia centrifuga, 5 perc, percenkénti 2000 fordulat, szobahőmérséklet). A sejtüledéket az eredeti térfogat egynegyedének megfelelő mennyiségű I táptalajban újraszuszpendáljuk és a kapott CEF sejtszuszpenziót sejttenyészet lemezekbe inokuláljuk. A tenyészeteket a kiindulási sejtsűrűségtől függően 1-2 napon át hagyjuk növekedni, majd közvetlenül vagy 1-2 további áthaladás után használjuk fel a fertőzéshez. Az ilyen primer tenyészetek kialakítására vonatkozó összefoglalás az alábbi irodalmi helyen található: Frehney, Culture of Animál Cells, Alán R. Liss Verlag, New York, 1983, 11. fejezett 99. oldal.
A fertőzést oly módon hajtjuk végre, hogy 175 cmes tenyész-üvegekben (Falcon 3028) növekedő 8090%-ban összefüggő CEF sejtekből a táptalajt eltávolítjuk és a sejteket vírust [0,1 pfu/sejt, 0,01 ml/cm2] tartalmazó PBS oldatban szobahőmérsékleten másfél órán át (20 ’C) inkubáljuk [PBS/Dulbeco, Amimed]. Ezután I táptalajt adunk hozzá (0,2 ml/cm2) és az üvegeket 37 ’C-on 2-3 napon át addig inkubáljuk, amíg a sejtek kb. 80%-ában lízis lép fel. A kapott törzsoldatot a vírustisztítás előtt a sejtekkel és táptalajjal együtt az eredeti tenyészetüvegekben -30 ’C-on tároljuk.
A soron következő tisztítási lépések segítségével valamennyi gazdasejt specifikus komponenstől mentes víruskészítményt nyerünk. A -30 ’C-on tárolt fertőzött sejttenyészeteket kiengedjük és a visszamaradó sejteket az üveg felületéről rázogatással vagy kaparással eltávolítjuk.
A sejteket és a vírust a közegből kicentrifugáljuk (Sorvall centrifuga, GSA forgórész, 1 óra, percenként 5000 fordulat, 10 ’C). A sejtüledéket és a vírusrészecskéket PBS-ben újraszuszpendáljuk (az üledék térfogata 10-20-szorosában) majd a fentiekben ismertetett módon újra centrifugáljuk. Az üledéket 10-szeres térfogatú RSB pufferben újraszuszpendáljuk (10 mM triszHC1, pH 8,0, 10 mM kálium-klorid, 1 mM magnézium-klorid).
A visszamaradó ép sejtek lizálása és a vírusnak a sejtmembránokból történő felszabadítása céljából a fenti szuszpenziót ultrahangos kezelésnek vetjük alá (kétszer, 10 másodperc, 60 Watt, szobahőmérséklet, Labsonic 1510 4 mm-es próba). Az elegyet Sorvall GSA forgórészben percenkénti 3000 fordulat mellett 10 ’C-on 3 percen át centrifugáljuk. A fenti módszerrel sejtmagoktól és nagz sejtmaradványoktól mentes vírusszuszpenziót nyerünk. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk és az üledéket RSB pufferben újraszuszpendáljuk, majd a fent ismertetett módon ultrahanggal ismét kezeljük, centrifugáljuk.
A második felülúszót az elsővel egyesítjük, 10 ml 35%-os szacharóz párnára (Fluka, 10 mM trisz-HClben, pH 8,0) felvisszük és Kontron TST 28,38/17 forgórészben (Beckman SW 27 analóg) percenkénti 14 000 fordulat mellett 10 ‘C-on 90 percen át centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk és a vírusrészecskék üledékét 10 ml 1 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0) újraszuszpendáljuk, az elegy homogenizálása céljából ult1
HU 212 505 Β rahanggal kezeljük (szobahőmérsékleten kétszer 10 másodpercig, a fent ismertetett módon), majd további tisztítás céljából lépés gradiens oszlopra felvisszük.
A lépésgradiens 10 mM trisz-HCl-ben (pH 8,0) készített szacharóz-oldatok 5 ml-es aliquot részeiből áll az alábbi koncentrációban: 20%, 25%, 30%, 35% és 40%. Ezt a gradienst kontron TST 28,38/17 forgórészben percenkénti 14 000 fordulat mellett 10 ’C-on 35 percen át centrifugáljuk. A vírusrészecskéket tartalmazó néhány sáv a 30-40%-os szacharóz-tartományban láthatóvá válik. Ezt a gradiens tartományt eltávolítjuk (10 ml) a szacharóz oldatot 20 ml PBS-el hígítjuk és a vírusrészecskéket kiülepítjük. (Kontron forgórész, 90 perc, percenkénti 14 000 fordulat, 10 ’C). Az üledék csaknem kizárólag vírusrészecskéket tartalmaz (az optikai sűrűség mérés és plakk meghatározás összehasonlítása alapján, lásd az alábbiakban). Az üledéket PBSben újraszuszpendáljuk oly módon, hogy az átlagos víruskoncentráció 1-5x10’ pfu/ml. Ezt a vírusállományt közvetlenül felhasználjuk vagy PBS-el hígítjuk.
A víruskoncentráció és a vírus-állomány meghatározására két módszert alkalmazunk. A vírusrészecskék abszolút koncentrációját előnyösen határozhatjuk meg oly módon, hogy a törzs-oldat optikai sűrűségét (OD) 260 nm mellett (OD/260) spektrofotométerben (Uvikon 860) mérjük, aholis 1 OD/260 mintegy l,2xl010 részecske/ml értéknek felel meg [Joklik: Virology 18,9 (1962)]. A víruskoncentrációt továbbá a vírusnak sejteken történő titrálásával is meghatározzuk (plakk meghatározás) feltételezve, hogy 60 vírusrészecskéből csak egy képes megfertőzni a sejtet.
A víruskoncentráció tenyészsejteken történő meghatározása céljából CEF sejteket 8 cm2-es műanyag tenyészetlemezeken (Falcon 3001) I táptalajban növesztünk. Miután a sejtek egybeolvadása a 80-90%os értéket elérte, a közeget eltávolítjuk, 0,2 ml PBSben készített híg vírus-oldattal helyettesítjük és szobahőmérsékleten egy órán át állni hagyjuk. A vírus törzsoldatot 10-szeres lépésben hígítjuk. Az inkubálást szobahőmérsékleten végezzük el, majd minden lemezhez 2 ml félszilárd I táptalajt (I táptalaj+1% agaróz) adunk és a lemezeket 16-24 órán át széndioxid inkubátorban tartjuk. Ezután az élő sejteket 2 ml félszilárd 0,2% semleges vörös színezéket (Fluka 72 210) tartalmazó I táptalaj rárétegzésével megfestjük és a lemezeket további 16-24 órán át inkubáljuk. A színtelen plakkokat mikroszkóp alatt megszámláljuk.
7.2.2. Csibe immunizáció
A teszt segítségével meghatározzuk, hogy a 8A2 és 6A5 monoklonális anti-testekhez specifikusan kötődő E. tenella fehérjéket kódoló tehénhimlő vírusos vektor gének képesek-e csirkéknek a patogén E. tenella törzsek [T2-750/7, T7-776/1 vagy T6-771] sporulázó oocisztái által előidézett fertőzésekkel szemben történő megvédésére. Az alábbi tesztet végezzük el:
Valamennyi teszthez az E. Wuthrich, Belp, Svájc baromfikeltető állomás által szállított fiatal kakasokat (Warren tenyészet) alkalmazunk. Egy napos csirkéket a megjelölt kor eléréséig melegített helyen tenyésztünk majd a madarakat különböző teszt-csoportokba osztjuk és huzalokból kialakított fenekű ketrecekben kokcidiózis-mentesen tartunk. A teszt során a madarakat kereskedelmi forgalomban levő, kukorica-, búza- és szójababliszt-alapú Broiler táppal (nyers fehérje 21,7%) etetjük.
Az első teszt során 42 azonos testtömegű csirkét véletlen kiválasztás alapján három 6-6 madarat tartalmazó csoportba osztunk. A csirkéket 3 nap múlva rekombináns vagy vad-típusú tehénhimlő vírussal immunizáljuk oly módon, hogy a madarak jobb szárnyának szövetébe a megfelelő vírus szuszpenzióból (1010 pfu/ml PBS-ben) 2x50 μΐ-t szubkutáns úton befecskendezünk. Két rekombináns himlő vírust alkalmazunk, mindkettő a 8A2 anti-testhez specifikusan kötődő E. tenella fehérjét kódoló DNS-t tartalmaz. Az egyik vírus (jelzése 37K M3) a 190 kD maláriás antigén leader szekvenciáját tartalmazza, míg a másik vírusban (jelzése 37K K3) ez a leader szekvencia nincs jelen. Negatív kontrollként a vad-típusú himlő WR törzs szolgál.
Az első injekció beadása után egy héttel a csirkék bal szárnyának szövetébe azonos körülmények között, a fentiekben leírttal azonos tehéhimlővírus típusú felhasználásával emlékeztető oltást fecskendezünk be. Az emlékeztető oltás beadása után egy héttel (59. nap) minden csirkéből 2 ml-es vérmintát veszünk és a szérumot specifikus anti-testek jelenlétére ELISA meghatározásnak vetjük alá. Ennek során a mikrotiter-lemez (NUNC Immunoplate F96) mélyedéseibe E. tenella sporozitáinak szuszpenzióját töltjük (10 000 sejt/ml) és a csirkeszérummal növekvő hígításban inkubáljuk. Kimutató szerként torma-peroxidázhoz konjugált kecske anti-csirke immunoglobulinokat (Kirkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, USA) alkalmazunk és szubsztrátumként tetrametil-benzidint használunk. A kifejlődő kék színt Titertek Multiskan MCC/340 MklI berendezésben 450 nM hullámhossz mellett olvassuk le. A Titert a háttér-érték legalább kétszeresének megfelelő optikai sűrűséget eredményező szérum-hígítás reciprok értéke formájában adjuk meg.
Az első injekció beadása után 4 héttel (73. nap) a csirkéket 50 000 sporulázott oocisztával megfertőzzük. A kokcikiális inokulumot 1 ml fiziológiás konyhasóoldatba szuszpendáljuk és kalibrált fecskendőn levő tompa tű segítségével orálisan adjuk be a csirkéknek. A 80. napon az összes csirkét leöljük, felboncoljuk és a vakbélben levő durva sérüléseket az alábbi skála szerinti értékeljük:
= normális;
= enyhe fertőzöttség;
= közepes fertőzöttség;
= súlyos sérülések;
= a csirkék kokcidiózisban elpusztultak.
Az ürüléket a fertőzéses ciklus utolsó két napján kvantitatívan összegyűjtjük és a kiürített oociszták számát reprezentatív ürülékmintákban meghatározzuk. Az eredményeket a 7. táblázatban foglaljuk össze.
HU 212 505 Β
7. táblázat napos csibék beoltása a 28 kD fehérjét kifejező himlő vírusokkal
Vírus1 Csibék száma Anti-test titer Vakbélsé- rulések pontszáma Naponta kiürített oocisz- ták/csibe (xlO-6)
37 K3 6 430 1,33 149
37 M3 6b 1360 1,50 107
Vad-típus 6 200 2,67 271
a = A 37 M3 vírus 190 kD maláriái fehérje leader szekvenciáját tartalmazza; a 37 K3 vírus nem. Vad-típusú vírusként a WR tehénhimlő törzset alkalmazzuk b = A kokcidiális fertőzés előtt két csirkét leölünk.
A 7. táblázatból kitűnik, hogy a vad-típusú kontroll vírussal összehasonlítva a 28 kD fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó mindkét vírus a parazitával szemben specifikus anti-testek termelését indukálja és az oociszta fertőzéssel szemben bizonyos védettséget biztosít. Ezt a védettséget a vakbélsénilés-pontszám és az oociszta-kiválasztás csökkenése egyaránt igazolja. Akokcidiózissal szembeni védelem tekintetében a két vírus egyaránt hatékony, a maláriás káderrel képezett szerkezet (37 M3) azonban csirkén a sporozoita antigénnel szemben magasabb antitest titert idéz elő, mint a standard vírus szerkezet (37 K3) és ez a fúziós szerkezet előnyös voltát jelzi.
A második tesztben a fiatal kakasokat a fentiekben leírt módon - azonban a 22. naptól - tenyésztjük és immunizáljuk. Ebben az időpontban 2X108 pfu vírusos dózist adunk be 100 ml PBS-ben. A felhasznált vírusok négy különböző tehénhimlő vírus készítményből származnak, amelyek a 28 kD fehérjét kódoló DNS-t tartalmaznak, a maláriás leader szekvencia nélkül (37 K5) vagy azzal együtt (37 Ml9). Kontrollként ugyanazt a vad-típusú WR vírustörzset alkalmazzuk. A madarak jobb szárnyának szövetébe ugyanabban a dózisban az első injekció beadása után egy vagy két héttel emlékeztető oltást fecskendezünk.
Az 57 napon (5 héttel az első injekció után) az összes csirkét 50 000 sporulázott oocisztával megfertőzzük. A csirkéket egy hét múlva leöljük, felboncoljuk és a fentismertetett skála segítségével a vakbélsérülések pontszámát megállapítjuk. A fertőzés utáni napi súlygyarapodást és az utolsó két napon mutatott oociszta ürítést szintén meghatározzuk.
8. táblázat napos csibék beoltása a 28 kD fehérjét kifejező himlő vírussal
Vírus1 Emlékeztető oltásig eltelt idő (hét) Csibék száma Napi súlygya- rapodás (g) Vakbél- sérülés pontszá- ma Napi oociszta ürí- tés/csibe (xlO6)
37 K5 1 8 11,45 2,38 21,0
37M19 1 8 15,61 2,13 24,0
Vad- típus 1 8 8,77 2,50 33,1
Vírus1 Emlékeztető oltásig eltelt idő (hét) Csibék száma Napi súlygya- rapodás (g) Vakbél- sérülés pontszá- ma Napi oociszta ürí- tés/csibe (xlO6)
37 K5 2 8 5,14 2,25 22,3
37M19 2 8 11,79 2,13 32,7
Vad- típus 2 8 8,34 2,63 37,0
a = A 37 M19 vírus a 190 kD maláriás antigén leader szekvenciáját tartalmazza, míg a 37 K5 vírus nem. Vad-típusú vírusként WR tehénhimlő törzset alkalmazunk.
A 8. táblázatból kitűnik, hogy a vad-típusú kontroll vírussal összehasonlítva a kokcidiális DNS-t tartalmazó mindkét vírus patogén oociszta fertőzéssel szemben bizonyos védettséget biztosít. Ezt a súlygyarapodás, vakbélsérülési pontszám és oociszta ürítés egyaránt igazolja. A két vírus hozzávetőlegesen egyformán hatékony. Amennyiben az emlékeztető oltást egy héttel a primer injekció után adjuk be, valamivel jobb súlygyarapodást és alacsonyabb oociszta ürítést tapasztalunk, azonban a vakbélsérülési pontszám a két emlékeztető oltás beadási módszer esetében hozzávetőlegesen azonos.
A harmadik teszt során 3 beoltás hatását határozzuk meg. 21 napos csirkék jobboldali szárnyának szövetébe vad-típusú tehénhimlő vírus vagy a 6A5 monoklonális anti-testhez specifikusan kötődő 20 kD fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó vírus 2x50 μΐ aliquot részletét (3X1O9 pfu/ml) fecskendezzük. Minden csirke bal szárnyának szövetébe a 28. napon azonos dózisban emlékeztető oltást adunk. Néhány csibe mindkét szárnyának szövetébe a 35. napon ugyanebben a dózisban további emlékeztető oltást fecskendezünk. Más csirkéket nem oltunk be (kontroll).
A 42. napon minden csibétől vérmintát veszünk és a parazita sporozoita szakasza elleni specifikus anti-testek jelenlétét ELISA segítségével meghatározzuk. Az összes csibét a 49. napon (4 héttel az első injekció után) 50 000 sporulázó oocisztával megfertőzzük. A csibéket egy hét múlva leöljük, felboncoljuk és a durva vakbélsérülések pontszámát a fent ismertetett módon meghatározzuk. A napi súlygyarapodás kiszámításához a testtömeget naponta feljegyezzük és az oociszta ürítés meghatározása céljából az ürüléket a fertőzési ciklus utolsó két napjában összegyűjtjük. Az eredményeket a 9. táblázatban foglaljuk össze.
9. táblázat napos csibék beoltása a 20 kD fehérjét kifejező himlő vírussal
VV Befecs- kende- zések száma Csibék száma Anti- test Napi súly- gyara- podás (g) Vak- bélsé- rülési pont- szám Oo- ciszta ürí- tés/g ürülék (xlO-6)
rVV 2 6 210 2,9 2,33 1,69
rVV 3 6 7200 4,2 1,67 1,32
HU 212 505 Β
WT 3 6 560 -4,1 2,67 2,09
N - 6 0 -3,8 2,83 1,75
rVV = kokcidiális DNS-t tartalmaz;
WT = vad-típusú;
N = A 9. táblázat adataiból kitűnik, hogy a kokcidiális antigént termelő vírus háromszori befecskendezése a sporozoita fehérjék elleni specifikus anti-testek magas titerét eredményezi. Ezenkívül e rekombináns vírussal történő mindkét kezelés az oociszta fertőzéssel szemben bizonyos védettséget ad. Ezt a nagyobb súlygyarapodás, kisebb vakbélsérülési pontszám és csökkentett oociszta ürítés egyaránt igazolja. A be nem oltott kontrollal történő összehasonlítás azt mutatja, hogy a vad-típusú tehénhimlő vírussal történő beoltás nem ad védettséget. így tehát a kokcidiális DNS-t tartalmazó vírus által biztosított védelem specifikus és nem a tehénhimlő vírus által okozott általános immun-stimulációnak köszönhető. Három beoltás hatékonyabb mint kettő.
A jelen találmány a szakember számára nyilvánvaló módon sokféleképpen módosítható és változtatható anélkül, hogy a találmány szellemétől, oltalmi körétől és lényegétől eltérnénk. A leírásban példálódzó jelleggel találmányunk néhány előnyös foganatosítási módját és kiviteli alakját ismertetjük, anélkül, hogy a szabadalom oltalmi körét ezekre korlátoznánk.

Claims (18)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehéije előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehérjét kódoló DNS-szekvenciát magábanfoglaló rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet a DNS-szekvencia vagy fragmense kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk; mimellett a fentemlített felületi antigén látszólagos molekulatömege mintegy 28, 37, 120 vagy nagyobb mint 200 kilodalton, és az American Type Culture Collection intézménynél letétbe helyezett és HB 9707-HB 9712 számon hozzáférhető egy vagy több monoklonális anti-testhez specifikusan kötődik; és
    b) a fehérjét a tenyészetből izoláljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15. ábrán feltüntetett aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy annak funkcionális ekvivalensét kódoló DNS szekvenciát magában foglaló rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztjük.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 17. ábrán feltüntetett aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy annak funkcionális ekvivalensét kódoló DNS szekvenciát magábanfoglaló rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztjük.
  4. 4. Az igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 19. ábrán feltüntetett aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy annak funkcionális ekvivalensét kódoló DNS szekvenciát magábanfoglaló rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztjük.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 21. ábrán feltüntetett aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy annak funkcionális ekvivalensét kódoló DNS szekvenciát magábanfoglaló rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztjük.
  6. 6. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyikében meghatározott fehérjét kódoló DNS szekvencia kifejezésére alkalmas transzformált gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gazdaszervezetet a fentemlített DNS-t tartalmazó rekombináns vektorral önmagában ismert módon transzformálunk.
  7. 7. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjék elleni anti-testek előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti fehérjét önmagában ismert módon a fehéijével szembeni immunreakció kiváltására képes állatba fecskendezzük, és a termelt anti-testeket önmagában ismert módon izoláljuk.
  8. 8. Eljárás baromfi kokcidiózissal szemben történő immunizálására alkalmas vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyikében meghatározott fehérjét gyógyászatilag alkalmas hordozóanyaggal összekeverjük.
  9. 9. Eljárás valamely Eimeria felületi antigén egy vagy több immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó fehérjét kódoló DNS szekvencia vagy fragmense előállítására, amely felületi antigén látszólagos molekulatömege mintegy 28, 37, 120 vagy nagyobb mint 200 kilodalton, és az American Type Culture Collection intézménynél letétbe helyezett, HB 9707-9712 számon hozzáférhető egy vagy több monoklonális anti-testhez specifikusan kötődik, azzal jellemezve, hogy nukleotidokat a fentiekben leírt fehérje aminosav szekvenciája által meghatározott szekvenciában ismert módszerekkel polimerizálunk, vagy mRNS-t Eimeria sporulázó oocisztákból vagy merozoitákból izolálunk és a fenti DNS szekvencia szintézisében templátként ismert módszerekkel alkalmazunk.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 14. ábrán feltüntetett nukleotid szekvenciát teljesen vagy részben tartalmazó DNS-szekvenciát állítunk elő.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16. ábrán feltüntetett nukleotid szekvenciát teljesen vagy részben tartalmazó DNS szekvenciát állítunk elő.
  12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 18. ábrán feltüntetett nukleotid szekvenciát teljesen vagy részben tartalmazó DNS szekvenciát állítunk elő.
  13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 20. ábrán feltüntetett nukleotid szekvenciát teljesen vagy részben tartalmazó DNS szekvenciát állítunk elő.
  14. 14. Eljárás rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 9-13. igénypontok bármelyike
    HU 212 505 Β szerinti eljárással előállított DNS szekvenciát valamely vektorba ismert módszerekkel működőképesen építünk be.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kompatíbilis gazdaszervezetben a DNS 5 kifejezésének irányítására képes rekombináns vektort állítunk elő.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns vektorként valamely himlővírus vektort állítunk elő.
  17. 17. A 14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns vektorként egy E. coli vektort állítunk elő.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns vektorként pEV/2-4 vektort állítunk elő.
HU892814A 1988-06-03 1989-06-02 Process for the preparation of recombinant coccidiosis vaccines HU212505B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20272188A 1988-06-03 1988-06-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT52963A HUT52963A (en) 1990-09-28
HU212505B true HU212505B (en) 1996-07-29

Family

ID=22750986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU892814A HU212505B (en) 1988-06-03 1989-06-02 Process for the preparation of recombinant coccidiosis vaccines

Country Status (22)

Country Link
US (2) US5661015A (hu)
EP (1) EP0344808B1 (hu)
JP (1) JP3051130B2 (hu)
KR (1) KR0156545B1 (hu)
CN (3) CN1040126C (hu)
AR (1) AR241942A1 (hu)
AT (1) ATE120489T1 (hu)
AU (1) AU635704B2 (hu)
CA (1) CA1340538C (hu)
DE (1) DE68921923T2 (hu)
DK (1) DK272889A (hu)
ES (1) ES2070866T3 (hu)
FI (1) FI101453B (hu)
HU (1) HU212505B (hu)
IE (1) IE67544B1 (hu)
IL (1) IL90489A0 (hu)
MC (1) MC2039A1 (hu)
NO (1) NO303876B1 (hu)
NZ (1) NZ229377A (hu)
PT (1) PT90727B (hu)
YU (1) YU47880B (hu)
ZA (1) ZA893740B (hu)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5174993A (en) * 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5279960A (en) * 1984-07-05 1994-01-18 Enzon Corp. 25 KD coccidial antigen of eimeria tenella
US5273901A (en) * 1984-07-05 1993-12-28 Enzon Corp. Genetically engineered coccidiosis sporozoite 21.5 Kb antigen, ac-6b
US5824656A (en) * 1988-01-15 1998-10-20 Merck & Co., Inc. Recombinant and native group B eimeria tenella immunogens useful as coccidiosis vaccines
DE68927350T2 (de) * 1988-07-05 1997-04-24 British Tech Group Usa Gentechnologisch hergestellter coccidiose-impfstoff
ZA902147B (en) * 1989-03-28 1990-12-28 Akzo Nv Coccidiosis vaccine
ATE94208T1 (de) * 1989-06-21 1993-09-15 Akzo Nv Eimeria tenella-vakzin.
ZA9010461B (en) * 1990-01-26 1991-10-30 Hoffmann La Roche Recombinant coccidiosis vaccines-5-7 eimeria surface antigen
JPH07500483A (ja) * 1991-03-14 1995-01-19 ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・ユーエスエイ・インコーポレーテッド 組換え体抗コクシジアワクチン
US6008342A (en) * 1991-07-12 1999-12-28 Roche Vitamins Inc. DNA encoding eimeria antigen
US5403581A (en) * 1991-07-12 1995-04-04 Hoffmann-La Roche Inc. Coccidiosis vaccines
JP3534774B2 (ja) 1995-06-07 2004-06-07 ファイザー・インク コクシジウム症に対する卵内予防接種
US6500438B2 (en) 1995-06-07 2002-12-31 Pfizer Incorporated In ovo vaccination against coccidiosis
ES2253746T3 (es) * 1995-07-03 2006-06-01 Akzo Nobel N.V. Vacuna contra la coccidiosis aviar.
AU2590997A (en) * 1996-03-29 1997-10-22 Life Technologies, Inc. Method for increasing viability and transformation efficiency of bacteria during storage at low temperatures
US6632923B1 (en) * 1996-11-27 2003-10-14 Boston Heart Foundation, Inc. Low density lipoprotein binding proteins and their use in diagnosing and treating atherosclerosis
US6627205B2 (en) 1997-12-01 2003-09-30 Pfizer Incorporated Ovo vaccination against coccidiosis
US6984378B1 (en) 1999-02-26 2006-01-10 Pfizer, Inc. Method for the purification, recovery, and sporulation of cysts and oocysts
ZA200400479B (en) * 2001-07-06 2006-05-31 Abic Biolog Lab Teva Nucleic acids encoding recombinant 56 a 82 KDA antigens from gametocytes of Eimeria maxima and their use
KR100490669B1 (ko) * 2001-08-30 2005-05-19 (주)아비코아생명공학연구소 조류 콕시듐증을 유발하는 에이메리아 종의 포자소체 표면항원에 대한 ｓｃＦｖ 재조합 항체
WO2003020917A1 (en) 2001-08-30 2003-03-13 Embrex, Inc. Improved methods for producing oocysts
JP3995541B2 (ja) * 2002-06-28 2007-10-24 株式会社ゲン・コーポレーション 抗鶏コクシジウム症組成物
DE10330235A1 (de) * 2003-07-04 2005-01-20 Bayer Healthcare Ag Neues Eimeria Gen und Protein sowie deren Verwendung
US7348401B2 (en) * 2003-09-10 2008-03-25 Innate Biotech, Inc. Peptides that inhibit complement activation
DE602005021873D1 (de) * 2004-03-12 2010-07-29 Univ Georgia Neues impfstoffadjuvans und dessen herstellung und verwendung
US7087425B2 (en) * 2004-03-31 2006-08-08 Embrex, Inc. Method of purifying oocysts using enzymatic digestion of fecal debris
US20110078828A1 (en) * 2004-09-10 2011-03-31 Guardian Biotechnologies Inc. Multi epitope vaccine for poultry
DE602005003429T2 (de) * 2004-12-01 2008-10-02 Zeon Corp. Kodierende DNS für ein Eimeria Apical Membran Antigen 1 und dessen Verwendungen
CN100398156C (zh) * 2005-11-23 2008-07-02 南京农业大学 用于预防鸡球虫病的免疫调节型dna疫苗
US20080194006A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Embrex, Inc. Methods of releasing sporocysts from oocysts using controlled shear forces
US11701683B2 (en) 2010-12-22 2023-07-18 The Procter & Gamble Company Methods for foil stamping parts having asymmetrical edges
US10758601B2 (en) 2016-12-22 2020-09-01 Intervet Inc. Eimeria vaccine with improved efficacy
WO2020243240A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 Case Western Reserve University Compositions and methods for preserving dna methylation

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
DE2814039C3 (de) 1978-03-31 1981-02-19 Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien
EP0135073A3 (en) * 1983-08-19 1987-05-27 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozites of eimeria spp.
US4650676A (en) 1983-08-19 1987-03-17 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozoites of Eimeria spp.
US4710377A (en) * 1983-08-19 1987-12-01 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of Eimeria spp.
EP0135712A3 (en) * 1983-08-19 1987-05-27 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of eimeria spp.
US4874705A (en) * 1985-05-16 1989-10-17 Solvay & Cie, S.A. DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella
US5187080A (en) * 1984-06-05 1993-02-16 Solvay & Cie S.A. DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella
CA1340520C (en) * 1984-06-05 1999-05-04 Karel Z. Newman Jr. Antigenic proteins and vaccines containing them and protective antibodies directed to them for prevention of coccidiosis caused by eimeria tenella and eimeria necatrix
US4639372A (en) 1984-06-29 1987-01-27 Merck & Co., Inc. Coccidiosis vaccine
WO1986000528A1 (en) * 1984-07-05 1986-01-30 Genex Corporation Cloned gene and method for making and using the same
US5273901A (en) * 1984-07-05 1993-12-28 Enzon Corp. Genetically engineered coccidiosis sporozoite 21.5 Kb antigen, ac-6b
ES2109254T3 (es) * 1985-12-03 1998-01-16 Dimminaco Ag Sa Ltd Proteinas antigenas y vacunas que las contienen para la prevencion de cocidiosis.
EP0241139A3 (en) * 1986-03-13 1989-04-19 Merck & Co. Inc. Anti-idiotypic vaccine for coccidiosis
US5496550A (en) * 1986-08-14 1996-03-05 Chilwalner Method of reducing the output of Eimeria oocysts from a newborn chick
ATE145245T1 (de) * 1987-03-06 1996-11-15 Amgen Boulder Inc Polypeptide zur verwendung bei der diagnose von kokkidien-infektion und rekombinant-dns, verfahren zur herstellung derselben
EP0315073A2 (en) * 1987-11-02 1989-05-10 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. A composition for pattern forming materials
NZ227595A (en) * 1988-01-15 1991-11-26 Merck & Co Inc Recombinant production of eimeria tenella antigens and their use
NZ227597A (en) * 1988-01-15 1991-11-26 Merck & Co Inc Eimeria tenella group b immunogens and their production
AU620366B2 (en) * 1988-02-12 1992-02-20 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Cloned genes coding for avian coccidiosis antigens which induce a cell-mediated response and method of producing the same
DE3926461A1 (de) * 1989-07-15 1991-01-24 Suttner Gmbh & Co Kg Ventilpistole, insbesondere fuer ein hochdruckreinigungsgeraet

Also Published As

Publication number Publication date
CA1340538C (en) 1999-05-11
CN1076204C (zh) 2001-12-19
FI101453B1 (fi) 1998-06-30
PT90727A (pt) 1989-12-29
CN1186695A (zh) 1998-07-08
CN1187368A (zh) 1998-07-15
MC2039A1 (fr) 1990-05-30
ZA893740B (en) 1990-02-28
KR0156545B1 (ko) 1998-11-16
KR910000183A (ko) 1991-01-29
DE68921923D1 (de) 1995-05-04
JP3051130B2 (ja) 2000-06-12
PT90727B (pt) 1994-11-30
YU113889A (en) 1991-10-31
AU635704B2 (en) 1993-04-01
JPH037594A (ja) 1991-01-14
DK272889D0 (da) 1989-06-02
ES2070866T3 (es) 1995-06-16
AR241942A1 (es) 1993-01-29
EP0344808B1 (en) 1995-03-29
ATE120489T1 (de) 1995-04-15
US5661015A (en) 1997-08-26
DE68921923T2 (de) 1995-08-10
NZ229377A (en) 1992-06-25
IE891812L (en) 1989-12-03
DK272889A (da) 1989-12-04
CN1077438C (zh) 2002-01-09
EP0344808A1 (en) 1989-12-06
FI892714A (fi) 1989-12-04
US20030175311A1 (en) 2003-09-18
NO892251L (no) 1989-12-04
HUT52963A (en) 1990-09-28
NO303876B1 (no) 1998-09-14
FI892714A0 (fi) 1989-06-02
IL90489A0 (en) 1990-01-18
FI101453B (fi) 1998-06-30
AU3601689A (en) 1989-12-07
CN1040126C (zh) 1998-10-07
YU47880B (sh) 1996-05-20
NO892251D0 (no) 1989-06-02
IE67544B1 (en) 1996-04-17
CN1038837A (zh) 1990-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU212505B (en) Process for the preparation of recombinant coccidiosis vaccines
JPH0699475B2 (ja) コクシジウムのモノクロ−ナル抗体
EP0390267B1 (en) Coccidiosis vaccine
JP4573773B2 (ja) マラリア・ワクチン
JP3450018B2 (ja) コクシジウム症ワクチン
AU634335B2 (en) Recombinant coccidiosis vaccines -5-7 eimeria surface antigen
CA2135547A1 (en) Coccidiosis poultry vaccine
JP2812759B2 (ja) ヒトマラリアワクチン抗原をコードする遺伝子
CA2067469C (en) Recombinant vaccine against marek&#39;s disease
JPH08127593A (ja) 家禽コクシジウム症ワクチン
AU747818B2 (en) Vaccines
EP0554064A1 (en) Vaccine against schistosomiasis
EP0872486A1 (en) Eimeria proteins as vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee