JP2024504566A

JP2024504566A - 核酸ワクチン

Info

Publication number: JP2024504566A
Application number: JP2023536901A
Authority: JP
Inventors: フレデリクサンダーバーテルセン，アダム; アーゲルトーニールセン，モータン; ゴッソイー，ルイーズ; エリエッテフジュルー，サイリーレ; ジョン，ウィレムエイドリアーンデ
Original assignee: ユニバーシティオブコペンハーゲン; アダプトヴァクエーピーエス
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2024-02-01
Also published as: MX2023007319A; EP4262856A1; IL303557A; CA3202379A1; US20240108718A1; WO2022129547A1; AU2021402072A9; KR20230122019A; AU2021402072A1

Abstract

本発明は、疾患及び障害の予防及び／または治療に特に有用な、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸に基づくナノ粒子ベースのモジュラー組成物に関連する。【選択図】図１

Description

本発明は、疾患及び障害の予防及び／または治療に特に有用な、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸に基づくナノ粒子ベースのモジュラー組成物に関連する。

ワクチンは依然として、感染症の蔓延を防止及び制御するための最も効果的な手段である。弱毒生ワクチンは免疫原性が高く、１回の予防接種でも長寿命の抗体反応を誘導する。対照的に、最新のサブユニットワクチン（すなわち、可溶性タンパク質抗原に基づく）は高い安全性を示すが、免疫原性低く、ヒトにおいて同様の持続的な抗体反応を誘導できない。従って、単純なサブユニットワクチンでは、病原体や疾患関連抗原に対する強力かつ持続的な免疫応答を誘導することは非常に困難である。

しかし、認可されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン（Ｃｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）、Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）、及びＧａｒｄａｓｉｌ９（登録商標））は弱毒生ワクチンに匹敵する免疫原性を持ち、単回投与でもヒトにおいて非常に強力かつ耐久性のある抗体反応を誘導する可能性があるため、これは重要な例外である（Ｓｃｈｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，２０１８，Ｓｃｈｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，２０１２，ＤｅＶｉｎｃｅｎｚｏｅｔａｌ．，２０１４）。重要なことに、このワクチンはウイルス様粒子（ＶＬＰ）へのＨＰＶ主要カプシドタンパク質の自己組織化によって形成され、これがこのワクチンの高い効力の原因であると考えられている。

実際多くの研究により、ＶＬＰの高い免疫原性と、ネイティブウイルスとの構造的類似性との間の強い因果関係が確立されており、自己抗原を含む異種抗原提示のための足場としてＶＬＰを利用するいくつかの戦略が追求されてきた。これらの研究は、多価、反復抗原表示が、実際に抗原の免疫原性を大幅に増加させ、長期にわたる免疫を誘導することも可能であることを総合的に示している。

以前、ＶＬＰの表面に一方向的、多価的及び反復的な方法で抗原を付着させるための分割タンパク質（タグ／キャッチャー）コンジュゲーション技術を使用したＶＬＰベースのモジュラーワクチンプラットフォームの開発について記載した（ＷＯ２０１６／１１２９２１）。今日まで、この技術は非常に強力かつ汎用性の高いワクチンプラットフォームとなっている。

ＤＮＡ及び／またはＲＮＡベースのワクチンは、タンパク質ベースのワクチンとは対照的に、ワクチン抗原の組換発現及び精製のステップが省略される簡便かつ低コストな製造により、大きな利点を有している。実際、臨床ワクチンのバッチは通常、抗原をコードする配列が利用可能になった直後には、すでに生成可能である。更なる利点は、製造工程の拡張性が高く、細胞を使用しないことである。更に、一施設で複数の異なるワクチンを製造するには、製造工程を特定のワクチン製剤に対して最小限に適合させるだけで済む。最後に、現在の発現系では組み換えによる生成が困難または不可能な複雑なタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現が、これらのワクチンでは可能である。

しかしこれまでのところ、ＤＮＡワクチンは、ヒト及びヒト以外の霊長類で試験した場合、抗原に対して比較的弱い免疫応答しか誘導しないことが示されているため、商業的利用が制限されている。

従って、多価微粒子ワクチンの高い免疫原性と、核酸ベースのワクチンに関連する製造上の利点とを組み合わせたワクチンが緊急に必要とされている。

本発明は、核酸ベースのワクチンを提供し、これは、ワクチン接種中に真核細胞に送達されると、分割タンパク質タグ／キャッチャーのコンジュゲーションシステムを利用することにより、一方向的、反復的及び多価的な方法でワクチン抗原を表示する自己集合ナノ粒子に翻訳される。

反復的な多価抗原表示は、ワクチン抗原の免疫原性を高め、ワクチン接種後の強力な抗原特異的免疫応答の誘導を可能にする。同時に、核酸（ＤＮＡ及び／またはｍＲＮＡ）ベースのワクチン技術は、ワクチン抗原の組換生産に関連する上流及び下流工程を省略できるため、製造において大きな利点を有する。更に、核酸配列としてのワクチン抗原の送達は、コードされたタンパク質のｉｎｖｉｖｏ翻訳を可能にし、さもなければ組み換え生成が困難または不可能になる場合がある。

本明細書では、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み、
前記抗原及び前記タンパク質は、細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、組成物が提供される。

本明細書では、組成物を必要とする対象の疾患の予防及び／または治療に使用するための、本明細書に開示される前記組成物も提供される。

本明細書では、前記組成物を必要とする対象の疾患を予防または治療する方法も提供される。

本明細書では、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み、
前記第１及び前記第２のポリヌクレオチドが細胞内で発現すると、前記抗原及び前記タンパク質は、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、発現系も提供される。

本明細書では、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行請求項のいずれか１項に定義される前記第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行請求項のいずれか１項に定義される前記第２のポリヌクレオチドと、を発現する細胞であって、
前記抗原及び前記タンパク質は、前記細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、前記細胞も提供される。

本明細書では、本明細書に開示される発現系を含む宿主細胞も提供される。

本明細書では、組成物を必要とする対象の疾患の予防及び／または治療に使用するための前記組成物の投与方法であって、
ｉ．本明細書に開示される少なくとも１つの前記組成物を得るステップと、
ｉｉ．本明細書で定義される疾患の予防及び／または治療のために、前記組成物を対象に少なくとも１回投与するステップと、を含む前記投与方法も提供される。

本明細書では、
ｉ．本明細書で定義される組成物または発現系と、
ｉｉ．任意的に、前記組成物を投与するための医療器具またはその他の手段と、
ｉｉｉ．使用説明書と、を含むパーツのキットも提供される。

ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣ）－ｅＧＦＰ及びＳｐｙｔａｇｇｅｄ（ＳｐｙｔＴ）ＨＢｃｏｒｅによるコトランスフェクションの７２時間後のＣ２Ｃ１２マウス細胞の共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）。写真は、核周囲分布を有する明確な微粒子高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の蛍光信号を示す（すべてのパネル）。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣ）－ｅＧＦＰ及びＳｐｙｔａｇｇｅｄ（ＳｐｙｔＴ）ＡＰ２０５によるコトランスフェクションの７２時間後のＣ２Ｃ１２マウス細胞の共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）。写真は、細胞全体のｅＧＦＰ蛍光による均一な緑色のスメアを示す（すべてのパネル）。スケールバーは５０μｍを示す。Ｓｐｙｔａｇｇｅｄ（ＳｐｙｔＴ）ＡＰ２０５コートタンパク質及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣ）－ｅＧＦＰによってコトランスフェクションされた、超音波処理されたＣ２Ｃ１２細胞の超遠心分離前（ＵＣ入力）及び超遠心分離後（ＵＣ）の画分（３－２１及び３１）における、ｅＧＦＰの検出のためのポリクローナル抗ｅ－ＧＦＰ抗体でプローブされたウエスタンブロット（ＷＢ）。ｅＧＦＰの理論上のサイズは４１ｋＤａだが、ｅＧＦＰ及びＡＰ２０５のコンジュゲーションは５９ｋＤａになる。約５９ｋＤａのバンドはｅＧＦＰで毎週見られ、ＵＣ入力サンプルで更に強く見られるが、ＵＣ後の画分サンプルでは見られない。すなわち、ｅＧＦＰが結合したＡＰ２０５粒子が形成されたという兆候はない。Ｓｐｙｔａｇｇｅｄ（ＳｐｙｔＣ）ＨＢｃｏｒｅ抗原及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣ）－ｅＧＦＰによってコトランスフェクションされた、超音波処理されたＣ２Ｃ１２細胞の超遠心分離前（ＵＣ入力）及び超遠心分離後（ＵＣ）の画分（３－２１及び３１）における、ｅＧＦＰの検出のためのポリクローナル抗ｅ－ＧＦＰ抗体でプローブされたウエスタンブロット（ＷＢ）。ｅＧＦＰの理論上のサイズは４１ｋＤａだが、ｅＧＦＰ及びＨＢｃｏｒｅ抗原のコンジュゲーションは６４ｋＤａである。約６４ｋＤａのバンドは、ＵＣ入力サンプルとＵＣ後の画分に見られ、コンジュゲーションしたＳｐｙＴＨＢｃ及びＳｐｙＣｅＧＦＰタンパク質から微粒子構造が形成されたことを示している。ｐＶＡＸ１（Ｖ２６０２０、ｔｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のベクターマップ。ＣＭＶプロモーター：塩基１３７－７２４、Ｔ７プロモーター／プライミングサイト：塩基６６４－６８３、マルチクローニングサイト：塩基６９６－８１１、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）リバースプライミングサイト：塩基８２３－８４０、ＢＧＨポリアデニル化シグナル：塩基８２９－１０５３、カナマイシン耐性遺伝子：塩基１２２６－２０２０、ｐＵＣ起源：塩基２３２０－２９９３。プラスミドＤＮＡからの粒子形成サブユニットタンパク質の発現。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後の、粒子形成サブユニットのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞は、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－ｃｔａｇ。一次抗体：ａＳｐｙＣ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：３５．７ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清サンプルで予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの粒子形成サブユニットタンパク質の発現。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後の、粒子形成サブユニットのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞は、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ｔａｎｄｅｍＨＢｃ－ＳｐｙＣ。一次抗体：ａＨＢｃ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：５２．３ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清サンプルで予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの粒子形成サブユニットタンパク質の発現。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後の、粒子形成サブユニットのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞は、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ｔａｎｄｅｍＨＢｃ－ＳｐｙＣ。一次抗体：ａＨＢｃ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：２３．１２ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清サンプルで予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの粒子形成サブユニットタンパク質の発現。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後の、粒子形成サブユニットのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞は、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ９－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ－ＳｐｙＣ。一次抗体：ａＳｐｙＣ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：３２．６ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清サンプルで予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの可溶性タンパク質の発現。ＨＥＫ細胞におけるプラスミドＤＮＡトランスフェクション後の可溶性タンパク質のウエスタンブロット画像。ＨＥＫ細胞に、可溶性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、可溶性タンパク質の検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：３０．８ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清で予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの可溶性タンパク質の発現。ＨＥＫ細胞におけるプラスミドＤＮＡトランスフェクション後の可溶性タンパク質のウエスタンブロット画像。ＨＥＫ細胞に、可溶性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、可溶性タンパク質の検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：２９ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清で予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの可溶性タンパク質の発現。ＨＥＫ細胞におけるプラスミドＤＮＡトランスフェクション後の可溶性タンパク質のウエスタンブロット画像。ＨＥＫ細胞に、可溶性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、可溶性タンパク質の検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ。一次抗体：ａＳｐｙＣ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：１５．４ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清で予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの可溶性タンパク質の発現。ＨＥＫ細胞におけるプラスミドＤＮＡトランスフェクション後の可溶性タンパク質のウエスタンブロット画像。ＨＥＫ細胞に、可溶性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、可溶性タンパク質の検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ。プライマリ抗体：ａＣｔａｇ－ビオチン。二次抗体：ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：２４．３ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清で予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。プラスミドＤＮＡからの可溶性タンパク質の発現。ＨＥＫ細胞におけるプラスミドＤＮＡトランスフェクション後の可溶性タンパク質のウエスタンブロット画像。ＨＥＫ細胞に、可溶性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。細胞及び上清をトランスフェクションの６日後に収穫し、ＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、可溶性タンパク質の検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：４１．７ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清で予想されるサイズのバンドを示しているため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ細胞における粒子形成サブユニットタンパク質の発現及び分泌を示している。異なる粒子形成タンパク質に対するｅＧＦＰのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したｅＧＦＰのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ｅＧＦＰ＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を回収した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＧＦＰの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ及びｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－フェリチン。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：６２ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したｅＧＦＰの、予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクションした後に、対応するタグ／キャッチャーを持つｅＧＦＰ及び粒子をｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するｅＧＦＰのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したｅＧＦＰのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ｅＧＦＰ＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を回収した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＧＦＰの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ及びｓｉｇｎ８－Ｈｂｃ－ＳｐｙＴ。一次抗体：ａＨＢｃ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：６４．８ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したｅＧＦＰの、予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクションした後に、対応するタグ／キャッチャーを持つｅＧＦＰ及び粒子をｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するｅＧＦＰのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したｅＧＦＰのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ｅＧＦＰ＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を回収した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＧＦＰの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ｔａｎｄｅｍＨＢｃ－ＳｐｙＣ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：８３．１ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したｅＧＦＰの、予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクションした後に、対応するタグ／キャッチャーを持つｅＧＦＰ及び粒子をｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するｅＧＦＰのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したｅＧＦＰのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ｅＧＦＰ＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を回収した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＧＦＰの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－ｃｔａｇ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：６６．５ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したｅＧＦＰの、予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクションした後に、対応するタグ／キャッチャーを持つｅＧＦＰ及び粒子をｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するｅＧＦＰのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したｅＧＦＰのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ｅＧＦＰ＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を回収した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＧＦＰの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：７２．４５ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したｅＧＦＰの、予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクションした後に、対応するタグ／キャッチャーを持つｅＧＦＰ及び粒子をｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するｅＧＦＰのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したｅＧＦＰのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ｅＧＦＰ＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を回収した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＧＦＰの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－ＬＳ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：６１．７ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したｅＧＦＰの、予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＨＥＫ細胞にコトランスフェクションした後に、対応するタグ／キャッチャーを持つｅＧＦＰ及び粒子をｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するＳｐｙＣのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したＳｐｙＣのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ＳｐｙＣをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞および上清を収穫した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＳｐｙＣの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２。一次抗体：ａＨｉｓ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：４６．１５ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したＳｐｙＣの予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＳｐｙＣ及び対応するタグ／キャッチャーを有する粒子を、ＨＥＫ細胞でのコトランスフェクション後にｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するＳｐｙＣのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したＳｐｙＣのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ＳｐｙＣをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞および上清を収穫した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＳｐｙＣの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２。一次抗体：ａＨｉｓ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：３５．４ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したＳｐｙＣの予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＳｐｙＣ及び対応するタグ／キャッチャーを有する粒子を、ＨＥＫ細胞でのコトランスフェクション後にｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するＳｐｙＣのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したＳｐｙＣのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ＳｐｙＣをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞および上清を収穫した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＳｐｙＣの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ８－Ｈｂｃ－ＳｐｙＴ。一次抗体：ａＨｉｓ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：３８．５ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したＳｐｙＣの予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＳｐｙＣ及び対応するタグ／キャッチャーを有する粒子を、ＨＥＫ細胞でのコトランスフェクション後にｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するＳｐｙＣのコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したＳｐｙＣのウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、ＳｐｙＣをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞および上清を収穫した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合したＳｐｙＣの検出に使用した。サンプル：ｓｉｇｎ８－Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ－ＳｐｙＴ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ。一次抗体：ａＨｉｓ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：７８．１６ｋＤａ。写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したＳｐｙＣの予想されるサイズのバンドを示している。これは、ＳｐｙＣ及び対応するタグ／キャッチャーを有する粒子を、ＨＥＫ細胞でのコトランスフェクション後にｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。異なる粒子形成タンパク質に対するＰｆｓ２５のコンジュゲーションの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合したＰｆｓ２５のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するキャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞および上清を収穫した。ＨＲＰに結合した関連抗体は、粒子形成サブユニットに結合したＰｆｓ２５の検出に使用した。Ａ．サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ及びｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ。一次抗体：ａＣｔａｇ－ｂｉｏｔｉｎ。二次抗体：ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：５６．９ａ。Ｂ．サンプル：ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－Ｃｔａｇ及びｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ。一次抗体：ａＣｔａｇ－ｂｉｏｔｉｎ。二次抗体：ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：６０ｋＤａ。これらの写真は、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したＰｆｓ２５の予想されるサイズのバンドを示している。これは、Ｐｆｓ２５及び対応するタグ／キャッチャーを有する粒子を、ＨＥＫ細胞でのコトランスフェクション後にｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。超遠心分離（ＵＣ）及びＷＢによるナノ粒子形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞に、粒子形成サブユニットタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットの検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－Ｃｔａｇ。一次抗体：ａＳｐｙＣ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：３６ｋＤａ。写真は、すべての構築物での粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後、粒子サブユニットの発現及び分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで粒子の形成もあったことを示している。超遠心分離（ＵＣ）及びＷＢによるナノ粒子形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞に、粒子形成サブユニットタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットの検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ８－ｔａｎｄｅｍＨＢｃ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ。一次抗体：ａＨＢｃ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：５２ｋＤａ。写真は、すべての構築物での粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後、粒子サブユニットの発現及び分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで粒子の形成もあったことを示している。超遠心分離（ＵＣ）及びＷＢによるナノ粒子形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞に、粒子形成サブユニットタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットの検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ９－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ－ＳｐｙＣ。一次抗体：ａＳｐｙＣ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：３２．６ｋＤａ。写真は、すべての構築物での粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後、粒子サブユニットの発現及び分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで粒子の形成もあったことを示している。ＵＣ及びウエスタンブロット（ＷＢ）によるナノ粒子の結合形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のＷＢ画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した抗原の検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ６２ｋＤａ。写真は、すべての構築物での結合した粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後、粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現ならびに分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。ＵＣ及びウエスタンブロット（ＷＢ）によるナノ粒子の結合形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のＷＢ画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した抗原の検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２。一次抗体：ａＨｉｓ－ＨＲＰ。予想されるサイズ４６．１５ｋＤａ。写真は、すべての構築物での結合した粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後、粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現ならびに分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。ＵＣ及びウエスタンブロット（ＷＢ）によるナノ粒子の結合形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のＷＢ画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した抗原の検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ＋ｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ。一次抗体：ａＨｉｓ－ＨＲＰ。予想されるサイズ３５．４ｋＤａ。写真は、すべての構築物での結合した粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後、粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現ならびに分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。ＵＣ及びウエスタンブロット（ＷＢ）によるナノ粒子の結合形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のＷＢ画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した抗原の検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ。一次抗体：ａＣｔａｇ－ｂｉｏｔｉｎ。二次抗体：ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ。予想されるサイズ５６．９ｋＤａ。写真は、すべての構築物での結合した粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後、粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現ならびに分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。ＵＣ及びウエスタンブロット（ＷＢ）によるナノ粒子の結合形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のＷＢ画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した抗原の検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ。一次抗体：ａＣｔａｇ－ｂｉｏｔｉｎ。二次抗体：ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ。予想されるサイズ６０ｋＤａ。写真は、すべての構築物での結合した粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後、粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現ならびに分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。ＵＣ及びウエスタンブロット（ＷＢ）によるナノ粒子の結合形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のＷＢ画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した抗原の検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２＋ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ７２．４５ｋＤａ。写真は、すべての構築物での結合した粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後、粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現ならびに分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。ＵＣ及びウエスタンブロット（ＷＢ）によるナノ粒子の結合形成の検証。ＨＥＫ細胞をトランスフェクションした上清からのＵＣ画分のＷＢ画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。各画分は、ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した抗原の検出に使用したＷＢで実行した。何らかの粒子が形成された場合、対応するサイズのバンドが３～８の画分で予想される。サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２＋ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想されるサイズ６１．７ｋＤａ。写真は、すべての構築物での結合した粒子形成を示しており、関連する画分（３－８）に予想されるサイズのバンドが存在することが分かる。従ってこれは、ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後、粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現ならびに分泌だけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子形成の可視化。プラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ細胞からのＵＣ精製上清の電子顕微鏡画像。ＨＥＫ細胞を、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクションするか、または可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。粒子を含む画分をプールし、ＴＥＭ画像用に１ｘＰＢＳに透析した。サンプル：ｓｉｇｎ９－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ－ＳｐｙＣ。予想されるサイズ：１２ｎｍ。写真は、トランスフェクションまたはコトランスフェクションされた細胞のＳＮで形成された予想されるサイズの粒子を示している。従って本発明者らは、プラスミドＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたはコトランスフェクションした細胞の上清で、粒子及び結合粒子を形成することができることを更に確認することができる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子形成の可視化。プラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ細胞からのＵＣ精製上清の電子顕微鏡画像。ＨＥＫ細胞を、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクションするか、または可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。粒子を含む画分をプールし、ＴＥＭ画像用に１ｘＰＢＳに透析した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ＋ｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ。予想されるサイズ：１２ｎｍ。写真は、トランスフェクションまたはコトランスフェクションされた細胞のＳＮで形成された予想されるサイズの粒子を示している。従って本発明者らは、プラスミドＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたはコトランスフェクションした細胞の上清で、粒子及び結合粒子を形成することができることを更に確認することができる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子形成の可視化。プラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ細胞からのＵＣ精製上清の電子顕微鏡画像。ＨＥＫ細胞を、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクションするか、または可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。粒子を含む画分をプールし、ＴＥＭ画像用に１ｘＰＢＳに透析した。サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２＋ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ。予想されるサイズ：１２ｎｍ。写真は、トランスフェクションまたはコトランスフェクションされた細胞のＳＮで形成された予想されるサイズの粒子を示している。従って本発明者らは、プラスミドＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたはコトランスフェクションした細胞の上清で、粒子及び結合粒子を形成することができることを更に確認することができる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子形成の可視化。プラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ細胞からのＵＣ精製上清の電子顕微鏡画像。ＨＥＫ細胞を、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクションするか、または可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。粒子を含む画分をプールし、ＴＥＭ画像用に１ｘＰＢＳに透析した。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ。予想されるサイズ：１２ｎｍ。写真は、トランスフェクションまたはコトランスフェクションされた細胞のＳＮで形成された予想されるサイズの粒子を示している。従って本発明者らは、プラスミドＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたはコトランスフェクションした細胞の上清で、粒子及び結合粒子を形成することができることを更に確認することができる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子形成の可視化。プラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ細胞からのＵＣ精製上清の電子顕微鏡画像。ＨＥＫ細胞を、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクションするか、または可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。粒子を含む画分をプールし、ＴＥＭ画像用に１ｘＰＢＳに透析した。サンプル：ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－Ｃｔａｇ＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ。予想されるサイズ：２５ｎｍ。写真は、トランスフェクションまたはコトランスフェクションされた細胞のＳＮで形成された予想されるサイズの粒子を示している。従って本発明者らは、プラスミドＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたはコトランスフェクションした細胞の上清で、粒子及び結合粒子を形成することができることを更に確認することができる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子形成の可視化。プラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ細胞からのＵＣ精製上清の電子顕微鏡画像。ＨＥＫ細胞を、粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクションするか、または可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。トランスフェクションの６日後に上清を収穫し、ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配にロードした。勾配を３時間３０分、４７８００ＲＰＭ、１６^ｏＣで遠心分離し、１２画分に分画した。粒子を含む画分をプールし、ＴＥＭ画像用に１ｘＰＢＳに透析した。サンプル：ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ。予想されるサイズ：１２ｎｍ。写真は、トランスフェクションまたはコトランスフェクションされた細胞のＳＮで形成された予想されるサイズの粒子を示している。従って本発明者らは、プラスミドＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたはコトランスフェクションした細胞の上清で、粒子及び結合粒子を形成することができることを更に確認することができる。ナノ粒子形成タンパク質への抗原のコンジュゲーションが細胞内で発生したことの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合した可溶性抗原のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を収穫した。収穫時に、細胞を１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴに再懸濁して、更なる結合を防いだ。１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴの細胞サンプル及び上清をＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した可溶性抗原の検出に使用した。従って、何らかの結合がＷＢで認められる場合、その結合は収穫前に細胞内で発生することになっていたはずである。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ。一次抗体：ａＳｐｙＣ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：３５．４ｋＤａ。写真は、粒子及び可溶性抗原が、上清だけでなく細胞内でも結合できることを示している。実際、ＳＤＳ＋ＤＴＴで収穫した細胞で予想される結合サイズのバンドが可視化されたため、ｉｎｖｉｔｒｏ培養において細胞内で結合が発生したことが示された。ナノ粒子形成タンパク質への抗原のコンジュゲーションが細胞内で発生したことの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合した可溶性抗原のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を収穫した。収穫時に、細胞を１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴに再懸濁して、更なる結合を防いだ。１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴの細胞サンプル及び上清をＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した可溶性抗原の検出に使用した。従って、何らかの結合がＷＢで認められる場合、その結合は収穫前に細胞内で発生することになっていたはずである。サンプル：ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（Ｂ１８２２＋Ｂ１７７２）。一次抗体：ａＳｐｙＣ（マウス血清）。二次抗体：抗マウスＨＲＰ。予想されるサイズ：６３．４ｋＤａ。写真は、粒子及び可溶性抗原が、上清だけでなく細胞内でも結合できることを示している。実際、ＳＤＳ＋ＤＴＴで収穫した細胞で予想される結合サイズのバンドが可視化されたため、ｉｎｖｉｔｒｏ培養において細胞内で結合が発生したことが示された。ナノ粒子形成タンパク質への抗原のコンジュゲーションが細胞内で発生したことの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合した可溶性抗原のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を収穫した。収穫時に、細胞を１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴに再懸濁して、更なる結合を防いだ。１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴの細胞サンプル及び上清をＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した可溶性抗原の検出に使用した。従って、何らかの結合がＷＢで認められる場合、その結合は収穫前に細胞内で発生することになっていたはずである。サンプル：ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－ｃｔａｇ（Ｂ１７７４）及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ（Ｂ１８２２）。一次抗体：ａＨｉｓ－ＨＲＰ。予想されるサイズ：６６．５ｋＤａ。写真は、粒子及び可溶性抗原が、上清だけでなく細胞内でも結合できることを示している。実際、ＳＤＳ＋ＤＴＴで収穫した細胞で予想される結合サイズのバンドが可視化されたため、ｉｎｖｉｔｒｏ培養において細胞内で結合が発生したことが示された。ナノ粒子形成タンパク質への抗原のコンジュゲーションが細胞内で発生したことの検証。ＨＥＫ細胞にプラスミドＤＮＡをコトランスフェクションした後の、粒子形成タンパク質に結合した可溶性抗原のウエスタンブロット（ＷＢ）画像。ＨＥＫ細胞を、可溶性抗原＋タグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡと、粒子形成タンパク質＋対応するタグ／キャッチャーをコードするプラスミドＤＮＡとでコトランスフェクションした。コトランスフェクションの６日後に細胞及び上清を収穫した。収穫時に、細胞を１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴに再懸濁して、更なる結合を防いだ。１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴの細胞サンプル及び上清をＷＢで実行した。ＨＲＰに結合した関連抗体を、粒子形成サブユニットに結合した可溶性抗原の検出に使用した。従って、何らかの結合がＷＢで認められる場合、その結合は収穫前に細胞内で発生することになっていたはずである。サンプル：ｓｉｇｎ８－ｅＧＦＰ－ＳｐｙＣ（Ｂ２００９）及びｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ（Ｂ１９２９）レーン１（細胞）、２（ＳＮ）と、ｓｉｇｎ８－ｅＧＦＰ（Ｂ２０３３）及びｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ（Ｂ１９２９）レーン３（細胞）、４（ＳＮ）とを比較した。一次抗体：ａＧＦＰ－ＨＲＰ。予想：Ｂ２００９＋Ｂ１９２９は結合できるはずだが、Ｂ２０３３＋Ｂ１９２９は結合できないはずである（Ｂ２０３３にはキャッチャーがないため）。写真は、粒子及び可溶性抗原が、上清だけでなく細胞内でも結合できることを示している。実際、ＳＤＳ＋ＤＴＴで収穫した細胞で予想される結合サイズのバンドが可視化されたため、ｉｎｖｉｔｒｏ培養において細胞内で結合が発生したことが示された。粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡワクチンの免疫原性の検証。プラスミドＤＮＡ免疫化後のマウスにおける総ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価。粒子及び／または可溶性抗原をコードするプラスミドＤＮＡを、マウスのワクチン接種に使用した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、３０ｕｇのＬＳ－ＳｐｙＴ（Ｂ１９２９）及び３０ｕｇのＳｐｙＣ（Ｂ１９２８）（Ｎ＝６）、または３０ｕｇのＳｐｙＣ（Ｂ１９２８）（Ｎ＝４）、または３０ｕｇのＥ２－ＳｐｙＴ（Ｂ１９３０）及び３０ｕｇのＳｐｙＣ（Ｂ１９２８）で免疫化した。ＤＮＡをＰＢＳ中で製剤化し、右大腿筋に注射した。マウスは０日目及び５週目に免疫化し、初回後及びブースト後の３週目及び４週目に血液を採取した。血液から血清を分離し、抗ＳｐｙＣＩｇＧの検出のためにＥＬＩＳＡを実行した。この目的のために、９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ）をＰＢＳ中のＳｐｙＣでコーティングした。ＳｐｙＣに対するＩｇＧは、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１６０７２）で検出された。プレートをＴＭＢＸ－ｔｒａ基質（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ、４８００Ａ）で現像し、吸光度を４５０ｎＭで測定した。Ａ．Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける初回免疫化後３週間及び４週間のＳｐｙＣに対するＥＬＩＳＡ力価ＥＬＩＳＡ力価は、粒子をコードするＤＮＡ及びＳｐｙＣをコードするＤＮＡを投与されたマウスは、ＳｐｙＣをコードするＤＮＡのみを投与されたマウスと比較して、最初の免疫化後のＳｐｙＣに対するＩｇＧ力価が高いことを示している。更に、この傾向は追加免疫化後に更に高くなる。これは、ＬＳ粒子またはＥ２粒子のいずれかと組み合わせてＳｐｙＣを投与されたマウスの両方のグループに当てはまる。粒子形成サブユニットをコードするプラスミドＤＮＡワクチンの免疫原性の検証。プラスミドＤＮＡ免疫化後のマウスにおける総ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価。粒子及び／または可溶性抗原をコードするプラスミドＤＮＡを、マウスのワクチン接種に使用した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、３０ｕｇのＬＳ－ＳｐｙＴ（Ｂ１９２９）及び３０ｕｇのＳｐｙＣ（Ｂ１９２８）（Ｎ＝６）、または３０ｕｇのＳｐｙＣ（Ｂ１９２８）（Ｎ＝４）、または３０ｕｇのＥ２－ＳｐｙＴ（Ｂ１９３０）及び３０ｕｇのＳｐｙＣ（Ｂ１９２８）で免疫化した。ＤＮＡをＰＢＳ中で製剤化し、右大腿筋に注射した。マウスは０日目及び５週目に免疫化し、初回後及びブースト後の３週目及び４週目に血液を採取した。血液から血清を分離し、抗ＳｐｙＣＩｇＧの検出のためにＥＬＩＳＡを実行した。この目的のために、９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ）をＰＢＳ中のＳｐｙＣでコーティングした。ＳｐｙＣに対するＩｇＧは、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１６０７２）で検出された。プレートをＴＭＢＸ－ｔｒａ基質（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ、４８００Ａ）で現像し、吸光度を４５０ｎＭで測定した。Ｂ．Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける追加免疫化後３週間及び４週間のＳｐｙＣに対するＥＬＩＳＡ力価ＥＬＩＳＡ力価は、粒子をコードするＤＮＡ及びＳｐｙＣをコードするＤＮＡを投与されたマウスは、ＳｐｙＣをコードするＤＮＡのみを投与されたマウスと比較して、最初の免疫化後のＳｐｙＣに対するＩｇＧ力価が高いことを示している。更に、この傾向は追加免疫化後に更に高くなる。これは、ＬＳ粒子またはＥ２粒子のいずれかと組み合わせてＳｐｙＣを投与されたマウスの両方のグループに当てはまる。

本開示は、核酸ベースのワクチンを提供し、これは、ワクチン接種中に真核細胞に送達されると、分割タンパク質タグ／キャッチャーのコンジュゲーションシステムを利用することにより、一方向的、反復的及び多価的な方法でワクチン抗原を表示する自己集合ナノ粒子に翻訳される。

反復的な多価抗原表示は、ワクチン抗原の免疫原性を高め、ワクチン接種後の強力な抗原特異的免疫応答の誘導を可能にする。同時に、核酸（ＤＮＡ及び／またはｍＲＮＡ）ベースのワクチン技術は、ワクチン抗原の組換生産に関連する上流及び下流工程を省略できるため、製造において大きな利点を有する。更に、核酸配列としてのワクチン抗原の送達は、コードされたタンパク質のｉｎｖｉｖｏ翻訳を可能にし、さもなければ組換え生成が困難または不可能になる場合がある。

本発明の解決策は、抗原エピトープを効率的に表示し、長期の防御免疫を誘導することができる多用途の核酸ベースのワクチン送達プラットフォームを作成するための新規アプローチを示す。

定義
本明細書で使用される「イソペプチド結合」という用語は、カルボキシル基とアミノ基との間のアミド結合を指し、そのうちの少なくとも１つはタンパク質主鎖に由来しないか、またはタンパク質骨格の一部ではないと考えられる。イソペプチド結合は、単一のタンパク質内で形成される場合、または２つのペプチドの間もしくはペプチドとタンパク質との間で発生し得る。従ってイソペプチドは、単一のタンパク質内で分子内に、または分子間、すなわち２つのペプチド／タンパク質分子間で形成される場合がある。通常イソペプチド結合は、２つの反応性アミノ酸（リジン及びアスパラギンまたはアスパラギン酸）の間で分子内で発生し得る。この工程を発生させるには、２つの反応性アミノ酸が、しばしば芳香族残基を含む疎水性環境で近接している必要がある。最後に、自己触媒工程は、それ自体はイソペプチド結合に関与しない触媒アスパラギン酸塩またはグルタミン酸残基によって促進され得る。

分子間イソペプチド結合の場合、結合は典型的に、リジン残基と、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、もしくはグルタミン酸残基、またはタンパク質もしくはペプチド鎖の末端カルボキシル基との間で発生するか、またはタンパク質もしくはペプチド鎖のαアミノ末端と、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸との間で発生し得る。イソペプチド結合に関与する対の各残基は、本明細書では反応性残基と称される。従ってイソペプチド結合は、リジン残基とアスパラギン残基との間、またはリジン残基とアスパラギン酸残基との間で形成され得る。特にイソペプチド結合は、リジンの側鎖アミンとアスパラギンのカルボキサミド基との間で発生する場合がある。

本明細書で使用される「オープンリーディングフレーム」という用語は、１）翻訳開始コドン、２）対象の１つ以上の遺伝子産物であって、好ましくは１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のコドン、及び３）翻訳終止コドンの５’から３’方向に含まれるヌクレオチド配列を指し、これにより１）、２）及び３）がフレーム内で動作可能に連結されていることが理解される。従ってオープンリーディングフレームは、３つのヌクレオチド（トリプレット）の倍数で構成される。

「配列変異体」という用語は、ポリペプチド及び／またはポリヌクレオチド配列に対する、少なくとも７０％、例えば７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％、例えば９９．５％、例えば１００％の配列同一性を有する前記ポリペプチド及び／またはポリヌクレオチド配列を指す。

「抗原性変異体」という用語は、ポリペプチドの全長または前記ポリペプチドの断片の変異体を指し、断片は、宿主の細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び／またはＢ細胞によって認識されるエピトープを含む。前記断片はより免疫原性が高いため、由来する元のポリペプチドよりも強力及び／またはより長く持続する免疫反応を誘導し得る。好ましくは、抗原変異体の免疫原性部分は、参照配列のアミノ酸配列の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に少なくとも７５％及び特に少なくとも９０％（例えば、９５％または９８％）を含む。免疫原性部分は、好ましくは参照配列のエピトープ領域のすべてを含む。前記抗原変異体の免疫原性は、Ｗａｄｈｗａｅｔａｌ．，２０１５に記載されている方法など、当技術分野において周知のいずれかの方法によって検証され得る。

本明細書で説明するように、第１のペプチドタグ及び第２のペプチドタグ（または結合パートナー）は、イソペプチド結合、好ましくは自発的イソペプチド結合を介して互いに結合する第１及び第２のペプチドタグを指す。好ましくは、第１のペプチドタグはイソペプチド結合に関与する反応性残基の１つを含み、第２のペプチドタグはそのイソペプチド結合に関与する他の反応性残基を含む。

本明細書で使用される「自発的」という用語は、他の薬剤（例えば、酵素触媒）が存在しない及び／またはタンパク質もしくはペプチドの化学修飾を伴わず、例えばネイティブケミカルライゲーションまたは化学的結合を伴わない、タンパク質内またはペプチド間もしくはタンパク質間（例えば、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間）で形成され得る結合、特に急ペプチド結合を指す。従って自発的なイソペプチド結合は、酵素または他の外因性物質の非存在下もしくは化学修飾なしで、自然に形成され得る。しかし、特に自発的なイソペプチドまたは共有結合は、結合の形成を可能にするために、結合に関与するペプチド／タンパク質の１つにグルタミン酸またはアスパラギン酸残基の存在を必要とする場合がある。

「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という用語は、ウイルスコートの形態を模倣するが感染性遺伝物質を欠く、高分子微粒子構造に自発的に集合する、ウイルスカプシドタンパク質などの１つまたは複数の組換え発現ウイルスタンパク質を指す。

本明細書における「粒子」という用語は、本明細書に記載するように、表面に抗原を表示することができるウイルス様粒子またはナノ粒子を指す。表面は、内部表面、すなわち粒子の内部に面する表面、または外部表面、すなわち粒子の周囲に面する表面であり得る。

「自己集合」という用語は、既存のコンポーネントのシステムが、特定の条件下で、コンポーネント自体の間の相互作用を通じて、より組織化された構造を採用する工程を指す。本文脈において、自己集合とは、特定の条件にさらされた場合、ウイルスタンパク質、例えばカプシドタンパク質、及び／またはファージタンパク質などのタンパク質が、粒子、特に他のウイルスタンパク質が不在のウイルス様粒子に自己集合する固有の能力を指す。「自己集合」は、細胞タンパク質、例えばシャペロンが、細胞内ＶＬＰまたはナノ粒子集合の工程に関与する可能性を排除するものではない。自己集合工程は敏感で壊れやすい可能性があり、発現宿主の選択、発現条件の選択、及びウイルス様粒子の成熟条件などの要因の影響を受ける場合があるが、これらに限定されるものではない。ウイルスカプシドタンパク質は、単独で、またはいくつかのウイルスカプシドタンパク質と組み合わせてＶＬＰを形成することができ、これらは任意ですべて同一である。

本明細書で使用される「一貫した配向」という用語は、本明細書で開示される粒子の表面、すなわち、粒子の内面または外面、好ましくは少なくとも外面上の抗原の配向及びその空間的配向を指す。本明細書に開示されるように、第２のペプチドタグに融合した抗原を第２のペプチドタグを含むタンパク質に連結する場合、抗原の１つの分子は、抗原及びタンパク質の両方の固有の部位で単一の粒子形成タンパク質にしか連結することができないため、一貫した配向を有する前記抗原の均一及び／または一貫した提示を作成する。対照的に、例えば、ストレプトアビジンホモ四量体は、ビオチン化ＶＬＰの外表面上でいくつかのタンパク質を架橋する場合があるため、前記抗原の不規則かつ一貫性のない配向を作成する。更に、複数のビオチン結合部位がビオチン化ＶＬＰの架橋及び凝集を可能にするため、例えばビオチン化抗原をビオチン化ＶＬＰにコンジュゲーションするための架橋分子としてストレプトアビジンを使用することは非常に困難である。

本明細書で使用される「等間隔」という用語は、ＶＬＰまたはナノ粒子の表面上にパターンを形成する本発明の抗原を指す。そのようなパターンは、抗原の対称、円状、及び／または花束状のパターンであり得る。

「治療」という用語は、健康問題の改善を指す。また治療は、防御的及び／または予防的であるか、もしくは疾患及び／または感染の発生リスクを低減し得る。また治療は、疾患及び／または感染症を治癒もしくは改善し得る。

「予防的」という用語は、疾患及び／または感染の発生リスクを軽減することを指す。また予防的とは、疾患及び／または感染の発生の防止を指す場合もある。

「ループ」という用語は、ポリペプチド鎖がその全体的な方向を逆にするポリペプチドの二次構造を指し、ターンと呼ばれることもある。

「ワクチンカクテル」という用語は、一緒に投与される抗原の混合物を指す。ワクチンカクテルは、単回投与として、または一定期間にわたって投与される数回投与として投与され得る。時間間隔は、同じ年、月、週、日、時間及び／または分内の投与であり得るが、これらに限定されるものではない。同時ワクチン接種及びワクチンカクテルは、同義で使用され得る。

「自己抗原」という用語は、異常な細胞代謝の結果として以前は正常だった細胞内で生成された内因性抗原を指す。

組成物
本明細書では、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み、
前記抗原及び前記タンパク質は、細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、組成物が提供される。

前記組成物は、本明細書において以下に記載されるように、疾患または障害の予防及び／または治療に有用である。

前記第１及び第２のポリヌクレオチドを含む前記組成物の対象への投与は、前記第１及び第２のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む組成物の投与と比較して、前記被験体においてより強い免疫応答を誘導する場合があり、前記第１及び第２のっポリペプチドは、対象への投与前に、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して結合されている。

第１のペプチドタグ及び第２のペプチドタグは、イソペプチド結合またはエステル結合を形成する固有の能力を有するペプチドから選択され、これにより互いに結合する。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは自発的に、ナノ粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）などの粒子を形成する能力を有するタンパク質をコードする。従って、細胞内で発現すると、第１のポリヌクレオチドは、第１のペプチドタグに融合されたタンパク質によって形成される粒子の形成をもたらし、一方で、第２のポリヌクレオチドは、第２のペプチドタグに融合された抗原を含むまたは抗原からなる融合タンパク質の発現をもたらす。集合粒子は、免疫系によって認識されるウイルスまたはその他の病原性生物に非常に似ている場合があるが、病原性遺伝物質を含まないため非感染性である。第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合またはエステル結合の自発形成により粒子が形成され、その表面、好ましくは外表面に抗原を表示する。重要なことは、一貫した抗原の配向に加えて、このようなナノ粒子及びＶＬＰは、一貫した抗原の配向、高密度、及び規則的な間隔を含む、非常に有益な抗原表示特性を予期せず有していることである。従って、得られたナノ粒子及びＶＬＰは、強力な液性応答を誘導し、Ｂ細胞耐性を克服することができる。このようなナノ粒子またはＶＬＰの形成の成功は、本開示の実施例２及び３に開示されている方法など、当業者に既知の関連する方法で評価され得る。このようなナノ粒子またはＶＬＰは驚くべきことに、化学結合法と比較して抗原結合の効率が向上し、大型及び小型抗原の両方に対して、一貫した抗原配向、高密度、及び規則的な間隔を有する抗原表示を可能にする。

第１及び第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、好ましくは、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両方ともＤＮＡ、または両方ともＲＮＡであり得る。

ＲＮＡ構築物及び／またはＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡは、多シストロン性であり得る。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリヌクレオチドは、同じリボ核酸分子上にコードされる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリヌクレオチドは同じオープンリーディングフレーム内にあり、これにより両方のポリヌクレオチドを転写するために１つのプロモーター配列のみが必要とされる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のポリヌクレオチドは別々のオープンリーディングフレーム内にあるため、別々のプロモーターによって制御され得る。

タンパク質
好ましい実施形態において、タンパク質は粒子形成タンパク質である。例えばタンパク質は、糖タンパク質などのウイルスカプシドタンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、哺乳動物ウイルス、例えばヒトウイルスに由来する。

いくつかの実施形態において、タンパク質は、Ｂ型またはＥ型肝炎などの肝炎ウイルス由来のタンパク質、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のコアタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質はＮｏＶなどのノロウイルス由来のタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、好ましくはＨＰＶＬ１などの、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８などのパピローマウイルス由来のタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ポリオーマウイルスｖｐ１（ＰｙＶ）などのポリオーマウイルス由来のタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、好ましくはＦＣＶＶＰ１などのカリシウイルス由来のタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、好ましくはＰＣＶ２ＯＲＦ２などのサーコウイルス由来のタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＮＮＶコートタンパク質などの神経壊死ウイルス（ＮＮＶ）由来のタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、イヌパルボウイルス（ＣＶＰ）、好ましくはＣＰＶＶＰ２、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）またはブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、好ましくはＧＰＶまたはＰＰＶ由来の構造タンパク質、もしくはパルボウイルスＢ１９などのパルボウイルス由来のタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、腸炎ウイルス、例えばミンク腸炎ウイルス（ＭＥＶ）、好ましくはＭＥＶＶＰ２、またはアヒルペストウイルス（ＤＰＶ）、好ましくはＤＰＶ構造タンパク質などのプロトパルボウイルス由来のタンパク質である。

タンパク質は、ササゲウイルス、タバコウイルス、トマトウイルス、キュウリウイルスまたはジャガイモウイルスなどの植物ウイルスからのタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、植物ウイルスはモザイクウイルス、好ましくはササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）である。いくつかの実施形態において、植物ウイルスはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）である。いくつかの実施形態において、植物ウイルスはトマト黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）である。いくつかの実施形態において、植物ウイルスはトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）である。いくつかの実施形態において、植物ウイルスはキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）である。いくつかの実施形態において、植物ウイルスはジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）である。

いくつかの実施形態において、タンパク質は、サルモネラウイルスＰ２２、ＭＳ２、ＱＢｅｔａ、ＰＲＲ１、ＰＰ７、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆ２またはＣｂ５などの、バクテリオファージタンパク質である。追加の関連バクテリオファージタンパク質は、Ｌｉｅｋｎｉｎａｅｔａｌ．，２０１９に記載されている。

いくつかの実施形態において、タンパク質は、哺乳動物、特にヒトに共通するウイルス由来のタンパク質である。理論に束縛されるものではないが、そのようなウイルスは、哺乳類以外の生物で一般的に見られるウイルスよりも、哺乳動物細胞、特にヒト細胞での発現に適している可能性がある。従って、いくつかの実施形態において、ウイルスはＢ型またはＥ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスはノロウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのパピローマウイルス、好ましくはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８である。いくつかの実施形態において、ウイルスはポリオーマウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスはパルボウイルスである。

いくつかの実施形態において、タンパク質は、フェリチン、ｉ３０１、レプリカーゼポリタンパク質１ａ（ｐｐ１ａ）またはルマジンシンターゼなどの粒子形成タンパク質である。その他の粒子形成タンパク質は当技術分野において既知であり、使用される場合もある。

第１及び第２のペプチドタグ
イソペプチド結合の（自発的）形成を介して互いに結合することができる第１のペプチドタグ及び第２のペプチドタグからなるペプチド対は、当技術分野において既知であるか、または当技術分野において既知の方法、特にＺａｋｅｒｉｅｔａｌ．，２０１２及びＺａｋｅｒｉｅｔａｌ．，２０１０に記載される方法で設計または取得することができる。

本明細書で使用される「ペプチドタグ」という用語は、一般に、分子内イソペプチド結合を自然に形成するタンパク質から直接設計または誘導され得る小さなペプチド断片を指す。またペプチドタグは、ペプチドライブラリをスクリーニングするために、例えば分子内イソペプチド結合を自然に形成するタンパク質に由来する既知の結合パートナーを使用することによって同定され得る。従って、候補ペプチドタグは、候補ペプチドタグをスクリーニングすることができるライブラリ、例えばペプチドライブラリ由来のものであり得る。また候補ペプチドタグは、ｉｎｓｉｌｉｃｏでも設計され得る。

従って、本明細書で理解されるペプチド対は、イソペプチド結合の自発的形成を介して、またはエステル結合を介して相互作用することができる２つのペプチドタグからなる。一般的に、これらは「タグ及びキャッチャー」システムとも呼ばれ、２つのペプチドタグの長い方を「キャッチャー」と呼び、２つのペプチドタグの短い方を「タグ」と呼ぶ。たとえば、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、第１のペプチドタグ（ＳｐｙＴａｇ）及び第２のペプチドタグ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）で構成される。

いくつかの実施形態において、本明細書で理解されるペプチド対は、エステル結合の自発的形成を介して相互作用することができる２つのペプチドタグからなる。このような自発的なエステル結合を形成することができる有用なペプチドタグは、Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．，２０１７に更に記載されている。

「タグ」は、長さが５～５０アミノ酸、例えば長さが１０、２０、３０、４０～５０アミノ酸であり、本明細書で定義される結合パートナーにイソペプチド結合を介して共有結合し得る。従って「タグ」は、本明細書に記載されるように、結合パートナーを設計するために使用されるイソペプチドタンパク質中のイソペプチド結合に関与する１つの反応性残基を含み得る（結合パートナーは、その結合に関与する他の反応性残基を含み得る）。

いくつかの実施形態において、「タグ」は、７～４７個の間のアミノ酸、例えば８から４６個の間のアミノ酸、例えば９から４５個の間のアミノ酸、例えば１０から４４個の間のアミノ酸、例えば１１から４３個の間のアミノ酸、例えば１２から４２個の間のアミノ酸、例えば１３から４１個の間のアミノ酸、例えば１４から４０個の間のアミノ酸、例えば１５から３９個の間のアミノ酸、例えば１６から３８個の間のアミノ酸、例えば１７～３７個の間のアミノ酸、例えば１８～３６個の間のアミノ酸、例えば１９～３５個の間のアミノ酸、例えば２０～３４個の間のアミノ酸、例えば２１～３３個の間のアミノ酸、例えば２２～３２個の間のアミノ酸、例えば２３～３１個の間のアミノ酸、例えば２４～３０個の間のアミノ酸、例えば２５～２９個の間のアミノ酸、例えば２６～２８個の間のアミノ酸、例えば２７個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、「タグ」は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６個のアミノ酸の長さを有する。

いくつかの実施形態において、「キャッチャー」は、長さが少なくとも２０個のアミノ酸である。好ましくは「キャッチャー」は、５個以上のアミノ酸、例えば１０個以上のアミノ酸、例えば１５個以上のアミノ酸、例えば２０個以上のアミノ酸、例えば２５個以上のアミノ酸、例えば３０個以上のアミノ酸、例えば３５個以上のアミノ酸、例えば４０個以上のアミノ酸、例えば４５個以上のアミノ酸、例えば５０個以上のアミノ酸、例えば６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０個以上のアミノ酸などの長さを有する。いくつかの実施形態において、「キャッチャー」は、長さが少なくとも２０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、「キャッチャー」は、長さが７５～１２５個の間のアミノ酸である。

好ましくは「キャッチャー」は、「タグ」よりも多くのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、第１及び第２のペプチドタグの１つは、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１）、ＳｄｙＴａｇ（配列番号２）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号３）、ＰｈｏＴａｇ（配列番号４）、ＥｎｔＴａｇ（配列番号５）、ＫＴａｇ、ＢａｃＴａｇ（配列番号１５）、Ｂａｃ２Ｔａｇ（配列番号１６）、Ｂａｃ３Ｔａｇ（配列番号１７）、Ｂａｃ４Ｔａｇ（配列番号１８）、ＲｕｍＴｒｕｎｋＴａｇ（配列番号１３または配列番号１４）、Ｒｕｍ７Ｔａｇ（配列番号１２）、ＲｕｍＴａｇ（配列番号６）、Ｒｕｍ２Ｔａｇ（配列番号７）、Ｒｕｍ３Ｔａｇ（配列番号８）、Ｒｕｍ４Ｔａｇ（配列番号９）、Ｒｕｍ５Ｔａｇ（配列番号１０）、Ｒｕｍ６Ｔａｇ（配列番号１１）及びＢａｃ５Ｔａｇ（配列番号１９）からなる群から選択される。前記タグをコードする核酸配列は以下の通りである。ＳｐｙＴａｇ（配列番号３５）、ＳｄｙＴａｇ（配列番号３６）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号３７）、ＰｈｏＴａｇ（配列番号３８）、ＥｎｔＴａｇ（配列番号３９）、ＫＴａｇ、ＢａｃＴａｇ（配列番号４９）、Ｂａｃ２Ｔａｇ（配列番号５０）、Ｂａｃ３Ｔａｇ（配列番号５１）、Ｂａｃ４Ｔａｇ（配列番号５２）、ＲｕｍＴｒｕｎｋＴａｇ（配列番号４７または配列番号４８）、Ｒｕｍ７Ｔａｇ（配列番号４６）、ＲｕｍＴａｇ（配列番号４０）、Ｒｕｍ２Ｔａｇ（配列番号４１）、Ｒｕｍ３Ｔａｇ（配列番号４２）、Ｒｕｍ４Ｔａｇ（配列番号４３）、Ｒｕｍ５Ｔａｇ（配列番号４４）、Ｒｕｍ６Ｔａｇ（配列番号４５）及びＢａｃ５Ｔａｇ（配列番号４６）。

いくつかの実施形態において、第１及び第２のペプチドタグの他方は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号５５）、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号５６）、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号５７）及びエステル形成分割タンパク質対からなる群から選択される。エステル形成分割タンパク質対の例は、ｃｐｅ０１４７（ＵｎｉｐｒｏｔＢ１Ｒ７７５）（配列番号３４、ＤＮＡ配列：配列番号６８）のアミノ酸残基４３９～５８７に対応する断片及びｃｐｅ０１４７（ＵｎｉｐｒｏｔＢ１Ｒ７７５）（配列番号２０、ＤＮＡ配列：配列番号５４）のアミノ酸残基５６５～５８７に対応する断片である。その他の第１または第２のペプチドタグは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３に提示され、対応するＤＮＡ配列は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、及び配列番号６７である。

いくつかの実施形態において、ペプチド対は、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ペプチド対は、ＳｐｙＴａｇ及びＳｄｙＣａｔｃｈｅｒを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ペプチド対は、ＳｎｏｏｐＴａｇ及びＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒを含むか、またはそれらからなる。

いくつかの実施形態において、ペプチド対は、上記いずれかの切断版または改変版、すなわち、イソペプチド結合を形成する能力を保持しているが、更に操作されたペプチド対を含むか、またはそれらからなる。

ペプチド対は、例えば、変異または変更を、第１または第２のペプチドタグのいずれか１つもしくは２つ、すなわちタグ及びキャッチャーのいずれか１つまたは２つに導入して、変更されてもよい。ペプチドタグ、すなわち第１または第２のペプチドタグは、自発的に、イソペプチド結合を介してまたはエステル結合を介して、対応する結合パートナーに共有結合することができはずである。この点において、各ペプチドタグは、好ましくはイソペプチドタンパク質におけるイソペプチド結合の形成に関与する反応性アミノ酸残基の１つを含む。従って各ペプチドタグは、イソペプチド結合からの反応性残基を１つだけ含み、関与する両方の反応性残基を含まない。更に、ペプチドタグが改変または変異されている場合、その断片中の反応性残基は、好ましくは変更されないままである。これは、ペプチドタグのホモログが使用される場合、ホモログは好ましくは元のペプチドタグに最初に存在した反応性残基を依然として含むことを意味する。しかしいくつかの実施形態において、ペプチドタグが改変または変異された場合、その断片中の反応性残基も変化する。

好ましくは、タグに存在する反応性残基はアスパラギンまたはアスパラギン酸残基であり、上述したように、結合パートナーまたは修飾結合パートナー（キャッチャー）の反応性残基とイソペプチド結合を形成することができる。従って、１つのペプチドタグには１つの反応性残基が含まれ、他方のペプチドタグにはもう１つの反応性残基が含まれるため、単一のペプチドタグが両方の反応性残基を含むことはない。

いくつかの実施形態において、両方の反応性残基がイソペプチド結合の形成に関与する。いくつかの実施形態において、第１のペプチドタグの反応性残基は、第２のペプチドタグの反応性残基とは異なる。好ましくは、「キャッチャー」に存在する反応性残基はリジン残基である。いくつかの実施形態において、「キャッチャー」に存在する反応性残基はアスパラギンまたはアスパラギン酸残基である。好ましくは、「タグ」に存在する反応性残基はアスパラギンまたはアスパラギン酸残基である。いくつかの実施形態において、「タグ」に存在する反応性残基はリジン残基である。これらの残基が一緒になって、イソペプチド結合を形成し得る。

理論に束縛されるものではないが、イソペプチド結合の形成には第３の残基が関与してもよい。結合に直接参加するものではないが、この第３の残基は結合の形成を仲介してもよい。典型的に、第３の残基はグルタミン酸残基である。修飾結合パートナーは、好ましくはこの第３の残基を含む。換言すれば、ペプチドタグ、すなわち第１、第２または第３のペプチドタグのいずれかは、好ましくは、代わりに修飾結合パートナーに存在するこの第３の残基を含まない。

従って、ペプチド対がイソペプチド結合を形成する能力を保持している限り、ペプチド対は、前述のペプチドタグのいずれかの切断版または修飾版を含むか、またはそれらから構成されてもよい。

従って、いくつかの実施形態において、第１及び第２のペプチドタグの１つは、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１）、ＳｄｙＴａｇ（配列番号２）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号３）、ＰｈｏＴａｇ（配列番号４）、ＥｎｔＴａｇ（配列番号５）、ＫＴａｇ、ＢａｃＴａｇ（配列番号１５）、Ｂａｃ２Ｔａｇ（配列番号１６）、Ｂａｃ３Ｔａｇ（配列番号１７）、Ｂａｃ４Ｔａｇ（配列番号１８）、ＲｕｍＴｒｕｎｋＴａｇ（配列番号１３または配列番号１４）、Ｒｕｍ７Ｔａｇ（配列番号１２）、ＲｕｍＴａｇ（配列番号６）、Ｒｕｍ２Ｔａｇ（配列番号７）、Ｒｕｍ３Ｔａｇ（配列番号８）、Ｒｕｍ４Ｔａｇ（配列番号９）、Ｒｕｍ５Ｔａｇ（配列番号１０）、Ｒｕｍ６Ｔａｇ（配列番号１１）、Ｂａｃ５Ｔａｇ（配列番号１９）及びそれらに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれらに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するそれらの相同体からなる群から選択される。同様に、第１及び第２のペプチドタグの１つの核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ（配列番号３５）、ＳｄｙＴａｇ（配列番号３６）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号３７）、ＰｈｏＴａｇ（配列番号３８）、ＥｎｔＴａｇ（配列番号３９）、ＫＴａｇ、ＢａｃＴａｇ（配列番号４９）、Ｂａｃ２Ｔａｇ（配列番号５０）、Ｂａｃ３Ｔａｇ（配列番号５１）、Ｂａｃ４Ｔａｇ（配列番号５２）、ＲｕｍＴｒｕｎｋＴａｇ（配列番号４７または配列番号４８）、Ｒｕｍ７Ｔａｇ（配列番号４６）、ＲｕｍＴａｇ（配列番号４０）、Ｒｕｍ２Ｔａｇ（配列番号４１）、Ｒｕｍ３Ｔａｇ（配列番号４２）、Ｒｕｍ４Ｔａｇ（配列番号４３）、Ｒｕｍ５Ｔａｇ（配列番号４４）、Ｒｕｍ６Ｔａｇ（配列番号４５）、Ｂａｃ５Ｔａｇ（配列番号４６）及びそれらに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれらに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体からなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態において、第１及び第２のペプチドタグの他方は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２１）、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２２）、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２３）、エステル形成分割タンパク質対（ｃｐｅ０１４７（ＵｎｉｐｒｏｔＢ１Ｒ７７５）のアミノ酸残基４３９～５８７に対応する断片（配列番号３４、ＤＮＡ配列：配列番号６８）及びｃｐｅ０１４７（ＵｎｉｐｒｏｔＢ１Ｒ７７５）（配列番号２０、ＤＮＡ配列：配列番号５４）のアミノ酸残基５６５～５８７に対応する断片など）、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３、ならびにそれらに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれらに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するそれらの相同体からなる群から選択される。同様に、第１及び第２のペプチドタグの他方の核酸配列は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７及びそれらに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれらに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ペプチド対は、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１）またはそれに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するそれらの相同体、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２１）またはそれに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するそれらの相同体を含むか、もしくはそれらから構成される。同様に、ペプチド対の核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ（配列番号３５）またはそれに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号５５）またはそれに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体を含むか、もしくはそれらから構成されてもよい。

いくつかの実施形態において、ペプチド対は、ＳｐｙＴａｇ（配列番号２）またはそれに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するそれらの相同体、及びＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２２）またはそれに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するその相同体を含むか、もしくはそれらから構成される。同様に、ペプチド対の核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ（配列番号３６）またはそれに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号５６）またはそれに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体を含むか、もしくはそれらから構成されてもよい。

いくつかの実施形態において、ペプチド対は、ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号３）またはそれに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれらに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するそれらの相同体、及びＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２３）またはそれに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれらに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有するそれらの相同体を含むか、もしくはそれらからなる。同様に、ペプチド対の核酸配列は、ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号３７）またはそれに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体、及びＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号５７）またはそれに対して少なくとも６０％の配列同一性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの変異体を含むか、もしくはそれらから構成されてもよい。

第１のペプチドタグのタンパク質への融合及び第２のペプチドタグの抗原への融合
第１のペプチドタグがタンパク質に融合される位置を変更することにより、粒子上の抗原の配向を変更でき得る。これは、抗原の最も重要なエピトープの最適な表示を可能にするために実施され得る。最適な配向は、抗原ごとに異なってもよい。

特定のモノクローナル抗体のエピトープは、抗原構造上にマッピングされてもよく、これにより、粒子への抗原のコンジュゲーション後にどのエピトープが接近可能であるかを決定することが可能になる。具体的には、ＥＬＩＳＡまたは別の親和性測定技術（例えばＡｔｔａｎａ）を使用するなどして、特定のモノクローナル抗体と、粒子に結合した抗原の複合体（抗原：粒子複合体）との間の結合を測定することで、抗原の配向を決定してもよい。クライオ電子顕微鏡法は、抗原：粒子複合体全体の構造を決定するために使用してもよい。抗原が機能的結合エピトープを含む場合、エピトープが最終的な抗原：粒子複合体で曝露されているかまたは隠れているかを判断するために結合アッセイを実施してもよい。

第２のペプチドタグが抗原に融合される位置を変更することにより、粒子上の抗原の配向を変更できる。これは、抗原の最も重要なエピトープの最適な表示を可能にするために実施され得る。最適な配向は、抗原ごとに異なってもよい。

いくつかの実施形態において、第１のペプチドタグはタンパク質のＮ末端に融合される。その他の実施形態において、第１のペプチドタグはタンパク質のＣ末端に融合される。その他の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、タンパク質のコード配列にインフレームで挿入される。融合タンパク質は、第１のペプチドタグとタンパク質との間にリンカーを含んでもよい。

同様に、いくつかの実施形態において、第２のペプチドタグは抗原のＮ末端に融合される。その他の実施形態において、第２のペプチドタグは抗原のＣ末端に融合される。その他の実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、タンパク質のコード配列にインフレームで挿入される。融合タンパク質は、第２のペプチドタグと抗原との間にリンカーを含んでもよい。

疾患と医学的適応
本発明は、ナノ粒子またはＶＬＰが発現される細胞内、すなわちｉｎｖｉｖｏで、直接様々な抗原をナノ粒子またはＶＬＰにコンジュゲートするための、新規かつ汎用的で使いやすいアプローチである。抗原に応じて、本組成物は広範囲の疾患の予防及び／または治療に使用することができる。本発明を予防及び／または治療に使用できる疾患には、がん、心血管疾患、アレルギー疾患、慢性疾患、神経疾患、及び／または感染症が含まれるが、これらに限定されるものではない。抗原は、典型的には、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質もしくはそれらの断片であり、すなわちそれらはアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成される。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのがん疾患に関連する抗原は、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間の相互作用を介して、本明細書に記載される粒子形成タンパク質などのタンパク質に連結される。更なる実施形態において、本組成物は、がん及び／または抗原が関連するがんの予防及び／または治療のために使用され得る。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの心血管疾患に関連する抗原は、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間の相互作用を介して、本明細書に記載される粒子形成タンパク質などのタンパク質に連結される。更なる実施形態では、本組成物は、心血管疾患及び／または抗原が関連する心血管疾患の予防及び／または治療に使用され得る。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアレルギー疾患に関連する抗原は、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間の相互作用を介して、本明細書に記載される粒子形成タンパク質などのタンパク質に連結される。更なる実施形態において、本組成物は、アレルギー疾患及び／または抗原が関連するアレルギー疾患の予防及び／または治療のために使用することができる。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの感染症に関連する抗原は、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間の相互作用を介して、本明細書に記載される粒子形成タンパク質などのタンパク質に連結される。更なる実施形態において、本組成物は、感染症及び／または抗原が関連する感染症の予防及び／または治療のために使用することができる。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの慢性疾患に関連する抗原は、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間の相互作用を介して、本明細書に記載される粒子形成タンパク質などのタンパク質に連結される。更なる実施形態において、本組成物は、慢性疾患及び／または抗原が関連する慢性疾患の予防及び／または治療のために使用することができる。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの神経疾患に関連する抗原は、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間の相互作用を介して、本明細書に記載される粒子形成タンパク質などのタンパク質に連結される。更なる実施形態において、本組成物は、神経疾患及び／または抗原が関連する神経疾患の予防及び／または治療のために使用することができる。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのウイルス性疾患に関連する抗原は、第１のペプチドタグと第２のペプチドタグとの間の相互作用を介して、本明細書に記載される粒子形成タンパク質などのタンパク質に連結される。更なる実施形態において、本組成物は、抗原が関連する慢性疾患の予防及び／または治療のために使用することができる。いくつかの実施形態において、ウイルス性疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス、マラリア、結核、ＨＩＶまたはインフルエンザによって引き起こされる。

本発明で使用され得る抗原の非網羅的な一覧を表１及び表２に概説する。更に表１は、抗原が関連する特定の疾患の例に加えて、本組成物を用いた予防及び／または治療の必要がある可能性のある患者群の例を示す。

関連する抗原には、ヘマグルチニン、ＧＤ２、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２１、ノイラミニダーゼ、ヒト黒色腫タンパク質ｇｐ１００、ヒト黒色腫タンパク質ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ１、ＨＩＶエンベロープタンパク質、Ｍ２ｅ、ＶＡＲ２ＣＳＡ、ＩＣＡＭ１、ＣＳＰ、デングウイルスＮＳ１、デングウイルスエンベロープタンパク質、チクングニアウイルスエンベロープタンパク質、チロシナーゼ、ＨＣＶＥ２、ＮＡ１７－Ａｎｔ、ＭＡＧＥ－３、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶＬ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ｐ５３、ｈＣＧ、Ｆｅｌｄ１、ＥＧＲＦｖＩＩＩ、エンドグリン、ＡＮＧＰＴＬ－３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ－４、ＨＥＲ２、ＩｇＥ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＴＳＬＰ、ＮＧＦ及び（ＩＨＮＶ）Ｇタンパク質、リンホトキシンαまたはβなどのリンホトキシン、リンホトキシン受容体、核因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＩＬ－２３ｐ１９、グレリン、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＣＰ－１、エンドグリン、ＧｎＲＨ、ＴＲＨ、エオタキシン、ブラジキニン、ＢＬＣ、ＴＮＦ－α、アミロイドβペプチドＡ、アンギオテンシン、ガストリン、プロガストリン、ＣＥＴＰ、ＣＣＲ５、Ｃ５ａ、ＣＸＣＲ４、Ｄｅｓ－Ａｒｇ－ブラジキニン、ＧｎＲＨペプチド、アンジオテンシンペプチドまたはＴＮＦペプチドが挙げられる。

いくつかの実施形態において、抗原は、ヘマグルチニン、ＧＤ２、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２１、ノイラミニダーゼ、ヒト黒色腫タンパク質ｇｐ１００、ヒト黒色腫タンパク質ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ１、ＨＩＶエンベロープタンパク質、Ｍ２ｅ、ＶＡＲ２ＣＳＡ、ＩＣＡＭ１、ＣＳＰ、デングウイルスＮＳ１、デングウイルスエンベロープタンパク質、チクングニアウイルスエンベロープタンパク質、チロシナーゼ、ＨＣＶＥ２、ＮＡ１７－Ａｎｔ、ＭＡＧＥ－３、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶＬ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ｐ５３、ｈＣＧ、Ｆｅｌｄ１、ＥＧＲＦｖＩＩＩ、エンドグリン、ＡＮＧＰＴＬ－３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ－４、ＨＥＲ２、ＩｇＥ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＴＳＬＰ、ＮＧＦ及び（ＩＨＮＶ）Ｇタンパク質、リンホトキシンαまたはβなどのリンホトキシン、リンホトキシン受容体、核因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＩＬ－２３ｐ１９、グレリン、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＣＰ－１、エンドグリン、ＧｎＲＨ、ＴＲＨ、エオタキシン、ブラジキニン、ＢＬＣ、ＴＮＦ－α、アミロイドβペプチドＡ、アンギオテンシン、ガストリン、プロガストリン、ＣＥＴＰ、ＣＣＲ５、Ｃ５ａ、ＣＸＣＲ４、Ｄｅｓ－Ａｒｇ－ブラジキニン、ＧｎＲＨペプチド、アンジオテンシンペプチドもしくはＴＮＦペプチドの、抗原断片または抗原変異体である。この抗原性断片または抗原性変異体は、対応する抗原よりも強力な免疫応答を誘導するのに優れている場合がある。
従って、いくつかの実施形態において、抗原断片または抗原変異体のタンパク質配列は、対応する抗原の相同体であって、それに対して少なくとも６０％の相同性、例えばそれに対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、抗原断片または抗原変異体は、ポリペプチドによってコードされる。前記ポリペプチドは、対応する天然抗原の核酸配列変異体から構成されるか、またはそれを含んでもよく、核酸配列変異体は、それに対して少なくとも６０％、例えば対応する抗原に対して少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する。

細胞は、本明細書に記載されるタグにそれぞれが融合された、抗原及び粒子形成タンパク質のトランスフェクション及び発現時に、粒子形成タンパク質に連結された抗原を表示する自己集合粒子を形成できることが望ましい。これは、本開示の実施例２及び３に開示されている方法など、当業者に既知の関連する方法で評価され得る。

本発明の組成物は、他の疾患に対して使用してもよく、及び／または本明細書に列挙したもの以外のその他の抗原を使用してもよい。

本発明の一実施形態において、医学的適応は、心血管疾患、免疫炎症性疾患、慢性疾患、神経疾患、感染症及びがんからなる群から選択される。特定の実施形態において、医学的適応は免疫炎症性疾患である。別の特定の実施形態において、医学的適応は心血管疾患である。別の実施形態において、医学的適応は慢性疾患である。別の実施形態において、医学的適応は神経疾患である。別の実施形態において、医学的適応は感染症である。別の実施形態において、医学的適応はがんである。

別の実施形態において、抗原は、心血管疾患及び／またはアレルギー反応／疾患などの異常な生理学的反応に関連するポリペプチド、ペプチド及び／またはポリペプチドの抗原断片である。特定の実施形態において、異常な生理学的反応はがんである。

更なる実施形態において、抗原は、本明細書に開示される医学的適応に関連するタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である。

がん及び関連抗原
２０１２年には、世界中で１，４００万人以上の成人ががんと診断され、８００万人以上ががんで死亡した。従って、効率的ながん治療法が必要とされている。

がん細胞の特徴の一つに、遺伝子及びタンパク質の異常な発現レベルがある。がん関連遺伝子の一例はＨＥＲ２で、これは全乳癌の２０％で過剰発現しており、高い転移能及び患者の生存率の低下に関連している。がん細胞は、免疫学的に正常細胞と区別する方法でがん関連抗原を発現するが、ほとんどのがん関連抗原は、一般的に宿主によって許容される「自己」タンパク質であるため、ほとんどのがん関連抗原は免疫原性が弱いのみである。本組成物は、対象の細胞において、抗原、例えばがん関連抗原に反応して、そのような抗原に対する免疫寛容を克服するために、免疫系を活性化することができる抗原を表示する粒子を発現させるために使用することができる。異なるがんは、異なるがん関連抗原を有することによって特徴付けられる。サバイビンは、ほとんどのがん細胞で過剰発現していると考えられており、本発明でも使用され得る。従って本発明は、腫瘍関連抗原を過剰発現するほとんどの種類のがんの治療／予防に使用してもよい。

これにより本発明は、例えばがん関連抗原に対して反応し、そのような抗原に対する免疫寛容を克服するために免疫系を活性化することができる組成物を提供する。更なる実施形態において、本組成物は、抗原が関連するがんの予防及び／または治療のために使用され得る。

別の実施形態において、本発明は、抗原を過剰発現するいかなる種類のがんの治療／予防に使用される。本発明が使用され得るがんの種類は、抗原の選択によって決定される。

オンコウイルスががんを引き起こすことは既知である。従って一実施形態において、本発明のワクチンは、イソペプチド結合またはエステル結合を介してタンパク質、好ましくは粒子形成タンパク質に連結されたオンコウイルス関連抗原を含む。

更なる実施形態において、本組成物は、抗原が関連するがんの予防及び／または治療のために使用され得る。

一実施形態において、抗原は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、男性の乳癌、青年のがん、小児のがん、若年成人のがん、原発不明がん（ＣＵＰ）、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、目のがん、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、白血病、成人の急性リンパ球性、白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、小児白血病、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、小児の非ホジキンリンパ腫、口腔及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織癌肉腫、皮膚癌、基底及び扁平上皮細胞皮膚癌、黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、原発性マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんに関連するタンパク質もしくはペプチドまたはポリペプチドの抗原断片である。

いくつかの実施形態において、がんは、乳癌、胃癌、卵巣癌、及び子宮体部漿液性癌からなる群から選択される。

それらのＨｅｒ２／Ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）及び／またはサバイビンもしくはその抗原断片を、本明細書に記載されるＶＬＰまたはナノ粒子に連結することにより、例えばＨｅｒ２／Ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）及び／またはサバイビンの高発現を有する細胞に対して反応し、免疫寛容を克服するために免疫系を活性化することができるＶＬＰまたはナノ粒子を形成する。一実施形態において、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）及び／またはサバイビンは、本明細書に開示されるがん疾患及び／または他のがん疾患の予防及び／または治療のために使用され得る。同様の推論を使用して、その他のがん疾患関連抗原を任意のがん疾患に対して使用してもよい。そのような抗原は、インターロイキン－１７、ヘマグルチニン、ＧＤ２、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２１、ヒト黒色腫タンパク質ｇｐ１００、ヒト黒色腫タンパク質メラン－Ａ／ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＮＡ１７－Ａｎｔ、ＭＡＧＥ－３、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶＬ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ｐ５３、ｈＣＧ、Ｆｅｌｄ１、及び（ＩＨＮＶ）Ｇタンパク質からなる群から選択され得る。

一実施形態において、本発明の抗原は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）及び／またはサバイビンもしくはその抗原断片であって、抗原は、本明細書に開示される種類のがんの少なくとも１つに関連し、それを対象とする。一実施形態において、本開示の抗原は、そのインターロイキン－１７、赤血球凝集素、ＧＤ２、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２１、ヒト黒色腫タンパク質ｇｐ１００、ヒト黒色腫タンパク質ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＮＡ１７－Ａｎｔ、ＭＡＧＥ－３、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶＬ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＨＰＶＬ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ｐ５３、ｈＣＧ、Ｆｅｌｄ１及び（ＩＨＮＶ）Ｇタンパク質または抗原断片であって、抗原は、本明細書に開示される種類のがんの少なくとも１つに関連し、それを対象とする。

心血管疾患及び関連抗原
２００８年には推定１，７３０万人が心血管疾患で死亡し、これは全世界の死亡者数の３０％に相当する。タバコの使用、不健康な食事と肥満、運動不足、高血圧、糖尿病、脂質の上昇などのリスク要因に対処することは、心血管疾患の予防にとって重要である。しかし、予防的な医薬品対策の必要性はますます重要になっている。本発明は、ほとんどの種類の心血管疾患の治療／予防に使用され得る。本発明が使用され得る心血管疾患の種類は、抗原の選択によって決定される。

本発明の一実施形態において、抗原は、高脂血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ高脂血症、続発性高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、黄色腫症、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠乏症、動脈硬化状態（例えば、アテローム性動脈硬化症）、冠動脈疾患、心血管疾患などの脂質疾患を含む群から選択される疾患に関連するタンパク質もしくはペプチドまたはポリペプチドの抗原断片である。

本発明の一実施形態において、抗原は、心血管疾患に関連するタンパク質もしくはペプチドまたはポリペプチドの抗原断片である。更なる実施形態において、心血管疾患は、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、及び高コレステロール血症からなる群から選択される。

心血管疾患に関連するポリペプチドの一例は、コレステロール恒常性に作用するＰＣＳＫ９である。ＰＣＳＫ９の阻害には医学的意義があり、血漿及び／または血清の低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）値を低下させることができる。ＬＤＬ－Ｃを減らすと、心臓発作などのリスクが軽減される。

ＰＣＳＫ９抗原をＶＬＰまたはナノ粒子に連結すると、ＰＣＳＫ９の結合及び血流からのＰＣＳＫ９の除去またはＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体への結合の妨害のいずれかを行う抗体を産出するために免疫系を活性化することができるＰＣＳＫ９－ＶＬＰ／ナノ粒子ベースのワクチンが形成される。一実施形態において、本組成物は、本明細書に開示される心血管疾患及び／またはその他の心血管疾患の予防及び／または治療のために使用することができる。同様の推論を使用して、その他の心血管疾患関連抗原を、任意の心血管疾患に対して使用してもよい。

好ましい実施形態において、抗原は、ＰＳＣＫ９またはその抗原断片を含み、抗原は、本明細書に開示される心血管疾患及び／またはその他の心血管疾患の少なくとも１つに関連し、それを対象とする。

心血管疾患に関連するポリペプチドの別の例は、コレステロール恒常性に作用するＡＮＧＰＴＬ３である。ＡＮＧＰＴＬ３の阻害には医学的意義があり、血漿及び／または血清の低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）値を低下させることができる。ＬＤＬ－Ｃを減らすと、心臓発作などのリスクが軽減される。

ＡＮＧＰＴＬ３抗原をＶＬＰまたはナノ粒子に連結すると、ＡＮＧＰＴＬ３の結合及び血流からのＡＮＧＰＴＬ３の除去またはＡＮＧＰＴＬ３のＬＤＬ受容体への結合の妨害のいずれかを行う抗体を産出するために免疫系を活性化することができるＡＮＧＰＴＬ３－ＶＬＰ／ナノ粒子ベースのワクチンが形成されるため、ＬＤＬ－Ｃ値及び心臓発作のリスクが低下する。一実施形態において、本組成物は、本明細書に開示される心血管疾患及び／またはその他の心血管疾患の予防及び／または治療のために使用され得る。同様の推論を使用して、その他の心血管疾患関連抗原を任意の心血管疾患に対して使用してもよい。

好ましい実施形態において、抗原は、ＡＮＧＰＴＬ３またはその抗原断片を含み、抗原は、本明細書に開示される心血管疾患及び／またはその他の心血管疾患の少なくとも１つに関連し、それを対象とする。

免疫炎症性疾患及び関連抗原
世界中の免疫炎症性疾患の有病率は、先進国と発展途上国の両方で劇的に上昇している。世界保健機関の統計によると、世界で数億人もの対象がアレルギー性鼻炎に苦しんでおり、３億人が、個人の生活の質に著しく影響を与え、社会の社会経済的福祉に悪影響を及ぼしている喘息を患っていると推定される。

インターロイキン５（ＩＬ－５）は、重度の好酸球性喘息を含む、様々な種類のアレルギーにおける好酸球性炎症において重要な役割を果たすことが示されている。好酸球は、その動員、活性化、成長、分化、及び生存に関してＩＬ－５によって調節されており、その結果、このサイトカインが治療的介入の主な標的として特定された。

ＩＬ－５抗原またはその断片を本発明の粒子形成タンパク質に連結すると、ＩＬ－５に対して反応するために免疫系を活性化することができるＩＬ－５－ＶＬＰ／ナノ粒子ベースのワクチンが形成される。従って、本発明に記載のＩＬ－５ベースの組成物は、好酸球性喘息またはその他の免疫炎症性疾患の治療／予防に使用され得る。その他の免疫炎症性疾患関連抗原（例えば、ＩｇＥもしくはインターロイキン１７またはＩＬ－１７）は、同様の推論を使用して本発明によって使用され得る。従って、本発明に記載されるＩＬ－１７ベースの組成物は、好酸球性喘息またはその他の免疫炎症性疾患の治療／予防に使用され得る。発明が使用され得る喘息またはアレルギーもしくはその他の免疫炎症性疾患の種類は、抗原の選択によって決定される。一実施形態において、抗原は、本明細書に開示される１つまたは複数の喘息または免疫炎症性疾患に関連するタンパク質またはペプチドもしくはポリペプチドの抗原断片である。好ましい実施形態において、喘息または免疫炎症性疾患は、好酸球性喘息、アレルギー、鼻ポリープ、アトピー性皮膚炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、及びチャーグ・シュトラウス症候群からなる群から選択される。

好ましい実施形態において、抗原は、ＩＬ－５、ＩＬ－１７、またはその抗原断片を含み、抗原は、本明細書に開示される喘息またはアレルギー疾患及び／もしくは他の免疫炎症性疾患の少なくとも１つに関連し、それを対象とする。

感染症及び関連抗原
結核及びマラリアは、２つの主要な感染症である。２０１２年には、推定２億７００万例のマラリアが発生し、５０万人以上が死亡した。また、２０１２年には推定８６０万人が結核を発症し、１３０万人がこの疾患で死亡した。現在の治療法は不十分であり、いくつかは薬剤耐性につながっている。従って、結核及びマラリアを治療／予防するための新しく効率的な薬剤が必要とされている。マラリアまたは結核関連抗原もしくはその断片を本発明のＶＬＰまたはナノ粒子に連結すると、例えばマラリアまたは結核に対して反応するために免疫系を活性化することができるＶＬＰまたはナノ粒子ベースのワクチンが形成される。同様の推論を使用して、本発明は、ほとんどの感染症の治療／予防に使用され得る。本発明が使用され得る感染症の種類は、抗原の選択によって決定される。

２０２０年はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックによって特徴付けられ、世界中で数百万人もの感染者が発生したため、この感染症は非常に注目されている。インフルエンザは、対象となる別の感染症である。

一実施形態において、本発明の第２のペプチドタグに融合された抗原は、結核及び／またはマラリアなどの感染症に関連するタンパク質またはペプチドもしくはポリペプチドの抗原断片である。

一実施形態において、熱帯熱マラリア原虫からの抗原は、マラリアの治療／予防に使用するために第２のペプチドタグに融合する。

更なる実施形態において、結核菌からの抗原は、結核の治療／予防に使用するために第２のペプチドタグに融合する。

更なる実施形態において、抗原は、結核菌からのＡｇ８５Ａ、熱帯熱マラリア原虫からのＰｆＲＨ５、熱帯熱マラリア原虫からのＶＡＲ２ＣＳＡ（ドメイン、ＩＤ１－ＩＤ２ａ）、ＣＩＤＲ１ａドメイン、熱帯熱マラリア原虫からのＰｆＥＭＰ１、熱帯熱マラリア原虫からのＧＬＵＲＰ、熱帯熱マラリア原虫からのＭＳＰ３、熱帯熱マラリア原虫からのＰｆｓ２５、熱帯熱マラリア原虫からのＣＳＰ、熱帯熱マラリア原虫からのＰｆＳＥＡ－１、または開示される抗原の抗原断片からなる群から選択される。別の実施形態において、抗原は、熱帯熱マラリア原虫からのＭＳＰ３とＧＬＵＲＰ（ＧＭＺ２）との間に融合構築物を含む。

更なる実施形態において、抗原は、インフルエンザウイルスからのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原またはその抗原断片である。

別の実施形態において、本発明の抗原は、感染症を引き起こす病原生物からのタンパク質、またはその抗原断片を含む。

一実施形態において、抗原は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である。従って、いくつかの実施形態において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質のタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である。いくつかの実施形態において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である。いくつかの実施形態において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質のタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である。いくつかの実施形態において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質のタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である。特定の実施形態において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＲＢＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＱＩＡ２００４４．１）のアミノ酸３１９～５９１である。前記抗原は、キャッチャーまたはタグに融合されてもよく、更にＣタグ精製タグを含んでもよい。

従って、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、
ｉ．第１のペプチドタグに融合したタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み、
前記抗原及び前記タンパク質は、細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を表示する粒子を形成する、前記組成物である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、
ｉ．ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合したタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．ＳｐｙＴａｇに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、
ｉ．ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合したタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．ＳｄｙＴａｇに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、
ｉ．ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒに融合したタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．ＳｐｙＴａｇに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、
ｉ．ＳｐｙＴａｇに融合したタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、
ｉ．ＳｐｙＴａｇに融合したタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、
ｉ．ＳｎｏｏｐＴａｇに融合したタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む。

一実施形態において、抗原は、インフルエンザウイルスのタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である。

異種発現系での発現が困難であることが既知の抗原
いくつかの抗原は、異種発現系での発現が困難である（例えば、大腸菌で産生される哺乳動物抗原）。また多数の抗原も多タンパク質複合体として存在し、生成及び配合を更に複雑にしている。生成及び結合中のタンパク質の分解または凝集も、粒子表示、特にＶＬＰ表示の問題を引き起こす場合がある。これにより抗原が不溶性になり、ｉｎｖｉｔｒｏでの生成及びＶＬＰ技術のワクチンとしての使用が非常に複雑または不可能になる可能性がある。

従ってこれらの抗原は、ｉｎｖｉｖｏでＤＮＡ／ｍＲＮＡによって生成され、ｉｎｖｉｖｏでＶＬＰに直接結合されることから恩恵を受ける可能性がある。これにより、最初にタンパク質／タンパク質複合体を生産および精製する必要がなくなり、最適ではない可能性があるバッファーでの長時間の保存も防ぐ。以下は、このような技術の恩恵を受ける可能性のある数種類の抗原のいくつかの例である。

インターロイキン：アレルギー及び喘息の文脈では、インターロイキンのレベルが疾患の重症度に関与している。粒子技術、特にＶＬＰ技術は、免疫寛容の突破を可能にしてインターロイキンのレベルを制御するため、いくつかの疾患の症状のを緩和する。しかし多くのインターロイキンは、（特に大腸菌において、しかし他の様々な発現系においても）生成が困難であり、不溶性であることが多い。これらのうち、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１及びＩＬ－１７Ａは、現在のｍＲＮＡ／ＤＮＡ技術の恩恵を受ける可能性がある。

従っていくつかの実施形態において、抗原はＩＬ－１３である。いくつかの実施形態において、抗原はＩＬ－３１である。いくつかの実施形態において、抗原はＩＬ－１７である。

同様に、ＰＣＳＫ９はコレステロール値に関与しているため、研究はＰＣＳＫ９ワクチンの作成に焦点を当ててきた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックでは、ウイルスの変異率が非常に高いため、様々な変異体から保護するために新しいワクチンが必要になる可能性がある。しかし、これらの抗原は両方とも真核細胞で生成する必要があり、生産ラインにはコストと時間がかかる。更にＰＣＳＫ９は、ＶＬＰを含む粒子に安定して結合することが非常に困難であることが証明されており、タンパク質の凝集及び分解の問題により開発が大幅に遅れており、成功するには新しいＰＣＳＫ９設計が必要である。従ってこの抗原は、生産時間及びコストを削減するために、ｍＲＮＡ／ＤＮＡ送達技術の恩恵を受ける可能性がある。

従っていくつかの実施形態において、抗原はＰＣＳＫ９である。

最後に、ＨＩＶトリマー及びインフルエンザステム三量体も非常に大きなタンパク質であるため、ＶＬＰなどの粒子に結合するのが難しいタンパク質であり、人工的に設計されたステム三量体には固有の安定性の問題がある。また、多くのＨＩＶ変異体配列は、不安定性の問題により、ステムのみのＨＩＶワクチン設計に組み込むことが不可能であることが証明されていることも文献から既知である（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０２１）。これらの抗原がＤＮＡ／ｍＲＮＡとして送達される（結合効率及び圧力が異なると同時に、粒子に結合する前に不安定な抗原を長期間処理する必要がなくなる）ｉｎｖｉｖｏ系では、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ粒子技術が解決策になり得る。

従っていくつかの実施形態において、抗原はＨＩＶ三量体である。いくつかの実施形態において、抗原はインフルエンザウイルス三量体である。

発現系
本明細書では、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み、
前記第１及び前記第２のポリヌクレオチドが細胞内で発現すると、前記抗原及び前記タンパク質は、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、発現系も提供される。

発現系は、そこから転写されたｍＲＮＡがポリシストロン性の、ポリシストロン性ＲＮＡ構築物及び／またはＤＮＡ構築物からなるか、またはそれを含んでもよい。従っていくつかの実施形態において、発現系の第１及び第２のポリヌクレオチドは、同じリボ核酸分子上にコードされる。いくつかの実施形態において、発現系の第１及び第２のポリヌクレオチドは同じオープンリーディングフレーム内にあり、これにより両方のポリヌクレオチドを転写するために１つのプロモーター配列のみが必要となる。いくつかの実施形態において、発現系の第１及び第２のポリヌクレオチドは別々のオープンリーディングフレーム内にあるため、別々のプロモーターによって制御され得る。

第１のペプチドタグ、第２のペプチドタグ、タンパク質及び／または抗原は、本明細書の他の場所で定義される通りであり得る。

「発現系」という用語は、細胞内でタンパク質及び／またはＲＮＡを生成するように設計された遺伝子構築物を指す。従って発現系は、細胞内でそれぞれタンパク質またはＤＮＡに翻訳または転写されるＲＮＡ及び／またはＤＮＡを含み得る。

発現系は、細胞における遺伝子発現に必要な配列を含み得る。これらには、プロモーター、リボソーム結合部位などの翻訳開始配列、開始コドン、終止コドン、及び転写終結配列が含まれてもよい。原核生物と真核生物とではタンパク質合成に関与する酵素に違いがあるため、発現ベクターは、選択した宿主に適した発現エレメントを含まなければならない。例えば原核生物の発現系は、リボソーム結合のための翻訳開始部位にシャイン・ダルガーノ配列を含んでもよいが、真核生物の発現系は、コザックコンセンサス配列を含んでもよい。

発現系は、選択マーカーなどのマーカー、すなわち人工選択に適した形質を与える遺伝子を追加で含んでもよく、これにより発現系を含む細胞が選択されるか、またはレポーター遺伝子などのスクリーニング可能なマーカー、すなわち、発現系を含む細胞と含まない細胞との区別を可能にする遺伝子であってもよいため、発現系を含む細胞が同定され得る。そのようなマーカーの実施例には、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー、ならびに有色及び／または蛍光化合物などの検出可能な化合物を発現する遺伝子が含まれる。

いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両方ともＤＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、両方ともＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドであり、他方はＲＮＡポリヌクレオチドである。

第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターなどのプロモーターの制御下にあってもよい。第１及び／または第２のポリヌクレオチドは、それぞれ第１及び／または第２のプロモーターの制御下にあってもよく、これらは同一であっても異なっていてもよい。またこれらは、単一のプロモーターの制御下にあってもよい。

発現系の第１及び第２のポリヌクレオチドは、同じ分子内に含まれてもよい。あるいは、発現系の第１及び第２のポリヌクレオチドは、２つ以上の別々の分子内など、異なる分子内に含まれていてもよい。

第１及び／または第２のポリヌクレオチドは、分泌または排出シグナルを含む融合タンパク質を取得するためにこのようなシグナルを更に含んでもよく、これにより、第１のペプチドタグに融合されたタンパク質及び／または第２のペプチドタグに融合された抗原は、小胞体から、更に任意的に細胞から分泌または排出される。

本発明の発現系は、本明細書において上記で開示された広範囲の疾患の予防及び／または治療のために使用され得る。

細胞及び宿主細胞
本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド及び／または発現系を含む、宿主細胞などの細胞に更に関連する。ポリヌクレオチド及び／または発現系は、コドン最適化された配列を有してもよい。コドン最適化法は当技術分野において既知であり、異種宿主生物または細胞における最適化された発現を可能にする。一実施形態において、細胞は、細菌、酵母、真菌、植物、哺乳動物及び／または昆虫細胞を含む群から選択され得る。

宿主細胞などの細胞内で第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドを発現させる方法は、当技術分野で周知である。第１または第２のポリペプチドは、細胞のゲノムにクローン化された対応するポリヌクレオチド配列から異種発現されてもよく、または第１または第２のポリペプチドは、ベクター内に含まれていてもよい。例えば、第１及び／または第２のポリペプチドをコードする第１及び／または第２のポリヌクレオチドがゲノムにクローン化され、第１及び／または第２のポリペプチドをコードする第１及び／または第２のポリヌクレオチドが、細胞に変換またはトランスフェクトされたベクター内に含まれる。

細胞における第１及び第２のポリペプチドの発現は、一時的方法で起こり得る。ポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチドがゲノムにクローン化される場合、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターも同様にクローン化され得る。このような誘導性プロモーターは当技術分野で周知である。あるいは、遺伝子サイレンシングのサプレッサーをコードする遺伝子を、ゲノムに、または細胞内でトランスフェクトされたベクターにクローン化することもできる。

従って、更に本明細書では、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行請求項のいずれか１項に定義される前記第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行請求項のいずれか１項に定義される前記第２のポリヌクレオチドと、を発現する細胞であって、
前記抗原及び前記タンパク質は、前記細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、前記細胞が提供される。

いくつかの実施形態において、細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は真菌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は植物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は昆虫細胞である。

特定の実施形態において、宿主細胞などの細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ｓｆ９）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）、ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓２９３、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｃｖ．ＳａｍｓｕｎＮＮ及びＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍｃｖ．Ｓｏｌａｒａを含む群から選択され得る。従って一実施形態において、細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである。別の実施形態において、細胞はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａである。別の実施形態において、細胞はＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓである。別の実施形態において、細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。別の実施形態において、細胞はＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである。別の実施形態において、細胞はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２である。別の実施形態において、細胞はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓである。別の実施形態において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）である。別の実施形態において、細胞はヒト胎児腎臓２９３である。別の実施形態において、細胞はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）である。別の実施形態において、細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｃｖ．ＳａｍｓｕｎＮＮである。別の実施形態において、細胞はＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍｃｖ．Ｓｏｌａｒａである。

いくつかの実施形態において、宿主細胞などの細胞は、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を発現し、
前記抗原及び前記タンパク質は、細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成し、前記細胞は、細菌、酵母、真菌、植物、哺乳動物及び／または昆虫細胞を含む群から選択される。

宿主細胞などの本細胞は、本明細書で上記に開示されているように、広範囲の疾患の予防および／または治療に使用することができる。

実施例１－実施例２及び３の材料及び方法
ＳｐｙｔａｇｇｅｄＢ型肝炎コア抗原、ＳｐｙｔａｇｇｅｄアシネトバクターバクテリオファージＡＰ２０５主要コートタンパク質及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の遺伝子配列は、Ｇｅｎｅａｒｔによってコドン最適化及び合成した。

配列：
＞ｐＶａｘ１＿ＳｐｙＴａｇ－ＡＰ２０５

ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫＧＳＧＴＡＧＧＧＳＧＳＡＮＫＰＭＱＰＩＴＳＴＡＮＫＩＶＷＳＤＰＴＲＬＳＴＴＦＳＡＳＬＬＲＱＲＶＫＶＧＩＡＥＬＮＮＶＳＧＱＹＶＳＶＹＫＲＰＡＰＫＰＥＧＣＡＤＡＣＶＩＭＰＮＥＮＱＳＩＲＴＶＩＳＧＳＡＥＮＬＡＴＬＫＡＥＷＥＴＨＫＲＮＶＤＴＬＦＡＳＧＮＡＧＬＧＦＬＤＰＴＡＡＩＶＳＳＤＴＴＡ＊（配列番号８５、配列番号８８のＤＮＡ配列）

＞ｐＶＡＸ１＿ＨＢｃ－ＳｐｙＴａｇ

ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＶＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＬＲＱＩＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＴＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＧＧＧＧＧＳＰＧＧＧＴＰＳＰＧＧＧＧＳＱＳＰＧＧＧＧＳＱＳＧＥＳＱＣＧＳＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ＊（配列番号８６、配列番号８９のＤＮＡ配列）

＞ｐＶＡＸ１－ＳＰＹＣＥＧＦＰ

ＧＡＭＶＤＴＬＳＧＬＳＳＥＱＧＱＳＧＤＭＴＩＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＫＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＱＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＫＡＴＫＧＤＡＨＩＧＧＳＧＳＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ＊（配列番号８７、配列番号９０のＤＮＡ配列）

ＤＮＡ免疫化に適したプラスミドベクター（ｐＶＡＸ１－図５を参照）への構築物のモジュール組み合せＩＮＦＵＳＩＯＮシャフリング及びクローン化を実行した。

マウス由来のＣ２Ｃ１２筋芽細胞前駆細胞を、以下とトランスフェクトした（リバーストランスフェクション、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を使用した２ｘ２４ウェルプレート）。
Ａ）ＳＰＹＣＥＧＦＰ（ｎ＝３）
Ｂ）ＳＰＹＣＥＧＦＰ及びＳｐｙＴＡＰ２０５（ｎ＝３）
Ｃ）ＳＰＹＣＥＧＦＰ及びＨＢｃＳｐｙＴ（ｎ＝３）

実施例２－トランスフェクションした哺乳動物細胞における明確な細胞内粒子の形成
ｅＧＦＰ（Ｎ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと遺伝子的に融合）及びＢ型肝炎コア抗原（Ｃ末端でＳｐｙＴａｇと遺伝子的に融合）を有する真核細胞のコトランスフェクションは、両方の成分の明らかな発現をもたらし、その後互いに（ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの相互作用を介して）結合して、ｅＧＦＰを表示する微粒子複合体を形成することができた。具体的には、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ｅＧＦＰ及びＳｐｙｔａｇｇｅｄＨＢｃｏｒｅでそれぞれコトランスフェクションしてから７２時間後に収穫したマウス細胞の共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）により、ｅＧＦＰ蛍光シグナルの明確な核周囲分布が明らかになり、ｅＧＦＰの特異化が示された（図１を参照）。

対照的に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ｅＧＦＰ及びＳｐｙｔａｇｇｅｄＡＰ２０５コートタンパク質（大腸菌での発現時に自発的にＶＬＰを形成することが前に示した）によるトランスフェクションは、細胞全体に拡散／不鮮明なｅＧＦＰ蛍光シグナルをもたらした（図２を参照）。

全体として、これらの結果は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒｅＧＦＰ及びＨＢｃＳｐｙＴタンパク質の両方が正常に発現され、ｅＧＦＰが（ｓｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを介して）ＨＢｃＳｐｙＴカプシドタンパク質によって形成された微粒子構造に結合できたことを示している。

実施例３－哺乳動物細胞におけるコードされたタンパク質への微粒子複合体の同時発現及び集合
Ｓｐｙｔａｇｇｅｄコートタンパク質（ＡＰ２０５及びＨＢｃｏｒｅ）が発現してウイルス様粒子を形成できるかどうか、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ｅＧＦＰタンパク質もそのような粒子に（ｓｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを介して）結合できるかどうかを更に調査するために、本発明者らはコトランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞を（トランスフェクションの４８時間後に）収穫し、その後４５秒間（３回、３０％）超音波処理し、イオジキサノール超遠心密度勾配カラムを使用した超遠心分離（ＵＣ）によって画分した。ＵＣ後の画分（コントロールを含む）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで実行し、ニトロセルロース膜に転写し、最終的にポリクローナルＨＲＰコンジュゲート抗ＧＦＰ抗体でプローブした。

コンジュゲートの理論上のサイズ（すなわち５９ｋＤＡ）のおおよそのサイズを有するＵＣ入力レーン（／ペレットレーン）におけるタンパク質のバンドの出現によって示されるように、この実験は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒｅＧＦＰ及びＳｐｙＴａｇｇｅｄＡＰ２０５のコトランスフェクションが２つのタンパク質の発現及びコンジュゲーションを導いた可能性があることを示した。しかし、微粒子タンパク質が含まれていた可能性のあるＵＣ画分（Ｆ３－Ｆ２１）のいずれにも、そのサイズのタンパク質のバンドは見られなかった（図３）。

しかし、ＳｐｙＴ－ＨＢｃ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ｅＧＦＰでコトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の同様の分析は、微粒子タンパク質複合体（図４）を含むと予想される高密度画分を含む、ＵＣ入力サンプル及びＵＣ後の画分（Ｆ３～２１、Ｆ３１及びＦ３２）の両方において、約６４ｋＤａ（すなわち、ＳｐｙＴＨＢｃ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ｅＧＦＰコンジュケートの理論上のサイズ）の透明なタンパク質のバンドを示している。これらの結果は更に、ＳｐｙｔａｇｇｅｄＨＢｃｏｒｅ抗原及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ｅＧＦＰのコトランスフェクションが哺乳動物細胞で同時に発現し、微粒子複合体に集合できることを示している。

実施例４－実施例５から１０で使用されるＤＮＡ配列
以下の命名法は、示されたアミノ酸配列番号をコードするＤＮＡ配列を指すために、実施例５から１０を通して使用される。

実施例５－プラスミドＤＮＡからの可溶性抗原及び粒子形成タンパク質の発現
方法
ＤＮＡをｐＶＡＸ１ベクター（Ｖ２６０２０、ｔｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にクローン化し、大腸菌（ＯｎｅｓｈｏｔＴｏｐ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ４０４００６）にクローン化した。ベクターは、ミディプレップキットを用いて精製した。

ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸＲｅａｇｅｎｔ（１６４４７１００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、３７．５ｕｇを３０ｍＬの培養液でトランスフェクトまたはコトランスフェクションした。

６日間のインキュベーション後、細胞及び上清を収穫した。上清を－２０^ｏＣで凍結し、上清（ＳＮ）と呼ばれるサンプルとした。細胞を１２００ＲＰＭで５分間遠心分離してペレット化し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、１１８３６１７０００１）でＰＢＳに再懸濁した。細胞を３０％、４５秒、３回超音波処理し、２０．０００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した。上清は－２０℃で凍結し、「細胞」と呼ばれるサンプルとした。

細胞及びＳＮの両方を変性ＳＤＳ＋ＤＴＴゲル（１５ｕＬロード）上で泳動し、その後ＳＤＳゲルをニトロセルロース膜に転写して、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ミルク中で一晩ブロッキングした。膜上のタンパク質は、（各ゲルに指定された）一次抗体及び必要に応じて（各ゲルに指定された）二次抗体で検出した。膜は、各抗体間及びＴＢＳ－Ｔで現像する前に３回洗浄した。膜は、製造者の指示に従ってＥＣＬ基板で現像した。

結果及び結論
ｉｎｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞におけるＤＮＡトランスフェクション後、粒子及び可溶性抗原の発現及び（分泌シグナルによる）分泌は、細胞のＷＢ及びトランスフェクションした細胞からのＳＮによって検出することができた。ウエスタンブロットは、粒子または可溶性抗原の予想されるサイズでバンドの出現を示している。

これは、以下で示された。
・Ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－ｃｔａｇ
・Ｓｉｇｎ８－ｔａｎｄｅｍＨＢｃ－ＳｐｙＣ
・Ｓｉｇｎ８－ＨＢｃ－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ９－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ－ＳｐｙＣ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ
・Ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ

図６及び７に見られるように、すべての構築物の細胞及び上清サンプルで予想されるサイズのバンドが観察されたため、プラスミドＤＮＡトランスフェクション後の、ヒト（ＨＥＫ）における細胞粒子形成サブユニットタンパク質及び可溶性タンパク質の発現及び分泌が示された。

実施例６－プラスミドＤＮＡから発現した粒子及びタンパク質の結合
方法
ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸＲｅａｇｅｎｔ（１６４４７１００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、３７．５ｕｇを３０ｍＬの培養液でコトランスフェクションした。

細胞は、粒子をコードするベクター及び結合に適合するｔａｇ－ｃａｔｃｈｅｒを持つタンパク質をコードするベクターとコトランスフェクションした。

６日間のインキュベーション後、細胞及び上清を収穫した。上清を－２０℃で凍結し、上清（ＳＮ）と呼ばれるサンプルとした。細胞を１２００ＲＰＭで５分間遠心分離してペレット化し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、１１８３６１７０００１）でＰＢＳに再懸濁した。細胞を３０％、４５秒、３回超音波処理し、２００００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した。上清は－２０℃で凍結し、「細胞」と呼ばれるサンプルとした。

結果及び結論
哺乳動物（ＨＥＫ２９３）細胞のｉｎｖｉｔｒｏでのＤＮＡコトランスフェクション後、個々に発現した抗原及び粒子形成タンパク質のイソペプチド結合により媒介されるコンジュゲーションは、コンジュゲーションした抗原及び粒子形成タンパク質の予想されるサイズのバンドを検出することによって、ＷＢで検証することができた。

これは、以下で示された。
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ及びｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ及びｓｉｇｎ８－Ｈｂｃ－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ８－ｔａｎｄｅｍＨＢｃ－ＳｐｙＣ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－ｃｔａｇ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－ＬＳ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ８－Ｈｂｃ－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ及びｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－Ｃｔａｇ及びｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ８－Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ－ＳｐｙＴ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ

図８、９、及び１０に見られるように、すべての構築物の細胞及び上清中の異なる粒子形成サブユニットタンパク質に結合したｅＧＦＰ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、及びＰｆｓ２５（モデル抗原）の予想されるサイズのバンドが観察された。これは、ヒト（ＨＥＫ）細胞にコトランスフェクションした後に、対応するタグ／キャッチャーを持つ抗原及び粒子をｉｎｖｉｔｒｏで結合することができることを示している。

実施例７－超遠心分離及びウェスタンブロッティングによるナノ粒子形成の検証
方法
ＨＥＫ細胞のトランスフェクション及び収穫後、上清をＯｐｔｉｐｒｅｐステップ勾配（２３、２９及び３５％）にロードし、続いて４７８００ｇ、１６℃で３時間３０分間遠心分離した。次に勾配を画分（Ｆ１～Ｆ１２）に滴下し、各画分に約２５０ｕＬを含めた。

粒子が形成された場合、中間画分（Ｆ３～Ｆ８）で見られると予想される。

すべての画分を変性ＳＤＳ＋ＤＴＴゲル（１５ｕＬロード）上で泳動し、その後ＳＤＳゲルをニトロセルロース膜に転写して、ＴＢＳ－Ｔ５％ミルク中で一晩ブロッキングした。膜上のタンパク質は、（各ゲルに指定された）一次抗体及び必要に応じて（各ゲルに指定された）二次抗体で検出した。膜は、各抗体間及びＴＢＳ－Ｔで現像する前に３回洗浄した。膜は、製造者の指示に従ってＥＣＬ基板で現像した。

結果及び結論
ｉｎｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞でのＤＮＡのコトランスフェクションまたはトランスフェクションの後、本発明者らは、粒子の形成及び分泌の可能性を検出することができた。タンパク質が、密度勾配から３～８番目の画分内に見られる場合、粒子形成を期待することができる。これは、以下の場合に当てはまった。
・Ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－Ｃｔａｇ
・Ｓｉｇｎ８－ｔａｎｄｅｍＨＢｃ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ
・Ｓｉｇｎ９－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ－ＳｐｙＣ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ＋ｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２＋ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ＋ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－ｅＧＦＰ

図１１及び１２に見られるように、関連する画分（画分３～８）に存在する予想されるサイズのバンドが見られるため、粒子形成及び抗原に結合した粒子の形成がすべての描写された構築物で観察された。従ってこれは、ヒト（ＨＥＫ）細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後、ｉｎｖｉｖｏで粒子サブユニット及び可溶性抗原の発現及び分泌があっただけでなく、ｉｎｖｉｔｒｏで粒子及び抗原に結合した粒子の形成もあったことを示している。

実施例８－透過型電子顕微鏡による粒子形成の可視化
ＨＥＫ細胞のトランスフェクション、収穫、及び超遠心分離による精製の後、サンプルを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で実行した。

ＤＮＡをｉｎｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞にコトランスフェクションまたはトランスフェクションした後、分泌された粒子の形成をＴＥＭで可視化した。

これは、以下で示された。
・Ｓｉｇｎ９－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ－ＳｐｙＣ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ＋ｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＴ－Ｅ２＋ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ
・Ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－Ｃｔａｇ＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ
・Ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ＋ｓｉｇｎ７－Ｐｆｓ２５－ＳｐｙＴ－Ｃｔａｇ

図１３から分かるように、予想されるサイズの粒子が、トランスフェクションまたはコトランスフェクションされた細胞の上清に形成された。従って、プラスミドＤＮＡからｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクションまたはコトランスフェクションした細胞の上清で、粒子及び結合粒子を形成することができることが更に確認された。

実施例９－ナノ粒子形成タンパク質への抗原の細胞内コンジュゲーションの検証
方法
ＤＮＡをｐＶＡＸ１（Ｖ２６０２０、ｔｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ベクターにクローン化し、大腸菌（ＯｎｅｓｈｏｔＴｏｐ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ４０４００６）にクローン化した。ベクターは、ミディプレップキットを用いて精製した。

ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸＲｅａｇｅｎｔ（１６４４７１００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、３７．５ｕｇを３０ｍＬの培養液でトランスフェクションまたはコトランスフェクションした。

６日間のインキュベーション後、細胞及び上清を収穫した。上清を－２０℃で凍結し、上清（ＳＮ）と呼ばれるサンプルとした。細胞を１２００ＲＰＭで５分間遠心分離してペレット化し、１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴに再懸濁して－２０℃で凍結し、「細胞」と呼ばれるサンプルとした。

細胞及びＳＮの両方を変性ＳＤＳ＋ＤＴＴゲル（１５ｕＬロード）上で泳動し、その後ＳＤＳゲルをニトロセルロース膜に転写して、ＴＢＳ－Ｔ５％ミルク中で一晩ブロッキングした。膜上のタンパク質は、（各ゲルに指定された）一次抗体及び必要に応じて（各ゲルに指定された）二次抗体で検出した。膜は、各抗体間及びＴＢＳ－Ｔで現像する前に３回洗浄した。膜は、製造者の指示に従ってＥＣＬ基板で現像した。

結果及び結論
この技術は、細胞内の粒子と可溶性抗原との間の結合の可視化を可能にする。本発明者らは以前、いくつかの粒子がいくつかの抗原と結合できることを示したが、それが分泌後に起こっているのか、それともすでに細胞内で起こっているのかはわからなかった。この実験は、本発明者らがＳＤＳ＋ＤＴＴで収穫された細胞基質からの結合バンドを観察すると、結合が細胞内で起こっていることを示している（これらの化合物は、収穫後の結合を禁止する）。

これは、以下で示された。
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＣ－Ｈｉｓ及びｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ
・Ｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ＋ｓｉｇｎ９－ＳｐｙＣ－Ｆｅｒｒｉｔｉｎ
・Ｓｉｇｎ３－ＳｐｙＣ－ｉ３０１－ｃｔａｇ及びｓｉｇｎ８－ＳｐｙＴ－ｅＧＦＰ
・Ｓｉｇｎ８－ｅＧＦＰ－ＳｐｙＣ及びｓｉｇｎ９－ＬＳ－ＳｐｙＴ

図１４に見られるように、粒子及び可溶性抗原は、上清だけでなく細胞内でも結合させることができた。実際、ＳＤＳ＋ＤＴＴで収穫した細胞で予想される結合サイズのバンドが可視化されたため、ｉｎｖｉｔｒｏ培養において細胞内で結合が発生したことが示された。

実施例１０－マウスにおけるプラスミドＤＮＡの免疫化
方法
粒子及び／または可溶性抗原をコードするＤＮＡを、マウスのワクチン接種に使用した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、３０μｇのＬＳ－ＳｐｙＴ及び３０μｇのＳｐｙＣ（Ｎ＝６）、または３０μｇのＳｐｙＣ（Ｎ＝４）、または３０μｇのＥ２－ＳｐｙＴ及び３０μｇのＳｐｙＣ（Ｎ＝６）で免疫化した。ＤＮＡをＰＢＳ中で製剤化し、右大腿筋に注射した。

マウスは０日目及び５週目に免疫化し、初回後及びブースト後の３週目及び４週目に血液を採取した。血液から血清を分離し、抗ＳｐｙＣＩｇＧの検出のためにＥＬＩＳＡを実行した。この目的のために、９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ）を、ＰＢＳ中の０．１μｇ／ウェルのＳｐｙＣで、４℃で一晩コーティングした。プレートは、ＰＢＳ中のスキムミルク０．５％を使用して、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。マウス血清を、ブロッキングバッファーで１：５０または１：１０に希釈し、２倍希釈でプレートに加えた後、室温で１時間インキュベーションした。プレートを、ステップの間にＰＢＳで３回洗浄した。総血清ＩｇＧを測定するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１６０７２）をブロッキングバッファーで１：１０００に希釈した後、室温で１時間インキュベーションした。プレートをＴＭＢＸ－ｔｒａ基質（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ、４８００Ａ）で現像し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＢｉｏＳａｎＨｉＰｏＭＰＰ－９６マイクロプレートリーダーでデータを収集し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（バージョン８．４．３、米国、サンディエゴ）を使用して分析した。

結果及び結論
マウスのＤＮＡ免疫化後、粒子をコードするＤＮＡ及びＳｐｙＣをコードするＤＮＡを投与されたマウスは、ＳｐｙＣをコードするＤＮＡのみを投与されたマウスと比較して、最初の免疫化後のみＳｐｙＣに対するＩｇＧ力価が高くなることが示された。更に、この傾向は追加免疫化後に更に高くなる。これは、ＬＳ粒子またはＥ２粒子のいずれかと組み合わせてＳｐｙＣを投与されたマウスの両方のグループに当てはまる。

これは図１５に示されており、粒子をコードするＤＮＡ及びＳｐｙＣをコードするＤＮＡを投与されたマウスは、ＥＬＩＳＡで示されるように、ＳｐｙＣをコードするＤＮＡのみを投与されたマウスと比較して、最初の免疫化後のＳｐｙＣに対するＩｇＧ力価が高くなる。

実施例１１－ｍＲＮＡからの可溶性抗原及び粒子形成タンパク質の発現
ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸＲｅａｇｅｎｔ（１６４４７１００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、３７，５μｇを３０ｍＬの培養液でトランスフェクションまたはコトランスフェクションすることになる。

６日間のインキュベーション後、細胞及び上清を収穫することになる。上清を－２０^ｏＣで凍結し、上清（ＳＮ）と呼ばれるサンプルとすることになる。細胞を１２００ＲＰＭで５分間遠心分離してペレット化し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、１１８３６１７０００１）でＰＢＳに再懸濁することになる。細胞を３０％、４５秒、３回超音波処理し、２００００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離することになる。上清は－２０℃で凍結し、「細胞」と呼ばれるサンプルとする。

細胞及びＳＮの両方を、変性ＳＤＳ＋ＤＴＴゲル（１５μＬロード）で泳動することになる。ＳＤＳゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ミルクで一晩ブロッキングすることになる。膜上のタンパク質は、一次抗体及び必要に応じて二次抗体で検出することになる。膜は、各抗体間及びＴＢＳ－Ｔで現像する前に３回洗浄することになる。膜は、製造者の指示に従ってＥＣＬ基板で現像することになる。

ｉｎｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡのトランスフェクション後、粒子及び可溶性抗原の発現及び（分泌シグナルによる）分泌は、実施例５に記載したものと同様のウェスタンブロッティングによって検出されることになる。

すべての構築物（粒子形成サブユニットタンパク質または可溶性タンパク質抗原）の細胞及び上清で予想されるサイズのバンドは、ｍＲＮＡトランスフェクション後のヒト（ＨＥＫ）細胞における可溶性タンパク質の発現及び分泌を示すことになる。

実施例１２－ｍＲＮＡから発現した異なる粒子形成タンパク質への可溶性抗原のコンジュゲーションの検証
ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸＲｅａｇｅｎｔ（１６４４７１００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、３７，５μｇ（各ＲＮＡの１８．７５μｇ）を３０ｍＬの培養液でコトランスフェクションすることになる。

細胞は、粒子をコードするベクター及び結合に適合するｔａｇ－ｃａｔｃｈｅｒを持つタンパク質をコードするベクターとコトランスフェクションすることになる。

６日間のインキュベーション後、細胞及び上清を収穫することになる。上清を－２０ｏＣで凍結し、上清（ＳＮ）と呼ばれるサンプルとすることになる。細胞を１２００ＲＰＭで５分間スピンダウンしてペレット化し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、１１８３６１７０００１）でＰＢＳに再懸濁する。細胞を３０％で、４５秒、３回超音波処理し、２００００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離する。上清は－２０℃で凍結し、「細胞」と呼ばれるサンプルとする。

ｉｎｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡのコトランスフェクション後、発現、分泌及び可溶性抗原への粒子の結合は、実施例６に記載されたものと同様に、粒子及び抗原の予想されるサイズのバンドを検出することによって、ＷＢで検出されることになる。

実施例１３－超遠心分離及びウェスタンブロッティングによる、トランスフェクションしたｍＲＮＡから発現した場合のナノ粒子形成の検証
ｍＲＮＡでＨｅｋ細胞をトランスフェクション及び収穫した後、上清をＯｐｔｉｐｒｅｐステップ勾配（２３、２９及び３５％）にロードし、続いて４７８００ｇ、１６℃で３時間３０分間遠心分離することになる。次に勾配を画分（Ｆ１～Ｆ１２）に滴下し、各画分に約２５０ｕＬを含めることになる。

粒子が形成される場合、中間画分（Ｆ３～Ｆ８）で見られると予想される。

すべての画分は、変性ＳＤＳ＋ＤＴＴゲル（１５μＬロード）で泳動されることになる。ＳＤＳゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ミルクで一晩ブロッキングすることになる。膜上のタンパク質は、一次抗体及び必要に応じて二次抗体で検出することになる。膜は、各抗体間及びＴＢＳ－Ｔで現像する前に３回洗浄することになる。膜は、製造者の指示に従ってＥＣＬ基板で現像することになる。

ｉｎｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡのコトランスフェクションまたはトランスフェクション後、実施例７に記載されたものと同様に、粒子形成及び分泌の可能性が検出されることになる。タンパク質が、密度勾配から３～８番目の画分内に見られる場合、粒子形成を期待することができる。

実施例１４－透過型電子顕微鏡による粒子形成の可視化
実施例８に記載されるように、ＨＥＫ細胞内のｍＲＮＡ構築物から発現した、分泌され集合した粒子は、透過型電子顕微鏡によって検出されることになる。

実施例１５－ｍＲＮＡから発現した場合のナノ粒子形成タンパク質への抗原の細胞内コンジュゲーションの検証
ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸＲｅａｇｅｎｔ（１６４４７１００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、３７．５μｇのＲＮＡを３０ｍＬの培養液でトランスフェクションまたはコトランスフェクションすることになる。

６日間のインキュベーション後、細胞及び上清を収穫することになる。上清を－２０℃で凍結し、上清（ＳＮ）と呼ばれるサンプルとすることになる。細胞を１２００ＲＰＭで５分間遠心分離してペレット化し、１ｘＳＤＳ＋ＤＴＴに再懸濁して－２０℃で凍結し、「細胞」と呼ばれるサンプルとすることになる。

細胞及びＳＮの両方を、変性ＳＤＳ＋ＤＴＴゲル（１５μＬロード）で泳動することになる。ＳＤＳゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ミルクで一晩ブロッキングすることになる。膜上のタンパク質は、一次抗体及び必要に応じて二次抗体で検出することになる。膜は、各抗体間及びＴＢＳ－Ｔで現像する前に３回洗浄することになる。膜は、製造者の指示に従ってＥＣＬ基板で現像する。

これにより、実施例９に示したものと同様に、細胞内の粒子と可溶性抗原との間の結合を可視化することができるようになる。これは、構築物がｍＲＮＡから発現する場合、結合が細胞内で起こることを示すことになる。

実施例１６－マウスにおけるｍＲＮＡ免疫化
粒子及び／または可溶性抗原（それぞれ別々のペプチドタグに融合された粒子及び抗原）をコードするｍＲＮＡは、実施例１０に記載されたものと同様に、マウスにおけるワクチン接種に使用されることになる。

Ｂａｌｂ／ｃマウスは、粒子をコードするｍＲＮＡ及び可溶性抗原をコードするｍＲＮＡの組み合わせ、または可溶性抗原をコードするｍＲＮＡのみのいずれかで免疫化されることになる。マウスは０日目及び５週目に免疫化し、初回後及びブースト後の３週目及び４週目に血液を採取することになる。

血液から血清を分離し、抗原特異的ＩｇＧの検出のためにＥＬＩＳＡを実行することになる。この目的のために、９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ）を、ＰＢＳ中の０．１μｇ／ウェルのＳｐｙＣで、４℃で一晩コーティングすることになる。プレートは、ＰＢＳ中のスキムミルク０．５％を使用して、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングすることになる。マウス血清を、ブロッキングバッファーで１：５０に希釈し、２倍希釈でプレートに加えた後、室温で１時間インキュベーションすることになる。プレートを、ステップの間にＰＢＳで３回洗浄することになる。総血清ＩｇＧを測定するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１６０７２）をブロッキングバッファーで１：１０００に希釈した後、室温で１時間インキュベーションすることになる。プレートをＴＭＢＸ－ｔｒａ基質（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ、４８００Ａ）で現像し、吸光度を４５０ｎＭで測定することになる。ＢｉｏＳａｎＨｉＰｏＭＰＰ－９６マイクロプレートリーダーでデータを収集し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（バージョン８．４．３、米国、サンディエゴ）を使用して分析することになる。

マウスでのｍＲＮＡ免疫化後、粒子及び可溶性抗原をコードするＲＮＡを投与された（従って、結合した抗原粒子複合体を形成する）マウスは、可溶性抗原をコードするＲＮＡのみを投与されたマウスと比較して、可溶性抗原に対するＩｇＧ力価が高くなる。実施例１０に示した結果と同様に、この傾向はブースト免疫化後に更に高くなると予想される。

参照文献

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項目
１．疾患の予防及び／または治療に使用するための組成物であって、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み、
前記抗原及び前記タンパク質は、細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、前記組成物。

２．前記タンパク質が、糖タンパク質などのウイルスカプシドタンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質などの粒子形成タンパク質である、項目１に記載の使用のための組成物。

３．前記タンパク質が、Ｂ型またはＥ型肝炎などの肝炎ウイルスからのタンパク質、例えばＢ型肝炎ウイルスからのコアタンパク質、ＮｏＶなどのノロウイルスからのタンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、好ましくはＨＰＶＬ１などのＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８などのパピローマウイルスからのタンパク質、ポリオーマウイルスｖｐ１（ＰｙＶ）などのポリオーマウイルスからのタンパク質、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、好ましくはＦＣＶＶＰ１などのカリシウイルスからのタンパク質、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、好ましくはＰＣＶ２ＯＲＦ２などのサーコウイルスからのタンパク質、ＮＮＶコートタンパク質などの神経壊死ウイルス（ＮＮＶ）からのタンパク質、イヌパルボウイルス（ＣＶＰ）、好ましくはＣＰＶＶＰ２、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）またはブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、好ましくはＧＰＶもしくはＰＰＶ、またはパルボウイルスＢ１９からの構造タンパク質などのパルボウイルスからのタンパク質、腸炎ウイルス、例えばミンク腸炎ウイルス（ＭＥＶ）、好ましくはＭＥＶＶＰ２、またはアヒルペストウイルス（ＤＰＶ）、好ましくはＤＰＶ構造タンパク質などのプロトパルボウイルスからのタンパク質である、項目２に記載の使用のための組成物。

４．前記タンパク質が、サルモネラウイルスＰ２２から、ＭＳ２から、ＱＢｅｔａ、ＰＲＲ１、ＰＰ７、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆ２またはＣｂ５からのタンパク質などのバクテリオファージタンパク質である、先行項目のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

５．前記第１及び／または前記第２のペプチドタグが、イソペプチド結合形成に関与する反応性アミノ酸をそれぞれ含む相補的結合パートナーを得るために、分子内イソペプチド結合を含むタンパク質の分割に由来するか、既知の結合パートナーを使用することによりライブラリから同定されるか、またはｉｎｓｉｌｉｃｏで設計される、前記組成物であって、好ましくは前記第１または前記第２のペプチドタグが、ＳｐｙＴａｇ（配列番号１）、ＳｄｙＴａｇ（配列番号２）、ＳｎｏｏｐＴａｇ（配列番号３）、ＰｈｏＴａｇ（配列番号４）、ＥｎｔＴａｇ（配列番号５）、ＫＴａｇ、ａＢａｃＴａｇ（配列番号１５）、Ｂａｃ２Ｔａｇ（配列番号１６）、Ｂａｃ３Ｔａｇ（配列番号１７）、Ｂａｃ４Ｔａｇ（配列番号１８）、ＲｕｍＴｒｕｎｋＴａｇ（配列番号１３または配列番号１４）、Ｒｕｍ７Ｔａｇ（配列番号１２）、ＲｕｍＴａｇ（配列番号６）、Ｒｕｍ２Ｔａｇ（配列番号７）、Ｒｕｍ３Ｔａｇ（配列番号８）、Ｒｕｍ４Ｔａｇ（配列番号９）、Ｒｕｍ５Ｔａｇ（配列番号１０）、Ｒｕｍ６Ｔａｇ（配列番号１１）及びＢａｃ５Ｔａｇ（配列番号１９）からなる群から選択されるタグを含み、及び／または好ましくは前記第１または前記第２のペプチドタグは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２１）、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２２）、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（配列番号２３）、及びエステル形成分割タンパク質対からなる群から選択されるタグを含む、先行項目のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

６．疾患が、がん、脂質障害、心血管疾患、免疫炎症性疾患、慢性疾患、神経疾患、アレルギー反応／疾患並びに／もしくはマラリア、結核、及びコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、マラリア、結核、ＨＩＶ、ＨＣＶ、デング熱、チクングニア熱、黄熱病、ＨＢＶまたはインフルエンザなどのウイルスによって引き起こされる疾患からなる群から選択される感染症などの感染症である、先行項目のいずれか１項に記載の使用のための前記組成物。

７．前記抗原が、がん特異的なポリペプチド、心血管疾患に関連するポリペプチド、喘息に関連するポリペプチド、ポリペプチド、鼻ポリープに関連するポリペプチド、アトピー性皮膚炎に関連するポリペプチド、好酸球性食道炎に関連するポリペプチド、好酸球増加症候群に関連するポリペプチド、チャーグ・ストラウス症候群に関連するポリペプチド、及び病原性生物に関連するポリペプチドからなる群のタンパク質、ペプチド、及び／または抗原断片であって、好ましくは前記抗原が、タンパク質、ペプチド及び／または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の抗原断片である、先行項目のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

８．前記抗原が、ヘマグルチニン、ＧＤ２、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２１、ノイラミニダーゼ、ヒト黒色腫タンパク質ｇｐ１００、ヒト黒色腫タンパク質メラン－Ａ／ＭＡＲＴ１、ＨＩＶエンベロープタンパク質、Ｍ２ｅ、ＶＡＲ２ＣＳＡ、ＩＣＡＭ１、ＣＳＰ、デングウイルスＮＳ１、デングウイルスエンベロープタンパク質、チクングニアウイルスエンベロープタンパク質、チロシナーゼ、ＨＣＶＥ２、ＮＡ１７－Ａｎｔ、ＭＡＧＥ－３、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶＬ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ｐ５３、ｈＣＧ、Ｆｅｌｄ１、ＥＧＲＦｖＩＩＩ、エンドグリン、ＡＮＧＰＴＬ－３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ－４、ＨＥＲ２、ＩｇＥ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＴＳＬＰ、ＮＧＦ、（ＩＨＮＶ）Ｇタンパク質、リンホトキシンαまたはβなどのリンホトキシン、リンホトキシン受容体、核因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＩＬ－２３ｐ１９、グレリン、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＣＰ－１、エンドグリン、ＧｎＲＨ、ＴＲＨ、エオタキシン、ブラジキニン、ＢＬＣ、ＴＮＦ－α、アミロイドβペプチドＡ、アンギオテンシン、ガストリン、プロガストリン、ＣＥＴＰ、ＣＣＲ５、Ｃ５ａ、ＣＸＣＲ４、Ｄｅｓ－Ａｒｇ－ブラジキニン、ＧｎＲＨペプチド、アンギオテンシンペプチド、ＴＮＦペプチド、またはその抗原断片もしくは抗原性変異体からなる群から選択される、前記組成物であって、好ましくは前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質からなる群から選択される、先行項目のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

９．先行項目のいずれか１項に記載の組成物。

１０．
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む発現系であって、
前記第１及び前記第２のポリヌクレオチドが細胞内で発現すると、前記抗原及び前記タンパク質は、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成し、任意的に、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、前記タンパク質及び／または前記抗原は、項目１～８のいずれか１項に定義されるとおりである、前記発現系。

１１．
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行項目のいずれか１項に定義される、前記第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行項目のいずれか一項に定義される、前記第２のポリヌクレオチドと、を発現する細胞であって、
前記抗原及び前記タンパク質は、前記細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成し、任意的に、前記細胞が項目１０に記載される前記発現系を含む、前記細胞。

１２．宿主細胞が、項目１０に記載される前記発現系を含む、前記宿主細胞。

１３．対象における免疫反応を誘導する方法における使用のための、項目１０に記載の前記発現系、及び／または項目１１～１２に記載のいずれか１項に記載の前記細胞または前記宿主細胞であって、前記方法が、前記組成物、前記ポリヌクレオチドまたは前記発現系を前記対象に対して少なくとも１回投与するステップを含む、項目１～８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

１４．組成物を必要とする対象の疾患の予防及び／または治療に使用するための前記組成物の投与方法であって、
ｉ．項目１～９のいずれか１項に定義される少なくとも１つの前記組成物を得るステップと、
ｉｉ．先行項目のいずれか１項に定義された疾患の予防及び／または治療のために、前記組成物を対象に少なくとも１回投与するステップと、を含む前記投与方法。

１５．
ｉ．項目１～９のいずれか１項に記載の組成物または項目１０に記載の発現系と、
ｉｉ．任意的に、前記組成物を投与するための医療器具またはその他の手段と、
ｉｉｉ．使用説明書と、を含むパーツのキット。

Claims

疾患の予防及び／または治療に使用するための組成物であって、
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み、
前記抗原及び前記タンパク質は、細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、前記組成物。
前記粒子がウイルス様粒子である、請求項１に記載の使用のための組成物。
前記粒子がナノ粒子である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１及び／または前記第２のポリヌクレオチドがＤＮＡである、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１及び／または前記第２のポリヌクレオチドがＲＮＡである、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記ＲＮＡが脂質粒子製剤に製剤化されている、請求項５に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が粒子形成タンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が、糖タンパク質などのウイルスカプシドタンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が、ヒトウイルスなどの哺乳動物ウイルスからのウイルスカプシドタンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が、Ｂ型またはＥ型肝炎などの肝炎ウイルスからのタンパク質、例えばＢ型肝炎ウイルスからのコアタンパク質、ＮｏＶなどのノロウイルスからのタンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、好ましくはＨＰＶＬ１などのＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８などのパピローマウイルスからのタンパク質、ポリオーマウイルスｖｐ１（ＰｙＶ）などのポリオーマウイルスからのタンパク質、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、好ましくはＦＣＶＶＰ１などのカリシウイルスからのタンパク質、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、好ましくはＰＣＶ２ＯＲＦ２などのサーコウイルスからのタンパク質、ＮＮＶコートタンパク質などの神経壊死ウイルス（ＮＮＶ）からのタンパク質、イヌパルボウイルス（ＣＶＰ）、好ましくはＣＰＶＶＰ２、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）またはブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、好ましくはＧＰＶもしくはＰＰＶ、またはパルボウイルスＢ１９からの構造タンパク質などのパルボウイルスからのタンパク質、腸炎ウイルス、例えばミンク腸炎ウイルス（ＭＥＶ）、好ましくはＭＥＶＶＰ２、またはアヒルペストウイルス（ＤＰＶ）、好ましくはＤＰＶ構造タンパク質などのプロトパルボウイルスからのタンパク質である、請求項９に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が、ササゲウイルス、タバコウイルス、トマトウイルス、キュウリウイルスまたはジャガイモウイルスなどの植物ウイルスからのタンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記植物ウイルスが、モザイクウイルス、好ましくはササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマト黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、またはジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）である、請求項１１に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が、バクテリオファージタンパク質、例えばサルモネラウイルスＰ２２から、ＭＳ２から、ＱＢｅｔａから、ＰＲＲ１、ＰＰ７、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆ２またはＣｂ５からのタンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が、配列番号６９に記載のフェリチン、配列番号７２に記載のｉ３０１、レプリカーゼポリタンパク質１ａ（ｐｐ１ａ）、配列番号７０に記載のルマジンシンターゼ、配列番号９２に記載のＨｂｃ、配列番号９３に記載のｔａｎｄｅｍＨＢｃ、配列番号９７に記載の２－オキソ酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ２、または配列番号９８に記載のノロウイルスカプシドタンパク質などの粒子形成タンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１または前記第２のペプチドタグが、配列番号１に記載のＳｐｙＴａｇ、配列番号２に記載のＳｄｙＴａｇ、配列番号３に記載のＳｎｏｏｐＴａｇ、配列番号４に記載のＰｈｏＴａｇ、配列番号５に記載のＥｎｔＴａｇ、配列番号１５に記載のＢａｃＴａｇ、配列番号１６に記載のＢａｃ２Ｔａｇ、配列番号１７に記載のＢａｃ３Ｔａｇ、配列番号１８に記載のＢａｃ４Ｔａｇ、配列番号１３または配列番号１４に記載のＲｕｍＴｒｕｎｋＤ９Ｎｔａｇ、配列番号１２に記載のＲｕｍ７Ｔａｇ、配列番号６に記載のＲｕｍＴａｇ、配列番号７に記載のＲｕｍ２Ｔａｇ、配列番号８に記載のＲｕｍ３Ｔａｇ、配列番号９に記載のＲｕｍ４Ｔａｇ、配列番号１０に記載のＲｕｍ５Ｔａｇ、配列番号１１に記載のＲｕｍ６Ｔａｇ及び配列番号１９に記載のＢａｃ５Ｔａｇからなる群から選択されるタグを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１または前記第２のペプチドタグが、配列番号２１に記載のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、配列番号２２に記載のＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ、配列番号２３に記載のＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、及びエステル形成分割タンパク質対からなる群から選択されるタグを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記組成物がＳｐｙＬｉｇａｓｅを更に含み、これにより前記２つのペプチドタグが互いにロックされ得る、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１及び前記第２のペプチドタグの一方がＳｄｙＴａｇであり、前記第１及び前記第２のペプチドタグの他方がＳｄｙＣａｔｃｈｅｒである、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１及び前記第２のペプチドタグの１つは、配列番号１に記載のＳｐｙＴａｇまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体などのＳｐｙＴａｇであり、前記第１及び前記第２のペプチドタグの他方は、配列番号２１に記載のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体などのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１及び前記第２のペプチドタグの一方がＳｎｏｏｐＴａｇであり、前記第１及び前記第２のペプチドタグの他方がＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒである、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
１つまたは複数の前記第１のペプチドタグが、前記タンパク質のＮ末端、Ｃ末端に融合され、及び／または前記タンパク質のコード配列に、任意的にリンカーによってインフレームで挿入される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
１つまたは複数の前記第２のペプチドタグが、前記抗原のＮ末端、Ｃ末端に融合され、及び／または前記抗原のコード配列に、任意的にリンカーによってインフレームで挿入される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記疾患が、がん、脂質異常症、心血管疾患、免疫炎症性疾患、慢性疾患、神経疾患、感染症及び／またはアレルギー反応／疾患である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記がんが、乳癌、胃癌、卵巣癌、神経膠芽腫、骨癌、皮膚癌及び子宮体部漿液性癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用のための組成物。
前記脂質障害が、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型高脂血症、続発性高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、黄色腫症及びコレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠損症などの脂質障害からなる群から選択される、請求項２３から２４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記心血管疾患が、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患及び／または高コレステロール血症からなる群から選択される、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記慢性または免疫炎症性疾患が、好酸球性喘息、アレルギー、鼻ポリープ、アトピー性皮膚炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、接触性アレルギー及びチャーグ・ストラウス症候群からなる群から選択される、請求項２３から２６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記神経疾患がアルツハイマー病である、請求項２３から２７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記感染症が、マラリア、結核、及びコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、マラリア、結核、ＨＩＶ、ＨＣＶ、デング熱、チクングニア熱、黄熱病、ＨＢＶまたはインフルエンザなどのウイルスによって引き起こされる疾患からなる群から選択される、請求項２３から２８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原が、ポリペプチド、ペプチド、及び／または異常な生理学的反応に関連または特異的なポリペプチドの抗原断片である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記異常な生理学的反応が、自己免疫疾患、アレルギー反応及び／またはがんである、請求項３０に記載の使用のための組成物。
前記抗原が、がん特異的なポリペプチド、心血管疾患に関連するポリペプチド、喘息に関連するポリペプチド、ポリペプチド、鼻ポリープに関連するポリペプチド、アトピー性皮膚炎に関連するポリペプチド、好酸球性食道炎に関連するポリペプチド、好酸球増加症候群に関連するポリペプチド、チャーグ・ストラウス症候群に関連するポリペプチド、及び病原性生物に関連するポリペプチドからなる群のタンパク質、ペプチド、及び／または抗原断片である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のタンパク質、ペプチド及び／または抗原断片である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原は、ヘマグルチニン、ＧＤ２、ＥＧＦ－Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２１、ノイラミニダーゼ、ヒト黒色腫タンパク質ｇｐ１００、ヒト黒色腫タンパク質ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ１、ＨＩＶエンベロープタンパク質、Ｍ２ｅ、ＶＡＲ２ＣＳＡ、ＩＣＡＭ１、ＣＳＰ、デングウイルスＮＳ１、デングウイルスエンベロープタンパク質、チクングニアウイルスエンベロープタンパク質、チロシナーゼ、ＨＣＶＥ２、ＮＡ１７－Ａｎｔ、ＭＡＧＥ－３、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＨＰＶＬ２、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ｐ５３、ｈＣＧ、Ｆｅｌｄ１、ＥＧＲＦｖＩＩＩ、エンドグリン、ＡＮＧＰＴＬ－３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＬＡ－４、ＨＥＲ２、ＩｇＥ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＴＳＬＰ、ＮＧＦ、（ＩＨＮＶ）Ｇタンパク質、リンホトキシンαまたはβなどのリンホトキシン、リンホトキシン受容体、核因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＩＬ－２３ｐ１９、グレリン、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＣＰ－１、エンドグリン、ＧｎＲＨ、ＴＲＨ、エオタキシン、ブラジキニン、ＢＬＣ、ＴＮＦ－α、アミロイドβペプチドＡ、アンギオテンシン、ガストリン、プロガストリン、ＣＥＴＰ、ＣＣＲ５、Ｃ５ａ、ＣＸＣＲ４、Ｄｅｓ－Ａｒｇ－ブラジキニン、ＧｎＲＨペプチド、アンジオテンシンペプチドもしくはＴＮＦペプチド、またはその抗原断片もしくは抗原変異体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原が、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－１７Ａ、ＰＳＣＫ９、ＨＩＶ三量体、及びインフルエンザウイルス三量体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原が、配列番号９４に記載のｅＧＦＰまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、配列番号９６に記載のＰｆｓ２５またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、及び配列番号９５に記載のＨｉｓ浄化タグまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原が、前記感染症を引き起こす前記病原生物に特異的なタンパク質またはペプチド、もしくはその断片である、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原が、ホモサピエンス、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、マウス、ラット、サルなどの哺乳動物、及び／またはニワトリなどのトリ及び／またはサケなどのサカナなどの動物における免疫反応を誘導することができる、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記抗原がポリヒスチジンタグを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記タンパク質が、配列番号７２に記載のｉ３０１またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、配列番号９２に記載のＨｂｃ、またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、配列番号９３に記載のｔａｎｄｅｍＨＢｃまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、配列番号６９に記載のヒトフェリチン、またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、配列番号９７に記載の前記２－オキソ酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ２またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、配列番号７０に記載のルマジンシンターゼ、またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、及び配列番号９８に記載の前記ノロウイルスカプシドタンパク質またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
前記第１及び前記第２のペプチドタグが、配列番号１に記載のＳｐｙＴａｇまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、及び配列番号２１に記載のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体からなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
前記抗原が、配列番号９４に記載のｅＧＦＰまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、配列番号９６に記載のＰｆｓ２５またはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体、及び配列番号９５に記載のＨｉｓ浄化タグまたはそれに対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するその相同体からなる群から選択される、請求項４１から４２のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含む発現系であって、
前記第１及び前記第２のポリヌクレオチドが細胞内で発現すると、前記抗原及び前記タンパク質は、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、前記発現系。
前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、前記タンパク質及び／または前記抗原が、請求項１から４０のいずれか１項に定義されるとおりである、請求項４４に記載の発現系。
前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、両方ともＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項４４のいずれか１項に記載の発現系。
前記第１及び前記第２のポリヌクレオチドが、ウイルスベクターまたはプラスミドなどの１つのベクター内に含まれるか、または前記第１及び前記第２のポリヌクレオチドが、２つのウイルスベクター、２つのプラスミド、もしくは１つのウイルス及び１つのプラスミドなどの２つのベクター内に含まれる、請求項４４から４６のいずれか１項に記載の発現系。
前記ウイルスベクターが、修飾アデノウイルスベクター、例えば複製欠損サルアデノウイルスベクターＣｈＡｄＯｘ１、または修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターなどのアデノウイルスベクターである、請求項４７に記載の発現系。
前記発現系がプラスミドを含むか、またはそれで構成される、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の発現系。
前記プラスミドがｐＶＡＸ１である、請求項４９に記載の発現系。
前記発現系がプラスミドを含むか、またはｍＲＮＡで構成される、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の発現系。
前記第１のポリヌクレオチドが、第１のペプチドタグを含むタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含むか、またはそれで構成され、前記第２のポリヌクレオチドが、第２のペプチドタグを含む抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含むか、またはそれで構成される、請求項４４から５１のいずれか１項に記載の発現系。
前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、同じ核酸分子内、または２つの異なる核酸分子内に含まれる、請求項４４から５２のいずれか１項に記載の発現系。
前記第１のポリヌクレオチドの上流に第１のプロモーターを更に含む、請求項４４から５３のいずれか１項に記載の発現系。
前記第２のポリヌクレオチドの上流に第２のプロモーターを更に含む、請求項４４から５４のいずれか１項に記載の発現系。
前記第１のプロモーターが構成的プロモーターであり、前記第２のプロモーターがビタミンＤ誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターである、請求項４４から５５のいずれか１項に記載の発現系。
前記第１及び前記第２のプロモーターが前記構成的プロモーターである、請求項４４から５５のいずれか１項に記載の発現系。
前記第１のポリヌクレオチドが分泌または排出シグナルを更に含み、これにより、前記第１のペプチドタグに融合された前記タンパク質が、前記細胞の小胞体から分泌または排出される、請求項４４から５７のいずれか１項に記載の発現系。
前記第２のポリヌクレオチドが分泌または排出シグナルを更に含み、これにより、前記第２のペプチドタグに融合された前記抗原が、前記細胞の前記小胞体から分泌または排出される、請求項４４から５８のいずれか１項に記載の発現系。
前記分泌または前記排出シグナルが、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３もしくは配列番号８４を含むか、またはそれで構成される、請求項４４から５９のいずれか１項に記載の発現系。
ｉ．第１のペプチドタグに融合されたタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行請求項のいずれか１項に定義された、前記第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ．第２のペプチドタグに融合された抗原をコードする第２のポリヌクレオチドであって、好ましくは先行請求項のいずれか１項に定義された、前記第２のポリヌクレオチドと、を発現する細胞であって、
前記抗原及び前記タンパク質は、前記細胞内で発現すると、前記第１のペプチドタグと前記第２のペプチドタグとの間のイソペプチド結合、またはエステル結合を介して連結され、これにより、ｉ－ｉｉが前記抗原を表示する粒子を形成する、前記細胞。
請求項４４から６０のいずれか１項に記載の前記発現系を含む、請求項６１に記載の細胞。
宿主細胞が、請求項４４から６０のいずれか１項に記載の発現系を含む、前記宿主細胞。
前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される、請求項６３に記載の宿主細胞。
対象で免疫反応を誘導する方法における使用のための、請求項４４から６０のいずれか１項に記載の前記発現系、及び／または請求項６１から６４のいずれか１項に記載の前記細胞または前記宿主細胞であって、前記方法が、前記組成物、前記ポリヌクレオチドまたは前記発現系を前記対象に対して少なくとも１回投与するステップを含む、請求項１から４０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
組成物を必要とする対象の疾患の予防及び／または治療に使用するための前記組成物の投与方法であって、
先行請求項のいずれか１項に定義される疾患の予防及び／または治療のために、請求項１から４０のいずれか１項に定義される少なくとも１つの前記組成物を対象に少なくとも１回投与するステップを含む、前記投与方法。
前記組成物は、以前の投与とは異なる形態または身体部位での投与によって増強される、請求項６６に記載の使用のための組成物の投与方法。
前記組成物は、提示された疾患の受容体である可能性が高い領域に投与される、請求項６６から６７のいずれか１項に記載の使用のための組成物の投与方法。
前記対象が、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、マウス、ラット、サルなど、最も好ましくはヒトなどの哺乳動物、またはニワトリなどのトリもしくはサケなどのサカナである、請求項６６から６８のいずれか１項に記載の使用のための組成物の投与方法。
前記組成物をその他のワクチンと組み合わせて投与する、請求項６６から６９のいずれか１項に記載の使用のための組成物の投与方法。
前記組成物がワクチンカクテルの一部を形成する、請求項６６から７０のいずれか１項に記載の使用のための組成物の投与方法。
ｉ．先行請求項のいずれか１項に定義される組成物または請求項４４から６０のいずれか１項に記載の発現系と、
ｉｉ．任意的に、前記組成物を投与するための医療器具またはその他の手段と、
ｉｉｉ．使用説明書と、を含むパーツのキット。
第２の有効成分を含む、請求項７２に記載のパーツのキット。