ES2887004T3

ES2887004T3 - Proteínas y etiquetas peptídicas con velocidad aumentada de formación espontánea de enlace isopeptídico y su uso

Info

Publication number: ES2887004T3
Application number: ES18727355T
Authority: ES
Inventors: Mark Howarth; Anthony Keeble
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: GB201706430D0; KR102642896B1; CN110709412A; CA3060025A1; CN118580325A; AU2018258000A1; EP3615556A1; US11873323B2; KR20190141229A; WO2018197854A1; AU2018258000B2; US11059867B2; EP3615556B1; US20220119459A1; CN110709412B; US20200131233A1; DK3615556T3

Abstract

Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, en la que: (i) X en la posición 1 es arginina o no aminoácido; (ii) X en la posición 2 es glicina o no aminoácido; (iii) X en la posición 5 es histidina o treonina, preferentemente histidina; (iv) X en la posición 11 es alanina, glicina o valina, preferentemente alanina; y (v) X en la posición 14 es arginina o lisina, preferentemente arginina, en la que cuando X en la posición 1 es no aminoácido, X en la posición 2 es no aminoácido, y en la que dicho péptido es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicho enlace isopeptídico se forma entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 1 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas y etiquetas peptídicas con velocidad aumentada de formación espontánea de enlace isopeptídico y su uso La presente invención se refiere a un conector de dos parte que comprende una etiqueta peptídica y un polipéptido (proteína) que es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico. En particular, el conector de dos parte de la invención puede ser visto como un par cognado de etiqueta peptídica y pareja de enlace polipeptídica que pueden conjugarse por un enlace covalente cuando se ponen en contacto en condiciones que permiten la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre la etiqueta peptídica y su pareja de enlace polipeptídica. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cada parte de dicho conector de dos partes (es decir, etiqueta peptídica y pareja de enlace polipeptídica), vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, y células hospedadoras que comprenden dichos vectores y moléculas de ácido nucleico. También se proporciona un kit que comprende dicho conector de dos partes (es decir, etiqueta peptídica y pareja de enlace polipeptídica), y/o moléculas de ácido nucleico/vectores. También se proporciona un método para producir dicho conector de dos partes (es decir, etiqueta peptídica y pareja de enlace polipeptídica) y los usos del conector de dos partes de la invención.

La función celular depende de un gran número de interacciones proteína-proteína no covalentes reversibles y la disposición exacta de las proteínas en los complejos influye y determina su función. Por tanto, la capacidad de manipular por ingeniería genética las interacciones proteína-proteína covalente puede traer una gama de nuevas oportunidades para la investigación básica, la biología sintética y la biotecnología. En particular, la conjugación de dos o más proteínas para formar una denominada "proteína de fusión" puede dar como resultado moléculas con características útiles. Por ejemplo, la agrupación de un tipo único de proteína con frecuencia aumenta mucho las señales biológicas, por ejemplo, la repetición de estructuras de antígeno en vacunas. La agrupación de proteínas con diferentes actividades también puede dar como resultado complejos con actividades mejoradas, por ejemplo, la canalización de sustrato por enzimas.

Las interacciones proteicas normalmente covalentes se miden a través de puentes disulfuro, pero los disulfuros son reversibles, no aplicables en los compartimentos celulares reductores, y pueden interferir con el plegamiento proteico. Las etiquetas peptídicas son herramientas convenientes para el análisis proteico y la modificación debido a que su pequeño tamaño minimiza la perturbación a la función proteica. Las etiquetas peptídicas son sencillas de codificar genéticamente y su pequeño tamaño reduce la alteración a partir de la interferencia con otras interacciones, el coste de la biosíntesis y la introducción de la inmunogenicidad. Sin embargo, las interacciones entre las etiquetas peptídicas y sus parejas de enlace peptídicas o polipeptídicas son casi nunca de alta afinidad, lo que limita su utilidad en la formación de complejos estables.

Las proteínas que son capaces de la formación espontánea de enlace isopeptídico (denominadas "proteínas isopeptídicas") se han usado ventajosamente para desarrollar pares de etiqueta peptídica/pareja de enlace polipeptídica (es decir, conectores de dos partes) que se unen covalentemente entre sí y proporcionan interacciones irreversibles (véase, por ejemplo, los documentos WO2011/098772 y WO 2016/193746). En este sentido, las proteínas que son capaces de la formación espontánea de enlace isopeptídico pueden expresarse como fragmentos separados, para dar una etiqueta peptídica y una pareja de enlace polipeptídica para la etiqueta peptídica, donde los dos fragmentos son capaces de reconstituirse covalentemente mediante la formación de enlace isopeptídico, enlazando de este modo moléculas o componentes fusionados con la etiqueta peptídica y su pareja de enlace polipeptídica. El enlace isopeptídico formado por la etiqueta peptídica y su pareja de enlace polipeptídica es estable en condiciones donde las interacciones no covalentes se disociarían rápidamente, por ejemplo, durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, semanas), a temperatura alta (hasta al menos 95 °C), a alta fuerza, o con riguroso tratamiento químico (por ejemplo, pH 2-11, disolvente orgánico, detergentes o desnaturalizantes).

Los enlaces isopeptídicos son enlaces amida formados entre los grupos carboxilo/carboxamida y amino, donde al menos uno de los grupos carboxilo o amino está fuera de la cadena principal proteica (la cadena principal de la proteína). Tales enlaces son químicamente irreversibles en condiciones biológicas típicas y son resistentes a la mayoría de las proteasas. Puesto que los enlaces isopeptídicos son covalentes en la naturaleza, dan como resultado algunas de las interacciones proteicas medidas más fuertes.

En resumen, un conector de dos partes, es decir, una etiqueta peptídica y su pareja de enlace polipeptídica (un denominado par de etiqueta peptídica/pareja de enlace) puede derivarse de una proteína capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico (una proteína isopeptídica), en el que los dominios de la proteína se expresan por separado para producir una etiqueta peptídica que comprende uno de los residuos implicados en el enlace isopeptídico (por ejemplo, un aspartato o una asparagina) y una pareja de enlace peptídica o polipeptídica (o "receptor") que comprende el otro residuo implicado en el enlace isopeptídico (por ejemplo, una lisina) y al menos otro residuo requerido para formar el enlace isopeptídico (por ejemplo, un glutamato). La mezcla de la etiqueta peptídica y la pareja de enlace da como resultado la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre la etiqueta y la pareja de enlace. Por tanto, al fusionar por separado la etiqueta peptídica y la pareja de enlace con diferentes moléculas o componentes, por ejemplo, proteínas, es posible enlazar covalentemente dichas moléculas o componentes juntos por un enlace isopeptídico formado entre la etiqueta peptídica y la pareja de enlace, es decir, para formar un conector entre las moléculas o los componentes fusionados con la etiqueta peptídica y la pareja de enlace.

Un par etiqueta peptídica/pareja de enlace (conector de dos partes), llamado SpyTag/SpyCatcher, se ha derivado del dominio CnaB2 de la proteína FbaB de Streptococcus pyogenes (Zakeri et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 109, E690-697), y se usó en diversas aplicaciones, entre las que se incluyen biomateriales (Botyanszki et al., 2015, Biotechnology and bioengineering 112, 2016-2024; Chen et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 108, 11399-11404), secuenciación de la próxima generación (Stranges et al., 2016, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 113, E6749-E6756), estabilización enzimática (Schoene et al., 2016, Scientific reports 6, 21151) y desarrollo de vacuna (Brune et al., 2016, Scientific reports 6, 19234; Thrane et al., 2016, Journal of nanobiotechnology 14, 30). Sin embargo, aunque la velocidad de formación del enlace isopeptídico entre SpyTag y SpyCatcher es satisfactoria con componentes purificados, la velocidad es limitante a niveles de expresión celular.

Por consiguiente, existe un deseo de desarrollar conectores, por ejemplo, pares de etiqueta peptídica ("etiqueta"("tag")) y pareja de enlace polipeptídica ("receptor"("catcher")) con las propiedades ventajosas asociadas a los sistemas etiqueta/receptor derivados de las proteínas isopeptídicas, es decir, una etiqueta peptídica y la pareja de enlace polipeptídica, que forman un enlace estable y fuerte como se ha tratado anteriormente, con velocidades de reacción que son lo suficientemente altas para posibilitar la reacción eficaz a concentraciones bajas, particularmente a niveles de expresión celular.

Los presentes inventores sorprendentemente han determinado que la velocidad de reacción de los péptidos SpyTag y SpyCatcher puede incrementarse significativamente modificando (es decir, mutando) las secuencias de aminoácidos del péptido SpyTag y el polipéptido SpyCatcher (SEQ ID NO: 6 y 7, respectivamente). Como se trata en detalle en los Ejemplos, se requeriría un número de etapas para determinar si se podría mejorar la velocidad de reacción de SpyTag y SpyCatcher y, si es así, qué modificaciones del péptido SpyTag y el polipéptido SpyCatcher incrementarían la velocidad de reacción sin afectar de manera adversa a otras proteínas deseables del par de etiqueta peptídica y pareja de enlace.

En primer lugar, los inventores tuvieron que identificar los parámetros de la investigación que pudiera identificar con éxito modificaciones que mejorasen la actividad de SpyTag y SpyCatcher, es decir, el grado al que los residuos en el péptido SpyTag (SEQ ID NO: 6) y el polipéptido SpyCatcher (SEQ ID NO: 7) podrían modificarse sin reducir sustancialmente la velocidad de reacción. Se planteó la hipótesis de que la actividad del péptido SpyTag se determina predominantemente por unos pocos residuos "ancla". Puesto que es probable que la mutación de los residuos ancla enmascare los efectos de las mutaciones en otras posiciones que tienen únicamente un efecto moderadamente positivo sobre la velocidad de reacción se propuso que la generación de una biblioteca mutante de etiquetas peptídicas en las que se permiten las mutaciones en cualquier parte en la secuencia realmente reduce la posibilidad de identificar péptidos con actividad mejorada. Por tanto, los inventores seleccionaron los dos residuos N-terminales de SpyTag y los seis residuos C-terminales de SpyTag para la modificación y determinaron que la adición de residuos en los extremos N y/o C era permisible. Se desarrolló una biblioteca de polipéptidos SpyCatcher aleatoriamente mutados para su uso en el método de cribado ("screening"). En este sentido, es difícil diseñar mutaciones basadas en la estructura cristalina de SpyCatcher debido a que no todos los residuos son visibles en la estructura cristalina.

En segundo lugar, los inventores determinaron que los mutantes de SpyTag N-terminales y C-terminales deberían cribarse por separado y diseñarse un procedimiento de cribado adecuado para identificar péptidos SpyCatcher y polipéptidos SpyCatcher mutantes con actividad mejorada. Por consiguiente, se produjeron dos subconjuntos de bibliotecas con mutaciones en el extremo N o C de SpyTag y se cribaron por actividad mejorada en un sistema de expresión en fago usando SpyCatcher como cebo. Se realizó un cribado separado usando una biblioteca de mutantes de SpyCatcher usando SpyTag como cebo.

El diseño de los parámetros de selección en el sistema de expresión en fago no fue sencillo. En este sentido, se planteó la hipótesis de que la velocidad a la que el péptido SpyTag y el polipéptido SpyCatcher interactúan puede ser limitante sobre la velocidad de reacción. Por consiguiente, el desarrollo de un sistema de cribado adecuado requiso la selección de las condiciones de reacción a las que la velocidad de reacción entre el péptido SpyTag y el polipéptido SpyCatcher no es óptima. El uso de las condiciones de reacción (por ejemplo, pH, temperatura, etc.) a las que la velocidad de reacción entre SpyTag y SpyCatcher es más rápida impediría la detección de diferencias en la reactividad de los péptidos y polipéptidos mutantes en relación con SpyTag y SpyCatcher, respectivamente. Un punto clave adicional para la identificación de péptidos y polipéptidos mutantes surgió del diseño de las condiciones usadas para separar los complejos etiqueta-receptor mutantes no reaccionados asociados por enlaces no covalentes de los complejos enlazados por un enlace isopeptídico. Como se trata en los ejemplos, se usó una combinación de tratamiento con tampón de bajo pH y proteasa para separar complejos no covalentes y covalentes asegurando de este modo que únicamente los péptidos y polipéptidos mutantes capaces de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con su respectiva pareja se seleccionaban para el análisis y la modificación adicional.

En este sentido, el desarrollo de la "etiqueta" y el "receptor" mutantes con mejoradas velocidades de reacción en relación con SpyTag y SpyCatcher requiso del diseño y la introducción de diferentes modificaciones adicionales (es decir, mutaciones) a los péptidos y polipéptidos mutantes identificados a partir del procedimiento de cribado. No solamente las mutaciones dieron como resultado péptidos "etiqueta" y polipéptidos "receptor" mutantes con velocidades de reacción mejoradas cuando reaccionaron con su parejas no mutadas (por ejemplo, incremento de >6 veces para la etiqueta mutada reaccionada con SpyCatcher no mutado e incremento de >3 veces para el receptor mutado reaccionado con SpyTag no mutado), sino que sorprendentemente se determinó que el efecto de las mutaciones sobre la velocidad de reacción de la "etiqueta" y el "receptor" mutantes es acumulativo cuando se usan juntos (es decir, un par de etiqueta y receptor mutantes muestra un incremento >10 veces en velocidad de reacción en relación con la reacción del par de SpyTag y SpyCatcher). Por tanto, ventajosamente, la etiqueta y el receptor mutantes de la invención (es decir, el conector de dos partes) son particularmente útiles a concentraciones bajas. Como se trata adicionalmente más adelante, la constante de velocidad mejorada de la etiqueta y el receptor mutantes de la invención es también ventajosa en reacciones en las que la etiqueta y/o el receptor se fusionan con moléculas o componentes que pueden frenar la reacción (por ejemplo, proteínas grandes) y en reacciones donde las moléculas o los componentes fusionados con la etiqueta y/o el receptor mutantes de la invención causan impedimento estérico. Es más, las modificaciones requeridas para mejorar la velocidad de reacción no afectan a las otras propiedades útiles asociadas a SpyTag y SpyCatcher, es decir, estabilidad térmica, la reacción a lo largo de un intervalo de valores de pH y temperaturas y en un amplio rango de tampones, incluido en presencia de detergente, y la expresión eficaz en Escherichia coli.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona, por lo tanto, proporciona un péptido, es decir, una etiqueta peptídica, que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, en la que: (i) X en la posición 1 es arginina o no aminoácido;

(ii) X en la posición 2 es glicina o no aminoácido;

(iii) X en la posición 5 es treonina o histidina, preferentemente histidina;

(iv) X en la posición 11 es alanina, glicina o valina, preferentemente alanina;

y

(v) X en la posición 14 es arginina o lisina, preferentemente arginina,

en la que cuando X en la posición 1 es no aminoácido, X en la posición 2 es no aminoácido,

y en la que dicho péptido (etiqueta peptídica) es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con un polipéptido (es decir, una pareja de enlace polipeptídica) que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicho enlace isopeptídico se forma entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 1 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2.

Por tanto, la etiqueta peptídica de la invención comprende al menos cuatro (por ejemplo, cinco o seis) modificaciones (por ejemplo, adiciones y sustituciones) en relación con el péptido SpyTag original.

Como se trata en los Ejemplos de más adelante, la etiqueta peptídica mutante guía (péptido variante de SpyTag) identificada en el cribado N-terminal contenía tres aminoácidos N-terminales en relación con SpyTag y se determinó que dos de estos residuos podrían extraerse sin afectar significativamente a la velocidad de reacción del péptido. Por tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica de la invención no contiene aminoácidos en las posiciones 1 y 2 de SEQ ID NO: 1, es decir, cuando X en la posición 1 es no aminoácido, X en la posición 2 es no aminoácido y cuando en la posición 2 es no aminoácido, X en la posición 1 es no aminoácido. Como alternativa a lo observado, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 8, en la que:

(i) X en la posición 3 es treonina o histidina, preferentemente histidina;

(ii) X en la posición 9 es alanina, glicina o valina, preferentemente alanina; y

(iii) X en la posición 12 es arginina o lisina, preferentemente, arginina.

Sin embargo, los inventores han determinado que la inclusión de los residuos de arginina y glicina en el extremo N mejora más la velocidad de reacción de la variante de SpyTag. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, la etiqueta peptídica de la invención comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, en la que:

(i) X en la posición 1 es arginina;

(ii) X en la posición 2 es glicina;

(iii) X en la posición 5 es treonina o histidina, preferentemente histidina;

y

(v) X en la posición 14 es arginina o lisina, preferentemente, arginina.

Como alternativa a lo observado, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9, en la que:

(i) X en la posición 5 es treonina o histidina, preferentemente histidina;

(ii) X en la posición 11 es alanina, glicina o valina, preferentemente alanina; y

(iii) X en la posición 14 es arginina o lisina, preferentemente, arginina.

Se contempló que las sustituciones conservativas en las posiciones 11 y 14 de SEQ ID NO: 1 y 9 (equivalentes a las posiciones 9 y 12 de SEQ ID NO: 8) pueden tolerarse sin afectar significativamente a la actividad de la etiqueta peptídica. No obstante, en algunas realizaciones, se prefiere que la posición 11 de SEQ ID NO: 1 y 9 (equivalente a la posición 9 de SEQ ID NO: 8) sea alanina y/o la posición 14 de SEQ ID NO: 1 y 9 (equivalente a la posición 12 de SEQ ID NO: 8) sea arginina.

La etiqueta peptídica mutante guía (péptido variante de SpyTag) identificada en el cribado N-terminal en los Ejemplos contenía un residuo de valina en la posición 3 y un residuo de treonina en la posición 5 (usando la numeración de SEQ ID NO: 1), que corresponde a las posiciones -1 y 2 en SpyTag (SEQ ID NO: 6), respectivamente. Aunque se planteó la hipótesis de que cada mutación de aminoácido identificada a partir del procedimiento de cribado contribuía a la actividad mejorada del péptido variante de SpyTag, los inventores cuestionaron las mutaciones no conservativas en el péptido variante de SpyTag. En este sentido, el residuo de valina en la posición 3 de SEQ ID NO: 1 representa una mutación no conservativa en relación con el residuo de ácido aspártico en la posición equivalente en el dominio CnaB2 de la proteína FbaB de Streptococcus pyogenes de la que se deriva SpyTag. Es más, el residuo de treonina en la posición 5 de SEQ ID NO: 1 representa una sustitución no conservativa en relación con el residuo de histidina en la posición equivalente en SpyTag. Sorprendentemente, los inventores determinaron que el residuo de valina es esencial para la actividad mejorada de la variante de SpyTag puesto que su deleción redujo drásticamente la actividad. Además, la sustitución del residuo de treonina por histidina en la posición 5 de SEQ ID NO: 1 (es decir, reversión de la secuencia de SpyTag) mejoró inesperadamente la actividad.

Por consiguiente, en realizaciones preferidas, la etiqueta peptídica de la invención comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, en la que:

(i) X en la posición 1 es arginina;

(ii) X en la posición 2 es glicina;

(iii) X en la posición 5 es histidina;

y

(v) X en la posición 14 es arginina o lisina, preferentemente, arginina.

Como alternativa a lo observado, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica de la invención comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10, en la que:

(i) X en la posición 11 es alanina, glicina o valina, preferentemente alanina; y

(ii) X en la posición 14 es arginina o lisina, preferentemente, arginina.

Por tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica de la invención comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 3, 4 o 5, preferentemente SEQ ID NO: 4 o 5, lo más preferentemente SEQ ID NO: 5.

Como se ha tratado anteriormente, el cribado por expresión en fago identificó un polipéptido (una pareja de enlace de la etiqueta peptídica o catcher) variante (es decir, mutante) con actividad mejorada en relación con SpyCatcher. Se contempló que cada sustitución en el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención (SEQ ID NO: 2, es decir, variante del polipéptido SpyCatcher) en relación con la secuencia de aminoácidos de SpyCatcher (SEQ ID NO: 7) puede mejorar por separado la actividad del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). Además, en vista del hecho de que el polipéptido SpyCatcher puede estar truncado en su extremo N y su extremo C sin afectar significativamente a su actividad (Li et al., 2014, J. Mol. Biol.; 426(2): 309-317), se contempla que el polipéptido ilustrado en el presente documento (es decir, SEQ ID NO: 2) puede estar truncado en el extremo N y/o el extremo C sin reducir significativamente la actividad del polipéptido. En particular, la SEQ ID NO: 2 puede estar truncada por hasta 24 aminoácidos en el extremo N (por ejemplo, 5, 10, 15 o 20 aminoácidos) y/o por hasta 9 aminoácidos en el extremo C (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos).

Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que comprende:

i) una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2;

ii) una parte de (i) que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 101;

iii) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende una lisina en la posición 34, ácido glutámico en la posición 80 y uno o más de los siguientes:

1) treonina en la posición 5;

2 ) prolina en la posición 16;

3) arginina en la posición 40;

4) histidina en la posición 65;

5) prolina en la posición 92;

6) ácido aspártico en la posición 100:

7) ácido glutámico en la posición 108; y

8) treonina en la posición 116

en la que los residuos de aminoácido especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en SEQ ID NO: 2 y; o

iv) una parte de (iii) que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en SEQ ID NO 101 (por ejemplo, al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 101), en la que la secuencia de aminoácidos comprende una lisina en la posición 10 (o una posición equivalente a la posición 34 en SEQ ID NO: 2), un ácido glutámico en la posición 56 (o una posición equivalente a la posición 80 en SEQ ID NO: 2) y uno o más de los siguientes:

1) arginina en la posición 16 (o una posición equivalente a la posición 40 en SEQ ID NO: 2);

2) histidina en la posición 41 (o una posición equivalente a la posición 65 en SEQ ID NO: 2);

3) prolina en la posición 68 (o una posición equivalente a la posición 92 en SEQ ID NO: 2); y

4) ácido aspártico en la posición 76 (o una posición equivalente a la posición 100 en SEQ ID NO: 2),

en la que los residuos de aminoácido especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en SEQ ID NO: 101 (o SEQ ID NO: 2),

y en la que dicho polipéptido es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con un péptido (etiqueta peptídica) que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 5, en la que dicho enlace isopeptídico se forma entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 5 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2 o la posición 10 de SEQ ⁱD NO: 101.

En realizaciones en las que las variantes (es decir, polipéptidos relacionados con identidad de secuencia y porciones de los mimos) del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención no contienen todos los residuos anteriormente especificados, se prefiere que, a excepción de la posición 5 (tratada más adelante), en las posiciones especificadas las variantes contengan los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes en el péptido SpyCatcher (SEQ ID NO: 7). Las posiciones equivalentes pueden determinarse fácilmente comparando la secuencia de aminoácidos de la variante del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) con SEQ ID NO: 7, por ejemplo, usando el algoritmo BLASTP.

Por tanto, a modo de ejemplo, en las realizaciones donde el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, si el residuo en la posición 16 (o la posición equivalente) no es prolina, se prefiere que el residuo sea glutamina. Igualmente, si el residuo en la posición 40 (o la posición equivalente) no es arginina, se prefiere que el residuo sea lisina. Si el residuo en la posición 65 (o la posición equivalente) no es histidina, se prefiere que el residuo sea glutamina. Si el residuo en la posición 92 (o la posición equivalente) no es prolina, se prefiere que el residuo sea alanina. Si el residuo en la posición 100 (o la posición equivalente) no es ácido aspártico, se prefiere que el residuo sea glutamina. Si el residuo en la posición 108 (o la posición equivalente) no es ácido glutámico, se prefiere que el residuo sea lisina. Si el residuo en la posición 116 (o la posición equivalente) no es treonina, se prefiere que el residuo sea isoleucina.

En algunas realizaciones, una variante del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la presente invención puede diferir de SEQ ID NO: 2 en, por ejemplo, 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, por ejemplo, 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos, inserciones y/o deleciones, preferentemente 1 a 23, 1 a 20, 1 a o 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, por ejemplo, 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos y/o 1 a 33, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, por ejemplo, 1, 2 o 3 deleciones de aminoácidos. Como se trata más adelante, en algunas realizaciones, se prefiere que las deleciones sean en el extremo N y/o C, es decir, truncamientos, generando de este modo partes del polipéptido de SEQ ID NO: 2 como se ha definido anteriormente.

En algunas realizaciones, cualquier mutación que esté presente en el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la presente invención en relación con el polipéptido ilustrado (s Eq ID NO: 2) puede ser sustitución de aminoácido conservativa. Una sustitución de aminoácido conservativa se refiere al reemplazo de un aminoácido por otro que conserva el carácter fisicoquímico del polipéptido (por ejemplo, D puede ser reemplazado por E o viceversa, N por Q, o L o I por V o viceversa). Por tanto, generalmente el aminoácido sustituto tiene propiedades similares, por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad, cadenas laterales grandes, etc. que las del aminoácido a reemplazar. Se pueden incorporar isómeros del L-aminoácido nativo, por ejemplo, D-aminoácidos.

Por tanto, en algunas realizaciones en las que las variantes del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención no contienen todos los residuos anteriormente especificados (es decir, todas las mutaciones en SEQ ID NO: 2 en relación con SEQ ID NO: 7), a excepción de la posición 5, en las posiciones especificadas la variante puede contener una sustitución conservativa de los residuos de aminoácido en posiciones equivalentes en el péptido SpyCatcher (SEQ ID NO: 7). Por tanto, por ejemplo, si el residuo en la posición 16 (o la posición equivalente) no es prolina o glutamina se prefiere que el residuo sea asparagina.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende una lisina en la posición 34, un ácido glutámico en la posición 80 y dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho de los siguientes: 1) treonina en la posición 5;

2) prolina en la posición 16;

3) arginina en la posición 40;

4) histidina en la posición 65;

5) prolina en la posición 92;

6) ácido aspártico en la posición 100:

7) ácido glutámico en la posición 108; y

8) treonina en la posición 116,

en la que los residuos de aminoácido especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en SEQ ID NO: 2.

Como se trata en los Ejemplos de más adelante, los inventores inesperadamente han determinado que la presencia de un residuo de ácido aspártico en la posición 5 (basado en la numeración de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 7) de los mutantes (es decir, variantes) del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) identificados en el cribado por expresión en fago da como resultado la formación de un dímero de polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) por una reacción secundaria no deseada en el que los polipéptidos se conjugan por un enlace isopeptídico. Se demostró que la mutación de residuo de ácido aspártico en la posición 5 a treonina o alanina elimina la reacción secundaria no deseada y mejora más la velocidad de la actividad del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). Por tanto, en algunas realizaciones, el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende una treonina en la posición 5, una lisina en la posición 34, un ácido glutámico en la posición 80 y uno o más de los siguientes:

1 ) prolina en la posición 16;

2) arginina en la posición 40;

3) histidina en la posición 65;

4) prolina en la posición 92;

5) ácido aspártico en la posición 100:

6) ácido glutámico en la posición 108; y

7) treonina en la posición 116,

Se contempló que el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención puede comprender uno cualquiera o cualquier combinación de los residuos de aminoácido especificados anteriormente definidos (por ejemplo, cualquier combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los residuos de aminoácido anteriormente especificados), por ejemplo, 1) y 2), 1) y 3), 1 y 4), 1) y 5), 1) y 6), 1) y 7), 1) y 8), 2) y 3), 2) y 4) etc., 1), 2) y 3), 1), 3) y 4), 1), 3) y 5) etc. Sin embargo, algunas combinaciones particularmente preferidas incluyen:

a)

1) treonina en la posición 5;

2 ) prolina en la posición 16;

3) lisina en la posición 34;

4) arginina en la posición 40;

5) histidina en la posición 65;

6) ácido glutámico en la posición 80;

7) ácido glutámico en la posición 108; y

8) treonina en la posición 116;

b)

1) treonina en la posición 5;

2 ) prolina en la posición 16;

3) lisina en la posición 34;

4) arginina en la posición 40;

5) histidina en la posición 65;

6) ácido glutámico en la posición 80;

7) prolina en la posición 92;

8) ácido glutámico en la posición 108; y

9) treonina en la posición 116; y

c)

1) treonina en la posición 5;

2 ) prolina en la posición 16;

3) lisina en la posición 34;

4) arginina en la posición 40;

5) histidina en la posición 65;

6) ácido glutámico en la posición 80;

7) prolina en la posición 92;

8) ácido aspártico en la posición 100:

9) ácido glutámico en la posición 108; y

10) treonina en la posición 116,

En algunas realizaciones adicionales, las variantes del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) anteriormente definidas también pueden comprender una glicina en la posición 12 y/o una treonina en la posición 22. Por tanto, el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la presente invención particularmente puede ser al menos un 80 % idéntico a la secuencia ilustrada como se expone en SEQ ID NO: 2 y más particularmente es al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 2, en la que la variante del polipéptido comprende una lisina en la posición 34 (o una posición equivalente), un ácido glutámico en la posición 80 (o una posición equivalente) y uno o más de los siguientes:

1) treonina en la posición 5;

2) prolina en la posición 16;

3) arginina en la posición 40;

4) histidina en la posición 65;

5) prolina en la posición 92;

6) ácido aspártico en la posición 100:

7) ácido glutámico en la posición 108; y

8) treonina en la posición 116,

El término "conector" como se usa en el presente documento se refiere a moléculas que funcionan para enlazar, es decir, conjugar o unir, dos moléculas o componentes juntos, preferentemente por un enlace covalente, por ejemplo, un enlace isopeptídico. Por tanto, la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención pueden ser vistos como un conector de dos partes, en el que la formación del enlace isopeptídico entre la primera parte, es decir, la etiqueta peptídica, y la segunda parte, es decir, el polipéptido, reconstituye el conector, uniendo de este modo moléculas o componentes fusionados o conjugados con dichas primera y segunda partes del conector. Como alternativa a lo indicado, la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención pueden ser vistos como un par cognado que funciona como un conector, es decir, un par cognado de etiqueta peptídica y polipéptido o un par cognado de etiqueta peptídica y pareja de enlace. Estos términos se usan indistintamente a lo largo de la descripción.

El término "cognado" se refiere a componentes que funcionan juntos. Por tanto, en el contexto de la presente invención, un par cognado se refiere a una etiqueta peptídica y polipéptido de la invención que reaccionan juntos espontáneamente para formar un enlace isopeptídico. Por tanto, un conector de dos partes que comprende una etiqueta peptídica y polipéptido que reaccionan juntos eficazmente para formar un enlace isopeptídico en condiciones que posibilitan la formación espontánea de dicho enlace isopeptídico también puede ser referido como que tiene un "par complementario", es decir, un par complementario de etiqueta peptídica y polipeptídico.

Por tanto, la invención proporciona además un conector de dos partes que comprende un péptido (etiqueta peptídica) y un polipéptido (una pareja de enlace de la etiqueta peptídica), en el que:

a) dicho péptido (etiqueta peptídica) comprende una secuencia de aminoácidos como se ha definido anteriormente; y

b) dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) comprende una secuencia de aminoácidos como se ha definido anteriormente,

y en el que dicho péptido (etiqueta peptídica) y polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) son capaces de formar espontáneamente un enlace isopeptídico entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 1 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2.

La etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención forman espontáneamente un enlace isopeptídico entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 1 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2 en diferentes condiciones incluidas las explicadas más adelante que son adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico entre dicha etiqueta peptídica y dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). Resulta evidente a partir de los Ejemplos de más adelante que la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención son activos en un intervalo de condiciones.

Por ejemplo, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) son activos en una variedad de tampones entre los que se incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazintanosulfónico (HEPES), solución salina tamponada con HEPES (HBS) y solución salina tamponada con Tris (TBS), tanto con como sin EDTA. La etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) son activos a pH de aproximadamente 3,0-8,0, por ejemplo, 4,0-7,0, 5,0-7,0, tal como aproximadamente 5,5-6,5, en una amplio intervalo de temperaturas, por ejemplo, 0-40 °C, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35 o 37 °C, preferiblemente aproximadamente 25-35 °C, por ejemplo, aproximadamente 25 °C. La etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención son también activos en presencia de los detergentes comúnmente usados, tales como Tween 20 y Tritón X-100, por ejemplo, hasta una concentración de aproximadamente 1 % (v/v), y en presencia de urea, por ejemplo, hasta una concentración de aproximadamente 3 M. El experto será capaz de determinar fácilmente otras condiciones adecuadas.

Por tanto, en algunas realizaciones, las condiciones que son adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico entre dicha etiqueta peptídica y dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención incluye cualquier condición en la que al poner en contacto la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención da como resultado la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre dicha etiqueta peptídica y dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica), particularmente entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de s Eq iD NO: 1 (o posición equivalente) y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2 (o posición equivalente). Por ejemplo, poner en contacto dicha etiqueta peptídica y dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) en condiciones tamponadas, por ejemplo, en solución tamponada o en una fase sólida (por ejemplo, columna) que se ha equilibrado con un tampón, tal como PBS. La etapa de contacto puede ser a cualquier pH adecuado, tal como pH 3,0-8,0, por ejemplo, 4,0-7,0, tal como pH 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8 o 7,0. Adicionalmente o como alternativa, la etapa de contacto puede ser a cualquier temperatura adecuada, tal como aproximadamente 0-40 °C, por ejemplo, 1-39, 2-38, 3-37, 4-36, 5-35, 6 34, 7-33, 8-32, 9-31 o 10-30 °C, por ejemplo, aproximadamente 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 33, 35 o 37 °C, preferiblemente aproximadamente 25-35 °C, por ejemplo, aproximadamente 25°C.

En algunas realizaciones, poner en contacto dicha etiqueta peptídica y dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención "en condiciones que posibilitan la formación espontánea de un enlace isopeptídico" incluye poner en contacto dicha etiqueta peptídica y dicho polipéptido en presencia de una chaperona química, por ejemplo, una molécula que aumenta o mejora la reactividad de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). En algunas realizaciones, la chaperona química es TMAo (N-óxido de trimetilamina). En algunas realizaciones, la chaperona química, por ejemplo, TMAO, está presente en la reacción a una concentración de al menos aproximadamente 0,2 M, por ejemplo, al menos 0,3, 0,4, 0,5, 1 ,0, 1,5, 2,0 o 2,5 M, por ejemplo, aproximadamente 0,2-3,0 M, 0,5-2,0 M, 1,0-1,5 M.

Como se ha indicado anteriormente, la formación del enlace isopeptídico entre la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención es espontánea. En este sentido, el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) comprende un ácido glutámico en la posición 80 (o una posición equivalente, basado en la numeración de s Eq ID NO: 2) que facilita, por ejemplo, induce, promueve o cataliza, la formación del enlace isopeptídico entre los residuos de aspartato y lisina en la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica), respectivamente.

El término "espontáneo" como se usa en el presente documento se refiere a un enlace isopeptídico, que puede formarse en una proteína o entre péptidos o proteínas (por ejemplo, entre dos péptidos o un péptido y una proteína, es decir, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención) sin que ningún otro agente (por ejemplo, un catalizador enzimático) esté presente y/o sin modificación química de la proteína 0 el péptido, por ejemplo, sin ligamiento químico natural o acoplamiento químico usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Por tanto, no se lleva a cabo ligamiento químico natural para modificar un péptido o una proteína que tenga un tioéster C-terminal.

Por tanto, un enlace isopeptídico espontáneo puede formarse entre una etiqueta peptídica y un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención cuando están aislados y sin modificación química de la etiqueta peptídica y/o el polipéptido de la invención. Por lo tanto, un enlace isopeptídico espontáneo puede formarse por sí mismo en ausencia de enzimas u otras sustancias exógenas y sin modificación química de la etiqueta peptídica y/o el polipéptido de la invención.

Un enlace isopeptídico espontáneo puede formase casi inmediatamente después del contacto de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención, por ejemplo, en 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, o 30 minutos, o en 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 o 24 horas.

La etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención abarca formas mutantes de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) (es decir, referidas en el presente documento como homólogos, variantes o derivados), que son estructuralmente similares a la etiqueta peptídica ilustrada expuesta en SEQ ID NO: 3-5 y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) expuesto en SEQ ID NO: 2, respectivamente. Las variantes de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención son capaces de funcionar como una etiqueta peptídica y la pareja de enlace (receptor), es decir, capaces de formar espontáneamente un enlace isopeptídico entre el ácido aspártico en la posición 10 (o posición equivalente) de la variante de la etiqueta peptídica y la lisina en la posición 34 (o posición equivalente) de la variante del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) en condiciones adecuadas como se ha definido anteriormente.

En casos donde una variante de la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) comprende mutaciones, por ejemplo, deleciones o inserciones, en relación con SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, los residuos anteriormente especificados están presentes en las posiciones de aminoácido equivalentes en las secuencias variantes de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). En algunas realizaciones, las deleciones en las variantes de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención no son truncamientos N-terminales y C-terminales.

Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, se contempla que el polipéptido ilustrado en el presente documento (es decir, SEQ ID NO: 2) puede estar truncado en el extremo N y/o el extremo C sin reducir significativamente la actividad del polipéptido. En particular, la SEQ ID NO: 2 puede estar truncada por hasta 24 aminoácidos en el extremo N (por ejemplo, 5, 10, 15 o 20 aminoácidos) y/o por hasta 9 aminoácidos en el extremo C (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos). Por tanto, el término variante como se usa en el presente documento incluye variantes de truncamiento del polipéptido ilustrado. Como alternativa a lo observado, se puede ver que la invención proporciona una parte del polipéptido ilustrado, en la que dicha parte comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 101 o una variante de la misma, como se ha tratado anteriormente. Tal como se refiere en el presente documento una "parte" comprende al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID N^o: 101, es decir, al menos 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 100, 105, 110 o más aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (la secuencia de la cual se deriva) que contiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 101. Por tanto, dicha parte puede obtenerse de una parte central o N-terminal o C-terminal de la secuencia. Preferentemente dicha parte se obtiene de la parte central, es decir, comprende un truncamiento N-terminal y/o C-terminal como se ha definido anteriormente. Notablemente, "parte" como se describe en el presente documento son polipéptidos de la invención y, por lo tanto, satisfacen las condiciones de identidad (relativa a una región comparable) y las condiciones de equivalencia funcional mencionadas en el presente documento.

En algunas realizaciones, una variante de la etiqueta peptídica de la presente invención puede diferir de SEQ ID NO: 1 en, por ejemplo, 1 a 5, 1 a 4, por ejemplo, 1, 2 a 3 sustituciones de aminoácidos, inserciones y/o deleciones, preferentemente sustituciones, como se ha definido anteriormente. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la presente invención puede diferir de SEQ ID NO: 2 como se ha definido anteriormente.

La identidad de secuencia puede determinarse mediante cualquier medio adecuado conocido en la materia, por ejemplo, usando el banco de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT que usa FASTA pep-cmp con un pamfactor variable, y la penalización por creación de huecos establecida en 12,0 y la penalización por extensión de huecos establecida en 4,0, y una ventana de 2 aminoácidos. Otros programas para determinar la identidad de secuencia de aminoácidos incluyen el programa BestFit del paquete informático "Genetics Computer Group" (GCG) Versión 10 de la Universidad de Wisconsin. El programa usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman con los valores predeterminados: Penalización por creación de hueco - 8, Penalización por extensión de hueco = 2, Emparejamiento medio = 2,912, Emparejamiento incorrecto medio = -2,003.

Preferentemente, dicha comparación se realiza en toda la longitud de la secuencia, pero puede realizarse en una ventana de comparación más pequeña, por ejemplo, menos de 100, 80 o 50 aminoácidos contiguos.

Preferentemente las variantes (por ejemplo, variantes relacionadas con la identidad de secuencia) de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) son funcionalmente equivalentes a la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que tienen una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 3-5 o SEQ ID NO: 2 o 101, respectivamente. Como se cita en el presente documento, "equivalencia funcional" se refiere a variantes de la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención anteriormente tratados que pueden mostrar algo de eficacia reducida en la formación espontánea de un enlace isopeptídico con su respectiva pareja (por ejemplo, rendimiento de la expresión menor, velocidad de reacción menor, o actividad en un intervalo limitado de condiciones de reacción (por ejemplo, intervalo más estrecho de temperaturas, tal como 10-30 °C etc.)) en relación con la molécula primaria (es decir, la molécula con la que muestra homología de secuencia), pero preferentemente son tan eficaces o son más eficaces.

Una etiqueta peptídica mutante o variante de la invención con actividad que es "equivalente" a la actividad de una etiqueta peptídica o que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en una de SEQ ID NO: 3-5 puede tener actividad que sea similar (es decir, comparable) a la actividad de una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en una de SEQ ID NO: 3-5, es decir, de modo que las aplicaciones prácticas de la etiqueta peptídica no están significativamente afectadas, por ejemplo, dentro de un margen de error experimenta. Por tanto, una actividad equivalente de la etiqueta peptídica quiere decir que la etiqueta peptídica mutante o variante de la invención es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica, por ejemplo, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, 7 o 101) con una velocidad de reacción (es decir, constante de velocidad como se trata más adelante) y/o rendimiento similares a una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 3-5 en las mismas condiciones.

Igualmente, un polipéptido mutante o variante (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención con actividad que es "equivalente" a la actividad de un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101 (preferentemente SEQ ID NO: 2) puede tener actividad que es similar (es decir, comparable) a la actividad de un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101 (preferentemente SEQ ID NO: 2), es decir, de modo que las aplicaciones prácticas del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) no están significativamente afectados, por ejemplo, dentro de un margen de error experimenta. Por tanto, una actividad equivalente del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) quiere decir que el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) mutante o variante de la invención es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con una etiqueta peptídica (por ejemplo, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 3-6) con una velocidad de reacción (es decir, constante de velocidad como se trata más adelante) y/o rendimiento similares a un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101 (preferentemente SEQ ID NO: 2) en las mismas condiciones.

La actividad de las diferentes etiquetas peptídicas y polipéptidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 frente a mutante o SEQ ID NO: 2 frente a mutante, respectivamente) medida en las mismas condiciones de reacción, por ejemplo, temperatura, sustratos (es decir, secuencias de etiqueta peptídica o polipéptido) y su concentración, tampón, sal, etc. como se ha ilustrado anteriormente, puede compararse fácilmente para determinar si la actividad para cada etiqueta peptídica y polipéptido es mayor, menor o equivalente.

En particular, las variantes de la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención tienen una constante de velocidad equivalente a la etiqueta peptídica y el polipéptido que tienen una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 3-5 o ^sE^qID NO: 2 o 101, respectivamente. La constante de velocidad se refiere al coeficiente de proporcionalidad en relación a la velocidad de la reacción (la formación de un enlace isopeptídico) a una temperatura dada al producto de las concentraciones de los reactivos (es decir, el producto de la concentración de la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención).

Por tanto, la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de la etiqueta peptídica variante (por ejemplo, mutante) puede ser de al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70, 75, 80, 85 o 90% de la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de la etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en una de SEQ ID NO: 3-5, tal como al menos un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de la actividad de una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en una de SEQ ID NO: 3-5. Como alternativa a lo observado, la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de la etiqueta peptídica mutante puede ser de no más de un 40 % menor que la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de la etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en una de SEQ ID NO: 3-5, por ejemplo, no más de un 35, 30, 25 o 20 % menor que la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de la etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en una de SEQ ID NO: 3-5, tal como no más de un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % menor que la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de la etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en una de SEQ ID NO: 3-5.

Igualmente, la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) variante (por ejemplo, mutante) de la invención puede ser de al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70, 75, 80, 85 o 90 % de la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101, tal como al menos un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99 % de la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101. Como alternativa a lo observado, la actividad del polipéptido mutante puede ser de no más de un 40 % menor que la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101, por ejemplo, no más de un 35, 30, 25 o 20 % menor que la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101, tal como no más de un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % menor que la actividad, por ejemplo, la constante de velocidad, de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 o 101.

Notablemente, la constante de velocidad de la reacción de la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención puede ser menor que los valores descritos en los Ejemplos cuando la etiqueta peptídica y/o el polipéptido se fusionan con moléculas o componentes grandes (por ejemplo, proteínas), que se difunden más lentamente que la etiqueta peptídica y el péptido aislados. Es más, la constante de velocidad puede reducirse si las moléculas o los componentes con los que se fusionan la etiqueta peptídica y/o el polipéptido causan impedimento estérico a la reacción. Por consiguiente, cuando se mide la constante de velocidad de la reacción de las variantes de la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención, se prefiere que la medición se realice usando etiquetas peptídicas y polipéptidos aislados, es decir, etiquetas peptídicas y polipéptidos que no están fusionados o conjugados con otras moléculas o componentes.

Resultará evidente que la fusión con moléculas o componentes grandes y el impedimento estérico también afectarán a la constante de velocidad de otras etiquetas peptídicas y polipéptidos, por ejemplo SpyTag y SpyCatcher. Por tanto, las mejoras en la constante de velocidad de la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención todavía pueden ser ventajosas cuando la etiqueta peptídica y el polipéptido de la invención se usan a altas concentraciones (por ejemplo, cuando se fusionan con moléculas o componentes grandes) además de su uso a concentraciones bajas.

La velocidad de reacción y la constante de velocidad pueden valorarse por cualquiera medio adecuado conocido en la materia como se describe en los Ejemplos. Por ejemplo, puede hacerse un seguimiento de la velocidad de reacción valorando la movilidad de los productos de reacción en SDS-PAGE después de ebullición en SDS u otro tratamiento de desnaturalización fuerte que alterase todas las interacciones no covalentes o por espectrometría de masas.

Por lo tanto, puede realizarse cualquier modificación o combinación de modificaciones a SEQ ID NO: 2 para producir un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención variante, siempre que el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) variante comprenda un residuo de lisina en una posición equivalente a la posición 34 de SEQ ID NO: 2 y un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente a la posición 80 de SEQ ID NO: 2 y al menos otro (preferentemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) residuo de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 5, 16, 40, 65, 92, 100, 108, 116 y opcionalmente 12 y 22 de SEQ ID NO: 2 como se ha definido anteriormente y conserve las características funcionales anteriormente definidas, es decir, da como resultado un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 3-6 y opcionalmente tiene un rendimiento equivalente o superior, velocidad de reacción, por ejemplo, la constante de velocidad, intervalo temperatura y/o tampón en relación con un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2.

Como alternativa a lo observado, puede realizarse cualquier modificación o combinación de modificaciones (preferentemente sustituciones) a SEQ ID NO: 101 para producir un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención variante, siempre que el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) variante comprenda un residuo de lisina en una posición equivalente a la posición 10 de SEQ ID NO: 101 y un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente a la posición 56 de SEQ ID NO: 101 y al menos otro (preferentemente 2, 3, o 4) residuo de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 16, 41, 68 y 76 de SEQ ID NO: 101 como se ha definido anteriormente y conserve las características funcionales anteriormente definidas, es decir, da como resultado un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 3-6 y opcionalmente tiene un rendimiento equivalente o superior, velocidad de reacción, por ejemplo, la constante de velocidad, intervalo temperatura y/o tampón en relación con un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 101. Una posición equivalente en la etiqueta peptídica de la invención se determina preferentemente en referencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 5. Una posición equivalente en el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención se determina en referencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 101. La posición homóloga o correspondiente puede deducirse fácilmente alineando la secuencia de la etiqueta peptídica homóloga (mutante, variante o derivada) y la secuencia de SEQ ID NO: 1 o 5 o la secuencia del polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) homólogo (mutante, variante o derivado) y la secuencia de SEQ iD NO: 2 o 101 basado en la homología o la identidad entre las secuencias, por ejemplo, usando un algoritmo BLAST.

Los términos "etiqueta" y "etiqueta peptídica" como se usa en el presente documento se refieren en general a un péptido u oligopéptido.

El término "pareja de enlace de la etiqueta peptídica", "pareja de enlace" o "receptor" como se usa en el presente documento se refieren en general a un polipéptido o proteína.

En este sentido, no hay definición convencional en relación a los límites de tamaño entre lo que se quiere decir por péptido u oligopéptido. Normalmente un péptido puede ser visto como que comprende entre 2-20 aminoácidos y el oligopéptido entre 21-39 aminoácidos. Por consiguiente, un polipéptido puede ser visto como que comprende al menos 40 aminoácidos, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 110 aminoácidos.

Por tanto, en realizaciones preferidas una etiqueta peptídica como se define en el presente documento puede ser vista como que comprende al menos 12 aminoácidos, por ejemplo, 12-39 aminoácidos, tal como, por ejemplo, 13-35, 14-34, 15-33, 16-31, 17-30 aminoácidos de longitud, por ejemplo, puede comprender o consistir en 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos.

Un polipéptido de la invención (una pareja de enlace de la etiqueta peptídica, pareja de enlace o "receptor") como se define en el presente documento puede ser visto como que comprende al menos 80 aminoácidos, por ejemplo, 80 150 aminoácidos, tal como, por ejemplo, 80-140, 80-130, 80-120 aminoácidos de longitud, por ejemplo, puede comprender o consistir en 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101.102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 o 120 aminoácidos.

Como se ha tratado anteriormente, los conectores de dos partes (por ejemplo sistemas o par etiqueta y receptor, es decir, pares cognados) tienen un gran número de utilidades y la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención encuentran particular utilidad en la conjugación (es decir, la unión o enlace) de dos moléculas o componentes por un enlace isopeptídico. Por ejemplo, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden conjugarse o fusionarse por separado con moléculas o componentes de interés y posteriormente ponerse en contacto juntos en condiciones adecuadas para permitir la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica), uniendo de este modo (es decir, enlazando o conjugando) las moléculas o componentes por un enlace isopeptídico.

Por tanto, en algunas realizaciones, se puede ver que la invención proporciona el uso de un par de péptido (etiqueta peptídica) y polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) como se define en el presente documento para conjugar dos moléculas o componentes por un enlace isopeptídico,

en el que dichas moléculas o componentes conjugados por un enlace isopeptídico comprenden:

a) una primera molécula o componente que comprende (por ejemplo conjugado o fusionado) un péptido (etiqueta peptídica) de la invención; y

b) una segunda molécula o componente que comprende (por ejemplo conjugado o fusionado) un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención.

Resultará evidente que el uso del par etiqueta peptídica y polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) (es decir, conector de dos partes) anteriormente descrito comprende poner en contacto dichas primera y segunda moléculas en condiciones adecuadas para posibilitar (por ejemplo, promover o facilitar) la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre dicha etiqueta peptídica y dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) como se ha descrito anteriormente.

Como alternativa a lo observado, la invención proporciona un procedimiento para conjugar dos moléculas o componentes por un enlace isopeptídico que comprende:

a) proporcionar una primera molécula o componente que comprende (por ejemplo, conjugado o fusionado) un péptido (etiqueta peptídica) de la invención;

b) proporcionar una segunda molécula o componente que comprende (por ejemplo, conjugado o fusionado) un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención;

c) poner en contacto dicha primera y segunda moléculas o componentes en condiciones que posibilitan (por ejemplo, promueven o facilitan) la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre el péptido y el polipéptido como se ha descrito anteriormente, conjugando de este modo dicha primera molécula o componente con dicha segunda molécula o componente por un enlace isopeptídico para formar un complejo.

Los términos "conjugación" o "enlace" en el contexto de la presente invención con respecto a la conexión de dos o más moléculas o componentes para formar un complejo se refiere a la unión o conjugación de dichas moléculas o componentes, por ejemplo, proteínas, por un enlace covalente, particularmente un enlace isopeptídico que se forma entre la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) que se incorporan en, o fusionan con, dichas moléculas o componentes, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden formar dominios de proteínas para ser conjugadas o enlazadas juntas).

Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención se fusionan o conjugan con otras moléculas u otros componentes o entidades. Tales moléculas o componentes (es decir, entidades) pueden ser una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo de metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula tipo virus o cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones el componente o la entidad con la que se fusiona o conjuga la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) es un soporte sólido, es decir, sustrato sólido o fase sólida, como se define más adelante.

Por tanto, como alternativa a lo observado, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo de metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula tipo virus o cualquier combinación de los mismos o soporte sólido fusionado o conjugado con una etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención.

La célula puede ser una célula procariota o eucariota. En algunas realizaciones, la célula es una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden conjugarse o fusionarse con un compuesto o molécula que tiene un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, un antibiótico, antivíricos, vacuna, agente antitumoral, por ejemplo, un compuesto radioactivo o isótopo, citocinas, toxinas, oligonucleótidos y ácidos nucleicos que codifican genes y vacunas de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden conjugarse o fusionarse con un marcador, por ejemplo, un radiomarcador, un marcador fluorescente, marcador luminiscente, un marcador cromóforo así como sustancias y enzimas que generan un sustrato detectable, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina. Esta detección puede aplicarse en numerosos ensayos donde convencionalmente se usan anticuerpos, entre los que se incluyen la transferencia Western/inmunotransferencia, histoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), o formatos de citometría de flujo (FACS). Marcadores para la producción de imágenes por resonancia magnética, sondas de tomografía de emisión de positrones y boro 10 para terapia de captura de neutrón también pueden conjugarse con la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención. Particularmente, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden fusionarse o producirse con otro péptido, por ejemplo, etiqueta His6, y/o pueden fusionarse o producirse con otra proteína, por ejemplo, con el fin de aumentar la expresión de la proteína recombinante mediante la fusión con proteína de unión a maltosa.

En una realización particularmente útil, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) se fusionan con otro péptido, oligopéptido o polipéptido. Por ejemplo, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden producirse como parte de otro péptido, oligopéptido o polipéptido usando técnicas recombinantes como se trata más adelante, es decir, como una proteína o polipéptido recombinante o sintético.

Resultará evidente que la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden fusionarse con cualquier proteína o polipéptido. La proteína puede derivarse u obtenerse de cualquier fuente adecuada. Por ejemplo, la proteína puede ser traducida o purificada in vitro a partir de muestras biológicas y clínicas, por ejemplo, cualquier muestra celular o tisular de un organismo (eucariota o procariota), o cualquier fluido corporal o preparación derivada de los mismos, así como muestras tales como cultivos celulares, preparaciones celulares, lisados celulares, etc. Las proteínas pueden derivarse u obtenerse, por ejemplo, purificarse de muestras ambientales, por ejemplo, muestras de suelo y agua y también se incluyen muestras de comida. Las muestras pueden prepararse en el momento o pueden ser tratadas anteriormente de cualquier modo conveniente, por ejemplo, almacenamiento.

Como se ha indicado anteriormente, en una realización preferida, el péptido, el oligopéptido o la proteína fusionados con la etiqueta peptídica y/o el polipéptido de la invención pueden producirse recombinantemente y, por tanto, las moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas recombinantes pueden derivarse u obtenerse de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, cualquier material vírico o celular, que incluye todas las células procariotas o eucariotas, virus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos y orgánulos. Por tanto, tal material biológico puede comprender todos los tipos de células de animales mamíferos y no mamíferos, células vegetales, algas incluidas las algas verde-azuladas, hongos, bacterias, protozoos, virus, etc. En algunas realizaciones, las proteínas pueden ser proteínas sintéticas. Por ejemplo, el péptido y el polipéptido (proteínas) divulgados en el presente documento pueden producirse por síntesis química, tal como síntesis de péptidos en fase sólida.

La posición de la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) dentro de una proteína recombinante o sintética no es particularmente importante. Por tanto, en algunas realizaciones la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden estar ubicados en el extremo N o el extremo C del polipéptido recombinante o sintético. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden estar ubicados internamente dentro del polipéptido recombinante o sintético. Por tanto, en algunas realizaciones la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden verse como un dominio N-terminal, C-terminal o interno del polipéptido recombinante o sintético. En algunas realizaciones preferidas, el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) está ubicado preferentemente en el extremo N o el extremo C del polipéptido recombinante o sintético. Por tanto, en algunas realizaciones el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) puede verse como un dominio N-terminal o C-terminal del polipéptido recombinante o sintético.

En algunas realizaciones, puede ser útil incluir uno o más espaciadores, por ejemplo, un espaciador peptídico, entre el péptido, el oligopéptido o el polipéptido a unirse o conjugarse con la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). Por tanto, el péptido, el oligopéptido o polipéptido y la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) se pueden enlazar directamente entre sí o pueden enlazarse indirectamente por medio de uno o más espaciadores. Por tanto, una secuencia espaciadora puede intercalarse entre o separar dos o más partes individuales del polipéptido recombinante o sintético. En algunas realizaciones, un espaciador puede ser N-terminal o C-terminal a la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). En algunas realizaciones, los espaciadores pueden estar en ambos lados de la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica).

La naturaleza concreta de la secuencia espaciadora no es crítica y puede ser de longitud y/o secuencia variable, por ejemplo, puede tener 1-40, más particularmente 2-20, 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 o 1-6 residuos, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. A modo de ejemplo representativo la secuencia espaciadora, si está presente, puede tener 1-15, 1-12, 1 10, 1-8, o 1-6 residuos, etc. La naturaleza de los residuos no es crítica y pueden ser, por ejemplo, cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido neutro o un aminoácido alifático, o alternativamente pueden ser hidrófobos, o polares o cargados o formadores de estructura, por ejemplo, prolina. En algunas realizaciones preferidas, el conector es una secuencia rica en serina y/o glicina.

Por tanto, las secuencias espaciadoras a modo de ejemplo incluyen cualquier residuo de aminoácido, por ejemplo S, G, L, V, P, R, H, M, A o E, o un di-, tri-, tetra-, penta- o hexa-péptido compuesto por uno o más de tales residuos. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido recombinante o sintético que comprende una etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención como se ha definido anteriormente, es decir, un polipéptido recombinante o sintético que comprende un péptido, oligopéptido o polipéptido (por ejemplo, péptido heterólogo, oligopéptido o polipéptido, es decir, un péptido, oligopéptido o polipéptido que normalmente no está asociado con la etiqueta peptídica o el polipéptido de la invención, por ejemplo, de un organismo diferente) fusionado con una etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención. El polipéptido recombinante o sintético opcionalmente comprende un espaciador como se ha definido anteriormente.

El polipéptido recombinante o sintético de la invención también puede comprender restos de purificación o etiquetas para facilitar su purificación (por ejemplo, antes de usarse en los métodos y los usos de la invención tratados más adelante). Cualquier resto de purificación adecuado o etiqueta puede incorporarse dentro del polipéptido y tales restos son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polipéptido recombinante o sintético puede comprender una etiqueta o resto de purificación de péptido, por ejemplo, una secuencia de etiqueta His. Tales restos o etiquetas de purificación pueden incorporarse en cualquier posición dentro del polipéptido. En algunas realizaciones preferidas, el resto de purificación puede estar ubicado en o hacia (es decir, dentro de 5, 10, 15, 20 aminoácidos de) el extremo N o C del polipéptido.

Como se ha indicado anteriormente, una ventaja de la presente invención surge del hecho de que las etiquetas peptídicas y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) incorporados en un péptido, oligopéptido o polipéptido (por ejemplo, los péptidos recombinantes o sintéticos de la invención) pueden codificarse genéticamente por completo. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una etiqueta peptídica, polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) o polipéptido recombinante o sintético como se ha definido anteriormente.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica una etiqueta peptídica anteriormente definida comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 11-13 o una secuencia de nucleótidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 11-13.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica una pareja de enlace anteriormente definida comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 14 o una secuencia de nucleótidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia como se expone en SEQ ID NO: 14.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico anterior es al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a la secuencia con la que se compara.

La identidad de secuencia de ácido nucleico puede determinarse por, por ejemplo, FASTA Search usando un paquetes de GCG, con valores predeterminados y un pamfactor variable y una penalización por creación de huecos establecida a 12,0 y una penalización por extensión de huecos establecida a 4,0 con una ventana de 6 nucleótidos. Preferentemente, dicha comparación se realiza en toda la longitud de la secuencia, pero puede realizarse en una ventana de comparación más pequeña, por ejemplo, menos de 600, 500, 400, 300, 200, 100 o 50 nucleótidos contiguos.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar compuestas de ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos así como de residuos sintéticos, por ejemplo, nucleótidos sintéticos, que son capaces de participar en interacciones de pares bases tipo Watson-Crick o análogos. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico es ADN o ARN.

Las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas pueden enlazarse de manera operativa a una secuencia de control de la expresión, o un vehículo o vector de clonación de ADN recombinante que contiene tal como una molécula de ADN recombinante. Esto permite la expresión celular de los péptidos y polipéptidos de la invención como un producto génico, la expresión de la que se dirige por el(los) gen(es) introducido(s) en las células de interés. La expresión génica se dirige a partir de un promotor activo en las células de interés y pueden insertarse en cualquier forma del vector de ácido nucleico lineal o circular (por ejemplo, ADN) para la incorporación en el genoma o para la replicación independiente o la transfección/expresión transitoria. Las técnicas de transformación o transfección adecuadas están bien descritas en la bibliografía. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico desnudo (por ejemplo, ADN o ARN, que puede incluir uno o más residuos sintéticos, por ejemplo, análogos de base) pueden introducirse directamente en la célula para la producción de péptidos y polipéptidos de la invención. Como alternativa el ácido nucleico puede convertirse en ARNm por transcripción in vitro y las proteína relevantes pueden generarse por traducción in vitro.

Los vectores de expresión apropiados incluyen, secuencias de control apropiadas tales como, por ejemplo, elementos de control de la traducción (por ejemplo, codones de inicio y parada, sitios de unión ribosómica) y de la transcripción (por ejemplo, regiones promotoras y operadoras, secuencias de parada de la terminación) enlazados en el marco de lectura de emparejamiento con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los vectores apropiados pueden incluir plásmidos y virus (incluidos tanto los virus bacteriófagos como eucariotas). Vectores víricos adecuados incluyen baculovirus y también adenovirus, virus adenoasociado, herpes y virus vaccinia/poxvirus. En la materia se describen muchos otros vectores víricos. Ejemplos de vectores adecuados incluyen vectores de expresión bacteriana y de mamífero pGEX-KG, pEF-neo y pEF-HA.

Como se ha indicado anteriormente, el polipéptido recombinante o sintético de la invención puede comprender secuencias adicionales (por ejemplo, etiquetas peptídicas/polipeptídicas para facilitar la purificación del polipéptido) y, por tanto, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse de manera conveniente con el ADN que codifica un péptido o polipéptido adicional, por ejemplo, etiqueta His, proteína de unión a maltosa, para producir una proteína de fusión en la expresión.

Por tanto, visto desde otro aspecto, la presente invención proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente.

Otros aspectos de la invención incluyen métodos para preparar moléculas de ácido nucleico recombinantes de acuerdo con la invención, que comprenden insertar molécula de ácido nucleico de la invención que codifica la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención en el ácido nucleico vector.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferentemente, contenidas en un vector, pueden introducirse en una célula por cualquier medio apropiado. Las técnicas de transformación o transfección adecuadas están bien descritas en la bibliografía. Se conocen numerosas técnicas y pueden usarse para introducir tales vectores en células procariotas o eucariotas para la expresión. Las células hospedadoras preferidas para este fin incluyen líneas celulares de insecto, levadura, líneas celulares de mamífero o E. coli, tales como la cepa BL21/DE3. La invención también se extiende a células hospedadoras procariotas o eucariotas transformadas o sometidas a transfección que contienen una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector como se ha definido anteriormente.

Por tanto, en otro aspecto, se proporciona una célula hospedadora recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico y/o vector como se ha descrito anteriormente.

Por "recombinante" se quiere decir que la molécula de ácido nucleico y/o el vector se han introducido en la célula hospedadora. La célula hospedadora puede o no contener de manera natural una copia endógena de la molécula de ácido nucleico, pero es recombinante ya que se ha introducido una copia exógena o endógena adicional de la molécula de ácido nucleico y/o el vector.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar una etiqueta peptídica y/o el péptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención como se ha definido anteriormente en el presente documento, que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente, en condiciones por las cuales dicha molécula de ácido nucleico que codifica dicha etiqueta peptídica y/o dicho polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) se expresa y recuperar dicha molécula (etiqueta peptídica y/o polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica)) producida así. La etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) expresados forman un aspecto adicional de la invención.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención, o para su uso en el método y los usos de la invención, pueden generarse mediante síntesis, por ejemplo, por ligamiento de aminoácidos o péptidos generados mediante síntesis más pequeños, o más convenientemente por expresión recombinante de una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden generarse mediante síntesis por cualquier medio adecuado conocido en la materia.

Por tanto, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden ser una etiqueta peptídica o polipéptido aislados, purificados, recombinantes o sintetizados.

El término "polipéptido" se usa indistintamente en el presente documento con el término "proteína". Como se ha indicado anteriormente, el término polipéptido o proteína normalmente incluye cualquier secuencia de aminoácidos que comprende al menos 40 residuos de aminoácido consecutivos, por ejemplo, al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 aminoácidos, tal como 40-1000, 50-900, 60-800, 70-700, 80-600, 90-500, 100-400 aminoácidos.

Igualmente, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser una molécula de ácido nucleico aislada, purificada, recombinante o sintetizada.

Por tanto, como alternativa a lo observado, la etiqueta peptídica, los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico de la invención preferentemente son moléculas no nativas, es decir, de origen no natural.

En el presente documento se usa la nomenclatura de aminoácidos convencional. Por tanto, el nombre completo de un residuo de aminoácidos puede usarse indistintamente con un código de una letra o abreviaciones de tres letras. Por ejemplo, lisina puede sustituirse por K o Lys, isoleucina puede sustituirse por I o Ile, etc. Es más, los términos aspartato y ácido aspártico, y glutamato y ácido glutámico se usan indistintamente en el presente documento y pueden reemplazarse por Asp o D, o Glu o E, respectivamente.

Aunque se prevé que la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de, y para su uso en, la invención pueden producirse de recombinantemente, y esto es una realización preferida de la invención, resultará evidente que la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden conjugarse con proteínas u otras entidades, por ejemplo, moléculas o componentes, como se ha definido anteriormente por otros medios. En otras palabras, la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) y otra molécula, componente o entidad, por ejemplo, proteína, pueden producirse por separado por cualquier medio disponible, por ejemplo, mediante recombinación, y posteriormente conjugarse (unirse) para formar un conjugado etiqueta peptídica-otro componente o conjugado polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica)-otro componente que pueden usarse en los métodos y los usos de la invención. Por ejemplo, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden producirse mediante síntesis o recombinación, como se ha descrito anteriormente, y conjugarse con otro componente, por ejemplo, una proteína por un conector o espaciador no peptídico, por ejemplo, un conector o espaciador químico.

Por tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) y otro componente, por ejemplo, proteína, pueden unirse o bien directamente a través de un enlace o indirectamente a través de un grupo de enlace. Cuando se emplean grupos de enlace, tales grupos pueden elegirse para mantener la unión covalente de la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) y la otra entidad, por ejemplo, proteína, a través del grupo de enlace. Los grupos de enlace de interés pueden variar mucho dependiendo de la naturaleza de la otra entidad, por ejemplo, proteína. El grupo de enlace, cuando está presente, está en muchas realizaciones biológicamente inerte.

Los expertos en la materia conocen muchos grupos de enlace y encuentran su uso en la invención. En realizaciones representativas, el grupo de enlace es generalmente de al menos aproximadamente 50 daltons, generalmente al menos aproximadamente 100 daltons y pueden ser tan grandes como 1.000 daltons o mayores, por ejemplo, hasta 1.000.000 daltons si el grupo de enlace contiene un espaciador, pero en general no superarán los aproximadamente 500 daltons y generalmente no superarán los aproximadamente 300 daltons. En general, tales conectores comprenderán un grupo espaciador terminado en cualquiera de los extremos con una funcionalidad reactiva capaz de unirse covalentemente a la etiqueta peptídica o pareja de enlace y otra molécula o componente, por ejemplo, proteína.

Los grupos espaciadores de interés pueden incluir cadenas de hidrocarburo alifático e insaturado, espaciadores que contienen heteroátomos tales como oxígeno (éteres tales como polietilenglicol) o nitrógeno (poliaminas), péptidos, carbohidratos, sistemas cíclicos o acíclicos que posiblemente pueden contener heteroátomos. Los grupos espaciadores también pueden comprender ligandos que se unen a metales de modo que la presencia de un ion metálico coordina dos o más ligandos para formar un complejo. Los elementos espaciadores específicos incluyen: 1,4-diaminohexano, xililendiamina, ácido tereftálico, ácido 3,6-dioxaoctanodióico, ácido etilenodiamina-N,N-diacético, 1,1'-etilenobis(ácido 5-oxo-3-pirrolidinocarboxílico), 4,4'-etilenodipiperidina, oligoetilenglicol y polietilenglicol. Las funcionalidades reactivas potenciales incluyen grupos funcionales nucleófilos (aminas, alcoholes, tioles, hidrazidas), grupos funcionales electrofílicos (aldehídos, ésteres, vinilcetonas, epóxidos, isocianatos/maleimidas), grupos funcionales capaces de reacciones de cicloadición, que forman puentes disulfuros, o unión a metales. Ejemplos específicos incluyen aminas primarias y secundarias, ácidos hidroxámicos, N-hidroxisuccinimidil ésteres, carbonatos de N-hidroxisuccinimidilo, oxicarbonilimidazoles, nitrofenilésteres, trifluoroetil ésteres, éteres de glicidilo, vinilsulfonas y maleimidas. Grupos conectores específicos que pueden encontrar uso en el reactivo bloqueante de sujeto incluyen compuestos heterofuncionales, tales como azidobenzoil hidrazida, N-[4-(p-azidosalicilamino)butil]-3'-[2'-piridilditio]propionamid), suberato de bis-sulfosuccinimidilo, dimetiladipimidato, disuccinimidiltartrato, éster de N-maleimidobutiriloxisuccinimida, N-hidroxi sulfosuccinimidil-4-azidobenzoato, N-succinimidil [4-azidofenil]-1,3'-ditiopropionato, N-succinimidil [4-iodoacetil]aminobenzoato, glutaraldehído, y succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato, N-hidroxisuccinimida éster de ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP), N-hidroxisuccinimida éster de ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico (SMCC), y similares. Por ejemplo, un espaciador se puede formar con una azida que reacciona con un alquino o se puede formar con una tetrazina que reacciona con un trans-ciclooctano o un norboneno.

En algunas realizaciones, puede ser útil modificar uno o más residuos en la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) para facilitar la conjugación de estas moléculas y/o para mejorar la estabilidad de la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). Por tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de, o para su uso en, la invención pueden comprender aminoácidos no convencionales o no naturales.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de, o para su uso en, la invención pueden comprender uno o más, por ejemplo, al menos 1 , 2, 3, 4, 5 aminoácidos no convencionales, tal como 10, 15, 20 o más no convencionales, es decir, aminoácidos que poseen una cadena lateral que no está codificada por el código genético estándar, denominados en el presente documento "aminoácidos no codificados" (véase, por ejemplo, la Tabla 1 ). Estos pueden seleccionarse de aminoácidos que se forman a través de procesos metabólicos tal como ornitina o taurina, y/o aminoácidos modificados artificialmente tal como 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), (terc)-(B)util(o)xi(c)arbonilo (Boc), aminoácidos protegidos con 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), o aminoácidos que tienen el grupo benciloxicarbonilo (Z).

Ejemplos de aminoácidos no convencionales o análogos estructurales que pueden usarse en la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de, y para su uso en, la invención son D-aminoácidos, isósteros de amida (tales como N-metilamida, amida retroinvertida, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E)-vinilo, metilenamino, metilentio o alcano), L-N metilaminoácidos, D-a metilaminoácidos, D-N-metilaminoácidos. Ejemplos de aminoácidos no convencionales, es decir, no codificados, se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1

Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código ácido a-aminobutírico Abu L-N-metilalanina Nmala a-amino-a-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg aminociclopropano-carboxilato Cpro L-N-metilasparagina Nmasn ácido L-N-metilaspártico Nmasp ácido aminoisobutírico Aib L-N-metilcisteína Nmcys aminonorbornilcarboxilato Norb L-N-metilglutamina Nmgln ácido L-N-metilglutámico Nmglu (continuación)

Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código ciclohexilalanina Chexa L-N-metilhistidina Nmhis ciclopentilalanina Cpen L-N-metilisoleucina Nmile D-alanina Dal L-N-metilleucina Nmleu D-arginina Darg L-N-metilisina Nmlys ácido D-aspártico Dasp L-N-metilmetionina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle D-glutamina Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva ácido D-glutámico Dglu L-N-metilornitina Nmorn D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmphe D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr D-metionina Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp D-ornitina Dorn L-N-metiltirosina Nmtyr D-fenilalanina DPhe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina DThr L-norleucina Nle D-triptófano Dtrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtyr a-metil-aminoisobutirato Maib D-valina Dval a-metil-Y-aminobutirato Mgabu D-a-metilalanina Dmala a-metilciclohexilalanina Mchexa D-a-metilarginina Dmarg a-metilciclopentilalanina Mcpen D-a-metilasparagina Dmasn a-metil-a-naftilalanina Manap D-a-metilaspartato Dmasp a-metilpenicilamina Mpen D-a-metilcisteína Dmcys N-(4-aminobutil)glicina Nglu D-a-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg D-a-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Norn D-a-metilisoleucina Dmile N-amino-a-metilbutirato Nmaabu D-a-metilleucina Dmleu a-naftilalanina Anap D-a-metillisina Dmlys N-bencilglicina Nphe D-a-metilmetionina Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln D-a-metilornitina Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn D-a-metilfenilalanina Dmphe N-(2-carboxietil)glicina Nglu D-a-metilprolina Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp D-a-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metiltreonina Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep D-a-metiltriptófano Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex D-a-metiltirosina Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec D-a-metilvalina Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metilaspartato Dnmasp N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm D-N-metilcisteina Dnmcys N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe D-N-metilglutamina Dnmgln N-(3-guanidinopropil)glicina Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Nthr D-N-metillhistidina Dnmhis N-(hidroxietil))glicina Nser D-N-metilisoleucina Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis D-N-metilleucina Dnmleu N-(3-indolilietil)glicina Nhtrp D-N-metilisina Dnmlys N-metil-Y-aminobutirato Nmgabu N-metilciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe N-metilaminoisobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N-(1-metilpropil)glicina Nile D-N-metilserina Dnmser N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltriptófano Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nval D-N-metiltirosina Dnmtyr N-metilanaftilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen ácido Y-aminobutírico Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr L-t-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys L-etilglicina Etg penicilamina Pen (continuación)

Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código L-homofenilalanina Hphe L-a-metilalanina Mala L-a-metilarginina Marg L-a-metilasparagina Masn L-a-metilaspartato Masp L-a-metil-t-butilglicina Mtbug L-a-metilcisteína Mcys L-metiletilglicina Metg L-a-metilglutamina Mgln L-a-metilglutamato Mglu L-a-metilhistidina Mhis L-a-metilhomofenilalanina Mhphe L-a-metilisoleucina Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet L-a-metilleucina Mleu L-a-metillisina Mlys L-a-metilmetionina Mmet L-a-metilnorleucina Mnle L-a-metilnorvalina Mnva L-a-metilornitina Morn L-a-metilfenilalanina Mphe L-a-metilprolina Mpro L-a-metilserina Mser L-a-metiltreonina Mthr L-a-metiltriptófano Mtrp L-a-metiltirosina Mtyr L-a-metilvalina Mval L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe N-(N-(2,2-difeniletil) carbamilmetil) glicina Nnbhm N-(N-(3,3-difenilpropil) carbamilmetil) glicina Nnbhe 1-carboxi-1-(2 ,2-difenil-etilamino)ciclopropano Nmbc L-O-metil serina Omser L-O-metil homoserina Omhse

En algunas realizaciones, puede ser útil fusionar o conjugar la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención con un sustrato sólido (es decir, una fase sólida o soporte sólido) y resultará evidente que esto se puede conseguir de cualquier modo conveniente. Por tanto, el modo o medio de inmovilización y el soporte sólido pueden seleccionarse, de acuerdo con la preferencia, de cualquier número de medios de inmovilización y soportes sólidos como se conocen ampliamente en la materia y están descritos en la bibliografía. Por tanto, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden unirse directamente a un soporte, por ejemplo, por un dominio o resto de la etiqueta peptídica o polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) (por ejemplo, químicamente entrelazado). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden unirse indirectamente por medio de un grupo conector, o por un grupo de unión intermediario (por ejemplo, por medio de una interacción biotinaestreptavidina). Por tanto, la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden unirse covalentemente o no covalentemente al soporte sólido. El enlace puede ser un enlace reversible (por ejemplo, escindible) o irreversible. Por tanto, en algunas realizaciones, el enlace puede escindirse enzimáticamente, químicamente, o con luz, por ejemplo, el enlace puede ser un enlace sensible a la luz.

Por tanto, en algunas realizaciones, puede proporcionarse una etiqueta peptídica o polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) con medios para la inmovilización (por ejemplo, una pareja de enlace por afinidad, por ejemplo, biotina o un hapteno, capaz de unirse a su pareja de enlace, es decir, una pareja de enlace cognada, por ejemplo, estreptavidina o un anticuerpo) proporcionado sobre el soporte. En algunas realizaciones, la interacción entre la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) y el soporte sólido debe ser lo suficientemente fuerte para permitir las etapas de lavado, es decir, la interacción entre la etiqueta peptídica o el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) y el soporte sólido no se ve alterada (no alterada significativamente) por las etapas de lavado. Por ejemplo, se prefiere que con cada etapa de lavado, menos de un 5 %, preferentemente menos de un 4, 3, 2, 1, 0,5 o 0,1 % de la etiqueta peptídica o polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) se separen o eluyan de la fase sólida.

El soporte sólido (fase o sustrato) puede ser cualquiera de los soportes o matrices bien conocidos que actualmente se usan o se proponen mucho para la inmovilización, la separación, etc. Estos pueden tomar la forma de partículas (por ejemplo, perlas que pueden ser magnéticas, paramagnéticas o no magnéticas), láminas, geles, filtros, membranas, fibras, capilares, portaobjetos, matrices o tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos, etc.

El soporte puede estar hecho de vidrio, sílice, látex o un material polimérico. Adecuados son los materiales que presentan una alta superficie para la unión de la proteína de fusión. Tales soportes pueden tener una superficie irregular y pueden ser, por ejemplo, porosos o particulados, por ejemplo, partículas, fibras, redes, tobas o tamices. Los materiales particulados, por ejemplo, las perlas son útiles debido a su mayor capacidad de unión, particularmente las perlas poliméricas.

Convenientemente, un soporte sólido particulado usado de acuerdo con la invención comprenderá perlas esféricas. El tamaño de las perlas no es crítico, pero, por ejemplo, puede ser del orden de diámetro de al menos 1 y preferentemente al menos 2 pm, y tener un diámetro máximo de preferentemente no más de 10 y, por ejemplo, no más de 6 pm.

Partículas monodispersas, es decir, aquellas que son sustancialmente uniformes en tamaño (por ejemplo, tamaño que tiene una desviación estándar de diámetro de menos de un 5 %) tienen la ventaja de que proporcionan reproducibilidad muy uniforme de la reacción. Partículas de polímero monodispersas representativas pueden producirse por la técnica descrita en el documento US-A-4336173.

Sin embargo, para ayudar a la manipulación y la separación, las perlas magnéticas son ventajosas. El término "magnético" como se usa en el presente documento quiere decir que el soporte es capaz de tener un momento magnético impartido al mismo cuando se coloca en un campo magnético y, por tanto, se puede desplazar bajo la acción de ese campo. En otras palabras, un soporte que comprende partículas magnéticas puede ser retirado fácilmente por agregación magnética, que proporciona un modo rápido, sencillo y eficaz de separar las partículas tras las etapas de formación del enlace isopeptídico.

En algunas realizaciones, el soporte sólido es una resina de amilosa.

En una realización adicional, la invención proporciona un kit, particularmente un kit para su uso en los procedimientos y usos de la invención, es decir, para conjugar dos moléculas o componentes por un enlace isopeptídico, en el que dos de las moléculas o componentes en el complejo están conjugados por un enlace isopeptídico, en el que dicho kit comprende:

(a) un péptido (etiqueta peptídica) como se ha definido anteriormente, opcionalmente conjugado o fusionado con una molécula o componente, por ejemplo, una proteína; y

(b) un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) como se ha definido anteriormente, opcionalmente conjugado o fusionado con una molécula o componente, por ejemplo, una proteína tal como un polipéptido recombinante o sintético que comprende un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) como se ha definido anteriormente; y/o

(c) una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector, que codifica un péptido (etiqueta peptídica) como se ha definido en (a); y

(d) una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector, que codifica un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) como se ha definido en (b).

Resultará evidente que la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención tienen un amplia gama de utilidades. Como alternativa a lo observado, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden emplearse en una diversidad de industrias.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden encontrar utilidad en marcación fluorescente u otras sondas biofísicas o marcadores para proteínas específicas. En este sentido, la proteína de interés puede modificarse para incorporar una etiqueta peptídica de la invención (por ejemplo, una de SEQ ID NO: 3-5), como se ha tratado anteriormente, y el fluorescente u otra sonda o marcador biofísico pueden fusionarse o conjugarse con el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica, por ejemplo, SEQ ID NO: 2). La proteína modificada y la sonda o marcador pueden ponerse en contacto en condiciones adecuadas para permitir la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica), marcando de este modo la proteína con el marcador o la sonda por un enlace isopeptídico.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden encontrarse en la inmovilización de proteína para la proteómica. En este sentido, las proteínas de interés pueden modificarse para incorporar una etiqueta peptídica de la invención (por ejemplo, una de SEQ ID NO: 3-5), y un sustrato sólido puede fusionarse o conjugarse con el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica, por ejemplo, SEQ ID NO: 2). Las proteínas modificadas y el sustrato sólido pueden ponerse en contacto en condiciones adecuadas para permitir la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica), inmovilizando de este modo las proteínas sobre el sustrato sólido por un enlace isopeptídico. Resultará evidente que la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden usarse para inmovilizar simultáneamente proteínas múltiples sobre una fase/sustrato sólido.

En otras realizaciones adicionales, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden encontrar utilidad en la conjugación de antígenos con partículas tipo virus, virus, bacterias o armazones de multimerización para la vacunación. Por ejemplo, la producción de partículas tipo virus, virus o bacterias que expresan el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) sobre la superficie facilitaría la conjugación de los antígenos que comprenden la etiqueta peptídica de la invención (por ejemplo, una de SEQ ID NO: 3-5) con su superficie por un enlace isopeptídico. En este sentido, la multimerización de antígeno da lugar a respuestas inmunitarias muy aumentadas. Por tanto, en algunas realizaciones, la molécula o el componente fusionado con el polipéptido de la invención es una proteína de cápside vírica y/o la molécula o componente fusionado con la etiqueta peptídica de la invención es un antígeno, por ejemplo, un antígeno asociado con una enfermedad particular, por ejemplo, una infección.

En otras realizaciones, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) pueden usarse para someter a ciclación una enzima, por ejemplo, fusionando la etiqueta peptídica y la pareja de enlace a cada extremo de la enzima y posteriormente permitiendo la formación espontánea del enlace isopeptídico entre la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica). En este sentido, la ciclación de las enzimas ha demostrado que incrementa la resiliencia enzimática.

En particular, la ciclación de las enzimas o polímeros enzimáticos (proteínas de fusión) pueden mejorar la termoestabilidad de la proteína o unidades proteicas en el polímero enzimático. En este sentido, las enzimas son herramientas valiosas en muchos procedimientos pero son inestables y difíciles de recuperar. Los polímeros enzimáticos tienen mayor estabilidad a la temperatura, el pH y los disolventes orgánicos y existe un deseo incrementado de usar polímeros enzimáticos en los procedimientos industriales. Sin embargo, la generación de polímero enzimático comúnmente usa una reacción no específica de glutaraldehído y esto dañará o desnaturalizará (es decir, reducirá la actividad de) muchas enzimas potencialmente útiles. Se espera que el enlace específico a sitio de proteínas en las cadenas (polímeros) a través de enlaces isopeptídicos usando la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la presente invención aumente la resiliencia enzimática, tal como en diagnósticos y enzimas añadidos a la alimentación animal. En realizaciones particularmente preferidas, las enzimas pueden estabilizarse por ciclación, como se ha tratado anteriormente.

La etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención también podrían usarse para unir enzimas múltiples en rutas para promover la eficacia metabólica, como se describe en el documento WO 2016/193746. En este sentido, las enzimas con frecuencia se juntan para funcionar en rutas dentro de células y tradicionalmente ha sido difícil conectar enzimas múltiples fuera de las células (in vitro). Por tanto, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención podrían usarse para acoplar o conjugar enzimas para producir proteínas de fusión y, por lo tanto, aumentar la actividad de las rutas enzimáticas de múltiples enzimas, lo cual podría ser útil en una gama de conversiones industriales y para diagnósticos.

La etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención también encontrarán utilidad en la producción de polímeros de anticuerpo. En este sentido, los anticuerpos son una de la clases más importantes de compuestos farmacéuticos y con frecuencia se usan sujetos a superficies. Sin embargo, la mezcla de antígeno en una muestra y, por lo tanto, la captura de dicho antígeno en dicha muestra, son ineficaces cerca de superficies. Al ampliar las cadenas de los anticuerpos, se anticipa que la eficacia de captura mejorará. Esto será especialmente valioso en el aislamiento celular del tumor circundante, lo cual está presente en uno de los modos más prometedores de poder diagnosticar pronto el cáncer.

En otra realización adicional, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden encontrar utilidad en la producción de fármacos para activar la señalización celular. En este sentido, muchos de los modos más eficaces para activar la función celular son a través de ligandos proteicos. Sin embargo, en la naturaleza un ligando proteico generalmente no actuará solo sino con una combinación específica de otras moléculas de señalización. Por tanto, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención permiten la generación de proteínas de fusión a medida (es decir, equipos proteicos), que podrían dar activación óptima de la señalización celular. Estas proteínas de fusión (equipos proteicos) podrían aplicarse para controlar la supervivencia, la división, o la diferenciación celular.

En otras realizaciones adicionales más, la etiqueta peptídica y el polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica) de la invención pueden encontrar utilidad en la generación de hidrogeles para el cultivo de células eucariotas, por ejemplo, neuronas, células madre, preparación de biomateriales, funcionalización de anticuerpo con colorantes o enzimas y estabilización de enzimas por ciclación.

La invención se describirá a continuación con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitantes en referencia a los siguientes dibujos:

La Figura 1 muestra un dibujo del procedimiento de selección ("panning") para seleccionar las variantes de SpyTag expresadas sobre pIII del fago M13.

La Figura 2 muestra (A) un gráfico de barras que demuestra la cantidad de fago de SpyTag recuperado después de selección con el cebo SpyCatcher tipo silvestre (WT), en comparación con el SpyCatcher EQ no reactivo, cuantificada como unidades formadoras de colonia (ufc) (media ± 1 s.d., n=3); y (B) una tabla de secuencias seleccionadas de variantes de SpyTag de las rondas finales de la selección de la biblioteca N-terminal (NLib1-3, SEQ ID NO: 15-17) y la posterior biblioteca C-terminal (CLib1-10, SEQ ID NO: 18-27). WT se refiere a la secuencia de SpyTag (SEQ ID NO: 6) y SpyTag002 se refiere a una variante con una velocidad de reacción mejorada, SEQ ID NO: 3.

La Figura 3 muestra un gráfico de la secuencia temporal de la reacción de SpyCatcher con variantes de deleción de la variante más reactiva de la biblioteca N-terminal de SpyTag (NLib1-MBP). PPVPT se refiere a SEQ ID NO: 15, PVPT se refiere a SEQ ID NO: 30, VPT se refiera a SEQ ID NO: 31 y PT se refiere a SEQ ID NO: 32. Los datos muestran la media de las reacciones llevadas a cabo por triplicado ± 1 s.d.; algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles.

La Figura 4 muestra (A) un dibujo del esquema de selección por expresión en fago para variantes de SpyCatcher aceleradas. Los mutantes de SpyCatcher en fago M13 se seleccionan frente a cebo AviTag-SpyTag-MBP biotinilado, antes de la elución de proteasa TEV de las perlas de estreptavidina; y (B) muestra un gráfico de barras que demuestra la cantidad de fago de SpyCatcher recuperado después de cribado con el WT SpyTagMBP o el control SpyTag DA-MBP no reactivo, cuantificada como ufc (media ± 1 s.d., n=3).

La Figura 5 muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de variantes seleccionadas de la ronda final de las selecciones de la biblioteca de SpyCatcher. * sin cambio, : cambio muy conservativo, . cambio conservativo, y el hueco indica distinto cambio. WT se refiere a SEQ ID NO: 7, L1C1 se refiere a SEQ ID NO: 33, L1C4 se refiere a SEQ ID NO: 34, L1C2 se refiere a SEQ ID NO: 35, L2C1 se refiere a SEQ ID NO: 36, L1C3 se refiere a SEQ ID NO: 37, L1C6 se refiere a SEQ ID NO: 38, L2C8 se refiere a SEQ ID NO: 39 y SC002 se refiere a SEQ ID NO: 40.

La Figura 6 muestra un gráfico de la secuencia temporal de la reacción de las variantes de SpyCatcher seleccionadas por fago. Se incubó SpyTag-MBP con SpyCatcher y se seleccionaron las variantes, con cada proteína a 1 pM a 25 °C en PBS pH 7,5. La reacción se analizó después de ebullición por SDS-PAGE con tinción con Coomassie. Los datos muestran las medias de las reacciones replicadas. SpyCatcher se refiere a SEQ ID NO: 7, L1C1 se refiere a SEQ ID NO: 33, L1C4 se refiere a SEQ ID NO: 34, L1C2 se refiere a SEQ ID NO: 35, L2C1 se refiere a SEQ ID NO: 36, L1C3 se refiere a SEQ ID NO: 37, L1C6 se refiere a SEQ ID NO: 38 y L2C8 se refiere a SEQ ID NO: 39.

La Figura 7 muestra (A) un gel de SDS-PAGE que muestra que la autoreacción de la variante L1C6 de SpyCatcher se bloqueó en SpyCatcher002. L1C6 y SpyCatcher002 se analizaron aisladamente o después de la reacción con SpyTag002-MBP por SDS-PAGE con tinción con Coomassie. Se marcó una pequeña fracción del dímero L1C6 covalente, así como el producto de la reacción del dímero L1C6 con SpyTag002-MBP. Condiciones de reacción: variante de SpyCatcher 10 pM (+), SpyTag002-MBP 13 pM (++), PBS pH 7,5 a 25 °C durante 1 h; y (B) un alineamiento de parte de la secuencia de aminoácidos de SpyTag (SEQ ID NO: 41) con el extremo N de SpyCatcher L1C6 (SEQ ID NO: 42). El extremo N de L1C6 D5T (SEQ ID NO:43) previno la autoreacción.

La Figura 8 muestra un gráfico que presenta la calorimetría diferencial de barrido de SpyCatcher superpuesto con SpyCatcher002. Los valores Tm se muestran insertados.

La Figura 9 muestra (A) un gel de SDS-PAGE que representa la caracterización de la formación de enlace isopeptídico espontáneo entre SpyCatcher002 y SpyTag002. SpyCatcher002 y SpyTag002-MBP se mezclaron a 10 pM durante 1 h en tampón succinato-fosfato-glicina a pH 7,0 y se analizaron después de ebullición por SDS-PAGe con tinción con Coomassie. También se muestran las proteínas control no reactivas, SpyCatcher002 EQ y SpyTag002 DA-MBP; y (B) un gráfico de una secuencia temporal para la reacción de SpyCatcher002-sfGFP con SpyTag002-MBP o la reacción de SpyCatcher-sfGFP con SpyTag-MBP a 0,1 pM en tampón succinato-fosfatoglicina a pH 7,0. (media de triplicado ± 1 s.d.; algunas barras de error son demasiados pequeñas para ser visibles).

La Figura 10 muestra gráficos de secuencias temporales para la reacción de SpyCatcher002-sfGFP con SpyTag002-MBP o la reacción de SpyCatcher-sfGFP con SpyTag-MBP a (A) 1 pM y (B) 10 pM en tampón succinato-fosfato-glicina a pH 7,0. (media de triplicado ± 1 s.d.; algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles) (B).

La Figura 11 muestra un gráfico que cuantifica la constante de velocidad para SpyCatcher002 que reacciona con SpyTag002-MBP, a partir de medidas por triplicado (cada punto de datos mostrado). 0,5 pM de cada proteína estaba en tampón succinato-fosfato-glicina a pH 7,0, 25 °C. Se muestra la ecuación para la línea de tendencia y el coeficiente de correlación.

La Figura 12 muestra un gel de SDS-PAGE que representa el ensayo de la reacción de SpyCatcher002/SpyTag002 hasta su finalización. Se incubó SpyCatcher002 con SpyTag002-MBP en tampón succinato-fosfato-glicina pH 7,0 durante 1 h a 25 °C antes de análisis por SDS-PAGE y tinción con Coomassie. Las proteínas estaban a 10 pM (+) o 20 pM (+++).

La Figura 13 muestra (A) un gráfico que representa la dependencia de pH de la reacción de SpyCatcher002 con SpyTag002 durante 1 o 5 min a 25 °C en tampón succinato-fosfato-glicina, analizado por ^sDS-PAGE y tinción con Coomassie; (B) un gráfico de barras que muestra la dependencia de temperatura de la reacción como en (A) en PBS pH 7,5; (C) un gráfico de barras que muestra la dependencia de tampón de la reacción como en (A) a 25 °C y pH 7,5 con PBS, PBS 1 mM EDTA, HEPES 50 mM, solución salina tamponada con HEPES (HbS), o solución salina tamponada con tris (TBS) 50 mM; (D) un gráfico de barras que muestra la dependencia de detergente de la reacción como en (A) en PBS pH 7,5 a 25 °C sin detergente (PBS), PBS con Tritón X-100 al 1 %, o PBS con Tween-20 al 1 %; y (E) un gráfico que representa la dependencia de urea de la reacción de SpyCatcher002 con SpyTag002-MBP a 25 °C y pH 7,5 en PBS durante 30 o 120 min. Todos los gráficos muestran la media del triplicado ± 1 s.d.; algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles. La Figura 14 muestra (A) un gráfico que muestra una secuencia temporal de MBPx-SpyCatcher y MBPx-SpyCatcher002 que reaccionan con SpyTag002-MBP, con cada proteína a 0,5 pM a 25 °C en PBS pH 7,5, analizada después de ebullición por SDS-PAGE con tinción con Coomassie y demuestra que la reactividad mejorada de SpyCatcher002 sobre SpyCatcher se conservaba cuando una proteína se fusionaba con el extremo N; y (B) un gráfico de barras de la reactividad de AffiEGFR-SpyTag002 incubada con SpyCatcher o SpyCatcher002 durante 1 o 5 min, con cada proteína a 2 pM a 25 °C en PBS pH 7,5 y analizada por SDS-PAGE con tinción con Coomassie. Los datos muestran la media de las reacciones llevadas a cabo por triplicado ± 1 s.d.; algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles. Esto muestra que la reactividad mejorada de SpyCatcher002 sobre SpyCatcher se conservaba cuando SpyTag002 estaba en el extremo C. La Figura 15 muestra gráficos que representan una secuencia temporal para D5T SpyCatcher002 (SEQ ID NO: 40) 0,5 pM que reacciona con (A) SpyTag002-MBP (SEQ ID NO: 3-MBP) o SpyTag002 T3H-MBP (SEQ ID NO: 4-MBP) 0,5 pM; y (B) SpyTag002-T3H-MBP (SEQ ID NO: 4-MBP) o SpyTag002 RG T3H-MBP (SEQ ID NO: 5-MBP) 0,5 pM. La reacción se realizó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,5 a 25 °C y se analizó por SDS-PAGE y tinción con Coomassie mostrando los datos la media de las reacciones llevadas a cabo por triplicado ± 1 s.d. Se muestran las ecuaciones para la línea de tendencia y el coeficiente de correlación. Las constantes de velocidad de segundo orden para las reacciones vienen de las pendientes de las líneas de tendencia y tienen unidades de ^jM'1 min-1.

La Figura 16 muestra un gráfico que representa el análisis de la velocidad para variantes D5A SpyCatcher002 0,5 ^jM (SEQ ID NO: 44-47) que reacciona con AP-SpyTag002-MBP (SEQ ID NO: 3-MBP) 0,5 ^jM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,5 a 25 °C. Todas las reacciones se analizaron por SDS-PAGE y tinción con Coomassie mostrando los datos la media de las reacciones llevadas a cabo por triplicado ± 1 s.d. Se muestran las ecuaciones para la línea de tendencia y el coeficiente de correlación. Las constantes de velocidad de segundo orden para las reacciones vienen de las pendientes de las líneas de tendencia y tienen unidades de ^jM-1 min-1.

Ejemplos

Ejemplo 1- Optimización de la expresión en fago de SpyTag (SEQ ID NO: 6)

El SpyTag/SpyCatcher es un enfoque no convencional a las interacciones peptídicas y existen características de la interacción que no pueden predecirse mediante el diseño racional. La selección a partir de bibliotecas de fago se ha establecido durante décadas y lo difícil es normalmente detectar las interacciones débiles, en lugar del reto del cribado de las interacciones irreversibles. Inicialmente establecimos una selección modelo para lograr la selección eficaz de la formación de enlace isopeptídico.

Se encontró que el primer rasgo clave para posibilitar la selección con éxito del fago de SpyTag era capturar el cebo SpyCatcher (SEQ ID NO: 7) en la solución, en lugar de sujetar SpyCatcher a una perla. La captura en solución permitió la fácil titulación de la concentración del cebo y redujo el ruido de fondo de la unión no específica del fago a las perlas (Figura 1).

El segundo rasgo clave era el uso de escisión por proteasa para eluir el fago específicamente de las perlas de estreptavidina, por un sitio de proteasa TEV entre la biotina y SpyCatcher (Figura 1).

El tercer rasgo clave era el establecimiento de condiciones demasiados duras para disociar casi todas las interacciones no covalentes por el fago-variante de péptido, pero no tan duras que se destruía la infectividad del fago. Se estableció el uso de un lavado con glicina-HCl pH 2,2, a continuación, cuatro lavados con Tween-20 al 0,5 % (v/v).

Para la selección modelo usamos fago M13 que expresaba SpyTag sobre pIII. El cebo se sometió a biotinilación específicamente a sitio a través de una AviTag, unida a SpyCatcher o a SpyCatcher EQ de control negativo con una mutación en el ácido glutámico esencial para la formación de enlace covalente. Después de la precipitación para eliminar el exceso de cebo, la captura de estreptavidina-perla, el lavado y la elución de TEV, se midió el fago recuperado por detención por PCR cuantitativa (qPCR) del ADN empaquetado en el fago. Después de nuestra optimización de las condiciones de selección, este ensayo mostró enriquecimiento de 4 órdenes de magnitud para wt SpyCatcher sobre SpyCatcher EQ (Figura 2A).

La anterior mutagénesis dirigida a sitio había mostrado un papel clave para los residuos de la hebra p central en SpyTag, por tanto, produjimos dos bibliotecas diferentes aleatorizando residuos en los extremos N-terminales y C-terminales de SpyTag (Figura 2B). Con la aleatorización N-terminal y las rondas de selección de fago, NLib1 (PPVPTIVMVDAYKPTK, SEQ ID NO:15) dio la reacción más rápida. Nlib1 era 3 residuos más largo que la SpyTag primaria, por tanto, ensayamos cuánto de los residuos N-terminales eran importantes. Nlib1 podía estar truncado en el extremo N por dos residuos con poco efecto sobre la velocidad, pero el truncamiento del 3° residuo redujo mucho la reacción (Figura 3). Por lo tanto, VPT se usó a partir de entonces en el extremo N, mientras que el extremo C se aleatorizó basado en esta guía. Después de las rondas del cribado de la biblioteca de fago, se muestran los aciertos enriquecidos CLib1-10 (Figura 2B). De estas variantes, Clib1 era la más rápida para la reacción con SpyCatcher y de manera interesante conservaba la secuencia YK C-terminal en SpyTag. Sin embargo, la cisteína en Clib1 era indeseable debido al potencial para la dimerización y así este residuo se revertió a A (Figura 2B). Además, encontramos que la K terminal de SpyTag (no presente en la biblioteca de fago) incrementó la velocidad de reacción. Por lo tanto, con esta combinación de selección de fago y diseño racional, llegamos a una etiqueta optimizada, SpyTag002 (VPTIVMVDAYKRYK, SEQ ID NO: 3) (Figura 2B).

Ejemplo 2- Optimización de la expresión en fago de SpyCatcher (SEQ ID NO: 7)

La selección por expresión en fago de SpyCatcher se realizó de manera similar a la selección de las variantes de SpyTag, aunque la expresión de una proteína fragmentada sobre la superficie del fago proporciona un reto adicional. Encontramos que los rasgos clave importantes para la selección eficaz eran un sitio de escisión de la proteasa TEV entre SpyCatcher y pIII sobre el fago (que permite la elución específica del fago de las perlas magnéticas) y el uso de una secuencia señal DsbA para la translocación de cotraducción, que mejora la expresión de SpyCatcher sobre pIII. El cebo era AviTag-SpyTag-MBP biotinilado y las variantes de SpyCatcher se realizaron por PCr propensa a error (Figura 4A). Inicialmente optimizamos una selección modelo con el cebo deseado (SpyTag) o un control negativo, SpyTag DA, que se une no covalentemente a SpyCatcher pero no reacciona. Esta selección mostró captura aumentada aproximadamente 1.000 veces de cebo wt SpyTag en comparación con cebo SpyTag DA, valorada por qPCR de fago recuperado (Figura 4B).

Después de las rondas de selección con severidad creciente, la secuencia de los clones seleccionados se indica en la Figura 5. Las mutaciones se distribuyeron mucho sobre la estructura, con muchos residuos mutados distantes del sitio de unión a SpyTag. Los aciertos se expresaron como proteínas solubles en E. coli y se evaluaron para su velocidad de reacción con SpyTag-MBP. La secuencia de menor reacción era L1C6 (Figura 6).

Durante este proceso, se identificó una nueva banda sobre SDS-PAGE después de la expresión recombinante de la variante L1C6 de SpyCatcher (Figura 7A). Puesto que esta banda se desplazó completamente tras la mezcla con SpyTag002-MBP y tuvo una movilidad aproximadamente dos veces que la de SpyCatcher, estuvimos seguros de que la banda representaba un dímero de SpyCatcher covalente. Planteamos la hipótesis de que el aumento de la reactividad de SpyCatcher había promovido la formación de esta autoreactividad no intencionada. Buscando en SpyCatcher una secuencia con similitud a SpyTag, encontramos GAMVDT N-terminal (SEQ ID NO: 42) de SpyCatcher parecida a IVMVDA (SEQ ID NO:41) de SpyTag (Figura 7B). Estábamos satisfechos de ver que la mutación de GAMVDT (SEQ ID NO:42) a GAMVTT (SEQ ID NO:43) en nuestra variante acelerada (SpyCatcher002 Figura 5) eliminaba esta reacción secundaria (Figura 7A).

Para explorar el efecto de las mutaciones sobre el plegamiento de SpyCatcher, ensayamos las construcciones por calorimetría diferencial de barrido (DSC). La DSC mostró que había cambio mínimo en el punto de transición de no plegamiento entre SpyCatcher (49,3 °C) y SpyCatcher002 (49,9 °C), por tanto, la mutagénesis no había dañado la termoestabilidad (Figura 8).

Ejemplo 3 - Validación de las velocidades de la variante SpyTag002 y SpyCatcher002

Con SpyTag002 y SpyCatcher002 en mano, validamos con cuidado su comportamiento de reacción de una con otra. Confirmamos el papel clave de los residuos reactivos putativos, al mostrar que la mutación única en SpyTag002 (DA) o en SpyCatcher002 (EQ) abolía la reacción (Figura 9A).

La reacción de SpyTag/SpyCatcher es eficaz a concentraciones altas. Para analizar la reacción a concentraciones bajas, hicimos reaccionar con superfolder GFP (sfGFP) para la detección fluorescente de la formación de enlace covalente, después de la electroforesis de poliacrilamida. Si las muestras no se hierven, sfGFP puede permanecer plegado y fluorescente incluso en presencia de SDS. Este análisis mostró la principal mejora de la velocidad de reacción con SpyTag002 y SpyCatcher002 en comparación con las versiones primarias (Figura 9B). Como se esperaba, la diferencia era menos marcada cuando las concentraciones de ambas parejas se incrementaban a 1 pM y 10 pM, pero las versiones 002 eran aún más rápidas a 10 pM (Figura 10A y B). La velocidad de reacción se fijó bien para una reacción de segundo orden (Figura 11). A 25 °C a pH 7,0, SpyTag002-MBP reaccionó con SpyCatcher002 con una constante de velocidad de 2,0 ± 0,2 x 104 M'1.s_1 (12 veces más rápida que SpyTag-MBP reaccionando con SpyCatcher). SpyTag002 y SpyCatcher002 ambos mostraron retrocompatibilidad, reacción eficaz con las versiones primarias (Tabla 2).

Tabla 2: Constantes de velocidad para las reacciones de SpyCatcher o SpyCatcher002 con SpyTag-MBP o

- - - ° =

El sistema de SpyTag tiene baja reactividad intrínseca de los grupos reactivos (amino y ácido carboxílico) y, por tanto, tiene reducida oportunidad de reacciones secundarias, tales como hidrólisis de ésteres o tioésteres. El campo cuantitativo cercano es especialmente importante con reacciones secuenciales múltiples, tales como en síntesis de poliproteína en fase sólida o para el desarrollo clínico, donde la uniformidad es importante. Con exceso de dos veces de su pareja, en 1 hora reaccionó >99 % de SpyCatcher002 y >97 % de SpyTag002-MBP (Figura 12).

La formación de enlace isopeptídico entre SpyTag002 y SpyCatcher002 también se confirmó por espectrometría de masa con ionización por electronebulización, con la pérdida esperada de H2O tras la reacción.

Ejemplo 4 - Validación de las condiciones de reacción de la variante SpyTag002 y SpyCatcher002

Ensayamos la resiliencia de la reacción de SpyTag002 y SpyCatcher002 en un amplio intervalo de condiciones. Las constantes de velocidad anteriores se calcularon a pH 7, pero la reactivad era similar a pH 4 y ligeramente mayor a pH 5 y 6 (Figura 13A). La reacción era rápida a 4, 25 y 37 °C (Figura 13B). La reacción era relativamente independiente del tampón, con reacción eficaz con tamponamiento con fosfato, Tris o HEPES, con dependencia relativamente pequeña de aniones o cationes monovalentes o divalentes específicos (Figura 13C). La reacción de SpyTag002 y SpyCatcher002 toleró bien la presencia de detergentes Tritón X-100 o Tween-20, dando una ligera mejora de la reactividad (Figura 13D). La reacción de SpyTag002 y SpyCatcher002 también toleró urea por encima de 3M (Figura 13E).

SpyCatcher002 se seleccionó en fago como una fusión N-terminal con pIII. Confirmamos que SpyCatcher002 también se comportaba bien como una fusión C-terminal, lo que muestra la reacción eficaz de MBPx-SpyCatcher002 con SpyTag002-MBP (Figura 14A). Validamos que SpyTag002 reaccionaba eficazmente cuando se fusionaba al extremo N como SpyTag002-MBP (Figura 12) o al extremo C como AffiEGFR-SpyTag002 (Figura 14B).

Ejemplo 5 - Optimización adicional de SpyTag002

La fusión SpyTag002-MBP tiene una velocidad de reacción de 0,40 jM '1min'1 con SpyCatcher002. Sorprendentemente determinamos que la velocidad de reacción podría mejorarse más introduciendo modificaciones adicionales al péptido SpyTag002.

La sustitución del residuo de treonina en la posición 3 de SpyTag002 (SEQ ID NO: 3) con histidina, es decir, la reversión del residuo en la posición equivalente en SpyTag, dio como resultado un péptido (SEQ ID NO: 4) con una velocidad de reacción de 0,53-0,55 jM '1min'1, es decir, aproximadamente un incremento de un 35% en la actividad (Figura 15A).

La modificación del péptido mejorado para incluir residuos de arginina y glicina en el extremo N (SEQ ID NO: 5) aumentó más del doble la velocidad de reacción a 1,21 jM '1min'1 (Figura 15B).

Ejemplo 6 - Optimización adicional de SpyCatcher002

Una variante de SpyCatcher002 que contiene un residuo de alanina en la posición 5 (SpyCatcher002D5A SEQ ID NO:44) tiene una velocidad de reacción de 0,45 jM '1min'1 con SpyTag002-MBP. Sorprendentemente determinamos que la velocidad de reacción podría mejorarse más introduciendo modificaciones adicionales al polipéptido SpyCatcher002.

La sustitución del residuo de alanina en la posición 92 de la variante de SpyCatcher002 (SEQ ID NO: 44) por prolina dio como resultado un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica, SEQ ID NO: 45) con una velocidad de reacción de 0,84 jM '1min'1, es decir, aproximadamente un incremento de un 85 % en la actividad (Figura 16).

Aunque sin el deseo de limitarse a teoría alguna, se propone que la inserción de un residuo de prolina en esta posición en el polipéptido reduce la flexibilidad en un bucle del polipéptido. En este sentido, el ángulo phi de prolina está fijado, mientras que el ángulo phi de todos los otros residuos pueden variar sustancialmente. Encontramos que Ala tenía un ángulo phi adecuado para el reemplazo por prolina y también se juzgó que el tamaño de la cadena lateral incrementado de la prolina sería estéricamente tolerado. Basándose en nuestro trabajo sobre cristalografía de la interacción SpyTag/SpyCatcher, también pensamos que este bucle de SpyCatcher también sería importante para la interacción, debido a la proximidad de SpyTag. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que esta mutación produciría la conformación de la variante de SpyCatcher preorientada para el acoplamiento de SpyTag, por lo que se incrementaría de este modo la velocidad de reacción.

Igualmente, la sustitución del residuo de glutamina en la posición 100 de la variante SpyCatcher002 (SpyCatcher002D5A SEQ ID NO: 44) por ácido aspártico dio como resultado un polipéptido (pareja de enlace de la etiqueta peptídica, SEQ ID NO: 46) con una velocidad de reacción de 0,93 ^jM'1 min'1, es decir, aproximadamente un incremento de un 105 % en la actividad (Figura 16). Se piensa que el ácido aspártico en esta posición puede formar una interacción electrostática con lisina 111, incrementando así la estabilidad de la interacción entre dos bucles de la variante de SpyCatcher. Planteamos la hipótesis de que esta mutación produciría la conformación de SpyCatcher preorientada para el acoplamiento de SpyTag, por lo que se incrementaría de este modo la velocidad de reacción. La combinación de las sustituciones anteriormente descritas (SEQ ID NO: 47) mejoró más la velocidad de reacción a 1,22 ^jM'1 min_1, por lo que se demuestra de este modo que cada mutación tiene un efecto separado sobre la velocidad de reacción. Notablemente, la sustitución de la alanina en la posición 5 de SEQ ID NO: 47 por treonina (es decir, dando como resultado SEQ ID NO: 2) mejora más la velocidad de reacción (Figura 16).

Métodos

Clonación

Se usó polimerasa de alta fidelidad Q5 (NEB) para realizar todas las PCR y la mutagénesis dirigida a sitio. Se usó mezcla maestra de Gibson Assembly (NEB) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las construcciones inicialmente se clonaron en células NEB5a de E. coli químicamente competentes (NEB).

Los plásmidos pET28a SpyTag-MBP (ID plásmido de Addgene 35050), pET28A SpyTag-DA-MBP, pDEST14 SpyCatcher (GenBank JQ478411, ID plásmido de Addgene 35044), y pDEST14 SpyCatcher EQ (ID plásmido de Addgene 35045) se han descrito anteriormente (Zakeri et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 109, E690-697). pDEST14 AP-SpyCatcher (n.° de acceso de GenBank KU500645, ID plásmido de Addgene 72326) tanto como versiones WT como EQ, que contiene una etiqueta peptídica (AP) para la biotinilación específica a sitio en el extremo N, se construyó a partir de pDEST14 SpyCatcher (WT/EQ) usando SLIM PCR que usa cebadores 5'-GATTACGACATCCCAACGACCGAAAACCTG (SEQ ID NO:48), 5'-GCCTGAACGATATTTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAGGCGATTAC GACATCCCAACGACCGAAAACCTG (SEQ ID NO:49), 5'-GTGATGGTGATGGTGATGGTAGTACGACATATG (SEQ ID NO:50) y 5'-TGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAAATATCGTTCAGGCCGCTGCCGTGATG GTGATGGTGATGGTAGTACGACATATG (SEQ ID NO:51). pET28a AP-SpyTag-MBP y AP-SpyTag DA-MBP se construyeron insertando la misma etiqueta de biotinilación N-terminal (pero sin el sitio de escisión de proteasa TEV) en pET28a SpyTag(WT/DA)-MBP usando 5'-ATTACATATGGGTCTGAATGATATTTT CGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAGGTAGCGGAGCCCACATCGTGATGGTG (SEQ ID NO:52) y 5'-GGGGAAGCTTTTACGAGCTCGAATTAGTCTG (SEQ ID NO:53). El inserto se digirió con HindIII (NEB) y Ndel (NEB) y se ligó en pET28a.

Las variantes de SpyTag individuales (incluida SpyTag002 DA-MBP) se crearon usando QuikChange PCR con pET28a SpyTag-MBP como molde y se transformaron en células NEB5a. Las variantes de SpyCatcher individuales se clonaron del vector fagémido pFab5cHis en pDEST14 para la expresión de la proteína soluble mediante amplificación por PCR del gen de SpyCatcher usando cebadores directos (5'-CCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGCCATG (SEQ ID NO:54)) e inversos (5'-GCATCAACCATTTAGCTACCACTGGATCC (SEQ ID NO:55)). El cebador inverso conserva el conector peptídico GSGGS de pFab5cHis que viene de C-terminal a la proteína SpyCatcher para permitir la posterior superposición con el vector pDEST14. Las mutaciones puntuales adicionales en las variantes de SpyCatcher seleccionadas (incluida la versión inactiva SpyCatcher002 EQ) se introdujeron por mutagénesis por QuikChange PCR. Todas las mutaciones y las construcciones se verificaron por secuenciación.

El plásmido pJ404-SpyCatcher-sfGFP que codifica SpyCatcher fusionado con superfolder GFP (sfGFP) fue un amable regalo de Karl Brune (Universidad de Oxford) y se produjo en un Gibson Assembly de tres partes. El gen de SpyCatcher (que incluye la etiqueta His y el sitio de escisión de la proteasa TEV) se amplificó a partir del plásmido pDEST14 SpyCatcher que usa cebadores directos (5'-GTTTAACTTTAATAAGGAGATA TACCATGTCGTACTACCATCACCATCACC (SEQ ID NO:56)) e inversos (5'-CTTTACGGCCTGAACCACCAATATGAGCGTCACCTTTAGTTGC (SEQ ID NO:57)). El sfGFP precedido por un conector GGSG se amplificó con cebadores directos (5'-GGTGGTt Ca GGCCGTAAa Gg (SEQ ID No :58)) e inversos (5'-CCTTGGGGCTCGAGTTATCATTTGTACAGTTCATCCATACCATGC (SEQ ID NO:59)) del plásmido pJ404-sf-GF (DNA2.0). La cadena principal del plásmido se amplificó usando cebadores directos (5'-CATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAGGG (SEQ ID NO:60)) e inversos (5'-TGATAACTCGAGCCCCAAGG (SEQ ID NO:61)). A continuación, los tres productos de la PCR se enlazaron mediante Gibson Assembly. El plásmido pJ404-SpyCatcher002-sfGFP se creó amplificando el gen de SpyCatcher002 de pDEST14-SpyCatchero02 usando cebadores directos (5'-CATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAGGG(SEQ ID NO:62)) e inversos (5'-TGATAACTCGAGCCCCAAGG (SEQ ID NO:63)). La cadena principal del vector se amplificó en dos partes usando cuatro cebadores (5'-GGTGGTTCAGGCCGTAAAGGCGAAGAGCTG (SEQ ID NO:64); 5'-CGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTA CCGTCCTC (SEQ ID NO:65); 5'-GCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGTCGTTGGG (SEQ ID NO:66); y 5'-GAGGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCG (SEQ ID NO:67)) y se sometió a Gibson Assembly para producir la construcción final.

pET21 MBPx-SpyCatcher (Etiqueta His6 N-terminal-MBPmt-espaciador-MBPmt-espaciador-SpyCatcher) (n.° de acceso de GenBank KU361183, ID plásmido de Addgene 72327) se describió previamente (Veggiani et al., 2016 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 113, 1202-1207). pET21 MBPx-SpyCatcher002 se generó mediante un Gibson assembly de 3 partes. SpyCatcher002 se amplificó a partir de pDEST14-SpyCatcher002 usando cebadores directos (5'-CGAGCTCGGGTTCGGGCGGTAGTGGTGCCATGGTAACCACCTTATCAGGTTTATCAGGTG (SEQ ID NO:68)) e inversos (5'-GTGGTGGTGCTCGAGTG CGGCCGCAAGCTTCTATTAAGTATGAGCGTCACCTTTAGTTGC (SEQ ID NO:69)). La cadena principal molde se generó en dos partes del plásmido pET21 MBPx-SpyCatcher usando cuatro cebadores (5'-GGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCG (SEQ ID NO:70); 5'-CATGGCACCACTACCGCCCGAACCCGAGCTCG (SEQ ID NO:71), 5'-AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGC (SEQ ID NO:72); 5'-CGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACC (SEQ ID NO:73)) y se sometió a Gibson Assembly para producir el producto final.

pET28a AffiEGFR-SpyTag002 se generó mediante un Gibson Assembly de 2 partes usando cuatro cebadores (5'-GGCAGCATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAGGCAGTGGTGAGTCG GGATCCGGAGCTAGC (SEQ ID NO:74); 5'-GTTTATTATTTATAGCGTTTGTAGGCGTCCACCATAACAATAGTAGGAACACCGGAACCTTCCCCGGATCCCTCG AGGCC (SEQ ID NO:75); 5'-GGACGCCTACAAACGCTATA AATAATAAACTCTAGCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAC (SEQ ID NO:76); 5'-ACTGCCTTTGTTCACTTTA ATAAATTCAATGCTGCCCAGTTTCCCCATATGGCTGCCGCG (SEQ ID NO:77)) usando el plásmido pET28a SnoopTag-AffiEGFR-SpyTag (n.° de acceso de GenBank KU296973) como molde.

pET28a His-MBP se creó clonando el gen de la proteína de unión a maltosa del vector pMAL (NEB) en el vector pET28a como se ha descrito previamente por Zakeri et al (2012, supra).

pRK793 que codifica MBP-His6-proteasa TEV que contiene una mutación S219V para reducir la velocidad de autolisis y se modificó más para prevenir la autoescisión de la proteasa TEV de MBP por mutación del sitio de reconocimiento de TEV para inhibir la escisión.

El plásmido fagémido era una variante de pFab5c.His que codificaba una secuencia líder PeIB, un sitio de clonación y únicamente la parte del gen III que codificaba el dominio C-terminal final de la pIII del fago M13. El plásmido fagémido SpyTag (pFab5cHis-PeIB-SpyTag-gIII) se creó insertando ADN que codificaba SpyTag entre el líder PeIB y gIII. El plásmido pFab5cHis se digirió con Xhol (NEB) y Notl (NEB). Los cebadores 5'-TCGAGGGCGGCGCCCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCGACG AAGGGCGC (SEQ ID NO:78) y 5'-GGCCGCCTTCGTCGGCTTGTAGGCGTCCACCATCACGATGTGGGCGC CGCCC (SEQ ID NO:79) se alinearon y se ligaron en pFab5cHis. Para generar pFab5cHis SpyTag DA, pFab5cHis se digirió con Xhol y Notl. Los cebadores 5'-TCGAGGGCGGCGCCCACATCGTGATGGTGGCCGCCTACAAGCCGACGAAGGGCGC (SEQ ID NO:80) y 5'-GGCCGCCTTCGTCGGCTTGTAGCGGCCACCATCACGATGTGGGCGCCGCCC (SEQ ID NO:81) se alinearon y se ligaron en pFab5cHis. El pFab5cHis-DsbA-SpyCatcher-GSSGS-sitio de escisión de proteasa TEV-gIII se construyó en un procedimiento de dos etapas. En la primera etapa se clonó SpyCatcher seguido de la secuencia GSSGSENLYFQGSG en el marco con el líder PeIB y gIII por amplificación. SpyCatcher se amplificó a partir de pDEST14 SpyCatcher usando 5'-TAATCTCGAGATCAGGGCGCCATG GTTGATACCTTATC (SEQ ID NO:82) y 5'-ATATGCGGCCGCTCCACTCCCCTGGAAGTAGAGGTTTTC (SEQ ID NO:83). El inserto y el vector se digirieron usando Xhol y Notl y, a continuación, se ligaron. En la segunda etapa, la secuencia señal PeIB se reemplazó por la secuencia señal DsbA por SLIM-PCR usando 5'-GCGTTTAGCGCATCGGCGGGCAGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTG GTGCAGCTGCAGGTCG (SEQ ID NO:84), 5'-CGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACTAAACCAGCCAGCGCCAGCCAAATCTTTTTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAA ATTG (SEQ ID NO:85), 5'-GGTGCAGCTGCAGGTCG (SEQ ID NO:86), y 5'-TTTCATA GCTGTTTCCTGTGTGAAATTG (SEQ ID NO:87).

Generación de una biblioteca N-terminal aleatorizada de SpyTag

La biblioteca se recopiló de un fragmento amplificado por PCR del fagémido pFab5cHis-PeIB-SpyTag-gIII y un vector digerido por restricción por ligamiento. El inserto se amplificó por PCR usando cebadores directos (5'-ACCTCGAGATNNKNNKNNKNNKNNKATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCC (SEQ ID NO:88)) e inversos (5'-ATTCATATGGTTTACCAGCGCCAAAGACAAAAGGG (SEQ ID NO:89)) que flanqueaban el gen de SpyTag hacia adentro que añade los sitios de restricción Xhol y Ndel. Se añadió Dpnl a la mezcla de PCR de inserto tras la cliclación térmica y se incubó a 37 °C durante 1 h y se inactivó por calor a 80 °C durante 20 min. El ADN vector se digirió con Xhol y Ndel en tampón CutSmart (NEB) a 37 °C durante 1,5 h y se inactivó por calor a 65 °C durante 20 min. El inserto total y las mezclas de reacción se mezclaron con 6x colorante de carga de ADN y se separó por electroforesis en gel de agarosa. Las bandas de ADN que correspondían al vector y al inserto se purificaron por extracción del gel. El ADN inserto se digirió con Xhol y Ndel en tampón CutSmart a 37 °C durante 1 h y se inactivó por calor a 65 °C durante 20 min. El inserto digerido se limpió y se concentró usando una columna de centrifugado Thermo Scientific y se eluyó en agua MilliQ. El ligamiento se realizó a la relación molar vector optimizado:inserto de 1:7 (1:1 peso) con 627 ng de ADN de cada fragmento en un volumen total de 150 pl. El ADN y el agua se calentaron a 65 °C durante 5 min, se enfriaron, se añadieron ADN ligasa T4 (NEB) y tampón y la mezcla se incubó a 25 °C durante 1 h. El ADN se concentró en un filtro de centrifugado y se transformó en células supresoras de codon de parada ER2738 amber electrocompetentes (Lucigen) por electroporación. Los transformantes se recuperaron por adición de 950 pl de medio SOC a 37 °C durante 1 h y se sembraron en placa sobre agar LB, que contenía ampicilina a 100 pg/ml y tetraciclina a 25 pg/ml. Las placas se incubaron a 37 °C durante 16 h. Para recoger la biblioteca, se añadieron 5 ml de LB a la superficie de la placa y las células se rasparon con una espátula de plástico, se pipetearon en un tubo Falcon de 50 ml y se repitió con otros 5 ml. Después de la recolección de todas las placas, las células se sedimentaron a 2.500 x g durante 10 min a 4 °C, se resuspendieron en 10 ml de LB que contenía ampicilina (100 pg/ml), tetraciclina (25 pg/ml) y 22 % (v/v) de glicerol. Las alícuotas se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C.

Generación de una biblioteca de SpyTag C-terminal aleatorizado

La biblioteca se recopiló de dos fragmentos amplificados por PCR del fagémido pFab5cHis-PeIB-SpyTag-gIII. En la primer PCR, el cebador directo (5'-CGACCTCGAGATGTGCCTACTA TCGTGATGGTGGACNNKNNKNNKNNKNNKGCGGCCGCAGGCTCTAAAGATAT CAGACC (SEQ ID NO:90)) convierte el extremo N de la SpyTag en VPT de inicio en lugar de AH, además de la introducción de las mutaciones C-terminales, y un cebador inverso que ceba a partir del gen de resistencia a ampicilina (5'-GATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCC (SeQ ID NO:91)). En la segunda reacción de PCR, el cebador directo cebado a partir del gen de la ampicilina (5'-GGCCAACTTACTTCTGACAACGATC (SEQ ID NO:92)) y el cebador inverso (5'-GTCCACCATCACGATAGTAGGCACATCTCGAGGTCGACCTGC (SEQ ID NO:93)) eran del inicio del VPT-SpyTag inmediatamente antes de la región a mutar. Los dos productos de PCR se digirieron con Dpnl como anteriormente, se mezclaron con colorante de carga de ADN y se separaron por electroforesis en gel de agarosa. Las bandas de ADN se purificaron por extracción en gel y se juntaron por Gibson Assembly. El ADN se limpió, se concentró y se transformó en células ER2738 electrocompetentes.

Generación de bibliotecas de variantes de SpyCatcher por PCR propensa a error

Las bibliotecas se recopilaron de dos fragmentos amplificados por PCR del fagémido pFab5cHis-DsbA-variante de SpyCatcher-GSSGS-sitio de escisión de proteasa TEV-gIII por Gibson assembly. El vector se amplificó usando polimerasa KOD con cebadores de oligonucleótidos que flanqueaban el gen de SpyCatcher que se dirige hacia fuera (cebador directo: 5'-GGATCCAGTGGTAGCGAAAACC (SEQ ID NO:94); cebador inverso: 5'-AACCATGGCGCCCTGATCTCG (SEQ ID NO:95)). El inserto se amplificó con polimerasa Taq en condiciones propensas a error (MnCh 0,4 mM; dNTPs desequilibrado, dGTP 0,24 mM, concentraciones finales de dATP/dCTP/dTTP 0,2 mM) con cebadores de oligonucleótidos que flanqueaban SpyCatcher y se dirigían hacia dentro (cebador directo: 5'-CCTCGAGATCAGGGCGCCATGG (SEQ ID NO:96); cebador inverso: 5'-GAAGTAGAGGTTTTCGCTACCACTGGATC (SEQ ID NO:97)) durante 18-23 ciclos, con el número de ciclos variado para alterar la carga mutacional en la SpyCatcher. Se añadió Dpnl tras la ciclación térmica y se incubó a 37 °C durante 1 h y se inactivó por calor a 80 °C durante 20 min. Las mezclas de reacción totales se mezclaron con 6x colorante de carga de ADN y se separaron por electroforesis en gel de agarosa. Las bandas de ADN para el vector y el inserto se purificaron por extracción en gel (Thermo Scientific) y se enlazaron mediante Gibson Assembly (NEB). El ADN se limpió, se concentró y se transformó en células supresoras de codon de parada XL1 Blue amber electrocompetentes (Agilent Technologies).

Producción de fago

Las bibliotecas de SpyCatcher en células XL1 Blue y SpyTag en células ER2738 se convirtieron en bibliotecas de proteínas expresadas en fago por infección. Para la primera ronda de selección, se requiso el desarrollo de un fago mayor usando 250 ml de 2xTY con ampicilina (100 pg/ml), tetraciclina (25 pg/ml) con 0,2 % (v/v) de glicerol también incluido para la producción del fago de SpyCatcher. Estos medios se inocularon con 100 pl de la reserva de cultivo de biblioteca a -80 °C para las células producidas de las bibliotecas iniciales producidas como se ha descrito anteriormente. Para las posteriores rondas de selección, se usó 600 pl de reserva de cultivo de biblioteca a -80 °C (producido como se describe más adelante) para inocular 100 ml del medio de crecimiento. Para la purificación de variantes de fago monoclonales, se usaron cultivos de partida de toda la noche (crecimiento en el medio de cultivo) para inocular (a una dilución 1:100) 15 ml de medio de crecimiento. En todos los casos, los cultivos se cultivaron a 37 °C a 200 rpm hasta que se alcanzó una DO600 de 0,5 (aproximadamente 3-4 h) y se infectaron con 1012 de fago auxiliar R408 y se incubaron con mezcla lenta (80 rpm) a 37 °C durante 30 min. La expresión de las proteínas SpyCatcher/SpyTag-plll se indujo con IPTG (0,42 mM para la producción de fago de SpyTag y 0,1 mM para la producción de fago de SpyCatcher) y se incubó durante 18-20 h a 200 rpm a 25 °C (fago de SpyTag) o 18 °C (fago de SpyCatcher).

Purificación de fago por precipitación

Se centrifugaron cultivos bacterianos infectados a 15.000 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar las células bacterianas. Se añadió un volumen de tampón de precipitación [estéril, PEG8000 al 20 % (p/v), NaCI 2,5 M] a 4 volúmenes de sobrenadante. Los sobrenadantes se mezclaron y se incubaron a 4 °C durante 3-4 h. El fago se precipitó por centrifugación a 15.000 x g durante 30 min a 4 °C y se eliminó el sobrenadante. Los sedimentos de fago se resuspendieron en PBS pH 7,5 (2 ml por 100 ml de cultivo) y se centrifugaron a 15.000 x g durante 10 min a 4 °C para aclarar cualquier célula residual, antes de que el sobrenadante se transfiriera a un tubo nuevo. Las mezclas se precipitaron de nuevo como previamente, pero esta vez se resuspendieron en 0,25 ml de PBS por 100 ml de cultivo. Las muestras se centrifugaron a 15.000 x g durante 10 min a 4 °C para aclarar cualquier célula y fago residuales se precipitaron una tercera vez y se resuspendieron en un volumen final de 0,25 ml de PBS por 100 ml de cultivo. Las muestras se almacenaron a corto plazo (1-2 semanas) a 4 °C o a largo plazo a -80 °C. Normalmente, un cultivo de 100 ml dio 250 pl de aproximadamente 1012 fago/ml.

Cuantificación de fago

Los fagos purificados se cuantificaron por qPCR de fago lisado (por ebullición a 95 °C durante 7 min en PBS) usando cebadores específicos al gen de gIII (5'-GTCTGACCTGCCTCAACCTC (SEQ ID NO:98) y 5'-TCACCGGAACCAGAGCCAC (SEQ ID NO:99)). Se añadieron 5 pl de lisado de fago a 10 pl de mezcla maestra de qPCR (Bioline) en tubos de qPCR (Qiagen) para dar las concentraciones finales de 1 x tampón SensiMix (Bioline) y 0,25 pM de cada cebador. Se ensayaron patrones de concentración de fago conocida a 104 a 109 fago/ml para crear una curva patrón y se incluyó una muestra de la mezcla maestra agua tampón como control negativo. Las muestras se corrieron por duplicado usando: 45 ciclos con desnaturalización inicial 95 °C, 10 min (únicamente el primer ciclo); desnaturalización 95 °C, 10 s; alineación 60 °C, 10 s; extensión 72 °C, 15 min. Ganancia; verde 10 amarillo 5, HRM 7 en una máquina de qPCR Rotor-Gen (Qiagen). Los datos se analizaron usando el programa informático del fabricante usando un umbral superior de 0,2 y la pendiente que corrige justo por encima del ruido de fondo de las curvas para dar valores de recuento (Ct). Los patrones se usaron para producir una gráfica de número de fago frente a Ct.

Selección de variantes de biblioteca

Se usaron AP-SpyCatcher (WT/EQ) y AP-SpyTag(WT/DA)-MBP biotinilado como cebo para reaccionar con las bibliotecas de fago de SpyTag y SpyCatcher, respectivamente. Las variantes del cebo no reactivo (SpyCatcher EQ y SpyTag-DA-MBP) se incluyeron en secciones paralelas para valorar la eficacia del lavado posterior. Las reacciones se llevaron a cabo en PBS pH 7,5 con BSA al 3 % (p/v) y suplementado con His6-MBP 25 pM (para las selecciones de fago de SpyCatcher para contraseleccionar las variantes del fago de SpyCatcher que se unen a MBP en lugar de SpyTag) a 25 °C. En la primera ronda de selección, se incluyeron 1 x 1012 fagos a una concentración de cebo (bio-AP-SpyCatcher 0,5 pM para la selección del fago de SpyTag; y bio-AP-SpyTag-MBP 0,5 pM para la selección del fago de SpyCatcher) en la reacción y se hicieron reaccionar durante 5 h (fago de SpyTag) o 18 h (fago de SpyCatcher). Las dos rondas posteriores (bio-AP-SpyCatcher 0,2 pM y 30 min de reacción en la ronda 2 y bio-AP-SpyCatcher 0,2 pM y 10 min de reacción en la ronda 3) de la selección se llevaron a cabo para el fago de SpyTag con la reacción en la ronda 3 llevada a cabo con la modificación de la adición de DTT 10 mM. Para el fago de SpyCatcher se llevaron a cabo tres rondas posteriores de selección (bio-AP-SpyTag 0,2 pM y 30 min de reacción en la ronda 2, bio-AP-SpyTag 0,2 pM y 10 min de reacción en la ronda 3; bio-AP-SpyTag 0,05 pM y 10 min de reacción en la ronda 4). En cada caso, el tiempo de reacción se controló mediante la adición de proteína cebo en exceso (50 100 pM) sin una etiqueta AP y por consiguiente no biotinilada (SpyCatcher para la selección del fago de SpyTag, y SpyTag-MBP para el fago de SpyCatcher). Los fagos se purificaron a partir de cebo biotinilado no reaccionado usando precipitación con PEG/NaCl, con el sobrenadante descartado. El sedimento que contenía el aducto de fagocebo biotinilado se resuspendió en 200-800 pl de PBS pH 7,5 Tween20 al 0,1 % (v/v), según como fuera apropiado para la ronda de selección (se esperó que las rondas tempranas con tiempos de reacción más largos y mayores concentraciones de cebo biotinilado requiriesen un número mayor de perlas para asegurar que se unieran todas las variantes). Se añadieron 25 pl de Dynabeads ligante de biotina (ThermoFisher Scientific) por pocillo a una placa Nuc de unión baja de 96 pocillos que se había bloqueado previamente durante 2 h a 25 °C con BSA al 3 % (p/v) en PBS pH 7,5 Tween-20 al 0,1 % (v/v). Las perlas se capturaron usando una rejilla de separación magnética de placa de microtitulación de 96 pocillos (NEB) y se lavó 4 veces con 200 pl/pocillo de PBS pH 7,5 Tween-20 al 0,1 % (v/v). Para cada pocillo en la placa de microtitulación, las perlas se resuspendieron en 200 pl del PBS pH 7,5 Tween-20 al 0,1 % (v/v) que contenía el aducto de cebo biotinilado de fago y se incubaron con agitación a 800 rpm durante 1 h a 25 °C. Para retirar el fago débilmente unido, las perlas se lavaron una vez con 150 pl de glicina-HCI pH 2,2, a continuación, cuatro veces con 150 pl de TBS con Tween-20 al 0,5% (v/v). Los fagos se eluyeron de perlas mediante digestión con proteasa TEV a 34 °C, durante 2 h con agitación a 1.000 rpm en Tris 50 mM pH 8,0 con EDTA 0,5 mM usando 50 pl 0,72 mg/ml de MBP-proteasa TEV. Los fagos eluidos se recataron por infección de 1 ml de cultivos en la fase media del crecimiento logarítmico (DO600 = 0,5) de ER2738 (para el fago de SpyTag) o XL-1 Blue (para el fago de SpyCatcher) cultivadas en LB suplementado con 25 pg/ml de tetraciclina a 37 °C a 80 rpm durante 30 min. A continuación, las células se diluyeron en 100 ml de 2xTY (suplementado con glucosa al 1 % (v/v), 100 pg/ml de ampicilina y 25 pg/ml de tetraciclina) y se cultivaron durante 12-16 h con agitación a 200 rpm hasta que las células estuvieron en la fase estacionaria. Después de la adición de glicerol a una concentración final del 20 % (v/v), las alícuotas celulares se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C. El número de fago eluido se cuantificó mediante diluciones seriadas en placa.

Validación cinética "en fago" in vitro de variantes mejoradas

Antes de la clonación de variantes de fago monoclonales secuenciadas en vectores de expresión bacterianos, las variantes se preseleccionaron por ser capaces de reaccionar mejor que el fago tipo silvestre equivalente. Después de la expresión y purificación del fago (anteriormente descrito), se valoró su reactividad con sus cebos usando una versión adaptada del protocolo de selección ("panning") después de la normalización de la concentración del fago para el lote producido (con la variante tipo silvestre incluida cada vez) normalmente a un valor de 2 x 1012 fago/ml. Las condiciones de reacción usadas eran PBS pH 7,5 BSA al 2,5 % (p/v) a 25 °C con biotina-AP-cebo 200-500 pM (AP-SpyTag-MBP o AP-SpyCatcher). Para iniciar la reacción, se añadieron 2 pl de fago a 6 pl del tampón de reacción en tubos de PCR. Después del tiempo de reacción requerido (normalmente 15 min), las reacciones se detuvieron con cebo no biotinilado (concentración final de 100 pM) durante 20 min a 25 °C. Posteriormente, se añadieron 7 pl de tampón de precipitación de fago y se incubó durante 1 h a 4 °C. Los tubos de PCR se centrifugaron a 15.000 x g durante 30 min, el sobrenadante se descartó y el sedimento de fago se resuspendió en 200 pl de PBS Tween20 al 0,1 % (v/v). A continuación, se añadieron los fagos a Dynabeads de unión a Biotina como se ha descrito previamente para la selección de fago con las perlas. Después del lavado de las perlas una vez con 150 pl/pocillo Glicina-HCI pH 2,2, a continuación, cuatro veces con 150 pl/pocillo de TBS-Tween20 (0,5 % v/v), finalmente las perlas se respuspendieron en 150 pl de PBS y se retiraron 50 pl en un tubo de PCR fresco, y el fago se sometió a lisis mediante ebullición a 95 °C durante 7 min. Las perlas se capturaron con un imán MagRack 6 (GE) y en el sobrenadante se cuantificó el número de fago por qPCR, como anteriormente.

Expresión y purificación de variantes de SpyCatcher y SpyTag

Las variantes de SpyCatcher (incluida SpyCatcher002-EQ) se expresaron en E. coli C41 DE3 (un regalo de Anthony Watts (Universidad de Oxford)) y las variantes de SpyTag-MBP (incluida SpyTag002-DA-MBP) se expresaron en E. coli BL21 DE3 RIPL (Stratagene). Las colonias sencillas se recogieron en 10 ml de LB que contenía ampicilina (pDEST14) o kanamicina (pET28a) y se cultivaron durante una noche. Se inoculó 1 l de LB suplementado con glucosa al 0,8 % (p/v) y antibiótico apropiado en matraces con deflectores de alto rendimiento con dilución 1/100 del cultivo de una noche saturado y se cultivaron a 37 °C con agitación a 200 rpm. Después de alcanzar la DO6000,5 0,6, los cultivos se inocularon con IPTG 0,42 mM y se incubaron a 30 °C con agitación a 200 rpm durante 4-5 h. Las células se recogieron y se sometieron a lisis en TBS que contenía inhibidores de proteasa mezclados (cóctel de inhibidor de proteasa sin EDTA mini completo; Roche) y PMSF 1 mM por sonicación y se purificaron por Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas se sometieron a diálisis en PBS con tres cambios de tampón. La expresión y la purificación de AP-SpyCatcher (WT/EQ), AP-SpyTag (WT/DA)-MBP, SpyCatcher-sfGFP, SpyCatcher002-sfGFP, MBPx-SpyCatcher, His6-MBP, MBP-x- SpyCatcher002 también se llevaron a cabo usando el mismo procedimiento. NH2-MBP-His6-proteasa TEV se expresó y purificó de la misma manera, con el procedimiento modificado de modo que la proteína se sometió a diálisis tres veces en Tris HCI 50 mM pH 8,0 EDTA 0,5 mM.

Experimentos de reconstitución del enlace isopéptido

Se hizo un seguimiento de la formación del enlace isopeptídico como previamente se ha descrito (Zakeri et al., 2012, supra). Los tampones usados eran: HEPES [4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina 50 mM pH 7,5], HBS (HEPES 50 mM NaCl 150 mM pH 7,5), TBS [tris-hidroximetil aminometano 50 mM NaCl 150 mM pH 7,5), PBS, PBS EDTA 1 mM (ácido tetraacético de etilenodiamina) pH 7,5. Los puntos temporales se detuvieron por adición de 6x colorante de carga de SDS-PAGE (Tris HCI 0,23 M pH 6,8, glicerol al 24% (v/v), azul de bromofenol 120 pM, SDS 0,23 M), seguido de calentamiento a 95 °C en un ciclador térmico Bio-Rad C1000 durante 6 min. Las reacciones se analizaron usando SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 16 % con tinción usando InstantBlue (Expedeon) Coomassie y las intensidades de banda se cuantificaron usando un generador de imágenes Gel Doc XR y el programa informático Image Lab 5.0 (Bio-Rad). La reconstitución de isopéptido en porcentaje se calculó dividiendo la intensidad de la banda para el complejo covalente por la intensidad de todas las bandas en el carril y multiplicando por 100. La constante de velocidad de segundo orden para la formación del complejo covalente SpyCatcher:SpyTag-MBP se determinó haciendo un seguimiento de la reducción en la intensidad de la banda para la SpyCatcher en relación con un control no incubado con SpyTag-MBP, para dar la concentración de SpyCatcher no reaccionado. Se analizaron los puntos temporales durante la parte lineal de la curva de progreso de reacción. 1/[SpyCatcher] se trazó en la gráfica frente al tiempo y se analizó mediante regresión lineal usando Excel.

Cuando los ensayos se llevaron a cabo a 0,1 pM (Figura 9B), se usaron SpyCatcher-sfGFP y SpyCatcher002-sfGFP. La reacción se detuvo a la temperatura inferior de 50 °C después de la adición de tampón de carga de SDS para conservar la fluorescencia de sfGFP. Las reacciones se realizaron en SDS-PAGE al 16 % y las bandas de producto covalente SpyCatcher-sfGFP y SpyTag-MBP:SpyCatcher-sfGFP no reaccionado se cuantificaron usando el Analizador de Imagen Fluorescente FLA-3000 (FujiFilm) y el programa informático ImageGauge versión 4.21.

La dependencia de temperatura de la reacción se midió en PBS pH 7,5 (puesto que su pH tiene únicamente una pequeña variación con la temperatura) con 0,5 pM para cada proteína. Para la dependencia de pH, cada proteína se mezcló a 0,5 pM y 25 °C en tampón succinato-fosfato-glicina (ácido succínico 12,5 mM, NaH2PO443,75 mM, glicina 43,75 mM; el pH se ajustó usando HCl o NaOH), posibilitando el tamponamiento adecuado a lo largo de un amplio intervalo de pH.

La dependencia de tampón se midió en PBS (±EDTA), HBS, HEPES, o TBS a pH 7,5 con 0,5 pM para cada proteína a 25 °C. La dependencia de detergente se midió con 0,5 pM para cada proteína a 25 °C en PBS pH 7,5 suplementado con Tween 20 al 1 % (v/v) o Tritón X-100 al 1 % (v/v).

Los ensayos para probar si SpyCatcher002 y SpyTag002 reaccionan hasta su finalización se llevaron a cabo en tampón succinato-fosfato-glicina a pH 7,0 durante 1 h a 25 °C. Para ensayar si SpyCatcher002 reacciona hasta su finalización, se hizo reaccionar SpyCatcher002 10 pM con SpyTag002-MBP 20 pM. Para ensayar si SpyTag002-MBP reacciona hasta su finalización, se hizo reaccionar SpyTag002-MBP 10 pM con SpyCatcher00220 pM.

Los ensayos para probar la reacción de SpyCatcher002 con SpyTag002-MBP en concentraciones crecientes de urea se llevaron a cabo en PBS que incluía la concentración requerida de urea (de 0-8 M), que posteriormente se ajustó a pH 7,5 usando HCl. Todas las reacciones se llevaron a cabo usando soluciones de tampón que contenían urea recién preparada a 2 pM de cada proteína por triplicado a 25 °C. El alcance de la reacción se analizó después de 30 min y 120 min.

Los mutantes SpyCatcher002-EQ y SpyTag002-DA-MBP se construyeron por mutagénesis dirigida a sitio QuikChange. Los ensayos se llevaron a cabo con cada proteína a 10 pM en tampón succinato-fosfato-glicina a pH 7,0 durante 1 h a 25 °C.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, en la que:

(i) X en la posición 1 es arginina o no aminoácido;

(ii) X en la posición 2 es glicina o no aminoácido;

(iii) X en la posición 5 es histidina o treonina, preferentemente histidina;

y

(v) X en la posición 14 es arginina o lisina, preferentemente arginina,

y en la que dicho péptido es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicho enlace isopeptídico se forma entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 1 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2.

2. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende uno o más de los siguientes:

1) histidina en la posición 5;

2) alanina en la posición 11; y

3) arginina en la posición 14,

y/o en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 3-5, preferentemente SEQ ID NO: 5.

3. Un polipéptido que comprende:

i) una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2; o

iii) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende una lisina en la posición 34, un ácido glutámico en la posición 80 y uno o más de los siguientes:

1) treonina en la posición 5;

2) prolina en la posición 16;

3) arginina en la posición 40;

4) histidina en la posición 65;

5) prolina en la posición 92;

6) ácido aspártico en la posición 100:

7) ácido glutámico en la posición 108; y

8) treonina en la posición 116,

en la que los residuos de aminoácido especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en SEQ ID NO: 2; o

iv) una parte de (iii) que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 101, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una lisina en la posición 10, un ácido glutámico en la posición 56 y uno o más de los siguientes:

1) arginina en la posición 16;

2) histidina en la posición 41;

3) prolina en la posición 68; y

4) ácido aspártico en la posición 76,

en la que los residuos de aminoácido especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en SEQ ID NO: 101,

y en la que dicho polipéptido es capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico con un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 5, en la que dicho enlace isopeptídico se forma entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 5 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2 o la posición 10 de SEQ ID NO: 101.

4. El polipéptido de la reivindicación 3, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia a la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende una lisina en la posición 34, un ácido glutámico en la posición 80 y;

i) todo lo siguiente:

1) treonina en la posición 5;

2) prolina en la posición 16;

3) arginina en la posición 40;

4) histidina en la posición 65;

5) ácido glutámico en la posición 108; y

6) treonina en la posición 116; o

ii) todo lo siguiente:

1) treonina en la posición 5;

2) prolina en la posición 16;

3) arginina en la posición 40;

4) histidina en la posición 65;

5) prolina en la posición 92;

6) ácido glutámico en la posición 108; y

7) treonina en la posición 116; o

iii) todo lo siguiente:

1) treonina en la posición 5;

2) prolina en la posición 16;

3) arginina en la posición 40;

4) histidina en la posición 65;

5) prolina en la posición 92;

6) ácido aspártico en la posición 100:

7) ácido glutámico en la posición 108; y

8) treonina en la posición 116,

5. El polipéptido de la reivindicación 3 o 4, en el que el polipéptido comprende además uno o más de los siguientes:

1) glicina en la posición 12; y

2) treonina en la posición 22,

6. El péptido de la reivindicación 1 o 2 o el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho péptido y/o dicho polipéptido están:

(i) conjugados con una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo de metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula tipo virus o cualquier combinación de los mismos; o

(ii) inmovilización sobre un sustrato sólido.

7. Un conector de dos partes que comprende el péptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6 y el polipéptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dichos péptido y polipéptido son capaces de formar espontáneamente un enlace isopeptídico entre el residuo de ácido aspártico en la posición 10 de SEQ ID NO: 1 y el residuo de lisina en la posición 34 de SEQ ID NO: 2 o la posición 10 de SEQ ID NO: 101.

8. Un polipéptido recombinante o sintético que comprende: (i) un polipéptido; y (ii) el péptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6 y/o el polipéptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

9. Una molécula de ácido nucleico que comprende secuencia de nucleótidos que codifica el péptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6, el polipéptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 o el polipéptido recombinante o sintético de la reivindicación 8.

10. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9.

11. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 o el vector de la reivindicación 10.

12. Un procedimiento para producir o expresar el péptido y/o el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende las etapas de:

a) transformar o someter a transfección una célula hospedadora con un vector que comprende la secuencia de nucleótidos como se ha definido en la reivindicación 9, que codifica dicho péptido y/o dicho polipéptido;

b) cultivar la célula hospedadora en condiciones que permitan la expresión del péptido y/o polipéptido; y opcionalmente

c) aislar el péptido y/o polipéptido.

13. El uso del péptido conector de dos partes como se ha definido en la reivindicación 7 para conjugar dos moléculas o componentes por un enlace isopeptídico,

a) una primera molécula o componente que comprende el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6; y

b) una segunda molécula o componente que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

14. Un procedimiento para conjugar dos moléculas o componentes por un enlace isopeptídico que comprende: a) proporcionar una primera molécula o componente que comprende el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6;

b) proporcionar una segunda molécula o componente que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6;

c) poner en contacto dichas primera y segunda moléculas o componentes en condiciones que posibilitan la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre el péptido y el polipéptido, conjugando de este modo dicha primera molécula o componente con dicha segunda molécula o componente por un enlace isopeptídico para formar un complejo.

15. Un kit, preferentemente para utilizarse en el uso de la reivindicación 13 o el procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicho kit comprende:

(a) el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6, opcionalmente conjugado o fusionado con una molécula o componente; y

(b) el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, opcionalmente conjugado o fusionado con una molécula o componente; y/o

(c) una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector, que codifica el péptido como se ha definido en (a); y

(d) una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector, que codifica el polipéptido como se ha definido en (b).