CN104892733B - 具有预定支架的多肽文库 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有预定支架的多肽文库。提供了对预定靶具有亲和性的多肽及其用于制备检测、捕获、分离或诊断试剂盒和药物的应用，所述多肽包含第一支架氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，其中每个X相应于基于原始支架氨基酸序列的第二多肽中可随机化的氨基酸残基且其中所述第二多肽对所述预定靶具有亲和性。还提供了基于支架产生第一多肽的方法，包括提供对预定靶具有亲和性的第二多肽，其中所述第二多肽基于具有结构类似于一个SpA结构域的序列的原始支架，其中三螺旋束蛋白质的疏水性核心中的氨基酸是保守的，以及突变原始支架氨基酸，产生包含如下支架氨基酸序列的第一多肽SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，其中每个X分别相应于第二多肽中保守的氨基酸残基。

Description

具有预定支架的多肽文库
本申请是申请日为2008年12月22日，申请号为200880126773.7，发明名称为“具有预定支架的多肽文库”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及新的基于共有支架的多肽变体群。这些多肽群可以用于提供新的结合蛋白和多肽。
背景
本领域已经描述了构建新的结合蛋白的不同方法(Nygren PA and Uhlén M(1997)Curr Opin Struct Biol 7:463-469)。一种方法是产生组合文库以及针对希望的性质进行筛选或者选择。
原始
Figure GDA0002276722010000011
分子、这种分子的群体以及这种分子的支架已经在WO 95/19374中描述，该专利的教导在此援引加入本文作参考。
对于一些应用，希望具有改良性质如碱稳定性、低抗原性、结构稳定性、化学合成顺应能力以及亲水性的蛋白质、多肽或者
Figure GDA0002276722010000012
分子，这种分子的群体以及支架。
碱稳定性
蛋白质药物和生物工程试剂的生产需要一些纯化步骤，以富集特定产物，同时除去不希望的污染物。通过蛋白质样亲和性基质如单克隆抗体和金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)介导的亲和性纯化使得可以在一个步骤中有效纯化。然而，为了成本效益，希望能适当地再生所述亲和性基质。这通常包括称作就地清洁(cleaning-in-place，CIP)的方法，其中使用试剂(通常是碱溶液)洗脱污染物。
碱稳定性也是用最常用的SPECT核素锝-99m标记分子成像追踪剂所需的,以及使得可以进行一些其它类型的化学修饰。
低抗原性
基于蛋白质的药物，如治疗性单克隆抗体和
Figure GDA0002276722010000024
分子，可能在人体内激发不希望的免疫应答。导致免疫原性的主要因素是存在杂质、蛋白质聚集体、外源表位如新独特位、不同的Ig同种异型或者非自身序列。此外，交叉反应的免疫球蛋白(Ig)相互作用很可能增加产生针对所述蛋白质药物的特异性T细胞介导的记忆免疫应答的概率。为了使不希望的与免疫系统的相互作用的危险最小化，需要通过药物学蛋白质工程消除现有的免疫表位。
Figure GDA0002276722010000021
分子衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)，其是革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)表面上的细胞壁结合受体。更精确地，SpA由5个高度同源结构域组成，其结合许多哺乳动物物种包括人的免疫球蛋白。每个SpA结构域以两种不同方式与人Ig相互作用：直接结合Fcγ，包括IgG1、IgG2和IgG4(Langone JJ(1982)AdvImmunol 32:157-252)；或者结合VH3家族成员(Silverman GJ et al(1992)Int RevImmunol 9:57-78)。原始
Figure GDA0002276722010000022
分子的共有支架与SpA的结构域B基本相同，不同之处是G29A突变以及A1V突变，包含G29A突变是为了增加蛋白质稳定性和消除羟胺裂解位点，A1V突变导入在结构域之间的间隔区中(Nilsson B et al(1987),Prot Eng 1:107-113)。SpA中参与与Fcγ和VH3相互作用的氨基酸残基为本领域熟知，且已经在文献中描述(Graille M et al(2000)Proc Natl Acad Sci U S A.97:5399-5404)。通过在分子的一个表面上随机化已知参与与Fcγ相互作用的表面残基构建了不同
Figure GDA0002276722010000023
分子的分子文库，从而消除Fcγ亲和性。
结构稳定性
决定肽和蛋白质药物成功的一个关键因素是蛋白质的稳定性。显示高结构稳定性的蛋白质很可能在生产期间以及在人体内在功能上可经得住化学修饰和蛋白酶解。此外，稳定性将影响所述肽或者蛋白质药物的活性保存期以及所述肽或者蛋白质药物在人体内的活性期。
化学合成顺应能力
研究人员通过传统的生物方法获得蛋白质，但是肽和小蛋白质的化学合成方法是一种有效的互补方法，一般用于结构生物学、蛋白质工程和生物化学研究中。蛋白质的化学合成提供了一种产生无生物污染物如DNA杂质和宿主细胞蛋白质的同源蛋白质的快速且有效的方式。此外，由于化学合成可以掺入非天然氨基酸、化学修饰及导入生物化学和生物物理探针，由此可以增加灵活性。肽和蛋白质的化学合成的成功依赖于所述分子的氨基酸序列。某些氨基酸残基示出低偶联效力，意味着需要优化合成期间的一些步骤，这是耗时方法且无法保证成功。另外，在化学合成期间难以有效导入的氨基酸对于蛋白质产生更长的蛋白质序列具有显著的负面影响。
增加的亲水性
对于大多数应用，希望肽和蛋白质是高度可溶的，并显示低聚集倾向。这种蛋白质特性在生产蛋白质药物时尤为重要。蛋白质表面疏水性和低溶解性与增加的聚集倾向之间存在明显正相关。
发明描述
本发明的一个目的是提供基于新支架的多肽变体群。
这些新的支架与已知的相似支架即所谓的原始支架相比具有一些优势。所述优势也适用于使用这些新支架获得的多肽。这些优势将在下文详细论述，但是在此给出一些实例。例如，已经进行了广泛研究以开发在碱性环境中示出高稳定性的新多肽支架。碱稳定性的一方面是针对天冬酰胺脱酰胺的稳定性。通过增加结构刚性或者通过置换这个残基避免该反应也提供了化学稳定性，有助于例如在发酵过程或者贮存后获得均质产物，在发酵和贮存期间天冬酰胺的脱酰胺明显导致难以分离的异质混合物。
此外，通过在新支架序列中消除主要是VH3介导的剩余的免疫球蛋白亲和性而获得改良的低抗原性(很少的IgG结合)。
此外，新支架已经以此方式被工程化，示出了高结构稳定性，即简单折叠的 螺旋结构、高解链温度以及消除已知靶向蛋白酶解的位点。
原始
Figure GDA0002276722010000031
分子支架含有已经示出降低化学合成速度和成效的一些氨基酸。为了达到有效的、即高产量和高收益
Figure GDA0002276722010000032
蛋白质生产，将一些氨基酸用具有更具有化学合成相容性的残基置换。
为了改良亲水性和溶解性，将
Figure GDA0002276722010000041
分子支架表面上疏水性残基置换为更亲水的氨基酸。
本发明的另一目的是提供多核苷酸群。
本发明的再一目的是提供多肽群与多核苷酸群的组合。
本发明的另一目的是提供从多肽群中选择对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法。
本发明再一目的是提供分离编码对预定靶具有亲和性的所需多肽的多核苷酸的方法。
本发明另一目的是提供鉴别对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法。
本发明再一目的是提供选择和鉴别对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法。
本发明一相关目的是提供生产对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法。
本发明的群和方法使得可以通过提供特征在于特异性结合所述预定靶的多肽而提供(包括生产和评估)对预定靶具有亲和性的制剂。
本发明也可以提供呈现出很少或者无非特异性结合的结合预定靶的多肽。
本发明也可以提供结合预定靶的多肽，其可用作融合多肽中组成部分。
此外，本发明可提供结合预定靶的多肽，其解决了现有抗体试剂存在的一或多个已知问题。
此外，本发明可提供结合预定靶的多肽，其适用于治疗和/或诊断性应用中。
本发明也可提供结合预定靶的多肽，其可简便地通过肽化学合成方法制成。
此外，本发明可以鉴别结合预定靶的多肽，其与结合相同靶的已知试剂相比呈现出改良的稳定性。
本发明也可提供结合预定靶的多肽，当其在哺乳动物体内使用时呈现出低抗原性，和/或在给予哺乳动物时呈现出改良的生物分布状态。
这些及其它目的符合所附权利要求书要求的本发明的不同方面。
第一方面，本发明提供了基于共有支架的多肽变体群，该群中每个多肽均包含如下支架氨基酸序列：
EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ(SEQ.ID.No.1)
或者在一些情况中，更优选如下序列：
AKYAKEXXXAXX EIXXLPNLTX XQXXAFIXKL XDDPSQSSEL LSEAKKLNDS Q(SEQ.ID.No.2)
在上述序列中，每个X分别相应于在该群中变化的氨基酸残基。
该群由大量这种多肽分子的变体组成。在这种情况中，大量是指包含至少1×104个独特的多肽分子，或者至少1×106个或者至少1×108个或者至少1×1010个，或者至少1×1012个或者至少1×1014个独特的多肽分子的群。然而，需要使用足够大的组(group)以提供希望大小的群。本文所述“群”也可以表示“文库”。
上文规定每个X分别相应于变化的氨基酸残基。这意味着每个X可以是独立于所述序列中X表示的任何其它残基的任何氨基酸残基。在支架氨基酸序列中，不同的变化的氨基酸X可以选自所有20个天然发生的氨基酸残基，由此任何这20个天然发生的氨基酸残基在任何指定变体中可以存在于相应X位置。每个位置氨基酸残基的选择是或多或少随机化的。也可以将从中选择不同的变化的氨基酸残基的集团限制为20个天然发生的氨基酸残基中的19、18、17、16个或者更少氨基酸残基。不同位置的可变性可以在1个(意味着无随机化)至所有20个氨基酸之间个别调节。随机导入较小的氨基酸子集可以通过仔细选择导入的脱氧核糖核苷酸而获得，例如可以导入密码子T(A/C)C以获得在多肽链中指定位置随机导入丝氨酸或者酪氨酸。同样，可以导入密码子(T/C/A/G)CC，以获得在多肽链中指定位置随机导入苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸。技术人员意识到脱氧核糖核苷酸碱基组合的许多选择可用于在多肽链中指定位置获得不同氨基酸组合。可以在多肽链中指定位置出现的氨基酸集合(set)也可以通过在寡核苷酸合成期间导入三核苷酸而不是每次导入一个脱氧核糖核苷酸而确定。
包含上述支架氨基酸序列的多肽是新的
Figure GDA0002276722010000051
分子。由此，其衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA)。在这种情况中，“衍生”不是指所述多肽自身以任何方式必须直接源自SpA。该术语是指所述支架具有结构类似于一个SpA结构域的序列，其中三螺旋束蛋白质的疏水性核心中的氨基酸是保守的。
在不偏离本发明的范围内，可以对组成本发明多肽群的多肽进行不同的修饰和/或添加，以使得所述多肽适合特定应用。这种修饰和添加在下文详细描述，可包括在同一多肽链中添加氨基酸，或者使标记和/或治疗剂与组成该群的多肽化学缀合或者以不同方式结合。在一些实施方案中，可优选在C末端添加氨基酸残基。这些添加的氨基酸残基在多肽的结合中可发挥作用，但是也可以有其它目的，例如在多肽的生产、纯化、稳定化、结合或者检测中。这种添加的氨基酸残基可包含为了化学结合目的而加入的氨基酸残基。例如在多肽链的第一个或者最后一个位置即N或C末端加入半胱氨酸残基。用于化学偶联的半胱氨酸残基也可以通过置换蛋白质结构域表面上的、优选在该表面不参与靶结合的那部分上的另一氨基酸而导入。这种添加的氨基酸残基也可以包含“标记”以进行多肽纯化或者检测，如六组氨酸(His6)标记，或者“myc”标记或者“FLAG”标记以与特异于该标记的抗体相互作用。技术人员知道其它选择。
上文论述的“添加的氨基酸残基”也可以组成具有任何希望功能的一或多个多肽结构域，所述功能如另一结合功能、或者酶功能、或者金属离子螯合功能、或者荧光功能，或者这些功能的混合。
第二方面，本发明提供了多核苷酸群。这个群体中的每个多核苷酸均编码上述多肽群的成员。
第三方面，本发明提供了本发明的多肽群与本发明的多核苷酸群的组合，其中所述多肽群的每个成员与编码该成员的多核苷酸通过用于基因型-表型偶联的手段以物理方式结合或者在空间上结合。这种以物理方式的结合或者在空间上的结合根据所用系统是或多或少严格的。
用于基因型-表型偶联的手段可包含噬菌体展示系统。噬菌体展示系统为本领域技术人员熟知，例如在Smith GP(1985)Science 228:1315-1317和Barbas CF et al(1991)Proc Natl Acad Sci U S A 88:7978-7982中描述。
此外，用于基因型-表型偶联的手段可包括细胞表面展示系统。细胞表面展示系统可包含原核细胞，如革兰氏染色阳性(Gram+)细胞；或者真核细胞，如酵母细胞。细胞表面展示系统为本领域技术人员熟知。原核细胞系统例如在Francisco JA et al(1993)ProcNatl Acad Sci U S A 90:10444-10448和Lee SY et al(2003)Trends Biotechnol 21:45-52中描述。真核细胞系统在例如Boder ET et al(1997)Nat Biotechnol 15:553-557和Gai SA et al(2007)Curr Opin Struct Biol 17:467-473中描述。
此外，用于基因型-表型偶联的手段可包含无细胞展示系统。所述无细胞展示系统可包含核糖体展示系统，或者体外区室化展示系统，或者顺式(cis)展示系统，或者微珠展示系统。核糖体展示系统为本领域技术人员熟知，在例如Mattheakis LC et al(1994)ProcNatl Acad Sci U S A91:9022-9026和Zahnd C et al(2007)Nat Methods 4:269-279中描述。体外区室化系统为本领域技术人员熟知，在例如Sepp A et al(2002)FEBS Lett532:455-458中描述。Cis展示系统为本领域技术人员熟知，在例如Odegrip R et al(2004)ProcNatl Acad Sci USA 101:2806-2810中描述。微珠展示系统为本领域技术人员熟知，在例如Nord O et al(2003)J Biotechnol 106:1-13中描述。
此外，用于基因型-表型偶联的手段可包含非展示系统，如蛋白质-片段互补测定(PCA)。PCA系统为本领域技术人员熟知，在例如Koch H et al(2006)J Mol Biol 357:427-441中描述。
第四方面，本发明提供了从多肽群中选择对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法，包括如下步骤：
(a)提供如上述多肽群；
(b)使所述多肽群与预定靶在一定条件下接触，所述条件是使得靶与具有靶亲和性的至少一种所需多肽之间发生特异性相互作用的条件；以及
(c)基于所述特异性相互作用，从剩余的多肽群中选择至少一种所需多肽。
根据本发明，这种方法在下文被称作选择方法。
步骤(a)可包括提供多核苷酸群和表达所述多核苷酸群以产生所述多肽群的预备步骤。产生多肽群的方式根据使用的展示系统而有所不同，这种方式的例子可见于上述基因型-表型参考文献中。用于本发明的选择方法中的所述多肽群的每个成员可以通过用于基因型-表型偶联的手段与编码该成员的多核苷酸以物理方式结合。用于基因型-表型偶联的手段可以是上文论述的方式之一。
在一些实施方案中，用于本发明的选择方法中的所述多肽群的每个成员与编码该成员的多核苷酸可以通过用于基因型-表型偶联的手段在空间上结合。
步骤(b)包括使所述多肽群与预定靶在一定条件下接触的步骤，所述条件是使得靶与具有所述靶亲和性的至少一种所需多肽之间发生特异性相互作用。可应用的条件范围通过所述靶的鲁棒性(robustness)、展示系统的鲁棒性以及通过与靶相互作用的希望的性质确定。例如分离如酸化为预定pH值的相互作用的特定方法可能是希望的。本领域技术人员已知需要什么样的实验以确定合适的条件。
步骤(c)包括至少一种多肽的选择。基于预定靶与至少一种具有靶亲和性所需多肽之间的特异性相互作用，从剩余的多肽群中选择所需多肽的方式根据使用的展示系统而有所不同，可见于上述基因型-表型参考文献中。例如，体外展示选择系统是与如噬菌体展示系统和蛋白质片段区室化测定等系统相反的无细胞系统。
第五方面，本发明提供了分离编码对预定靶具有亲和性的所需多肽的多核苷酸的方法，包括如下步骤：
-使用本发明的选择方法从多肽群中选择所述所需多肽和编码其的多核苷酸；及
-分离由此分离的编码所需多肽的多核苷酸。
根据本发明，这种方法在下文被称作分离方法。
从多肽中分离多核苷酸可以根据用于选择的展示系统而不同地分离。例如，在无细胞展示系统如顺式展示系统和核糖体展示系统中，所述多核苷酸或者相应的mRNA通过使用在上述基因型-表型参考文献中所述方式从多肽中有效洗脱而回收。
多核苷酸的分离根据用于选择的展示系统而可以通过不同方法进行。在大多数上述选择系统中，例如在蛋白质片段互补测定中，多核苷酸可以通过使用合适的寡核苷酸进行特异性PCR扩增而直接分离。例外的是，如在核糖体展示系统中，多核苷酸可以通过使用逆转录从相应的mRNA中分离。分离多核苷酸的各种方式可见于上述基因型-表型参考文献中。
第六方面，本发明提供了鉴别对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法，包括如下步骤：
-使用本发明的分离方法分离编码所述所需多肽的多核苷酸；及
-对所述多核苷酸进行测序，以通过推导确定所述所需多肽的氨基酸序列。
多核苷酸测序可以根据本领域技术人员熟知的标准方法进行。
第七方面，本发明提供了从多肽群中选择和鉴别对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法，包括如下步骤：
(a)在单独的载体或者珠上合成所述多肽群的每个成员；
(b)基于所述多肽与预定靶的相互作用选择或者富集所述载体或者珠；以及
(c)通过蛋白质保证方法鉴别所述多肽。
在步骤(c)中，例如可以使用质谱分析法。
根据本发明，这种方法在下文被称作选择和鉴别方法。
第八方面，本发明提供了产生对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法，包括如下步骤：
-使用本发明的选择方法或者本发明的选择和鉴别方法选择和鉴别所需多肽；以及
-产生所述所需多肽。
根据本发明，这种方法在下文被称作本发明的产生方法。
在本发明的产生方法中，可以通过使用编码所需多肽的多核苷酸的重组表达进行生产。也可以通过使用所需多肽从头化学合成方法进行生产。
第九方面，本发明提供了产生对预定靶具有亲和性的所需多肽的方法，包括如下步骤：
(a1)使用本发明的分离方法分离编码所述所需多肽的多核苷酸；或者(a2)回译(backtranslating)用本发明的选择和鉴别方法鉴别的多肽；以及
(b)表达由此分离的多核苷酸以产生所述所需多肽，
其中步骤(b)在步骤(a1)或者步骤(a2)之后进行。
多核苷酸的表达可以在本领域技术人员已知的任何合适的表达宿主中进行，所述表达宿主例如但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞。
短语“对预定靶的结合亲和性”、“与预定靶结合”等是指多肽的性质，其可以通过确定亲和性常数-即在指定抗原浓度下结合和解离的多肽量-而直接测量。可以使用不同方法鉴定分子相互作用，例如但不限于竞争分析、平衡分析和微量热分析，以及基于表面等离子共振相互作用的实时相互作用作用分析(例如使用
Figure GDA0002276722010000101
仪器)。这些方法为本领域技术人员熟知，在例如Neri D et al(1996)Tibtech 14:465-470和Jansson M et al(1997)J Biol Chem 272:8189-8197中描述。
本发明人发现通过任何上述方法获得的结合预定靶的多肽与结合相同靶的已知多肽相比可以呈现出一或多种令人惊奇的优势，同时保留那些先前已知的多肽结合所述靶的能力。这种优势非限制性地例如下文所述：
·结合预定靶并通过任何上述方法获得的多肽包含更少的在多肽序列的化学合成中可以导致如低产量和成功率问题的氨基酸残基，如天冬酰胺、精氨酸、天冬氨酸和甲硫氨酸。
·结合预定靶并通过任何上述方法获得的多肽包含更少的赋予表面疏水性的氨基酸残基。这意味着具有低溶解性和聚集问题更少。不希望受理论的束缚，目前也认为在将多肽给予宿主时，更高的亲水性特性改变所述多肽的生物分布，从肝胆途径(通过肝排泄)至更希望的肾途径(通过肾排泄)。
·结合预定靶并通过任何上述方法获得的多肽包含更少的与多肽稳定性问题相关的氨基酸残基，如甲硫氨酸、天冬酰胺以及二肽天冬酰胺-脯氨酸。甲硫氨酸易氧化，天冬酰胺易脱酰胺，天冬酰胺-脯氨酸键易被酸裂解，由此导致终产物的非均质性。
·结合预定靶并通过任何上述方法获得的多肽缺少这样的氨基酸残基，即发现在相似的序列中增强与含有VH3的重链可变结构域的免疫球蛋白相互作用的氨基酸残基(Silverman GJ(1992)supra)。不希望受理论的束缚，目前认为置换结合预定靶并通过任何上述方法获得的多肽中这种氨基酸残基可以在将所述多肽的给予宿主时降低其抗原性。
在本发明支架的优势中，碱稳定性、低抗原性、结构稳定性、改良的化学合成性质和/或增加的亲水性是最重要的。
结合预定靶并通过任何上述方法获得的多肽可用作检测试剂、捕获试剂、分离试剂、体内或者体外诊断剂，独自用作治疗剂或者用作使其它治疗剂和/或诊断剂靶向预定靶的工具。体外应用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如在微滴定平板中、在蛋白质阵列中、在生物传感器表面上、在组织切片上等。
上述对组成本发明多肽群的多肽进行的修饰也可适用于通过任何上述方法获得的多肽。
本发明的多肽可以通过任何已知方法产生，包括化学合成方法或者在不同的原核或者真核宿主中表达，所述宿主包括植物和转基因动物。
现在通过描述根据本发明进行的实验详细地举例说明本发明。如下实施例不限制本发明范围。在实施例中，参考附图所述内容。
附图简述
图1示出得自使用Jasco J-810分光偏振计的CD测量的结果。对在PBS缓冲液中0.5mg/ml的His6-ZTNF-α:3230进行可变温度测量。从20至80℃在221nm测量吸光度，温度梯度为5℃/分钟。使用光程长度为1mm的小池。His6-ZTNF-α:3230的解链温度(Tm)从可变温度测量中确定。
图2示出在实施例4中描述的选择方法的总结。在两个不同路径中进行选择，一个是高浓度靶(路径1)，一个是低浓度靶(路径2)。根据每个路径和循环以及洗涤次数给出靶浓度(在括号内)。
图3是在将His6-Z04674加热至96℃之前(实线)和之后(虚线)的两个CD光谱覆盖图(overlay plot)。
图4示出多肽变体的Biacore分析结果；在固定的Dynazyme上相继注射His6-Z04777(实心方块)、His6-Z04687(实心三角)、His6-Z04665(空心三角)、His6-Z04674(黑色线)、His6-Z04781(灰色线)和运行缓冲液(空心方块)之后获得的传感图(sensorgram)。应答(RU表示)针对时间(s)作图。
图5A和5B示出具有序列maESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLSEAKK LNDSQAPK的多肽在氨基酸残基18-58的合成阶段的分析性HPLC洗脱图。A)在位置22-23、41-42、45-46和53-54使用假脯氨酸在聚苯乙烯树脂上进行合成。B)在聚苯乙烯树脂上无假脯氨酸的标准肽合成。
图6A和6B示出具有序列maESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLSEAKK LNDSQAPK的多肽在氨基酸残基1-58(A)和10-58(B)的合成阶段的分析性HPLC洗脱图。A)在位置22-23、41-42、45-46和53-54使用假脯氨酸在聚苯乙烯树脂上进行合成。B)在聚苯乙烯树脂上无假脯氨酸的标准肽合成。
图7A和7B示出具有序列A)和B)的多肽的分析性HPLC洗脱图，序列A)AEAKYAKEMWIAWEEIRNLP NLNGWQMTAF IAKLLDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPKC(本发明的序列)，序列B)AENKFNKEMW IAWEEIRNLP NLTGWQMTAF IASLLDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK(用以对比)。
实施例
实施例1：组合的多肽文库的构建
基本如
Figure GDA0002276722010000122
C et al(2007)J Biotechnol 128:162-183所述构建多肽的组合文库，通过PCR扩增编码金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白质A-衍生的蛋白质Z(Nilsson et al(1987),supra)的螺旋1和2的具有一些简并密码子的123个核苷酸的模板寡核苷酸(5’-GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATCNNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNNGAT GAC CCA AGC CAG AGC-3’)，所述螺旋1和2具有点突变N3A、F5Y、N6A、N23T和S33K。使用分别具有如表1下划线所示的Xho I位点和Sac I位点的引物AFFI-1364和AFFI-1365进行PCR扩增。
用Xho I和Sac I限制消化编码所述文库的所得基因片段。随后，将编码文库的基因片段连接在Xho I-和Sac I-限制的为噬菌体展示采用的噬菌粒载体pAY2016中，其基本基于噬菌粒载体pAffi1(
Figure GDA0002276722010000123
C et al(2007),supra)，与蛋白质Z的41-58位氨基酸残基符合读框，编码具有点突变A42S、N43E、A46S和A54S的螺旋3。螺旋3通过退火两个互补寡核苷酸AFFI-1333和AFFI-1334而构建(表1)。
将所得文库载体电穿孔进大肠杆菌菌株RR1ΔM15(Ruther U(1982)Nucl AcidsRes 10:5765-5772)中，产生2.4×1010个成员的文库。
使用包括M13K07辅助噬菌体的标准方法从所述文库中制备噬菌体原种(NewEngland Biolabs,Beverly,MA,USA)，通常产生大约1011cfu/ml培养物的噬菌体效价。
表1：寡核苷酸列表
Figure GDA0002276722010000121
Figure GDA0002276722010000131
实施例2：人HER2结合多肽变体的噬菌体展示选择和鉴定
概述
生物素酰化的HER2在噬菌体展示选择中用作靶，使用在实施例1中构建的文库。使用各种条件进行选择，以使得获得HER2高亲和性分子的可能性最大化。在洗脱选择的噬菌体之后，在ELISA装置中检测相应表达的蛋白质的HER2亲和性。鉴别阳性克隆并测序，推导相应多肽及其HER2结合基序的预测氨基酸序列，获得大量HER2结合分子序列。
HER2的生物素酰化
将冻干的人HER2蛋白(R&D Systems,#1129-ER)溶解于PBS(2.68mM KCl，1.47mMKH2PO4，137mM NaCl，8.1mM Na2HPO4，pH 7.4)中，至终浓度为10mg/ml。将EZ-link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce,#21335)溶解于水中，至终浓度为1mg/ml，并且将5和30倍摩尔过量加入500μg HER2中，总体积为0.5ml。将该混合物在室温(RT)保温30分钟。未结合的生物素通过使用透析盒(Slide-A-Lyser,10kDa；Pierce)用PBS透析而除去。
噬菌体展示选择
共进行5次选择循环，使用逐渐增加的严格条件，如降低HER2浓度以及增加洗涤次数。进行三次最初的选择循环，主要是确定合适的选择方案，然后使用表2列出的选择缓冲液、靶浓度和固体支持物组合再进行两次选择循环。
表2：HER2选择的选择条件
Figure GDA0002276722010000132
Figure GDA0002276722010000141
所述选择方法中使用的所有试管和珠(
Figure GDA0002276722010000142
M-280Streptavidin,#112.06；Dynal)均在TPBSB(5％)(0.05％Tween20，5％牛血清白蛋白(BSA)，0.02％叠氮化钠于PBS中)或者凝胶(0.5％)中在室温预封闭至少30分钟。
根据表2，选择溶液(1ml)含有生物素酰化的人HER2、噬菌体、叠氮化钠(0.02％)、Tween 20(0.05％)以及BSA(3％)或者凝胶(0.1％)，并且在PBS中制备。在循环4的3天期间以及在循环5的1天期间将噬菌体与生物素酰化的人HER2靶在4℃保温，随后在室温搅拌保温1小时。将选择样品移至封闭的链霉抗生物素蛋白珠，在室温搅拌保温15分钟。将该珠用1ml选择缓冲液(即TPBSB(3％)(0.05％Tween20，3％牛血清白蛋白(BSA)，0.02％叠氮化钠于PBS中)或者GT 0.1(0.1％凝胶，0.1％Tween 20和0.02％叠氮化钠于PBS中))洗涤10次，随后用PBS洗涤10次，其中倒数第二次洗涤进行5分钟。将噬菌体用1000μl 50mM甘氨酸-HCl、pH 2.2在室温洗脱10分钟，随后用补加100μl 1M Tris-HCl、pH 8.0的900μl PBS立即中和；或者用1000μl胰蛋白酶(2mg/ml)在室温洗脱30分钟，随后加入1000μl抑肽酶(0.4mg/ml)。在每次选择循环后，洗脱的噬菌体(3/4体积)用于感染50ml对数生长期大肠杆菌RR1ΔM15细胞(Rüther,1982,supra)。在37℃轻轻搅拌保温30分钟以及剧烈搅拌保温30分钟，离心细胞，将沉淀以较小体积溶解并涂布于TYE平板(15g/l琼脂，10g/l胰化蛋白胨水(Merck)，5g/l酵母提取物，3g/l NaCl，补加2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)上，最后在37℃保温过夜。
噬菌体原种制备
将来自平板的细胞重悬于TSB培养基(30g/l胰酶大豆肉汤)中，通过测量在600nm的光密度确定细胞浓度，假定OD600＝1相应于5×108个细胞/ml。将细胞接种于(与洗脱的噬菌体相比细胞超出大约100倍)补加2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的100ml TSB+YE培养基中，在37℃生长至大约OD600＝0.5-0.7。之后，将10ml移至新的培养瓶中，用10倍过量摩尔体积的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs,#NO315S)感染，低速搅拌保温30分钟。在2000g离心细胞10分钟，将沉淀重悬于补加100μM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的100ml TSB+YE培养基中，在25℃以100rpm生长过夜。将一部分重悬的细胞在–80℃贮存作为甘油原种。
将过夜培养物在2500g离心10分钟，上清中的噬菌体通过加入1/4体积的沉淀缓冲液(20％PEG/2.5M NaCl)沉淀，并在冰上保温1小时。沉淀的噬菌体通过在4℃以10000g离心30分钟沉淀，重悬于20ml PBS中，之后重复沉淀步骤。噬菌体最后重悬于1ml PBS中，通过0.45μm滤膜过滤。
在每轮选择之后滴定选择、洗涤和洗脱溶液。将噬菌体溶液在微滴定平板中在无菌水中稀释，在每个噬菌体稀释液中加入100μl对数生长期大肠杆菌RR1ΔM15细胞。在室温保温20分钟之后，将5μl每个滴定液移至TYE平板，在37℃保温过夜。计数所得菌落并计算效价(cfu/ml)。
HER2结合的ELISA分析
表达来自最后的选择循环的克隆，并针对HER2结合活性进行筛选，使用下文实施例4所述ELISA装置进行(但是使用HER2作为靶蛋白质)或者如下文所述进行。通过将每个菌落接种于补加100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的1ml TSB+YE培养基中以及在37℃生长18-24小时，在96孔深孔平板中表达随机挑取的菌落。在保温后，通过将一小部分每种培养物移至具有15％甘油的96孔平板中制作复制平板，在-20℃贮存。
剩余的细胞通过在3000g离心10分钟沉淀，重悬于400μl PBS-T 0.05(补加0.05％Tween 20的PBS)中，在–80℃冷冻。将冷冻的样品在水浴中解冻，将细胞在3700g离心至少20分钟沉淀。收集含有表达的分子的上清，用于ELISA中。
将一半面积的微滴定平板孔(Costar,#3690)用在ELISA包被缓冲液(Sigma,#3041)中浓度为6μg/ml的50μl的HSA包被过夜。将该孔用100μl封闭缓冲液(2％脱脂乳于PBS中)在室温封闭2小时。在除去封闭缓冲液之后，在孔中加入50μl制备的蛋白质，将该平板在室温保温1.5小时。弃去上清，在孔中加入于PBS-T 0.05中浓度为0.5-10μg/ml的生物素酰化的HER2，保温1.5小时。使用在PBS-T 0.05中1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(HRP,Dako,#P0397)检测结合的复合物，在室温保温1小时。在孔中加入50μl
Figure GDA0002276722010000161
TMB底物(Pierce,#34021)，根据厂商指导处理平板。在Tecan Ultra384ELISA读数器(Tecan)中读取所述孔的450nm吸光度，并使用Magellan v.5.0软件(Tecan)评估。在加入每种新试剂之前，使用PBS-T 0.05进行四次洗涤。
基于这个实验的结果，如下文所述挑取克隆进行测序。
ELISA阳性克隆的测序
使用合适的寡核苷酸从选择的菌落中扩增PCR片段。根据厂商指导及使用合适的生物素酰化的寡核苷酸，使用
Figure GDA0002276722010000162
Terminator v3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)对扩增的片段测序。使用Magnatrix 8000仪器(Magnetic Biosolutions)通过结合
Figure GDA0002276722010000163
REGENTM链霉抗生物素蛋白包被的顺磁性珠纯化测序反应，最后在ABI
Figure GDA0002276722010000164
3100基因分析仪(Applied Biosystems)上分析。
亚克隆进质粒pAY1448中
将编码选择的HER2特异性分子的DNA亚克隆进表达载体pAY1448中，产生His6-标记的单体分子，称作MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD(His6-Z#####)，其中Z#####表示起始变体分子群的经鉴别的成员。使用Qiagen Mini试剂盒(Qiagen)，根据厂商指导从大肠杆菌RR1ΔM15细胞在补加100μg/ml氨苄青霉素的TSB中的2ml过夜培养物中纯化含有插入体的质粒。
使用合适的PCR引物对通过AccI-NotI PCR粘端克隆将选择的分子的DNA亚克隆进表达载体pAY1448中。
将表达载体pAY1448在两个步骤中使用分别于NEB4和NEB3缓冲液(New EnglandBiolabs)中的AccI和NotI在37℃消化4小时，并且使用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP；Fermentas)在37℃去磷酸化1小时。裂解的质粒和片段通过使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据厂商指导进行纯化。
杂交PCR产物，并且使用T4 DNA连接酶(5单位/μl；Fermentas)在室温将其连接进AccI-NotI消化的去磷酸化的pAY1448中1小时。将等份的连接混合物电穿孔进大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。将该细胞铺板于补加50μg/ml卡那霉素的胰蛋白血琼脂基础(TBAB)平板上，在37℃保温过夜。如上述首先通过PCR筛选检验阳性克隆的插入体，然后分析正确的序列。
His6-标记的多肽的表达和纯化
如上述全部亚克隆进pAY1448中的选择的分子在大肠杆菌BL21(DE3)中表达为N-末端His6-标记融合体，并通过IMAC纯化。每个分子的菌落用于接种补加50μg/ml卡那霉素的5ml TSB培养基。培养物在37℃生长过夜。第二天，将50μl每种培养物单独接种于在1升培养瓶中补加50μg/ml卡那霉素的100ml TSB+YE培养基中，培养物在37℃在100rpm生长至OD600为0.7-1，之后加入IPTG至终浓度为0.5mM，将细胞在室温在100rpm保温过夜。通过在8000g离心5分钟收获培养物，将沉淀贮存在冷冻器中直至进行蛋白质制备。
His6-标记的蛋白质是在变性条件下使用1.5ml Ni-NTA Superflow柱(Qiagen)纯化的IMAC。使用PD-10柱(GE Healthcare)时缓冲液更换为PBS。
使用A280和BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)，根据厂商指导确定蛋白质浓度。蛋白质的纯度通过考马斯蓝R染色SDS-PAGE分析。
选择的分子的人HER2亲和性的生物传感器分析
根据厂商指导，使用人HER2在Biacore2000仪器(GE Healthcare)上进行生物传感器分析，所述人HER2通过胺偶联固定在CM-5芯片(研究级别，GE Healthcare)表面上羧化的葡聚糖层上。芯片上的表面1被激活及灭活，并且在注射期间用作参考池(cell)，将如上述表达和纯化的选择的分子在HBS-EP(GE Healthcare)中稀释为25nM，以25μl/分钟的恒定流速注射10分钟，随后在HBS-EP中解离30分钟。所述表面通过注射两次25mM HCl而再生。
实施例3：原始的及本发明的支架变体的克隆、生产以及解链温度和体外抗原性的 评估
概述
这个实施例描述了原始的和本发明的支架变体的克隆、产生和评估。据认为导入的支架突变改良多肽分子的一些性质，如抗原性、亲水性和碱稳定性以及结构稳定性。因此，评估不同分子的解链温度和体外抗原性，结果示出本发明的分子与原始分子相比具有增高的解链温度及展示较低的体外抗原性(较低的IgG结合力)。
多肽的克隆
对于原始构建体，在两个单独的反应(PCR1和PCR2)中通过PCR扩增DNA序列，所述DNA序列编码特异于肿瘤坏死因子-(TNF-α)、HER2、胰岛素、Taq聚合酶和血小板衍生的生长因子-受体(PDGF-Rβ)(表3)的分子。在PCR1和PCR2中分别使用引物对AFFI-267/AFFI-1014和AFFI-1015/AFFI-270(表4)，其编码5’末端中部分AccI限制位点。为了制备质粒模板，将携带该质粒DNA的细菌在补加50μg/ml卡那霉素的TSB培养基中生长过夜。通过离心沉淀细胞，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)制备质粒。
对于本发明的构建体，对编码修饰的本发明分子的核苷酸序列进行PCR扩增(PCR1和PCR2)，使用部分重叠的寡核苷酸作为模板(AFFI-1320-AFFI-1323，AFFI-1326和AFFI-1327)或者使用具有原始构建体和含有相关突变(AFFI-69，AFFI-70，AFFI-1151和AFFI-1152)的寡核苷酸的载体(表4)。所述PCR反应中包含编码5’末端部分AccI限制位点引物对AFFI-1328/AFFI-1331和AFFI-1329/AFFI-1330。
根据标准PCR方案使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene,#600854-52)扩增PCR反应，通过1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
使用具有改变的密码子和基于PCR的诱变技术，产生PDGF-Rβ结合Z变体。使用In-Fusion技术(Clontech,#639607)，将获得的PCR片段连接进裂解的表达载体中。
为了产生所有构建体的含有上游和下游AccI粘端的DNA片段，使用磁性链霉抗生物素蛋白珠分离PCR1和PCR2产物的正向和反向核苷酸链。在室温在持续旋转条件下保温30分钟之后，将该珠用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，10mM MgCl2，10mM DTT)洗涤，加热至95℃进行5分钟。收集含有非生物素酰化的片段的上清，加热至95℃，随后在30分钟期间逐步冷却至25℃以杂交DNA链。
随后将编码结合分子的DNA片段在CIP-处理的(小牛肠碱性磷酸酶)及纯化的表达载体中在室温连接2小时或者过夜，所述表达载体预先用AccI限制酶消化。获得的构建体为MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD、MGSSLQ-[Z#####]-VDC(对于ZPDGF-Rβ:2465)或者M-[Z#####]-C(对于ZPDGF-Rβ:3358)。
如实施例2所述，将连接体转化进电转感受态大肠杆菌TOP10细胞中，以及在平板上培养。如实施例2所述，对携带新构建的质粒的细菌菌落进行PCR筛选，检验插入的DNA序列。
如先前所述制备检验质粒。
多肽的表达
将用相关质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)培养物接种于补加50μg/ml卡那霉素和0.3ml/l防沫剂(Breox FMT 30)的800ml TSB-YE培养基中，在37℃生长至OD600大约为2。然后通过加入1M IPTG至终浓度为0.5mM诱导蛋白质表达。使用多发酵罐系统(multifermenter system)Greta(Belach)进行培养。诱导后5小时通过在15 900×g离心20分钟收获培养物。弃去上清，收集细胞沉淀并在-20℃贮存。通过使用SDS-PAGE及目测染色的凝胶确定蛋白质表达水平。
表达的多肽的纯化
如下所述纯化具有His6标记的蛋白质：将携带可溶的His6标记的多肽的沉淀的细菌细胞悬浮于His GraviTrap结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20mM咪唑和40U/ml
Figure GDA0002276722010000191
)中，通过超声破坏。在澄清后，将上清加样于预先用His GraviTrap结合缓冲液平衡的His GraviTrap柱(GE Healthcare)中。在将该柱用10个柱体积(CV)的HisGraviTrap洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，60mM咪唑)洗涤之后，使用3个柱体积(CV)的His GraviTrap洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱所述多肽。
如下所述纯化无His6标记的蛋白质：将携带可溶的ZPDGF-Rβ:2465-Cys或者ZPDGF-Rβ:3358-Cys的沉淀的细菌细胞悬浮于20mM Tris-HCl，pH 7.1中。为了破坏细胞及释放胞内内容物，将该细胞悬浮液加热至85℃进行3分钟。通过离心及随后过滤澄清裂解物，加样于充填在XK26柱(GE Healthcare)中25ml Q Sepharose FF(GE Healthcare)中，所述柱预先用20mM Tris-HCl,pH 7.1平衡。在将该柱用5个CV的20mM Tris-HCl,pH 7.1洗涤之后，在10个CV期间用线性梯度的在20mM Tris-HCl,pH 7.1中的0-0.5M NaCl洗脱结合的蛋白质。流速为5ml/分钟，检测在280nm的信号。含有ZPDGF-Rβ:2465-Cys或者ZPDGF-Rβ:3358-Cys的级分通过SDS-PAGE分析鉴别。集合相关级分，通过加入1M Tris-HCl,pH 8.0至终浓度为50mM将pH调节为8.0。所述构建体C末端半胱氨酸通过加入DTT至20mM还原，随后在40℃保温3分钟。在还原后，加入乙腈(ACN)至终浓度为5％，将还原的ZPDGF-Rβ:2465-Cys或者ZPDGF-Rβ:3358-Cys加样于预先用RPC A缓冲液(0.1％TFA，5％CAN，95％水)平衡的1ml Resource 15RPC柱(GEHealthcare)中。在将该柱用10个CV的RPC A缓冲液洗涤之后，用线性梯度的0-40％RPC B缓冲液(0.1％TFA，80％CAN，20％水)洗脱结合的蛋白质。流速为1ml/分钟，监测在280nm的信号。通过SDS-PAGE分析鉴别含有纯ZPDGF-Rβ:2465-Cys或者ZPDGF-Rβ:3358-Cys的级分并集合。
为了冻干所述蛋白质，将所述缓冲液更换为10mM碳酸氢铵缓冲液pH8.0或者10mM乙酸铵缓冲液pH 6.0，使用一次性PD-10脱盐柱(GE Healthcare)进行。根据相关蛋白质的等电点选择冻干缓冲液。最后，使用Christ Alpha 2-4LSC仪器冻干结合多肽His6-ZTNF-α:185、His6-ZHER2:342、His6-Z胰岛素:810、His6-ZTaq:1154、ZPDGF-Rβ:2465-Cys、His6-ZHER2:2628、His6-ZTaq:3229、His6-ZTNF-α:3230、His6-Z胰岛素:3232和ZPDGF-Rβ:3358-Cys，在4℃贮存直至使用(表5)。根据厂商(Pierce)指导，使用N-乙基马来酰亚胺(NEM)封闭游离的C-末端半胱氨酸。
纯化的多肽的分析
通过使用
Figure GDA0002276722010000201
ND-1000分光光度计测量在280nm的吸光度确定多肽溶液的浓度。使用SDS-PAGE和LC-MS进一步分析所述蛋白质。
对于SDS-PAGE分析，将大约10μg多肽与LDS样品缓冲液和DTT(终浓度45mM)混合，在70℃保温15分钟，加样于
Figure GDA0002276722010000202
4-12％Bis-Tris凝胶上。将该凝胶在Novex Mini-Cell中与MES SDS运行缓冲液一起运行，使用
Figure GDA0002276722010000203
Plus2预染标准作为分子量标记以及PageBlueTM蛋白质染色溶液进行染色。
为了检验多肽的相同性，使用装备API-ESI和单四极质谱分析仪(singlequadruple mass analyzer)的Agilent 1100LC/MSD系统进行LC/MS分析。在更换缓冲液之后，将蛋白质样品在冻干缓冲液中稀释至终浓度为0.5mg/ml，将10μl加样于Zorbax 300SB-C8 Narrow-Bore柱(2.1×150mm，3.5μm)上，流速为0.5ml/分钟。使用线性梯度10-70％溶液B以0.5ml/分钟流速洗脱蛋白质30分钟。在30℃进行分离。监测在280和220nm的离子信号及吸光度。纯化的蛋白质的分子量通过分析离子信号确定。
解链温度(Tm)的确定
将冻干的多肽溶解于PBS中至终浓度为大约0.5mg/ml，在冰上贮存。在光程长度为1mm的小池中使用Jasco J-810分光偏振计进行CD分析。在可变温度测量中，测量从20至80℃的在221nm的吸光度，温度坡度为5℃分钟。通过确定CD vs温度图示的转折中点计算检测多肽的解链温度(Tm)。
根据本发明修饰的多肽分子与原始分子相比具有增高的解链温度(表6)。图1示出His6-ZTNF-α:3230(本发明的TNF-α特异性多肽)获得的解链曲线。
体外抗原性ELISA(血清中IgG结合分析)
进行ELISA的一般条件如下所述：在96孔平板的一半区域中进行ELISA测定。除了在使用100μl进行封闭的情况中，所有保温使用体积是50μl。在4℃在(15mM Na2CO3和35mMNaHCO3)包被缓冲液中包被过夜，所有其它保温均在室温进行。灵长类血清和检测抗体的稀释在PBS+0.5％酪蛋白中进行。所有洗涤均使用自动ELISA Scan Washer 300进行，其中每个孔每次用175μl洗涤缓冲液(PBS-T；在1×PBS中0.05％Tween 20)洗涤缓冲液洗涤4次。
将ELISA平板的孔用2μg/ml的结合蛋白His6-ZTNF-α:185、His6-ZHER2:342、His6-Z胰岛素:810、His6-ZTaq:1154、ZPDGF-Rβ:2465-Cys-NEM、His6-ZHER2:2628、His6-ZTaq:3229、His6-ZTNF-α:3230、His6-Z胰岛素:3232和ZPDGF-Rβ:3358-Cys-NEM包被。ZHER2:342用作标准。在包被后，将孔用自来水洗涤两次，并且用PBS+0.5％酪蛋白封闭。倒空平板，将2倍稀释的得自猕猴(MAccacafascicularis；得自Swedish Institute for Infectious Disease Control)的灵长类动物血清集合加入孔中。滴定系列在1/100稀释度开始，在1/102400稀释度结束。直接在96孔平板中进行稀释。在与灵长类动物血清集合保温1小时后，洗涤平板，加入1/5000稀释的山羊抗人Ig-HRP抗体进行检测。在与检测抗体保温50分钟之后，洗涤平板并加入底物。将
Figure GDA0002276722010000221
TMB试剂盒中两种成分等体积混合，每孔加入50μl。随后，将平板在黑暗中保温12分钟，通过加入50μl终止溶液(2M H2SO4)终止反应。使用ELISA读数器记录在450nm的吸光度。作为阴性对照，使用PBS+0.5％酪蛋白代替灵长类动物血清集合。
为了评估结果以及获得代表灵长类动物结合所述多肽的Ig分子水平的IVA值，使用GraphPad Prism 5程序。减去背景OD值的样品值被加到基于XY-非线性回归(S型剂量效应)公式的模板。OD 0.3的稀释值得自该公式，IVA值通过设定标准稀释值为100以及通过关联所有样品为100而计算。低于100的值表示检测的多肽与用作阳性对照的ZHER2:342分子相比结合结合免疫球蛋白的能力降低。
本发明的分子与原始分子相比示出与免疫球蛋白结合力更低(表7)。结果以体外抗原性(IVA)值示出，IVA值降低则认为体外抗原性(IgG结合力)降低。
表3：结合多肽序列列表
Figure GDA0002276722010000222
表4：寡核苷酸列表
Figure GDA0002276722010000231
表5：检测的多肽列表
靶 名称 变体
TNF- His<sub>6</sub>-Z<sub>TNF-α:185</sub> 原始
TNF- His<sub>6</sub>-Z<sub>TNF-α:3230</sub> 本发明
HER2 Z<sub>HER2:342</sub> 原始
HER2 His<sub>6</sub>-Z<sub>HER2:342</sub> 原始
HER2 His<sub>6</sub>-Z<sub>HER2:2628</sub> 本发明
胰岛素 His<sub>6</sub>-Z<sub>胰岛素:810</sub> 原始
胰岛素 His<sub>6</sub>-Z<sub>胰岛素:3232</sub> 本发明
Taq聚合酶 His<sub>6</sub>-Z<sub>Taq:1154</sub> 原始
Taq聚合酶 His<sub>6</sub>-Z<sub>Taq:3229</sub> 本发明
PDGF-Rβ Z<sub>PDGF-Rβ:2465</sub>-Cys 原始
PDGF-Rβ Z<sub>PDGF-Rβ:3558</sub>-Cys 本发明
表6：检测的多肽的确定的Tm数值
靶 名称 变体 Tm(℃)
TNF- His<sub>6</sub>-Z<sub>TNF-α:185</sub> 原始 53
TNF- His<sub>6</sub>-Z<sub>TNF-α:3230</sub> 本发明 60
HER2 His<sub>6</sub>-Z<sub>HER2:342</sub> 原始 63
HER2 His<sub>6</sub>-Z<sub>HER2:2628</sub> 本发明 69
胰岛素 His<sub>6</sub>-Z<sub>胰岛素:810</sub> 原始 42
胰岛素 His<sub>6</sub>-Z<sub>胰岛素:3232</sub> 本发明 48
Taq聚合酶 His<sub>6</sub>-Z<sub>Taq:1154</sub> 原始 46
Taq聚合酶 His<sub>6</sub>-Z<sub>Taq:3229</sub> 本发明 50
PDGF-Rβ Z<sub>PDGF-Rβ:2465</sub>-Cys-NEM 原始 42
PDGF-Rβ Z<sub>PDGF-Rβ:3558</sub>-Cys-NEM 本发明 42
表7：检测的多肽的IVA数值
靶 名称 变体 IVA-数值
TNF- His<sub>6</sub>-Z<sub>TNF-α:185</sub> 原始 38
TNF- His<sub>6</sub>-Z<sub>TNF-α:3230</sub> 本发明 21
HER2 His<sub>6</sub>-Z<sub>HER2:342</sub> 原始 99
HER2 His<sub>6</sub>-Z<sub>HER2:2628</sub> 本发明 14
胰岛素 His<sub>6</sub>-Z<sub>胰岛素:810</sub> 原始 43
胰岛素 His<sub>6</sub>-Z<sub>胰岛素:3232</sub> 本发明 16
Taq聚合酶 His<sub>6</sub>-Z<sub>Taq:1154</sub> 原始 26
Taq聚合酶 His<sub>6</sub>-Z<sub>Taq:3229</sub> 本发明 18
PDGF-Rβ Z<sub>PDGF-Rβ:2465</sub>-Cys-NEM 原始 35
PDGF-Rβ Z<sub>PDGF-Rβ:3558</sub>-Cys-NEM 本发明 3
实施例4：Dynazyme结合多肽变体的噬菌体展示选择和鉴定
Dynazyme的生物素酰化
根据厂商指导，将得自Thermus brockianus物种(Finnzymes,#F-501L)的靶蛋白质Dynazyme II DNA聚合酶(Dynazyme)用10倍摩尔过量的No-weightTMSulfo-NHS-LC-生物素(Pierce,#21327)进行生物素酰化。使用Slide-a-lyzer透析试剂盒(Pierce,10K,0.5-3ml)通过透析更换缓冲液，在生物素酰化之前更换为PBS，在生物素酰化之后更换为TKMT(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.1％Triton X-100，pH 8.8)，以除去未结合的生物素。
噬菌体展示选择
使用本发明的多肽群针对生物素酰化的进行选择(实施例1)。使用两种选择方法：一种是高靶浓度(路径1)，一种是低靶浓度(路径2)。进行四次选择循环。在每次循环之间制备新的噬菌体原种。关于选择的综述和详细描述见图2。
如实施例2所述，将噬菌体文库原种经PEG/NaCl沉淀两次，溶解于补加0.1％凝胶的TKMT(TKMTg)中。将噬菌体用链霉抗生物素蛋白包被的珠(SA珠，
Figure GDA0002276722010000251
M-280)在室温预保温30分钟。选择方法和所有试管中使用的珠均在TKMTg中预先封闭。
每次选择循环中的靶浓度和洗涤次数在图2中示出。用于选择和洗涤的缓冲液是TKMTg。将预选择的噬菌体与生物素酰化的靶在4℃保温17小时，随后在第一次选择循环中在室温保温3小时；在随后的选择循环中分别为3小时和1小时。随后，将噬菌体颗粒移至预封闭的5mg(第一次循环路径1)、3.5mg(第一次循环路径2)或者0.5mg(所有其它循环)的SA珠，搅拌保温10分钟。之后，如实施例2所述，洗涤该珠，噬菌体颗粒通过用低pH缓冲液洗脱。在每次选择循环之后，洗脱的噬菌体用于感染对数生长期大肠杆菌RR1ΔM15细胞。在37℃保温20分钟之后，通过离心收获细胞。将沉淀溶解于小体积TSB-YE中，涂布于TYE平板上，在37℃保温过夜。在每次选择循环之间基本如实施例2所述制备噬菌体原种。在每次选择循环之后计算噬菌体颗粒效价和产量。每次选择循环(除了第二次循环之外)噬菌体颗粒产量(在外的噬菌体颗粒(phage particles out)/在内的噬菌体颗粒(phage particles in))增加，表示靶结合克隆的增多。
Dynazyme结合多肽的ELISA分析
如实施例2所述，随机挑取在最后一次选择循环之后获得的克隆，并用于在96孔平板中进行周质蛋白质表达。如下所述，在ELISA中测定含有与ABD融合的可溶多肽变体的上清的靶结合能力。推定的结合多肽示为aqle-[Z#####]-vdyv-[aBD]-SQKA(ABD＝白蛋白结合结构域GA3，来自葡萄球菌(Streptococcus sp.)G148，Kraulis et al(1996)FEBSLett.378(2):190-194)，其中Z#####表示本发明多肽群的各个变体。
将一半区域的微滴定平板孔(Costar,#3690)用50μl的在ELISA包被缓冲液中的2-3μg/ml Dynazyme包被。将该孔用100μl补加0.5％酪蛋白(Sigma)的TKMT(TKMT-酪蛋白)在室温封闭1小时。在除去封闭溶液之后，将50μl上清加入孔中，将平板在室温保温1.5小时。通过加入一抗及随后加入二抗检测捕获的多肽变体。将一抗(即亲和性纯化的兔抗Z变体的多克隆Ig)在TKMT-酪蛋白中1:5000稀释，在室温保温1.5小时。将二抗(即山羊α-兔-HRP Ig(DakoCytomation,#P0448))在TKMT-酪蛋白中1:5000稀释，在室温保温1.5小时。将平板用TKMT洗涤四次，之后与所述抗体及显色溶液一起保温。
如实施例2所述，使平板显色并在ELISA分光光度计中在450nm读数。使用相关阴性和阳性对照以及空白对照制备所有平板，其中使用TKMT代替周质上清。总而言之，在ELISA中筛选1080个随机挑取的克隆的结合Dynazyme的能力。选择阳性克隆和一些具有低吸光度值的克隆进行测序。
ELISA阳性多肽的测序
根据实施例2所述对各个克隆进行测序。在ELISA筛选中发现11个独特的结合多肽是阳性的。一些克隆以若干拷贝出现。此外，从具有低ELISA值的克隆中鉴别了一些序列。
多肽亚克隆进质粒pAY1448中
将15个独特的多肽作为单体亚克隆进提供N-末端His6-标记的表达载体pAY1448中(如实施例2所述)，使用制备的质粒作为粘端PCR的模板。如实施例3所述进行亚克隆。
多肽的纯化
下文描述了15个单体His6-标记的多肽的纯化，所述单体多肽的名称是His6-Z04665、His6-Z04672、His6-Z04674、His6-Z04678、His6-Z04687、His6-Z04767、His6-Z04770、His6-Z04775、His6-Z04776、His6-Z04777、His6-Z04778、His6-Z04779、His6-Z04780、His6-Z04781和His6-Z04899。将携带可溶的His6-标记的分子的沉淀的细菌细胞悬浮HisGraviTrapTM结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，20mM咪唑和25U/ml
Figure GDA0002276722010000271
)中，通过超声处理破坏。使用热水(95℃)加热经超声处理的细胞悬浮液，直至该悬浮液的温度在5分钟期间稳定在大约90℃。在通过离心澄清后，将上清加样于预先用His GraviTrap结合缓冲液平衡的His GraviTrap柱(GE Healthcare)。在用5个CV的His GraviTrap结合缓冲液和5个CV的His GraviTrap洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，60mM咪唑)洗涤该柱之后，使用3个CV的His GraviTrap洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱多肽。
将多肽变体通过反向层析(RPC)进一步纯化。在His GraviTrap的洗脱级分中加入乙腈(ACN)至终浓度为2％。将样品加样于预先用RPC A缓冲液(0.1％三氟乙酸(TFA)，2％CAN，98％水)平衡的RESOURCETMRPC 3ml柱(GE Healthcare)。在用5个CV的RPC A缓冲液洗涤该柱之后，结合的蛋白质通过使用20个CV的线性梯度0-50％RPC B缓冲液(0.1％TFA，80％CAN，20％水)洗脱。流速为5ml/分钟，监测在280nm的信号。含有纯多肽的级分通过SDS-PAGE分析鉴别并集合。
将纯化的多肽的缓冲液更换为50mM Tris-HCl，pH 8.8，在一次性PD-10脱盐柱(GEHealthcare)上进行大小排阻层析。
成功纯化了这15个多肽变体中的如下12个多肽变体：His6-Z04665、His6-Z04672、His6-Z04674、His6-Z04687、His6-Z04770、His6-Z04775、His6-Z04776、His6-Z04777、His6-Z04778、His6-Z04780、His6-Z04781和His6-Z04899。
纯化的多肽的分析
通过使用NanoDropTMND-1000分光光度计测量在280nm的吸光度，从而确定多肽溶液的浓度。使用SDS-PAGE和LC-MS进一步分析蛋白质。
对于SDS-PAGE分析，将多肽溶液与LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，在74℃保温10分钟。将10μg每个多肽变体加样于
Figure GDA0002276722010000281
4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)。将该凝胶与MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen)在XCell SureLockTMMini-Cell(Invitrogen)中一起电泳，其采用
Figure GDA0002276722010000282
Sharp预染的蛋白质标准(Invitrogen)作为分子量标记，以及采用PhastGelTM Blue R(GE Healthcare)蛋白质染色溶液进行染色。
为了检验多肽变体，使用装备API-ESI和单四极质谱分析仪的Agilent1100LC/MSD系统进行LC/MS分析。将蛋白质样品在50mM Tris-HCl,pH8.8中稀释至终浓度为0.5mg/ml，将10μl加样于Zorbax 300SB-C18柱(4.6×150，3.5μm)(Agilent)，流速为1ml/分钟。溶液A含有在水中的0.1％TFA，溶液B含有在ACN中的0.1％TFA。使用22分钟线性梯度15％-65％溶液B以1ml/分钟流速洗脱蛋白质。在30℃进行分离。监测在280和220nm的离子信号和吸光度。纯化的蛋白质的分子量通过分析离子信号检验。
根据SDS-PAGE和LC/MS分析确定所述多肽变体的纯度高于95％。
解链温度(Tm)的确定
将纯化的多肽变体在50mM Tris-HCl,pH 8.8中稀释至终浓度为0.5mg/ml。在光程长度为1mm的小池中使用Jasco J-810分光偏振计进行圆二色性(CD)分析。在可变温度测量中，测量从20°至90℃在221nm的吸光度，温度斜度为5℃/分钟。通过确定CD vs.温度图示中转折点计算多肽解链温度(Tm)。结果见表8.
表8：Dynazyme结合多肽变体的Tm
名称 Tm(℃)
His<sub>6</sub>-Z04665 38
His<sub>6</sub>-Z04672 33
His<sub>6</sub>-Z04674 35
His<sub>6</sub>-Z04687 60
His<sub>6</sub>-Z04770 44
His<sub>6</sub>-Z04775 45
His<sub>6</sub>-Z04776 55
His<sub>6</sub>-Z04777 58
His<sub>6</sub>-Z04778 43
His<sub>6</sub>-Z04780 65
His<sub>6</sub>-Z04781 66
His<sub>6</sub>-Z04899 39
热稳定性分析
在加热后再折叠为原始 螺旋结构的能力是要求上述多肽变体具备的性质。为了研究结构可逆性，获得在20℃每个样品的两个CD光谱。在两次测量之间，将样品加热至96℃。将样品保持在96℃持续2分钟，然后冷却至20℃。在加热之前与之后相似的CD光谱证实样品的结构可逆性。12个分析的多肽变体中有3个多肽变体受热处理的负面影响，而其它9个变体示出完全恢复其 螺旋结构。在加热之前和之后的两个CD光谱的典型覆盖图示于图3。
Biacore结合分析
在Biacore仪器(GE Healthcare)中分析12个根据本发明选择的His6-标记的单体Z变体与Dynazyme之间的相互作用。将靶蛋白质固定化在CM5芯片表面(GE Healthcare)的羧化葡聚糖层上的流动池(flow cell)中。根据厂商指导，使用胺偶联化学及pH 5.5乙酸盐进行固定化。芯片上的一个流动池表面被激活和灭活，在分析物注射期间用作空白对照。所述分析物即在HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)中稀释至终浓度为10μM的多肽变体，将其以随机顺序一式两份注射5分钟，流速为10μl/分钟。在解离10分钟之后，注射一次0.05％SDS使表面再生。在BiaEvaluation软件(GE Healthcare)中分析结果。空白对照表面的曲线从配体曲线中减去。该分析示出5个多肽变体与固定化的Dynazyme的相互作用，如图4所示。
实施例5：本发明的多肽群的化学合成对比研究
概述
在这个实施例的实验中，描述了本发明的多肽群的固相合成(SPPS)，以及与基于原始支架的多肽合成的对比。在四个位置导入突变，即[N23T]、[A42S]、[A46S]和[A54S]，使得可以使用简便缩写为Fmoc-Xxx-Yyy-OH的假脯氨酸前体的另一种合成策略。在上述的三或四个位置中使用假脯氨酸，可以合成具有如下序列的全长分子：
SEQ A:maESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKKLNDSQAPK
(其中ma代表与多肽的N末端偶联的巯基乙酰基)；以及
SEQ B:AEAKYAKEMW IAWEEIRNLP NLNGWQMTAF IAKLLDDPSQ SSELLSEAKKLNDSQAPKC；
标准合成方法不能产生具有SEQ A的肽。
SEQ C的标准合成方法:AENKFNKEMW IAWEEIRNLP NLTGWQMTAF IASLLDDPSQSANLLAEAKK LNDAQAPK，其与SEQ B相似，但是含有原始支架氨基酸，导致非常不纯的制备物以及低肽产量。
新的丝氨酸或者苏氨酸的导入也使得可以使用异酰基二肽，其是另一种假脯氨酸，通过在肽合成期间降低聚集而增加合成效力(Sohma et al,Tetrahedron Lett.47:3013,2006)。一些这种构建模块可得自Novabiochem of Merck Biosciences AG。
基本原理
HER2结合分子ZHER2:342(在WO 2005/003156中作为ZHER2:107揭示，有时也称作Z00342)的肽合成以及DOTA与这个分子N末端的偶联是可能的，且在文献中描述(Orlova Aet al(2006)Cancer Research 67:2178-2186)。然而，观测到在合成之后肽产量的巨大变化。难以再现地合成肽可以与肽的长度以及原始氨基酸序列相关。此外，具有仍保护的氨基酸侧链的反应性基团的长肽可以产生不适宜的二级结构，例如折叠，其可扰乱固相肽合成(Quibell M and Johnson T in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A PracticalApproach,W.C.Chan,P.D.White Eds,Oxford University Press2000:115-135)。在肽合成期间防止二级结构形成的一种方式是使用假脯氨酸。如果氨基酸Yyy是丝氨酸、苏氨酸或者半胱氨酸，可以使用简便缩写为Fmoc-Xxx-Yyy-OH的假脯氨酸。这些假脯氨酸展示相近的脯氨酸样结构，具有与主链连接的侧链，可以通过酸处理而转变为正常氨基酸结构(Haack Tand Mutter M(1992)Tetrahedron Lett 33:1589-1592)。在Xxx位置是14个氨基酸(所有天然发生的氨基酸，除了Arg、Cys、His、Met、Pro、Thr之外)以及在Yyy位置是丝氨酸或者苏氨酸的假脯氨酸可商购。
亲代分子ZHER2:342在原始序列中无苏氨酸和半胱氨酸。丝氨酸仅见于位置33、39和41。假脯氨酸前体仅可用于丝氨酸41(Q40-S41)。对于两个其它丝氨酸，位置Xxx中的氨基酸阻止使用假脯氨酸，因为没有可利用的前体(R32-S33和P38-S39)。
在本发明的多肽群的多肽中导入突变的目的在于但不限于促进肽合成。尤其是在位置23、42、46和54的突变，即[N23T]、[A42S]、[A46S]和[A54S]，可具有在SPPS中解决两个鉴别的难题的能力：其使得可以使用假脯氨酸以及氨基酸位置21-26周围的关键区域通过用苏氨酸置换天冬酰胺而被变为位置23。
合成策略1
氨基酸序列SEQ A在全自动肽合成仪中在Fmoc-Lys(Boc)-Wang聚苯乙烯树脂上装配。这个树脂特别适于使用Fmoc-方法形成肽。将57个氨基酸(具有适当的侧链保护)偶联在该树脂上。在最后的步骤中，人工进行S-三苯甲基-保护的巯基乙酸的偶联。
步骤1:固相肽合成
将Fmoc-Lys(Boc)-Wang聚苯乙烯树脂移至具有搅拌器的SPPS反应器中。然后用Fmoc使树脂去保护开始合成，随后是如下文提供的一般描述进行Fmoc-Pro-OH偶联方法。再次进行这个步骤，然后依次进行Fmoc去保护及随后的氨基酸衍生物的偶联。在用异丙醚(IPE)最后洗涤该树脂之后，将肽树脂在减压下在干燥器中干燥。
进行标准Fmoc肽合成以及在四个位置使用假脯氨酸进行合成。对于标准肽合成，仅使用Fmoc-氨基酸。对于另一种肽合成，使用除了Fmoc-氨基酸之外的如下假脯氨酸：在位置22-23使用Fmoc-Leu-Thr-OH，在位置41-42使用Fmoc-Ser-Ser-OH，在位置45-46使用Fmoc-Leu-Ser-OH以及在位置53-54使用Fmoc-Asp-Ser-OH。
Fmoc去保护方法
将所述树脂也用在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中的20％哌啶处理，以实现N-α-Fmoc保护基团的裂解。然后用NMP洗涤该树脂。
偶联方法
氨基酸衍生物Pro57与Glu1自动偶联。将至多3eq的Fmoc-AA溶解于NMP中。为了偶联，加入在二甲基甲酰胺(DMF)中的2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)及在NMP中的sym.-三甲基吡啶(2,4,6-三甲基吡啶)。在室温混合所得溶液，之后导入所述树脂上。NMP用作溶剂。在60℃至少15分钟的偶联时间之后，用NMP洗涤该树脂。
在每次偶联方法之后，自动重复进行在DMF中的2-(1H-7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TATU)作为偶联剂以及二氯乙烷作为溶剂的的偶联，随后用醋酸酐加帽。
步骤2:巯基乙酸的偶联
使用5摩尔当量的氨基酸、2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)以及10当量的N-二异丙基乙胺(DIEA，得自LancasterSynthesis,Morecambe,England)进行乙酰化。S-三苯甲基-巯基乙酸得自AnaSpec Inc(SanJose,CA,USA)。
步骤3:从树脂中裂解，包括裂解剩余的保护基团
将肽树脂用三氟乙酸(TFA)在存在纯化水、乙二硫醇(EDT)和三异丙基硅烷(TIS)的条件下处理。在室温进行大约2小时裂解之后，将反应混合物冷却至大约0℃，加入碘化铵和二甲基硫化物以还原氧化的甲硫氨酸。在在大约0℃进行另外60分钟裂解之后，形成的碘用抗坏血酸还原。在过滤除出产物之后，将其在IPE中冷却沉淀，再次滤出，用IPE洗涤，在减压下干燥。
通过HPLC进行纯度分析
使用Vydac 218TP54(5μm，250×4.6mm)柱及在水中的0.1％TFA和1％乙腈以及在乙腈中的0.1％TFA分别作为溶剂A和B，通过反向HPLC确定长度为58个氨基酸的肽及一些中间体的纯度。所述柱温度设定在35℃。使用梯度为15-45％的溶剂B在30分钟内洗脱该柱，或者使用梯度为20-50％的溶剂B在30分钟内洗脱该柱。在220nm进行UV检测。通过面积归一化法计算纯度。
结果
通过分析性反向层析分析使用或者不使用假脯氨酸合成的具有序列SEQ A的分子的产量和纯度。为了跟随合成的行进，在一些偶联步骤之后取一小部分合成树脂，分析预期的肽中间体的存在、纯度和产量。图5A和5B示出对长度为41个氨基酸的肽中间体(氨基酸18-58)进行的HPLC分析。在肽合成的这个阶段，如果使用假脯氨酸进行合成，则鉴别一个具有适当序列的清晰的主肽峰(RT＝15.33分钟，产量49％)(图5A)。然而，标准Fmoc合成产生大量小的肽峰以及相似大小的两个主峰，但是产量较低。这两个峰之一(RT＝20.82分钟)被鉴别是具有适当序列的肽中间体(aa 18-58)(图5B)。只有使用假脯氨酸进行合成，才获得全长肽(氨基酸1-58)。图6A示出一个产物峰，最终肽的产量为26％。然而，标准Fmoc-合成法不能产生最终肽产物。对来自标准合成法的长度为49个氨基酸的中间体(氨基酸10-58)进行分析，表明不可检测到预期的中间体，且该合成失败(图6B)。
合成策略2
在具有整合的微波炉的全自动肽合成仪上使用Fmoc-策略装配两个分子。
在Fmoc-Cys(Trt)-Wang LL聚苯乙烯树脂上基于本发明的支架序列装配长度为59个氨基酸残基的SEQ B(具有适当的侧链保护)。
在Fmoc-Lys(Boc)-Wang LL聚苯乙烯树脂上基于原始
Figure GDA0002276722010000341
分子支架装配长度为58个氨基酸的SEQ C(具有适当的侧链保护)。
所述Wang树脂LL特别适于使用Fmoc策略形成肽。
步骤1:固相肽合成
通过合成仪(Liberty,CEM Corporation,NC USA)将聚苯乙烯树脂自动移至SPPS反应容器中。然后使用Fmoc去保护树脂开始合成，随后根据下文所述进行Fmoc-保护的氨基酸(Fmoc-AA)偶联方法。这个步骤之后再次进行Fmoc去保护，随后是根据序列的氨基酸衍生物的偶联。在最后用二氯甲烷(DCM)洗涤该树脂之后，将肽树脂在减压下干燥。通过标准Fmoc肽合成法产生完整的肽SEQ C，而在SEQ B中某些位置使用假脯氨酸，这可以对支架进行改良。使用如下假脯氨酸：在位置41-42使用Fmoc-Ser-Ser-OH，在位置45-46使用Fmoc-Leu-Ser-OH以及在位置53-54使用Fmoc-Asp-Ser-OH。
Fmoc去保护方法
将树脂用在NMP中的5％哌嗪通过微波照射处理，以达到N-α-Fmoc保护基团裂解。然后用NMP洗涤该树脂。
偶联方法
氨基酸衍生物Cys59与Ala1(对于SEQ B)以及Lys58与Ala1(对于SEQ C)自动偶联。将直至5当量的Fmoc-AA溶解于NMP中。为了偶联，将O-(苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和在二甲基甲酰胺(DMF)中的N-羟基苯并三唑(HOBt)及在NMP中的N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA)以摩尔比率1:1:1:2(AA/HBTU/HOBt/DIPEA)加入树脂中。通过反应容器底部放出的泡沫氮气搅动该混合物。在75-80℃使用微波照射增加能量进行至少5分钟偶联之后，用NMP洗涤该树脂。
在每次偶联方法之后，进行自动化醋酸酐加帽。
步骤2:从树脂中裂解，包括裂解剩余的保护基团
将肽树脂在存在纯化水、乙二硫醇(EDT)和三异丙基硅烷(TIS)的条件下用三氟乙酸(TFA)处理。在室温裂解大约2小时之后，过滤裂解混合物，将树脂用纯净的95％TFA/水漂洗。将滤物缓慢加入冷却的甲基叔丁基醚(MTBE)中。离心沉淀，除去MTBE。将该固体重悬于醚中，重复进行共三次。在最后一次除去醚之后，将该固体重悬于0.1％TFA/水中，蒸发剩余的醚，将该溶液冷冻之后冻干。
通过HPLC-MS进行纯度和质量分析
通过高效液相层析和线上质谱分析(HPLC-MS)确定肽的纯度，使用装备了电喷雾离子化(ESI)和单四极的Agilent 1100HPLC/MSD。运行HPLC，使用Zorbax 300SB C18(3.5μm，150×4.6mm)柱，0.1％TFA/水和0.1％TFA/乙腈(ACN)分别作为溶剂A和B。将该柱温度设定为30℃。使用15-55％梯度的溶剂B在40分钟内洗脱柱。在220nm进行UV检测。通过面积归一化法计算纯度。用于质量分析和评估的软件是ChemStation Rev.B.02.01.(Agilent)。
结果
通过分析性反向层析分析SEQ B和SEQ C分子的产量和纯度。在这两个合成中均获得全长肽，然而SEQ B的产量更高。图7A示出对于SEQ B出现一个预期质量的主要产物峰(RT＝41.48分钟)，最终肽产量为15％。发现产量为8％的另一峰(RT＝41.21分钟)具有72Da质量，高于全长产物的预期质量。据信这是由于在Cys59氨基酸残基的副反应所致。根据副反应的类型，其可以在合成期间或者在从树脂中裂解肽期间发生。通过优化合成和/或裂解方案，这个副反应可以最小化，从而增加产量，在这种情况中使总产量增加直至23％。
然而，SEQ C的标准Fmoc-合成产生大量小肽峰(图7B)。主峰之一(RT＝43.60min)被鉴别为具有预期质量的全长肽。这个产物的产量为4％。
实施例6：原始和本发明的多肽变体的免疫原性
概述
在这个实施例中，在体内对比一个原始的和一个本发明的多肽变体的免疫原性。给予大鼠二聚体分子，在抗药物抗体(ADA)测定中确定特异性抗体应答。具有本发明的导入的支架突变的分子与原始Z变体相比示出更低和更延迟的抗体应答。
多肽和克隆和产生
在这项研究中使用与白蛋白结合结构域ABD035(Jonsson et al(2008)ProteinEng Des Sel 8:515-27)融合的两个Taq-聚合酶特异性结合多肽：
1.(Z01154)2-ABD035:原始支架
2.(Z03229)2-ABD035:本发明的支架
将PCR扩增和杂交的具有AccI-突出端的Z01154和Z03229片段分别在AccI消化的pET(Novagen)衍生的表达载体pAY492和pAY1450中克隆为二聚体。所得载体用AccI-NotI消化，并且与已经PCR扩增的具有AccI和NotI突出端的ABD035片段连接，产生构建体pAY1827(编码MGSSLQ-[Z01154]-[Z01154]-VD-[ABD035])和pAY2292(编码MGSSLQ-[Z03229]-[Z03229]-VD-[ABD035])。将该质粒转化进感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，通过发酵产生蛋白质，基本如实施例3所述进行。将沉淀的细胞悬浮于[25mM Tris-HCl,200mM NaCl,1mM EDTA,25U/ml
Figure GDA0002276722010000361
(Merck,#1.01654.0001),pH 8.0]中，在冰上通过超声处理破坏。将澄清的上清加样于充满与人血清白蛋白内部结合的CNBr-激活的Sepharose(GEHealthcare,#17-0981-03)的柱中。将该柱预先用1×TST[25mM Tris-HCl,200mM NaCl,1mMEDTA,0.05％Tween 20,pH 8.0]平衡。在应用样品之后，用1×TST洗涤，随后用5mM NH4AcpH 5.5洗涤，直至观测到Abs280信号不再降低。结合的蛋白质用0.5M HAc,pH 2.8洗脱。洗脱的样品补加乙腈至终浓度为2％，通过在Resource RPC柱(GE Healthcare,#17-1182-01)上进行反向层析进一步纯化。[2％乙腈，在水中0.1％TFA]用作运行缓冲液，使用0-50％的[80％乙腈，在水中0.1％TFA]的线性梯度经过25个柱体积洗脱样品。使用HiPrep 26/10脱盐柱(GH Healthcare,#17-5087-01)，将缓冲液更换为[5mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.2]。样品纯度通过实施例3所述SDS-PAGE和LC/MS分析检验。根据厂商指导，在AffinityPakDetoxi-Gel内毒素去除凝胶(Thermo,#20344)上除去微量内毒素。在由APL(ApoteketProduktion&Laboratorier AB,Sweden)进行的凝胶-凝块LAL检测中未检测出内毒素。通过在Superdex 75 10/300柱(GE Healthcare,#17-5174-01)上进行大小排阻层析证实样品无可溶的聚集体，使用1×PBS作为运行缓冲液，流速为0.5ml/分钟，样品体积为100μl，样品浓度为1mg/ml。
给予和取样方案
根据当地动物伦理委员会许可在Agrisera AB(
Figure GDA0002276722010000371
Sweden)进行动物研究。将雌性Sprague Dawley大鼠分为三组，如表9所示皮下注射(Z01154)2-ABD035、(Z03229)2-ABD035或者对照缓冲液。在第0、4、7、14、21和28天注射。在第-1天(pre-serum)和第6、13、20和35天从每只动物收集250μl血样。所有动物均在第35天处死。收集的血样置于4℃凝集过夜，获得血清在-20℃贮存直至进行分析。
表9：样品给予方案
Figure GDA0002276722010000372
抗药物抗体(ADA)测定
为了分析抗-(Z01154)2-ABD035和抗-(Z03229)2-ABD035抗体的存在，进行三种类型的ELISA分析。最开始针对反应性抗体的存在筛选所有样品，随后通过证实测定证实特异性。随后滴定具有Z变体特异性抗体的血清样品，以量化抗-(Z01154)2-ABD035和抗-(Z03229)2-ABD035抗体的效价。
为了筛选血清样品，将ELISA平板(96-孔，一半面积平板，Costar,#3690)用在包被缓冲液(Sigma,#C3041)中稀释至终浓度为2μg/ml的(Z01154)2-ABD035或者(Z03229)2-ABD035包被过夜。每孔加入50μl包被溶液，将该平板在4℃保温过夜。用去离子水人工洗涤该平板两次，随后用100μl/孔的PBS-酪蛋白(PBS和0.5％Casein(Sigma,#8654))封闭2小时。除去封闭溶液，加入在封闭缓冲液中1:50稀释的血清样品(50μl/孔)。在室温保温1.5小时之后，在自动ELISA洗涤器(Scanwasher 300,Scatron)中用PBST(PBS和0.05％Tween 20(Acros Organics,#233362500))洗涤该平板。为了检测大鼠Z变体的抗体，加入50μl/孔的在PBS-酪蛋白中1:6000稀释的HRP-缀合的抗大鼠IgG(Southern Biotech,#3050-05)。在保温1小时后，如上述洗涤该平板，加入50μl/孔底物溶液(
Figure GDA0002276722010000381
TMB,Pierce,#34021)。将平板在室温在黑暗处保温，15分钟后加入50μl/孔的2M H2SO4(VWR,#14374-1)终止显色。在ELISA读数器(Victor3,Perkin Elmer)中在450nm读数该平板。
上述ELISA方法也用于证实和滴定ELISA测定，但是具有一些改变。对于证实测定，将血清样品在PBS-酪蛋白中或者在包含1μg/ml各个多肽变体的PBS-酪蛋白中1:50稀释。OD信号降低45％或更多的血清样品被认为含有Z变体的特异性抗体。对于滴定测定，将血清样品在PBS-酪蛋白中1:50稀释，然后进行2倍或者5倍系列稀释直至其越过平板特定切割点，以计算样品的效价。
在测定期间，确定如下关键参数：
·最小稀释度：1:50
·非特异性背景(NSB):正常大鼠血清(Sprague Dawley rats,Scanbur)集合的OD450，用作稀释基质且包含在整个分析的每个平板中。
·测定切割点(cut point)：30个个体的正常大鼠血清的平均OD450加上1.645倍平均值标准误差。针对(Z01154)2-ABD035和(Z03229)2-ABD035获得的数值是0.11。
·标准化因子：测定切割点分别除以(Z01154)2-ABD035和(Z03229)2-ABD035的NSB:1.87和1.86的平均OD450。
在样品分析期间，如下所述确定平板特定切割点：平板特异性NSB的平均OD450乘以标准化因子。
证实含有这两种多肽变体的抗体的大鼠血清(高免疫的(hyperimmunised)Sprague Dawley大鼠，Agrisera)用于制备阳性对照(PC)样品，在整个分析中每个平板上均包含对照样品：HighPC：在PBS-酪蛋白中最小稀释之前在基质中1:4稀释的阳性对照血清。这个PC的OD值高于测定/平板切割点。LowPC：在PBS-酪蛋白中最小稀释之前在基质中1:300稀释的阳性对照血清。这个PC具有刚刚高于测定/平板切割点的OD值。
使用LowPC和HighPC值制备效价质量对照物LoQC1-5和HiQC1-5。将LowPC和HighPC在PBS-酪蛋白中1:50稀释，分别获得LoQC1和HiQC1。然后将这些物质在PBS-酪蛋白中进一步稀释，分别获得LoQC2(1:100)、LoQC3(1:200)、LoQC4(1:400)和LoQC5(1:800)，以及HiQC2(1:250)、HiQC3(1:1250)、HiQC4(1:6250)和HiQC5(1:31250)。
使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc)计算效价。简而言之，根据log稀释度绘制OD450值图，样品的效价定义为在平板特定切割点的log稀释度。
结果
原始分子((Z01154)2-ABD035)与本发明分子((Z03229)2-ABD035)之间的体内对比示出本发明分子的免疫原性较低。个体之间的应答变化非常大，随着时间而增加。可以对比接受原始分子三个个体与接受本发明分子的两个个体确定效价。在接受本发明分子的实验组中实际效价更低(表10)。观测到更少的动物产生抗体应答的原因可归因于融合的ABD分子，其先前已经示出降低融合多肽的免疫原性(见例如WO 2005/097202)。
表10：给予原始的或者本发明的多肽变体的大鼠中的免疫应答
Figure GDA0002276722010000391
Figure IDA0000731037850000011
Figure IDA0000731037850000021

Claims (30)

1.对预定靶具有亲和性的多肽，其包含第一支架氨基酸序列：
EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ(SEQ.ID.No.1)
其中每个X相应于基于原始支架氨基酸序列的第二多肽中可随机化的氨基酸残基，以及其中所述第二多肽对所述预定靶具有亲和性。
2.根据权利要求1所述的多肽，其包含第一支架氨基酸序列：
AKYAK EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ(SEQ.ID.No.2)
其中每个X相应于基于原始支架氨基酸序列的第二多肽中可随机化的氨基酸残基，以及其中所述第二多肽对所述预定靶具有亲和性。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述第一支架氨基酸序列具有结构类似于一个SpA结构域的序列，其中三螺旋束蛋白质的疏水性核心中的氨基酸是保守的。
4.根据权利要求1-3任一项所述的多肽，所述多肽包含额外的氨基酸残基。
5.根据权利要求4所述的多肽，所述多肽在所述多肽C末端包含额外的氨基酸残基。
6.根据权利要求4所述的多肽，其中加入所述额外的氨基酸残基用以结合、产生、纯化、稳定、偶联或者检测所述多肽。
7.根据权利要求5所述的多肽，其中加入所述额外的氨基酸残基用以结合、产生、纯化、稳定、偶联或者检测所述多肽。
8.根据权利要求4所述的多肽，其中所述额外的氨基酸残基组成一或更多个多肽结构域。
9.根据权利要求5所述的多肽，其中所述额外的氨基酸残基组成一或更多个多肽结构域。
10.根据权利要求8-9任一项所述的多肽，其中所述一或更多个多肽结构域具有选自下组的功能：结合功能，酶功能，金属离子螯合功能以及荧光功能，或者这些功能的组合。
11.根据权利要求1-3和5-9任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含标记。
12.根据权利要求4所述的多肽，所述多肽进一步包含标记。
13.根据权利要求10所述的多肽，所述多肽进一步包含标记。
14.根据权利要求1-3、5-9和12-13任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含治疗剂。
15.根据权利要求4所述的多肽，所述多肽进一步包含治疗剂。
16.根据权利要求10所述的多肽，所述多肽进一步包含治疗剂。
17.根据权利要求11所述的多肽，所述多肽进一步包含治疗剂。
18.根据权利要求1-13任一项所述的多肽在制备检测试剂盒、捕获试剂盒或者分离试剂盒中的应用。
19.根据权利要求1-17任一项所述的多肽在制备药物中的应用。
20.根据权利要求1-17任一项所述的多肽在制备诊断试剂盒中的应用。
21.根据权利要求1-3、5-9、12-13和15-17任一项所述的多肽，其中所述靶是TNF-α。
22.根据权利要求1-3、5-9、12-13和15-17任一项所述的多肽，其中所述靶是胰岛素。
23.根据权利要求1-3、5-9、12-13和15-17任一项所述的多肽，其中所述靶是taq-聚合酶。
24.基于支架产生第一多肽的方法，包括如下步骤：
提供对预定靶具有亲和性的第二多肽，其中所述第二多肽基于具有结构类似于一个SpA结构域的序列的原始支架，其中三螺旋束蛋白质的疏水性核心中的氨基酸是保守的，以及
突变原始支架氨基酸，产生包含如下支架氨基酸序列的第一多肽：
EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ(SEQ.ID.No.1)，
其中每个X分别相应于第二多肽中保守的氨基酸残基。
25.根据权利要求24所述的方法，所述第一多肽包含如下支架氨基酸序列：
AKYAK EXXXAXXEIX XLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ(SEQ.ID.No.2)，
其中每个X分别相应于第二多肽中保守的氨基酸残基。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述原始支架包含选自如下的支架氨基酸序列：
EXXXAXXEIX XLPNLNXXQX XAFIXSLXDD PSQSANLLAE AKKLNDAQ，以及
NKFNK EXXXAXXEIX XLPNLNXXQX XAFIXSLXDD PSQSANLLAE AKKLNDAQ，
其中每个X分别相应于任何氨基酸残基。
27.根据权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含氨基酸序列：
ELGWAIGEIG TLPNLTHQQF RAFILKLWDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ，且其中所述预定靶是TNF-α。
28.根据权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含氨基酸序列：
EKYMAYGEIR LLPNLTHQQV MAFIDKLVDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ，且其中所述预定靶是胰岛素。
29.根据权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述第一多肽包含氨基酸序列：
EKGEAVVEIF RLPNLTGRQV KAFIAKLYDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ，且其中所述预定靶是taq-聚合酶。
30.根据权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述原始支架具有结构类似于一个SpA结构域B的序列且包含G29A突变，其中三螺旋束蛋白质的疏水性核心中的氨基酸是保守的，所述突变相应于SEQ ID NO:1中位置22的A以及SEQ ID NO:2中位置27的A。
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US9187535B2 (en) 2007-12-19 2015-11-17 Affibody Ab Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
US20120165650A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 General Electric Company Her2 binders
DK2977088T3 (en) * 2010-03-08 2017-10-09 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab IMMUNOGLOBULIN G FC REGION BINDING POLYPEPTIDE
KR101884654B1 (ko) 2010-07-09 2018-08-02 애피바디 에이비 폴리펩타이드
LT2714712T (lt) 2011-06-01 2016-11-25 Estetra S.P.R.L. Estetrolio tarpinių junginių gamybos būdas
US11053274B2 (en) 2011-06-01 2021-07-06 Estetra S.P.R.L. Process for the production of estetrol intermediates
EP2383279A1 (en) 2011-07-19 2011-11-02 Pantarhei Bioscience B.V. Process for the preparation of estetrol
MY167232A (en) 2012-02-20 2018-08-14 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polypeptides binding to human complement c5
WO2013143890A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 Affibody Ab Oral administration
US10155792B2 (en) 2012-09-25 2018-12-18 Affibody Ab Albumin binding polypeptide
PL2912051T3 (pl) 2012-10-25 2018-08-31 Affibody Ab Sposób rozdzielania białek zawierających domenę wiążącą albuminę
WO2014064237A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Affibody Ab Abd binding polypeptide
CN105473606A (zh) * 2013-08-28 2016-04-06 阿菲博迪公司 具有突变的支架的结合多肽
EP3083675B1 (en) 2013-12-20 2018-03-07 Affibody AB Engineered albumin binding polypeptide
KR102399024B1 (ko) * 2014-06-13 2022-05-17 애피바디 에이비 신규 폴리펩티드
KR102014056B1 (ko) * 2017-04-18 2019-08-27 앱클론(주) 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드, 이의 항체 또는 항원 결합 단편과의 복합체, 및 이들의 제조방법
CN111989342A (zh) 2018-04-18 2020-11-24 艾克隆株式会社 开关分子以及可转换嵌合抗原受体
EP3941581A2 (en) 2019-03-22 2022-01-26 Reflexion Pharmaceuticals, Inc. Multivalent d-peptidic compounds for target proteins
WO2020198074A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 Reflexion Pharmaceuticals, Inc. D-peptidic compounds for vegf
KR102502287B1 (ko) 2020-04-17 2023-02-22 앱클론(주) 항-her2 어피바디 및 이를 스위치 분자로 이용하는 스위처블 키메라 항원 수용체
KR102350655B1 (ko) 2020-10-13 2022-01-12 인센 주식회사 테스토스테론-특이적 어피바디 및 이의 용도
WO2023140360A1 (ja) * 2022-01-20 2023-07-27 京都府公立大学法人 抗体模倣分子

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1729018A (zh) * 2001-07-11 2006-02-01 马克西根控股公司 G－csf偶联物
WO2006092338A2 (en) * 2005-03-01 2006-09-08 Affibody Ab Tnf-alpha binding polypeptide , uses thereof and methods employing it

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US6740734B1 (en) * 1994-01-14 2004-05-25 Biovitrum Ab Bacterial receptor structures
US6602977B1 (en) * 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
AU2004253835B2 (en) 2003-07-04 2009-01-29 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for HER2
SE0301987D0 (sv) * 2003-07-04 2003-07-04 Affibody Ab New polypeptide
DE05733048T1 (de) * 2004-04-06 2007-05-10 Affibody Ab Serumalbuminbindende peptidkonjugate zur arzneimittelherstellung
GB0524788D0 (en) 2005-12-05 2006-01-11 Affibody Ab Polypeptides
US8426557B2 (en) * 2007-08-03 2013-04-23 Affibody Ab IGF-1R binding polypeptides and their use
US8124725B2 (en) * 2007-12-19 2012-02-28 General Electric Company PDGF-Rβ binders
US9187535B2 (en) * 2007-12-19 2015-11-17 Affibody Ab Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
ATE527353T1 (de) 2007-12-19 2011-10-15 Affibody Ab Pdgf-bindendes polypeptid aus protein a
US8937047B2 (en) * 2007-12-19 2015-01-20 General Electric Company Biokinetics of fast-clearing polypeptides
EP2077272A1 (en) 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1729018A (zh) * 2001-07-11 2006-02-01 马克西根控股公司 G－csf偶联物
WO2006092338A2 (en) * 2005-03-01 2006-09-08 Affibody Ab Tnf-alpha binding polypeptide , uses thereof and methods employing it

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Huang et al. A specific nanobody-based affinity chromatography resin as a platform for small ubiquitin-related modifier fusion protein purification
Aoki et al. Engineering a Low-Immunogenic Mirror-Image VHH against Vascular Endothelial Growth Factor
Díaz Perlas From phage display and venoms to protease-resistant peptides: Design of BBB-shuttles and peptides targeting EGF

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