NO303876B1 - Fremgangsmåte ved rekombinante teknikker ved fremstilling av protein anvendelig i en coccodiosevaksine, samt antistoffer rettet mot proteinet - Google Patents

Description

Coccodiose er en sykDom hos fjærfe forårsaket av intracellulare protozoiske parasitter av slekten Eimeria. SykDommen er endemisk i store intensive klekkeanlegg for fjærfe, og den beregnede kostnad for bekjempelse av sykDommen via kjemoterapi overskrider 100 mill. dollar hvert år i Amerikas Forente Stater alene. Utviklingen av resistens overfor de anticoccodiale legemidler gjør det nødvendig med en stadig utvikling av nye midler på et tidspunkt hvor utvikling av legemidler blir stadig dyrere og forbrukeraksepteringen av gjenværende medikament i dyr som skal brukes til matvarer, blir stadig lavere.

Beskyttende immunitet mot naturlig coccodioseinfeksjoner har vært godt dokumentert. Kontrollert daglig tilførsel av et lite antall levedyktige oocyster over flere uker er blitt vist å gi fullstendig immunitet overfor en tilført infeksjon av en normal virulent dose [Rose et al., Parasitology 21:25 (1976); Rose et al., Parasitology 88:199

(1984)]. Påvisningen av ervervet resistens overfor infeksjon antyder muligheten av å konstruere en vaksine for å indusere immunitet hos unge kyllinger for å omgå behovet for kjemiske coccodiostater. Faktisk er et slikt konsept blitt undersøkt i "Coccivac"-formuleringen til Sterwin Laboratories, Opelika, Alabama, USA.

I lys av å danne en vaksine mot coccodiose fremstilte Murray et al., europeisk patentsøknad, publikasjonsnummer 167. 443, ekstrakter fra sporozoitter eller sporulerte oocyster hos Eimeria tenella som inneholder minst 15 polypeptider, hvorav mange var assosiert med overflaten av sporozoitten. Injeksjon av disse ekstrakter i kyllinger reduserte cekale lesjoner etter oral inokulering med virulente E. tenella-sporulerte oocyster. Senere beskrev Schenkel et al., U.S. patent nr. 4.650.676, dannelsen av monoklonale antistoffer mot E. tenella-merozoitter. Ved å bruke disse antistoffer, identifiserte Schenkel et al. et antall antigener mot hvilke antistoffene var rettet. Ved preinkubering av E. tenella-sporozoitter med disse antistoffer, og derpå innføring av de behandlede sporozoitter i ceca hos kyllinger, var Schenkel et al. i stand til å vise en viss reduksjon i cekale lesjonstall sammenlignet med ubehandlede sporozoittkontroller.

Fremskritt i rekombinant DNA-teknologi har gjort en annen innfallsvinkel mulig, dvs. subenhetsvaksiner. Ved anvendel-sen av for tiden gjeldende rekombinante DNA-prosedyrer blir spesielle DNA-sekvenser satt inn i en passende DNA-bærer eller -vektor for å danne rekombinante DNA-molekyler som kan replikere i vertsceller. Sirkulære dobbeltkjedede DNA-molekyler, kalt plasmider, blir ofte brukt som vektorer, og fremstillingen av slike rekombinante DNA-former krever bruk av restriksjons-endonukleaseenzymer som kan spalte DNA ved spesielle basesekvensseter. Når spaltningen er blitt foretatt med et restriksjonsenzym i et plasmid og i segmentet av fremmed DNA som skal settes inn, kan de to DNA-molekyler bli kovalent bundet via et enzym, kjent som en ligase. Generelle metoder for fremstillingen av slike rekombinante DNA-molekyler er blitt beskrevet av Cohen et al. [U.S. patent nr. 4.237.224], Collins et al. [U.S. patent nr. 4.304.863] og Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory] . Fordi de illustrerer meget av teknikkens stand, er disse referanser herved inkorporert pr. referanse.

Når de er fremstilt, kan rekombinante DNA-molekyler bli brukt for å danne produktet som blir spesifisert via den innsatte gensekvens kun dersom et antall betingelser er oppfylt. For det første er det påkrevet at det rekombinante molekyl er kompatibelt med, og således i stand til autonom replikasjon, i vertscellen. Meget arbeid i den senere tid har brukt Escherichia coli som vertsorganisme fordi den er kompatibel med et stort antall av rekombinante plami- der. Avhengig av det anvendte vektor-/vertscellesystem blir de rekombinante DNA-molekyler introdusert i vertsorganismen ved transformasjon, transduksjon eller transfeksjon.

Påvisning av tilstedeværelsen av rekombinante plasmider i vertscellene kan på passende måte bli oppnådd ved bruk av plasmidmarkøraktiviteter, så som antibiotikumresistens. Således kan en vertsorganisme som bærer et plasmid som koder for dannelsen av et ampicillinnedbrytende enzym, bli valgt ut fra uendrede celler ved å dyrke vertsorganismen i et medium inneholdende ampicillin. Ytterligere fordeler kan bli oppnådd dersom antibiotikumresistens-markørene er et plasmid som koder for en andre antibiotikumnedbrytende aktivitet ved et sete hvor den utvalgte restriksjonsendo-nuklease danner sin spaltning og den fremmede gensekvens blir satt inn. Vertsceller som inneholder passende rekombinante plasmider, vil så værekarakterisert vedresistens mot det første antibiotikum, men følsomhet overfor det andre.

Innsettingen av et rekombinant plasmid i en vertscelle alene og isoleringen av den modifiserte vertsorganisme vil ikke i seg selv sikre at signifikante mengder av det ønskede gen-produkt kan bli dannet. For at dette skal inntreffe, må den fremmede gensekvens bli fusert i passende forhold til en signalregion i plasmidet for DNA-transskripsjon, kalt en promoter. Alternativt kan det fremmede DNA bære sin egen promoter så lenge den blir gjenkjent av vertsorganismen. Uansett opprinnelse er promoteren en DNA-sekvens som dirigerer bindingen av RNA-polymerase og "fremmer" følgelig transskripsjonen av DNA til messenger-RNA (mRNA).

Gitt en sterk promoter som kan gi store mengder mRNA, vil den endelige dannelse av det ønskede genprodukt være avhengig av translasjonseffektiviteten fra mRNA til protein. Dette er i sin tur avhengig av effektiviteten av ribosomal binding til mRNA. I E. coli innbefatter ribosom- bindingssetet på mRNA et initieringskodon (AUG) og en oppstrøms Shine-Dalgarno (SD)-sekvens. Denne sekvens, som inneholder 3-9 nukleotider og ligger 3-11 nukleotider fra AUG-kodonet, er komplementær til den 3' ende av E. coli 16S ribosomal RNA (rRNA) [Shine og Dalgarno, Nature 254:34

(1975)]. Tydeligvis blir ribosomal binding til mRNA lettet ved baseparing mellom SD-sekvensen i mRNA og sekvensen ved den 3' ende av 16S rRNA. For en oversikt over maksimalise-ring av genekspresjon, se Roberts og Lauer, Methods in Enzymology £8:473 (1979).

Et alternativt ekspresjonssystem er blitt utviklet basert på lacZ-operonet i kombinasjon med lambdafagvektorer (Huynh et al. i DNA Cloning: Volum I, D.M. Glover, Ed.). I dette system er det strukturelle gen for S-galaktosidase sammen med den induserbare promoter, som kontrollerer ekspresjon av denne, blitt satt inn i fagvektoren. Et eneste klonings-sete ved den 3' ende av genet for S-galaktosidase resulterer i en genfusjon ved innsettingen av en cDNA-kopi av en mRNA eller et genomisk DNA-fragment som inneholder en proteinkodende region.

Ekspresjon av S-galaktosidasegenet resulterer i dannelsen av et fusjonsprotein som inneholder 114 kD av S-galaktosidase og et karboksylterminalt polypeptid som er kodet for av cDNA-innskuddet, forutsatt at innskuddet inneholder en åpen leseramme i samme register som leserammen for S-galaktosidase. En fag som inneholder et gen hvis produkt blir gjenkjent av et monoklonalt eller et polyklonalt antiserum, kan således bli identifisert ved immunologisk skjerming av biblioteket etter induksjon av ekspresjon for fusjonsproteinet ved å bruke S-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) for å inaktivere lacZ-repressoren. Dette ekspresjonsvektor-system kombinerer effektiviteten av fagsystemet i å pakke og innføre dette i E. coli-celler med en øket stabilitet av polypeptidfusjoner med S-galaktosidase.

I tillempingen med vaksinesubenheten blir en subenhet av hele den infeksjonsdyktige organisme tilført vertsdyret i en immunologisk relevant sammenheng. Subenheten kan være et protein renset fra parasitten, et rekombinant protein eller proteinfragment uttrykt i et heterologt system, et syntetisk peptid som omfatter en enkelt nøytraliserende determinant eller et protein innført via en viral vektor, så som vaccinia. Immunsystemet hos vertsorganismen danner en spesifikk respons mot subenheten uten noen gang å bli eksponert til hele parasitten. Ved tilføring av en virulent dose av den infiserende organisme danner immunsystemet hos vertsorganismen et effektivt forsvar som kun er tillært ved vaksinesubenheten mot hvilken den på forhånd hadde blitt eksponert.

Det kan finnes bevis i litteraturen for innvirkningen av sirkulerende antistoff, sekretorisk IgA i tarmepitelet [Davis et al., Immunology 34:879 (1978)] og det cellemedi-erte immunsystem [Giambroni et al., Poultry Science 5.9:38

(1980)] i ervervet motstandsdyktighet overfor coccodiose. For en oversikt, se P.S. Davis i Avian Immunology, M.E. Rose, Ed., British Poultry Science Ltd., Edenberg, s. 361-385 (1981) . Det sannsynlige engasjement av forskjellige deler av immunsystemet betyr at fullstendig og vedvarende beskyttelse kan nødvendiggjøre muligheten å etterape spesielle trekk ved den naturlige infeksjonsprosess. Disse aspekter innbefatter lokal eksponering ved det sted hvor beskyttelsen er ønsket, fremkallelse av en inflammatorisk respons for å samle antigenbehandlende celler, presentasjon av et passende parasittisk antigen og muligens assosiering med MHC-determinanter i en spesiell membrankonfigurasjon.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en fremgangsmåte for fremstilling av rensede proteiner eller fragmenter derav med én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter til et Eimeria-overflateantigen med aminosyresekvens som vist i figurene 15, 17, 19 og 21, eller en funksjonell ekvivalent derav med tilsvarende biologisk aktivtet. Fremgangsmåten er særpreget ved de trekk som fremgår fra krav l's krakteriserende del.

Mer spesielt fremskaffer fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse proteiner med én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av et Eimeria-overflateantigen, hvilket overflateantigen har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 28, 37, 120 eller mer enn 200 kD og som binder spesifikt til ett eller flere monoklonale antistoffer dannet av mikroorganismer deponert hos the American Type Culture Collection (ATCC) med tilgangsnumrene HB 9707-HB 9712. Slike proteiner er proteiner med aminosyrese-kvenser som er vist i figur 15, figur 17, figur 19 og figur 21 og deres funksjonelle ekvivalenter. Nevnte funksjonelle ekvivalenter er proteiner med en aminosyresekvens avledet fra aminosyresekvensene nevnt ovenfor ved addisjoner, utelatelser, innskudd og aminosyresubstitusjoner, forutsatt at disse proteiner opprettholder én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av et Eimeria-overflateantigen. Nevnte proteiner kan bli brukt for immunisering av fjærfe mot coccidiose.

Foreliggende oppfinnelse gir videre antistoffer rettet mot ovenfor nevnte proteiner, spesielt monoklonale antistoffer, så som de monoklonale antistoffer med dep. nr. HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 og HB 9712.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et protein med én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av et Eimeria tenella-overflateantigen, hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å dyrke en vertsorganisme transformert med en rekombinant vektor omfattende en DNA-sekvens som koder for nevnte protein i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser under betingelser hvor DNA-sekvensen blir uttrykt, og

(b) isolere proteinet eller fragmentet fra kulturen.

Foreliggende oppfinnelse kan lettere bli forstått under henvisning til den følgende beskrivelse av oppfinnelsen og eksemplet i forbindelse med de følgende figurer hvori: Figur 1 viser resultatene av en E. tenella-sporozoitt-ELISA. Fortynninger av museimmunserum (MS 107-2; A) og musekontrollserum (X) ble inkubert med 4 x IO<4>levende rensede sporozoitter. Spesifikke antistoffer bundet til sporozoittene ble påvist med et peroksydasekonjugert antimus-IgG-antistoff og peroksydasesubstratet o-fenylendiamin. OD492nm ble avlest i en "Titertek Multiscan" platele-ser. Figur 2 viser resultatene av et Western blot-assay utført med proteiner som er oppløst fra E. tenella-s<p>orozoitter. Løseliggjorte sporozoittproteiner ble atskilt ved redu-serende SDS-polyakrylamid-gelelektroforese i 12,5 % geler, ble overført til nitrocellulosemembraner og omsatt med hvert antistoff. De spesifikke proteiner som blir gjenkjent av hvert antistoff, ble gjort synlige med et peroksydasekonjugert antimus-IgG-antistoff og peroksydasesubstratet 4-klor-l-naftol. Antistoffet som ble omsatt med hver strim-mel, er angitt ved toppen av strimmelen. Figur 3 viser resultatene av et Western blot-assay utført med proteiner som er gjort løselige fra sporozoitter og merozoitter av E. tenella og fra sporozoitter av E. acervulina. Forskjellige monoklonale antistoffer og sera ble inkubert med nitrocellulosebundede Eimeria-proteiner og gjort synlige som forklart i beskrivelsen til figur 2. De anvendte monoklonale antistoffer innbefattet 3A5 (1) , 2 0C6 (2) , 7D1 (3) , 13A6 (4) , 6A5 (5) og et kontrollantistoff som var ikke-reaktivt overfor Eimeria-proteiner. De anvendte sera innbefattet mus nr. 107-2 immunserum (7) og kontroll-serum (8). Figur 4 viser i venstre panel resultatene av et immunoutfellingsassay med<125>I-merkede overflateproteiner av E. tenella-s<p>orozoitter. Sporozoittoverflateproteiner ble merket med enten I0D0GEN- eller IODOBEADS-metoden, gjort oppløselige og gjort synlige etter SDS-polyakrylamid-gelelektroforese i 12,5 % geler med autoradiografi. Høyre panel viser resultatene av immunutfelling av<125>I-merkede sporozoittoverflateproteiner med serum fra mus immunisert med levende sporozoitter. Museimmunsera (105-1, 105-2, 105-3, 107-1, 107-2 og 107-3) og musekontrollserum (kontroll) ble inkubert med1<25>I-sporozoittoverflateproteiner, og immunkompleksene ble fanget opp av et antimus-antistoff koblet til agarose. Immunkompleksene ble gjort oppløselige med Laemmli-prøvebuffer separert med SDS-gelelektroforese i 12,5 % geler og gjort synlige med autoradiografi. M representerer molekylvektene til standard markørproteiner i kD. Figur 5 viser resultatene av immunoutfelling av<125>I-sporozoittoverflateproteiner med monoklonale antistoffer. Prosedyren for identifisering av12<5>I-proteinene bundet til hvert antistoff, er forklart i beskrivelsen av figur 4. Spesifikke sporozoittmonoklonale antistoffer brukt og kontrollantistoff (kontroll) er indikert på toppen av hver gelbrønn. Molekylvektene til standard markørproteiner er vist i kg dalton. Figur 6 viser fasekontrastmikrografer og immunofluorescens-fargemønstermikrografer under anvendelse av forskjellige monoklonale antistoffer av lufttørkede E. tenella-sporozo-ittslidepreparater. Venstresidene av panelene A, B, C og D er fasekontrastmikrografer som viser intakte, forlengede sporozoitter med et stort, bakre reflekterende legeme (PRB) , et lite, fremre reflekterende legeme (ARB) og den apikale ende (A) overfor det bakre reflekterende legeme. Høyresiden av panelene A, B, C og D viser prøveglass som ble behandlet med monoklonale antistoffer 14C3 (spesifikt for overflateantigener) , 6A5 (spesifikt for overflateproteiner og protein fra reflekterende legeme), 11D2 (spesifikt for sporozoittapikaltupp) og kontrollantistoff hen-holdsvis. Antistoffene bundet til preparatene ble lokalisert med rhodaminkonjugert antimus-antistoff gjort synlig med epifluorescens ved å bruke et "Leitz Dialux 22"-mikroskop . Alle mikrografer er 630 ganger forstørret. Figur 7 viser antistoffarging av intracellulare sporozoitter og utviklende parasitter i kyllingnyreceller. Kyllingnyreceller ble infisert med sporozoitter, og de angitte tider etter infeksjon ble cellene behandlet for antistoffmerking. Kulturene ble vasket før fiksering for å fjerne eventuelle ekstracellulare sporozoitter. Fasekontrast og tilsvarende immunofluorescensmikrografer ble laget ved å bruke antistoffene 7D4, 8A2, 7B2 og 15A3 som angitt. Antistoffene bundet til preparatene ble lokalisert med rhoda-minkonjugerte antimus-antistoffer og gjort synlige med epifluorescens. Alle mikrografer er 630 ganger forstørret. Figur 8 viser antistoffmerking av intracellulare sporozoitter og den utviklende parasitt i kyllingnyreceller. Fasekontrastmikrografer og tilsvarende immunofluorescensmikrografer ble dannet ved å bruke monoklonale antistoffer 14B1 og 19D6, immunt kyllingserum og fluorescente andre antistoffer ved de angitte tider. Figur 9 viser nøytraliseringen av intracellular sporozoittutvikling med antisporozoitt-antistoffer. Rensede E. tenella-sporozoitter ble preinkubert i 1 time ved 40°C med enten kontrollantistoff (X) eller antisporozoitt-antistoffer 7D4 (□), 8A2 (O), 14B1 (•) eller 6A5 (■) og derpå tillatt å infisere MDBK-cellekulturer. Sporozoitter ble

også preinkubert med medium (A) eller med det anticoccodiale legemiddel lasalocid (*) .

Etter infisering ble utviklingen av den intracellulare sporozoitt målt ved inkorporeringen av<3>H-uracil i celle-kulturene. Siden lasalocid forhindrer intracellular utvikling av sporozoitten, viste kulturer forbehandlet med dette legemiddel minimal inkorporering av<3>H-uracil. Figur 10 viser resultatene av SDS-polyakrylamid-gelelektroforese/Western blot-analyse av 65 kD S-galaktosidase fusjonsproteinprøver eller andre prøver som angitt. Western blot-analysene ble utført ved å bruke murint anti-S-galaktosidase-antistoff (panel A) eller sammenslåtte monoklonale antistoffer 7D1, 7D4 og 20C6 (panel B) i konjunksjon med geite-antimus-HPOD-konjugat. Brønnene i begge paneler representerer (1) S-galaktosidase, (m) prefargede moleky-lære vektmarkører, hvorav størrelsene er angitt til venstre for plate A i kD, (2) totalt cellepelletprotein, (3) protein frigjort fra cellepelleten ved ultralydbehandling og (4) protein gjort oppløselig med guanidin-HCl fra pelleten etter ultralydbehandling. Figur 11 er en skjematisk fremstilling av plasmid pEV/2-4, et 65 kD proteinekspresjonsplasmid inneholdende et 1,7 kb EcoRI-DNA-innskudd fra fag lambda-m2-4. Posisjoner til forskjellige restriksjonsenzymseter i innskuddet er vist relativt til EcoRI-setet innbefattende Pstl (P, ved bp 53 og 776), Kpnl (K, ved bp 202), BstNI (B, ved bp 584, 1303 og 1412) og Sau3A (S, ved bp 1017 og 1439). Figur 12 er et kart av pEV3-SEQ inneholdende en polylinker med de angitte seter innsatt mellom EcoRI- og Sali-setene av pEV-vrf3. Det syntetiske oligonukleotid CGGTCGACTCGAGCCA indikert med den stiplede pil, ble brukt som en primer for kj edeavslutnings-DNA-sekvensanalyse . Figur 13 er et restriksjonskart av cDNA-kloner som koder for proteiner gjenkjent av monoklonalt antistoff 6A5. Restriksjonsendonukleaseseter brukt for Maxam-Gilbert DNA-sekvensanalyse av det 1,1 kb store cDNA er vist. EcoRI-setet i parentes er ved slutten av det 0,9 kb store cDNA. Feltet over kartet viser den åpne leseramme som er forutsagt fra DNA-sekvensen med det potensielle signalpeptid fylt inn. Linjene nedenfor kartet indikerer exolll-delesjonene brukt for kjedeavslutnings-sekvensanalyse. Figur 14 er nukleotidsekvensen til det 1,1 kb store cDNA-molekyl som koder for 2 0 kD proteinet gjenkjent av monoklonalt antistoff 6A5. Figur 15 er aminosyresekvensen til proteinet ifølge figur 14, forutsagt fra nukleotidsekvensen fra denne figur. Figur 16 er nukleotidsekvensen til det 1,7 kb store cDNA-molekyl som koder for 65 kD proteinet gjenkjent av mono-klonale antistoffer 7D1, 7D4 og 20C6. Figur 17 er aminosyresekvensen til proteinet fra figur 16, forutsagt fra nukleotidsekvensen ifølge denne figur og bekreftet ved sekvensanalyse av tryptiske peptider dannet fra det uttrykte 65 kD protein. Regioner i den fullstendige aminosyresekvens som tilsvarer enkelte av disse peptider, er vist understreket. De bestemte sekvenser av disse peptider er overstreket. Figur 18 er nukleotidsekvensen til det 1,1 kb store cDNA-molekyl som koder for 28 kD proteinet gjenkjent av monoklonalt antistoff 8A2. Figur 19 er aminosyresekvensen til proteinet ifølge figur 18, forutsagt fra nukleotidsekvensen i denne figur. Figur 20 er nukleotidsekvensen til det 3,2 kb store cDNA- molekyl som koder for proteinet gjenkjent av monoklonalt antistoff 7B2. Figur 21 er aminosyresekvensen til proteinet fra figur 20, forutsagt fra nukleotidsekvensen i denne figur. Figur 22 er en SDS-polyakrylamid-gelelektroforeseanalyse av det immunoaffinitetsrensede 65 kD protein. Gelen ble gjort synlig ved coomassie blue-farging og ved Western blot-analyse. Brønn 2 og 4 og 3 og 5 inneholder det rensede protein fra to preparater. Brønn 1 og 6 inneholder en blanding av molekylvektsmarkørproteiner med molekylvekter vist til venstre og høyre for figuren. Figur 23 er en HPLC-elueringsprofil av en E-merkaptoetanol-redusert (panel A) og uredusert (panel B) tryptisk fordøy-ing av 65 kD proteinet som viser absorbans ved 215/im som en funksjon av kolonnetilbakeholdelsestiden. Figur 24 viser restriksjonskart av fire elementer av basisvektoren som er brukt for rekombinasjon av gener som koder for coccodiale antigener i vacciniavirus. Disse elementer innbefatter 7,5 K promoterelementet (a og b, venstre), TK-locuset (a og b, høyre), deler av plasmid pUC8 (c) og poly-klonsetet fra M13tgl31 (d) . Dirigeringen av transskripsjonen av de virale 7,5 K og TK-promoterne er fra venstre mot høyre (dvs. fra Bglll- til EcoRI-restriksjonssetet i polylinkeren. Figur 25 viser aminosyresekvensen av N-terminalen av Eimeria-antigenet gjenkjent av monoklonalt antistoff 8A2

(A) , uttrykt fra et konstrukt inneholdende AUG-transla-sjonsstartkodonet i polylinkerelementet til vektoren ifølge

figur 24, og (B) fusert til det malariale 190 kD lederseg-ment (første 34 aminosyrer) og polylinkeren til kloningsvektoren fra figur 24 (de neste 13 aminosyrer) . Under utviklingsprosessen av proteinet kan de første 19 aminosy-

rer ved N-terminalen bli spaltet ved posisjonen angitt av et kolon.

I figurene er enkeltbokstavforkortinger brukt for å representere nukleotider, og standard én- eller trebokstavfor-kortelser er brukt for å representere aminosyrer. Betydnin-gene av disse forkortelser kan bli funnet i standardlærebø-ker i biokjemi, så som Lehninger, Principles of Biochemi-stry, 1984, Worth Publishers, Inc., New York, s. 96, 798.

Som brukt heri skal de følgende uttrykk ha de følgende betydninger: "20 kD-protein" betyr et rekombinant eller syntetisk protein med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 20 kD i SDS-polyakrylamid-gelelektroforese som binder spesifikt til monoklonalt antistoff 6A5. Dette antistoff reagerer også spesifikt med et Eimeria-overflateantigen (fra et hull-ekstrakt av Eimeria-proteiner) med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 28 kD i SDS-geler. Dette antigen er til stede i sporozoittutviklingstrinnet. Nukleotidsekvensen av et cDNA-molekyl som koder for dette protein og den forutsagte aminosyresekvens fra dette er vist hhv. i figurene 14 og 15.

"65 kD protein" betyr et rekombinant eller syntetisk protein med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 65 kD i SDS-polyakrylamid-gelelektrof orese som binder spesifikt til monoklonale antistoffer 7D1, 7D4 og 20C6. Disse antistoffer reagerer også spesifikt med et overflateantigen fra Eimeria-ekstrakter med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 120 kD i SDS-geler. Dette antigen er til stede i sporozoitt-, schizont- og merozoittutviklingstrinnene. Nukleotidsekvensen av et cDNA-molekyl som koder for dette protein og aminosyresekvensen avledet fra dette, er vist hhv. i figurene 16 og 17.

"28 kD protein" betyr et rekombinant eller syntetisk protein med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 28kD i SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og som binder spesifikt til monoklonalt antistoff 8A2. Dette antistoff reagerer også spesifikt med et Eimeria-overflateantigen med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 37 kD i SDS-geler. Dette antigen er til stede i sporozoitt-, schizont- og merozoittutviklingstrinnene. Nukleotidsekvensen til et cDNA-molekyl som koder for dette protein og aminosyresekvensen avledet fra dette, er vist hhv. i figurene 18 og 19.

"45 kD protein" betyr et rekombinant eller syntetisk protein med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 45 kD i SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og som binder spesifikt til monoklonalt antistoff 7B2. Dette antistoff reagerer også spesifikt med et Eimeria-overflateantigen med en tilsynelatende molekylvekt større enn 200 kD i SDS-geler. Dette antigen er til stede i sporozoittutviklingstrinnet. Nukleotidsekvensen til et cDNA-molekyl som koder for dette protein og aminosyresekvensen avledet fra dette, er vist hhv. i figurene 2 0 og 21.

Uttrykket "protein med én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter av et Eimeria-overflateantigen" betyr et protein med én eller flere regioner eller epitoper som er i stand til å fremskaffe en immunorespons i en immunologisk kompetent vertsorganisme og/eller er i stand til spesifikt å binde seg til et komplementært antistoff.

På grunn av degenerasjonen av den genetiske kode er det underforstått at det eksisterer mange potensielle nukleotidsekvenser (funksjonelle ekvivalenter) som kan kode for aminosyresekvensen vist i figurene 15, 17, 19 og 21. Det er også underforstått at nukleotidsekvensene fra DNA-sekvensene og -fragmentene ifølge oppfinnelsen satt inn i vektorer kan innbefatte nukleotider som ikke er deler av de faktiske strukturelle gener, så lenge de rekombinante vektorer som inneholder slike sekvenser og fragmenter er i stand til å dirigere dannelsen i en passende vertsorganisme av et protein eller fragment med én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter til et Eimeria-overflateantigen.

Videre har aminosyresubstitusjoner i proteiner som ikke i vesentlig grad endrer de biologiske og immunologiske aktiviteter, vært kjent å inntreffe og er blitt beskrevet , f.eks. av Neurath et al. i "The Proteins", Academic Press, New York (1979), spesielt i figur 6 på side 14. De oftest observerte aminosyresubstitusjoner er Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Glu, Asp/Gly og vice versa.

Slike funksjonelt ekvivalente nukleotidsekvensvariasjoner og aminosyresubstitusjoner av de eksemplifiserte utførelsesformer ifølge oppfinnelsen ligger innenfor rammen av oppfinnelsen, så lenge de resulterende proteiner opprettholder én eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter til et Eimeria-overflateantigen.

Uttrykket "fragment" betyr en DNA-sekvens eller et protein som omfatter en subsekvens av en av cDNA eller proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Slike fragmenter kan bli dannet ved enzymatisk spaltning av de større molekyler ved å bruke restriksjonsendonukleaser for DNA og proteaser for proteinene. Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til produktene av enhver form for enzymatisk spaltning, men innbefatter subsekvenser hvorav endene ikke tilsvarer noen enzymatiske spaltningspunkter. Slike fragmenter kan bli dannet f.eks. ved kjemisk syntese ved å bruke sekvensdataene angitt heri. DNA-fragmenter kan bli dannet ved ufullstendig komplementær DNA (cDNA)-syntese fra isolert messenger-RNA (mRNA). Proteinfragmenter kan også bli dannet ved å uttrykke DNA-fragmenter som koder for proteinfragmentene.

Proteinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli laget ved kjente metoder i faget, så som ved rekombinant DNA-metodologi, kjemisk syntese eller isolering fra Eimeria-preparater.

DNA som er nødvendig for å utføre fremgangsmåten for fremstilling av proteinene ifølge oppfinnelsen, kan bli kjemisk syntetisert ved å bruke nukleotidsekvensinformasjo-nen som er angitt i figurene 14, 16, 18 og 20. Slik kjemisk syntese kan bli utført ved å bruke alle av de kjente metoder selv om fosforamiditt-fastfasemetoden til Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)] er foretrukket.

Alternativt kan cDNA bli dannet fra Eimeria-mRNA. Messenger-RNA kan bli isolert fra sporulerende Eimeria-oocyster eller merozoitter ved å bruke standardteknikker. Disse mRNA-prøver kan så bli brukt for å danne dobbeltkjedet cDNA som beskrevet av Maniatis et al. supra. Dette cDNA kan så bli satt inn i en passende kloningsvektor som kan bli brukt for å transformere E. coli for å danne et cDNA-bibliotek.

cDNA-biblioteket kan så bli analysert ved å bruke de klonede gener benyttet ifølge foreliggende oppfinnelse eller fragmenter derav som prober. Slike gener eller fragmenter kan bli radiomerket f.eks. ved "nick-transla-tion" ved å bruke Pol I DNA-polymerase i nærvær av de fire deoksyribonukleotider, hvorav ett inneholder<32>P i op-posisjon (Maniatis et al. supra, s. 109) for bruk som prober.

Selv om Eimeria tenella ble brukt som en mRNA-kilde i eks-emplene nedenfor, kan de klonede gener fra denne type bli brukt som prober for å isolere gener fra andre typer av Eimeria grunnet DNA-sekvenshomologi blant de forskjellige

typer.

Når de en gang er identifisert og isolert, blir Eimeria-genene satt inn i en passende ekspresjonsvektor som inneholder de nødvendige elementer for transskripsjon og translasjon av de innsatte gensekvenser. Egnede kloningsvektorer kan omfatte segmenter av kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser, så som forskjellige kjente bakterielle plasmider, fag-DNA, kombinasjoner av plasmider og fag-DNA, så som plasmider som er blitt modifisert til å anvende fag-DNA eller andre ekspresjonskontroll-sekvenser eller gjærplasmider. Spesielle kloningsvektorer som kan bli brukt og som er kjent for fagmannen innbefatter, men er ikke begrenset til, pEV-vrf-plasmidene (pEV-vrfl, -2 og -3) ; SV4 0; adenovirus; gjær; lambda gt-WES-lambda B; Charon 4A og 28; lambda gt-11-lambda B; M13-avledede vektorer, så som pUC8, -9, -18 og -19; pBR-

313, -322 og -325; pAC105, pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUBHO; pMB9; colEl; pSClOl; pml21; RSF2124; pCRl eller RP4 .

Innsettingen av Eimeria-<g>enene i en kloningsvektor blir lett oppnådd når både genene og den ønskede kloningsvektor er blitt spaltet med samme restriksjonsenzym eller enzymer, siden komplementære DNA-terminaler derved blir dannet. Dersom dette ikke kan bli utført, kan det være nødvendig å modifisere de spaltede ender som blir dannet ved å fordøye enkeltkjedet DNA for å danne butte ender, eller oppnå det samme resultat ved å fylle i de enkeltkjedede terminaler med en passende DNA-polymerase. På denne måte kan buttendet ligering med et enzym, så som T4 DNA-ligase bli utført. Alternativt kan ethvert ønsket sete bli dannet ved å ligere nukleotidsekvenser (linkere) på DNA-terminalene. Slike linkere kan omfatte spesielle oligonukleotidsekvenser som koder for restriksjonssete-gjenkjennelsessekvenser. Den spaltede vektor og Eimeria-<g>enene kan også bli modifisert ved homopolymer haledannelse som beskrevet av Morrow

[Methods in Enzymology 68.:3 (1979)] .

Mange av kloningsvektorene som kan bli brukt i foreliggende oppfinnelse, inneholder én eller flere markøraktiviteter som kan bli brukt for å velge ut de ønskede transformanter, så som ampicillin- og tetracyklinresistens i pBR322, ampicillinresistens og J5-galaktosidaseaktivitet i pUC8 og ampicillinresistens i pEV-vrf2. Utvelgelse av vertsceller hvori slike vektorer er blitt satt inn, blir gjort meget enkelt når vertscellene ellers mangler aktivitetene som er tillagt vektorene.

Det er underforstått at nukleotidsekvensene til Eimeria-genene satt inn på en utvalgt plass i en kloningsvektor kan innbefatte nukleotider som ikke er en del av de faktiske strukturelle gener. Alternativt kan genet inneholde kun deler av det fullstendige villtypegen. Alt som er nødvendig er at genfragmentene, som er satt inn i kloningsvektoren, er i stand til å dirigere dannelsen i en passende vertsorganisme av et polypeptid eller protein med minst én immuno-reaktiv og/eller antigen determinant til et Eimeria-overflateantigen.

Utvelgelsen av en passende vertsorganisme blir påvirket av et antall faktorer som er kjent i faget. Disse faktorer innbefatter f.eks. kompatibilitet med den utvalgte vektor, toksisitet til proteinene kodet for av hybridplasmidet, letthet ved gjenvinning av det ønskede protein, ekspre-sjonskarakteristika, biosikkerhet og omkostninger. En balanse mellom disse faktorer må bli funnet, og det er underforstått at ikke alle vertsorganismer vil være like effektive for ekspresjon av et spesielt rekombinant DNA-molekyl.

Egnede éncellede vertsorganismer som kan bli brukt i foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, plante, pattedyr eller gjærceller og bakterier, så som Escherichia coli. Bacillus subtilis, Bacillus stearothermo-philus og Actinomvces. Spesielt foretrukket er Escherichia coli-stamme MC1061, som er blitt beskrevet av Casadaban et al. [J. Mol. Biol. 138:179 (1980)]. Denne stamme kan bli brukt eller enhver annen stamme av E. coli K-12 inneholdende plasmidet pRK248cIts. Plasmid pRK248cIts for bruk i E. coli K-12-stammer er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection og har tilgangsnummer ATCC 33766. E. coli-stamme MC1061 er også blitt deponert og har depone-ringsnummer ATCC 5333 8.

Overføring av den rekombinante klonvektor i vertscellen kan bli utført på en mengde måter. Avhengig av det spesielle utvalgte vektor-/vertscellesystem kan slik overføring bli utført ved transformasjon, transduksjon eller transfeksjon. Når en modifisert vertscelle er dannet, kan cellen bli dyrket og proteinekspresjonsproduktet kan bli isolert fra kulturen.

Kloner som danner Eimeria-<p>roteinene ifølge oppfinnelsen kan bli identifisert ved å bruke passende merkede antistoffer som er spesifikke for proteinene. Monoklonale antistoffer som er foretrukket, kan bli fremstilt ved å bruke standardmetoder som følger.

Antigene proteiner fra Eimeria tenella blir brukt for å immunisere dyr, så som mus, rotter, hester, geiter, griser, kaniner osv., for å erholde antistoffdannende somatiske celler for fusjon til myelomceller.

Somatiske celler med potensiale for å danne antistoff, spesielt B-celler, er egnet for fusjon med en myelomcellel-inje. Disse somatiske celler kan bli avledet fra lymfeknu-ter, milter og perifert blod fra tilførte dyr. Miltceller fra mus kan bli brukt delvis fordi disse celler danner en relativt høy prosentdel av stabile fusjoner med musemyelom-linjer. Det vil imidlertid være mulig å bruke rotte, kanin,

frosk eller andre celler i stedet.

Spesialiserte myelomcellelinjer er blitt utviklet fra lymfocyttsvulster for bruk i hybridoardannende fusjonsprosedyrer [Kohler og Milstein, Eur. J. Immunol. 6.:511 (1976); Shulman et al., Nature 276:269 (1978); Volk et al., J. Virol. 4_2:220 (1982)]. Disse cellelinjer er blitt utviklet av minst tre grunner. Den første er å lette utvelgelsen av fuserte hybridomer blant ufuserte og på lignende måte uendelige, selvformerende myelomceller. Vanligvis blir dette oppnådd ved å bruke myelomer med enzymdefekter som gjør dem ute av stand til å vokse i visse selektive medier som støtter veksten av hybridomer. Den andre grunn stammer fra den iboende egenskap hos lymfocytte tumorceller å danne sine egne antistoffer. Formålet med å bruke monoklonale teknikker, er å erholde fuserte hybridcellelinjer med ubegrenset livstid som danner det ønskede enkle antistoff under genetisk kontroll av den somatiske cellekomponent av hybridomet. For å eliminere dannelsen av tumorcelleanti-stoff av hybridomene, blir myelomcellelinjer som er ute av stand til å danne lette eller tunge immunoglobulinkjeder eller som mangler antistoffsekresjonsmekanismer brukt. En tredje grunn for valg av disse cellelinjer er for deres egnethet og effektivitet for fusjon.

Mange myelomcellelinjer kan bli brukt for dannelsen av fuserte cellehybrider innbefattende f.eks. P3/X63-Ag8, P3/NSl/l-Ag4-l, SP2/0-Agl4 og Sl94/5.XXO.BU.1. P3/X63-Ag8-og P3/NSI/l-Ag4-l-cellelinjene er blitt beskrevet av Kohler og Milstein [Eur. J. Immunol. 6_:511 (1976)]. Shulman et al.

[Nature 276:269 (1978)] utviklet Sp2/0-Agl4-myelomlinjen. S194/5.XXO.BU.1-linjen ble rapportert av Trowbridge [J. Exp. Med. 148:313 (1979)]. I eksemplet ifølge foreliggende oppfinnelse ble PAI-O-musecellelinjen (en ikke-Ig-dannende subklon av P3/X63-Ag8) brukt.

Metoder for å danne hybrider av antistoffdannende milt- eller lymfeknuteceller og myelomceller innbefatter vanligvis å blande somatiske celler med myelomceller i hhv. et 10:l-forhold (selv om forholdet kan variere fra ca. 20:1 til ca. 1:1) i nærvær av et middel eller midler (kjemiske, virale eller elektriske) som fremmer fusjonen av cellemem-braner. Det er foretrukket at samme type dyr virker som kilde for de somatiske og myelomcellene som blir brukt i fusjonsprosedyren. Fusjonsmetoder er blitt beskrevet av Kohler og Milstein [Nature 256:495 (1975) og Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)], av Gefter et al. [Somatic Cell Genet. 3:231 (1977)] og av Volk et al. (J. Virol. 42:220

(1982)]. De fusjonsfremmende midler som ble brukt av disse forskere, var Sendai-virus og polyetylenglykol (PEG). Fusjonsprosedyren for eksemplet ifølge foreliggende oppfinnelse anvender PEG.

Fordi fusjonsprosedyrer danner levedyktige hybrider i meget lav frekvens (f.eks. når milter blir brukt som en kilde for somatiske celler, erholdes kun et hybrid for ca. lx IO<5>miltcelle), er det nødvendig å ha en mulighet for å velge ut de fuserte cellehybrider fra de gjenværende ikke-fuserte celler, spesielt de ufuserte myelomceller. En mulighet for å påvise de ønskede antistoffdannende hybridomer blant andre resulterende fuserte cellehybrider, er også nødven-dig .

Generelt blir utvelgelsen av fuserte cellehybrider oppnådd ved å dyrke cellene i medier som støtter veksten av hybridomer, men som forhindrer veksten av myelomcellene, hvilke normalt ville fortsette å dele seg i det uendelige. (De somatiske celler som blir brukt i fusjonen, opprettholder ikke langtidslevedyktighet i in vitro-kultur og utgjør derfor ikke noe problem.) I eksemplet ifølge foreliggende oppfinnelse ble myelomceller som mangler hypoxantinfosfori-bosyl transferase (HPRT-negative) brukt. Seleksjon mot disse celler blir foretatt i hypoksantin/aminopterin/thymidin (HAT)-medium, et medium hvor de fuserte cellehybrider overlever grunnet den HPRT-positive genotype av miltcel-lene. Bruken av myelomceller med forskjellige genetiske svakheter (legemiddelsensitivitet osv.) som kan bli utvalgt i medier som støtter veksten av genotypisk kompetente hybrider, er også mulig.

Flere uker er nødvendig for selektivt å dyrke de fuserte cellehybrider. Tidlig i denne tidsperiode er det nødvendig å identifisere de hybrider som danner det ønskede antistoff slik at de påfølgende kan bli klonet og mangfoldiggjort. Generelt danner ca. 10 % av de erholdte hybrider det ønskede antistoff, selv om et område fra 1-3 0 % ikke er uvanlig. Påvisningen av antistoffdannende hybrider kan bli oppnådd ved enhver av flere standard assaymetoder innbefattende enzymtilknyttet immunoassay og radioimmunoas-sayteknikker som er blitt beskrevet i litteraturen [se f,eks. Kennet et al. (forfattere), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A new dimension in Biological Analyses, s. 376-384, Plenum Press, New York (1980)] . Flere påvisnings-metoder ble brukt i eksemplet i foreliggende oppfinnelse.

Når de ønskede fuserte cellehybrider er blitt valgt ut og klonet i enkelte antistoffdannende cellelinjer, kan hver cellelinje bli mangfoldiggjort på en av to standardmåter. En suspensjon av hybridomcellene kan injiseres i et histo-kompatibelt dyr. Det injiserte dyr vil derpå utvikle kreftsvulster som utskiller det spesielle monoklonale antistoff som dannes av det fuserte cellehybrid. Kroppsvæ-skene til dyret, så som serum og bukvæske, kan bli tappet for å gi monoklonale antistoffer i høy konsentrasjon. Alternativt kan de enkelte cellelinjer bli dyrket in vitro i laboratoriedyrkningsskåler. Kulturmediet inneholdende høye konsentrasjoner av ett enkelt spesielt monoklonalt antistoff kan bli innhøstet ved dekantering, filtrering eller sentrifugering.

Slik de dannes i E. coli, forblir Eimeria-proteinene i cyto-plasmaet eller i inklusjonslegemer. For å frigjøre proteinene, er det derfor nødvendig å ødelegge den ytre membran. Dette blir fortrinnsvis oppnådd ved ultralydbehandling eller ved andre mekaniske ødeleggelsesanordninger, så som en fransk trykkcelle eller Gaulin-homogenisator.

Celleødeleggelse kan også fremskaffes ved kjemiske eller enzymatiske metoder. Siden divalente kationer ofte er nød-vendige for cellemembranintegritet, kan behandling med passende gelaterende midler, så som EDTA eller EGTA, vise seg passende ødeleggende for å lette lekkasje av proteinene fra cellene. Likeledes er enzymer, så som lysozym, blitt brukt for å oppnå samme resultat. Dette enzym hydrolyserer peptidoglykanryggraden i celleveggen.

Tilføringen av osmotisk sjokk kan også bli anvendt. Kort kan dette bli oppnådd ved først å plassere cellene i en hyperton oppløsning som vil forårsake at de taper vann og skrumper. Påfølgende plassering i en hypoton "sjokk"-oppløsning ville så føre til et raskt innløp av vann i cellene med en utstøting av de ønskede proteiner.

Når de er frigjort fra cellene, kan Eimeria-proteinene bli konsentrert ved utfelling med salter, så som natrium eller ammoniumsulfat, ultrafiltrering eller andre metoder som er velkjent for fagmannen. Ytterligere rensing kan bli utført ved vanlige proteinrenseteknikker innbefattende, men ikke begrenset til, gelfiltrering, ionebytterkromatografi, preparativ diskgel- eller slørelektroforese, isoelektrisk fokusering, lavtemperatur organisk oppløsningsmiddelfrak-sjonering eller motstrømsfordeling. Opprenskning blir imidlertid utført fortrinnsvis ved immunoaffinitetskromatografi, som beskrevet nedenfor.

Proteinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse eller fragmenter derav kan også syntetiseres kjemisk ved en passende metode, så som ved eksklusiv fastfasesyntese, partielle fastfasemetoder, fragmentkondensasjon eller klassisk oppløsningssyntese. Fastfasesyntese, som beskrevet av Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85.: 2149 (1963)], er foretrukket.

Slike synteser blir utført med aminosyrer som er beskyttet ved a-aminoterminalen. Trifunksjonelle aminosyrer med labile sidekjeder er også beskyttet med egnede grupper som vil forhindre en kjemisk reaksjon fra å inntreffe ved dette sted under sammensetningen av peptidet. Den a-aminobeskyttende gruppe blir selektivt fjernet for å tillate påfølgen-de reaksjon å finne sted ved aminoterminalen. Betingelsene for fjerning av den a-aminobeskyttende gruppe forårsaker ikke deblokkering av de sidekjedebeskyttende grupper.

De of-aminobeskyttende grupper er slike som er kjent for å være anvendelige i faget for trinnvis syntese av peptider. Innbefattet er akryltypebeskyttende grupper (f.eks. formyl, trifluoracetyl, acetyl), aromatisk uretantypebeskyttende grupper (f.eks. benzyloksykarbonyl (Cbz) og substituert benzyloksykarbonyl) , alifatiske uretanbeskyttende grupper (f.eks. t-butyloksykarbonyl (Boe), isopropyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl) og alkyltypebeskyttende grupper (f.eks. benzyl, trifenylmetyl). Den foretrukne beskyttende gruppe er Boe. Den sidekjedebeskyttende gruppe for Tyr innbefatter tetrahydropyranyl, tert.-butyl, triyl, benzyl, Cbz, 4-Br-Cbz og 2,6-diklorbenzyl. Den foretrukne sidekjedebeskyttende gruppe for Tyr er 2,6-diklorbenzyl. De side-kj edebeskyttende grupper for Asp innbefatter benzyl, 2,6-diklorbenzyl, metyl, etyl og cykloheksyl. Den foretrukne sidekjedebeskyttende gruppe for Asp er cykloheksyl. De side-kjedebeskyttende grupper for Thr og Ser innbefatter acetyl, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-diklorbenzyl og Cbz. Den foretrukne beskyttende gruppe for Thr og Ser er benzyl. De sidekjedebeskyttende grupper for Arg innbefatter nitro, Tos, Cbz, adamantyloksykarbonyl eller Boe. Den foretrukne beskyttende gruppe for Arg er Tos. Sidekjedeaminogruppen til Lys kan bli beskyttet med Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos eller Boe. 2-Cl-Cbz-gruppen er den foretrukne beskyttende gruppe for Lys. Utvelgelsen av den sidekjedebeskyttende gruppe er basert på det følgende: Den sidekjedebeskyttende gruppe forblir intakt under koblingen og spaltes ikke av under deblokkeringen av den aminotermi-nalbeskyttende gruppe eller under koblingsbetingelser. Den sidekjedebeskyttende gruppe må bli fjernet ved avslutning av syntesen av det endelige peptid ved å bruke betingelser som ikke vil endre målpeptidet.

Fastfasesyntese blir vanligvis utført fra karboksyltermi-nalen ved å koble den a-aminobeskyttede (sidekjedebeskyt-tet) aminosyre til en passende fast bærer. En esterbinding blir dannet når festingen blir foretatt til et klormetylert eller hydroksymetylresin, og det resulterende målpeptid vil ha en fri karboksylgruppe ved C-terminalen. Alternativt blir benzhydrylamin eller p-metylbenzhydrylaminresin brukt, i hvilket tilfelle en amidbinding blir dannet, og det resulterende målpeptid vil ha en karboksamidgruppe ved C-terminalen. Disse resiner er kommersielt tilgjengelige, og fremstillingen av disse er beskrevet av Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. opplag, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984).

Den C-terminale aminosyre Arg, beskyttet ved sidekjeden med Tos og ved a-aminofunksjonen med Boe, blir koblet til benz-hydrylaminresinet ved å bruke forskjellige aktiverende midler innbefattende dicykloheksylkarbodiimid (DCC), N,N'-diisopropylkarbodiimid og karbonyldiimidazol. Etter festingen til resinstøtten blir den ot-aminobeskyttende gruppe fjernet ved å bruke trifluoreddiksyre (TFA) eller HCl i dioksan ved en temperatur mellom 0° og 25°C. Dimetylsulfid blir tilsatt til TFA etter innføringen av metionin (Met) for å undertrykke mulig S-alkylering. Etter fjerning av den a-aminobeskyttende gruppe blir de gjenværende beskyttede aminosyrer koblet trinnvis i den ønskede rekkefølge for å erholde den ønskede peptidsekvens.

Forskjellige aktiveringsmidler kan bli brukt for koblingsreaksjonene innbefattende DDC, N,N'-diisopropylkarbodiimid, benzotriazol-l-yl-oksy-tris-(dimetylamino)-fosfoniumheksa-fluorfosfat (BOP) og DCC-hydroksybenzotriazol (HOBt). Hver beskyttet aminosyre blir brukt i overskudd (>2,5 ekvivalenter) , og koblingene blir vanligvis utført i DMF, CH2C12eller blandinger derav. Graden av fullføring av koblingsreaksjonen overvåkes ved hvert trinn ved ninhydrinreak-sjonen som beskrevet av Kaiser et al., Anal. Biochem. 3_4:595 (1970). I tilfeller hvor ufullstendig kobling blir bestemt, gjentas koblingsreaksjonen. Koblingsreaksjonene kan bli utført automatisk på en Vega 250 Applied Biosystems syntetisator eller på et annet kommersielt tilgjengelig instrument. Etter den fullstendige sammensetning av målpeptidet blir peptidresinet deblokkert med TFA/ditioetan og derpå spaltet med et reagens, så som flytende HF, i 1-2 timer ved 0°C som spalter peptidet fra resinet og fjerner alle sidekjedebeskyttende grupper.

Sidekjede-til-sidekjede-cyklisering på det faste støtte-materiale krever bruken av et ortogonalt blokkeringsskjerna som tillater selektiv spaltning av sidekjedefunksjonene av de sure aminosyrer (f.eks. Asp) og de basiske aminosyrer (f.eks. Lys) . Den 9-fluorenylmetyl (OFm)-beskyttende gruppe for sidekjeden i Asp og den 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc)-beskyttende gruppe for sidekjeden til Lys kan bli brukt for dette formål. I disse tilfeller blir de side-kj edebeskyttende grupper til det Boc-beskyttede peptidresin selektivt fjernet med piperidin i DMF. Cyklisering blir oppnådd på den faste støtte ved å bruke forskjellige aktiverende midler innbefattende DCC, DCC/HOBt eller BOP. HF-reaksjonen blir utført på det cykliserte peptidresin som beskrevet ovenfor.

Rensing av de syntetiserte proteiner kan bli utført som beskrevet ovenfor for de rekombinant dannede proteiner.

Eimeria-proteiner kan også blir fjernet fra ekstrakter av membranproteiner fra E. tenella eller andre Eimeria-typer ved immunoutfelling eller immunoaffinitetskromatografi. Som allerede bemerket kan slike metoder danne de fullstendige villtypeproteiner. I enkelte tilfeller er disse proteiner større enn proteinene dannet ved rekombinant DNA-metodologi. Monoklonale antistoffer for dette formål kan bli dannet som beskrevet ovenfor ved å bruke syntetiske eller naturlige Eimeria-proteiner som antigen.

Andre nyttige proteiner som har de nødvendige immunoreaktive og/eller antigene determinanter, er antistoffer eller fragmenter derav som er antiidiotypiske mot den aktive determinant eller determinanter på proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Slike antiidiotypiske antistoffer kan bli fremskaffet mot andre antistoffer som er spesifikke for determinantene på proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen (dvs. de antiidiotypiske antistoffer er anti-antistoffer) . Foretrukket blir monoklonale antiidiotypiske antistoffer brukt. Slike antistoffer kan tilføres som en vaksine på samme måte som Eimeria-<p>roteinene i seg selv kan bli brukt.

Én eller flere av Eimeria-<p>roteinene og antiidiotypiske antistoffer kan bli dannet til vaksiner som består av proteinene samt en fysiologisk akseptabel bærer. Egnede bærere innbefatter f.eks. 0,01-0,1 M fosfatbuffer av nøytral pH eller fysiologisk saltoppløsning.

Øket immunitet mot coccodiose kan bli fremskaffet på en av to måter. For det første kan et hjelpestoff eller en immunopotensiator bli satt til vaksinen. For det andre kan proteinene bli presentert for et dyr som skal immuniseres i stor utstrekning enten som et kryssbundet kompleks eller konjugert til et bærermolekyl.

Egnede hjelpemidler for vaksineringen av dyr innbefatter, men er ikke begrenset til, Adjuvant 65 (inneholdende peanøttolje, mannidmonooleat og aluminiummonostearat); mineralgeler, så som aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat og alum; surfaktanter, så som heksadecylamin, oktadecylamin, lysolecitin, dimetyldioktadecyl-ammoniumbromid, N,N-diokta-decyl-N' ,N' -bis(2-hydroksymetyl)propandiamin,metoksyheksa-decylglyserol og "Pluronic" polyoler; polyanioner, så som pyran, dekstran, sulfat, poly IC, polyakrylsyre og karbo-pol; peptider, så som muramyldipeptid, dimetylglycin og tuftsin; og oljeemulsjoner. Proteinene kan også bli tilført etter inkorporering i liposomer eller andre mikrobærere.

Inkorporering i liposomer eller andre mikrobærere gir en anordning ved hvilken frigjøringen av vaksinene kan bli opprettholdt over en forlenget tidsperiode. En pumpe, så som en Alza-pumpe, kan bli brukt for samme formål.

Immunogenisiteten av proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen, spesielt de små fragmenter, kan bli øket ved kryssbinding eller ved kobling til et immunogent bærermolekyl (dvs. et makromolekyl med egenskapen å uavhengig fremskaffe en immunrespons i et vertsdyr, og til hvilket proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli kovalent bundet). Kryssbinding eller konjugering til et bærermolekyl kan være nødvendig fordi små proteinfragmenter enkelte ganger virker som haptener (molekyler som er i stand til spesifikt å binde til et antistoff, men som er ute av stand til å fremskaffe antistoffproduksjon, dvs. de er ikke immunogene) . Konjugering av slike fragmenter til et immunogent bærermolekyl gjør fragmentene immunogene via det som vanligvis er kjent som "bærereffekten".

Passende bærermolekyler innbefatter f.eks. proteiner og naturlige eller syntetiske polymere forbindelser, så som polypeptider, polysakkarider, lipopolysakkarider osv. En egnet bærer er et glykosid kalt Quil A, som er blitt beskrevet av Morein et al., Nature 308:457 (1984). Protein-bærermolekyler er spesielt foretrukket, innbefattende men ikke begrenset til pattedyr, serumproteiner, så som nøkkel-hulliglehemocyanin, humant eller bovint gammaglobulin, humant, bovint eller kaninserumalbumin eller metylerte eller andre derivater av slike proteiner. Andre proteinbæ-rere vil være innlysende for fagmannen. Foretrukket, men ikke nødvendig, vil proteinbæreren være fremmed for vertsdyret, i hvilket antistoffene mot Eimeria-proteinene skal fremskaffes.

Kovalent kobling til bærermolekylet kan bli utført ved å bruke metoder som er velkjent i faget, hvor det nøyaktige valg vil være diktert av naturen til det anvendte bærermolekyl. Når det immunogene bærermolekyl er et protein, kan proteinene eller fragmentene fremstilt ifølge oppfinnelsen være koblet f.eks. ved å bruke oppløselige karbodiimider, så som dicykloheksyl, karbodiimid eller glutaraldehyd.

Koblingsmidler slike som disse kan også bli brukt for å kryssbinde proteinene og fragmentene til seg selv uten å bruke et separat bærermolekyl. Slik kryssbinding til protein eller proteinfragmentaggregater kan også øke immunogenisiteten.

Tilføring av en effektiv mengde av vaksinene inneholdende proteinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, kan beskytte fjærfe mot infeksjon mot E. tenella. Monoklonale antistoffer mot E. tenella-anticrener kryssreagerer med E. acervulina og E. maxima in vitro, noe som indikerer at beskyttelse også kan bli tilført mot disse typer. En effektiv dose av proteinene eller proteinfragmentene strekker seg fra ca. 10 til ca. 50/xg/kg kroppsvekt av det vaksinerte dyr. En dose på ca. 25-50 fig/ kg er foretrukket. Opprinnelige vaksineringer blir fortrinnsvis fulgt av forsterkningsvaksineringer gitt fra én til flere uker senere. Flere forsterkninger kan bli tilført. Dosene av slike forsterkninger ligger generelt i området fra ca. 5-50/xg/kg, fortrinnsvis ca. 20-50/ig/kg. Standard tilfø-ringsruter kan bli brukt, så som subkutan, intradermal, intramuskulær, oral, anal eller in ovo administrering.

Presentasjonen av de coccodiale antigener fremstilt ifølge oppfinnelsen til immunsystemet hos fugl kan bli oppnådd ved å klone gener som koder for antigenene i bakterier (f.eks. E. coli eller Salmonella) eller i virus (f.eks. koppevirus eller herpesvirus) og tilføre de levende vektorsystemer til fuglene oralt ved injeksjon eller via andre vanlig brukte ruter. Carbit et al. [i: Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 68-71] har beskrevet bruken av E. coli, mens elements [Pathol. Immunopathol. Res. 6.: 13 7 (19 87)] har beskrevet bruken av Salmonella. Moss et al. [Ann. Rev. Immunol. 5.: 3 05 (1987)] har beskrevet bruken av virale vektorsystemer som bruker rekombinante koppevirus.

En type koppevirus, vacciniavirus, kan bli brukt for å undersøke avleveringen av coccodiale antigener i cellekultur og i dyr. For analytiske dyr er vacciniavirus blitt funnet å være mer effektive enn fuglekoppevirus, som er en annen koppervirusbærer som kan bli brukt. Dette er fordi vacciniavirus formerer seg raskere enn fugleviruset og har et vertsområde som ikke er begrenset til kyllingceller. Store mengder heterologt DNA kan bli satt inn i det virale vacciniagenom uten hemming av viral utvikling og infektivi-tet [Smith et al., Gene 25.: 21 (1983)] . Innsettingen og ekspresjonen av multiple heterologe gener ved å bruke viruset, fremskaffer antistoffdannelse mot uttrykte antigener i infiserte dyr [Perkus et al., Science 229:981 (1985)].

Teknikkene som blir brukt for å danne rekombinante vacciniavirus, kan lett bli tilpasset ved rutinemessige fremgangsmåter til fuglekoppe- eller herpesvirussystemer. Bruken av slike rekombinante virus som bærere i vaksiner mot coccodiose er spesielt fordelaktig ved at vaksinerte fugler utvikler immunitet både mot det coccodiale antigen og den virale bærer (dvs. slike vaksiner er bivalente). Anvendeligheten av slike vaksiner kan bli ytterligere øket ved å sette inn ytterligere gener i bærerviruset. For eksempel kan deler av Newcastle-sykDomsviralt genom bli satt inn sammen med et coccodialt antigen i et fuglekoppevirus for derved å overføre immunitet mot Newcastle-sykDom, coccodiose og fuglekoppe, alt med én enkelt vaksine.

Tilføringen av den levende vektorvaksine kan bli utført ved flere metoder velkjent i faget. For eksempel kan "stick-ing"-metoden, som vanligvis er brukt for å vaksinere fjærfe mot fuglekoppevirus, bli brukt. Denne metoden består i å stikke eller prikke vingehuden med en skarp nål dyppet i vaksinen. Nålen har vanligvis et øye nær tuppen, lik en symaskinnål, som bærer en dråpe vaksine. Alternativt kan de levende vaksiner injiseres subkutant eller intradermalt i vingevevet eller ethvert annet sted.

De rekombinante levende vektorvaksiner kan også bli satt til drikkevannet eller til og med sprøytet over kyllinger som skal vaksineres. De kan også bli tilført i foret, fortrinnsvis etter beskyttende innkapsling [Balancou et al., Nature 322:373 (1986)] eller in ovo. I sistnevnte metode injiseres de virale vaksiner direkte i kyllingembry-oer [Sharma, Avian Dis. 25:1155 (1985)].

EKSEMPEL

Med mindre annet er angitt, er prosentdelene gitt nedenfor for faststoff i fastblandinger, væsker i væsker og faststoff i væsker på hhv. en w/w-, vol/vol- og w/vol-basis.

1. FREMSTILLING AV MONOKLONALE ANTISTOFFER MOT EIMERIA-ANTIGENER

1.1 Parasittpreparat

Sporozoitter av E. tenella, E. acervulina, E. brunetti og E. maxima ble isolert fra sporulerte oocyster via standard-prosedyrer. Kort sagt ble sporulerte oocyster vasket med destillert vann og 20 % blekemiddel og derpå med destillert vann. Oocystene ble ødelagt i en vevshomogenisator, og uoppløselig materiale innbefattende sporocyster ble gjenvunnet ved sentrifugering. De frigjorte sporocyster og annet materiale i pelleten ble resuspendert i 0,25 % trypsin og kyllinggalle i Hanks saltoppløsning, pH 8, og inkubert i 2 timer ved 40°C. Den frigjørende oppløsning ble fjernet med to vasker med RPMI-1640-medium inneholdende 10 % føtalt bovint serum (FBS), fulgt av to vasker med PBS ved pH 7,4.

Sporozoittene ble så renset over en metrizamidgradient [Wisher et al., Parasitology 88:515 (1984)]. Kort sagt ble sporozoittene resuspendert i 2 ml PBS, pH 7,0, og 1 ml av suspensjonen ble lagt over en 15 ml metrizamidgradient. Gradienten besto av 5 ml hver av 12 %, 18 % og 24 % metrizamid i PBS, pH 7,0. Sporozoittene ble sedimentert med sentrifugering ved 900 x g i 40 min. Rensede sporozoitter ble isolert fra interfasen mellom 18 % og 24 % metrizamid ved innsetting av en 21 gauge nål gjennom siden av røret og ved å suge sporozoittene inn i en sprøyte.

De rensede sporozoitter ble vasket tre ganger med PBS, pH 7,0, og brukt umiddelbart for immunisering, infeksjons-studier, overflatemerking med<125>I, immunofluorescensassay eller SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (Laemmli, Nature 227:680 (1970)] og Western blotting-studier.

Merozoitter av E. tenella ble isolert som beskrevet nedenfor i del 6.2.3. De rensede merozoitter ble brukt for immunisering og ble gjort oppløselige med Laemmli-prøvebuf-fer for SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og Western blotting-studier.

1.2 Immuniseringer

Åtte Balb/c-hunmus (Charles River, Wilmington, Mass.) ble immunisert med rensede levende sporozoitter i henhold til nedenstående tabell.

Dag 1 lx 10<7>sporozoitter intravenøst (i.v.)

Dag 7 6 x IO<6>sporozoitter intraperitonealt (i.p.) Dag 85 6 x IO<6>sporozoitter i.p.

Dag 120 3 x IO<7>sporozoitter i.p.

Dag 244 Prefusjonsimmuniseringsforsterkere

Dag 1 5 x IO<6>sporozoitter i.v., 5 x IO<6>sporozoitter

i.p.

Dag 2 Samme som dag 1

Dag 5 Fusjon av hyperimmune splenocytter og myelomceller

Serumet fra hver mus ble undersøkt for antisporozoitt-antistoffer med ELISA med rensede sporozoittproteiner ved Western blot-assay med oppløseliggjorte sporozoittproteiner ved immunoutfelling av<125>j-merkede sporozoittoverflateproteiner og ved immunofluorescensassay med rensede sporozoitter. Musen med den høyeste sporozoittantireaktivitet (mus 107-2) ble valgt ut for prefusjonsimmuniseringsfor-sterkning (se figur 1 for ELISA-analyse av dette antiserum). På dag 5 ble musen avlivet, og milten ble fjernet

for fremstilling av splenocytter.

1.3 Cellekultur og cellefusioner

To dager før fusjon ble splenocyttfeederceller fremstilt fra naive mus i fullstendig medium [Iscoves modifisert Dulbeccos medium (IMDM, Gibco) med 10 % FBS, glutamin (2,0 mM) og 2-merkaptoetanol (100 jxM) ] pluss HAT (100/J.M hypok-santin, 0,4fiM aminopterin og 16/iM thymidin) . Ved å bruke en modifikasjon av prosedyren til de St. Groth et al. [J. Immunol. Methods 35.:1 (1980)] , ble IO<8>miltceller fusert medIO<8>PAI-O-musemyelomceller. Enhver annen myelomcelle som er egnet for fremstillingen av hybridomer kunne bli brukt. Et antall slike myelomceller er kjent og tilgjengelige for fagmannen.

Cellene ble blandet, pelletert ved sentrifugering og resuspendert under konstant forsiktig omrøring i 1,0 ml 35 %

(vol/vol) polyetylenglykol i IMDM ved 3 7°C over 1 min. Etter 3 minutters inkubering ved 37°C ble cellene pelletert igjen og forsiktig resuspendert i 10 ml IMDM + HAT. Cellene ble så fortynnet til 1 x IO<6>celler/ml i fullstendig medium + HAT og fordelt i 24 brønners mikrotiterplater (1 ml/brønn) inneholdende 5 x IO<5>splenocyttfeederceller i 1 ml fullstendig medium.

Hybridomsupernatanter ble undersøkt for antisporozoitt-antistoff med ELISA med rensede sporozoitter ved Western blotting med sporozoittproteiner ved immunoutfelling, med<125>I-merkede sporozoittoverflateproteiner og ved immunofluorescens med rensede sporozoitter, og med sporozoittinfiserte celler. Hybridomene ble klonet ved begrensende fortynning.

1.4 Sporozoitt- ELISA

Rensede sporozoitter (4 x 10<4>) ble satt til hver brønn av en 96 brønners U-bunn PVC-plate som på forhånd var blitt blokkert med 1 % BSA i PBS, pH 7,0. Sporozoittene ble sedimentert til bunnen av brønnene med sentrifugering ved 1000 x g i 5 min. Sporozoittene ble resuspendert i 100/xl fortynnet antiserum eller hybridomsupernatanter og inkubert i 2 timer ved romtemperatur med konstant omrøring. Sporozoittene ble så vasket med 1 % BSA i PBS, pH 7,0, for å fjerne ubundet antistoff.

For å påvise spesifikke antistoffer bundet til sporozoittene, ble 100 fil av peroksydasekonjugert geite-antimus-IgG tilsatt de resuspenderte sporozoitter, og suspensjonen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Sporozoittene ble vasket, og bundet antistoff ble gjort synlig ved å tilsette substratoppløsning (o-fenylendiamin, 0,4 mg/ml i 0,1 M citratbuf f er, pH 4,5, 0,12 % hydrogenperoksyd) i 3 0 min. ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 2,5 M H2S04inneholdende 50 mM natriummetabisulfitt. Mengden av bundet antistoff ble bestemt ved å lese av OD488av substratfargen.

Fra en total på 480 brønner utsådd fra cellefusjonen var 432 positive for hybridomvekst. Av disse viste 358 hybridomer seg positive for antistoffdannelse i det primære sporozoitt-ELISA. Under ekspansjon og passasje av disse opprinnelige parentale hybridomceller døde 104, eller stoppet å danne antistoff og var således negative i påføl-gende utvelgelsesmålinger med sporozoitt-ELISA og Western blot-assays. Sporozoitt-ELISA identifiserte 205 hybridomer som dannet antistoff ved 10 x bakgrunnsnivå.

1.5 Western blotting av sporozoittproteiner

Rensede sporozoitter (ca. 5 x IO<7>sporozoitter pr. ml pr. gel) ble gjort oppløselige i Laemmli-prøvebuffer, separert med SDS-polyakrylamid-gelelektroforese enten i en 12,5 % gel eller en 7,5-20 % gradientgel (Laemmli, supra) og overført elektroforetisk til nitrocelluloseark. Arkene ble blokkert i 3 % gelatinbuffer (3 % gelatin, tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl) og skåret i strimler, og disse strimler ble tillatt å reagere med fortynnet antiserum eller hybridomsupernatant i 12 timer ved 4°C i 1 % BSA-buffer (1 % BSA, 50 mM natriumf osf at, pH 6 , 5 , 0,5 M NaCl,.0,05 % Tween-20). Strimlene ble vasket i PBS, pH 7,4, 0,05 % Tween-20, og det spesifikt bundede antistoff ble påvist med et peroksydasekonjugert antimus-antistoff. De bundede antistoffer ble gjort synlige ved å tilsette substratoppløsning [4-klor-l-naftol (30 mg oppløst i 10 ml iskald metanol og 50 ml tris-HCl, pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,015 % endelig konsentrasjon H202]i 30 min. ved romtemperatur. Reaksjonen ble avsluttet ved utstrakt vask med destillert vann.

Av antistoffene som var positive i sporozoitt-ELISA var også 160 positive ved Western blotting-analyse ved å bruke oppløselige sporozoittproteiner.

Western blot-analyse (se figur 2) viste av de monoklonale antistoffer falt i ett av tre reaktivitetsmønstre: (a) de som binder enkle Eimeria-proteiner (f.eks. 11A1 og 11D1), (b) de som binder to eller tre proteiner (f.eks. 6A5 og 20C6) og (c) de som binder mange proteiner (f. eks. 11A5, 13A6 og 14B5).

Antistoffene ble viderekarakterisert vedWestern blot-analyse ved å bruke E. tenella-merozoitt- og E. acervulina-sporozoittproteiner (figur 3). Et antall antistoffer innbefattende 3A5, 13A6, 7D1 og 20C6 gjenkjente proteiner isolert fra sporozoitter av E. tenella og E. acervulina fra merozoitter av E. tenella. Andre antistoffer, så som 6A5, ble vist å være type- og trinnspesifikke og å binde kun til proteiner fra E. tenella-sporozoitter.

En oppsummering av resultatene erholdt for enkelte av antistoffene er vist i tabell 1, hvori spesifisiteten av anti stoffene er vist både som (a) opprinnelsen og størrelsen av proteinet(ene) i geler, til hvilke antistoffene bandt seg, og (b) størrelsen av<125>I-merkede Eimeria tenella-proteiner utfelt av antistoffene (høyre kolonne). Antistoffene er ytterligerekarakteriserti tabellen med isotype.

Spz og Mrz er forkortelser for hhv. sporozoitter og merozoitter .

G og M refererer til hhv. IgG og IgM.

m indikerer at antistoffene bundet til mange proteiner er fra 24 til mer enn 200 kD store.

Verdier indikert med N.D. ble ikke bestemt.

1.6 Immunoutfelling av 125 I- merkede sporozoittoverflateproteiner

Overflateproteinene av rensede sporozoitter ble merket med<125>I med IODOGEN-metoden (Pierce Chemical Co.) eller ved bruk av IODOBEADS (Pierce Chemical Co.). For sistnevnte prosedyre ble fire IODOBEADS vasket tre ganger med 0,2 M natriumfosfat, pH 7,5, og 1-3 mCi av12<5>I-Na ble tilsatt og inkubert i 5 min. ved romtemperatur. Rensede sporozoitter (3xIO<8>) i 200/xl PBS, pH 7,0, ble tilsatt reaksjons-flasken, og inkuberingen ble fortsatt i 15 min. Ved slutten av inkuberingen ble fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,5 mM.

Sporozoittene ble gjenvunnet fra inkuberingsblandingen ved sentrif ugering ved 12.000 x g i 30 sek. og gjort oppløselig i 1 ml av enten 2 % natriumdodecylsulfat (SDS) eller 1 % Triton X-100 in PBS, pH 7,0. Uløselig materiale ble fjernet ved sentrif ugering i 3 min. ved 12.000 x g. Oppløselige sporozoittproteiner ble dialysert mot 3 1 PBS, pH 7,0, ved 4°C ved å bruke en 3500 molekylvekts cuttoff-membran for å fjerne ethvert gjenværende fritt12<5>I. De<125>I-merkede sporozoittproteiner (typisk 1,5 x IO<8>cmp inkorporert i proteinet) ble lagret ved 4°C inntil de ble brukt. Den TCA-utfell-bare radioaktivitet var typisk i overskudd av 95 % av den totale radioaktivitet. SDS-polyakrylamid-gelelektroforeseanalyse av de12<5>I-merkede sporozoittproteiner er vist i figur 4, venstre panel.

Immunoutfelling ble utført ved å tilsette 300/xl av hybridomsupernatant eller fortynnet antiserum til 250/xl av<1>25i-merkede sporozoittproteiner (1 x IO<5>cpm) i buffer I (0,25 % NP-40, 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M Nacl) . Etter inkubering i 16 timer ved 4°C ble 100-200/xl av en 50 % suspensjon av geite-antimus-IgG koblet til agarose (Sigma Chemical Co.) tilsatt, og blandingen ble inkubert på en roterende blander i 2 timer ved romtemperatur. Kulene ble pelletert med sentrif ugering i 1 min. ved 12.000 x g og vasket tre ganger i vaskebuffer (0,1 % SDS, 0,5 % NP-4 0, 0,2 % natriumdeoksykolat, 10 mM PMSF, 10 mM tris-HCl, pH 8,5, 0,15 M NaCl).

De<125>I-merkede proteiner bundet til fastfaseantistoffene ble frigjort og denaturert ved å tilsette 60/xl av 2 x Laemmli-prøvebuf f er og oppvarming i 3 min. ved 95°C. De immunoutfelte<125>I-merkede sporozoittproteiner ble separert med SDS-polyakrylamid-gelelektroforese i en 12,5 % gel og gjort synlige med autoradiografi.

Resultatene fra immunoutfellingsassayet med museimmunserum er vist i figur 4, høyre panel. Av hybridomantistoffene som var positive ved sporozoitt-ELISA, var 74 positive ved immunoutfellingsassay. Som vist i figur 5 falt hybridomantistoffene i to kategorier, de som felte ut kun som enkle proteiner (f.eks. 3C4, 6A5, 7D4, 8A2, 11D2 og 20C6), og de som felte ut to eller flere proteiner (f.eks. 12B2, 15A3, 15C4 og 19D6) .-

1.7 Immunofluorescensassay med rensede sporozoitter

Sporozoitter (1 x 10<5>) ble satt til 8-kamrede plater (Lab Tek) i PBS, pH 7,0, og lufttørket ved 37°C i 12 timer. Platene ble blokkert med 10 % normalt geiteserum i 2 timer ved 3 7°C. Fortynnet antiserum eller hybridomsupernatant ble satt til hvert kammer og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket, og et rhodaminkonjugert antimus-antistoff (fortynnet i PBS, pH 7,0, 0,3 % Triton X-100) ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur. Etter vask av platene ble det bundede antistoff gjort synlig med fluorescens.

Det meste av antistoffene viste spesifikk immunofluorescens enten mot overflatemembran og/eller mot det reflekterende legeme av lufttørkede sporozoitter (figur 6, panel A og B) . Noen antistoffer farget intenst den apikale tupp av sporozoitten og farget bare lett den gjenværende sporozoittover-flate (figur 6, panel C) . En representasjon av de luft-tørkede, rensede sporozoitter kan bli observert i figur 6, venstre sides plater av panel A, B, C og D. De rensede sporozoitter var intakte og forlengede og viste prominent større, bakre reflekterende legeme (PRB) og mindre, fremre reflekterende legeme (ARB). Den apikale ende (A) av sporozoitten lå ovenfor det bakre reflekterende legeme. Det var også en liten forurensning av preparatene ved intakte sporocyster (panel B, venstre plate) og oppbrutte sporoc-ystmembraner.

1.8 Oppsummering av ELISA-, Western blot-, immunoutfel-lings- og immunofluorescensresultater

En oppsummering av resultater fra ovenfor angitte analyse av 55 monoklonale antistoffer er vist i tabell 2.

Monoklonale antistoffer 7D4, 7D1, 20C6, 8A2, 6A5 og 7B2, som er foretrukket, er blitt deponert i form av hybridomceller som skiller ut disse monoklonale antistoffer hos the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, under betingelsene ifølge Buda-pest-avtalen og er hhv. gitt tilgangsnumre HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 og HB 9712.

1. 9 In vitro infeksionsassay

Primære kyllingnyre-epitelceller ble etablert i henhold til metoden til Doran et al., J. Protozool. 25_:544 (1978) og dyrket til 40-50 % konfluens i 4-kamrede Lab Tek-plater. MDBK (Madin-Darby bovine kidney)-celler (ATCC-CCL 22) ble også brukt i stedet for kyllingnyre-epitelceller. Cellene ble inokulert med 50.000 eller 200.000 rensede sporozoitter. Ved 16 timer etter infeksjon ble cellemonolagene vasket flere ganger for å fjerne alle sporozoitter som ikke hadde trengt inn i cellene. Representative inokulerte cellekulturer ble fiksert i 100 % metanol (romtemperatur i 5 min.) ved 3, 16, 24, 48, 64, 96 og 120 timer etter infeksjon. Fikserte plater ble lagret i 1 % BSA i PBS, pH 7,0, ved 4°C inntil de ble behandlet for immunofluorescens som beskrevet ovenfor. Fargingsmønsteret erholdt med forskjellige antistoffer, er vist i figur 7.

Mellom 3 og 24 timer etter infeksjon viste de fikserte kulturer intracellulære sporozoitter (figur 7, 7D4 ved 3 timer og 8A2 ved 19 timer). Senere degenererte sporozoittene til reflekterende legemer alene (7D4, 60 timer). Overflaten og den apikale tupp av de intracellulare sporozoitter ble farget klart med antistoff 7D4 (figur 7, 7D4 ved 3 timer), men dette antistoff farget ikke overflaten av de infiserte celler.

Etter 24 timer begynte sporozoittene å degenerere og utviklet seg til schizonter som utviklet seg i løpet av de følgende 48 timer. Antistoff 7D4 fortsatte å reagere med de degenererende sporozoitter, men reagerte ikke med de uutviklede schizonter (figur 7, 7D4, 60 timer). Idet schizontene utviklet seg, begynte imidlertid 7D4 å reagere med strukturer inne i schizontene (figur 7, 7D4, 100 timer). Disse strukturer var de utviklende merozoitter, og antistoff 7D4 fortsatte å reagere med et overflateantigen av de ferdigutviklede og frigjorte merozoitter (figur 7, 7D4, 120 timer).

Således identifiserte 7D4 et 120 kD membranantigen som var til stede på E. tenella-sporozoitter og -merozoitter. Dette antigen ble ikke uttrykt under schizonttrinnet av parasitt-utviklingen inntil uferdige merozoitter utviklet seg inne i schizontene.

Antistoff 14B1 viste et reaktivitetsmønster lik det til antistoff 7D4, idet det farget overflaten og tuppen av intracellulare sporozoitter (figur 8, 14B1, 16 timer) og viste diffus farging av cytoplasmaet i den umiddelbare nær-het av den intracellulare sporozoitt. Antigenet gjenkjent av 14B1 er til stede på den apikale tupp av den uferdige merozoitt inne i den ferdigutviklede schizont (figur 8, 14B1, 100 timer) og den apikale tupp av de f erdigutviklede, frigjorte merozoitter (figur 8, 14B1, 120 timer). Farge-mønstrene vist av antistoff 7D4 og 14B1 er like, men proteinene som disse antistoffene gjenkjenner har meget forskjellige molekylvekter på hhv. ca. 120 og 6 kD.

Selv om antistoff 7D4 og 14B1 reagerte med de fleste trinn av parasittutvikling, reagerte andre antistoffer kun med overflateantigener (figur 7, 15A3) eller med det reflek terende legeme (figur 7, 7A2) av intracellulare sporozoitter og ikke med schizont- eller merozoittrinnene av parasitten.

To enkle antistoffer, 8A2 og 19D6, ble identifisert ved infeksjonsassayet. Antistoff 8A2 reagerte med et 37 kD protein som var til stede på overflaten av sporozoittene (figur 7C, 8A2, 19 timer) i alle trinnene av den utviklende schizont (figur 7C, 8A2, 120 timer) og på overflaten av de frigjorte merozoitter (figur 7C, 8A2, 120 timer). Ulikt proteinene gjenkjent av antistoff 7D4 og 14B1 ble 3 7 kD proteinet syntetisert gjennom hele den intracellulare utvikling av parasitten.

Antistoff 19D6 reagerte ikke bare med 180 kD sporozoitt-overf lateprotein, men også med et protein i cytoplasmaet av de sporozoittinfiserte celler (figur 8, 19D6 ved 3 timer). Det cytoplasmiske protein gjenkjent av antistoff 19D6 kan ha blitt utstøtt av sporozoitten etter celleinfeksjon siden proteinet forsvant under uferdig schizontutvikling og kom til syne på nytt i den f erdigutviklede schizont og i de frigjorte merozoitter (figur 8B, 19D6, 120 timer).

Serumantistoff fra kyllinger som har overlevet en E. tenella-infeksjon, farger den apikale tupp og overflaten av intracellulare sporozoitter (figur 8B, Immune Chick sera, 3 timer) i et mønster som er likt fargingsmønsteret til antistoff 7D4, men ikke det reflekterende legeme av den intracellulare sporozoitt.

Immunofluorescensstudiene med sporozoittinfiserte kyllingnyreceller identifiserte antigener som var (a) spesifikke mot sporozoitten (f.eks. større enn 200 og 2 8 kD proteiner gjenkjent av hhv. antistoff 7B2 og 6A5), (b) funnet i alle trinn av den intracellulare parasitt (f.eks. 37 kD proteinet gjenkjent av 8A2) og (c) spesifikke overfor sporozoitter og merozoitter, men ikke overfor schizonten (f.eks. 120 og 6 kD proteinene gjenkjent av hhv. antistoff 7D4 og 14B1).

1.10 In vitro sporozoitt- nøytraliseringsassay

I en modifikasjon av metoden til Schmatz et al., J. Protozool. 3_3:109 (1986) ble MDBK-celler trypsinert og suspendert i minimalt essensielt medium (Gibco) supplementert med 1 % FBS ved en tetthet på 7,5 x 10<4>celler/ml. Til hver brønn av en mikrotiterplate (vevskulturbehandlet 96 brøn-ner) ble1,5 x 10<4>celler tilsatt og inkubert i 48 timer ved 40°C. Rensede sporozoitter ble enten forbehandlet med antistoff i 1 time ved 40°C eller etterlatt ubehandlet før infeksjon av cellemonolagene. Antistoffene (enten vevskul-tursupernatanter, bukvæske eller antiserum) ble i utstrakt grad dialysert mot PBS, pH 7,0, varmeinaktivert ved 56°C i 30 min. og sterilfiltrert før bruk.

Umiddelbart etter infeksjon ble [5,6]-<3>H-uracil tilsatt alle brønner for å gi et endelig nivå på 5 iiCi/ml. Ved 19 timer etter infeksjon ble mediet fjernet, og kulturene ble vasket én gang med PBS. Cellene ble frigjort på nytt med trypsin-EDTA i 15 min. ved 40°C og høstet inn på glassfiberfiltre. Filtrene ble tørket, plassert i scintilleringsvæske ("Rea-dy-Solv", New England Nuclear) og opptelt for bundet radioaktivitet. Egenskapene for antistoffene å hemme sporozoittinntrengning og/eller utvikling ble bestemt ved radioaktiviteten som var inkorporert i cellene infisert med ubehandlede sporozoitter, sammenlignet med celler infisert med antistoffbehandlede sporozoitter.

Sporozoitter ble også preinkubert med kontrollantistoffer, buffer eller lasalocid, et coccodiostatisk legemiddel. Lasalocid blokkerer fullstendig sporozoittutvikling inne i MDBK-cellene og reduserer i stor grad inkorporeringen av<3>H-uracil.

Resultatene er vist i figur 9, hvor det kan observeres at antistoff 7D4 (□), 8A2 (O) og 14B1 (•) signifikant hemmet<3>H-uridininkorporering i de infiserte MDBK-kulturer. Antistoff 6A5 (■) var mindre effektivt, men viste noe inhibering. Behandling med buffer (A) og kontrollantistoff (X) ga ingen inhibering, men lasalocid (<*>) ga i hovedsak fullstendig inhibering.

2. KONSTRUKSJON AV cDNA-EKSPRESJONSBIBLIOTEK

2 .1 Fremstilling- av sporulerende oocyster

Ceca ble fjernet fra 3 uker gamle kyllinger (Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, New Jersey, USA) 7 dager etter oral inokulering med 50.000 E. tenella-sporulerte oocyster pr. fugl og malt i en Waring-blender med destillert vann i 1 min. Volumet ble justert til 1 1 med destillert vann, og pepsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) ble tilsatt til 3 g/l. pH ble justert til 2,0 med konsentrert HC1, og blandingen ble inkubert og omrørt i 2-3 timer ved 39°C, eller inntil en enkelt oocystsuspensjon ble observert. Etter fordøying ble pH justert til 8,0 med 10 N NaOH, og 3 1 destillert vann ble tilsatt. Blandingen ble nedfelt over natten. Supernatanten ble så fjernet, og sedimentet ble vasket med vann inntil supernatanten var klar. Oocystene ble sporulert ved å boble luft gjennom suspensjonen 1 destillert vann ved romtemperatur. Sporuleringen ble stoppet etter 24 timer for RNA-fremstilling.

2 . 2 Isolering av sporulerende oocvst- mRNA

Totalt RNA ble fremstilt ved modifikasjon av guanidin-/- cesiumkloridmetoden, beskrevet av Maniatis et al., supra, s. 196. Oocystene ble vasket med PBS (0,15 M NaCl, 20 mM natriumfosfat, pH 7,9) og resuspendert ved forsiktig virvelblanding i 10 ml av en oppløsning inneholdende 5 M guanidinisotiocyanat, 50 mM tris-HCl, 10 mM etylendiamin- tetraeddiksyre (EDTA), 0,5 % sarkosyl (natrium-N-lauroyl-sarkosin, Sigma Chemical Co.) og 0,1 M S-merkaptoetanol, pH 7.4, med 5/xl av Antifoam A (Union Carbide, Danbury, Connecticut, USA), eller et annet antiskummiddel foretrukket tilsatt. Cellesuspensjonen ble homogenisert inntil godt brudd av oocystene ble observert mikroskopisk.

Uoppløselig cellulært materiale ble fjernet ved lavhastighetssentrifugering, og homogenatet ble oppdelt i fire porsjoner og lagt i lag på 1,2 ml av 5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA, pH 7,5, i 12 ml polykarbonatrør. Rørene ble sentrifugert ved 40.000 rpm i en Beckman SW 50.1-rotor i 17 timer ved 15°C. Supernatantvæsken ble kastet, veggene til rørene ble tørket, og pelletene ble resuspendert i 1,25 ml 10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 % natriumdodecylsulfat (SDS), pH 7.5, med 200/xg/ml Proteinase K (Boehringer-Mannheim) . Etter inkubering ved 37°C i 30 min. ble oppløsningen ekstrahert tre ganger med fenol. RNA i den endelige vandige fase ble utfelt tre ganger med etanol og derpå oppløst i 1 ml vann.

Polyadenylert [poly (A)+]-RNA ble fremstilt ved å passere to ganger ca. 2 mg av totalt RNA over en oligo(dT)-cellulose-kolonne (Pharmacia Fine Chemicals), som beskrevet av Maniatis et al., supra, s. 197. Poly(A)<+->RNA ble utfelt to ganger med etanol og oppløst i 200/xl vann. Utbyttet var ca. 26 fig, som beregnet fra den optiske tetthet ved 260 nm.

2 . 3 Fremstilling av merozoitter

Merozoitter av E. tenella ble innhøstet fra ceca av 50 infi-serte kyllinger (3 uker gamle Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, NJ) 5 dager etter infeksjon med 50.0 00 av de ovenfor sporulerte oocyster pr. fugl. Ceca ble fjernet og vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) i 15 min. på en magnetisk rører. Det epiteliale avfall ble delvis fjernet ved lavhastighetssentrifugering (50 x g), og grovmerozoittene ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 2000 x g ved 4°C i 10 min. Pelleten ble resuspendert i lysebuf-fer (8,29 g/l NH4C1, 0,372 g/l Na2EDTA, 1,0 g/l KC03, pH 7,6) og inkubert på is i 30 min. Merozoittene ble samlet opp ved sentrif ugering, vasket én gang i PBS og passert over en kolonne inneholdende 1,0 g spunnet nylonfiber (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories Deerfield, Illi-nois, USA) i en separasjonstrakt. Merozoittene ble samlet opp ved sentrifugering som tidligere og frosset på tørris for RNA-isolering eller renset ytterligere i dietylamino-etylcellulose (DEAE, Whatman DE52, Whatman, Clifton, New Jersey, USA) for Western blot-analyse.

For opprenskning i DEAE-cellulose ble ca. lx IO<9>merozoitter tilført i PBS til en 10 ml bed-volumkolonne og eluert med PBS. Merozoittene ble gjenvunnet i de første 100 ml av gjennomstrømningsvæsken, i hovedsak fri for røde blodceller og annet cellulart avfall.

2 . 4 Isolering av merozoitt- mRNA

Frosne merozoittpelleter inneholdende 1 x IO<9>til 1 x10<10>organismer ble tint i 10 ml TEL-/SDS-buf f er (0,2 M tris-HCl, 0,1 M LiCl, 25 mM EDTA, 1 % (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,8) inneholdende 1 mM ditiotreitol (DTT) og 300 enheter RNasin (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA) og homogenisert med 10-12 føringer i en teflonbelagt vevshomogenisator. Uoppløselig avfall ble separert ved sentrifugering i kulde ved 3000 x g. Supernatantvæsken ble ekstrahert to ganger med fenol:kloroform:isoamylalkohol (24:24:1, v/v), som var blitt ekvilibrert med TEL-bufferen.

Den vandige fase ble fordøyet med 10 0/xg/ml proteinase K ved 37°C i 30 min. og reekstrahert med et likt volum av fenol:kloroform 1:1), og nukleinsyren ble utfelt med 2 volumdeler etanol i 1 time på tørris eller over natten ved +20°C. Pelleten ble etter sentrif ugering ved 10.000 x g i 1 time resuspendert i TE (10 mM tris, pH 7,5, 2 mM EDTA) og spunnet gjennom en 4 ml CsCl-pute (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA) ved 150.000 x g i 20 timer ved 15°C. RNA-pelleten ble igjen utfelt fra 0,2 M kaliumacetat med 2,5 volumdeler etanol. Dette totale RNA ble passert én gang over oligo-dT-cellulose for a anrike for Poly (A) +-RNA, som beskrevet av Maniatis, supra, s. 197. Et typisk utbytte på 1,9 mg av totalt RNA fra 5 xIO<9>merozoitter inneholdt ca. 20 fig av Poly (A)+-RNA.

2.5 Syntese av oocyst- og merozoitt- cDNA og innsetting i

f agvektorer.

Dobbeltkjedet cDNA ble syntetisert fra 6 itg av det sporulerende oocyst-Poly(A)<+->RNA som beskrevet av Gubler et al., Gene 25.: 263 (1983) ved å bruke revers transskriptase (BRL) til forlengelse fra en oligo(dT)-primer og RNase H (BRL) og E. coli DNA-polymerase I (New England Biolabs) for å syn-tetisere den komplementære kjede. Det dobbeltkjedede cDNA ble så gjort stumpendet med T4 DNA-polymerase (BRL) , og EcoRI-linkere (GGAATTCC, Collaborative Research) ble tilsatt etter behandling med EcoRI-metylase (New England Biolabs) ifølge produsentens anvisninger.

Etter fordøying av det således fremstilte cDNA med EcoRI ble et bibliotek fremstilt i lambda-gtll (Stratagene Cloning Systems, San Diego, California, USA), som beskrevet av Huynh et al. i D. Glover (ed.), DNA Cloning, vol. I: A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington D.C., s. 49-78. EcoRI-cDNA-fragmentene ble ligert til EcoRI-fordøy-ede defosforylerte lambda-gtll-armer (Stratagene Cloning Systems) , og det resulterende DNA ble pakket i fag med "Gigapack"-kit (Stratagene Cloning Systems) ifølge forhandlers anvisninger.

Det resulterende bibliotek ble forsterket ved utsåing på Y1088-vertsceller (ATCC nr. 37195) . Prosentandelen av rekombinante organismer ble bestemt fra forholdet mellom blå og fargeløse plakk på X-gal-plater (Maniatis, supra, s. 24) ved tilstedeværelse av isopropyl-JS-D-tiogalaktopyranosid (IPTG, Sigma Chemical Co.) til å være ca. 90 %.

Dobbeltkjedede cDNA-kopier av merozoitt-Poly(A)<+->RNA ble syntetisert i hovedsak som beskrevet ovenfor. Det dobbeltkjedede cDNA brukt i konstruksjonen av biblioteket, inneholdt fra ca. 200 til 4500 basepar (bp) som beregnet ved migrering i denaturerende geler [Bailey et al., Anal. Biochem. 70:75 (1976)].

Merozoitt-cDNA ble metylert og ligert til EcoRI-linkere som beskrevet ovenfor, bortsett fra at CCGAATTCGG-linkere (Collaborative Research) ble brukt. Etter fordøying med EcoRI ble cDNA fraksjonert i biogel A-50M for å fjerne overskudd av linkermolekyler og cDNA som var mindre enn ca. 300 bp, som beskrevet av Huynh et al., supra.

cDNA ble ligert til lambda-gtll-armer, og DNA ble pakket i fager som beskrevet ovenfor. Det resulterende bibliotek som inneholdt ca. 50.000 fager, ble forsterket ved utsåing på Y1088-vertsceller. Plakkanalyse på X-gal-plater ved tilstedeværelse av IPTG viste ca. 90 % rekombinanter.

3 . IMMUNOLOGISK ANALYSE AV cDNA-BIBLIOTEK

Lambda-gtll-merozoitt-cDNA ekspresjonsbibliotek ble sådd ut på Y1090-celler (ATCC nr. 37197) ved en tetthet på ca. 10.000 plakk pr. 150 mm plate. Seks slike plater ble inkubert i 3,5 time ved 42°C dekket med nitrocellulosefiltre, på forhånd gj ennomtrukket i 10 mM IPTG for å indusere ekspresjon av fé-galaktosidasefusjonsproteinet og inkubert i ytterligere 4-5 timer til over natten ved 37°C. Filtrene ble fjernet fra platene og underkastet flere porsjonsvise vasker med TBS (20 mM tris, pH 8,0, 0,15 M NaCl). Ikke-spesifikke proteinbindingsseter ble blokkert ved inkubering i 20 % fetalt kalveserum (FCS) i TBS i 2-4 timer på en

rotasjonsrister ved 4°C.

Bukvæske for ni monoklonale antistoffer, kjent for å reagere med merozoittantigener (betegnet 7D4, 7D1, 2 0C6, 13A6, 20C1, 11B6, 3A5, 13A1 og 15B2) ble slått sammen, justert til 20 % FCS og 0,15 M NaCl i et endelig volum på 100 ml og tilført hvert av filtrene i petriskåler, to filtre pr. skål. Filtrene ble inkubert med den primære monoklonale antistoffmasse ved 4°C over natten på en rotasjonsrister. Ubundet antistoff ble fjernet ved å vaske filtrene fem til seks ganger med TBS ved romtemperatur. Bundet antistoff ble påvist ved å inkubere filtrene med geite-antimus-pepperrotperoksydase (HPOD)-konjugat (Boehringer-Mannheim), fulgt av fargeutvikling ved å bruke 3 mg/ml 4-klor-l-naf tol (Bio Rad) og 0,018 % H202, som beskrevet av Hawkes et al., Anal. Biochem. 119:142 (1982).

Positive plakker identifisert i den opprinnelige høytett-hetsanalysen ble plakkrenset i en sekundær analyse ved å bruke det samme monoklonale antistoffmateriale. Hver positiv måling ble tilegnet et individuelt monoklonalt antistoff fra materialet ved å så ut de positive organismer i flerskjermrekker, hvorav hver ble indusert med IPTG, overført til nitrocellulose og inkubert med et av de monoklonale antistoffer fra materialet. Én positiv fag, betegnet lambda-m2-4, ble identifisert og som ble gjenkjent av tre av de åtte antistoffer i materialet, nemlig antistoffene 7D1, 7D4 og 20C6.

Lignende metoder ble brukt for å analysere det sporulerende oocyst-cDNA-bibliotek, bortsett fra at et materiale av mono-klonale antistoffer inneholdende antistoffene 6A5, 7B2, 15A3 og 2 0C6 ble brukt for den opprinnelige analyse; 7B2, 15A3, 2 0C6 og 8A2 ble brukt i en andre analyse, og 15A3, 7B2 og 20C6 ble brukt i en tredje analyse, og inkube-ringsbufferen inneholdt i tillegg 0,05 % Tween-20 [polyok-syetylen(20)-sorbitanmonolaurat]. På denne måte ble plakker betegnet lambda-Sl-3, lambda-Sl-4 og lambda-Sl-7; lambda-S2-1, lambda-S2-4 og lambda-S2-5 og lambda-Sl-3, som ble gjenkjent hhv. av monoklonalt antistoff 6A5, 8A2 og 7B2, identifisert i oocyst-cDNA-biblioteket. DNA dannet fra fagen som dannet protein som reagerte med 6A5-antistoffet, ble analysert ved fordøying med EcoRI og elektroforese i agarosegeler (Maniatis et al., supra, s. 150). Tre forskjellige innskudd med størrelser på ca. 1150, 890 og 615 bp ble således funnet.

4. EKSPRESJON AV EIMERIA-GENER I E. COLI

1,1 kb og 0,9 kb EcoRI-DNA-molekylene fra hhv. fag lambda-Sl-7 og lambda-Sl-3 ble isolert og satt inn i EcoRI-setet til hver av de tre variable leseramme-ekspresjonsvektorer pEV-vrfl, pEV-vrf2 og pEV-vrf3, dannet som beskrevet av Crowl et al., Gene 3_8:31 (1985). Plasmider inneholdende innskuddene i begge mulige orienteringer, ble transformert som beskrevet av Mandel et al. [J. Mol. Biol. 53:159

(1970)] i E. coli-stamme MC1061 som bærer det kompatible plasmid pRK248cIts, beskrevet av Bernard et al. [Methods in Enzymology 6_8:482 (1979)] . Stamme MC1061 og plasmid pRK248cIts er blitt deponert hos the American Type Culture Collection og gitt hhv. tilgangsnummer ATCC 33766 og 53338.

De bakterielle transformanter ble dyrket ved 30°C i M9-medium [Maniatis et al., supra, s. 68] med 0,5 % glukose og 0,5 % kasaminosyrer og skiftet til 42°C ved en O.D. (550 my.) på 0,5, som beskrevet av Crowl et al., supra, for å indusere transskripsjon ved lambda-PL promoteren. Etter inkubering i 2-3 timer ble 1 ml prøver tatt, og cellene i prøvene ble samlet opp ved sentrifugering. Cellepelletene ble behandlet som beskrevet av Crowl et al., supra, og lysatene ble underkastet natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamid-gelelektroforese, som beskrevet av Laemmli, Nature 227:680 (1970). Etter elektroforese ble proteinene i gelene enten farget med coomassie brilliant blue eller overført til nitrocellulosemembraner for Western blot-analyse [Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7 6:4350

(1979); Burnetti, Anal. Biochem. 112:195 (1981)] ved å bruke 6A5 monoklonalt antistoff og geite-antimus-HPOD-konjugat for påvisning.

Denne analyse viste at 0,9 kb cDNA-molekylet i én orientering i vektor pEV-vrfl dannet et 20 kD protein som reagerte med 6A5-antistoffet. Ingen ekspresjon ble observert med 1,1 kb molekylet, sannsynligvis fordi det inneholdt 5' ikke-kodende sekvenser. For å optimalisere utbyttet av dette protein, ble forskjellige ekspresjonsmedier under-søkt. Det ble funnet at det foretrukne medium inneholdt pr. 1 (± 10 %) 6,0 g KH2P04, 4,0 g K2HP04, 5,0 g (NH4)2S04, 3,5 g MgS047 H20, 21,0 g gj æreks trakt, 3,5 g baktotrypton, 1,0 ml LB625 Antifoam, 25 g glukose, 70 mg tiamin-HCl, 2,5 ml vitaminoppløsning [GIBCO MEM (100 x) Vitamin Solution] og 1,0 ml sporelementer. LB625 Antifoam, et produkt fra Union Carbide, er en lineær polymer av etylen og polypropy-lenoksyd med en viskositet på 625 Saybolt Universal Seconds ved 37,8°C.

Vitaminer pr. liter fermenteringsmedium innbefattet 0,25 mg hver av D-Ca-pantotenat, cholinklorid, folsyre, nikotin-amid, pyridoxal-HCl og ytterligere tiamin-HCl; 0,50 mg av inositol, og 0,025 mg riboflavin. Sporelementer pr. liter medium innbefattet 2, 7 mg FeCl3-6 H20; 0, 8 mg hver av ZnS04-7 H20 og CuS04-5 H20; 0, 7 mg hver av CoCl2-<6>H20 og Na2Mo04-2 H20; 0,2 mg H3B03og 0,5 mg MnS04-H20.

Naturen til det immunoreaktive protein uttrykt av fag lambda- m2- 4, ble undersøkt først i et lysogen isolert fra en infeksjon av Y1090-celler ved differensiell vekst ved permessive (30°C) og ikke-permessive (42°C) temperaturer. For Western blot-analyse av proteinene syntetisert av dette lysogen ble en 50 ml kultur dyrket ved 30°C i LB-medium

[Maniatis et al., supra, s. 69] til en O.D. (550 m/i) på 0,5 og skiftet til 42°C for å indusere replikasjon av fagen. Etter 15 min. ved 42°C ble IPTG tilsatt til 10 mM, og inkuberingen ble fortsatt ved 37°C i 3 0 min. Cellene ble innhøstet ved sentrifugering ved 4°C og lysert ved koking i 5 min. i Laemmli-prøvebuffer (0,125 M tris, pH 6,8, 1 %

(w/v) SDS, 1,4 M S-merkaptoetanol, 001 % bromfenolblått (w/v), 20 % (v/v) glyserol.

Ekvivalenten av 1,0 ml kultur ble funnet ved elektroforese i en 12,5 % SDS-polyakrylamidgel overført elektroforetisk til nitrocellulose og undersøkt som beskrevet ovenfor med et materiale av tre sammenslåtte monoklonale antistoffer (7D1, 7D4 og 2 0C6), som identifiserte lambda-m2-4-fagen. Utvikling av Western blot viste et fusjonsprotein med en størrelse større enn 150 kD og som var til stede i det induserte lysogen (figur 10, panel B, brønn 2). Antistoff spesifikt for 15-galaktosidase reagerte også med dette høymolekylvekt sprote in og med et protein på ca. 114 kD, som er den ventede størrelse av 15-galaktosidase alene (se figur 10, panel A, brønn 2).

Fag lambda-m2-4-DNA ble fordøyet med EcoRI for å danne et 1,7 kb DNA-molekyl. Dette molekyl ble subklonet i et EcoRI-linearisert plasmidmateriale som inneholdt plasmidene pEV-vrfl, -2 og -3 [Crowl et al., supra] og transformert i E. coli-stamme MC1061 inneholdende plasmid pRK248cIts, som beskrevet ovenfor. Transformanter ble undersøkt for ekspresjon av et immunoreaktivt protein ved temperaturinduksjon ved å bruke det sammenslåtte materiale av tre monoklonale antistoffer som er vist å reagere med fusjonsproteinet i lambda-m2-4-lysogenet. Det immunoreaktive rekombinante protein ble viderekarakterisert vedWestern blot-analyse av E. coli-lvsatene ved å bruke et av de tre monoklonale antistoffer 7D4 fra det sammenslåtte materiale. Hver av de positive kolonier ble funnet å inneholde plasmid-DNA

med det ventede 1,7 kb innskudd og å dirigere

syntesen av et protein på ca. 65 kD ved induksjon som bestemt ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforeseanalyse.

Ekspresjonen av dette 65 kD protein ble funnet å være relativt ufølsom for variasjoner i vekstmedium og induksjons-fremgangsmåte. Proteinet ble gjenvunnet kvantitativt i supernatanten etter ultralydødeleggelse av cellepelleten.

Ekspresjonsplasmidet inneholdende 1,7 kb innskuddet, ble brukt i påfølgende produksjon av rekombinant protein og er vist skjematisk i figur 11. Dette plasmid ble videreutvik-let i MC1061-vertsceller som var lysogene for lambda-cI857 (fremstilt ved å bruke standardmetoder for dannelsen av lambda-faglysogener beskrevet av Arber et al. i Cold Spring Monograph, Lambda II, 1983, Hendrix et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, s. 4 50) ved 3 0°C for å opprettholde den undertrykte tilstand av PL-promoteren i plasmidet.

Ved å bruke lignende metoder, ble ekspresjon av et 28 kD protein kodet for av et sporulerende oocyst-cDNA-segment med ca. 1,1 kb utført. Dette protein bandt spesifikt til monoklonalt antistoff 8A2. Ekspresjon av et 45 kD protein kodet for av et sporulerende oocyst-cDNA på ca. 1,2 kb ble også utført. Dette protein bandt spesifikt til monoklonalt antistoff 7D2.

5. DNA-SEKVENSANALYSE

Generelt ble isolering av plasmid-DNA fra 1 ml mettede overnattingskulturer i liten skala utført ved å bruke fremgangsmåten til Birnboim et al. [Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)] . Denne fremgangsmåte tillater isoleringen av en liten mengde DNA fra en bakteriell koloni for analytiske formål. Større mengder plasmid-DNA ble fremstilt ved å bruke 1 1 kulturer ifølge en standardprosedyre med cesium-kloridsentrifugering [Maniatis et al., supra, s. 93] . DNA-sekvensene av cDNA fra det sporulerende oocyst-bibliotek ble bestemt ved den kjemiske spaltningsmetode til Maxam et al., Methods in Enzymology 65_:499 (1980) og ved kjedeavslutningsmetoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74=5463 (1977) som modifisert for dobbeltkjedet plasmid-DNA av Smith et al., Cell 16:753 (1979) og Wallace et al., Gene 16.:21 (1981). I kjedeavslutningsmetoden ble 7-deaza-dGTP [Barr et al., BioTechniques 4:428 (1986)] brukt i stedet for dGTP for å eliminere G-C-kompresjonsartefak-ter .

For å lette sekvensanalyse ble 1,1 kb EcoRI-molekylet fra lambda-Sl-7 overført til plasmid pEV3-SEQ (figur 12), som har en polylinker ved siden av EcoRI-setet av pEV-vrf3. Denne polylinker ble brukt for å linearisere plasmidet ved BamHI- og Kpnl-setene for å danne enrettede delesjoner med eksonuklease III [Henikoff, Gene 28:351 (1984)]. Xbal-setet i polylinkeren ble brukt for 3'-endemerking for Maxam-Gilbert-sekvensering av delesjonene, og primeren CGGTCGACTCGAGCCA ble brukt for Sanger-sekvensering. Denne primer var<32>P-merket ved sin 5' ende ved å bruke [y-32P]ATP (ICN) og polynukleotidkinase, som beskrevet av Maniatis et al., supra, s. 122.

Figur 13 viser restriksjonssetene i 1,1 kb EcoRI-molekylet brukt for Maxam-Gilbert-sekvensering. Posisjonen av EcoRI-setene i 0,9 kb molekylet er også vist, siden disse også ble brukt. Endepunktene for delesjonene foretatt med endonuklease III er også vist. Disse ble sekvensert enten fra Xbal-setet i pEV3-SEQ-polylinkeren med Maxam-Gilbert-metoden eller med en primerforlengelse (figur 12) via Sanger-metoden. Begge kjeder til det fullstendige cDNA ble sekvensert med én eller begge av disse metoder. Grunnet et høyt G-C-innhold i DNA ble Maxam-Gilbert-reaksjonene vanligvis fraksjonert både i 8 % og 15 % polyakrylamid-ureageler.

Primerforlengelse ble utført ved å inkubere 1,5 ttg av poly-(A)<+->RNA med 2 pmol av den 5' endemerkede syntetiske oligo-nukleotidprimer GAGGTCTGCCATTTTGC I 60 min. ved 42°C i 50 mM tris-HCl, pH 8, 0, 8 mM MgS04, 0,1 M NaCl, 2 mM ditiotreitol, 2 mM av hvert deoksynukleotidtrifosfat (dNTP, Pharmacia Fine Chemicals), 2 0 enheter RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) og 20 enheter AMV revers transskriptase (Pharmacia, Piscataway, NJ, FPLC-ren). Produktene ble analysert i 8 % polyakrylamid-ureagelene brukt for sekvensanalyse med<32>P-merket Hpall-fordøyet pBR322-DNA som molekylstørrelsesmarkør.

For sekvensanalyse ble hovedproduktene eluert fra gelen og analysert ved den kjemiske spaltningsmetode til Maxam et al., supra, eller ddNTP ble brukt i forlengelsesreaksjonen [Tolan et al., J. Biol. Chem. 259:1127 (1984); Graves et al., J. Biol. Chem. 261:11409 (1986)]. Reaksjonene ble analysert i 8 % polyakrylamid-ureageler.

Nukleotidsekvensen til 1,1 kb cDNA-molekylet er vist i figur 14. Sekvensen til 0,9 kb molekylet strekker seg fra base 188 til base 1082 inne i dette større molekyl. Aminosyresekvensen forutsagt fra analyse av den åpne leseramme til denne nukleotidsekvens, er vist i figur 15. Riktigheten av den forutsagte aminosyresekvens vist i figur 15, ble bekreftet som følger.

Syntetiske polypeptider ble fremstilt med aminosyresekven-ser som tilsvarte residuene 41-54 og 145-164 fra figur 15. Kaninantiserum fremskaffet mot begge disse polypeptider ble brukt i Western blot-analyse av både totale sporozoittproteiner og et lysat av E. coli-transf ormanten, som uttrykte 0,9 kb cDNA. Antistoffene mot begge polypeptider bandt seg til proteiner i begge av Western blottene.

Ved å bruke lignende metoder, ble nukleotidsekvensen til 1,7 kb-innskuddet som koder for 65 kD-proteinet i fag lambda-m2-4 bestemt med resultatene vist i figur 16. Den forutsagte aminosyresekvens til proteinet kodet for av denne DNA-sekvens, er vist i figur 17. Denne sekvens ble bekreftet ved aminosyresekvensanalyse utført på polypeptider dannet ved tryptisk fordøying av det uttrykte 65 kD protein, som beskrevet nedenfor. Regioner i den totale aminosyresekvens som tilsvarer enkelte av disse peptider, er understreket i figur 17.

Merkelig nok ville man vente at DNA-sekvensen med åpen leseramme for 1,7 kb molekylet skulle kode for et protein på ca. 33.349 dalton. Imidlertid migrerer ekspresjonspro-duktet fra dette DNA-fragment i SDS-geler med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 65 kD. Grunnen for denne uover-ensstemmelse mellom den forutsagte og observerte protein-størrelse er ukjent. Dette protein blir heri referert til som "65 kD"-proteinet.

På lignende måte ble nukleotidet og den forutsagte aminosyresekvens av cDNA-molekylet som koder for 28 kD proteinet, gjenkjent av monoklonalt antistoff 8A2, bestemt hhv. med resultatene vist i figur 18 og 19.

På lignende måte ble nukleotidet og den forutsagte aminosyresekvens til 1,2 kb 7B2-CDNA bestemt. Siden en konti-nuerlig åpen leseramme ble funnet og proteinet isolert fra sporozoittene ved immunoutfelling er større enn 200 kD, ble biblioteket analysert for større cDNA ved å bruke 1,2 kb cDNA som en probe. Et 3,2 kb cDNA ble således erholdt med nukleotid og forutsagt aminosyresekvens vist hhv. i figur 20 og 21.

6. RENSING OG KARAKTERISERING AV 65 kD-PROTEINET

6.1 Proteinrensing

Fermentering av E. coli MC1061 (pRK248cIts) til høy celle- tetthet og inneholdende pEV/2-4-ekspresjonsplasmidet, ble utført i 10 liters kar i 1,5 x M-9-medium ved å bruke standardfremgangsmåter for temperaturinduksjon, som beskrevet ovenfor, etter ca. 4 timers vekst ved den permis-sive temperatur. Cellemassen ble innhøstet 5 timer etter induksjon og ga 500 g cellepasta. 50 g av E. coli-cellepastaen ble uniformt suspendert i 500 ml 10 mM tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, og omrørt ved 2-8°C i 2 timer. Suspensjonen ble passert gjennom en Gaulin-homogenisator (APV Gaulin, Everett, Massachusetts, USA) to til tre ganger ved 7000 psi. Cellelysatet ble sentrifugert ved 24.000 x g i 1 time i en Sorvall RC-5-sentrifuge, og pelleten ble kastet. Fast ammoniumsulfat ble tilsatt supernatanten (endelig konsentrasjon 80 %) . Dette ble holdt ved 4°C i 2 timer og derpå sentrifugert ved 24.000 x g i 1 time. Pelleten ble oppløst i 20 mM kaliumf osf at, pH 6,8. Etter sentrifugering ble supernatanten dialysert mot 20 mM kalium-fosfat, pH 6,8.

En Pharmacia-glasskolonne (5 cm diameter x 10 cm lengde) ble pakket med "NuGel P-DE 200" (200 Ångstrøm, 40-60/xm, svak anionebytter, Separation Industries, Metuchen, NJ) silikastøtte. Gelen ble ekvilibrert med 20 mM kaliumfosfat, pH 6,8. Prøven ble satt på (10 ml/min.), vasket med ekvili-breringsbuffer og eluert med 20 mM kaliumfosfat inneholdende 0,4 M NaCl, pH 6,8. Kolonnefraksjonene ble analysert ved Western blotting med antistoff 7D4 for å påvise 65 kD proteinet.

En immunoaffinitetskolonne ble brukt for ytterligere å rense 65 kD proteinet. Absorbenten i denne kolonne ble fremstilt ved å immobilisere monoklonalt antistoff 7D4 på "NuGel P-polyaldehyd" (500 Ångstrøm, 40-60/xm, Separation Industries, Metuchen, New Jersey, USA) silikastøtte. Immobiliseringsprosedyren innbefattet følgende: 10 g polyaldehydstøtte ble suspendert og vasket med 0,1 M kaliumfosfat, 0,1 M NaCl, pH 6,8, og overført kvantitativt til en Ehrlenmeyer-flaske inneholdende 2 0 ml av monoklonalt antistoff 7D4 ved en proteinkonsentrasjon på 8 mg/ml. Natriumcyanoborhydrid (4 mg) ble så satt til suspensjonen. Blandingen ble ristet forsiktig ved 4°C i 16 timer.. Gelen ble filtrert og vasket med 0,1 M kaliumfosfat, 0,1 M NaCl, pH 6,8. Sammenslåtte filtrater ble undersøkt for ubundet antistoff. Bindingstetthet var 8 mg/g støttemateriale. Ukoblede aktive seter ble blokkert ved å suspendere gelen i 20 ml 1 M etanolamin, pH 7,5. Natriumcyanoborhydrid (4 mg) ble satt til suspensjonen som så ble ristet ved 4°C i 16 timer. Gelen ble samlet opp og vasket grundig med kald koblingsbuffer.

For å utføre immunoaffinitets-kromatografien, ble en kolonne (1 cm x 10 cm) pakket med det immobiliserte 7D4-antistoff og ekvilibrert med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1 % Triton X-100. Et sammenslått materiale av fraksjoner fra "NuGel P-DE 200"-kolonnen inneholdende 65 kD proteinet ble fortynnet to ganger med PBS inneholdende 0,1 % Triton X-100 og satt på kolonnen ved en strømningsgrad på 10 ml/min. Etter påsetting ble gelen vasket med PBS for å fjerne uabsorbert materiale. Det absorberte immunoreaktive materiale ble eluert med 0,3 M eddiksyre, 0,1 M NaCl, pH 2,7-buffer. Proteinet ble så konsentrert i en "Amicon Stircell"-apparatur ved å bruke en YM 10-membran (Amicon, Div. W.R. Grace & Co., Danvers, Massachusetts, USA) .

Renheten av proteinet ble bestemt ved SDS-polyakrylamid-gelelektrof orese , som beskrevet av Laemmli [Nature 227:680

(1970)]. Gelen ble farget med coomassie blue. Western blot-analyse ble også utført ved å bruke 7D4 monoklonalt antistoff med geite-antimus-pepperrotperoksydasekonjugat. Resultatene er vist i figur 22. Brønn 2, 3, 4 og 5 inneholder renset protein fra to preparater. Brønn 1 og 6 inneholder en blanding av molekylvektsmarkørproteiner med molekylvektene vist til venstre og høyre i figuren. 10 fig protein ble påsatt i hver brønn.

I figur 22 kan det observeres at det rensede protein migrerte i SDS-gelen som et hovedbånd med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 65-kD med små bånd med større og mindre mobilitet.

6.2 Bestemmelse av isoelektrisk punkt

10 fig av det rensede 65 kD-protein ble underkastet isoelektrisk fokusering i en på forhånd dannet isoelektrisk foku-serende gel erholdt fra LKB Instruments, Gaithersburg, Maryland, USA. En blanding av standardproteiner med kjente isoelektriske punkter ble påsatt på samme tid. Gelen ble fokusert i ca. 2 timer ved 50 mA, 1500 volt, i henhold til forhandlers instruksjoner ved å bruke en 3,5-9,5 pH-gradient.

Ved avslutning av elektrofokuseringen ble gelen farget med coomassie blue-farge for å påvise proteinbåndene. Det isoelektriske punkt av det rensede protein ble så bestemt ved å måle posisjonen av båndet inne i pH-gradienten i forhold til posisjonene av proteinstandardene. Det isoelektriske punkt av proteinet således bestemt var 4.6.

6.3 Aminosyresammensetnings- analyse

Aminosyresammensetnings-analyse blir utført ved å bruke etterkolonnereaksjon med fluorescamin som beskrevet av Pan et al. i Methods of Protein Microcharacterization, 1986, Shively, ed., the Humana Press, s. 105-119. Prøver inneholdende 3 fig av 65-kD-proteinet ble hydrolysert i 6 N HCl inneholdende 4 % tioglykolsyre ved 110°C i 20-24 timer in vacuo, og 10 % av hydrolysatet ble brukt for analyse. Cysteinverdier ble bestemt etter permaursyreoksydering. Resultatene er vist i tabell 3.

6.4 N- og C- terminal sekvensanalvse

200 pikomol av proteinet (som bestemt i aminosyresammen-setningsanalyse) ble underkastet N-terminal analyse ved å bruke metoden til Hewick et al., J. Biol. Chem. 256:7990

(1981) og en Applied Biosystems modell 470A sekvensator (Applied Biosystems Inc., Foster City, California, USA). Den N-terminale sekvens som således ble bestemt, var M-N-K-N-S-?-L-G-G-F-?-S-M-Q-E-S-P-P-P. Identitetene til amino-syreresiduene ved posisjonene indikert med spørsmålstegn er usikre, fordi utbyttet av PTH-Cys var lavt og cystein-residuer kan være involvert i disulfidbindinger [Hewick et al., J. Biol. Chem. 256:7990 (1981)].

C-terminal analyse ble utført på 1200 pikomol av 65 kD-proteinet ved tidsbestemt karboksylpeptidase Y-fordøying, som beskrevet av Hayashi, Methods in Enzymology 47:84

(1977). Karboksylpeptidase Y (Boehringer-Mannheim, Indiana-polis, IN) ble brukt ved en konsentrasjon på 0,8/xg/350/xl i 0,05 M natriumacetatbuffer, pH 5,9, og porsjoner for prøve ble tatt etter 0, 2, 5, 10, 20 og 30 min. for analyse. Prøveporsjonene ble gjort sure med HCl for å stoppe videre reaksjon og derpå underkastet aminosyreanalyse som beskrevet ovenfor. Denne analyse viste at aminosyresekvensen til C-terminalen sannsynligvis er (Met, Trp)-Ala-Ser. Tryptofan ble observert å øke samtidig med metionin, men Trp er vanskelig å mengdebestemme i fluorescaminanalysato-ren fordi den har en lav reaktivitet med fluorescamin. Følgelig kunne de relative posisjoner til Trp og Met ikke bli bestemt med nøyaktighet ved denne analyse.

6.5 Tryptisk peptidanalyse

Delvis for å verifisere aminosyresekvensen forutsagt fra nukleotidsekvensen av cDNA som koder for 65 kD proteinet, ble noe av proteinet fordøyet med trypsin (Cooper, Biomedi-cal, Philadelphia, Pennsylvania, USA) , og de resulterende peptider ble sekvensert som beskrevet nedenfor.

Tryptiske fordøyinger ble utført over natten ved 3 7°C på 14 8/xg protein i 0,2 M ammoniumbikarbonat, pH 8, ved å bruke et enzym-til-substrat-forhold på 1:30. Peptider således dannet ble atskilt i et Waters HPLC-system ved å bruke en Altex ultrasphere 250 x 4,6 mm C-18-kolonne (Beckman Instruments, Fullerton CA) med en 0-55 % gradient med økende acetonitril i 0,1 % (basis) trifluoreddiksyre. Før HPLC-separasjonen ble fordøyingen redusert med 6- merkaptoetanol i 30 min. ved 37°C for å bryte alle disulfidbindinger i peptidene. Kolonneeffluent ble overvåket ved 215 m/x ved å bruke en laboratorie-datakontrolldetektor (Laboratory Data Control, Rivera Beach, Florida, USA) . HPLC-kolonnen atskilte åtte hovedtopper som vist i figur 23A.

Hver topp ble først analysert med aminosyreanalyse som beskrevet ovenfor for å bestemme både mengden og sammensetningen av peptidene. Derpå ble mesteparten av peptid-toppene fra HPLC-kolonnen sekvensert med automatisk Edman-degradering ved å bruke en Applied Biosystems modell 470A gassfasesekvensator. Fenyltiohydantoin (PTH)-aminosyrederi-vater ble identifisert i et Waters HPLC-system ved å bruke en Altex ultrasphere C-18-kolonne som beskrevet av Hawke et al. [Anal. Biochem. 120:302 (1982)] eller i en Applied Biosystems modell 120A on-line PTH aminosyreanalysator. Aminosyresekvensen til enkelte av disse peptider er vist under de understrekede regioner i figur 17. Tallet til hvert av disse peptider (tilsvarende HPLC-toppnumrene) er vist innsirklet ved siden av den tilsvarende sekvens. Usikkerhet i identiteten av enkelte av residuene i peptidsekvensen er angitt med et spørsmålstegn ved disse posisjoner, selv om aminosyresammensetnings-analysene til peptidene viste at aminosyrene indikert i de tilsvarende posisjoner av den forutsagte sekvens var til stede i peptidene. Usikkerheten i identitet av enkelte av peptidresiduene var på grunn av den lave reaktivitet av tryptofan med fluorescamin.

Peptid 6, som tilsvarer N-terminalen av det fullstendige 65 kD-protein, inneholder fire residuer ved sin N-terminal som er kodet for av nukleotidene i ekspresj onsplasmidet. Analyse av peptid 8 ga en aminosyresekvens som lignet den til peptid 3, men som manglet de fire C-terminale residuer, noe som antyder at dette sannsynligvis var resultatet av ufullstendig tryptisk fordøying. Peptid 5 ble ikke sekvensert fordi aminosyresammensetnings-analysen av dette peptid viste at det var det samme peptid som peptid 6 minus de første tre aminosyreresiduer ved N-terminalen.

HPLC-analyse av den tryptiske fordøying utført som beskrevet ovenfor, men uten forutgående merkaptoetanolreduksjon, ga en elueringsprofil hvor toppene 4, 7 og 8 var fraværende (figur 23B) . Denne observasjon antyder at disse cystein-inneholdende peptider sannsynligvis var involvert i disul-fidbindingsdannelse i det ureduserte protein.

7. FJÆRFEIMMUNISERING

7.1 Anvendelse av 65 kD- antigenet

For å bestemme hvorvidt tilførsel av det rensede rekombinante 65 kD-protein kunne beskytte kyllinger mot infeksjon med Eimeria tenella-sporulerte oocyster, ble en serie av immuniseringseksperimenter utført. I disse forsøk ble 1-3 uker gamle Leghorn-kyllinger (Avian Services, Frenchtown, New Jersey, USA) holdt i et rent rom og stelt av røktere som ikke hadde kontakt med andre fugler opp til infeksjons-tiden. Fuglene ble holdt i elektrisk' oppvarmede oppbeva-ringsbur inntil de var 3 eller 4 uker gamle, hvorpå de ble overført til utvoksingsbur.

Ikke-medisinert broileroppstartingsfor og vann ble tilført ad libitum gjennom eksperimentene. Ved tilføringstiden av oocystene ble fuglene overført til en annen bygning, hvor de ble holdt inntil slutten av forsøkene. Den kliniske tilstand til dyrene ble undersøkt minst tre ganger ukentlig før immunisering og på en daglig basis etter immunisering. Fuglene ble individuelt identifisert ved hjelp av vingebånd ved 3 eller 4 ukers alder før tilfeldig utvelgelse til forskjellige testgrupper.

Forskjellige mengder av 65 kD-proteinet renset med immunoaffinitetskromatografi, som beskrevet ovenfor, ble brukt som immunogenet. Disse mengder av immunogen inneholdt bakterielle endotoksinaktiviteter i området fra ca. 0,3 til ca. 5 0 endotoksinenheter pr./xg protein, hvor aktiviteten er bestemt og definert som beskrevet i the United States Pharmacopeia, 21. utgave, 1985, United States, Pharmaco-peial Convention, Inc., Rockville, Md., s. 1165-1167. Proteinet ble oppløst i 0,02 M K2HP04-buffer, pH 6,8, før bruk og fortynnet med samme buffer etter behov.

Bovint serumalbumin (BSA, Pentex) ble brukt som en kontroll. Fordi pyrogen aktivitet var til stede i det anvendte immunogen, ble ca. like mengder av slik aktivitet lagt til alle BSA-kontroller for å ta hensyn til alle ikke-spesifikke effekter som kan oppstå på grunn av denne aktivitet. Denne pyrogene aktivitet ble lagt til BSA i form av et utransformert E. coli-lysat som var preparert ved å ødelegge E. coli ved ultralydbehandling og derpå filtrere materialet gjennom et 0,45/x Millipore-filter.

Fortynnede prøver av kontroll-BSA eller Eimeria-antigenet ble kombinert med et likt volum hjelpestoffer og blandet grundig i glassprøyter utstyrt med 18 gauge nåler før tilførsel. Freunds fullstendige og ufullstendige medium ble brukt for hhv. primær og forsterkningsimmunisering. Begge medier var erholdt fra Gibco, Grand Island, New York, USA.

Primære immuniseringer ble foretatt subkutant på bakdelen av kroppen ved nakkegropen når fuglene var 4 uker gamle. Enkelte fugler mottok også forsterkningsimmuniseringer ved 6 ukers alder. Volumet av det injiserte materiale lå i området fra ca. 0,4-2,4 ml. For større volumer ble dosen delt mellom to injeksjoner. To eller tre uker etter siste vaksinering ble fuglene tilført 25.000 eller 50.000 sporulerte oocyster av E. tenella tilført oralt. Syv dager etter infeksjonen ble de overlevende fugler avlivet, obdusert og opptelt for store lesjoner. Alle fuglene som døde under eksperimentene, ble også obdusert. Diagnoser ble stilt og tarmlesjonene ble angitt som 0 = normal, 1 = lett infeksjon, 2 = moderat infeksjon, 3 = alvorlig infeksjon og 4 = død. Resultatene som ble erholdt, ble oppsummert som gjennomsnittlig infeksjonsgrad for hver gruppe fugler. Fuglene ble også veid ved inf eksjonstid og 7 dager etter infeksjon. Enkelte fugler ble ikke vaksinert med BSA eller coccodialt antigen, men ble behandlet som infiserte eller uinfiserte, uvaksinerte kontroller.

Resultatene av to slike eksperimenter er vist i tabell 4.

Dataene i tabell 4 viser at vaksineringen med 65 kD-protein generelt dannet numerisk lavere lesjonstall, sammenlignet med infiserte men uimmuniserte kontroller. To grupper av fugler gitt forsterkningsvaksineringer i eksperiment 1 (betegnet med underbokstav e i tabellen), viste reduserte lesjonstall som var statistisk signifikante. I andre tilfeller var graden av reduksjon i lesjonstall ikke så stor, men vektøkningen var ikke desto mindre generelt forbedret i de vaksinerte fugler.

For å bestemme hvorvidt en tredje vaksinering ytterligere ville øke beskyttelsen, ble et eksperiment utført hvor grupper av 8 fugler ble behandlet som infiserte eller uinfiserte, uvaksinerte kontroller eller vaksinerte med BSA eller merozoittproteinet ved 3 og 5 ukers alder, eller ved 3, 5 og 7 ukers alder. De første to vaksineringer ble foretatt med Freunds fullstendige medium. Hvor en tredje vaksinering ble gitt, ble denne gitt med Freunds ufullstendige medium. Inokuleringer ble gitt subkutant som beskrevet ovenfor.

To uker etter siste vaksinering ble hver fugl tilført 25.000 sporulerte oocyster av E. tenella ved oral tilfør-sel. Kroppsvektene ble målt ved tilføringstid og 7 dager, ved hvilken tid fuglene ble avlivet og cekale lesjoner ble opptelt. Resultatene er vist i tabell 5.

Dataene i tabell 5 viser at immunitet ikke ble forbedret ved å tilføre en tredje vaksinering. Større beskyttelse, som vist ved reduserte cekale lesjonstall, ble fremskaffet med antigenet sammenlignet med ubehandlede, infiserte kontroller eller fugler vaksinert med BSA.

For å bestemme hvorvidt tilføringsruter forskjellige fra subkutan injeksjon kunne gi bedre resultater, ble to doseringsnivåer av 65 kD-proteinet tilført tre ganger med 2 ukers mellomrom til grupper av åtte 3 uker gamle Leghorn-kyllinger ved å bruke intradermale, subkutane, intramuskulære, orale og anale tilføringsveier. To uker etter siste immunogentilførsel ble fuglene tilført 25.000 sporulerte oocyster av Eimeria tenella gitt oralt. Fuglene ble avlivet 1 uke etter tilførsel, og cekale lesjonstall ble bestemt.

Subkutane injeksjoner ble tilført som beskrevet ovenfor. Intramuskulære injeksjoner ble foretatt dypt i ytre side av venstre lår. Intradermale injeksjoner ble tilført i bakre side av høyre vinge. Oral tilførsel ble gitt ved å bruke en 5 cm lang 18 gauge rundtuppet nål som avsetter inokulumet i kråsen hos fuglen. Anal tilførsel ble foretatt ved å bruke en 5 cm lang 18 gauge nål med avlang tupp som ble innført til sin maksimale lengde i kloakkåpningen. Etter oral og anal tilførsel ble fuglene holdt hhv. i stående og oppned stilte posisjoner i flere minutter for å unngå mulig utstøting av inokulumet.

Den subkutane doseringsform var som beskrevet ovenfor med Freunds fullstendige medium brukt for primærinjeksjonen og Freunds ufullstendige medium brukt for forsterkningsinjek-sjonene. Doseringsformer for de andre tilføringsruter inneholdt protein ved de angitte nivåer i 0,02 M K2HP04-buf f er, pH 6,8.

Resultatene av dette eksperiment er vist i tabell 6.

Tabell 6 viser at de laveste cekale lesjonstall ble observert i fugler immunisert med 5 tig antigen via oral rute og med 25/xg antigen via intradermal rute. Disse resultater var statistisk signifikante. Numerisk lavere lesjonstall ble observert for andre tilføringsruter og andre doseringsnivåer, noe som indikerer en beskyttende tendens. Forskjel-lene mellom disse tall og de til IUC-fuglene var imidlertid ikke statistisk signifikante.

Det å ikke observere lineær doserespons i de foregående eksperimenter, kan ha vært grunnet forskjeller i spor-forurensninger og/eller pyrogent innhold i 65 kD-antigen-preparatene eller andre faktorer.

7.2 Vacciniavektorvaksinerint?

For å danne en mer effektiv mulighet for å immunisere kyllinger med E. tenella-antigenet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, ble 1,1 kb cDNA som koder for 20 kD proteinet, gjenkjent av monoklonalt antistoff 6A5 (figur 14), og 1,1 kb cDNA-molekylet som koder for 28 kD-proteinet, gjenkjent av monoklonalt antistoff 8A2 (figur 18), klonet i vaccinia-virus og brukt for å vaksinere kyllinger som beskrevet nedenfor.

7.2.1 Vektorfremstilling

Alle rekombinanter som ble dannet, var basert på homolog rekombinasjon i det virale thymidinkinase (TK)-locus, som beskrevet av Mackett et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:7415 (1982)]. TK-locuset er blitt kartlagt til vaccinia-virus (W) Hindlll J-fragmentet [Hruby et al., J. Virol. 4_3:403 (1982)] , og deler av dette fragment er blitt sekvensert [Weir et al., J. Virol. 46=530 (1983)].

For å konstruere en vektor for rekombinasjon ble W HindiII J-fragmentet subklonet i pUC8 (figur 24a). Denne konstruksjonen ble spaltet med Hpall. Fragmentene ble behandlet med E. coli DNA-polymerase Klenow-fragment (Klenow) og spaltet på nytt med Hindlll, og delen inneholdende det virale TK-gen ble isolert fra lavtsmeltende agarose. Det isolerte fragment ble ligert i Hindlll og gjort stumpendet (Sl-behandling) i EcoRI-setet av en pUC8-vektor (figur 24b, høyre). Derpå ble Hindlll-setet fjernet ved å behandle det HindiII-fordøyede DNA med Klenow og religere vektorfragmen-tet. For innsettingen av W-promoteren (betegnet 7,5K-promoteren) ble vektoren spaltet med Clal og EcoRI.

W 7,5K-promoteren ligger i et av de minste Sali-fragmenter av viruset [Venkatesan et al., Cell 25:805 (1981)]. Det tilsvarende fragment ble klonet i M13mp8. En klon ble utvalgt hvor transskripsjonsretningen var mot EcoRI-setet av M13mp8 (figur 24a, venstre). DNA ble spaltet med Seal og Smal, Bglll-linkere ble tilsatt, og dette DNA ble religert

(figur 24b). EcoRI-AccI-fragmentet inneholdende det virale promotersegment ble isolert fra M13-konstrukdjonrn og ligert i pUC8-TK-fragmentet beskrevet ovenfor, noe som resulterte i vektor pUC8-7,5K<*>. Denne nye vektor ble fordøyet med Bglll og EcoRI.

For å danne en vektor med multiple kloningsseter, ble en passende polylinker innbefattet i ovenfor nevnte konstruksjon. For dette formål ble polylinkeren inneholdt i

M13tgl31 (Amersham) valgt (figur 24d) . Polylinkerfragmentet ble isolert ved å fordøye fag-DNA med Bglll og EcoRI, og fragmentet ble satt inn i pUC8-TK-7,5K<*->konstruktet, noe som resulterte i den endelige basisvektor for rekombinasjon av fremmede antigener i W (figur 24c) , som er pUC8-TK-7, 5K.

EcoRI- fragmentet som koder for 2 8 kD-proteinet, som binder til monoklonalt antistoff 8A2, inneholder ikke sekvensen for den N-terminale del av proteinet. Det opprinnelige startkodon og ledersekvensen for proteinet mangler.

For å kompensere for disse manglende regioner, ble to forskjellige konstruksjoner dannet og undersøkt for ekspresjon. I den første konstruksjon ble et startkodon i leserammen dannet ved å fjerne deler av polylinkeren i basisvektoren for rekombinasjon pUC8-TK-7,5K (figur 24c). Vektoren ble fordøyet med EcoRV og Smal, som fjernet deler av polylinkeren (figur 24d) , og derpå religert. Ved denne manipulering ble ATG-kodonet inneholdt i Sphl-restriksjonssetet plassert i den korrekte leseramme for den kodende region av oocystproteinet på EcoRI-fragmentet. At manipule-ringen hadde lyktes, ble bekreftet ved sekvensering av det nye polylinkerfragment. Den forutsagte N-terminale aminosyresekvens av proteinet kodet for av denne konstruksjon, er vist i figur 25A.

For å kompensere i DNA-sekvensen, ikke bare for start- kodonet, men også for den manglende ledersekvens, ble EcoRI-fragmentet plassert i den korrekte leseramme bak en ledersekvens av et malarialt antigen. Det malariale antigen brukt for å isolere ledersekvensen, var 190 kD-proteinet beskrevet som Ro-33 [Certa et al., EMBO J. 6:4137 (1987)]. Det må imidlertid bemerkes at andre ledersekvenser, så som coccodiale ledersekvenser, kunne bli brukt for samme formål.

For å isolere DNA-fragmentet inneholdende ledersekvensen, ble Ro-33-DNA fordøyet med Dral. Fragmentet inneholdende gjenkjenningssetene for restriksjonsenzymene PvuII og Hindlll ble isolert og fordøyet med Hindlll. Den opprinnelige vektorkonstruksjon pUC8-TK-7,5K (figur 24c) ble spaltet med Sali, behandlet med Klenow og derpå fordøyet med Hind-III. I dette vektorfragment ble det isolerte Dral-Hindlll-malariale antigenlederfragment klonet. Denne konstruksjon ble brukt for å uttrykke et fusjonsprotein mellom P. falciparum 190 kD-proteinet og E. tenella-anti<g>e-net gjenkjent av antistoff 8A2 og kodet for av EcoRI-fragmentet. Den forutsagte N-terminale aminosyresekvens av dette fusjonsprotein er vist i figur 25B.

EcoRI-fragmentet som koder for 2 8 kD-proteinet ble klonet i EcoRI-setet av polylinkeren inneholdt i basisvektoren (figur 24c). Konstruksjoner inneholdende fragmentet i den korrekte orientering ble mangfoldiggjort og brukt for rekombinasjon i vacciniaviruset.

På grunn av måten som initieringssetet for translasjon av fragmentet ble satt inn i basisvektoren på (se ovenfor) , ble det ventet at to forskjellige N-terminale sekvenser for genet skulle uttrykkes av det rekombinante vacciniavirus (figur 25). Mens kun tre ytterligere aminosyrer (Met, Arg og Trp) er lagt til den opprinnelige sekvens i den første konstruksjon (figur 25A) , er det i den andre en total på 47 aminosyrer avledet fra ledersekvensen av det 190 kD malari ale antigen, fusert til N-terminalen av polypeptidet gjenkjent av monoklonalt antistoff 8A2 (figur 25B) . Ved å behandle det potensielle spaltningssete av ledersekvensen blir 19 av de ytterligere aminosyrer fjernet, noe som fører til et ferdigutviklet protein som starter med Val, Thr, His.

EcoRI- fragmentet som koder for 20 kD-proteinet, gjenkjent av monoklonalt antistoff 6A5, inneholder den fullstendige sekvens. Dette fragment ble uten videre manipulering klonet i EcoRI-setet av W-vektoren som beskrevet ovenfor.

Rekombinasjon av de ovenfor nevnte gener som koder for coccodiale antigener i et stamme WR-vacciniavirus, ble utført ved å bruke en totrinns prosedyre for utvelgelse av det rekombinante virus.

I første trinn ble CVl-apeceller dyrket i medium I [Eagles minimalt essensielt medium (MEM), 5 % føtalt kalveserum (FCS, fra Amimed), penicillin/streptomycin (hhv. 100 enheter/ml og 100 iig/ml) og 2 mM glutamin; alle reagenser fra Gibco] i 8 cm<2>dyrkningsskåler til 80-90 % konfluens. Mediet ble fjernet og erstattet med 0,2 ml av en virussuspensjon inneholdende den temperatursensitive vaccinia-virusstamme ts N7 [Drillen et al., Virology 131:385 (1983)] ved 0,1 plakkdannende enheter (pfu)/celle. Platene ble oppbevart ved romtemperatur i 1 time, hvorpå 2 ml av medium I ble tilsatt hver plate, og platene ble inkubert i 2 timer ved 33°C (temperatur som tillater vekst av dette virus) i en C02-inkubator [Kieny et al., Nature 312:163 (1984)].

En halvtime før slutten av ovenfor nevnte inkuberingspe-riode ble et DNA-inneholdende kalsiumfosfatpresipitat fremstilt. Dette inneholdt HeBS-buffer [280 mM NaCl, 1,5 mM natriumhydrogenfosfat, 50 mM HEPES], 200 ng renset vacciniastamme WR-virus-DNA og 200 ng renset coccodialt antigen-inneholdende plasmid-DNA i et totalt volum på 0,55 ml. Hvert DNA ble tilsatt i 1 /xl TE-buffer (10 mM tris-HCl, pH 7,5,1mM EDTA). Til denne oppløsning ble det tilsatt dråpevis og med forsiktig rotering 0,55 ml av en 250 mM kalsiumkloridoppløsning. Denne • blanding ble oppbevart ved romtemperatur i 20 min.

Etter 2 timers inkubering ble mediet fra kulturskålene aspirert og erstattet med 0,25 ml av ovenfor nevnte DNA-inneholdende kalsiumpresipitat og oppbevart ved romtemperatur i 1 time. Derpå ble 2 ml av medium I satt til hver plate, og platene ble inkubert i 2 timer ved 39,5°C i en 5 % C02-inkubator (Kieny et al., supra). Ved denne temperatur kan ikke ts N7-viruset replikere, noe som resulterte i en seleksjon for virus som har rekombinert i det minste i ts7-locuset. Fordi kalsiumfosfat i det lange løp hemmer celle-vekst, ble mediet fjernet etter ovenfor nevnte 2 timers inkubering, og cellene ble vasket tre ganger med 1 ml PBS under forsiktig rotering. Den endelige PBS-oppløsning ble aspirert, og 2 ml av medium I ble satt til hver plate. Inkubering ved 39,5°C i en C02-inkubator ble fortsatt i 2 dager.

Etter 2 dagers-inkuberingen ble kulturplatene med medium og celler plassert ved -^30°C i kort tid og derpå tint, de fremdeles festede celler ble skrapet fra bunnen av platen, og suspensjonen ble behandlet med ultralyd som beskrevet ovenfor. Dette homogenat ble brukt for andre utvelgelses-trinn.

I dette trinn ble medium fra et nesten konfluent bed av 143B TK-celler (ATCC CRL 8303) , som vokser i 8 cm<2>kultur-plater, fjernet og erstattet med 0,2 ml ufortynnet homogenat eller homogenat fortynnet 1:5 eller 1:30 (vol/vol) med PBS. Infeksjon av TK""<c>ellene ble tillatt å fortsette ved romtemperatur i 1 time.

Etter inkuberingen ble 2 ml semifast medium II (Medium I med ikke-essensielle aminosyrer (Gibco, ordrenr. 043-1140) , essensielle vitaminer (Gibco, ordrenr. 042-1120) og 1 % aga-rose), inneholdende 0,1 mg/ml bromdeoksyuridin (BUdR, Sigman Chemical Co.), satt til cellene. Platene ble så inkubert i 16-24 timer ved 37°C i en C02-inkubator. Et andre lag av semifast medium II, inneholdende 0,2 % nøytral-rødt i tillegg til ovenfor nevnte komponenter, ble plassert over cellene, og platene ble inkubert i ytterligere 16-24 timer. Fargeløse plakk opptrådte og var klart synlige, og viruset ble gjenvunnet som individuelle kloner ved å gjennombore plakkområdet med en Pasteur-pipette (plakkrensing). Virus gjenvunnet på denne måte ble dyrket på CV1-celler som beskrevet ovenfor og underkastet en andre og tredje runde av plakkrensing på 143B TK<1->eller. Disse plakkrensede virus ble dyrket og renset som beskrevet ovenfor.

For å undersøke for ekspresjonen av det coccodiale antigen med det rekombinante virus, ble CVl-celler infisert med rekombinant virus sedimentert i en bordsentrifuge (Hettich Mikrorapid K, 100 % i 3 min. ved 20°C) , og pelleten ble vasket tre ganger med PBS, sentrifugert på nytt og resuspendert i PBS. Cellesuspensjonen ble satt inn i en glass-mikroskopplate (Flow) og tillatt å tørke. En andre metode besto i å dyrke CVl-cellene direkte på mikroskopplatene (Miles Lab-Tek 4808), infisere cellene med virus og inkubere i 1-2 dager. Cellene ble så vasket fri for vekstmedium med PBS og tillatt å tørke på platene ved romtemperatur. For å fiksere cellene, ble platene neddykket i aceton i minst 1 time ved +30°C og tillatt å tørke ved romtemperatur .

Museanticoccodialt antigen-monoklonale antistoffer fortynnet i PBS ble lagt på mikroskopplatene, slik at cellene var jevnt dekket med væske. Platene ble plassert i et fuktig kammer ved 3 7°C i 1 time og derpå vasket flere ganger med PBS. Uten å tillate platene å tørke, ble et andre antistoff (FITC-merket geite-antimus-IgG, Nordic), også fortynnet i PBS, lagt på platene, og platene ble plassert i et fuktig kammer ved 37°C i 1 time for å tillate antistoffene å reagere. Etter flere vasker med PBS ble platene tillatt å tørke fullstendig. Et par dråper av 20 % (vol/vol) glyserin i vann ble pipettert på platen, og et dekkglass (Menzel 24 x 60) ble plassert på toppen. Fluorescensen av celleprepa-ratet ble så overvåket under UV-lys i et mikroskop (Zeiss ICM 405, F10 eller Planapo 63-objektiv).

WR-stammeviruset kan formere seg i nesten alle celletyper [Drillen et al., J. Virology 28.: 843 (1978)], og dets formering kan bli observert direkte via dannelsen av plakk. I de fleste tilfeller ble imidlertid kyllingembryofibro-blastceller (CEF) brukt for å danne store lagre av viruset.

For å erholde CEF-celler, ble 11 dager gamle embryoer isolert fra egg, fjernet for sine ekstremiteter, delt opp i små biter og resuspendert i en 0,25 % trypsinoppløsning (Difco) i 2 timer ved romtemperatur. Denne suspensjon ble fortynnet med1volumdel av medium I og filtrert gjennom en cellesikt (Bellco, 150 mesh), og cellene ble sedimentert (Hermie bordsentrifuge, 5 min., 2000 rpm, romtemperatur). Cellepelleten ble resuspendert i en fjerdedel av det opprinnelige volum av medium I og denne CEF-cellesuspensjon inokulert i cellekulturplater. Avhengig av utgangscelle-tettheten ble kulturene tillatt å vokse 1-2 dager og brukt for infeksjon direkte eller etter en til to ytterligere passasjer. En oversikt for etableringen av slike primær-kulturer kan bli funnet i Frehney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss Verlag, New York 1983, kap. 11, s. 99.

For infeksjon ble mediet fjernet fra 80-90 % konfluente CEF-celler som vokste i 175 cm kulturflasker (Falcon 3028), og cellene ble inkubert i en PBS-oppløsning inneholdende virus (0,1 pfu/celle, 0,01 ml/cm<2>) i 1 time ved romtemperatur (20°C) (PBS/Dulbecco, Amimed). Medium I ble så tilsatt (0,2ml/cm<2>, og flaskene ble inkubert ved 37°C i 2-3 dager inntil ca. 80 % av cellene hadde lysert. Den resulterende stamløsning ble lagret direkte med celler og medium i de opprinnelige kulturflasker ved -^30°C før virusrensing.

De følgende rensetrinn ble brukt for å erholde et virus-preparat som var fritt for alle vertscellespesifikke komponenter. Infiserte cellekulturer som var blitt lagret ved h-30°C ble tint, og de gjenværende celler ble fjernet fra overflaten av flasken ved risting eller skraping. Cellene og virus ble sentrifugert ut fra mediet (Sorvall-sentrifu-ge, GSA-rotor, 1 time ved 5000 rpm, 10°C) . Pelleten av celler og viruspartikler ble resuspendert i PBS (10-20 ganger volumet av pelleten) og resentrifugert som ovenfor. Denne pellet ble så resuspendert i et 10 gangers volum av RSB-buffer (10 mM tris-HCl, pH 8,0, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2).

For å lysere de gjenværende intakte celler og frigjøre viruset fra cellemembranene, ble ovenfor nevnte suspensjon underkastet ultralydbehandling (to ganger, 10 sek. ved 60 watt, romtemperatur, Labsonic 1510 med 4 mm sonde). Blandingen ble så sentrifugert i en Sorval GSA-rotor i 3 min. ved 3000 rpm, 10°C. En virussuspensjon fri for cellekjerner og stort cellemateriale ble således dannet. Supernatanten ble forsiktig fjernet, og pelleten ble resuspendert i RSB-buffer, behandlet på nytt med ultralyd og sentrifugert som ovenfor.

Den andre supernatant ble slått sammen med den første, lagt på et 10 ml 35 % sukroselag (Fluka, i 10 mM tris-HCl, pH 8,0) og sentrifugert i 90 min. ved 14.000 rpm i en Kontron TST 28.38/17-rotor (Beckman SW 27-analog) ved 10°C. Supernatanten ble dekantert, og pelleten av viruspartikler ble resuspendert i 10 ml av 10 mM tris-HCl, pH 8,0, behandlet med ultralyd for å homogenisere blandingen (to ganger i 10 sek. ved romtemperatur, som beskrevet ovenfor) og satt på en trinnvis gradient for videre rensing.

Den trinnvise gradient besto av 5 ml porsjoner av sukrose i 10 mM tris-HCl, pH 8,0, med følgende konsentrasjoner: 20 %, 25 %, 30 %, 35 % og 40 %. Denne gradient ble sentrifugert i en Kontron TST 28.38/17-rotor i 35 min. ved 14.000 rpm, 10°C. Flere bånd inneholdende viruspartikler var synlige i 30-40 % sukroseområdet. Dette område av gradienten ble fjernet (10 ml) , sukroseoppløsningen ble fortynnet med PBS (20 ml), og viruspartiklene ble sedimentert (Kontron rotor, 90 min. ved 14.000 rpm, 10°C). Pelleten inneholdt nesten utelukkende viruspartikler (som vurdert ved sammenligning av OD-måling og plakkassay, se nedenfor). Denne pellet ble resuspendert i PBS, slik at viruskonsentrasjonen gjennomsnittlig var 1-5 x IO<9>pfu/ml. Dette viruslager ble brukt enten direkte eller fortynnet med PBS.

For å bestemme viruskonsentrasjonen og renheten av virus-lageret, ble to metoder brukt. Den absolutte konsentrasjon av viruspartikler ble enkelt erholdt ved å måle den optiske tetthet (OD) av lagringsløsningen i et spektrofotometer (Uvikon 860) ved 260 nm (OD/260), hvor 1 OD/260 tilsvarer ca. 1,2 x 10<10>partikler/ml [Joklik, Virology 18:9 (1962)]. Viruskonsentrasjonen ble også erholdt ved å titrere viruset på celler (plakkassay) , idet det ble antatt at kun én av 6 0 viruspartikler kan infisere en celle.

For å titrere viruskonsentrasjonen på dyrkede celler, ble CEF-celler dyrket i medium I på 8 cm<2>plastkulturskåler (Falcon 3001) . Når cellene hadde nådd 80-90 % konfluens, ble mediet fjernet, erstattet med 0,2 ml av en fortynnet virusoppløsning i PBS og oppbevart ved romtemperatur i 1 time. Viruslagringsløsningen ble fortynnet i 10 gangers trinn. Etter romtemperaturinkuberingen ble 2 ml semifast medium I (medium I + 1 % agarose) satt til hver plate, og platene ble plassert i 16-24 timer i en C02-inkubator. Derpå ble 2 ml semifast medium I inneholdende 0,2 % nøytral-rødt (Fluka 72210) lagt på for å farge de levende celler, og platene ble inkubert i ytterligere 16-24 timer. De fargelø-

se plakk ble så opptelt under et mikroskop.

7.2.2 Kyllingimmunisering

For å bestemme hvorvidt vacciniavirale vektorer inneholdende gener som koder for E. tenella-<p>roteinene, som spesifikt binder til monoklonale antistoffer 8A2 og 6A5, kunne beskytte kyllinger mot tilførsel av sporulerte oocyster av en patogen stamme av E. tenella (stamme T2-750/7, T7-776/1 eller T6-771), ble de følgende forsøk utført.

Alle forsøk ble utført ved å bruke hanekyllinger av en vanlig stamme (Warren) fremskaffet ved klekkeriet E. Wutrich, Belp, Sveits. Daggamle kyllinger ble alet i oppvarmede massebur inntil den angitte alder, hvorpå de ble oppdelt i forskjellige forsøksgrupper og holdt coccodiose-frie i bur med wiregulv. Gjennom forsøkene ble det gitt en kommersiell broilervekstdiett basert på mais-, hvete- og soyamel (grovprotein 21,7

I første forsøk ble på dag 42 kyllinger med lik vekt tilfeldig oppdelt i tre grupper med seks fugler i hver. Tre dager senere ble kyllingene immunisert med enten rekombinant eller villtype vacciniavirus ved hjelp av to injeksjoner på 50 iil hver av de respektive virussuspensjoner (10<10>pfu/ml i PBS) gitt subkutant i høyre vingehud. To rekombinante vacciniavirus ble brukt, hvorav begge inneholdt DNA som koder for E. tenella-proteinet som spesifikt binder til antistoff 8A2. Et av virusene (betegnet 37K M3) inneholdt ledersekvensen av det 190 kD malariale antigen, det andre virus (betegnet 37K K3) manglet denne ledersekvens. Villtype vacciniastamme WR virket som en negativ kontroll.

En uke etter første injeksjon ble en forsterkningsinjeksjon foretatt i venstre vingehud til kyllingene under identiske betingelser ved å bruke samme type vacciniavirus som tidligere. En uke etter forsterkningen (dag 59) ble blod- prøver på 2 ml hver tatt fra alle kyllingene, og serumet ble undersøkt for tilstedeværelse av spesifikke antistoffer med ELISA. Kort fortalt ble brønnene av en mikrotiterplate (NUNC Immunoplate F96) belagt med en suspensjon av sporozoitter fra E. tenella (10.000 celler/ml) og inkubert med kyllingserumet ved økende fortynningsgrader. Som påvis-ningsmidler ble geite-antikylling-immunoglobuliner konjugert med pepperrotperoksydase (Kirkegaard og Perry Laboratory, Gaithersburg, USA) brukt sammen med tetrametylbenzi-din som substrat. Den utviklede blåfarge ble avlest i en Titertek Multiscan MCC/340 Mkll ved en bølgelengde på 450 nm. Titeren ble definert som den resiproke verdi av denne serumfortynning som ga en optisk tetthet på minst det doble av bakgrunnsverdien (tabell 7) .

Fire uker etter første injeksjon (dag 73) ble kyllingene tilført 50.000 av de sporulerte oocyster. Inokulumet av coccodial, som var suspendert i 1 ml fysiologisk saltvann, ble tilført oralt i kråsen av kyllingene ved hjelp av en buttendet kalibrert sprøyte. På dag 80 ble alle kyllingene avlivet, obdusert og opptelt for store lesjoner i ceca (måltall 0 = normal, 1 = lett infeksjon, 2 = medium infeksjon, 3 = alvorlige lesjoner, 4 = kylling død fra coccidiose). Avføringen ble samlet opp kvantitativt over de siste 2 dager av infeksjonssyklusen, og antallet utskilte oocyster ble bestemt i en representativ prøve av feces. Resultatene er vist i tabell 7.

Tabell 7 viser at sammenlignet med villtypekontrollviruset induserte begge virus inneholdende DNA som koder for 28 kD-proteindannelsen av antistoffer som var spesifikke for parasitten og ga en viss beskyttelse mot oocysttilførsel, både i form av en reduksjon av cekale lesjonstall og redusert oocystekskresjon. Med hensyn til beskyttelse mot coccodiose var de to virus like effektive, men konstruksjonen med den malariale leder (37 M3) ga en høyere anti-stof ftiter mot sporozoittantigenet enn standardviruskonstr-uksjonen (37 K3) i kyllingen, noe som indikerer en fordel for fusjonskonstruksjonen.

I det andre forsøk ble hanekyllinger alet og immunisert som beskrevet ovenfor, men ved oppstarting på dag 22. En viral dose på 2 x IO<8>pfu i 100 ml PBS ble tilført på dette tidspunkt. De anvendte virus var fra forskjellige preparater av vacciniavirus inneholdende DNA som koder for 2 8 kD-proteinet uten (betegnet 37 K5) eller med (betegnet 37 M19) den malariale ledersekvens. Den samme vi11typestamme WR-virus ble brukt som en kontroll. Forsterkningsinjeksjoner i høyre vingehud ved samme doser ble gitt enten 1 eller 2 uker etter første injeksjon.

På dag 57 (5 uker etter første injeksjon) ble alle kyllingene tilført 50.000 av de sporulerte oocyster. En uke senere ble kyllingene avlivet, obdusert og opptelt som beskrevet ovenfor. Daglig vektøkning etter infeksjon og oocystekskresjon under de siste 2 dager ble også bestemt. Resultatene er vist i tabell 8.

Tabell 8 viser at sammenlignet med villtypekontrollviruset ga begge virus inneholdende det coccodiale DNA en viss beskyttelse mot den patogene oocysttilførsel i forhold til vektøkning, cekale lesjonstall og oocystekskresjon. Begge virus var omtrent like effektive. Tilførsel av forsterkning 1 uke etter primærinjeksjonen ga noe bedre vektøkning og lavere oocystekskresjon, men cekale lesjonstall var ca. de samme for begge forsterkningstabeller.

I det tredje forsøk ble effekten av tre vaksinasjoner undersøkt. Kyllinger ble injisert (høyre vingehud) med to 50 til porsjoner (3 x IO<9>pfu/ml) av suspensjoner av villtype vacciniavirus eller virus inneholdende DNA som koder for 20 kD-proteinet, som binder spesifikt til monoklonalt antistoff 6A5 ved 21 dagers alder. Alle kyllinger ble gitt samme dose f orsterkningsinj eks joner ved dag 28 i venstre vingehud. Enkelte kyllinger ble gitt ytterligere forsterk-ningsinj eks j oner med samme dose i vingehuden på begge sider ved dag 35. Andre kyllinger ble holdt uten vaksineringer som ytterligere kontroller.

På dag 42 ble blodprøver tatt fra alle kyllingene og under-søkt med ELISA for tilstedeværelse av spesifikke antistoffer mot sporozoittrinnet av parasitten som tidligere beskrevet. På dag 49 (4 uker etter første injeksjon) ble alle kyllingene tilført 50.000 av de sporulerte oocyster. En uke senere ble kyllingene avlivet, obdusert og opptelt for store cekale lesjoner som beskrevet ovenfor. Kroppsvekt ble målt ukentlig for å regne ut daglig vektøkning, og avføringen ble samlet opp over de siste 2 dager av infeksjonssyklusen for å bestemme oocystekskresjon. Resultatene er vist i tabell 9.

Dataene i tabell 9 viser at når det injiseres tre ganger, ga viruset som danner det coccodiale antigen en høy titer av antistoffer som var spesifikke mot sporozoittproteiner. Videre ga begge behandlinger med denne type rekombinant virus en viss beskyttelse mot oocystinfeksjon som forbedret vektøkning, reduserte cekale lesjonstall og senket oocystekskresjon. Sammenligning med resultatene erholdt med uvaksinerte kontroller viser at vaksinering med villtype vacciniavirus ikke ga beskyttelse. Følgelig var beskyttelsen gitt med viruset som inneholdt det coccodiale DNA spesifikt, og ikke grunnet en generell immunstimulering forårsaket av eksponering til vacciniaviruset i seg selv. Tre vaksineringer var mer effektive enn to.

Mange modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse kan bli foretatt uten å fravike fra dens ånd og bredde, noe som vil være tydelig for fagmannen. De spesifikke utførelsesf ormer beskrevet heri er gitt kun som eksempler, og oppfinnelsen begrenses kun i betraktning av de medfølgende krav.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et protein med en eller flere immunoreaktive og/eller antigene determinanter fra et Eimeria-overflateantigen med aminosyresekvens som vist i figurene 15, 17, 19 eller 21, eller en funksjonell ekvivalent derav med tilsvarende biologisk aktivitet,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (a) å dyrke en transformert mikroorganisme inneholdende en rekombinant vektor omfattende en DNA-sekvens som koder for nevnte proteiner i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser under forhold hvor DNA-sekvensen blir uttrykt, og (b) isolere proteinet fra kulturen.

2. Antistoff, karakterisert vedat det er rettet mot et protein som angitt i krav 1, hvor antistoffet fortrinnsvis er et monoklonalt antistoff.

3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 2,karakterisert vedat det produseres av hybridomer valgt fra gruppen omfattende ATCC nr. HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 og HB 9712.