DK173779B1 - Schistosomprotein, DNA-fragment kodende for proteinet, ekspressionsenhed og viral vektor indeholdende DNA-fragmentet, celle transformeret med ekspressionsenheden, farmaceutisk præparat indeholdende proteinet eller vektoren, anvendelse af proteinet - Google Patents

Description

DK 173779 B1

Den foreliggende opfindelse angår et schistosomprotein, et DNA-frag-ment kodende for proteinet, en ekspressionsenhed og en viral vektor indeholdende DNA-fragmentet, en celle transformeret med ekspressionsenheden, et farmaceutisk præparat indeholdende proteinet eller vek-5 toren, anvendelse af proteinet eller cellen, en fremgangsmåde til fremstilling af proteinet samt en fremgangsmåde til mikrobiologisk omdannelse.

Schistosomose {eller bilharziose) er en parasitsygdom, der forekommer i tropiske og subtropiske områder i hele verden {undtagen Nordameri-10 ka); den findes endog i Nordafrika; der er også en betydelig forekomst i Ægypten, og nogle tilfælde er beskrevet i Spanien og Portugal .

Denne sygdom har ramt 200-400 millioner mennesker. Den ansvarlige parasit, schistosomen, er en lille fladorm, hvis komplicerede livs-15 cyklus går gennem en midlertidig vært, som er en ferskvandsmollusk.

Af denne grund udbredes sygdommen i takt med, at der bygges dæmninger og kunstvandingsreservoirer beregnet til udnyttelse af de tropiske egne.

Der kendes 5 typer schistosomer, der er patogene for mennesker: den 20 mest udbredte, S. mansoni, er almindelig i Afrika og Amerika; 2 arter, S. haematobium og intercalation, findes kun i Afrika og 2 andre, S. japonicum og mekongi, i Asien.

Kendskab til parasittens livscyklus er nødvendig til udarbejdelse af en strategi til forebyggelse af sygdommen.

25 Parasitten udviser nemlig en næsten perfekt tilpasning til værtens naturlige forsvar: når den når voksenstadiet, undgår den fuldstændig immunmekanismerne og kan leve i 5-20 år i blodkarrene tæt på tarmvæggen eller blæren, afhængigt af arten (henholdsvis S. mansoni og S. haematobium). Parasitten formerer sig ikke i mennesker, men hunnen 30 lægger op til 3.000 æg om dagen. Disse æg og affald fra ormens metabolisme findes i værtens kredsløb og fremkalder forskellige lidelser (tarm- og urinvejslidelser, mathed, anæmi, dannelse af granulomer med 2 DK 173779 B1 blokering af de kapillære blodkar, hvilket medfører vævsfibroser og især alvorlige leverinflammationer).

Æggene, som er forsynet med en spore, kan gennemtrænge tarm- eller blærevæggen, hvor de fremkalder mikrolæsioner, hvorefter de elimine-5 res. Hvis de hurtigt når i kontakt med vand, frigør de fimrelarver (miradicium), som svømmer, indtil de trænger ind i en mollusk. I denne midlertidige vært gennemgår larven kønsløse formeringscykler, der giver anledning til haleikter, som frigives i vandet. (En mollusk, der er inficeret med en enkelt miradicium, kan producere mere 10 end 50.000 haleikter under et livsforløb på 8-10 måneder).

En haleikte er en svømmende larve, som kun lever i 1-2 dage. Når den møder et pattedyr, især et menneske, trænger den gennem dets hud. I huden omdannes den til schistosomul, der er den umodne form af parasitten, og som successivt bliver ført ind i blodkredsløbet mod hjer-15 tet, lungerne og endelig leveren. Det er i leverkredsløbet, at parasitten bliver voksen. Hannen og hunnen parrer sig; hunnen anbringer sig i en kanal, der er dannet ved sammenfoldning af hannens krop, og parret slår sig endelig ned i et abdominalt blodkar, hvor hunnen begynder at lægge æg.

20 Den fuldstændige modning af schistosomulen til voksen orm tager ca.

14 dage. X voksenstadiet har parasitten til sin overflade adsorberet molekyler fra sin vært, og takket være denne camouflage undviger den værtens genkendelses- og immunforsvarsmekanismer. Desuden udskiller parasitten stoffer, som har en immunundertrykkende virkning. Hvert 25 schistosompar, der er beskyttet på denne måde, kan leve i deres vært i flere år og lægge tusindvis af æg hver dag.

Der findes et virksomt lægemiddel mod den voksne parasit, Praziquan-tel, men det er for dyrt til, at man kan forudse almindelig anvendelse deraf i udviklingslandene. Desuden forhindrer det ikke reinfek-30 tion, idet befolkningen i endemiske områder er i regelmæssig kontakt med vand, der er kontamineret med larverne.

Det eneste reelle håb om forebyggelse af sygdommen kan kun være at fremstille en virksom vaccine mod den umodne form af parasitten.

3 DK 173779 B1 schistosomul. Denne vaccine skal administreres til småbørn for at undgå primær infektion og til personer, der allerede er kontamineret, efter behandling med Praziquantel for at forebygge reinfektion.

Denne vaccine skal indeholde ét eller flere schistosomul-hovedantige-5 ner og inducere en immunreaktion, der er virksom mod larven, før den undviger værtens forsvarsmekanismer.

Nylige værker (se oversigt af Capron og Dessaint, 1985) har gjort det muligt at identificere et begrænset antal proteinantigener, der er til stede på overfladen af parasitten og dens larve, og som muligvis 10 spiller en betydelig rolle ved induktionen af et immunrespons.

Ét af disse antigener er påvist af Balloul et al. (1985): efter immunisering af rotter med geloprensede ekstrakter af S. mansoni genkender de inducerede antistoffer et antigen på 28 kd, betegnet p28, som er til stede i parasittens voksen- og larveformer. De samme an-15 tistoffer genkender et in vi tro-translationsprodukt fra mRNA'er ekstraheret fra den voksne parasit og ét af de eksterne schistosomulpro-teiner, identificeret ved mærkning med 125I.

Selv om disse anti-p28-antistoffer ikke i sig selv kan neutralisere schistosomulen, aktiverer de det cytotoxiske cellerespons, som kan 20 dræbe schistosomulerne.

En prøve af det oprensede p28-protein blev inokuleret i rotter og mus; de immuniserede dyr udviklede en høj grad af beskyttelse mod en forsøgsinfektion med schistosomuler (Balloul et al., 1986).

Denne række iagttagelser påviser betydningen af p28-antigenet ved 25 induktionen af et beskyttende immunrespons.

Den foreliggende opfindelse bygger på identifikation og bestemmelse af den cDNA-sekvens, der koder for p28-antigenet eller i det mindste for et polypeptid, som omfatter epitoperne af p28, hvilke epitoper genkendes af antistoffer mod det native p28-protein.

4 DK 173779 B1

Den foreliggende opfindelse angår således et protein, som har en glutathion-S-transferase-aktivitet og en aminosyresekvens i det væsentlige som vist på figur 1 og et protein, som har en glutathion- S-transferase-aktivitet og en molekylvægt på omkring 28 Kd, og som 5 kan opnås fra Schistosoma mansoni. Endvidere angår opfindelsen et protein, som omfatter epitoperne af disse proteiner, og som genkendes af antistoffer rejst mod disse proteiner.

Endvidere angår opfindelsen et DNA-fragment, som koder for et protein ifølge opfindelsen, en ekspressionsenhed beregnet for produktion af 10 et protein ifølge opfindelsen, som omfatter et DNA-fragment kodende for et protein ifølge opfindelsen placeret under kontrol af passende elementer beregnet på at sikre ekspressionen af DNA-fragmentet.

Den foreliggende opfindelse angår således et protein, hvis syntese er styret af dette cDNA, og hvilken syntese kan udføres i forskellige 15 værtsceller, bakterier, gærstammer eller celler fra højerestående dyr som en funktion af den vektor, i hvilken cDNA'et er indsat, og de ekspressionskontrolsignaler, under hvilke det er anbragt.

Proteinet ifølge opfindelsen kan have en primær struktur, der er identisk med strukturen af det native p28-protein, som er til stede i 20 schistosomulen, men det kan også være et derivat deraf eller et ufuldstændigt p28-protein, der dog omfatter de epitoper, som er vigtige for genkendelsen af antistoffer og således for induktionen af immunitet. Dette protein eller det ufuldstændige protein kan endvidere fusioneres med et andet protein (eller proteinfragment) efter en 25 genetisk manipulation af de tilsvarende DNA-segmenter, hvilken manipulation skal fremme en bedre ekspression af proteinet i værtscellen eller eventuelt fremkalde udskillelse deraf uden for cellen.

De teknologier, der muliggør kloning og ekspression af et fremmed gen i forskellige værtsceller, er kendte for fagfolk. De er belyst i 30 nedenstående eksempler, idet det er klart, at der kan benyttes andre vektorer og andre værtsceller.

Ekspressionen af det gen, der svarer til p28, i en bakterie, i det foreliggende tilfælde E. coli, blev opnået med en vektor omfatten- 5 DK 173779 B1 de λPL-promotoren og Cllrbs som ribosombindingssted. Det vundne hybridprotein omfatter en del af CII-proteinet og p28-proteinet eller en del deraf.

I det tilfælde, hvor værten er en gærstamme, fx S. cerevisiae, er det 5 muligt at anvende en gærplasmidvektor, der omfatter et funktionelt replikationsinitieringssted i gær, fx replikationsinitieringsstedet fra plasmidet 2μ, og et selektionsgen såsom URA3. I det foreliggende tilfælde er den anvendte promotor PGK-genpromotoren med 5'-delen af PGK-genet, hvilket enten fører til et fusioneret protein eller til et 10 modent protein.

Når værten er en pattedyrcelle, anvendes der fortrinsvis som ekspressionsvektor et poxvirus, fx vacciniavirus, i hvilket det gen, der koder for proteinet, er anbragt under kontrol af en ekspressionssekvens af dette gen ved hjælp af poxvirus. Dette rekombinante virus omfatter 15 det gen, der koder for et protein ifølge opfindelsen, fortrinsvis indsat i TK-genet fra vaccinia og under kontrol af en kraftig promotor såsom 7,5 K-proteinpromotoren fra vaccinia. Det gen, der koder for et protein ifølge opfindelsen, kan også være fusioneret med et område, som koder for en funktionel signalsekvens, fx signalsekvensen 20 for interleukin-2 eller rabiesglycoproteinet, for at sørge for udskillelse af proteinet uden for cellen; i dette tilfælde er det tilsvarende protein et hybridprotein, der omfatter en proteindel, som ikke stammer fra schistosomuler.

Det gen, der koder for et protein ifølge opfindelsen, kan ligeledes 25 være fusioneret med et område, som koder for transmembranzonen fra rabiesvirusglycoproteinet, for at sikre proteinets forankring i de inficerede cellers cytoplasmatiske membran.

Opfindelsen angår også værtsceller, der er transformeret med proteinekspressionsvektorerne ifølge opfindelsen, samt en fremgangsmåde til 30 fremstilling af sådanne proteiner, ved hvilken disse værtsceller dyrkes, og proteinerne ifølge opfindelsen isoleres.

Naturligvis afhænger metoderne til dyrkning, isolering og separation af proteinerne af værten, men de er kendte for fagfolk.

6 DK 173779 B1

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en viral vektor beregnet til fremstilling af et protein ifølge opfindelsen, hvilken vektor i sit genom har indsat et DNA-fragment kodende for et protein ifølge opfindelsen Tinder kontrol af passende ekspressionselementer.

5 Den foreliggende opfindelse angår endelig farmaceutiske præparater, der er nyttige som vacciner mod schistosomose, hvilke præparater i det mindste omfatter et protein eller et poxvirus ifølge opfindelsen i en farmaceutisk acceptabel bærer.

Den foreliggende opfindelse angår især levende vacciner, der omfatter 10 levende rekombinante vacciniavira, som udtrykker proteinet ifølge opfindelsen, hvilke vacciner er til stede i en farmaceutisk acceptabel bærer.

Disse vacciner er fortrinsvis i en form, der fx kan administreres ved injektion. Den farmaceutisk acceptable bærer kan være en vandig bærer 15 til injektion.

Vaccinationsprocessen skal være tilpasset til den type vaccine, der benyttes (protein eller levende virus).

Endelig muliggør den foreliggende opfindelse tilvejebringelse af antisera mod et protein ifølge opfindelsen.

20 Den foreliggende opfindelse muliggør desuden påvisning af en enzymatisk glutathion-S-transferaseaktivitet i det rekombinante p28-protein (eller p28I).

Glutathion-S-transferaser er særdeles vidt udbredte enzymer, som både er til stede i planter og i dyr, og som spiller en rolle ved afgift-25 ningen af forskellige molekyler (hydrofobe elektrofile forbindelser, endogene superoxider, alkyleringsmidler, herbicider, etc.).

En artikel af Smith et al. (1986) viser, at parasitten Schistosoma japonicum syntetiserer en glutathion-S-transferase, som kan spille en 7 DK 173779 B1 rolle ved beskyttelsen af parasitten mod de frie radikaler, der dannes af de celler, som bevirker immunitet hos den inficerede vart.

Den foreliggende opfindelse angår mere specifikt påvisning af en glutathion-s-transferaseaktivitet hos proteinet p28I, der stammer 5 fra Schistosoma mansoni og er syntetiseret i E. coli eller S. cerevi-siae, og hvis betydning som vaccineantigen er påvist ovenfor.

Mere specifikt angår den foreliggende opfindelse anvendelse af en celle eller af et protein som beskrevet ovenfor som middel, der har en glutathion-S-transferaseaktivitet, såsom p28-proteinet.

10 Den foreliggende opfindelse angår også anvendelse af celler, der er transformeret eller inficeret med en ekspressionsblok for det ovenfor beskrevne protein, som middel, der har en glutathion-S-transferase-aktivitet.

Disse proteiner og disse celler kan anvendes som omdannelsesmiddel 15 ved en mikrobiologisk omdannelsesproces under anvendelse af en gluta-thion-S-transferaseaktivitet.

Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til mikrobiologisk omdannelse under anvendelse af glutathion-S-transferaseaktivitet, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der som middel til omdannelse 20 benyttes et protein ifølge opfindelsen eller en celle ifølge opfindelsen .

Den foreliggende opfindelse muliggør identifikation og bestemmelse af den cDNA-sekvens, som koder for et andet p28-protein, der genkendes af antistoffer mod det native p28-protein.

25 Den foreliggende opfindelse angår en DNA-sekvens, som koder for det modne p28ll-protein som beskrevet i fig. 15.

Den foreliggende opfindelse angår også et protein, hvis syntese er styret af dette cDNA eller en del af dette cDNA, hvilket protein genkendes af antistoffer mod det native p28-protein.

B

DK 173779 B1

Den foreliggende opfindelse angår også celler, hvori det cDNA, der koder for det modne p28Il-protein eller et fragment deraf som beskrevet ovenfor, er inkorporeret.

Selv om proteinet i nedenstående eksempler kun udtrykkes i en bak-5 terie, B. coli, kan dets syntese også udføres i andre værtsceller, bakterier, gærstammer eller celler fra højerestående dyr som funktion af den vektor, i hvilken cDNA'et er indsat, hvilket er beskrevet ovenfor.

Ekspressionen af det gen, der svarer til p28II, blev opnået med den 10 ovenfor beskrevne vektor, som omfatter XP^-promotoren og ribosombindingsstedet , cllrbs.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes fremstilling af disse proteiner ved dyrkning af de ovenfor beskrevne celler.

Endelig angår opfindelsen et farmaceutisk præparat til behandling 15 eller forebyggelse af schistosomose, hvilket præparat som aktiv bestanddel i det mindste indeholder ét protein som beskrevet ovenfor.

Hvis cDNA'et er inkorporeret i et poxvirus såsom vaccinia, kan dette poxvirus selvfølgelig i visse tilfælde anvendes direkte som vaccinemiddel .

20 Det er også muligt at fremstille antistoffer mod disse proteiner.

Disse antistoffer og disse proteiner kan anvendes som middel til diagnose af schistosomose.

I nærværende beskrivelse er de nukleotidsekvenser af gener eller aminosyrer af proteiner, som er vist i figurerne, ikke gentaget, men 25 udgør en integreret del af opfindelsen og af nærværende beskrivelse.

Nedenstående eksempler tjener til påvisning af andre træk og fordele ved den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser den komplette cDNA-sekvens afledt af sekvenserne 9 DK 173779 B1 af XTG06, XTG08, XTG09, XTGlO og XTGll. Den åbne læseramme, som begynder ved den 7. nukleotid, koder for et polypeptid på 211 aminosyrer og med en molekylvægt på 28 kd.

Pig. 2 viser konstruktionen af pTG44 ved integration af en EcoRI-5 indsætning fra XTG06 i pTGl924. pTG1924 er et derivat af PTG908 med et EcoRI-sted i fase, anbragt 46 bp nedstroms for CII-initieringskodonen. pTG44 koder for et fusioneret cll/p28-protein med en molekylvægt på 25 kd.

Fig. 3 viser sekvensen af fusionsproteinet cll/p28, der indkodes 10 af den i pTG44 indsatte ekspressionsblok.

Pig. 4 viser totalekstrakter og uopløselige fraktioner af ekstrakter af E. coli TGE901 pTG44 efter elektroforese på SDS-acrylamidgel og farvning med Coomassie-blåt. Pilen viser positionen af proteinet på 25 kd.

15 A. totalekstrakt af TGE901 pTG44 ved 30 °C

B. uopløselig fraktion af samme ekstrakt

C. totalekstrakt af TGE901 pTG44 efter induktion i 7 timer ved 37°C

D. uopløselig fraktion af samme ekstrakt 20 E. totalekstrakt af TGE901 pTG44 efter induktion i 7

timer ved 42°C

F. uopløselig fraktion af samme ekstrakt

G. fraktion F. solubiliseret i 0,2% SDS

H. totalekstrakt af kontrolkultur af TGE901 pTG1924 efter

25 7 timer ved 42°C

I. uopløselig fraktion af samme ekstrakt.

Fig. 5 viser ekstrakter af S. cerevisiae TGYlsp4, der producerer p28-proteinet, som indkodes af konstruktionerne pTG1885 og PTG1886, efter elektroforese på SDS-acrylamidgel og farv-30 ning med Coomassie-blåt.

A. ekstrakt af TGYlsp4/pTG1885 (ikke-fusioneret protein på 28 kd) B. ekstrakt af kontrolkultur TGYlsp4 C. ekstrakt af TGYlsp4/pTG1886 (fusioneret protein på 35 30 kd).

Fig. 6 viser ekstrakter af E, coli og S. cerevisiae, der producerer et fusioneret eller modent protein på 28 kd, analyseret ved "Western blot" med kaninantistoffer, der er specifikke 10 DK 173779 B1 over for nativt p28. De fikserede antistoffer genkendes af anti-kaninantistoffer mærket med biotin, og dette complex visualiseres derefter ved hjælp af et streptavidin-peroxi-dase-reagens og farvning med HRP (BioRad).

5 A. totalekstrakt af E. coli TGE901 pTG44 B. uopløselig fraktion af samme ekstrakt C. totalekstrakt af S. cerevisiae TGYlsp4/pTG1885, der producerer det modne protein D. totalekstrakt af S. cerevisiae, der producerer det 10 modne protein fusioneret til de første 22 aminosyrer af PGK, TGYlsp4/pTG1886 E. ekstrakt af S. cerevisiae, negativ kontrol F. G. samme ekstrakter som C og D, 2 gange mindre koncentre ret.

15 Fig. 7 viser anbringelse i fase af EcoRI-stedet ved styret mutage-nese i det cDNA-område, der svarer til de 9 første aminosyrer af humant interleukin-2.

Fig. 8 viser konstruktionen af pTG45 og pTG46 ved indsætning af EcoRI-fragmenter fra XTG06 og XTG09 i EcoRI-stedet på 20 pTG188-I (se konstruktionen i fig. 7).

Fig. 9 viser strukturen af fusionsproteinet lL2/p28, der indkodes af pTG45. Bemærk tilstedeværelsen af et signalpeptid, som muliggør udskillelse af et protein på 24 kd, der omfatter størstedelen af p28.

25 Fig. 10 viser strukturen af fusionsproteinet IL2/p28, der indkodes af pTG46. Signalpeptidet muliggør udskillelse af et protein på 16 kd, der indeholder den centrale del af p28-antigenet.

Fig. 11 viser indsætning i et plasmid, der bærer TK-vacciniagenet, af det gen, som koder for IL2/p28, anbragt under kontrol af 30 7,5 K-vacciniapromotoren. Indsætning af denne ekspressions blok i virusgenomet ved dobbelt rekombination mellem TK-sekvenseme.

Fig. 12 viser detektion af proteiner udskilt i dyrkningsmediet for BHK2l-celler inficeret med de rekombinante vira 35 W.TG.p28Sm-l og W.TG.p28Sm-2 ved hjælp af kanin- eller rotteantistoffer, som er specifikke for nativt p28.

A og D supernatant fra W.TG.p28Sm-l B og E supernatant fra W.TG.p28Sm-2 11 DK 173779 B1

C og P supernatant fra kultur inficeret med vildtype-W

A, B,C detektion ved hjalp af kaninantistoffer D, E,F detektion ved hjælp af rotteantistoffer Numrene svarer til uafhængige isoleringer.

5 Fig. 13 viser detektion af anti-p28-antistoffer ved en "Western blot"-test med det native p28-protein i sera fra rotter immuniseret med cll/p28-proteinet syntetiseret af E. coli.

NRS: serum fra kontrolrotte, ikke inokuleret ,-SR28-20,J8, Jll, J16, J23: serum fra rotter indsamlet 8, 10 11, 16 og 23 dage efter inokulation af cll/p28-proteinet; SR28: serum fra rotte inokuleret med det native p28-prote-in.

Fig. 14 viser den biologiske aktivitet af de samme sera som i fig.

13, målt ved en test for eosinofilafhængig cytotoxicitet 15 over for schistosomuler (se tabel I, Il og III).

SR28-20 betegner antiserum mod et klonet fragment på 20 kd svarende til antigenet på 28 kd fra S. mansoni isoleret på forskellige tidspunkter efter den anden injektion; SR28 betegner antiserum mod nativt p28 isoleret 14 dage 20 efter den anden injektion.

Fig. 15 viser følgende kurver: - GT fra rottelever (9 /xg, 6 μg) - råekstrakter af E. coli, kontrol (o) og TGE90l/pTG54 (o) - råekstrakter af S. cerevisiae, kontrol { ), transformeret 25 med en plasmidvektor (Δ) og TGY2spl3b/pTG2800 (+).

Fig. 16a og 16b viser cDNA-sekvensen af p28II-proteinet samt den tilsvarende proteinsekvens efter de 3 læserammer.

Fig. 17 viser en elektroforese på acrylamidgel af ekstrakter af E. coli efter farvning med Coomassie-blåt: 30 A, C og F totalekstrakt B, D og E uopløselig fraktion af samme ekstrakter A, B, C, D E. coli TGE90l/pTG56 E, F E. coli TGE901/pTG908 (kontrolvektor) G molekylvægtmarkører DK 173779 B1 EKSEMPEL 1 12

Identifikation og kloning af cDNA, der koder for et p28-protein

Den valgte strategi til kloning af det gen, der koder for et p28-an-tigen, hvis sekvens ikke er kendt, var at identificere ekspressions-5 produkterne i E. coli fra en schistosom-cDNA-bank ved hjælp af poly-klonale antistoffer, der var specifikt rettet mod p28. Disse antistoffer blev induceret ved immunisering af kaniner og rotter med ekstrakter af den voksne parasit S. mansoni og fraktioneret på en gel.

10 Fremstilling af cDNA-bank

Ud fra RNA ekstraheret fra voksne schistosomer syntetiseres en komplementær DNA-streng ved påvirkning med omvendt MLV-transkriptase.

DNA'et, der er gjort dobbeltstrenget ved påvirkning med Klenow-fragmentet fra coli-polymerase, behandles derpå med Sl-nuklease for at 15 gøre enderne stumpe. De fragmenter, der svarer til den ønskede størrelse, selekteres på saccharosegradient, dvs. fragmenter mellem 500 og 4000 bp. Der tilføjes en hale af dG-rester til disse fragmenter, og de indsættes i EcoRI-stedet på derivatet af fagen λ gt 10 (Huynh, 1984) ved hjælp af en syntetisk adaptor, 5'-AATTCCCCCCCCCCC-3' (Le 20 Bouc et al., 1986).

Efter ligation pakkes de rekombinante fager in vitro. En således dannet bank på 2xl06 fager amplificeres derefter ved inokulation i E. coli POP 101 (Lathe, 1977).

Efter amplifikation koncentreres fagerne med PEG og oprenses ved to 25 centrifugeringer i CsCl-gradient, og deres DNA ekstraheres. CDNA-indsætningerne isoleres ved spaltning med EcoRI og oprenses på saccharosegradient. Fraktionerne på 500-2000 bp indsættes derefter i en ekspressionsvektor, et derivat af fagen λ gt 11, som muliggør ekspression af fremmede gener under kontrol af lac-promotoren efter fusion 30 af cDNA'et med genet for )3-galactosidase fra E. coli (Young og Davis, 1983) .

13 DK 173779 B1

Screening af banken og selektion af kandidater

En prøve af denne bank over λ gt 11 inokuleres på E. coli-stammen Y1090 (Young og Davis, 1983) i en fortynding, der repræsenterer lxlO5 fager pr. skål med en diameter på 90 mm.

5 Induktion af ekspressionen af proteinet under kontrol af lac-promoto-ren udløses ved 42eC i nærværelse af isopropyl-β-D-thiogalactopyrano-sid.

De syntetiserede proteiner adsorberes på nitrocellulosefiltre og inkuberes i nærværelse af et kaninantistof, der er specifikt over for 10 p28. De fikserede antistoffer genkendes af et andet anti-kaninanti stof mærket med biotin; dette complex visualiseres dernæst ved en reaktion med streptavidin-peroxidase efterfulgt af farvning med HRP (BioRad).

Denne detektion ved hjælp af antistoffer gør det muligt at identifi-15 cere de rekombinante fager, i hvilke cDNA-indsætningen styrer syntesen af et protein eller en proteinfraktion, der bærer epitoper, som genkendes af de specifikke anti-p28-antistoffer.

En første selektion fører til 3 uafhængige isolater, XTG06, XTG08 og XTG09, som indeholder cDNA-indsætninger på henholdsvis 650, 700 og 20 350 basepar.

Nukleotidsekvenserne af de indsætninger, som bærer af disse kandidater, overlapper hinanden og omfatter et område, som kunne svare til det C-terminale område af et hypotetisk protein med en molekylvægt på 28 kd. Et syntetisk nukleotid, 5'-GGAATAGTTGGTTTGATT-3', som er mær-25 ket med 32P og er komplementært med 5'-enden af det område, som koder for XTG06-indsætningen, blev syntetiseret og anvendt til udførelse af endnu en screening af cDNA-banken i X gt 10.

På denne måde kunne der isoleres to nye kandidater, XTG10 og XTGll, som begge indeholder en komplet nukleotidsekvens, der koder for et 30 protein på 211 aminosyrer svarende til en molekylvægt på 28 kd.

14 DK 173779 B1

Bestemmelse af den cDNA-sekvens, der bares af de rekombinante fager, og det tilsvarende protein

Den komplette cDNA-sekvens (bekræftet ved bestemmelse af sekvensen af de forskellige kandidater) og den primære aminosyrestruktur, som kan 5 udledes deraf, er vist i fig. 1.

Dette resultat og de for tiden offentliggjorte artikler giver ingen information om den N-terminale sekvens af det første translationsprodukt fra det native gen og ej heller om den eventuelle eksistens af en precursor og et signalpeptid før det modne protein.

10 Den nøjagtige placering af den første aminosyre er imidlertid ikke essentiel inden for opfindelsens rammer, for den strategi, der er anvendt til isolering af dette gen og til ekspression deraf, omfatter søgning efter hovedepitoper, som er til stede i p28, og som genkendes af værtens immunsystem.

15 Dette argument benyttes i nedenstående eksempler, der beskriver ekspressionen af vigtige epitoper i forskellige organismer.

Ekspression af p28-antigenet

Den generelle strategi, der er udvilket til ekspression af antigen-epitoper, som er til stede i p28, var at fusionere det klonede cDNA-20 fragment i korrekt læseramme med en nukleotidsekvens, som koder for det N-terminale område af et protein, der udtrykkes effektivt og er godt karakteriseret. Det således vundne hybridprotein genkendes generelt af antistoffer mod det native modne p28, og man kan håbe på, at det inducerer et immunrespons mod parasitten. Med denne arbejdshypo-25 tese blev der anvendt forskellige værtssystemer for at analysere fusionsproteinernes immunogene egenskaber, både in vivo og in vitro, hvilket er beskrevet i nedenstående eksempler.

15 DK 173779 B1 EKSEMPEL 2

Ekspression i E. coli

For at opnå ekspression af et p28-antigen i E. coli blev der anvendt et derivat af ekspressionsplasmidet pTG908, som er beskrevet i FR 5 83.00909, til at syntetisere et fusionsprotein, hvis struktur er vist i fig. 3.

Vektoren pTG908 indeholder et replikationsinitieringssted, PL-promo-toren fra bakteriofag λ og cll-ribosombindingssekvensen, herunder den N-terminale ende af cll-genet med hensigtsmæssige restriktionssteder 10 nedstrøms for signalet for translationsinitiering. BamHI-stedet 39 bp nedstrøms for ATG-kodonen blev benyttet til indsætning af et EcoRI-sted ved hjælp af en dobbeltstrenget adaptor omfattende følgende oligomerer: 5'-dGATCCGAATTCG-3' 15 3'-GCTTAAGCCTAGd-5'

Det resulterende plasmid, pTGl924, indeholder et unikt EcoRI-sted med GAA-kodonen i fase med initieringskodonen fra cll-genet. Alle cDNA-indsætningerne stammende fra λ gtll-rekombinanter, som gav et positivt signal efter selektion med anti-p28-serum, blev indsat direkte i 20 dette sted. Når indsætningen befinder sig i den korrekte orientering, giver dette en nukleotidsekvens, som koder for den N-terminale ende af cll-genet, og som fortsætter i fase med den cDNA-sekvens, som koder for p28-antigenet eller for en del heraf.

Én af de resulterende plasmidkonstruktioner, pTG44, indeholdende 25 indsætningen i dette EcoRI-sted fra fragmentet afledt fra kTG06 er vist i fig. 2. Sekvensen af fusionsproteinet cll-p28 med en anslået molekylvægt på 25 kd er vist i fig. 3.

En kultur af E. coli N4830 transformeret med pTG44 dyrkes på LB-medi-um indtil en OD600 på 0,2, hvorefter syntesen af fusionsproteinet 30 induceres ved en temperaturforhøjelse til 42°C i de næste 8 timer.

16 DK 173779 B1

Ved afslutningen af dyrkningen blev celleekstrakterne analyseret på SDS-acrylamidgel ved farvning med Coomassie-blåt (fig. 4). cll-p28-fusionsproduktet isoleres i den uopløselige fraktion, der fås efter lyse af cellerne ved sonikering. Proteinet isoleres med en renhed i 5 størrelsesordenen 80% ved ekstraktion af den uopløselige fraktion i nærværelse af 0,2% SDS. Analyse ved "Western blot" af slutpræparatio-nen viser, at dette bestemte protein effektivt genkendes af kaninantistoffer mod det native p28-antigen (fig. 5).

EKSEMPEL 3 10 Ekspression i gæren S. cerevisiae

Der udførtes to typer konstruktioner for at udtrykke cDNA fra p28 i gær: den første fører til et fusionsprotein, der på den N-terminale side omfatter de 22 første aminosyrer af phosphoglyceratkinase (PGK) fra gær; den anden giver et protein, der ligner det naturlige modne 15 protein.

Konstruktion af en vektor, der bærer en fusion af de gener, som koder for PGK og p28 (pTG1886) 1) EcoRI-indsætningen fra XTG10 indeholdende cDNA fra p28-proteinet blev indsat i et E. coli-gær-shuttleplasmid, pTG836.

20 Dette plasmid er et derivat af pBR322, som indeholder replikations-initieringsstedet fra gærplasmidet 2μ, URA3-genet (FR 84.12598) og PGK-gærgenet (Hitzemann et al., 1982).

Et unikt EcoRI-sted blev indsat mellem BamHl-stedet (beliggende 20 kodoner nedstrøms for PGK-initieringskodonen) og Sall-stedet (til 25 stede i sekvensen fra pBR322) ved indsætning af en syntetisk adaptor: 5'-GATCTGAATTCAGATCTC-3' 3' -ACTTAAGTCTAGAGAGCT-5'

Det resulterende plasmid er pTG1880.

17 DK 173779 B1

Indsætning af BcoRI-fragmentet fra XTG10 i EcoRI-stedet på pTG1880 i den korrekte orientering giver pTG1883.

2) PGK-p28-ekspressionsblokken, der bæres af dette plasmid, isoleres og indsættes i en gærekspressionsvektor, pTG848 (FR 85.06672). Dette 5 nødvendiggør en intermediær manipulation i fagen M13:

Et Hindlll-Bglll-fragment indeholdende PGK-p28-ekspressionsblokken indsættes i M13TG131 (Kieny et al., 1983) mellem Hindlll- og BamHI-stederne, hvilket giver M13TG1884.

På grund af forekomsten af nabostillede restriktionssteder gør denne 10 konstruktion det muligt at isolere den samme ekspressionsblok i form af et Smal-BglII-fragment.

Dette fragment indsættes derefter mellem Smal- og Bglll-stederne på ekspressionsvektoren pTG848.

Det resulterende plasmid er pTG1886.

15 3) Gæren TGYlsp4 blev transformeret med plasmidet pTG1886.

Rå celleekstrakter fra disse kulturer blev analyseret ved elektrofo-rese på SDS-acrylamidgel og ved "Western blot"-teknikken. Fig. 5 og 6 viser klart tilsynekomsten af et nyt proteinbånd med en molekylvægt på 30 kd som forventet for PGK-p28-fusionsproteinet, hvilket bånd 20 genkendes af antistoffer mod nativt p28 ekstraheret fra schistosomer.

Konstruktion af en ekspressionsvektor, der kun bærer cDNA fra p28 linder kontrol af PGK-promotoren 1) I den ovenfor beskrevne konstruktion M13TG1884 er der før initieringskodonen fra p28-proteinet de 22 første kodoner af PGK-genet 25 samt 8 kodoner, der skyldes kloningsteknikken (især dC-rester). Disse 90 yderligere basepar blev slettet ved mutagenese in vitro af enkelt-strenget M13TG1884 i nærværelse af oligonukleotidet 1 1 -C AACAAAATATAAAC^T^CTGGCGAGCATATC-3 * 18 DK 173779 B1 som svarer til de 16 første nukleotider af mRNA-ledersekvensen fra PGK efterfulgt af nukleotider fra begyndelsen af den sekvens, som koder for p28; mellem disse 2 sekvenser findes det ATG, som både falder sammen med initierings-ATG'et fra PGK og p28.

5 2) Det korrekt slettede derivat, M13TG1884m, blev spaltet med Smal og

Bglll, og det fragment, der bærer cDNA fra ikke-fusioneret p28 anbragt under kontrol af PGK-promotoren, blev indsat i ekspressionsvektoren pTG848 (som beskrevet ovenfor), hvilket gav pTG1885.

3) Gæren TGYlsp4 blev transformeret med plasmidet pTG1885.

10 Rå celleekstrakter fra disse kulturer blev analyseret ved elektrofo-rese på SDS-acrylamidgel og ved "Western blot"-teknikken. Pig. 5 og 6 viser klart tilsynekomsten af et nyt proteinbånd med en molekylvægt på 28 kd, hvilket bånd genkendes af antistoffer mod nativt p28 ekstraheret fra schistosomer.

15 EKSEMPEL 4

Ekspression i rekombinante vacciniavira a) Konstruktion af et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker p28 fusioneret til de første aminosyrer af IL-2

De cDNA'er, der bæres af fagerne XTG06 og XTG09, blev indsat i hen-20 sigtsmæssige vektorer for til sidst at blive indsat i vacciniavirus-genomet og således udtrykt i pattedyrceller.

Vektorerne ifølge den foreliggende opfindelse stammer fra vektorer, som er blevet fremstillet til ekspression af humant interleukin-2 (se FR 85.09480). Der blev således konstrueret et derivat af pTGl88, som 25 indeholder et EcoRI-sted i et område af nukleotidsekvensen, der svarer til 9 aminosyrer nedstrøms for den N-terminale alaninrest i nativt interleukin-2 (fig. 7). cDNA-indsætningerne fra XTG06 og XTG09 blev indsat i den korrekte orientering mellem EcoRl-stederne på 19 DK 173779 B1 pTG188-I, hvilket gav plasmiderne pTG45 og pTG46, der koder for et IL-2/p28-fusionsprotein med en molekylvægt på henholdsvis 24 kd og 16 kd (fig. 8), hvilket er vist i fig. 9 og 10. Tilstedeværelsen af et signalpeptid opstrøms for konstruktionen muliggør udskillelse af 5 proteinet i dyrkningsmediet.

De betydningsfulde dele af plasmiderne pTG45 og pTG46 omfatter TK-virusgenet afbrudt af den sekvens, der koder for IL-2/p28-fusionsproteinet, anbragt under kontrol af en effektiv promotor, 7,5 K-vac-ciniaproteinpromotoren.

10 Disse sekvenser, indsat i TK-genet fra vaccinia, kan overføres til vacciniavirusgenomet ved en dobbelt reciprok rekombination (fig. 11), således som det er beskrevet tidligere {Panicali og Paoletti, 1982;

Mackett et al., 1982; Kieny et al., 1984).

De rekombinante vira W.TG.p28Sm-l og W.TG.p28Sm-2, der indeholder 15 cDNA'er stammende fra henholdsvis XTG06 og λTGO9, anvendes til at inficere et monolag af BHK21-celler. Efter 24 timer ved 37eC testes kultursupernatanten for at bestemme tilstedeværelsen af !L-2/p28-fusionsproteinet ved adsorption på nitrocellulosefilter og inkubation med rotte- eller kaninantistoffer, der er specifikke over for nativt 20 p28.

Detektionen af fikserede antistoffer udføres ved inkubation med et biotinyleret antiserum mod totale immunoglobuliner fra rotte eller kanin; dette complex visualiseres derpå ved en reaktion med strept-avidin-peroxidase og endelig farvning i nærværelse af et farverea-25 gens, HRP (BioRad).

Både for W.TG.p28Sm-l og W.TG.p28Sm-2 kan der detekteres specifikke antigener (mere end 100 ng/ml) (fig. 12) i dyrkningsmediet, og dette gælder for forskellige uafhængige rekombinanter, mens supematanteme fra celler, der kun er inficeret med vildtypevirus, ikke giver noget 30 signifikant signal.

20 DK 173779 B1 b) Konstruktion af et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker p28 fusioneret til signalpeptidet for rabiesglycoproteinet (W. TG. 1184)

Konstruktion af bakteriofagen M13TG177 5 Bakteriofagen M13TG169 (FR 86.05043) indeholder den sekvens, der koder for env-genet fra HIV-l-virus, omgivet ved 5'-enden af den sekvens, der koder for signalpeptidet for rabiesglycoproteinet, og ved 3'-enden af den sekvens, der koder for transmembranzonen og den in-tracytoplasmatiske zone fra rabiesglycoproteinet.

10 Der blev indsat et EcoRI-sted mellem Kpnl- og HindiII-stederne på M13TG169 for at danne M13TG176, der har følgende struktur:

EcoRI EcoRI

5 TM

_i—. -1_i_lIj _

PstI PstI

s.· signal for rabies-gp TM: transmembranzone fra rabies-gp

EcoRl-stedet nedstrøms for signalpeptidet blev derefter elimineret 15 ved lokaliseret mutagenese ved hjælp af oligonukleotidet 5' GGGGAAATCGTAATC 3'

Den resulterende bakteriofag M13TG177 har således et unikt EcoRI-sted.

Konstruktion af bakteriofagen M13TG1105 20 EcoRI-restriktionsfragmentet fra XTG10 indeholdende den kodende sekvens for p28 indsættes i M13TG177 til dannelse af M13TG1105, der har følgende struktur: 21 DK 173779 B1

EcoRI EcoRI

S j TM

-i-1-3LJ=*--1 I----1- 1 ATG stop *

PstI ρ2θ PstI

PstI

Konstruktion af bakteriofagen M13TG1108

De to første aminosyrer efter S-signalpeptidet fusioneres i fase med den kodende sekvens for p28 ved lokaliseret mutagenese med følgende oligonukleotid: 5 5' CTTGATATGCTCGCCAGCAATAGGGAATTTCCCAAA 3'

Den resulterende bakteriofag betegnes M13TG1108.

Konstruktion af plaemidet pTG1184

Bakteriofagen M13TG1108 spaltes delvis med PstI for at isolere det fragment, der indeholder hele den sekvens, som koder for p28, og 10 indsættes i Pstl-stedet på plasmidet pTG186POLY til dannelse af pTG1184.

c) Konstruktion af et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker p28 fusioneret til signalpeptidet og transmembranzonen fra rabies-glycoproteinet (W.TG. 1185) 15 Konstruktion af bakteriofagen M13TG1109 I bakteriofagen M13TG1108 fusioneres den sidste aminosyre før kodonen for translationstermination i fase med den første aminosyre fra transmembranzonen TM ved hjælp af følgende oligonukleotid: 5' TGCACTCAGTAATACATAGAAGGGAGTTGCAGGCCT 3' 20 Den resulterende bakteriofag betegnes M13TG1109.

22 DK 173779 B1

Konstruktion af plasmidet pTG1185

Som ved konstruktionen af pTG1184 underkastes bakteriofagen M13TG1109 delvis spaltning med PstI, og det fragment, der indeholder hele den kodende sekvens for p28, indsættes i PstI-stedet på pTG186POLY til 5 dannelse af pTG1185.

d) Karakterisering af viraene W.TG.1184 cg 1185

Plasmiderne pTG1184 og 1185 anvendes til at overføre det gen, der koder for p28, til vacciniavirusgenomet som beskrevet ovenfor.

Viruset W.TG.1184 udtrykker p28 fusioneret til signalpeptidet fra 10 rabiesglycoproteinet.

Viruset W.TG.1185 udtrykker p28 fusioneret til signalpeptidet og transmembranzonen fra rabiesglycoproteinet.

BHK21-celler inficeres med viruset W.TG.1184 eller 1185 (0,2 pfu/-celle) i 16 timer. Efter tilsætning af 35S-methionin i løbet af 4 ti-15 mer immunudfældes de mærkede proteiner ved hjælp af et kaninantistof mod p28. I tilfælde af W.TG.1184-virus påvises et bånd svarende til en molekylvægt på 28 kd. Dette protein er også til stede i stor mængde i kultursupernatanten, hvilket viser, at proteinet udskilles.

I tilfælde af W.TG.1185-virus påvises et bånd svarende til en mole-20 kylvægt på 35 kd. Dette protein er ikke til stede i kultursuper- natanteme, hvilket viser, at det holdes tilbage i cellemembranen ved hjælp af transmembranzonen fra rabiesglycoproteinet.

EKSEMPEL 5

Vaccination af dyr med p28-antigenet fremstillet ved genetisk manipu-25 lation

Den biologiske virkning af de rekombinante proteiner, der indeholder én eller flere hovedepitoper fra nativt p28, blev analyseret i sam- 23 DK 173779 B1 TTienligning med det respons, der iagttages efter immunisering af rotter med nativt modent p28, som er isoleret fra samlede ekstrakter fra voksne parasitter. De fusionsproteiner, der enten er produceret af mikroorganismer såsom E. coli eller S. cerevisiae eller af et 5 rekombinant vacciniavirus, kan anvendes til et sådant forseg, men kun de resultater, der er opnået med cII/p28-fusionsproteinet, er beskrevet nedenfor.

Immunisering af rotter 20 "Fisher"-hanrotter med en alder på 3 måneder immuniseres ved in-10 traperitoneal injektion med 50 fig af et cII/p28-fusionsprotein (eksempel 2) i nærværelse af Freunds adjuvans. Dyrene får endnu en dosis efter 2 uger, og antisera tages efter dag 8.

4 serumpuljer, der hver omfatter 5 prøver, analyseres 3 gange for at teste tilstedeværelsen af antistoffer, der genkender det native p28-15 protein, samt seraenes cytotoxicitet med hensyn til schistosomuler.

Detektion af specifikke antistoffer

Sera fra rotter immuniseret med cIl/p2B-proteinet ekstraheret fra E. coli bedømmes ved en "Western blot"-test for deres reaktion mod p28 fra en samlet ekstrakt fra voksne parasitter, adskilt ved elektrofo-20 rese på SDS-polyacrylamidgel. Fig. 13 viser, at disse sera entydigt genkender det native p28-protein.

Den maksimale intensitet af dette respons nås på dag 23 og er praktisk talt lig med det respons, der iagttages med sera fra dyr immuniseret med det native antigen.

25 Bedømmelse af den eoeinofUafhængige cytotoxicitet

De samme sera blev bedømt i en test for eosinofilafhængig cytotoxicitet ved den af Capron et al. (1981) beskrevne teknik.

50 schistosomuler fra S. mansoni inkuberes i nærværelse af hvert serum, der skal testes (uopvarmet), eller passende kontroller og i » 24 DK 173779 B1 nærværelse af eosinofiler (ikke-adhærerende peritonealceller fra Lou-rotte indeholdende 40-70% eosinofiler). Reaktionsblandingen omfatter 6000 effektorceller pr. 1 schistosomul i et samlet volumen på 200 μΐ. Efter 48 timers inkubation ved 37°C bedømmes den procentuelle 5 dødelighed af schistosomulerne ved undersøgelse under et mikroskop.

De i tabel I anførte resultater viser klart tilstedeværelsen af en cytotoxisk faktor, der er i stand til at inducere en høj dødelighed hos schistosomuler, hvilken dødelighed ligger meget tæt på den, der induceres af serum fra en rotte inficeret med S. mansoni.

10 Påvisning a£ rollen af specifikke IgB'er i cytotoxicitetsreaktionen

Den samme cytotoxicitetstest blev udført med opvarmet serum {2 timer ved 56°C) og med opvarmet serum tilsat komplement. De i tabel II anførte resultater viser, at den faktor, der er ansvarlig for cyto-toxiciteten, er varmefølsom, og at dette aktivitetstab ikke kan kom-15 penseres ved tilsætning af komplement.

Desuden kan man selektivt eliminere IgE'er fra de sera, der skal undersøges, ved en adsorption ved hjælp af et gedeantistof, der er specifikt over for rotte-IgE'er, koblet til sepharose B. De således behandlede og dialyserede sera testes for deres eosinofilafhængige 20 cytotoxiske aktivitet.

Tabel in viser, at selektiv nedsættelse af rotteseras IgE forhindrer ekspression af cytotoxiciteten. Denne er således meget specifik for IgE'er fra sera fra rotter, der er immuniseret med cII/p28-proteinet.

Påvisning af beskyttelse af dyr mod en foreøgsinjektion med haleikter 25 Fischer-rotter blev injiceret (som beskrevet ovenfor) med p28-antige-net produceret i E. coli eller i gær i nærværelse af aluminiumhydroxid eller med vacciniavirus, der udtrykker p28-antigenet, W.TG.1185 (5xl07 pfu rekombinant virus pr. dyr). Kontroldyr injiceres kun med aluminiumhydroxid.

25 DK 173779 B1

Seks uger efter immuniseringen inficeres dyrene subkutant med 1000 haleikter (infektiøs larvetilstand af schistosom).

21 dage efter forsøgsinokulationen aflives rotterne, og deres indhold af voksne parasitter bedømmes. Disse opsamles ved perfusion af leve-5 rens vena portae med fysiologisk vand og tælles derefter.

Der ses en reduktion i parasitantallet i forhold til kontrollerne med 64 ± 4% med antigenet produceret i S. coli 70 ± 10% med antigenet produceret i gær 60 ± 8% med antigenet produceret af vaccinia.

26 DK 173779 B1

TABEL I

Test af eosinofilafhængig cytotoxicitet

Undersøgelse af sera fra rotter immuniseret med cll/p28-proteinet produceret i E. coli 5 % cytotoxicitet

Slutfortynding efter 48 timers

Kilde til antistof af serummet inkubation

Serum fra rotte immuniseret 10 med cll/p28, taget på dagen J8 1/16 60,5 ± 2,5 1/32 55,5 ± 5 1/64 6,5 ± 6,5 J10 1/16 85,5 ± 0,5 15 1/32 76 ±3,5 1/64 57 ±4,7 J16 1/16 85,5 ± 0,5 1/32 78 ±6 1/64 52 ±3 20 J23 1/16 88 ±3,5 1/32 92 ±0 1/64 52 ± 11,5

Serum fra rotte inficeret med S. mansoni 1/16 97 ±1 25 Serum fra sund rotte 1/16 0 27 DK 173779 B1

TABEL II

Bosinofilafhængig cytotoxicitet

Undersøgelse af deltagelse af komplement

Serum fra rotte immuniseret med cll/p28-5 proteinet produceret af E. coli (slutfor- % cytotoxicitet efter tynding 1/16) 16 dage efter immunisering 48 timer inkubation

Uopvarmet serum 85,5 ± 0,5

Opvarmet serum 26,5 * 5,5 10 Opvarmet serum + marsvinekomplement 38,5 ± 0,5

Opvarmet serum + opvarmet marsvinekomplement 21,5 ± 1,5

TABEL III

Eosinofilafhængig cytotoxicitet 15 Undersøgelse af deltagelse af antistoffer af IgE-isotype % cytotoxicitet efter

Kilde til antistof 48 timers inkubation

Serum fra rotte immuniseret med cll/p28 20 produceret i E. coli taget på dagen J16 48,5 J23 40

Serum fra sund rotte 0 25 Effluent fra anti-IgE-søjle J16 0 J23 0

Serum fra sund rotte 0 EKSEMPEL 6 28 DK 173779 B1

Glutathion-S-transferaseaktiviteten blev påvist i ekstrakter af E. coli TGE901/pTG54 og fra S. cerevisiae TGY2spl3b/pTG2800, der udtrykker p28-proteinet fra Schistosoma mansoni (den eneste forskel mellem 5 pTG2800 og pTG1894 beskrevet i eksempel 3 er en deletion af 170 bp i promotorområdet af ura3-genet).

Kulturerne centrifugeres, og bundfaldene resuspenderes i puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT) . Gærstammerne knuses med glaskugler; bakterierne ultralydbehandles. Ekstrakterne centrifugeres for at 10 eliminere cellerester, og aktiviteten måles i supernatanten (ifølge de af Moore et al., 1986, og Habig et al., 1974, beskrevne teknikker) . I en spektrofotometer-cuvette blandes 40-100 μΐ råekstrakt, 10 μΐ 100 mM CDNB-reagens (l-chlor-2,4-dinitrobenzen i opløsning i 100% ethanol) og 1 ml 100 mM KHjPC^ (pH 6,5)/2,5 mM reduceret gluta-15 thion.

Som positiv kontrol anvendes glutathion-S-transferase fra en rotte (leveret af Sigma) i en slutkoncentration på 9 rø og 6 /ig pr. test.

Som negative kontroller anvendtes en ekstrakt af E. coli TGE901/-pTG959, der bar en vektor uden p28-sekvens, og en ekstrakt af S.

20 cerevisiae TGY2spl3b og TGY2spl3b/pTG848, der bar en vektor uden p28-sekvens.

Alle bakterie- og gærekstrakterne indstilles til en koncentration af samlede proteiner på 0,33 mg/ml.

En gul farve fremkommer i de cuvetter, hvor der findes en glutathion-25 transferaseaktivitet. Ændringen af OD måles med et spektrofotometer ved 340 nm hvert minut i 15 minutter.

De i fig. 15 anførte resultater viser, at de ekstrakter af E. coli og S. cerevisiae, som indeholder det rekombinante p28I-protein, har en stærk glutathion-S-transferaseaktivitet.

EKSEMPEL 7 29 DK 173779 B1

Screening af banken og selektion af kandidaten XTG07

Screening af cDNA-banken for Xgtll, der er beskrevet i eksempel 1, gjorde det muligt at fremkalde flere typer kandidater.

5 Ved immundetektion med et polyklonalt rotteantistof (induceret ved injektion af oprenset p28 fra schistosomer) blev der selekteret en ny kandidat, XTG07, som ikke genkendes af de syntetiske prober, som blev anvendt til selektion af kandidaterne XTG10 og XTGll, som er beskrevet i eksempel 1, og hvis sekvens således er anderledes. Da pro-10 teinet genkendes af de samme anti-p28-antistoffer, betegnes dette nye protein p28II {og det, som blev identificeret tidligere, betegnes p28I).

EKSEMPEL 8

Bestemmelse af cDNA-sekvensen, der bsres af fagen XTG07 15 Forskellige cDNA-restriktionsfragmenter blev genklonet i M13 for at blive sekventeret.

Den fuldstændige cDNA-sekvens og den primære aminosyrestruktur, som kan udledes deraf (i de 3 læserammer), er vist i fig. 16a og 16b.

EKSEMPEL 9 20 Dannelse af et BaaHI-sted i begyndelsen af cDNA-sekvensen

For at lette indsætningen af cDNA i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor blev der ved styret mutagenese dannet et BamHI-sted i begyndelsen af den kodende sekvens.

Mutagenesen blev udført på DNA klonet i M13 med følgende synteseoli-25 gomer, som er en 21mer, der er komplementær med nukleotideme 18-38 i 30 DK 173779 B1 den i fig. la viste sekvens med undtagelse af de nukleotider, der skal muteres: 5' GTAÅGGAGCGGATCCACGATG 3’

BaaHI-sted cDNA-sekvensen kan således isoleres i form af et BamHI-fragment, idet 5 endnu et BamHI-sted er til stede i polylinkeren fra Ml3 nedstrøms for den kodende sekvens.

EKSEMPEL 10

Ekspression a£ p28II-proteinet i E. coli

Den cDNA-sekvens, der koder for p28II, blev isoleret i form af et 10 BamHI-fragment og indsat i ekspressionsvektoren pTG908 i BamHI-ste- det.

Strukturen af den vundne rekombinant er identisk med den, der er vist skematisk i fig. 2.

Denne vektor indeholder et replikationsinitieringssted, P^-promotoren 15 fra fagen λ og sekvensen for fiksering af cll-ribosomer, herunder den N-terminale ende af cll-genet med et BamHI-restriktionssted 29 bp nedstrøms for stedet for translationsinitiering.

cDNA-p28II-indsætningen befinder sig således i fase med den N-terminale ende af cll-genet.

20 Et rekombinant plasmid, som bærer indsætningen i den korrekte orientering, blev selekteret: pTG56, og konstruktionen blev bekræftet ved sekventering.

En kultur af E. coli TGE901 transformeret med dette plasmid dyrkes på LB-medium til en ODg00 på 0,2,- derefter induceres syntesen af cll-25 p28II-proteinet ved en temperaturforhøjelse til 42“C i løbet af de næste 8 timer.

31 DK 173779 B1

Ved afslutningen af dyrkningen isoleres celleekstrakterne efter ultralydbehandling og analyseres efter elektroforese på SDS-acrylamid-gel og farvning med Coomassie-blåt (fig. 17).

Et bånd med en anslået molekylvægt på 28 K er klart synligt i eks-5 trakteme af TGE901/pTG56 (fig. 17; bånd A, B, C, D) .

En analyse ved "Western blot" af en oprenset præparation af dette protein ekstraheret fra E. coli viser, at det genkendes af rotteantistoffer mod nativt p28 oprenset fra schistosomer.

Der blev søgt efter en eventuel enzymatisk glutathion-s-transferase-10 aktivitet, men testen er negativ. Dette negative resultat var forventet på grund af fraværet af homologi mellem sekvensen af de 2 p28-proteiner.

EKSEMPEL 11

Vaccination af rotter med p2BIX-antigenet produceret af E. coli 15 Rotterne immuniseres ifølge den i eksempel 5 beskrevne proces, og deres sera bedømmes ved en test for eosinofilafhængig cytotoxicitet.

De i tabel IV anførte resultater viser, at disse seras cytotoxiske evne kan sammenlignes med serum fra rotter immuniseret med det første antigen, p28I, eller med nativt p28.

TABEL IV

32 DK 173779 B1

Test for eosinofilafhængig· cytotoxicitet: undersøgelse af serum fra rotter immuniseret med nativt p28-protein, cll-p28 og cII-p28II produceret i E. coli {serumfortynding 1/16).

5 % cytotoxicitet af serum taget på dag

Rotter immuniseret med: 7 14 21 nativt p28 52,5% 29% 73% 10 CII-P28I/S. coli 24,5% 20% 59,5% cII-p28II/E. coli 55% 68% 61,5% adjuvans alene (BSA + pertussis) 30% ikke-injicerede rotter 0% 15 rotter inficeret med S. mansoni 89,5%

Antistoffer fra rotter immuniseret med p28II-proteinet produceret i S. coli genkender ikke p28I-proteinet. Ligeledes genkender antistof-20 fer fra rotter immuniseret med p28I-proteinet produceret i E. coli ikke p28Il-proteinet. Imidlertid genkender de 2 typer antistoffer præparationen af nativt p28 oprenset fra schistosomer, og antistoffer mod nativt p28 genkender de 2 rekombinante proteiner.

Dette resultat forklares ved en heterogenitet af præparationen af 25 nativt p28 oprenset fra schistosomer. En omhyggelig observation af immunpræcipitationen efter vandring på gel i 2 dimensioner af det native p28-protein eller translateret in vitro på mRNA'er fra schis-tosomer viser eksistensen af et mindre bånd, som dublerer båndet på 28 K (figur publiceret af J.M. Balloul, R.j. Pierce, J.M. Grzych og 30 A. Capron, Mol. Biochem. Parasitology 17 (1985) 105-114). Dette mindre bånd må svare til p28II.

33 DK 173779 B1

Deponering af stammer Følgende stammer er deponeret i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris:

Stammen E. coli N4830 beskrevet i eksempel 2 transformeret med 5 plasmidet pTG44, med nummeret 1-562, 6. juni 1986; stammen TGE90l/pTG56, med nummeret 1-656, 3. april 1987.

BIBLIOGRAFI

I. Capron, A. og Dessaint, J.P. (1985) Ann. Rev. Immunol. 3, 455-476 .

10 2. Balloul, J.M., Pierce, R.J., Grzych, J.M. og Capron, A. (1985)

Mol. Biochem. Parasitol. 17, 105-114.

3. Balloul, J.M., Grzych, J.M., Pierce, R.J. og Capron, A. (1986), under udgivelse.

4. Young, R.A. og Davis, R.W. (1983) Science 222, 778-782.

15 5. Huynh, T.V. i DNA Cloning Techniques : A Practical Approach (Glover, D., red.) IRL Press, Oxford (1984).

6. Le Bouc, Y., Dreyer, D., Jaeger, F., Binoux, M. og Sondermeyer, P. (1986) FEBS Lett. 196, 108-112.

7. Lathe, R. og Lecocq, J-P. (1977) Virology 83, 204-206.

20 8. Hitzemann, R.A., Hagie, F.E., Hayflick, J.S., Chen, C.Y., See- burg, P.H. og Derynck, R. (1982) Nucleic Ac. Res. 10, 7791-7808.

9. Kieny, M.P., Lathe, R. og Lecocq, J-P. (1983) Gene 26, 91-99.

10. Smith, G.L., Mackett, M. og Moss, B. (1983) Nature 302, 490-495.

II. Panicali, D. og Paoletti, E. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

25 79, 4927-4931.

12. Mackett, M., Smith, J.L. og Moss, B. (1982) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 79, 7415-7419.

13. Kieny, M.P., Lathe, R., Drillien, R., Spehner, D., Skory, S-,

Schmitt, D., Wiktor, T., Koprowski, H. og Lecocq, J-P. (1984) 30 Nature 312, 163-166.

14. Capron, M., Bazin, H., Torpier, G., Joseph, M. og capron, A.

(1981) J. Immunol. 126, 1764-1768.

15. Habig, W.H., Pabst, M.J. & Jakoby, W.B. (1974) J. Biol. Chem.

249, 7130.

34 DK 173779 B1 16. Moore, R.E., Davies, M.S., O'Connell, K.M., Harding, E.I., Wie-gand, R.C. & Tiemeier, D.C. (1986) Nucl. Ac. Res. 14, 7227.

17. Smith, D.B., Davern, R.M., Board, P.G., Tiu, W.U., Garcia, E.G.

& Mitchell, G.F. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8703.

Claims (14)

1. Protein, kendetegnet ved, at det har en glutathion-S-transferase-aktivitet og en amino-syresekvens l det væsentlige som vist på figur 1.

2. Protein, kendetegnet ved, at det har en glutathion-S-transferase-aktivitet og en molekyl-5 vægt på omkring 28 Kd, og at det kan opnås fra Schistosoma mansoni.

3. Protein, kendetegnet ved, at det omfatter epitopeme af proteinet ifølge krav 1 eller 2, og at det genkendes af antistoffer rejst mod proteinet ifølge krav 1 eller 2.

4. DNA-fragment, kendetegnet ved, at det koder for et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3.

5. Ekspressionsenhed beregnet for produktion af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at det omfatter et DNA-fragment kodende for et protein 15 ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, placeret under kontrol af passende elementer beregnet på at sikre ekspressionen af DNA-fragmentet.

6. Celle, kendetegnet ved, at den er transformeret med en ekspressionsenhed ifølge krav 5. 20

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning af en celle ifølge krav 6 og oprensning af proteinet fra dyrkningsmediet.

8. Viral vektor beregnet til fremstilling af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at den i sit genom har indsat et DNA-fragment kodende for et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3 under kontrol afpassende ekspressions-elementer.

9. Viral vektor ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den er en vacciniavirus.

10. Farmaceutisk komposition beregnet til behandling og forebyggelse af schistosomose, kendetegnet ved, at den som aktiv bestanddel omfatter et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3 eller et immunologisk fragment deraf omfattende epitopeme som 35 genkendes af antistoffer rejst mod proteinet. DK 173779 B1

11. Farmaceutisk komposition beregnet tii behandling og forebyggelse af schistosomose, kendetegnet ved, at den som aktiv bestanddel omfatter en viral vektor ifølge krav 8 eller 9.

12. Anvendelse af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3 som middel udvisende glutathion-S-transferase-aktivitet.

13. Anvendelse afen celle ifølge krav 6 som middel udvisende glutathion-S-transferase-aktivitet. 10

14. Fremgangsmåde til mikrobiologisk omdannelse under anvendelse af glutathion-S-transferase-aktivitet, kendetegnet ved, at der som middel til omdannelse benyttes et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3 eller en celle ifølge krav 6.