DK175533B1

DK175533B1 - Vaccine mod rabies samt fremgangsmåde til fremstilling deraf

Info

Publication number: DK175533B1
Application number: DK198506062A
Authority: DK
Inventors: Marie-Paule Kieny; Jean-Pierre Lecocq; Robert Drillien; Richard Lathe
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 1984-04-25
Filing date: 1985-12-23
Publication date: 2004-11-22
Also published as: WO1985004810A1; DK606285D0; EP0162757B1; JP2537345B2; US6024953A; EP0162757A1; ZA853081B; AU4233585A; DK606285A; CA1253093A; JPS61501957A; ATE49707T1; FR2563434B1; AU580059B2; DE3575520D1; FR2563434A1

Description

DK 175533 B1 I

Rabies er en meget gammel sygdom, men den fuldstændige bekæmpelse deraf har indtil nu ikke kunnet gennemføres. Selv om der findes effektive vacciner mod rabies, er sådanne vacciner for kostbare til at kunne anvendes som forebyggende middel. Desuden er rabiesvirus meget udbredt hos vilde dyr, og derfor har kun

5 øriger såsom Storbritannien og Japan kunnet opnå udryddelse af denne sygdom. I

Det stof, som forårsager denne sygdom, er et Rhabdovirus. Overførsel af rabies I

omfatter sædvanligvis, at et modtagerindivid bides af et inficeret dyr; den I

ændring i adfærd, som er forbundet med kronisk infektion, spiller en stor rolle i I

10 sygdommens etiologi. I

Hos mennesker følges infektionen af en latensperiode, hvor viruset vandrer I

I gennem nervesystemet op til hjernen. I begyndelsen kan denne sygdom behand- I

I les effektivt ved intensiv vaccination; når der opstår adfærdsmæssige symptomer, I

I 15 er døden imidlertid næsten uundgåelig.

I Viruset omfatter 5 virusproteiner, hvoraf kun ét, glycoproteinet (G, hæmagglu- I tinin), trænger igennem det lipide dobbeltlag, som omslutter viruset. Således er I glycoproteinet den eneste virusbestanddel, som er i stand til at reagere med I 20 antistoffer, som neutraliserer viruset, og ligeledes at fremkalde dannelse deraf.

I Anilionis et at. (1981) har beskrevet isolering af en kodende sekvens, som svarer I til mRNA for rabies-glycoproteinet, stamme ERA, og Lathe et al. (1984) har I beskrevet ekspressionen af denne sekvens i en bakterie.

I 25 I Lignende resultater er beskrevet af Yelverton et al. (1983), idet der blev anvendt I en anden rabiesstamme, CVS.

I Der er imidlertid endnu ikke blevet opnået en effektiv immunisering mod rabies- I 30 virus under anvendelse af det materiale, der er syntetiseret af bakterier.

I Foreløbige resultater antyder, at modifikationer efter translationen og/eller glyco- I proteinets præsentation er vigtige parametre ved anvendelsen af dette antigen, I for at det giver beskyttelse mod rabiesvirus.

I 35 I DK 175533 B1 H Den foreliggende opfindelse beskriver ekspressionen af en sekvens, som koder for rabies-glycoproteinet G i et miljø, således at en korrekt modifikation og præsenta- tion af produkterne fra den primære translation kan foreligge.

5 To grupper har for nylig påvist anvendelsen af levende rekombinanter af vacci- niavirus til ekspression af antigenet for influenza eller hepatitis B og immunisering mod disse sygdomme (Smith et al., 1983 og Panicali et al., 1983).

Ekspression af en sekvens, som koder for et exogent protein i vacciniavirus (W),

H 10 omfatter nødvendigvis to trin: I

1) Den kodende sekvens skal være i læseramme med en promotor for W og I

indsættes i et ikke-essentielt DNA-segment fra W klonet i et hensigts- I

mæssigt bakterieplasmid; I

15 2) DNA-sekvenserne fra W, som findes på begge sider, skal muliggøre homo- I

loge rekombinationer in vivo mellem plasmidet og virusgenomet. En dobbelt I

reciprok rekombination fører til en overførsel af DNA-indsætningen fra plas- I

midet til virusgenomet, i hvilket den formeres og udtrykkes (Panicali og

Paoletti, 1982; Mackett et al., 1982; Smith et al., 1983; Panicali et al., 20 1983).

I Den foreliggende opfindelse angår et vacciniavirus, som er ejendommeligt ved, at det omfatter hele eller en del af en DNA-sekvens, som koder for et antigen-glyco- protein for rabies, i det følgende betegnet DNA-sekvens (I).

I 25 I Udtrykket "vacciniavirus" betegner hele eller en del af et virus af arten Poxvirus, I især af underarten vaccinia, som foruden selve vaccinia omfatter andre vira I såsom "Cowpox".

I 30 Udtrykket "antigen-glycoprotein for rabies" betegner et glycoprotein, som in vitro, men fortrinsvis in vivo, har immunogene karakteristika, som er identiske eller be- I slægtede med glycoproteinet for naturlig rabies, dvs. for vild virus.

I Selv om det til DNA-sekvensen I foretrækkes at anvende den DNA- sekvens, som I 35 koder for det komplette modne protein, er det muligt kun at anvende en del af

DK 175533 B1 I

denne DNA-sekvens eller en sådan sekvens med punktmutationer, men som fører I

til produkter med næsten identisk aktivitet. Dette virus omfatter fortrinsvis alle de I

segmenter, der sikrer ekspression af ovennævnte glycoprotein, især en promotor I

for et vacciniagen såsom promotoren for genet 7,5K med betegnelsen P7,5K, som I

5 befinder sig oven for DNA-sekvensen I. I

Denne promotor/DNA-sekvens I-enhed indsættes i et gen for vacciniavirus, fx I

genet TK, hvilket giver en mulighed for selektion, hvilket beskrives nedenfor. I

10 Det således vundne hybridvirus kan anvendes som sådan, levende eller inaktive- I

ret ved kemisk eller fysisk behandling, som vaccinemiddel eller kan anvendes til I

at inficere en cellekultur, hvorfra man ved kendte teknikker kan ekstrahere I

antigen-glycoproteinet ud fra de sprængte celler. I

15 For at reducere risikoen for uheld ved vaccinationer med et levende virus mest I

muligt kan man også påtænke at anvende en varmefølsom mutant af vaccinia (F. I

Keller et al., 1978, og F. Keller og R. Drillien, 1980). Desuden kan denne type ts- I

I mutation findes på selve vacciniavektoren eller indføres ved mutation i de rekom- I

I binante vira ifølge opfindelsen. Især kan man i det rekombinante virus indføre I

I 20 forskellige varmefølsomheder for at bibeholde fænotypen, selv i tilfælde af delvis I

I tilbagefald. I

I Desuden kan man påtænke anvendelsen af et virus, der er en mutant af vaccinia I

I og har en værtsspecificitet, som ikke vokser eller kun vokser lidt på humane cel- I

I 25 ler, og hvis patogenicitet er endnu svagere end vaccinias. I

I Den foreliggende opfindelse angår vacciner beregnet til behandling eller I forebyggelse af rabies, hvilke vacciner er ejendommelige ved, at de består af et I rekombinant vacciniavirus, som omfatter en DNA-sekvens, der koder for I 30 glycoprotein G fra rabiesvirus.

I Til disse vacciner kan administrationsvejene varieres, og især kan der anvendes I intradermal eller oral administration. Vaccinerne kan administreres med kendte I farmaceutiske bærere og desuden indeholde adjuvanser, som gør det muligt at I 35 forøge deres vaccinestyrke.

I DK 175533 B1

Nedenstående eksempler tjener til at belyse andre karakteristika og fordele ved den foreliggende opfindelse.

5 Fremstillingen af viruset ifølge opfindelsen omfatter især følgende trin: 1) restrukturering af en ende af cDNA for rabies, vist i fig. 1, ved den i fig. 2 B viste fremgangsmåde, til dannelse af pTG155, B 2) mutation af en af sekvenserne fra dette cDNA for i glycoproteinet at B 10 retablere prolin ved den 8. aminosyre, fig. 3, til dannelse af ptgl55-pro, B 3) syntese af et miniplasmid, ptglH, ud fra pBR322 (fig. 4), B 4) indsætning i dette miniplasmid af Hin-J-fragmentet, som bærer TK-genet fra I W, B 5) indsætning i TK-genet af promotoren for proteinet 7,5K (fig. 5), B 15 6) indsætning nedenfor promotoren for P7,5K af rabiesgenet, som bæres af B ptgl55-pro (fig. 5), og B 7) kloning af de essentielle segmenter af sidstnævnte plasmid i vacciniavirus I (fig. 6).

B 20 Nedenstående eksempler belyser egenskaberne af de forskellige vundne bestand- dele.

I De forskellige materialer, der blev anvendt, er identificeret i eksemplerne.

25 Medmindre andet er angivet, er enzymerne anvendt under de af fabrikanten an- befalede betingelser, og de anvendte teknikker er kendte for fagfolk.

I De i figurerne viste aminosyresekvenser og nucleotidsekvenser er ikke vist i beskrivelsesteksten for ikke at gøre den for tung, men de udgør en integreret del 30 deraf.

I Restrukturering af cDNA'et for rabies-glycoproteinet 5 DK 175533 B1

Den sekvens, der koder for rabies-glycoproteinet, og som er beskrevet af Anilionis et al., er vist i fig. 1 og omfatter segmenter, som kan forstyrre dens translation og ekspression som antigen.

5 cDNA for rabies-glycoproteinet, som stammer fra plasmidet pRG beskrevet af Anilionis et al. (1981) og bæres på et Sg/II/5g/II-fragment af forskellige plasmider såsom pTG147, pTG171 og pTG150, er beskrevet i fransk patentansøgning nr.

83 15716 (WO-A-85/1516).

10 ATG'et svarende til initeringskodonen for mRNA for det modne protein befinder sig græn-sende umiddelbart op til en polyG-sekvens, som indføres ved cDNA-klonings-processen. Denne sekvens er i stand til at frembringe ustabilitet ved in vivo rekombination mellem G/C-segmenteme ved hver af enderne af cDNA'et og kan desuden forstyrre translationen af proteinet.

15

Desuden svarer sekvenserne af cDNA'et for glycoproteinet ikke fuldstændig til den sekvens, som koder for den N-terminale del af det modne glycoprotein. Derfor blev det besluttet at eliminere disse to forhindringer, før kloningen af den tilsvarende kodende sekvens blev udført.

20

Kozak (1981, 1983) har påvist, at initieringskodonerne for translationen i eukaryote celler normalt befinder sig i en sekvens, som kan vises på følgende måde: A * * ATG (A eller G), og ændringer af denne sekvens kan føre til en formindsket translation. Selv om vigtigheden af disse ende-nucleotider ikke er 25 fuldstændig erkendt, synes dét at være foretrukket at eliminere den tilstødende G/C-sekveris og at bevare essensen af den ovenfor nævnte overensstemmende sekvens. Desuden er det nødvendigt at have en Sg/II-genkendelsessekvens oven for for at lette efterfølgende bearbejdning. 1

Under rekonstruktionen af 5’-enden af cDNA, hvilket er vist i fig. 2, blev eksistensen af et unikt Afsfll-sted udnyttet, hvilket sted dækker de kodoner, som koder for aminosyrerne 2, 3 og 4 af det primære translationsprodukt.

I DK 175533 B1 I

I 6 I

I cDNA'et for rabies-glycoproteinet ifølge Anilionis blev indsat i plasmidet pTG150 I

I under anvendelse af adaptoroligonudeotiderne Pstl/Bglll (Lathe et al., 1982) i et I

I unikt 8g/II-sted indsat i H/ndlll-stedet i plasmidet pBR327 (Soberon et al., 1980). I

5 Dette plasmid, som er angivet med A i fig. 2, blev spaltet delvis med Bgfll og I

I fuldstændigt med Mstll, og de derved dannede lineære fragmenter blev isoleret I

I ved elektroforese på agarosegel ved lav geleringstemperatur. Oligonudeotiderne I

I {5’-dGATCTAATATGGTTCC-3') og (5’-dTGAGGAACCATATTA-3’) blev syntetiseret i I

I henhold til en tidligere beskrevet teknik (Kohli et al., 1982). Oligonudeotiderne I

I 10 hybridiseres til dannelse afen delvis dobbeltstreng (B i fig. 2) og indsættes I

I mellem Bgfll- og MstlΙ-enderne i det oprensede lineære plasmid, hvilket muliggør I

I redrkularisering og frembringer plasmidet pTG155 (C i fig. 2). I

I Den 8. aminosyre i det modne glycoprotein (som ikke har nogen signalsekvens) I

I 15 fra virusstammerne ERA og CVS for rabies er prolin, medens man i det cDNA, der I

er isoleret af Anilionis et al., i denne stilling finder en triplet, som koder for leucin; I

I I pTG155, som er vist i fig. 3, er det muterende sted omgivet af et EcoRI-sted I

oven for i vektoren og af et Hindlll-sted pi sekvenserne svarende til I

I 20 aminosyrerne 10 og 11 i den sekvens, som koder for det modne glycoprotein. I

I Dette lille EcoRI/fiindlll-fragment klones i bakteriophagen M13tgl31 (Kieny et al., I

I 1983) i omvendt orientering. Der udføres en lokaliseret mutagenese dirigeret af et I

oligonucleotid i henhold til den af Zoller og Smith (1983) beskrevne teknik under I

I anvendelse af oligonucleotidet (5’-dATCACGATCCCAGACAAGC-3r), som er I

I 25 syntetiseret som beskrevet ovenfor. I

Kodonen for den 8. aminosyre i cDNA-sekvensen udskiftes for at erstatte CTA I

I med CCA. I

I 30 Oligonucleotidet (19mer) indeholder to modifikationer i forhold til den oprindelige I

I sekvens: et T i stedet for C, hvilket ændrer tripletten for leucin, CTA, til prolin, I

I CCA, og et A i stedet for C, hvilket svarer til en transversion i sekvensen GATA. I

I Dette giver en sekvens GATC for dam-methylering, hvilket fremmer inkorporering I

I af oligonucleotidsekvensen ved korrigering af de selektive sammenkoblingsfejl I

I 35 in vivo. I

7 DK 175533 B1

Det bør bemærkes, at £coRI/tf/ndIII-fragmentet, som blev klonet i omvendt orientering af den, som præsenteres her, således at den nederste streng, som er komplementær til oligonucleotidet, er til stede i den enkeltstrengede rekombi-5 nante bakteriophag M13.

Phagområder undersøges for hybridisering under hensigtsmæssige betingelser 32 med et oligonudeotid, der ved sin 5’-ende er mærket med P. Der udtages et vist antal positive områder, og de tilsvarende indsætninger sekventeres. Indsæt-10 ningen af én af de korrekt modificerede kloner klones igen i pTG155 ved at udskifte £coRl/H/'ndIII- fragmenterne for sluttelig at fremstille det omstrukturerede plasmid pTG155-pro. Analyse af de i dette trin forekommende kloner lettes ved tilstedeværelsen af et nyt sted for restriktionsenzymet Sau3A, som falder sammen med dam-methyleringssekvensen, der blev indført under den af 15 oligonucleotidet dirigerede mutagenese.

I plasmidet pTG155-pro er cDNA’et for det omstrukturerede rabies- glycoprotein på hver af enderne omgivet af 6g/II-steder. Ved enden nedenfor stammer BglIlstedet fra anvendelsen af det octamere adaptoroligonucleotid Bgfll/Pstl, der 20 anvendes for at klone cDNA-fragmentet Pstl/Pstl i Øg/II-stedet, og stedet ovenfor stammer fra anvendelsen af et lille dobbeltstrenget oligonudeotid, der skal eliminere G/C-enden.

Konstruktion af hybridplasmider 25

Den samlede størrelse af de forskellige segmenter, der er nødvendige til overførslen af den sekvens, som koder for rabies-glycoproteinet i VV-genomet, og den efterfølgende ekspression, er i størrelsesordenen flere kb. Det er således blev anset for nødvendigt at minimere størrelsen af plasmidet til replikation i E. coti, 30 som anvendes til konstruktionsarbejdet, for at lette de nødvendige manipulationer.

W/ndIII-fragmentet (Hin-3) fra W-genomet indeholder det komplette gen for thymidin-kinase (TK), som allerede er blevet anvendt tidligere for at muliggøre 35 udskiftning og rekombination af DNA indsat i W-genomet (Mackett et al., 1982).

I DK 175533 B1 I

I I

Det er vigtigt at bemærke, at overførslen af en indsætning i TK-genet til W- I

I genomet danner et mangelfuldt TK-virus, som kan genkendes ved simpel I

I selektion. Det har først været nødvendigt at producere et plasmid med lille I

I størrelse, som havde et unikt Hindlll-sted, der kunne anvendes til integrering af I

I 5 Hin-J W-fragmentet. Desuden var det nødvendigt at eliminere de restriktions- I

sekvensfer i plasmidet, der ikke var nødvendige, for at muliggøre følgende I

manipulationer. I

I Konstruktionen blev påbegyndt ved at gå ud fra plasmidet pML2 (Lusky og I

I 10 Botchan, 1981), som er en vektor, der er afledt af plasmidet pBR322 ved spontan I

sletning, og i hvilket segmentet mellem nudeotiderne 1089 og 2491 er gået tabt I

(fig. 4). Først blev PstI-sekvensen elimineret ved indsætning af fragmentet I

I Ahalll/AhalU fra pUC8 (Vieira og Messing, 1982) mellem to Ahalll-steder i pML2 I

og eliminering af 19 basepar. Man anvendte ,,linker-tailing"-metoden (Lathe et al., I

I 15 1984) til at indsætte en W/ndlll-linker mellem Nrul- og EcoRI- stederne, der var I

I behandlet med SI fra dette plasmid, idet BamHI- stedet blev elimineret. Dette I

giver et plasmid på 2049 basepar, som har det funktionelle β-lactamase-gen (som I

meddeler ampicillinresistens og desuden omfatter et aktivt replikations- I

initieringssted i E. coli og et unikt W/ncftll-restriktionssted). I

I 20 I

Denne konstruktion blev betegnet pTGlH. I

I Hin-J-fragmentet fra VV-DNA bærende TK-genet er i forvejen blevet klonet i en I

vektor, der var afledt af pBR327 (Drillien og Spehner, 1983). Dette fragment på I

I 25 4,6 kb blev klonet igen i W/ncflll-stedet i pTGlH. Der blev selekteret en klon, i I

I hvilken TK-genet befinder sig distalt i forhold til det gen, som koder for ampicillin- I

I resistens. I

I Denne konstruktion, pTGlH-TK, blev anvendt som bærer i følgende forsøg. I

I 30 I

Næste trin bestod i at isolere en promotor fra W, der kunne anvendes til at styre 1

I ekspressionen af den sekvens, som koder for det indsatte rabies-glycoprotein. I

I Promotoren for et tidligt gen, der koder for et protein på 7.500 dalton (7,5K) er I

I allerede blevet anvendt med held til et identisk formål (Smith et al., 1983), og I

I 35 man gik derfor videre til isolering af dette segment. I

9 DK 175533 B1

Genet 7;5K er beliggende på et af de mindste Sa/I-fragmenter (Sa/-S- fragmentet) på W-genomet af WR-type (Venkatasan et al., 1981). Da man fortrinsvis kloner de små fragmenter, bærer en stor del af de kloner, som opnås ved direkte kloning 5 af DNA fra VV af WR-type, som er skåret med Sall i plasmidet pBR322, Sal-S-fragmentet. Dette fragment overføres til bakteriophag-vektoren M13mp701 (se Kieny et al., 1983) ved Sa/I-spaltning og religering, hvilket fører til phagen M13tgSal-S.

ίο I denne klon findes der et Scal-sted umiddelbart i nærheden af initierings-ATG'et i genet 7,5K. Neden for genet 7,5K findes unikke SamHI- og EcoRI-steder, der stammer fra vektoren. BamHl- og Seal- stederne fusioneres ved hjælp af en Bg/II-linker 5'-CAGATCTG-3’ ved "linker"-teknikker, efter at de ved BamHl-spaltning genererede ender er kompletteret med Klenow-polymerasefragmentet.

15 Denne fremgangsmåde eliminerer Scal-stedet, men rekonstituerer SamHI-stedet og flytter det unikke fcoRI-sted nedad. Samtidig elimineres Sa/I-stedet (Accl) nedenfor, og stedet ovenfor bliver således unikt.

Denne konstruktion blev betegnet M13tg7,5K.

20

Inden for Hind-J-fragmentet fra DNA fra VV befinder sig C/al- og EcoRI-steder, som er adskilt med ca. 30 basepar (Weir og Moss, 1983). Promotorfragmentet 7,5K, som er til stede i M13tg7,5K, udskæres med Accl og EcoRI og klones mellem Clal- og froRI-stederne i pTGlH-TK til dannelse af pTGlH-TK-P7,5K, hvis 25 syntese er vist skematisk i fig. 5.

Denne konstruktion fører til overførsel af det unikke 5am HI-sted i vektoren M13 umiddelbart neden for sekvensen af promotoren 7,5K. Dette unikke SamHI-sted anvendes i de følgende konstruktioner.

30 pTGlH-TK-P7,5K spaltes med SamHI og ligeres med pTG155-pro, der er spaltet med Sg/II (fig. 5).

I DK 175533 B1 I

I I

Efter transformation i E. coli selekteres ét af de ved denne fremgangsmåde isole- I

rede rekombinante plasmider, pWgRAB, da det bærer cDNA’et for rabies-glyco- I

I proteinet i den korrekte orientering for ekspressionen ud fra promotoren 7,5K. I

I 5 pWgRAB betegnes undertiden pTGlH-TK-P7,5K-gRAB. I

Kloning i vacciniaviruset (fig. 6) I

H Den af Smith et al. (1983) beskrevne strategi bygger på in vivo ombytning af et I

I 10 plasmid, som har en indsætning i genet VV TK, og vildtypevirusgenomet, således I

af TK-genet, som bæres af viruset, inaktiveres. TK’-vira kan selekteres ved ud- I

pladning på en TK-negativ cellelinje i nærværelse af 5-bromdeoxyuridin (5BUDR) I

(Mackett et al., 1982). Thymidin-kinase phosphorylerer 5BUDR til S'-monophos- I

phat, som derefter omdannes til triphosphat. Denne forbindelse er en dTTP- I

15 analog, og indsætning deraf i DNA blokerer den korrekte udvikling af viruset. Et I

TK -virus kan ikke desto mindre replikere sit DNA normalt, hvilket fører til synlige I

virusplaque i et ligeledes TK* cellelag. I

I Vacciniaviruset formerer sig i inficerede cellers cytoplasma snarere end i deres I

20 kerne. Derfor er det ikke muligt at drage fordel af replikations- og transkrip- I

tionsmaskineriet for DNA fra værten, og det er nødvendigt, at virionet har I

bestanddele til ekspression af virusgenet. Oprenset DNA fra W er ikke smitsomt. I

I Til dannelse af rekombinanter er det nødvendigt samtidigt at udføre celleinfektion I

I 25 med et VV og transficering med det interessante klonede DNA-segment. Dan- I

I nelsen af rekombinanter er imidlertid begrænset til en lille del af de celler, som er I

I kompetente for transfektion med DNA. Derfor var det nødvendigt at iværksætte I

I en indirekte "kongruens"- strategi for at reducere baggrundsstøj fra ikke- I

I rekombinante stamvira. Dette blev foretaget, idet der som levende infek- I

I 30 tionsvirus blev anvendt en varmefølsom (ts) mutant af vaccinia, hvilken mutant I

ikke er i stand til at formere sig ved en utilladelig temperatur på 39,5°C (Drillien I

I og Spehner, 1983). Nar cellerne inficeres med en ts-mutant under utilladelige I

I betingelser og transficeres med DNA fra et vildtype-virus, sker der kun I

I virusmultiplikation i de celler, som er kompetente for transfektion, og i hvilke en I

11 DK 175533 B1 rekombination mellem det vilde virus-DNA og genomet fra ts-virus har fundet sted; der opnås intet resultat i de andre celler på trods af, at de er blevet inficerede. Hvis et rekombinant plasmid indeholdende et DNA-fragment fra vaccinia såsom pVVgRAB er indeholdt i transfektionsblandingen i en passende koncen-5 tration med vildtype-DNA, er det ligeledes muligt at opnå, at det deltager i den homologe rekombination med DNA’et fra vaccinia i de kompetente celler.

Enkeltlag af primære fibroblast-celler fra kyllingefostre (CEF) inficeres ved 33°C med W-Copenhague ts 26 (0,1 pfu/celle) og transficeres med et copræcipitat af 10 calciumphosphat fra vildtype-DNA W-Copenhague (0,5 pg/106 celler) og fra det rekombinante plasmid pTGlH-TK-P7,5-gRAB (3,0 pg/106 celler). Det skal bemærkes, at svagere koncentrationer (0,1 pg/106 celler) i nedenstående forsøg gav betydeligt forbedrede udbytter af rekombinanter.

15 Efter 2 timers inkubation ved en temperatur, som ikke tillader udvikling af ts-virus (39,5°C), skylles cellerne og inkuberes i 48 timer ved 39,5°C. Fortyndinger af ts+- virus anvendes til at geninficere et enkeltlag af museceller L-TK ved 37°C og inkuberes i nærværelse af 5BUDR (100 pg/ml). Der fås forskellige TK -plaques ud fra disse celler, som har modtaget det rekombinante plasmid, medens 20 kontrolkulturer uden plasmid ikke udviser synlige plaques.

En korrekt, reciprok dobbelt rekombination mellem hybridplasmidet for rabies/-vaccine og W-genomet udskifter TK-virusgenet med det TK-gen, der bæres af den indsætning, som er til stede i plasmidet. I W-genomet er TK-genet til stede 25 på et unikt tf/ndlll/W/n-J-fragment. De rekombinanter, som har overført ekspressionsblokken fra rabies- glycoproteinet, synes at have integreret et internt W/nc/III-sted, som stammer fra cDNA'et for glycoproteinet. Derfor spaltes DNA’erne, som er oprenset ud fra TK'-virus, med HindUl og underkastes elektro-forese på agarosegel. Som det var forudsagt, er F//n-J-fragmentet på 4,6 kb ikke 30 til stede, hvorimod to nye fragmenter på 1,1 og 5,5 kb afslører tilstedeværelsen af en indsætning indeholdende et internt HindlU-sted. Efter subkloning af TK -vira bevares én af rekombinanterne WgRAB-26D3.

Ekspression af rabies-glycoproteinet ud fra rekombinante vacciniavira

I DK 175533 B1 I

I 12 I

I Enkeltlag fra semikonfluente L-TK**celler inficeres med WgRAB-26D3 I

I (50 pfu/celle) i 1 time ved omgivelsestemperatur, hvorefter der tilsættes et me- I

I thionin-frit dyrkningsmiljø, og efter 30 minutter beriges hver dyrkningsskål med I

I 5 35^ L-methionin (1265 Ci/mmol), og inkubationen fortsættes ved 37°C i 4 timer. I

I Cellerne høstes og resuspenderes i en immunudfældningspuffer inde-holdende I

I protease-inhibitorer, og efter sprængning ved hjælp af ultralyd og klaring isoleres I

I de proteiner, som er fikseret af anti-rabies-antiserium, ved affi-nitetschromato- I

I grafi på en harpiks af A-protein/Sepharose® og påføres på en elektroforesegel og I

I 10 fluorograferes i henhold til den af Lathe et al. (1980) beskrevne teknik. I

I Et polyklonalt antiserium 3554-R215, som er rettet mod det på Wistar Institute I

I oprensede glycoprotein, blev anvendt ved de i fig. 7, A (a) og B viste forsøg; I

I identiske resultater (b,c) opnås med to monoklonale antistoffer, som neutraliserer I

I 15 viruset (509-6 og 101-1 fra Wistar), og som identificerer forskellige epitoper på I

I rabies-glycoproteinet. Ved A er det cellulære enkeltlag inficeret med I

I 1) rekombinanten WgRAB-26D3, I

I 2) vildtype-vacciniavirus, og I

I 20 3) intet virus. I

I Ved B er et cellulært enkeltlag inficeret med VVgRAB-26D3 og mærket i nærvæ- I

I relse (1) eller fraværelse (2) af tunicamycin (2 pg/ml). I

I 25 I (A) og (B) er standard-molekylvægtene anført i kilodalton. I

I Som det fremgår af fig. 7A, neutraliseres viruset af et polyklonalt rabies-anti- I

I serum samt to monoklonale antistoffer, og de udfælder et protein, som vandrer i I

I form af et diffust bånd med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 66.000 dalton. I

I 30 Denne molekylvægt svarer præcist til molekylvægten, 67.000 dalton, af et auten- I

I tisk rabies-glycoprotein. I

I Eftersom molekylvægten af det naturlige glycoprotein og rekombinanten stemmer I

I overens, er det blevet bekræftet, at det rekombinante glycoprotein blev glyco- I

13 DK 175533 B1 syleret in vivo. Et cellulært enkeltlag blev inficeret med WgRAB-26D3 som ovenfor, og til miljøet blev der før mærkningen tilsat en kraftig glycosylerings-inhibitor, tunicamycin (2 pg/ml). De inficerede celleekstrakter immunudfældes under anvendelse af et polyklonalt antistof, og produktet anbringes på en elek-5 troforesegel som beskrevet ovenfor. Som det fremgår af fig. 7B, fører tilsætning af tunicamycin til miljøet til en reduktion af molekylvægten af det rekombinante protein på 66.000 dalton, hvilket svarer til eliminering af proteinets giycosylerede grupper. Det kan således konkluderes, at det rekom-binante rabies-glycoprotein gtycosyleres i de med VVgRAB inficerede celler. For-skellige andre bånd i linje (1) 10 antages at være produkter fra nedbrydningen af det ikke-glycosylerede rabiesantigen.

I et andet forsøg inficeres et enkeltlag af L-TK -celler med VVgRAB- 26D3 (105 pfu pr. plaque indeholdende 106 celler) og inkuberes i 8 timer ved 37°C. Cellerne fik-15 seres og behandles med monoklonale og polyklonale antistoffer, og efter grundig vask detekteres det fikserede antistof ved anvendelse af et andet antistof (gede-antimus), som er mærket med fluorescein. Størstedelen af de med rekombinanten VVgRAB-26D3 inficerede celler (A) udviser signifikant fluorescens, medens de ikke-inficerede celler (C) og cellerne inficeret med ikke- rekombinante vira (B) 20 ikke udviser fluorescens.

Som det fremgår af fig. 8, er fluorescensen fortrinsvis forbundet med cytoplasmamembranen, hvilket man kunne forvente af et transmembran-protein.

25 Immunologiske egenskaber in vivo af det levende vaccinia/rabies-hybridvirus

Kaniner immuniseres intradermalt med 3 x 107 pfu WgRAB-26D3, og der udtages serumprøver efter 0, 11 og 14 dage. Der iagttages en tydelig hævelse på infektionsstedet, som biiver mindre efter 8-9 dage. En rabies-virusstamme ERA, som 125 30 er inaktiveret med β-propiolacton og mærket med I i henhold til standardfremgangsmåden, testes for sin reaktion med serum fra de immuniserede dyr.

De fikserede proteiner anbringes på elektroforesegel og autoradiograferes.

I DK 175533 B1 I

I 14 I

I Serummet fra kontroldag 11 og 14, men ikke serummet fra kontroldag 0, viser sig I

I at genkende og effektivt fiksere det radiomærkede virus- glycoprotein. Serum fra I

I kontroldyrene, som er immuniseret med den ikke-rekombinante vacciniavirus af I

I Copenhague-typen giver ikke sidanne reaktioner. Serum fra dyr, der er immuni- I

I 5 seret som beskrevet ovenfor, testes derefter for inaktivering af rabies-viruset I

I in vitro. Fortyndinger af rabiesstammen ERA præinkuberes i 1 time med forskel- I

I lige mængder kanin-antiserum og udplades på celler fra nyrer fra nyfødte ham- I

I stere (BHK) pi mikrotiterplader (103 celler/brønd). Efter inkubation ved 37°C i 22 I

I timer farves de producerende inficerede celler under anvendelse af en teknik til I

I 10 direkte immunofluorescens. I

I Tabel I viser, at der selv med de højeste fortyndinger af antiserummet fra kon- I

I troldag 11 og 14 opnas fuldstændig inaktivering af viruset. De præimmune og I

I ikke-rekombinante sera giver ingen detekterbar neutralisering. Tallene er angivet I

I 15 som den stærkeste fortynding, ved hvilken der iagttages inhibering af infektionen. I

I TABEL I I

I Antal dage ef- VVgRAB-26D3 Vildtype- I

I 20 ter vaccination Kanin I Kanin II Kanin III Kanin IV vaccine I

I 000000 I

I 11 10000 10000 10000 10000 o I

I 14 >30000 >30000 >30000 >30000 0 I

25 -- I

I Disse resultater viser, at rekombinanten VVgRAB-26D3 ikke blot inducerer I

I dannelse af antistoffer, som reagerer med rabiesviruset, men også at antiserum

I fra immuniserede dyr er i stand til at inaktivere rabiesvirus in vitro. Induktion af I

I 30 neutraliserende antistof hænger ikke altid sammen med en beskyttelse mod I

I udvikling af sygdommen. Derfor blev der udført et direkte studium af en beskyt- I

I telsestest under anvendelse af det rekombinante virus. Mus immuniseres ved I

I injektion i poten eller indgnidning på halen med 107 pfu levende WgRAB-26D3. I

I Dyrene inokuleres derefter med en letal dosis (1000 enheder, DL50) af en vild I

I 35 rabiesvirus, der indføres ved intracerebral injektion. Efter 10 dage har kontrol- I

15 DK 175533 B1 dyrene, som er immuniseret med den ikke-rekombinante vaccinia, en terminal rabiesinfektion, hvorimod 15 ud af de 15 dyr, der blev immuniseret med WgRAB-26D3, ikke viser nogen tegn på sygdom.

5 Det kan således konkluderes, at immunisering med den levende rekombinante vaccinia/rabiesvirus fører til beskyttelse mod rabies.

Immunologiske egenskaber in vivo af inaktiveret vaccinia/rabies-hybridvirus 10 Der kan fremstilles tre typer inaktiveret vaccine ud fra celler inficeret med den rekombinante vaccinia/rabiesvirus: 1) en råekstrakt fra inficerede celler, 2) det intakte oprensede virus og 3) det oprensede glycoprotein 6. De tre præparater inaktiveres med β-propiolacton.

15 - BHK-celler, som er inficeret med WgRAB-26D3, homogeniseres i en

Dounce-formaler, og supernatanten fra centrifugeringen udgør den rå celleekstrakt.

For at få dræbt oprenset virus inaktiveres dette præparat med β-propiolacton 1/4000 og centrifugeres på en saccharosegradient i henhold til 20 kendte teknikker.

Det oprensede glycoprotein G fås ved solubilisering af råekstrakten i nærværelse af 2% Triton® X-100. Efter 1 times centrifugering ved 100.000 x g isoleres G fra supernatanten ved passage på en affinitetssøjle, der er fremstillet med et anti-G monoklonalt antistof. Dette 25 oprensede glycoprotein g inaktiveres også med β-propiolacton.

Mus immuniseres ved 2 intraperitoneale injektioner med 0,5 ml af disse inakti-verede præparater med 1 uges mellemrum og underkastes prøven 1 uge senere (240 enheder DL50) ad intracerebral vej.

30

I DK 175533 B1 I

I 16 I

I Tabel II viser anti-rabies-antistof målt på dag 7 og 14. I

I TABEL II I

I 5 Mængde proteiner in- Anti-rabies- I

I jiceret i pg/mus antistof-titer I

I Dag 7 Dag 14 I

I WgRAB-26D3 140 80 8.000 I

I 10 råekstrakt I

I WgRAB-26D3 9 270 4.000 I

I oprenset virus I

I 15 WgRAB-26D3 50 120 15.000 I

I G oprenset I

I Vaccine af Copenhague- 900 10 10 I

I typen, råekstrakt I

I 20 - I

I Alle de dyr, som er vaccineret med de forskellige vaccinepræparater, der er inak- I

I tiveret og afledt af WgRAB-26D3, overlever intracerebral injektion af rabiesvirus, I

I medens dyr fra kontrolgruppen dør inden for det forventede tidsrum. I

I 25 I

I Det er vigtigt at bemærke, at hybridviruset WgRAB-26D3, selv når det er inak- I

I tiveret, giver effektiv beskyttelse mod rabiesinfektion ved forsøgene. Dette viser, I

I at rabies-glycoproteinet i det intakte rekombinante virus forekommer på over- 1

I fladen af virionet og er i stand til at inducere et immunologisk respons, som ligner I

I 30 det, der induceres af det inaktiverede rabiesvirus. I

I Vaccination af ræve og oral vaccination I

17 DK 175533 B1 I Vesteuropa er ræve hovedårsagen til udbredelsen af rabies. Det er derfor altafgørende at kunne kontrollere vaccinationen af ræve. Dette sker fortrinsvis oralt for at minimere berøring af dyrene.

5 Røde ræve (Vulpes vulpes) med en alder på under 1 år immuniseres ad forskellige veje med 10® pfu levende WgRAB-26D3. Kontrollerne udgøres af 2 ræve, der er vaccineret med kendt dræbt antirabiesvaccine, og af 4 ræve, der er vaccineret med vildtype-vaccinia.

10 I tabel III anføres anti-rabies-antistoftiteret målt på dag 7, 14 og 28. Tabellen viser, at det rekombinante vaccinia/rabiesvirus hos ræve ligesom hos mus inducerer dannelse af antistof, som kan sammenlignes med det, der induceres af den kendte vaccine.

15 De vaccinerede dyr underkastes på dag 28 en test med injektion af virulent rabiesvirus.

De ræve, der er vaccineret med vildtype-virus, dør inden for det forventede tidsrum. Alle de ræve, der er vaccineret med den kendte dræbte vaccine eller med 20 WgRAB-26D3 (selv ræv 2), som er inokuleret subkutant, og som ikke havde serumneutraliserende antistoffer) er levende 2 måneder efter forsøget.

I DK 175533 B1 I

I I

I Antistoftiter* I

I Anvendt vaccine Inokulationsvej Dag 6 Dag 14 Dag 28 I

I 5 Kendt dræbt subkutant 1) 0,33 0,64 0,24 I

I 2) 0,07 0,05 0,07 I

I Vildtype-vaccine intradermalt ...

I 10 VVgRAB-26D3 intradermalt 1) 0,64 6,1 4,4 I

I 2) 0,05 0,6 1,67 I

I WgRAB-26D3 subkutant 1) 0,46 2,32 4,3 I

I 2) - I

I 15 I

I WgRAB-26D3 oralt med ska- I

I rifikation af I

I mucosa 1) 0,33 0,88 1,67 I

I 2) 0,24 0,88 2,31 I

I 20 --- I

I *) Antistoftiterne er udtrykt i internationale enheder (referenceserum - 65

I -4 2 I

I IU - neutraliserende ved 10 ' ).

I Følgende stamme er den 30. september 1983, under deponeringsnummeret I

I 25 1-248, deponeret hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes I

I (CNCM), 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15: E. colt TGE1106 I

I transformeret med pTG171. I

19 DK 175533 B1

REFERENCER

A. Anilionis, W.H. Wunner & PJ. Curtis, Nature 294, 1981, s. 275- 278.

R. Drillien & D. Spehner, Virology 131, 1983, s. 385-393.

5 M.P. Kieny, R. Lathe & J.P. Lecocq, Gene 26, 1983, s. 91-99.

V. Kohli, A. Balland, M. Wintzerith, R. Sauerwald, A. Staub & J.P. Lecocq, Nucleic Acids Res. 10, 1982, s. 7439-7448.

M. Kozak, Nucleic Acids Res. 9, 1981, s. 5233-5252.

M. Kozak, Microbiol. Rev. 47, 1983, s. 1-45.

10 R. Lathe, P. Hirth, M. Dewilde, N. Harford & J.P. Lecocq, Nature 284, 1980, s.

473-474.

R. Lathe, A. Bailand, V. Kohli & J.P. Lecocq, Gene 20, 1982, s. 187-195.

R. Lathe, M.P. Kieny, D. Schmitt, P. Curtis & J.P. Lecocq, J. Mol. Appl. Genet, 1984a, under trykning.

15 R- Lathe, M.P. Kieny, S. Skory & J.P. Lecocq, DNA, 1984a, under trykning.

M. Lusky & M. Botchan, Nature 293, 1981, s. 79-81.

M. Mackett, J.L. Smith & B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, s. 7415-7419.

D. Panicali & E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, s. 4927-4931.

20 D. Panicali, S.W. Davis, R.L. Weinberg & E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, s. 5364-5368.

G.L. Smith, M. Mackett & V. Moss, Nature 302, 1983, s. 490-495.

Soberon et al., Gene 9, 1980, s. 287-305.

S. Venkatesan, B.M. Baroudy & B. Moss, Cell 125, 1981, s. 805-813.

25 J. Vieira & J. Messing, Gene 19, 1982, s. 259-268.

J.P. Weir & B. Moss, J. Virol. 46, 1983, s. 530-537.

T. J. Wiktor, Develop. Biol. Standard 40, 1978, s. 255-264.

T.J. Wiktor, i Rhabdoviruses III, 1980, s. 99-112, red. D.H.L. Bishop, CRC Press,

Inc.

30 W.H. Wunner, B. Dietzschold, PJ. Curtis &T.J. Wiktor, J. Gen. Virol. 64, 1983, s. 1649-1659.

E. Yelverton, S. Norton, J.F. Obijeski & D.V. Doeddel, Science 219, 1983, s. 614-620.

M.J. Zoller & M. Smith, i Methods in Enzymology 100, 1983, s. 468-500, red. R.

35 Wu, L. Grossman, K. Moldave, Academic Press, London.

DK 175533 B1 I

F. Keller, R. Drillien & A. Kirn, Thermosensibilité du développement des poxvirus I

et virulence. Utilisation de souches thermosensibies comme vaccin. Rencontre

Biologique, 1978 (L. Hartmann), s. 121-126, red. Varia, Paris. I

F. Keller & R. Drillien, Un mutant thermosensible atténué du virus vaccinal. Ann. I

5 Virol. (INSTITUT PASTEUR), 1980, 131 E, s. 85-94. I

Claims

20 DK 175533 B1

1. Vaccine til behandling eller forebyggelse af rabies, kendetegnet ved, at den består af et rekombinant vacciniavirus, som omfatter en DNA-sekvens I, som koder for et glycoprotein G fra rabiesvirus.

2. Vaccine ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at den DNA-sekvens, som koder for rabies-glycoprotein G, er den DNA-sekvens, som koder for det komplette modne glycoprotein.

3. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen I er under kontrol af en promotor fra 20 vaccinia.

4. Vaccine ifølge krav 3, kendetegnet ved, at promotoren fra vaccinia er promotoren for genet fra proteinet 7,5K fra vaccinia. 25

5. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at sekvensen, som koder for rabies-glycoprotein G, er indsat i et ikke-essentielt gen fra vaccinia.

6. Vaccine ifølge krav 5, kendetegnet ved, at sekvensen, som koder for rabies-glycoprotein G, er klonet i TK-genet fra vaccinia.

7. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 35 kendetegnet ved, at vacciniaviruset er varmefølsomt. --------- DK 175533 B1 I

8. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, I kendetegnet ved, at viruset er levende. I

9. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, H kendetegnet ved, at viruset er inaktiveret. I