WO2023140360A1 - 抗体模倣分子 - Google Patents

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WO2023140360A1
WO2023140360A1 PCT/JP2023/001741 JP2023001741W WO2023140360A1 WO 2023140360 A1 WO2023140360 A1 WO 2023140360A1 JP 2023001741 W JP2023001741 W JP 2023001741W WO 2023140360 A1 WO2023140360 A1 WO 2023140360A1
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WO
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molecule
csp
amino acid
antibody
csd
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PCT/JP2023/001741
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俊一 田中
心人 雨坂
和文 高野
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京都府公立大学法人
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to an antibody mimetic molecule and a method for producing the same.
  • Antibodies and antibody-mimicking molecules are used for pharmaceuticals, in vitro or in vivo diagnostic agents, and medical and biological tools such as ELISA.
  • Formulation processes for antibodies and antibody-mimetic molecules include cell culture using Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc., purification using column resin, sterilization using microfiltration membranes, and the like.
  • problems in these formulation processes include that microfiltration membranes are expensive, disposable, and costly, that filtration with microfiltration membranes cannot completely remove small-sized viruses and the like, and that endotoxin (lipopolysaccharide, a strong toxin, which is a component of the outer membrane of Escherichia coli) may be contaminated.
  • the high-pressure steam sterilization method using an autoclave has the advantage of being less costly than sterilization using a microfiltration membrane, capable of inactivating viruses, and promoting the inactivation of endotoxin toxins.
  • conventional antibodies and antibody-mimetic molecules are denatured by autoclaving and irreversibly rendered non-functional, and thus the above method cannot be used.
  • An object of the present invention is to obtain an autoclaveable antibody-mimicking molecule. Another object of the present invention is to provide a method for producing such an antibody-mimetic molecule.
  • the present inventors conducted intensive studies in order to solve the above problems. As a result, they conceived the idea of using a cold shock protein (CSP) or a cold shock domain (CSD) having refolding properties (structural restoration properties) as a skeleton of antibody mimetic molecules as a new antibody mimetic molecule, and found that the above problems could be solved thereby.
  • CSP cold shock protein
  • CSS cold shock domain
  • the present invention was completed by further studies based on such findings, and includes the following aspects. Section 1.
  • a cold shock protein (CSP) or cold shock domain (CSD) scaffold comprising at least one mutated structural surface amino acid;
  • An antibody-mimicking molecule that binds with a Kd of at least 10000 nM or less to a target molecule to which the CSP or CSD prior to the mutation introduction does not bind with a Kd of at least 10000 nM or less.
  • Section 2. 3. The antibody mimetic molecule of paragraph 1, wherein said mutated structural surface amino acid is contained in the loop region of the CSP or CSD.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 5. The antibody mimetic molecule according to any one of Items 1 to 4, wherein the CSP is derived from the hyperthermophile Thermotoga maritima.
  • Item 6. Item 3. The antibody mimetic molecule according to Item 1 or 2, wherein the CSD is of human origin.
  • Item 8. A nucleic acid molecule encoding the antibody mimetic molecule of any one of Clauses 1-7.
  • Item 9. An expression vector comprising the nucleic acid molecule of Item 8.
  • a nucleic acid library comprising the nucleic acid molecule of Item 8.
  • Item 11. Item 11.
  • a method for producing an antibody mimetic molecule that binds with a Kd of at least 10000 nM to a target molecule to which the CSP or CSD before the mutation is not bound with a Kd of at least 10000 nM (A) contacting a target molecule with a display library of polypeptides having a CSP or CSD scaffold containing at least one mutated structural surface amino acid, and selecting at least one polypeptide that binds to the target molecule with a Kd of at least 10000 nM; selecting a species polypeptide as said antibody mimetic molecule.
  • Item 13 Item 13.
  • Item 14 A CSP or CSD scaffolded antibody mimetic molecule comprising at least one mutated structural surface amino acid, The step of selecting at least one polypeptide that binds with a Kd of at least 10000 nM to a target molecule to which the CSP or CSD before the mutation is not bound with a Kd of at least 10000 nM, and that (A) contacts the target molecule with a display library of polypeptides having a backbone of CSP or CSD containing at least one mutated structural surface amino acid, and binds to the target molecule with a Kd of at least 10000 nM; A method comprising the step of selecting at least one polypeptide that binds to a target molecule with a Kd of at least 10000 nM as the antibody-mimicking molecule by repeating step (A) at least once using the at least
  • autoclavable antibody-mimicking molecules can be provided.
  • a method for producing such an antibody-mimicking molecule can be provided.
  • TmCSP The structure of TmCSP is shown.
  • TmCSP has four loop regions (AB loop, BC loop, CD loop and DE loop) on the surface of the structure.
  • WT wild-type TmCSP
  • mutant TmCSP AB3Ser, AB3Ser+4Ser, AB3Ser+2Ser, AB3Ser+1Ser, and BC5Ser.
  • Spectral measurements were performed at 20° C. (black) and 80° C. (grey) at concentrations of 0.10-0.20 mg/ml for each sample.
  • the vertical axis represents the average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol ⁇ 1 ), and the horizontal axis represents the wavelength (nm).
  • the results of secondary structure analysis of mutant TmCSP (BC5Ser+4Ser, CD3Ser, CD3Ser+4Ser, CD3Ser+2Ser, CD3Ser+1Ser, and CD7Ser) by CD spectrum measurement are shown. Spectral measurements were performed at 20° C. (black) and 80° C. (grey) at concentrations of 0.10-0.20 mg/ml for each sample.
  • the vertical axis represents the average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol ⁇ 1 ), and the horizontal axis represents the wavelength (nm).
  • the results of secondary structure analysis of mutant TmCSP (CD7Ser+4Ser, CD4Ser, DE7Ser, DE7Ser+4Ser, DE6Ser, and DE6Ser+4Ser) by CD spectrum measurement are shown. Spectral measurements were performed at 20° C. (black) and 80° C. (grey) at concentrations of 0.10-0.20 mg/ml for each sample.
  • the vertical axis represents the average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol ⁇ 1 ), and the horizontal axis represents the wavelength (nm).
  • the results of secondary structure analysis of mutant TmCSP (DE6Ser+2Ser, F37A, and F37S) by CD spectrum measurement are shown. Spectral measurements were performed at 20° C. (black) and 80° C. (grey) at concentrations of 0.10-0.20 mg/ml for each sample.
  • the vertical axis represents the average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol ⁇ 1 ), and the horizontal axis represents the wavelength (nm).
  • thermostability analysis by CD spectrum measurement of wild-type TmCSP (a) and mutant TmCSP (b) are shown. Shown is the mean molar residue ellipticity [ ⁇ ] at 210 nm (deg cm 2 dmol -1 ) of wild-type and mutant TmCSP at 20°C to 100°C.
  • the results of thermostability analysis by CD spectrum measurement of mutant TmCSP (c, d) are shown. Shown is the average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol ⁇ 1 ) at 210 nm for mutant TmCSPs from 20°C to 100°C.
  • thermostability analysis by CD spectrum measurement of mutant TmCSP (e, f) are shown. Shown is the average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol ⁇ 1 ) at 210 nm for mutant TmCSPs from 20°C to 100°C.
  • the results of thermostability analysis by CD spectrum measurement of mutant TmCSP (g, h) are shown. Shown is the average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol ⁇ 1 ) at 210 nm for mutant TmCSPs from 20°C to 100°C.
  • FIG. 2 shows the results of thermostability analysis of mutant TmCSP(i) by CD spectroscopy.
  • FIG. 2 shows secondary structure analysis results of the mutant TmCSP after freeze-drying by CD spectrum measurement.
  • FIG. 1 shows the results of thermostability analysis by CD spectrum measurement of mutant TmCSP after freeze-drying. Average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol -1 ) at 218 nm from 10°C to 100°C is shown.
  • Fig. 2 shows the results of analysis of binding ability of mutant TmCSP to target molecules before and after freeze-drying by gel filtration chromatography.
  • A before lyophilization
  • FIG. 2 shows secondary structure analysis results of the mutant TmCSP after freeze-drying by CD spectrum measurement.
  • FIG. 1 shows the results of thermostability analysis by CD spectrum measurement of mutant TmCSP after freeze-drying. Average molar residue ellipticity [ ⁇ ] (deg cm 2 dmol -1 ) at 218 nm from 10°C to 100°C.
  • Fig. 2 shows the results of analysis of binding ability
  • mutant hCSD human-derived CSD
  • results of thermal stability analysis by CD spectrum measurement of mutant hCSD (1H95, 1WFQ, 2YTX, and 2YTY) are shown.
  • the amino acid sequence of hCSD(2YTX), its three-dimensional structure, and the site of mutation introduction are shown.
  • results of secondary structure analysis of mutant hCSD(2YTX) (Ab3Ser, BC6Ser, BC6Ser+2Ser and BC6Ser+4Ser) by CD spectrum measurement are shown.
  • mutant hCSD(2YTX) BC6Ser+E18D/E25D, BC8Ser, CD4Ser and DE3Ser
  • results of secondary structure analysis of mutant hCSD(2YTX) DE4Ser, DE6Ser, C3S and C3V
  • results of secondary structure analysis of mutant hCSD(2YTX) C8S/A9S, F14S/F16S, F14Y/F16Y and F14Y/F16Y/F27Y
  • FIG. 2 shows the results of thermostability analysis of mutant hCSD(2YTX) (Ab3Ser, BC6Ser, BC6Ser+2Ser and BC6Ser+4Ser) by CD spectrum measurement.
  • FIG. 2 shows the results of thermal stability analysis of mutant hCSD(2YTX) (BC6Ser+E18D/E25D, BC8Ser, CD4Ser and DE3Ser) by CD spectrum measurement.
  • Fig. 2 shows the results of thermostability analysis of mutant hCSD(2YTX) (DE4Ser, DE6Ser, C3S and C3V) by CD spectrum measurement.
  • Antibody mimetic molecules of the present invention are based on a cold shock protein (CSP) or cold shock domain (CSD) containing at least one mutated structural surface amino acid.
  • CSP cold shock protein
  • CSS cold shock domain
  • the antibody-mimicking molecule of the present invention binds to a target molecule to which the CSP or CSD before the introduction of the mutation does not bind or does not bind so strongly.
  • Target molecule includes proteins and nucleic acids.
  • the affinity of the antibody-mimicking molecule of the present invention for a target molecule can be represented by an equilibrium dissociation constant (Kd value), which is preferably 10000 nM or less, more preferably 8000 nM or less, even more preferably 6000 nM or less, particularly preferably 4000 nM or less, and most preferably 2000 nM or less.
  • Kd value equilibrium dissociation constant
  • the method for measuring the equilibrium dissociation constant (Kd value) in the present invention is not particularly limited, and flow cytometry, surface plasmon resonance (SPR), isothermal titration calorimetry (ITC), etc. can be used. Specifically, for example, it can be measured using a flow cytometer (fluorescence activated cell sorting; FACS), Biacore (registered trademark), an isothermal titration calorimeter, or the like.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • Biacore registered trademark
  • an isothermal titration calorimeter or the like.
  • structural surface amino acid refers to an amino acid exposed on the surface of the CSP or CSD conformation.
  • the antibody mimetic molecule of the present invention contains at least one mutated structural surface amino acid. Due to the partial conformational change that accompanies the introduction of such mutations, the antibody-mimetic molecules of the present invention will bind to target molecules to which the CSP or CSD before the mutations do not bind or do not bind so strongly. Selection of molecules having such binding properties for any target molecule can be performed by screening using a display library of polypeptides based on CSP or CSD containing at least one mutated structural surface amino acid, and such techniques are well known. Mutagenesis methods for constructing a polypeptide display library include, for example, the Kunkel method, QuikChange method, Inverse PCR method, Overlap-extension method, and artificial gene synthesis.
  • CSP or CSD contains a loop structure and a ⁇ -sheet structure.
  • the mutated structural surface amino acid may be contained in the loop region of the CSP or CSD, or may be contained in the ⁇ -sheet region.
  • the mutated structural surface amino acids do not affect the conformation of CSP or CSD, except for the partial conformational changes that contribute to binding to target molecules as described above.
  • mutation refers to, for example, substitution, deletion, insertion, etc. of amino acid residues.
  • the biological species from which the CSP or CSD, which is the skeleton of the antibody-mimetic molecule of the present invention, is derived is not particularly limited, and can be selected from any biological species including animals, plants, and microorganisms.
  • CSP derived from thermophilic bacteria or CSD derived from humans can be used.
  • thermophilic bacteria include thermophiles and hyperthermophiles.
  • thermophiles include, but are not limited to, Pseudothermotoga hypogea, Pseudothermotoga thermorum, Thermotoga profunda, Thermodesulfobacterium ses, Thermodesulfobacterium hveragerdense, Thermosipho melanesiensis, Thermodesulfobacterium thermophilum, Thermodesulfatator atlanticus, Thermodesulfatator atlantic us, Caldimicrobium thiodismutans, Fervidobacterium gondwanense, Thermodesulfobacterium geofontis, Fervidobacterium pennivorans, Fervidobacterium changbaicum, Fervidobacterium nodosum, Thermodesulfobacterium hydrogeniphilum, Kosmotoga arenicorallina, Kosmotoga pacifica, Thermoactinomyces vulgaris, Thermosulfurimonas dismutans and the like.
  • hyperthermophiles include, but are not limited to, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Aquifex pyrophilus, Thermocrinis ruber, and Fervidobacterium thailandense.
  • the antibody-mimicking molecule of the present invention preferably has 80% or more homology, more preferably 85% or more homology, and even more preferably 90% or more homology with any one of the hyperthermophile Thermotoga maritima-derived CSP amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the human-derived CSD amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3 to 12.
  • the % homology of two or more amino acid sequences is determined by Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) using default parameters.
  • CSP or CSD has refolding properties (structural restoration properties). This property allows the antibody mimetic molecules of the present invention to be autoclaved (ie, heat and/or pressure treated), as well as freeze-dried and freeze-thaw treated.
  • refolding property means the property that a denatured protein is rewound into an active native structure or a structure closer to the native structure. Therefore, in the present invention, the term “refolding property (structure restoring property)” is a concept including recovery of the three-dimensional structure of the denatured protein and recovery of protein function by the recovery of the three-dimensional structure.
  • Causes of protein denaturation are not particularly limited, and include heating, pressurization, freeze-drying, freeze-thawing, ultrasonic waves, physical factors (vigorous stirring, etc.), chemical factors (pH, organic solvents, surfactants, heavy metal solutions, etc.). Among them, heating, pressurization, freeze-drying, and freeze-thawing are preferable as factors for protein denaturation.
  • the recovery of the denatured protein's three-dimensional structure can be verified by analyzing and comparing the secondary, tertiary, or quaternary structure of the protein before and after denaturation.
  • the restoration of the function of the denatured protein can be verified by analyzing and comparing the function of the protein before and after denaturation (for example, the ability to bind to the target molecule, etc.).
  • the refolding properties of the antibody-mimicking molecule of the present invention can be expressed, for example, as the recovery ratio (%) of the ability of the antibody-mimicking molecule to bind to the target molecule after denaturation when the binding ability of the antibody-mimicking molecule to the target molecule before denaturation is 100%, and can be measured, for example, using gel filtration chromatography.
  • the recovery rate of binding ability to the target molecule after denaturation of the antibody-mimicking molecule of the present invention is preferably 20% or more, more preferably 25% or more, even more preferably 40% or more, particularly preferably 50% or more, and most preferably 90% or more.
  • the three-dimensional structure (secondary structure) of the antibody-mimetic molecule before and after denaturation can be analyzed, for example, by circular dichroism dispersion (CD) spectrum measurement, gel filtration chromatography, and the like.
  • CD circular dichroism dispersion
  • the recovery rate of the secondary structure after denaturation of the antibody mimetic molecule of the present invention is judged to be 100% when the spectra of the antibody mimetic molecule before and after denaturation match.
  • the recovery rate of the secondary structure after denaturation of the antibody-mimicking molecule of the present invention is calculated by the same method as the recovery rate of the binding ability to the target molecule of the antibody-mimicking molecule before and after the denaturation, and shows the same value.
  • the recovery rate of the secondary structure after denaturation of the antibody mimetic molecule of the present invention is preferably 20% or more, more preferably 25% or more, even more preferably 40% or more, particularly preferably 50% or more, and most preferably 90% or more.
  • the method for analyzing the three-dimensional structure (tertiary structure and quaternary structure) of the antibody-mimetic molecule before and after denaturation is not particularly limited, and includes X-ray crystal structure analysis and nuclear magnetic resonance (NMR) analysis.
  • the antibody-mimicking molecule of the present invention exhibits affinity and refolding properties for the target molecule as described above due to the three-dimensional structure of the mutated CSP or CSD. Therefore, as long as such affinity and refolding properties are not lost, the antibody-mimetic molecule of the present invention may have a skeleton of the mutated CSP or CSD and another structure added thereto.
  • the antibody mimetic molecule of the present invention can be lyophilized.
  • the method of freeze-drying is not particularly limited, and for example, a method of freezing with liquid nitrogen and then drying with a freeze-dryer can be mentioned.
  • the freeze-drying treatment may be performed before autoclaving or after autoclaving.
  • nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule that encodes the antibody mimetic molecule.
  • the expression vector of the present invention is an expression vector containing a nucleic acid molecule encoding the antibody mimetic molecule. More specifically, the expression vector of the present invention is an expression vector in which said nucleic acid molecule is linked under the control of a suitable promoter.
  • the expression vector of the present invention is not particularly limited, but for the E. coli expression system, for example, pBlueScript-based vector (Agilent Technologies), pUC-based vector (TaKaRa), pET-based vector (Novagen), pCold-based vector (TaKaRa), etc. can be used.
  • pBlueScript-based vector Agilent Technologies
  • pUC-based vector TaKaRa
  • pET-based vector Novagen
  • pCold-based vector TaKaRa
  • yeast expression systems pYD1-based vectors (Invitrogen), pPICZ-based vectors (Invitrogen), and the like can be used.
  • nucleic acid library of the present invention is a nucleic acid library containing nucleic acid molecules that encode the antibody-mimicking molecules.
  • the nucleic acid library of the present invention provides the peptide display library of the present invention.
  • the peptide display library of the present invention is a peptide display library derived from a nucleic acid library containing nucleic acid molecules encoding the antibody mimetic molecule.
  • the peptide display library of the invention is a display library of CSP- or CSD-backbone polypeptides comprising at least one mutated structural surface amino acid.
  • Examples of methods for introducing mutations for creating the display library of the present invention include the Kunkel method, QuikChange method, Inverse PCR method, Overlap-extension method, and artificial gene synthesis.
  • the peptide display library of the present invention can be used for screening the antibody-mimicking molecules of the present invention.
  • the use of the peptide display library of the present invention is not particularly limited, and it can be used, for example, as a kit for identifying the amino acid sequence of a polypeptide that specifically binds to a specific target molecule.
  • Antibody-mimicking molecules of the present invention can be selected by a method of contacting target molecules with a library of candidate polypeptides.
  • a method for producing an antibody mimetic molecule of the present invention comprises: (A) contacting a target molecule with a display library of CSP or CSD scaffolded polypeptides containing at least one mutated structural surface amino acid and selecting at least one polypeptide that binds to the target molecule with a Kd of at least 10000 nM strength; (B) repeating step (A) at least once using at least one polypeptide selected in step (A) to select at least one polypeptide that binds to the target molecule with a Kd of at least 10000 nM as the antibody-mimicking molecule.
  • the method for producing an antibody-mimicking molecule of the present invention may further comprise (C) a step of heating and/or pressurizing the obtained antibody-mimicking molecule after the above steps (A) and (B).
  • step (C) the conditions for heating and/or pressure treatment can be set as appropriate.
  • the heating temperature in step (C) is not particularly limited, but is preferably 70 to 200°C, more preferably 80 to 150°C, and even more preferably 90 to 130°C.
  • the pressurization conditions in step (C) are not particularly limited, but are preferably 1 to 5 atmospheres, more preferably 1 to 4 atmospheres, and even more preferably 1 to 3 atmospheres.
  • the heating and/or pressurization time in step (C) is not particularly limited, but is preferably 3 to 60 minutes, more preferably 4 to 45 minutes, and even more preferably 5 to 30 minutes.
  • step (C) an autoclave can be used for heating and/or pressure treatment.
  • bactericidal, virucidal, and endotoxin inactivation can be performed efficiently and at low cost in the obtained antibody-mimicking molecule, making it easy to formulate.
  • the antibody-mimicking molecules of the present invention preferably include, but are not limited to, pharmaceutical compositions, cytooptic reagents added to cultured cells, diagnostic tools used in ELISA, FACS, and the like, kits provided with antibody-mimicking molecules, and the like, and the present disclosure includes everything disclosed herein and recognized by those skilled in the art.
  • CSP is a protein with excellent refolding properties and has multiple loop regions on its structural surface.
  • CSP originally binds non-specifically to nucleic acids and has no binding ability to proteins.
  • the purpose of the present invention is to create a mutant CSP by comprehensively mutating and diversifying the amino acid residues that make up the loop region on the structural surface of the CSP, and to obtain an antibody-mimicking molecule in which the loop region of the CSP functions as an antigen-binding site and maintains refolding properties.
  • TmCSP Thermotoga maritima-derived Cold Shock Protein derived from hyperthermophiles has five ⁇ -sheets A to E, and four loop regions (AB loop, BC loop, CD loop, and DE loop) on the structural surface (Fig. 1).
  • the amino acid sequence of TmCSP (SEQ ID NO: 1) is shown below.
  • sequences surrounded by boxes in the amino acid sequence above indicate the amino acid sequences that constitute the four loop regions of TmCSP, respectively. That is, the amino acid sequence of the AB loop is SKK, the amino acid sequence of the BC loop is KDEGG, the amino acid sequence of the CD loop is HWSAIMEMEGFKTLKEGQ, and the amino acid sequence of the DE loop is QEGKKGP.
  • the underlined portion indicates a hydrophobic amino acid, the side chain of which points toward the hydrophobic core inside the TmCSP structure.
  • a mutation was introduced to replace any amino acid residue with a serine residue (in this specification, sometimes referred to as "Ser” or “S”) in the amino acid sequence that constitutes each loop region.
  • Ser serine residue
  • Table 1 shows mutation introduction sites in each loop region.
  • TmCSP (2) Preparation of Mutated TmCSP (2-1) Cloning of TmCSP Gene
  • the gene sequence of wild-type TmCSP (SEQ ID NO: 2) was amplified by PCR. Amplified gene fragments were separated by agarose gel electrophoresis and purified. The purified gene fragment was digested with BamHI and XhoI at 37° C. overnight. The gene fragment after restriction enzyme treatment was separated by agarose gel electrophoresis and purified. The resulting gene fragment was inserted into the BamHI/XhoI site of the pHET vector.
  • Escherichia coli competent cells JM109 were transformed with the ligated plasmid DNA.
  • the transformed JM109 was cultured and plasmid extraction was performed. It was confirmed by DNA sequencing that Ser was added to the designated site.
  • the collected target protein solution was poured into a Vivaspin Turbo 15 centrifugal ultrafiltration filter (Sartorius) with a 3 kDa cutoff, and centrifuged repeatedly at an acceleration of 4,000 x g until it was concentrated to 2.5 mL using a high-speed refrigerated centrifuge cooled to 4°C. After that, AKTA FPLC was used and replaced with 1 ⁇ PBS buffer. A HiLoad 16/60 Superdex 200pg (Cytiva) was loaded with the concentrated protein solution and the sample was run at a flow rate of 1.0 ml/min. Contaminant proteins were separated from the target protein to increase its purity. Collected samples were concentrated to a concentration of 1 mg/ml.
  • Tm value The thermal denaturation temperature at which the secondary structure of wild-type TmCSP and mutated TmCSP changes was calculated using the thermal denaturation analysis program Spectra Manager (JASCO) (Table 3).
  • the mutant TmCSPs in which the AB loop or CD loop was mutated maintained high thermal stability (Fig. 3-1 b, Fig. 3-2 d).
  • mutant TmCSPs (AB3Ser+1Ser, AB3Ser+2Ser, AB3Ser+4Ser, CD3Ser+1Ser, CD3Ser+2Ser, and CD3Ser+4Ser), which were elongated by inserting one, two, or four serine residues in addition to the substitution of amino acid residues contained in the loop region with serine residues, showed a decrease in the Tm value of up to about 30°C compared to the wild-type TmCSP. was observed (Fig. 3-1 b, Fig. 3-2 d).
  • mutant TmCSPs in which the BC loop or DE loop is mutated there are mutant TmCSPs in which the amino acid residues contained in the loop region are replaced with serine residues (BC5Ser, DE7Ser, and DE6Ser), and mutant TmCSPs in which the amino acid residues contained in the loop region are replaced with serine residues, and in addition, two or four serine residues are inserted and extended (BC5Ser+4Ser, DE7Ser+4Ser, DE6Ser +2Ser, and DE6Ser+4Ser) all maintained high thermal stability (Fig. 3-2 c, Fig. 3-4 g, h).
  • TmCSP is extremely tolerant of mutations caused by amino acid residue substitutions and consecutive amino acid residue insertions, except for mutations caused by insertion of amino acid residues in the short loop region.
  • TmCSP was shown to be effective as a scaffold for highly thermostable antibody-mimicking molecules.
  • Example 2 Preparation of antibody-mimicking molecules (1) Preparation of gene library (1-1) Preparation of dU-ssDNA Competent cells CJ236 (Cm-resistant, Takara Bio) were transformed with Phagemid (a derivative vector based on pBluescript II SK(+) (Agilent), Amp-resistant) containing a protein gene in which full-length pIII was fused to the C-terminal side of TmCSP, and LB plate medium (Amp 100 ⁇ g/mL, Cm 10 ⁇ g/mL) was transformed. , both final concentrations).
  • Phagemid a derivative vector based on pBluescript II SK(+) (Agilent), Amp-resistant
  • Kan was added to a final concentration of 70 ⁇ g/mL, and cultured overnight at 37° C. and 160 rpm.
  • the culture solution was equally divided into four sterilized 50 mL falcon tubes, centrifuged at 8,500 rpm at 4°C for 60 min, and the supernatant was transferred to new sterilized 50 mL falcon tubes.
  • the supernatant was transferred to a new sterilized 50 mL Falcon tube, to which 7.5 mL of PEG/NaCL solution (polyethylene glycol (average mol wt 8,000, Sigma-Aldrich) 66.6 g and NaCL 78 g dissolved in 317 mL MilliQ water, sterilized) was added and stirred. After that, it was allowed to stand on ice for 60 minutes. After centrifugation at 8,500 rpm and 4°C for 60 minutes, the supernatant was discarded and the precipitate was recovered.
  • PEG/NaCL solution polyethylene glycol (average mol wt 8,000, Sigma-Aldrich) 66.6 g and NaCL 78 g dissolved in 317 mL MilliQ water, sterilized
  • Precipitates in four Falcon tubes were dissolved in 1 mL of TBS (20 mM Tris-HCL pH 8.0, 150 mM NaCL), transferred to microtubes, and centrifuged at 15,000 rpm at 4°C for 5 minutes. After collecting the supernatant, 250 ⁇ L of PEG/NaCL solution was added to the supernatant and stirred. After that, it was allowed to stand on ice for 30 minutes. After centrifugation at 15,000 rpm and 4°C for 30 minutes, the supernatant was discarded and the precipitate was collected. The precipitate was dissolved with 500 ⁇ L of TBS, and then centrifuged at 15,000 rpm at 4°C for 5 minutes to collect the supernatant. For the M13KO7 phage contained in the collected supernatant, dU-ssDNA was purified using QIAprep (trademark) Spin M13 (QIAGEN) according to the protocol of the product.
  • QIAprep trademark
  • 5'-terminal phosphorylated oligo DNA was annealed to dU-ssDNA.
  • the annealing reaction was carried out in the order of 70°C for 12 min, lowering the temperature to 37°C at 0.1°C/sec, and 37°C for 20 min.
  • the culture solution was divided into two 500 mL centrifuge tubes (250 mL each) and centrifuged at 5,000 rpm and 2°C for 5 min. The supernatant was discarded, the precipitate was suspended in sterilized MilliQ water, centrifuged again at 5,000 rpm and 2°C for 5 minutes, and the supernatant was discarded. Again, washing with sterilized 1 mM HEPES-Na Buffer and washing with sterilized MilliQ water were performed once each, and then 350 ⁇ L of sterilized MilliQ water was added to the precipitate to suspend it.
  • Hetero-DNA prepared by the Kunkel method was purified using FastGeneTM gel/PCR extraction kit (Nippon Gene).
  • Purified Hetero-DNA and 350 ⁇ L of suspension of SS320 were mixed and transformed with 2.5 KV electric pulse using BIO-RAD's PULSE CONTROLLER PLUS and BIO-RAD's GENE PULSERTM II. As soon as the electric pulse was finished, 1 mL of SOC medium was added. Furthermore, 50 mL of SOC medium was added, and recovery culture was then performed for 1 hour at 37°C and 120 rpm agitation.
  • the titer was measured using the culture solution after the recovery culture was completed. Specifically, the culture solution was diluted to 10-2 to 10-6 with TBS, 5 ⁇ L of each dilution was spread on LB plate medium (Amp 100 ⁇ g/mL, Spec 50 ⁇ g/mL, both final concentrations), and the titer was calculated from the number of colonies.
  • the SOC solution was added to 500 mL of 2xYT (Amp 100 ⁇ g/mL, Spec 50 ⁇ g/mL, both final concentrations) and cultured overnight at 37°C with stirring at 120 rpm. Bacteria were collected equally into 6 sterilized falcon tubes (approximately 90 mL of culture solution was collected per tube). In this collection, centrifugation was performed at 5,000 rpm and 4°C for 10 minutes. DNA was extracted from one Falcon tube of the collected cells using Wizard (trademark) Plus Midipreps DNA Purification System (Promega). DNA was eluted with 300 ⁇ L of sterile MilliQ water.
  • the reaction solution after restriction enzyme treatment was divided into 3 equal parts (about 33 ⁇ L each) and purified with FastGene TM gel/PCR extraction kit (Nippon Gene).
  • SS320 (containing pMCSG1) was transformed with the purified Mutagenized-DNA.
  • the SOC culture medium was added to 500 mL of 2xYT (Carb 100 ⁇ g/mL, Spec 50 ⁇ g/mL, IPTG 0.2 mM, Hyperphage M13KO7 ⁇ pIII (PROGEN) 9.0 ⁇ 10 9 pfu/mL) and cultured overnight at 37° C. with stirring at 120 rpm.
  • the culture medium was divided into 277 mL portions, placed in centrifugation tubes, centrifuged at 8,500 rpm and 4°C for 30 minutes, and the obtained supernatants were transferred to new centrifugation tubes. Then, a PEG/NaCL solution of 1/5 volume of the supernatant liquid was added, stirred, and allowed to stand on ice for 1 hour. After centrifuging at 8,500 rpm and 4°C for 1 hour and discarding the supernatant, each precipitate was dissolved with 30 mL of TBS Buffer.
  • biotinylated antigen model proteins Six types of antigen model proteins were selected: green fluorescent protein (EGFP), maltose binding protein (MBP), ubiquitin-like protein (ySUMO), thermophile-derived esterase (AacEst), adenylate kinase (Adktm), and E. coli ribonuclease HII (EcRNHII). Inserted into the BamHI/XhoI site. The protein expressed by this construct is fused with His10tag, Avitag, TEV protease recognition site, and antigen model protein from the N-terminal side. E.
  • EGFP green fluorescent protein
  • MBP maltose binding protein
  • ySUMO ubiquitin-like protein
  • Adktm thermophile-derived esterase
  • Adktm adenylate kinase
  • EcRNHII E. coli ribonuclease HII
  • coli BL21DE3E was transformed using the prepared plasmid and pBirA plasmid (pACYC184 vector with BirA gene inserted, Cm resistant), and plated on an LB plate medium (Kan 50 ⁇ g/mL, Cm 10 ⁇ g/mL, both final concentrations). A single colony was picked, inoculated into 2xYT medium (Kan 50 ⁇ g/mL, Cm 10 ⁇ g/mL, both final concentrations), and cultured with shaking at 37° C. and 120 rpm until OD600 reached 0.5.
  • D-Biotin was added to a final concentration of 200 ⁇ M and IPTG was added to a final concentration of 0.2 mM, and expression was induced overnight at 18° C. and 120 rpm.
  • the culture solution was centrifuged at 8,000 rpm and 4°C for 10 min to collect bacteria. After suspending the collected cells in TBS, they were sonicated.
  • the crushed solution was centrifuged at 18,000 ⁇ g and 4° C. for 30 minutes to collect the supernatant.
  • the obtained supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m filter for clarification, and then purified using an affinity chromatography column HisTrap FF (Cytiva).
  • the column purification used 20 mM Imidazole, 20 mM Tris-HCL pH 8.0, 500 mM NaCL as the binding buffer and 500 mM Imidazole, 20 mM Tris-HCL pH 8.0, 500 mM NaCL as the elution buffer.
  • the collected fractions containing the target protein were clarified by passing through a 0.45 ⁇ m filter, and then applied to a size exclusion chromatography column HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (Cytiva). Fractions containing the protein of interest were determined by SDS-PAGE analysis and collected. TBS was used as an elution buffer for this column purification.
  • EGFP, MBP, ySUMO, AacEst, Adktm, and EcRNHII were used as antigen model target proteins, and the protein concentrations in each round were 100 nM: 1st round, 100 nM: 2nd round, 50 nM: 3rd round, and 50 nM: 4th round.
  • the AB/CD loop and DE loop gene fragments in the phage clones obtained for the above six target proteins were amplified by PCR using the oligo DNA shown in Table 9.
  • yeast surface display vector (derived vector based on pYD1 (Invitrogen)) was linearized by digestion with NcoI and XhoI and introduced into yeast EBY100 (ATCC). Using the principle of homologous recombination in yeast cells, the AB/CD loop and DE loop genes were shuffled. After that, sorting was performed using a flow cytometer (JSAN cell sorter, Bay Bioscience Co., Ltd.). These series of experimental operations were basically carried out according to the method described in Koide et al.'s report [Affinity maturation of single-domain antibodies by yeast surface display. Methods Mol. In addition, multiple rounds of selection by a flow cytometer were performed with different target protein concentrations, and Table 10 shows the target protein concentrations in each round. Furthermore, Table 11 shows reagents for fluorescent labeling used in sorting with a flow cytometer.
  • CSPs CSP(EGFP_01), CSP(EGFP_02), CSP(EGFP_03), CSP(EGFP_04), CSP(MBP_01), CSP(ySUMO_01), CSP(ySUMO_02), CSP(ySUMO_03), CSP(ySUMO_0 4), CSP(ySUMO_05)
  • Phagemid Amp-resistant
  • LB plate medium Amp 100 ⁇ g/mL, Tet 10 ⁇ g/mL, Spec 50 ⁇ g/mL.
  • a single colony was picked from the plate and inoculated into 3 mL of 2 ⁇ YT medium (Amp 100 ⁇ g/mL, Tet 10 ⁇ g/mL, Spec 50 ⁇ g/mL) using a test tube. Shaking culture was performed under the conditions of 37° C. and 140 rpm until growth of the cells was visually confirmed. Hyperphage was added to a final concentration of 1 ⁇ 10 10 pfu/mL and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. IPTG was added to a final concentration of 0.2 mM, and the cells were cultured overnight at 37°C and 140 rpm. 1 mL of the culture medium was centrifuged at 15,000 rpm for 15 min at 4°C, and the supernatant was recovered.
  • biotinylated antigen model protein (EGFP, MBP, ySUMO) was added, and immobilization reaction was carried out for 30 minutes while stirring at 25° C. and 110 rpm.
  • the remaining biotinylated antigen model protein solution was discarded and washed twice with 200 ⁇ L of TBS.
  • 45 ⁇ L of the phage solution and 5 ⁇ L of 5% (w/v) BSA solution were mixed and put into each well, and the binding reaction was performed for 40 min while stirring at 25° C. and 110 rpm.
  • the remaining phage solution was discarded and washed 5 times with 200 ⁇ L of TBS/0.1% (v/v) TWEEN (registered trademark)-20 (hereinafter referred to as TBST).
  • An anti-M13-HRP conjugated (0.15 ⁇ g/mL) solution diluted with TBST was added at 50 ⁇ L/well, and bound with stirring under the conditions of 25°C, 40 min, and 110 rpm.
  • the remaining anti-M13-HRP conjugated solution was discarded, and washed 4 times with 200 ⁇ L of TBST. Furthermore, it was washed once with 200 ⁇ L of TBS.
  • the presence or absence of specific binding ability was determined by comparing the median value of fluorescence intensity that increases with binding to the concentration of each target protein. More specifically, when the median fluorescence intensity for the target protein was set to 1, relative values for non-target proteins were calculated and compared (Fig. 7).
  • the dissociation constant Kd value was calculated by plotting the median value of fluorescence intensity that increases with binding (median value) against the concentration of each target protein and fitting the plot with a 1:1 binding model. SigmaPlot software (Systat Software) was used in this fitting.
  • Escherichia coli BL21DE3 was transformed with the pHFT2 vector into which the CSP gene was inserted. This transformant was cultured in 2xYT medium (Kan 50 ⁇ g/mL, final concentration) with shaking at 37°C and 120 rpm until the OD600 value reached 0.5. IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM, and expression was induced overnight at 18°C and 120 rpm. The culture solution was centrifuged at 8,000 rpm and 4°C for 10 minutes to collect bacteria.
  • the collected cells were suspended in a suspension buffer (20 mM Tris-HCL pH 8.0, 0.5 mg/mL lysozyme, 10 ⁇ g/mL DNase I, 10 ⁇ g/mL RNase I, 5 mM MgCl2, all final concentrations) and left at 37°C for 1 hour to disrupt the cells and degrade DNA/RNA.
  • NaCL was added to the solution after the reaction to a final concentration of 500 mM, and then the cells were further disrupted by ultrasonic waves.
  • the crushed solution was centrifuged at 18,000 ⁇ g and 4° C. for 30 minutes to collect the supernatant.
  • the obtained supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m filter for clarification, and then purified using an affinity chromatography column HisTrap FF (Cytiva).
  • HisTrap FF Chromata
  • the column purification used 20 mM Imidazole, 20 mM Tris-HCL pH 8.0, 500 mM NaCL as the binding buffer and 500 mM Imidazole, 20 mM Tris-HCL pH 8.0, 500 mM NaCL as the elution buffer. Fractions of 8.0 mL each were collected so that the imidazole had a stepwise concentration gradient. Purity of the target protein was tested by SDS-PAGE using 18% polyacrylamide gel.
  • the collected peak fractions were dialyzed against a solution of 20 mM Tris-HCL pH 8.0 for buffer exchange, clarified by passing through a 0.45 ⁇ m filter, and subsequently purified using an anion exchange chromatography column HiTrapQ HP (Cytiva).
  • 20 mM Tris-HCL pH 8.0 was used as the binding buffer and 20 mM Tris-HCL pH 8.0, 1 M NaCL as the elution buffer.
  • Fractions of 8.0 mL each were collected in a stepwise concentration gradient of NaCL. Purity of the target protein was tested by SDS-PAGE using 18% polyacrylamide gel.
  • the collected fraction containing the target protein was clarified by passing it through a 0.45 ⁇ m filter, and then subjected to size exclusion chromatography column HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (Cytiva). Fractions containing the protein of interest were determined by SDS-PAGE analysis and collected. During this column purification, PBS (137 mM NaCL, 2.7 mM KCL, 1.8 mM KH2PO4, 10 mM NaH2PO4, adjusted to pH 8.0 with NaOH) was used as an elution buffer to replace the buffer with PBS at the same time.
  • PBS 137 mM NaCL, 2.7 mM KCL, 1.8 mM KH2PO4, 10 mM NaH2PO4, adjusted to pH 8.0 with NaOH
  • a 9.6 ⁇ M CSP solution, an 8 ⁇ M antigen model protein solution, a mixed solution of 9.6 ⁇ M CSP and 8 ⁇ M antigen model protein, a mixed solution of 9.6 ⁇ M CSP and 8 ⁇ M antigen model protein after treatment at 100°C for 10 minutes, and a mixed solution of 9.6 ⁇ M CSP and 8 ⁇ M antigen model protein after autoclaving (121°C, 20 minutes, 2 atm) were prepared, respectively.
  • the mixed solution was subjected to a binding reaction at 110 rpm and 25°C for 30 minutes after mixing the CSP and the antigen model protein, and then applied to the column.
  • Table 13 shows the results of (7) to (9). Affinity analysis by FACS showed that some of the obtained antibody mimetic molecules had high affinity for the target protein. In addition, as a result of secondary structure analysis by CD spectrum measurement and binding ability analysis by gel filtration chromatography, the antibody mimetic molecule of the present invention was shown to recover its secondary structure and binding ability to the target protein when returned to normal temperature after high temperature treatment or autoclave treatment.
  • Antibody-mimicking molecule (mutant TmCSP(AacEst_01)) was used as ligand and antigen model protein AacEST was used as analyte for analysis.
  • the antibody-mimicking molecule on the ligand side was immobilized on the Chip using the His10 tag on the N-terminal side.
  • the antigen model protein on the analyte side was treated with TEV protease to cleave the His10 tag so that it would not bind to the Chip via the His10 tag.
  • the composition of the running buffer at the time of measurement was 10 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, and 0.005% Tween (registered trademark)20.
  • a regeneration solution (0.35 M EDTA in running buffer) was flowed at a flow rate of 20 ⁇ L/min for 60 seconds, followed by a Ni solution (500 ⁇ M in running buffer) at a flow rate of 20 ⁇ L/min for 60 seconds, followed by a ligand solution (200 nM antibody mimetic molecule in running buffer) at a flow rate of 10 ⁇ L/min for 420 seconds.
  • Measurement conditions were a flow rate of 20 ⁇ L/min, Contact time of 420 seconds, and Dissociation time of 420 seconds. Each analyte under the same concentration condition was measured twice.
  • Antibody-mimicking molecules that had been cryopreserved at -80°C were dried under reduced pressure using a vacuum pump GLD-136C (manufactured by ULVAC) and a freeze dryer VD-500F (manufactured by TITEC). The dried sample was resuspended in the buffer and subjected to the following analyzes (11-1) and (11-2).
  • Fig. 10 shows the results of secondary structure analysis by CD spectrum measurement.
  • the CD spectra at 20°C of mutant TmCSP (AacEst_01) before and after freeze-drying were almost identical. This result indicated that the freeze-drying treatment did not affect the secondary structure of the antibody mimetic molecule.
  • the CD spectrum at 20°C of the mutant TmCSP (AacEst_01) that was lyophilized and then heat treated at 100°C almost matched the CD spectrum at 20°C of the mutant TmCSP (AacEst_01) that was heat treated at 100°C without being lyophilized. This result indicated that the freeze-drying treatment did not affect the secondary structure of the antibody-mimetic molecule after high-temperature treatment.
  • Fig. 11 shows the results of thermal stability analysis by CD spectrum measurement. While the Tm value before freeze-drying was 45.4°C, the Tm value after freeze-drying was 44.6°C, and the Tm values before and after freeze-drying were comparable. This result indicated that the lyophilization process did not affect the thermal stability of the antibody mimetic molecule.
  • the mutant TmCSP (AacEst_01) before lyophilization (A) Similar to the mutant TmCSP (AacEst_01) before lyophilization (A), the mutant TmCSP (AacEst_01) after lyophilization (B) binds to the antigen model protein (AacEst) to form a complex.
  • the eluate at this elution peak position was subjected to SDS-PAGE, bands representing AacEst and CSP (AacEst_01) were confirmed, which also supported the binding of the lyophilized mutant TmCSP (AacEst_01) to the antigen model protein AacEst.
  • Example 3 Verification of the applicability of human-derived CSD as a scaffold for antibody-mimicking molecules
  • Antibody-mimicking molecules based on Thermotoga maritima Cold Shock Protein (TmCSP) from hyperthermophiles are likely to pose problems of immunogenicity in humans. Therefore, we attempted to create an antibody-mimetic molecule that can be heat-sterilized using a human-derived protein as a backbone.
  • TmCSP Thermotoga maritima Cold Shock Protein
  • CSP Cold Shock Domain
  • hCSD human-derived CSD
  • the CSD of human YB1 (1H95), the first CSD of human URN protein (1WFQ), the second CSD of human URN protein (2YTX), and the fourth CSD of human URN protein (2YTY) were high in soluble expression using E. coli.
  • secondary structure analysis and thermal stability analysis before and after heat treatment were performed by CD spectrum measurement.
  • the protein purification method and CD analysis method were the same as in the case of TmCSP.
  • heat treatment high temperature treatment (80° C., 12 minutes, or 100° C., 10 minutes) or autoclave treatment (121° C., 20 minutes, 2 atmospheres) was performed.
  • Fig. 13 shows the results of secondary structure analysis by CD spectrum measurement.
  • 1H95 was structurally unstable at 20°C.
  • 1WFQ did not recover to the secondary structure of the native structure only by exposure to 80°C.
  • 2YTX and 2YTY did not recover their secondary structures after autoclave treatment (121°C, 20 minutes, 2 atm), but recovered their secondary structures after high temperature treatment (100°C, 10 minutes). These results suggested that 2YTX and 2YTY may serve as scaffolds for antibody-mimetic molecules that can withstand heat sterilization at 100°C for 10 minutes.
  • Fig. 14 shows the results of thermal stability analysis by CD spectrum measurement.
  • the Tm value for 1H95 was not measurable.
  • 1WFQ had the highest thermal stability among the four analyzed proteins, but as shown in Fig. 13, it did not recover its secondary structure when subjected to high temperature treatment at 80°C. Therefore, we thought that 2YTX, which has the second highest thermal stability with a Tm value of 54.8°C and whose secondary structure was restored after high-temperature treatment (100°C, 10 minutes), would be the most suitable scaffold for heat-sterilizable human-derived antibody-mimicking molecules.
  • 2YTX has five ⁇ -sheets corresponding to A to E of TmCSP and four loop regions (AB loop, BC loop, CD loop, and DE loop) on the surface of the structure.
  • the amino acid sequence of 2YTX (SEQ ID NO: 6) is shown below.
  • the boxed sequences in the amino acid sequence above indicate the amino acid sequences that constitute the four loop regions of 2YTX, respectively. That is, the amino acid sequence of the AB loop is KEA, the amino acid sequence of the BC loop is RGDVVK, the amino acid sequence of the CD loop is HYSEFK, and the amino acid sequence of the DE loop is KDRNGKEV.
  • the aim was to create a mutant CSD by comprehensively mutating and diversifying the amino acid residues, and to obtain an antibody-mimicking molecule in which the loop region of the CSD functions as an antigen-binding site and maintains refolding properties.
  • mutant hCSD mutations were introduced in the loop region or ⁇ sheet of CSD.
  • the purpose of introducing mutations in the ⁇ -sheet was to verify whether amino acid residues with side chains facing the outside of the structure could be substituted.
  • 2YTX has a Cys residue, and we investigated the substitution of the Cys residue so that we do not have to consider the effects of disulfide bonds when applying it in the cytoplasm under a reducing environment.
  • Table 15 shows the mutagenesis sites and types of mutations in hCSD mutants of 2YTX, and FIG. 15 shows the mutagenesis sites in 2YTX.
  • Mutant hCSD (2YTX) introduced with the above mutations was prepared, and in order to examine the refolding properties of these mutant hCSDs, secondary structure analysis and thermal stability analysis before and after heat treatment were performed by CD spectrum measurement. The results are shown in FIGS. 16 and 17. FIG. Moreover, these results are collectively shown in Table 16. In Table 16, regarding soluble expression, when soluble expression could be confirmed, it was indicated as " ⁇ ", and when soluble expression could not be confirmed, it was indicated as "X”. Regarding the recovery of the secondary structure after the heat treatment, “ ⁇ ” was given when the secondary structure was completely recovered, “ ⁇ ” was given when the recovery of the secondary structure was incomplete, and "-” was given when analysis was not performed.
  • the results of secondary structure analysis by CD spectrum measurement showed that the secondary structure of all mutant hCSDs, except mutant hCSD (BC8Ser), recovered even after high-temperature treatment (100°C, 10 minutes). Furthermore, the results of thermal stability analysis by CD spectroscopy showed that the thermal stability of the AB and BC loops was not impaired even when the amino acid residues constituting these loops were successively replaced with Ser residues, and that the thermal stability of the BC loop was maintained even after extension by introducing four Ser residues.
  • substitutions on the ⁇ -sheet it was shown that the substitution of Ser residues for the 14th and 16th Phe residues decreased the thermal stability (mutant hCSD (F14S/F16S)).
  • substitution of the 9th Ala residue with a Ser residue or substitution of the 14th, 16th, and 27th Phe residues with a Tyr residue did not reduce the secondary structure recovery ability and thermal stability after heat treatment (mutant hCSD (C8S/A9S) and mutant hCSD (F14Y/F16Y/F27Y)).
  • the AB loop and BC loop can be used as mutation sites for the library.
  • the 8th Cys and 9th Ala residues could be randomly mutated on the ⁇ -sheet.
  • the 14th, 16th, and 27th Phe residues are not tolerant to random mutation, it was suggested that they could be replaced with Tyr residues, which frequently occur at the site of mutation introduction in antibody-mimetic molecules, to mediate molecular contact in terms of both affinity and specificity.

Abstract

オートクレーブ処理可能な抗体模倣分子を取得することを課題とする。当該課題を、少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むコールドショックプロテイン（CSP）又はコールドショックドメイン（CSD）を骨格とし、前記変異が導入される前のCSP又はCSDが少なくとも10000 nM以下の強さのKdで結合しない標的分子に対して少なくとも10000 nM以下の強さのKdで結合する抗体模倣分子により解決する。

Description

抗体模倣分子
　本発明は、抗体模倣分子、及びその製造方法に関する。
　抗体及び抗体模倣分子は、医薬や、in vitro又はin vivoでの診断薬、ELISA等の医学・生物学的ツール等に用いられる。抗体及び抗体模倣分子の製剤化工程には、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を用いた細胞培養、カラム樹脂を用いた精製、精密ろ過膜による除菌等が含まれる。しかしながら、これらの製剤化工程における課題として、精密ろ過膜が高価かつ使い捨てでコストが高いこと、精密ろ過膜によるろ過では粒径の小さいウイルス等を完全に除去できないこと、並びに、エンドトキシン（強力な毒素である大腸菌の外膜成分であるリポ多糖）が混入する可能性があること等が挙げられる。
　この点、オートクレーブによる高圧蒸気滅菌法は、精密ろ過膜による除菌に比べてコストが低く、ウイルスの不活化が可能であり、エンドトキシンの毒素不活化を促進するという利点を有する。しかし、従来の抗体及び抗体模倣分子は、オートクレーブ処理により変性し、不可逆的に機能を失った状態になるため、上記方法を利用できない。
　本発明は、オートクレーブ処理可能な抗体模倣分子を得ることを課題とする。また、本発明は、かかる抗体模倣分子の製造方法を提供することも課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行ったところ、新たな抗体模倣分子として、リフォールディング特性（構造復活特性）を有するコールドショックプロテイン（Cold Shock Protein；CSP）又はコールドショックドメイン（Cold Shock Domain；CSD）を抗体模倣分子の骨格とすることを着想し、これにより上記課題を解決できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいてさらに検討を加えることにより完成したものであり、以下の態様を含む。
項１．
少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むコールドショックプロテイン（CSP）又はコールドショックドメイン（CSD）を骨格とし、
前記変異が導入される前のCSP又はCSDが少なくとも10000 nM以下の強さのKdで結合しない標的分子に対して少なくとも10000 nM以下の強さのKdで結合する、抗体模倣分子。
項２．
前記変異した構造表面アミノ酸が、CSP又はCSDのループ領域に含まれる、項１に記載の抗体模倣分子。
項３．
前記CSPが、好熱性の菌由来である、項１又は２に記載の抗体模倣分子。
項４．
前記CSPが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、リフォールディング特性を有する、項１～３のいずれか一項に記載の抗体模倣分子。
項５．
前記CSPが、超好熱菌Thermotoga maritima由来である、項１～４のいずれか一項に記載の抗体模倣分子。
項６．
前記CSDが、ヒト由来である、項１又は２に記載の抗体模倣分子。
項７．
前記CSDが、配列番号３～１２で表されるアミノ酸配列のいずれか一つと80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、リフォールディング特性を有する、項１、２、及び６のいずれか一項に記載の抗体模倣分子。
項８．
項１～７のいずれか一項に記載の抗体模倣分子をコードする、核酸分子。
項９．
項８に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
項１０．
項８に記載の核酸分子を含む、核酸ライブラリ。
項１１．
項１０に記載の核酸ライブラリに由来する、ペプチドディスプレイライブラリ。
項１２．
少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とし、
前記変異が導入される前のCSP又はCSDが少なくとも10000 nMの強さのKdで結合しない標的分子に対して少なくとも10000 nMの強さのKdで結合する抗体模倣分子を製造する方法であって、
（Ａ）少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とするポリペプチドのディスプレイライブラリに標的分子を接触させ、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを選別する工程；及び
（Ｂ）前記（Ａ）工程で選別された少なくとも1種のポリペプチドを用いて、前記（Ａ）工程を少なくとも1回繰り返すことにより、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを、前記抗体模倣分子として選別する工程
を含む、製造方法。
項１３．
前記抗体模倣分子を加熱及び／又は加圧処理する工程をさらに含む、項１２に記載の製造方法。
項１４．
少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とする抗体模倣分子であって、
前記変異が導入される前のCSP又はCSDが少なくとも10000 nMの強さのKdで結合しない標的分子に対して少なくとも10000 nMの強さのKdで結合し、かつ
（Ａ）少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とするポリペプチドのディスプレイライブラリに標的分子を接触させ、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを選別する工程；及び
（Ｂ）前記（Ａ）工程で選別された少なくとも1種のポリペプチドを用いて、前記（Ａ）工程を少なくとも1回繰り返すことにより、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを、前記抗体模倣分子として選別する工程
を含む方法によって得られうる、抗体模倣分子。
項１５． 
加熱及び／又は加圧処理されている、項１４に記載の抗体模倣分子。
　本発明によれば、オートクレーブ処理可能な抗体模倣分子を提供できる。また、本発明によれば、かかる抗体模倣分子の製造方法を提供できる。
TmCSPの構造を示す。TmCSPは、構造表面に4つのループ領域（ABループ、BCループ、CDループ、及びDEループ）を有する。 野生型TmCSP（WT）及び変異体TmCSP（AB3Ser、AB3Ser+4Ser、AB3Ser+2Ser、AB3Ser+1Ser、及びBC5Ser）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。各サンプルは濃度0.10～0.20 mg/mlで、20℃（黒色）及び80℃（灰色）においてスペクトル測定を行った。縦軸は平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）、横軸は波長（nm）を表す。 変異体TmCSP（BC5Ser+4Ser、CD3Ser、CD3Ser+4Ser、CD3Ser+2Ser、CD3Ser+1Ser、及びCD7Ser）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。各サンプルは濃度0.10～0.20 mg/mlで、20℃（黒色）及び80℃（灰色）においてスペクトル測定を行った。縦軸は平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）、横軸は波長（nm）を表す。 変異体TmCSP（CD7Ser+4Ser、CD4Ser、DE7Ser、DE7Ser+4Ser、DE6Ser、及びDE6Ser+4Ser）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。各サンプルは濃度0.10～0.20 mg/mlで、20℃（黒色）及び80℃（灰色）においてスペクトル測定を行った。縦軸は平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）、横軸は波長（nm）を表す。 変異体TmCSP（DE6Ser+2Ser、F37A、及びF37S）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。各サンプルは濃度0.10～0.20 mg/mlで、20℃（黒色）及び80℃（灰色）においてスペクトル測定を行った。縦軸は平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）、横軸は波長（nm）を表す。 野生型TmCSP（a）及び変異体TmCSP（b）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。野生型TmCSP及び変異体TmCSPの、20℃～100℃における210 nmの平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）を示す。 変異体TmCSP（c、d）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。変異体TmCSPの、20℃～100℃における210 nmの平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）を示す。 変異体TmCSP（e、f）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。変異体TmCSPの、20℃～100℃における210 nmの平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）を示す。 変異体TmCSP（g、h）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。変異体TmCSPの、20℃～100℃における210 nmの平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）を示す。 変異体TmCSP（i）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。変異体TmCSPの、20℃～100℃における210 nmの平均モル残基楕円率[θ]（deg cm2 dmol-1）を示す。 バイオパニングによる抗体模倣分子の選別の概略図を示す。 本実験で用いたELISAの系の概要を示す。 ELISAによる抗原特異的結合能解析の結果を示す。 酵母表層ディスプレイによる抗原特異的結合能解析の結果を示す。 ガウス曲線を仮定し、サイズ排除クロマトグラフィーのピークを2成分に分解する解析法の一例を示す。 表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；SPR）法による加熱処理前後における変異体TmCSPの標的タンパク質に対する親和性解析の結果を示す。 凍結乾燥後の変異体TmCSPのCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。（A）凍結乾燥前、（B）凍結乾燥後。 凍結乾燥後の変異体TmCSPのCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。10℃～100℃における218 nmの平均モル残基楕円率［θ］（deg cm2 dmol-1）を示す。 ゲルろ過クロマトグラフィーによる凍結乾燥前後における変異体TmCSPの標的分子に対する結合能解析の結果を示す。（A）凍結乾燥前、（B）凍結乾燥後。 ヒト由来CSD（hCSD）の変異体（1H95、1WFQ、2YTX、及び2YTY）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。 変異体hCSD（1H95、1WFQ、2YTX、及び2YTY）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。 hCSD(2YTX)のアミノ酸配列、並びに、立体構造及び変異導入箇所を示す。 変異体hCSD(2YTX)（Ab3Ser、BC6Ser、BC6Ser+2Ser及びBC6Ser+4Ser）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。 変異体hCSD(2YTX)（BC6Ser+E18D/E25D、BC8Ser、CD4Ser及びDE3Ser）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。 変異体hCSD(2YTX)（DE4Ser、DE6Ser、C3S及びC3V）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。 変異体hCSD(2YTX)（C8S/A9S、F14S/F16S、F14Y/F16Y及びF14Y/F16Y/F27Y）のCDスペクトル測定による二次構造解析結果を示す。 変異体hCSD(2YTX)（Ab3Ser、BC6Ser、BC6Ser+2Ser及びBC6Ser+4Ser）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。 変異体hCSD(2YTX)（BC6Ser+E18D/E25D、BC8Ser、CD4Ser及びDE3Ser）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。 変異体hCSD(2YTX)（DE4Ser、DE6Ser、C3S及びC3V）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。 変異体hCSD(2YTX)（C8S/A9S、F14S/F16S、F14Y/F16Y及びF14Y/F16Y/F27Y）のCDスペクトル測定による熱安定性解析結果を示す。
　１．　抗体模倣分子
　本発明の抗体模倣分子は、少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むコールドショックプロテイン（Cold shock protein；CSP）又はコールドショックドメイン（Cold Shock Domain；CSD）を骨格とする。
　本発明の抗体模倣分子は、前記変異が導入される前のCSP又はCSDが結合しない又はそれほど強く結合しない標的分子に対して、結合する。
　「標的分子」とは、タンパク質、及び核酸を含む。
　本発明の抗体模倣分子の標的分子に対する親和性は平衡解離定数（Kd値）により表すことができ、平衡解離定数（Kd値）は、10000 nM以下であることが好ましく、より好ましくは8000 nM以下、さらに好ましくは6000 nM以下であり、とりわけ好ましくは4000 nM以下であり、最も好ましくは2000 nM以下である。
　本発明において平衡解離定数（Kd値）を測定する方法は、特に制限されず、フローサイトメトリー法や表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；SPR）法、等温滴定カロリメトリー（Isothermal Titration Calorimetry；ITC）等を用いることができる。具体的には、例えば、フローサイトメーター（Fluorescence activated cell sorting；FACS）やBiacore（登録商標）、等温滴定型熱量計等を用いて測定することができる。
　本発明において、「構造表面アミノ酸」とは、CSP又はCSDの立体構造の表面に露出しているアミノ酸をいう。
　本発明の抗体模倣分子は、変異した構造表面アミノ酸を、少なくとも1個含む。かかる変異が導入されることに伴う、部分的な立体構造変化により、本発明の抗体模倣分子は、変異が導入される前のCSP又はCSDが結合しない又はそれほど強く結合しない標的分子に対して、結合するようになる。任意の標的分子に対して、そのような結合性を有する分子を選別することは、少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とするポリペプチドのディスプレイライブラリを用いてスクリーニングを行うことにより可能であり、そのような手法は周知である。ポリペプチドのディスプレイライブラリを作成するための変異導入方法としては、例えばKunkel法、QuikChange法、Inverse PCR法、Overlap-extension法、及び人工遺伝子合成等を用いることができる。
　CSP又はCSDはループ構造及びβシート構造を含む。本発明において、変異した構造表面アミノ酸は、CSP又はCSDのループ領域に含まれていてもよいし、βシート領域に含まれていてもよい。本発明において、変異した構造表面アミノ酸は、前述の標的分子への結合に寄与する部分的な立体構造変化を除き、CSP又はCSDの高次構造には影響を与えない。
　本発明において、「変異」は、例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入等をいう。
　本発明の抗体模倣分子の骨格とされるCSP又はCSDの由来となる生物種は特に制限されず、動物、植物、微生物を含むあらゆる生物種から選択することができる。好ましくは、好熱性の菌由来のCSP又はヒト由来のCSDを用いることができる。本発明において、好熱性の菌には、好熱菌及び超好熱菌が含まれる。好熱菌としては、特に制限されないが、例えば、Pseudothermotoga hypogea、Pseudothermotoga thermarum、Thermotoga profunda、Thermodesulfobacterium commune、Thermodesulfobacterium hveragerdense、Thermosipho melanesiensis、Thermodesulfobacterium thermophilum、Thermodesulfatator atlanticus、Thermodesulfatator atlanticus、Caldimicrobium thiodismutans、Fervidobacterium gondwanense、Thermodesulfobacterium geofontis、Fervidobacterium pennivorans、Fervidobacterium changbaicum、Fervidobacterium nodosum、Thermodesulfobacterium hydrogeniphilum、Kosmotoga arenicorallina、 Kosmotoga pacifica、Thermoactinomyces vulgaris、Thermosulfurimonas dismutans等が挙げられる。超好熱菌としては、特に制限されないが、例えば、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Aquifex pyrophilus、Thermocrinis ruber、Fervidobacterium thailandense等が挙げられる。
　本発明の抗体模倣分子は、配列番号１で表される超好熱菌Thermotoga maritima由来のCSPのアミノ酸配列、及び配列番号３～１２で表されるヒト由来のCSDのアミノ酸配列のいずれか一つと、80％以上の相同性を有することが好ましく、85％以上の相同性を有することがより好ましく、90％以上の相同性を有することがさらに好ましい。
　本発明において、2つ以上のアミノ酸配列の相同性％は、Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）により、デフォルトのパラメーターを用いて決定する。
　CSP又はCSDは、リフォールディング特性（構造復活特性）を有する。この特性により、本発明の抗体模倣分子はオートクレーブ処理（すなわち、加熱及び／又は加圧処理）、並びに、凍結乾燥処理及び凍結融解処理が可能となる。
　本発明において、「リフォールディング特性（構造復活特性）」とは、変性したタンパク質が活性のある天然型構造又は天然型構造により近い構造に巻き戻される特性を意味する。したがって、本発明において、「リフォールディング特性（構造復活特性）」との用語は、変性タンパク質の立体構造の回復、及び立体構造の回復によるタンパク質の機能の回復を含む概念である。
　タンパク質の変性の要因としては、特に制限されず、加熱、加圧、凍結乾燥、凍結融解、超音波、物理的要因（激しい攪拌等）、化学的要因（pH、有機溶媒、界面活性剤、重金属溶液等）等が挙げられる。中でも、タンパク質の変性の要因としては、加熱、加圧、凍結乾燥、及び凍結融解が好ましい。
　変性タンパク質の立体構造の回復は、変性前後のタンパク質の二次構造、三次構造、又は四次構造を解析・比較することで検証することができる。
　変性タンパク質の機能の回復は、変性前後のタンパク質の機能（例えば、標的分子に対する結合能等）を解析・比較することで検証することができる。
　本発明の抗体模倣分子のリフォールディング特性は、例えば、変性前における抗体模倣分子の標的分子に対する結合能を100％としたときの変性後における抗体模倣分子の標的分子に対する結合能の回復割合（%）で表すことができ、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて測定することができる。
　本発明の抗体模倣分子の変性後における標的分子に対する結合能の回復割合は、20％以上であることが好ましく、25％以上であることがより好ましく、40％以上であることがさらに好ましく、50％以上であることがとりわけ好ましく、90％以上であることが最も好ましい。
　本発明において、変性前後の抗体模倣分子の立体構造（二次構造）は、例えば、円二色性分散（CD）スペクトル測定、及びゲルろ過クロマトグラフィー等により解析することができる。CDスペクトル測定による解析の場合、本発明の抗体模倣分子の変性後の二次構造の回復割合は、変性前後の抗体模倣分子においてスペクトルが一致する場合には100％であると判断する。また、ゲルろ過クロマトグラフィーによる解析の場合、本発明の抗体模倣分子の変性後の二次構造の回復割合は、前記変性前後の抗体模倣分子の標的分子に対する結合能の回復割合と同じ方法で算出され、同じ値を示す。
　本発明の抗体模倣分子の変性後における二次構造の回復割合は、20％以上であることが好ましく、25％以上であることがより好ましく、40％以上であることがさらに好ましく、50％以上であることがとりわけ好ましく、90％以上であることが最も好ましい。
　本発明において、変性前後の抗体模倣分子の立体構造（三次構造及び四次構造）の解析方法は、特に制限されず、X線結晶構造解析や核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance；NMR）による解析等が挙げられる。
　本発明の抗体模倣分子は、前記変異が導入されたCSP又はCSDの立体構造に起因して、上記の通り標的分子に対する親和性とリフォールディング特性とを示す。よって、かかる親和性とリフォールディング特性とが失われない限りにおいて、本発明の抗体模倣分子は、前記変異が導入されたCSP又はCSDを骨格とし、さらにそこに別の構造が付加されたものであってもよい。
　本発明の抗体模倣分子は、凍結乾燥することができる。凍結乾燥の方法は特に制限されず、例えば液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥機で乾燥させる方法が挙げられる。凍結乾燥処理は、オートクレーブ処理前に行ってもよいし、オートクレーブ処理後に行ってもよい。
　２．　核酸分子
　本発明の核酸分子は、前記抗体模倣分子をコードする核酸分子である。
　３．　発現ベクター
　本発明の発現ベクターは、前記抗体模倣分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターである。より具体的には、本発明の発現ベクターは、前記核酸分子を適切なプロモーターの支配下に連結した発現ベクターである。
　本発明の発現ベクターとしては、特に制限されないが、例えば、大腸菌発現系であれば、pBlueScript系ベクター（Agilent Technologies）、pUC系ベクター（TaKaRa）、pET系ベクター（Novagen）、pCold系ベクター（TaKaRa）等を用いることができる。酵母発現系であれば、pYD1系ベクター（Invitrogen）、pPICZ系ベクター（Invitrogen）等を用いることができる。
　４．　核酸ライブラリ
　本発明の核酸ライブラリは、前記抗体模倣分子をコードする核酸分子を含む核酸ライブラリである。
　本発明の核酸ライブラリは、本発明のペプチドディスプレイライブラリを提供する。
　５．　ペプチドディスプレイライブラリ
　本発明のペプチドディスプレイライブラリは、前記抗体模倣分子をコードする核酸分子を含む核酸ライブラリに由来するペプチドディスプレイライブラリである。具体的には、本発明のペプチドディスプレイライブラリは、少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とするポリペプチドのディスプレイライブラリである。本発明のディスプレイライブラリを作成するための変異導入方法としては、例えばKunkel法、QuikChange法、Inverse PCR法、Overlap-extension法、及び人工遺伝子合成等を用いることができる。
　本発明のペプチドディスプレイライブラリは、本発明の抗体模倣分子の選別に用いることができる。
　本発明のペプチドディスプレイライブラリの用途は、特に制限されず、例えば、特定の標的分子に特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列を特定することを目的とするキット等に用いることができる。
　６．　抗体模倣分子の製造方法
　本発明の抗体模倣分子は、候補となるポリペプチドのライブラリに標的分子を接触させる方法により選別することができる。
　本発明の抗体模倣分子の製造方法は、
（Ａ）少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とするポリペプチドのディスプレイライブラリに標的分子を接触させ、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを選別する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）工程で選別された少なくとも1種のポリペプチドを用いて、前記（Ａ）工程を少なくとも1回繰り返すことにより、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを、前記抗体模倣分子として選別する工程
を含む。
　本発明の抗体模倣分子の製造方法は、上記（Ａ）及び（Ｂ）工程の後に、（Ｃ）得られた抗体模倣分子を加熱及び／又は加圧処理する工程をさらに含んでいてもよい。
　工程（Ｃ）において、加熱及び／又は加圧処理の条件は、適宜設定できる。
　例えば、工程（Ｃ）の加熱温度は、特に制限されないが、70～200℃とすることが好ましく、80～150℃とすることがより好ましく、90～130℃とすることがさらに好ましい。
　例えば、工程（Ｃ）の加圧条件は、特に制限されないが、1～5気圧とすることが好ましく、1～4気圧とすることがより好ましく、1～3気圧とすることがさらに好ましい。
　例えば、工程（Ｃ）の加熱及び／又は加圧時間は、特に制限されないが、3～60分とすることが好ましく、4～45分とすることがより好ましく、5～30分とすることがさらに好ましい。
　工程（Ｃ）において、加熱及び／又は加圧処理には、オートクレーブを用いることができる。
　これにより、得られた抗体模倣分子において、殺菌、殺ウイルス、エンドトキシン不活化を効率的かつ低コストで行うことができるため、製剤化が容易である。
　以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本発明の抗体模倣分子は、医薬組成物、培養細胞に添加する細胞光学用試薬、ELISAやFACSなどに使用する診断薬ツール、抗体模倣分子を供えたキット等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
　以下、本開示について、さらに詳細に説明する。なお、本明細書において、本開示についての各態様を説明するにあたり、例えば「一態様において」「別の態様において」などといった説明を行う場合があるが、かかる説明は、各態様の特徴を2以上併せ持つことを妨げるものではなく、本開示は、これらの説明に係る各態様の特徴を1又は2以上併せ持つものを全て包含する。
　なお、本明細書において「含む」とは、「のみから実質的になる」と、「のみからなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting substantially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
　また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　CSPの抗体模倣分子の骨格としての利用可能性の検証
　CSPは、優れたリフォールディング特性を有するタンパク質であり、構造表面に複数のループ領域を有する。また、CSPは、本来核酸に対しては非特異的に結合し、タンパク質に対しては結合能を有しない。本発明においては、CSPの構造表面のループ領域を構成するアミノ酸残基を網羅的に変異多様化させた変異体CSPを創出し、CSPのループ領域が抗原結合部位として機能し、かつ、リフォールディング特性を維持する抗体模倣分子を得ることを目的とした。そこで、まず、CSPのループ領域における変異がCSPの構造特性の安定性に与える影響を調べた。
　（１）変異導入箇所の決定
　超好熱菌由来Thermotoga maritima由来のCold Shock Protein（TmCSP）は、A～Eの5つのβシートを有し、構造表面に4つのループ領域（ABループ、BCループ、CDループ、及びDEループ）を有する（図１）。以下に、TmCSPのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
　上記アミノ酸配列中の四角で囲まれた配列は、それぞれTmCSPの4つのループ領域を構成するアミノ酸配列を示す。すなわち、ABループのアミノ酸配列はＳＫＫ、BCループのアミノ酸配列はＫＤＥＧＧ、CDループのアミノ酸配列はＨＷＳＡＩＥＭＥＧＦＫＴＬＫＥＧＱ、DEループのアミノ酸配列はＱＥＧＫＫＧＰである。下線部は疎水性アミノ酸を示し、その側鎖がTmCSP構造内部の疎水性コアに向いていることから、TmCSPの構造特性の安定性において重要な役割をもつと考えられる。
　各ループ領域を構成するアミノ酸配列において、任意のアミノ酸残基をセリン残基（本明細書において、「Ser」、又は「S」と記載する場合がある。）に置換する変異を導入した。表１に各ループ領域における変異導入箇所を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（２）変異導入TmCSPの作製
　（２－１）TmCSP遺伝子のクローニング
　野生型のTmCSPの遺伝子配列（配列番号２）をPCRによって増幅した。増幅された遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。精製した遺伝子断片をBamHI及びXhoIを用いて37℃で一晩制限酵素処理した。制限酵素処理後の遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。得られた遺伝子断片をpHETベクターのBamHI/XhoIサイトに挿入した。
　（２－２）Inverse PCR
　野生型のTmCSP遺伝子に変異が導入された変異体TmCSPを作製するため、Q5 polymeraseを用いたInverse PCRを行った。表２に各TmCSP変異体の作製に用いたオリゴDNAの配列をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（２－３）大腸菌JM109の形質転換
　Ivverse PCR後のDNA産物から鋳型のDNAを取り除くためにDpnI処理を行った。DpnI処理後、遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、精製した。精製した遺伝子断片を環状化するために、遺伝子断片の5’末端をリン酸化した。リン酸化遺伝子断片をプラスミドベクターにライゲーションした。
　ライゲーションしたプラスミドDNAで大腸菌コンピテントセルJM109を形質転換した。形質転換したJM109を培養し、プラスミド抽出を行った。指定した箇所にSerが付加されたことをDNAシークエンスにより確認した。
　（２－４）タンパク質の発現及び精製
　発現用プラスミドで大腸菌コンピテントセルBL21(DE3)を形質転換した。形質転換したBL21(DE3)を培養した後、集菌した。集菌した大腸菌を超音波ホモジナイザーで破砕し、高速冷却遠心機を用いて遠心分離して、可溶性画分と不溶性画分を得た。
　可溶性画分を0.45 μmのフィルターに通して清澄化した後、終濃度が20 mMになるように2 Mイミダゾールを加えた。その後、アフィニティークロマトカラムHisTrap FF（Cytiva）を用いて精製を行った。このカラム精製では、結合バッファーとして20 mM Imidazole、20 mM Tris-HCL pH 8.0、500 mM NaCLを用い、溶出バッファーとして500 mM Imidazole、20 mM Tris-HCL pH 8.0、500 mM NaCLを用いた。イミダゾールが段階的濃度勾配になるようにフラクションを8.0 mLずつ回収した。目的タンパク質の純度検定は18％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで行った。
　大腸菌細胞由来の核酸に非特異的な結合が確認されたサンプルについては、核酸を取り除くために、HiTrap Q HP陰イオン交換カラムによる分離精製をさらに行った。回収したピークフラクションを20 mM Tris-HCL pH8.0の溶液で透析してバッファー交換を行った後、0.45 μmフィルターに通して清澄化し、続いて、陰イオン交換クロマトカラムHiTrapQ HP（Cytiva）を用いて精製を行った。このカラム精製では、結合バッファーとして20 mM Tris-HCL pH 8.0を用い、溶出バッファーとして20 mM Tris-HCL pH 8.0、1 M NaCLを用いた。NaCLが段階的濃度勾配になるようにフラクションを8.0 mLずつ回収した。目的タンパク質の純度検定は18％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで行った。
　回収した目的タンパク質溶液を3 kDa cutoffのビバスピンターボ15遠心式限外ろ過フィルター（Sartorius）に注ぎ、4℃に冷却した高速冷却遠心機を用いて、加速度4,000×ｇで2.5 mLに濃縮されるまで遠心を繰り返した。その後、AKTA FPLCを用いて、1×PBSバッファーで置換した。HiLoad 16/60 Superdex 200pg（Cytiva）に濃縮したタンパク質溶液をロードし、流速1.0 ml/minでサンプルを流した。目的タンパク質から夾雑タンパク質を分離させ、純度を高めた。回収したサンプルを濃度1 mg/mlになるまで濃縮を行った。
　（３）変異導入TmCSPの構造特性の安定性の検証
　ゲルろ過クロマトグラフィーにより回収したサンプルのピーク部分を0.10 mg/ml～0.20 mg/mlの濃度になるように1×PBSで希釈し、以下の円二色性（circular dichroism: CD）スペクトル測定による二次構造解析及び熱安定性解析に供した。
　（３－１）CDスペクトル測定による二次構造解析
　野生型のTmCSP及び変異導入TmCSPについて、20℃及び80℃で、200 nm～260 nmの波長領域のCDスペクトルを測定した（図２）。スペクトル測定には、光路長が0.2 cmの石英セルを使用した。野生型のTmCSPと変異導入TmCSPとの間で、20℃及び80℃のいずれにおいても、スペクトルの波形に大きな違いは見られなかった。
　（３－２）CDスペクトル測定による熱安定性解析
　野生型のTmCSP及び変異導入TmCSPについて、20℃～100℃における、210 nmの平均モル残基楕円率を測定した（図３）。平均モル残基楕円率［θ］（deg cm2 dmol-1）の換算にはアミノ酸の平均分子量110を用いた。
　野生型のTmCSP及び変異導入TmCSPの二次構造が変化する熱変性温度（Tm値）を、熱変性解析プログラムSpectra Manager（日本分光）を用いて算出した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ABループ又はCDループに変異を導入した変異体TmCSPのうち、ループ領域に含まれるアミノ酸残基をセリン残基に置換した変異体TmCSP（AB3Ser、及びCD3Ser）では、高い熱安定性が維持された（図３－１のｂ、図３－２のｄ）。しかしながら、ループ領域に含まれるアミノ酸残基のセリン残基への置換に加えて、さらに1個、2個又は4個のセリン残基を挿入して伸長させた変異体TmCSP（AB3Ser+1Ser、AB3Ser+2Ser、AB3Ser+4Ser、CD3Ser+1Ser、CD3Ser+2Ser、及びCD3Ser+4Ser）では、野生型のTmCSPに比べて最大約30℃のTm値の低下がみられた（図３－１のｂ、図３－２のｄ）。これは、ABループ又はCDループに変異を導入した変異体TmCSPにおいて、置換したアミノ酸配列の長さが短いことから、新たにアミノ酸を挿入する変異の導入により野生型TmCSPの立体構造が維持されなかったことが原因と考えられる。このことは、CDループに変異を導入した変異体TmCSPのうち、ループ領域に含まれるアミノ酸残基をセリン残基に置換した変異体TmCSPであるCD7Ser、及び、当該置換に加えてさらに4個のセリン残基を挿入して伸長させた変異体TmCSPであるCD7Ser+4Serの両方において、高い熱安定性が維持された結果とも一致する。
　一方、BCループ又はDEループに変異を導入した変異体TmCSPでは、ループ領域に含まれるアミノ酸残基をセリン残基に置換した変異体TmCSP（BC5Ser、DE7Ser、及びDE6Ser）、並びに、ループ領域に含まれるアミノ酸残基のセリン残基への置換に加えて、さらに2個又は4個のセリン残基を挿入して伸長させた変異体TmCSP（BC5Ser+4Ser、DE7Ser+4Ser、DE6Ser+2Ser、及びDE6Ser+4Ser）の全てにおいて、高い熱安定性が維持された（図３－２のｃ、図３－４のｇ、ｈ）。これは、BCループ及びDEループが、ABループ及びCDループに比べて、ループ領域が長いことから、当該ループ領域に新たにアミノ酸を挿入する変異が導入されても野生型のTmCSPの立体構造が維持されやすいことを示唆している。
　以上の結果から、TmCSPは、短いループ領域におけるアミノ酸残基の挿入による変異を除き、アミノ酸残基の置換や連続的なアミノ酸残基の挿入による変異に極めて寛容であることが示された。すなわち、TmCSPは熱安定性の高い抗体模倣分子の骨格としての利用に有効であることが示された。
　＜実施例２＞
　抗体模倣分子の作製
　（１）遺伝子ライブラリの作製
　（１－１）dU-ssDNAの作製
　TmCSPのC末端側に全長pIIIが融合されたタンパク質の遺伝子を含むPhagemid（pBluescript II SK(+)（Agilent）をベースとする派生ベクター、Amp耐性）でコンピテントセルCJ236（Cm耐性、タカラバイオ）を形質転換し、LBプレート培地（Amp 100 μg/mL, Cm 10 μg/mL、いずれも終濃度）にまいた。プレートからシングルコロニーを拾い、試験管を用いて3 mLの2×YT培地（Amp 100 μg/mL, Cm 10 μg/mL、いずれも終濃度）に植菌した。その後、37℃、160 rpmの条件で、OD600 ＝ 0.5になるまで振盪した。120 mLの2×YT培地（Amp 100 μg/mL、Uridine 0.5 μg/mL、Helper phage M13KO7（New England BioLabs）109 pfu/mL、いずれも終濃度）に前培養液1.2 mLを加え、37℃、160 rpmの条件で90 min振盪培養を行った。Kanを終濃度 70 μg/mLとなるように加え、37℃、160 rpmの条件で一晩培養を行った。4本の滅菌済み50 mL容ファルコンチューブに培養液を等分で移し、8,500 rpm、4℃の条件で60 min遠心後、上清を新しい滅菌済み50 mL容ファルコンチューブに移した。8,500 rpm、4℃の条件で30 minさらに遠心後、上清を新しい滅菌済み50 mL容ファルコンチューブに移し、そこにPEG/NaCL溶液（Polyethylene glycol（average mol wt 8,000、Sigma-Aldrich) 66.6 g とNaCL 78 gを317 mLのMilliQ水に溶解し、滅菌処理をしたもの) 7.5 mL を加えて撹拌した。その後、氷上で60 min静置した。8,500 rpm、4℃の条件で60 min遠心後、上清を捨て、沈殿を回収した。4本分のファルコンチューブの沈殿を1 mLのTBS（20 mM Tris-HCL pH 8.0, 150 mM NaCL)で溶かし、マイクロチューブに移した後、15,000 rpm、4℃の条件で5 min遠心を行った。上清を回収後、その上清に250 μLのPEG/NaCL溶液を加え、撹拌した。その後、氷上で30 min静置した。15,000 rpm、4℃の条件で30 min遠心後、上清を捨て、沈殿を回収した。沈殿を500 μLのTBSで溶かし、その後、15,000 rpm、4℃の条件で5 min遠心し、上清を回収した。回収した上清に含まれるM13KO7ファージに対して、QIAprep（商標）Spin M13（QIAGEN）を用いて、当該製品のプロトコールに従ってdU-ssDNAを精製した。
　（１－２）Hetero-DNAの合成（Kunkel法)
　表４に記載のオリゴDNAを、表５に記載の組成で5’末端リン酸化処理を行った。リン酸化反応は、37℃：2 hrs、75℃：15 min、25℃：∞の順で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表６に示す組成で、dU-ssDNAに5’末端リン酸化オリゴDNAをアニーリングした。アニーリング反応は、70℃：12 min、0.1℃/secで37℃まで温度を下げ、37℃：20 minの順で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　アニーリング反応を終えた溶液10 μLを37℃に保温したまま、表７に示した組成の伸長反応溶液3 μLを加えて、伸長反応を行った。伸長反応は、37℃：30 min、70℃：15 min、8℃：∞の順で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（１－３）Mutagenized-DNAの作製
　pMCSG1 Plasmid（Spec耐性、我々の研究室で作製したlacI高発現用Plasmid）を用いてE.coli SS320（Lucigen）を形質転換し、LBプレート培地（Tet 10 μg/mL, Spec 50 μg/mL、いずれも終濃度）にまいた。プレートよりシングルコロニーを拾い、500 mLのSuperbroth（Tet 10 μg/mL, Spec 50 μg/mL、いずれも終濃度）に植菌した。37℃、120 rpm攪拌でOD600 = 0.5になるまで培養し、その後、培養液を氷上で10 min静置した。培養液を500 mL遠沈管2本に250 ｍL ずつに分け、5,000 rpm、2℃の条件で5 min遠心し、沈殿を250 mLの滅菌済み1 mM HEPES-Na Bufferで懸濁し、再度5,000 rpm、2℃の条件で5 min遠心した。上清を捨て、沈殿を滅菌済みMilliQ水で懸濁し、再び5,000 rpm、2℃の条件で5 min遠心し、上清を捨てた。再度、滅菌済み1 mM HEPES-Na Bufferを用いた洗浄と、滅菌済みMilliQ水を用いた洗浄をそれぞれ1回ずつ行い、その後、沈殿に350 μLの滅菌済みMilliQ水を加え、懸濁した。Kunkel法で作製したHetero-DNAをFastGeneTMゲル/PCR抽出キット（ニッポンジーン）で精製した。精製したHetero-DNAとSS320（pMCSG1で形質転換されたもの）の懸濁液350 μLを混合し、BIO-RADのPULSE CONTROLLER PLUSとBIO-RADのGENE PULSER（商標）IIを用いて、2.5 KV の電気パルスで形質転換を行った。電気パルスをかけ終えるとすぐに1 mLのSOC培地を加えた。さらに50 mLのSOC培地を加え、その後、1 hour、37℃、120 rpm攪拌で回復培養を行った。
　回復培養が終わった培養液を用いてタイター測定を行った。具体的には、培養液をTBSで10-2～10-6まで希釈し、それぞれの希釈液を5 μLずつ、LBプレート培地（Amp 100 μg/mL、Spec 50 μg/mL、いずれも終濃度）にまいてコロニーの数からタイターを算出した。
　SOC溶液を500 mLの2xYT（Amp 100 μg/mL、Spec 50 μg/mL、いずれも終濃度）に加え、37℃、120 rpm攪拌で一晩培養を行った。滅菌済みファルコンチューブ6本に等分となるように集菌を行った（1本あたり約90 mLの培養液を回収）。なお、この集菌では5,000 rpm、4℃の条件で10 min遠心を行った。Wizard（商標）Plus Midipreps DNA Purification System（Promega）を用いて、集菌したファルコンチューブ1本分の菌体からDNAを抽出した。DNAは300 μLの滅菌済みMilliQ水で溶出した。
　（２）CSPファージライブラリの作製
　作製したMutagenized-DNAを表８に示す組成で、37℃、1 hour制限酵素処理を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　制限酵素処理後の反応液を3等分（約33 μLずつ）に分け、FastGeneTMゲル/PCR抽出キット（ニッポンジーン)で精製した。精製したMutagenized-DNAを用いてSS320（pMCSG1を含む）を形質転換した。SOC培養液を500 mLの2xYT（Carb 100 μg/mL、Spec 50 μg/mL、IPTG 0.2 mM、Hyperphage M13KO7ΔpIII（PROGEN）9.0×109pfu/mL）に加え、37℃、120 rpm攪拌で一晩培養を行った。培養液を277 mLずつに分けて遠心管に入れ、8,500 rpm、4℃の条件で30 min遠心し、得られた上清を新しい遠心管に移した。その後、上清の液量の1/5量のPEG/NaCL溶液を加えて攪拌し、氷上で1 hour静置した。8,500 rpm、4℃の条件で1 hour遠心し、上清を捨てた後、それぞれの沈殿を30 mLのTBS Bufferで溶解した。8,500 rpm、4℃の条件で30 min遠心し、上清を新しい滅菌済み50 mL容ファルコンチューブに移し、その後、上清の液量の1/5量のPEG/NaCL溶液を加えて攪拌し、氷上に30 min静置した。8,500 rpm、4℃の条件で30 min遠心し、上清を捨てた後、それぞれの沈殿を7.5 mLのTE Buffer（10 mM Tris-HCL pH 8.0、0.1 mM EDTA）で溶解した。8,500 rpm、4℃の条件で30 min遠心し、上清を新しい滅菌済み50 mL容ファルコンチューブに移した。終濃度が50%（v/v）となるようにグリセロールを加え、その溶液を-30℃で保管した。
　（３）ビオチン化された抗原モデルタンパク質の調製
　抗原モデルタンパク質として、緑色蛍光タンパク質（EGFP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、ユビキチン様タンパク質（ySUMO）、好熱菌由来エステラーゼ（AacEst）、アデニル酸キナーゼ（Adktm）、大腸菌リボヌクレアーゼHII（EcRNHII）の6種類を選び、それぞれの遺伝子をpHBT2ベクター（pET28aをベースとする派生ベクター、Kan耐性）のBamHI/XhoIサイトに挿入した。なお、このコンストラクトによって発現されたタンパク質は、N末端側からHis10tag、Avitag、TEV protease recognition site、抗原モデルタンパク質が融合されたものとなる。調製したPlasmidと、pBirA plasmid（pACYC184ベクターにBirA遺伝子が挿入されたもの、Cm耐性）を用いてE.coli BL21DE3Eを形質転換し、LBプレート培地（Kan 50 μg/mL、Cm 10 μg/mL、いずれも終濃度）にまいた。シングルコロニーを拾い、2xYT培地（Kan 50 μg/mL、Cm 10 μg/mL、いずれも終濃度）に植菌し、OD600の数値が0.5になるまで37℃、120 rpmで振盪培養した。その後、終濃度が200 μMとなるようにD-Biotinを、また、終濃度が0.2 mMとなるようにIPTGを加え、18℃、120 rpmの条件で一晩、発現誘導を行った。培養液を8,000 rpm、4℃の条件で10 min遠心することで集菌した。集菌した菌体をTBSに懸濁した後、超音波破砕を行った。破砕後の溶液を18,000×g、4℃の条件で30 min遠心し、上清を回収した。得られた上清を0.45 μmフィルターに通して清澄化した後、アフィニティークロマトカラムHisTrap FF（Cytiva）を用いて精製を行った。このカラム精製では、結合バッファーとして20 mM Imidazole、20 mM Tris-HCL pH 8.0、500 mM NaCLを用い、溶出バッファーとして500 mM Imidazole、20 mM Tris-HCL pH 8.0、500 mM NaCLを用いた。回収した目的タンパク質を含むフラクションを0.45 μmフィルターに通して清澄化した後、サイズ排除クロマトカラムHiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade（Cytiva）に供した。目的タンパク質を含むフラクションをSDS-PAGE解析によって判断し、回収した。なお、このカラム精製の際に溶出バッファーとしてTBSを用いた。
　（４）バイオパニング法（ファージディスプレイ法と酵母表層ディスプレイ法）による抗体模倣分子の選別
　本発明者らの報告（[Monobody-mediated alteration of enzyme specificity. Nature Chem. Biol. 11, 762-764. (2015)]、及び[Monobody-mediated alteration of lipase substrate spepcficity. ACS Chem. Biol. 13, 1487-1492. (2018)]）に記載の方法に従い、CSPのファージライブラリを用いたバイオパニングを4ラウンド行った（図４）。抗原モデルの標的タンパク質としては、EGFP、MBP、ySUMO、AacEst、Adktm、及びEcRNHIIを用い、それぞれのラウンドでのタンパク質濃度は100 nM：1ラウンド目、100 nM：2ラウンド目、50 nM：3ラウンド目、50 nM：4ラウンド目、とした。
　上記6つの標的タンパク質に対して得られたファージクローン内のAB・CDループとDEループの遺伝子断片を、表９に示したオリゴDNAを用いてPCRで増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　それぞれの遺伝子セットとともに、酵母表層ディスプレイ用ベクター（pYD1（Invitrogen）をベースとする派生ベクター）をNcoIとXhoIで制限酵素処理して線状化したものを酵母EBY100（ATCC）に導入し、酵母細胞内での相同組み換えの原理を利用して、AB・CDループとDEループの遺伝子をシャッフリングした。その後、フローサイトメーター（JSANセルソーター、ベイ バイオサイエンス株式会社）を用いた選別を行った。なお、これらの一連の実験操作については、基本的にはKoideらの報告[Affinity maturation of single-domain antibodies by yeast surface display. Methods Mol. Biol. 911, 431-443. (2012)]に記載の方法に従って実施した。また、フローサイトメーターによる選別は標的タンパク質濃度を変えて複数ラウンド行っており、各ラウンドでの標的タンパク質濃度を表１０に示した。さらに、フローサイトメーターによる選別で用いた蛍光ラベリング用の試薬類を表１１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　（５）ELISAによる抗体模倣分子の抗原特異的結合能解析
　図５に示した系を用いて、以下の操作手順で行った。コンピテントセルXL1-Blue（Tet耐性、Agilent）を、pMCSG1（Spec耐性)とバイオパニングを経てモノクローン化したCSP（CSP(EGFP_01)、CSP(EGFP_02)、CSP(EGFP_03)、CSP(EGFP_04)、CSP(MBP_01)、CSP(ySUMO_01)、CSP(ySUMO_02)、CSP(ySUMO_03)、CSP(ySUMO_04)、CSP(ySUMO_05)）のPhagemid（Amp耐性）を用いて形質転換し、LBプレート培地（Amp 100 μg/mL、Tet 10 μg/mL、Spec 50 μg/mL）にまいた。プレートからシングルコロニーを拾い、試験管を用いて3 mLの2×YT培地（Amp 100 μg/mL、Tet 10  μg/mL、Spec 50 μg/mL）に植菌した。37℃、140 rpmの条件で、目視で菌体の増殖が確認できるまで振盪培養を行った。Hyperphageを終濃度が1×1010 pfu/mLとなるようにを加え、室温で30 min静置した。IPTGを終濃度が0.2 mMとなるように加え、37℃、140 rpmの条件で一晩培養を行った。1 mLの培養液を15 min、15,000 rpm、4℃の条件で遠心し、上清を回収した。Nunc MaxiSorp Plate（Thermo Fischer Scientific）を用いて、1ウェルあたりに50 μLのNeutrAvidin溶液（4 μg/mL in TBS）を入れ、4℃で一晩、静置で固定した。NeutrAvidin溶液を捨て、200 μLのTBSで1回洗浄した。150 μLのTBS/0.5% BSA溶液を各ウェルに入れ、25℃、110 rpmの条件で撹拌しながら1 hourブロッキングを行った。TBS/0.5% BSAを捨て、200 μLのTBSで1回洗浄した。50μLの200 nM ビオチン化抗原モデルタンパク質（EGFP、MBP、ySUMO）を入れ、25℃、110 rpmの条件で撹拌しながら、30 min固定化反応を行った。残ったビオチン化抗原モデルタンパク質溶液を捨て、200 μLのTBSで2回洗浄した。45 μLのファージ溶液と5 μLの5%（w/v）BSA溶液を混合しながら各ウェルに入れ、25℃、110 rpmの条件で撹拌しながら、40 min結合反応を行った。残ったファージ溶液を捨て、200 μLのTBS/0.1%（v/v）TWEEN（登録商標）-20（以降、TBSTという）で5回洗浄した。TBSTで希釈したanti-M13-HRP conjugated（0.15 μg/mL）溶液を50 μL/ウェルで入れ、25℃、40 min、110 rpmの条件で撹拌しながら結合させた。残ったanti-M13-HRP conjugated溶液を捨て、200 μLのTBSTで4回洗浄した。さらに200 μLのTBSで1回洗浄した。1-Step Ultra TMB ELISA Substrate Solution（Thermo Fischer Scientific）を50 μL加え、2～10 minで溶液が青くなることを確認し、その後、2.0 M 硫酸を50 μL加え、反応を停止した。プレートリーダー（iMark（商標）マイクロプレートリーダー、BIO-RAD）を用いて、波長450 nmの吸光度を測定した。
　＜結果＞
　ELISAによる抗原特異的結合能解析の結果、選抜された抗体模倣分子は各標的タンパク質を特異的に認識可能であることが示された（図６）。
　（６）酵母表層ディスプレイ法による抗体模倣分子の抗原特異的結合能解析
　得られた変異体TmCSPの各標的タンパク質に対する特異的結合能は、酵母表層ディスプレイ法を用いて、本発明者らの報告（[Monobody-mediated alteration of enzyme specificity. Nature Chem. Biol. 11, 762-764. (2015)]、及び[Monobody-mediated alteration of lipase substrate spepcficity. ACS Chem. Biol. 13, 1487-1492. (2018)]）に記載の方法に従って解析を行った。CSP(AacEst_01)、CSP(AacEst_02)、CSP(AacEst_03)、CSP(AacEst_04)、CSP(AdkTm_01)、CSP(AdkTm_02)、CSP(AdkTm_03)、CSP(AdkTm_04)、CSP(EcRNH2_01)、CSP(EcRNH2_03)を細胞表層に提示したそれぞれの酵母細胞に対して、500 nMのAacEST、Adktm、EcRNHIIを別々に混合して結合反応を行い、続いて洗浄を行った後、表１０に示した蛍光ラベル化用試薬の中から適当なものを選択して蛍光ラベル化した。得られた酵母細胞をフローサイトメーター（Guava Muse、Luminex）で解析を行った。特異的結合能の有無は、各標的タンパク質の濃度に対して結合に伴って上昇する蛍光強度の中央値（メディアン値）の比較から判断を行った。より具体的には、標的タンパク質に対する蛍光強度の中央値を1とした場合の、非標的タンパク質に対する値の相対値を算出して比較した（図７）。
　＜結果＞
　酵母表層ディスプレイ法による抗原特異的結合能解析の結果、選抜された抗体模倣分子は各標的タンパク質を特異的に認識可能であることが示された（図７）。
　（７）フローサイトメーター（FACS）による親和性解析
　得られた変異体TmCSPの各標的タンパク質に対する親和性は酵母表層ディスプレイを用いて、本発明者らの報告（[Monobody-mediated alteration of enzyme specificity. Nature Chem. Biol. 11, 762-764. (2015)]、及び[Monobody-mediated alteration of lipase substrate spepcficity. ACS Chem. Biol. 13, 1487-1492. (2018)]）に記載の方法に従って解析を行った。CSPを表層に提示した酵母細胞を様々な濃度の標的タンパク質と混合して結合反応を行い、続いて洗浄を行った後、表１０に示した蛍光ラベル化用試薬の中から適当なものを選択して蛍光ラベル化した。得られた酵母細胞をフローサイトメーター（Guava Muse、Luminex）で解析を行った。解離定数Kd値は、各標的タンパク質の濃度に対して、結合に伴って上昇する蛍光強度の中央値（メディアン値）をプロットし、そのプロットに対して1:1結合モデルでフィッティングすることで算出した。なお、このフィッティングではSigmaPlotソフトウェア（Systat Software）を用いた。
　（８）円二色性 (CD) スペクトル測定による二次構造解析
　（８－１）変異体TmCSPの発現・精製
　標的タンパク質に対する結合能が確認されたいくつかの変異体TmCSPについて、表１２に示したオリゴDNAを用いてPCRによって遺伝子を増幅し、その後、Sticky-end PCR法によってpHFT2ベクター（pET28aをベースとする派生ベクター、Kan耐性）のBamHI/XhoIサイトに挿入した。なお、このコンストラクトによって発現されたタンパク質は、N末端側からHis10tag、Flagtag、TEV protease recognition site、CSPが融合されたものとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　CSP遺伝子を挿入したpHFT2ベクターを用いて大腸菌BL21DE3を形質転換した。この形質転換体を2xYT培地（Kan 50 μg/mL、終濃度）でOD600の数値が0.5になるまで37℃、120 rpmで振盪培養した後、終濃度が0.5mMになるように IPTGを加え、18℃、120 rpmの条件で一晩、発現誘導を行った。培養液を8,000 rpm、4℃の条件で10 min遠心することで集菌した。集菌した菌体を懸濁バッファー（20 mM Tris-HCL pH 8.0、0.5 mg/mL リゾチーム、10 μg/mL DNase I、10 μg/mL RNase I、5 mM MgCl2、いずれも終濃度）に懸濁した後、37℃で1 hour静置することで、菌体破砕とDNA/RNAの分解処理を行った。反応後の溶液に終濃度が500 mMとなるようにNaCLを添加し、その後、超音波によってさらに菌体破砕を行った。破砕後の溶液を18,000×g、4℃の条件で30 min遠心し、上清を回収した。得られた上清を0.45 μmフィルターに通して清澄化した後、アフィニティークロマトカラムHisTrap FF（Cytiva）を用いて精製を行った。このカラム精製では、結合バッファーとして20 mM Imidazole、20 mM Tris-HCL pH 8.0、500 mM NaCLを用い、溶出バッファーとして500 mM Imidazole、20 mM Tris-HCL pH 8.0、500 mM NaCLを用いた。イミダゾールが段階的濃度勾配になるようにフラクションを8.0 mLずつ回収した。目的タンパク質の純度検定は18%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで行った。回収したピークフラクションを20 mM Tris-HCL pH8.0の溶液で透析してバッファー交換を行った後、0.45 μmフィルターに通して清澄化し、続いて、陰イオン交換クロマトカラムHiTrapQ HP（Cytiva）を用いて精製を行った。このカラム精製では、結合バッファーとして20 mM Tris-HCL pH 8.0を用い、溶出バッファーとして20 mM Tris-HCL pH 8.0、1 M NaCLを用いた。NaCLが段階的濃度勾配になるようにフラクションを8.0 mLずつ回収した。目的タンパク質の純度検定は18%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで行った。回収した目的タンパク質を含むフラクションを0.45 μmフィルターに通して清澄化した後、サイズ排除クロマトカラムHiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade（Cytiva）に供した。目的タンパク質を含むフラクションをSDS-PAGE解析によって判断し、回収した。なお、このカラム精製の際に溶出バッファーとしてPBS（137 mM NaCL、2.7 mM KCL、1.8 mM KH2PO4、10 mM NaH2PO4、pH 8.0にNaOHで調整）を用いることで、PBSへのバッファー置換も同時に行った。
　（８－２）円二色性 (CD) スペクトル測定
　短波長（210 nm～260 nm）CDスペクトルはJ-725 spectropolarimeter（日本分光）を用いて、20℃、80℃、100℃処理後のサンプルについて20℃、オートクレーブ処理（121℃、20分、2気圧）後のサンプルについて20℃、の条件で測定した。サンプルはPBS Bufferで0.10～0.20 mg/mLに希釈し、光路長2 mmの石英セルを用いて行った。平均残基分子楕円率［θ］（deg cm2 dmol-1）の換算にはアミノ酸の平均分子量110を用いた。
　（９）ゲルろ過クロマトグラフィーによる結合能解析
　以下の実験に用いた変異体TmCSPタンパク質は、（８－１）と同様の方法で発現・精製した。
　9.6 μMのCSP溶液、8 μMの抗原モデルタンパク質溶液、9.6 μMのCSPと8 μMの抗原モデルタンパク質の混合溶液、100℃で10 min処理した後の9.6 μMのCSPと8 μMの抗原モデルタンパク質の混合溶液、オートクレーブ処理（121℃、20 min、2気圧）した後の9.6 μMのCSPと8 μMの抗原モデルタンパク質の混合溶液をそれぞれ用意し、サイズ排除クロマトカラムSuperdex 75 Increase 10/300 GL（Cytiva）に供した。混合溶液は、CSPと抗原モデルタンパク質を混合後に110 rpm、25℃で30 min結合反応を行った後、カラムに供した。サンプル溶量は500 μLを添加した。混合溶液において結合が確認できると、抗原モデルタンパク質のピークが高分子量側にシフトし、またCSPのピーク面積が減少する。100℃で10 min処理したサンプル、または、オートクレーブ処理したサンプルにおいて、熱処理前と同等のピークシフトが確認された場合には、CSPの結合能がほぼ100%維持されている（＝ほぼ100%巻き戻っている）と判断した。他方、ピークシフトが不十分である場合、ピーク成分を分解するために、仮定したガウス曲線（正規分布）をExcel用計算ソフトのソルバーを用いて非線形最小二乗法でフィッティングを行った。その結果の一例を図８に示す。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーでは、抗原モデルのみ（単独タンパク質）であっても、ピーク後半に尾を引いた形であり、必ずしもガウス曲線とはならない。そのため、2成分のガウス曲線に分解されてしまう（図８の１のパネル）。このことを考慮するために、熱処理後の混合溶液だけではなく、熱処理前の混合溶液についても、ピークを2成分のガウス曲線に分解し、そのうち、複合体部分の成分だけを抽出してその面積（図８の斜線部分）の比較を行った。この面積比から、熱処理後にどれだけ結合能を保持しているのか（＝どれだけ巻き戻っているのか）の割合を算出した。
　＜結果＞
　（７）～（９）の結果を表１３に示す。FACSによる親和性解析により、得られた抗体模倣分子には標的タンパク質に対して高親和性を示すものが存在することが示された。また、CDスペクトル測定による二次構造解析及びゲルろ過クロマトグラフィーによる結合能解析の結果、本発明の抗体模倣分子は、高温処理後又はオートクレーブ処理後常温に戻すと、その二次構造及び標的タンパク質に対する結合能が回復することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　（１０）分子間相互作用分析装置を用いた親和性解析
　変異体TmCSP(AacEst_01)の加熱処理前後における標的タンパク質AacEstに対する親和性を分子間相互作用分析装置であるBiacore（登録商標）T-100（Biacore社）を用いて分析した。加熱処理として、高温処理（100℃、10分）又はオートクレーブ処理（121℃、20分、2気圧）を行った。
　抗体模倣分子（変異体TmCSP(AacEst_01)）をリガンド、抗原モデルタンパク質AacESTをアナライトとして解析を行った。Chipは、Series S Sensor Chip NTAを用いた。リガンド側の抗体模倣分子は、Ｎ末端側のHis10 tagを利用して、Chip上に固定化した。アナライト側の抗原モデルタンパク質は、TEVプロテアーゼ処理を行うことでHis10 tagを切断して、His10 tagを介してChip上には結合しないようにした。
　測定時のRunninng bufferの組成は10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.005% Tween（登録商標）20であった。Chip上にリガンドを固定化するために、再生溶液（0.35 M EDTA in running buffer）を流速20 μL/minで60秒間流し、続いてNi溶液（500 μM in running buffer）を流速20 μL/minで60秒間流した後、リガンド溶液（200 nM 抗体模倣分子 in running buffer）を流速10 μL/minで420秒間流した。測定条件は、流速20 μL/min、Contact time 420秒、Dissociation time 420秒で行った。同じ濃度条件のアナライトはそれぞれ2回ずつ測定した。
　結果を図９に示す。高温処理又はオートクレーブ処理を行った変異体TmCSP(AacEst_01)の標的タンパク質AacEstに対する親和性はいずれも、熱処理なしの変異体TmCSP(AacEst_01)の標的タンパク質AacEstに対する親和性と比べて有意な差は見られなかった。このことから、加熱処理が本発明の抗体模倣分子の標的タンパク質に対する親和性に影響を与えないことが示された。
　（１１）凍結乾燥が変異体TmCSPに与える影響の検証
　凍結乾燥により抗体模倣分子の長期保存や輸送コストの削減等が可能となる。一方で、凍結乾燥によりタンパク質が変性し不活化するおそれがあった。そこで、凍結乾燥が本発明の抗体模倣分子の二次構造、熱安定性、及び結合能に与える影響を検証した。
　精製した抗体模倣分子を液体窒素で凍結した後、-80℃で保管した。-80℃で凍結保存している抗体模倣分子を真空ポンプGLD-136C（ULVAC社製）と凍結乾燥機VD-500F (TITEC社製）を用いて減圧しながら乾燥させた。乾燥させたサンプルを再びBufferに懸濁して、以下の解析（１１－１）及び（１１－２）に供した。
　（１１－１）CDスペクトル測定による二次構造解析及び熱安定性解析
　凍結乾燥した変異体TmCSP(AacEst_01)をpH8.0のPBS Bufferに溶解し、0.20 mg/mLになるよう調製した。上記実施例（８）と同様の方法で、20℃、80℃又は100℃処理後のサンプルについて20℃の条件でCDスペクトルを測定した。
　CDスペクトル測定による二次構造解析結果を図１０に示す。凍結乾燥前後の変異体TmCSP(AacEst_01)の20℃でのCDスペクトルはほぼ一致していた。この結果から、凍結乾燥処理が抗体模倣分子の二次構造に影響を与えないことが示された。また、凍結乾燥後100℃で高温処理した変異体TmCSP(AacEst_01)の20℃でのCDスペクトルは、凍結乾燥処理せずに100℃で高温処理した変異体TmCSP(AacEst_01)の20℃でのCDスペクトルとほぼ一致していた。この結果から、凍結乾燥処理が高温処理後の抗体模倣分子の二次構造にも影響を与えないことが示された。
　CDスペクトル測定による熱安定性解析結果を図１１に示す。凍結乾燥前のTm値は45.4℃であったのに対して、凍結乾燥後のTm値は44.6℃であり、凍結乾燥前後におけるTm値は同程度であった。この結果から、凍結乾燥処理が抗体模倣分子の熱安定性に影響を与えないことが示された。
　（１１－２）分析ゲルろ過クロマトグラフィーによる結合能解析
　凍結乾燥処理前又は凍結乾燥処理後の12 μMのCSP（変異体TmCSP(AacEst_01)）溶液、10 μMの抗原モデルタンパク質(AacEst)溶液、凍結乾燥処理前又は凍結乾燥処理後の12 μMのCSP(AacEst_01)と10 μMの抗原モデルタンパク質(AacEst)の混合溶液、100℃で10 min処理した後の9.6 μMのCSPと8 μMの抗原モデルタンパク質の混合溶液をそれぞれ用意し、サイズ排除クロマトカラムSuperdex 75 Increase 10/300 GL（Cytiva）に供した。混合溶液は、CSPと抗原モデルタンパク質を混合後に110 rpm、25℃で30 min結合反応を行った後、カラムに供した。サンプル溶量は500 μLを添加した。
　結果を図１２に示す。凍結乾燥後（B）の変異体TmCSP(AacEst_01)は、凍結乾燥前（A）の変異体TmCSP(AacEst_01)と同様に、抗原モデルタンパク質（AacEst）と結合して複合体となることで溶出ピーク位置が高分子量側（少ない体積側）へとシフトすることが確認された。また、この溶出ピーク位置における溶出液をSDS-PAGEに供したところ、AacEst及びCSP(AacEst_01)を示すバンドが確認され、このことからも凍結乾燥後の変異体TmCSP(AacEst_01)と抗原モデルタンパク質AacEstとが結合したことが支持された。これらの結果から、凍結乾燥処理が抗体模倣分子の結合能に影響を与えないことが示された。
　＜実施例３＞
　ヒト由来CSDの抗体模倣分子の骨格としての利用可能性の検証
　超好熱菌由来Thermotoga maritima由来のCold Shock Protein（TmCSP）を骨格とした抗体模倣分子では、ヒトに対する免疫原性の問題が生じる可能性が高い。そこで、ヒト由来タンパク質を骨格とした加熱滅菌可能な抗体模倣分子の創出を試みた。
　CSPは、コールドショックドメイン（Cold Shock Domain；CSD）として、細菌からヒトに至るまで高度に保存されている [D. Karlson et al., A Journal of Biological Chemistry, 277(38), 35248-35256 (2002)]。これまでに複数のヒト由来CSD（hCSD）の配列が同定されており、その中で8種類のhCSDの構造が解析され、Protein Date Bank（PDB）に登録されている（表１４）。それら8種類のhCSDは、TmCSPとの配列相同性や構造相同性も非常に高い。しかし、hCSDのリフォールディング特性に関する報告はない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表１４に示す10種類のCSDのうち、ヒトYB1のCSD(1H95)、ヒトURNタンパク質の1番目のCSD(1WFQ)、ヒトURNタンパク質の2番目のCSD(2YTX)、及びヒトURNタンパク質の4番目のCSD(2YTY)の4種類が大腸菌を用いた可溶性発現量が多かったので、これら4種類のタンパク質について、CDスペクトル測定により、加熱処理前後における二次構造解析と熱安定性解析を行った。タンパク質精製方法ならびにCDによる解析方法は、TmCSPの際と同様の方法で行った。加熱処理として、高温処理（80℃、12分、若しくは100℃、10分）又はオートクレーブ処理（121℃、20分、2気圧）を行った。
　CDスペクトル測定による二次構造解析結果を図１３に示す。1H95は、20℃での構造が不安定であった。また、1WFQは、80℃にさらされるだけで天然型構造の二次構造に回復することがなかった。さらに、2YTX、及び2YTYは、オートクレーブ処理（121℃、20分、2気圧）では二次構造が回復しなかった一方で、高温処理（100℃、10分）では二次構造が回復した。これらの結果から、2YTX、及び2YTYは、100℃、10分での加熱殺菌処理に耐え得る抗体模倣分子の骨格としての可能性が示唆された。
　CDスペクトル測定による熱安定性解析結果を図１４に示す。1H95のTm値は測定不能であった。1WFQは、解析した4種類のタンパク質のうち最も熱安定性が高かったが、図１３で示した通り80℃での高温処理を行うと二次構造が回復しなかったため、加熱殺菌可能な抗体模倣分子の骨格に適していないと判断した。そのため、Tm値が54.8℃と二番目に熱安定性が高く、高温処理（100℃、10分）後に二次構造が回復した2YTXが加熱殺菌可能なヒト由来抗体模倣分子の骨格として最適であると考えた。
　2YTXは、TmCSPのA～Eに対応する5つのβシートを有し、構造表面に4つのループ領域（ABループ、BCループ、CDループ、及びDEループ）を有する。以下に、2YTXのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　上記アミノ酸配列中の四角で囲まれた配列は、それぞれ2YTXの4つのループ領域を構成するアミノ酸配列を示す。すなわち、ABループのアミノ酸配列はＫＥＡ、BCループのアミノ酸配列はＲＧＤＶＶＫ、CDループのアミノ酸配列はＨＹＳＥＦＫ、DEループのアミノ酸配列はＫＤＲＮＧＫＥＶである。
　2YTXについて、アミノ酸残基を網羅的に変異多様化させた変異体CSDを創出し、CSDのループ領域が抗原結合部位として機能し、かつ、リフォールディング特性を維持する抗体模倣分子を得ることを目的とした。
　変異体hCSDでは、CSDのループ領域又はβシートに変異を導入した。βシートにおける変異の導入は、側鎖が構造の外側を向いたアミノ酸残基に置換可能であるのかを検証することを目的とした。また、2YTXは、Cys残基を有しており、還元環境下である細胞質内での応用の際にジスルフィド結合による影響を考慮しなくても済むようにCys残基の置換も検討した。2YTXの各変異体hCSDの変異導入箇所及び変異の種類を表１５に、2YTXにおける変異導入箇所を図１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　上記の変異を導入した変異体hCSD（2YTX）を作製し、これら変異体hCSDのリフォールディング特性を調べるために、CDスペクトル測定により、加熱処理前後における二次構造解析及び熱安定性解析を行った。結果を図１６及び図１７に示す。また、これらの結果をまとめて表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 表１６中、可溶性発現について、可溶性発現が確認できた場合は「○」、可溶性発現が確認できなかった場合は「×」とした。また、加熱処理後の二次構造回復について、二次構造が完全に回復した場合は「○」、二次構造の回復が不完全であった場合は「△」、未解析の場合は「－」とした。さらに、熱安定性について、Tm値が57.0℃以上の場合は「◎」、Tm値が51.7℃以上51.6℃未満の場合は「○」、Tm値が51.6℃以下の場合は「△」、未解析の場合は「－」とした。
　CDスペクトル測定による二次構造解析結果より、変異体hCSD(BC8Ser)を除くすべての変異体hCSDが高温処理（100℃、10分）後も二次構造が回復することが示された。また、CDスペクトル測定による熱安定性解析結果より、ABループ及びBCループでは、これらのループを構成するアミノ酸残基をSer残基に連続置換しても熱安定性が損なわれないこと、BCループでは、4個のSer残基の導入により伸長しても熱安定性が維持されることが示された。さらに、BCループの両端に位置する18番目と25番目のGlu残基は、Ser残基に置換すると加熱処理後の二次構造回復割合が低下したが（変異体hCSD(BC8Ser)）、同じ酸性アミノ酸であるAsp残基に置換しても加熱処理後の二次構造回復割合が低下しないことが示された（変異体hCSD(BC6Ser+E18D/E25D)）。一方で、CDループ及びDEループでは、Ser残基への置換により熱安定性が低下したことから、ライブラリ設計においてCDループ及びDEループは変異導入箇所として適さないことが分かった。
　また、Cys残基の置換については、8番目のCys残基をVal残基又はSer残基に置換しても加熱処理後の二次構造回復能及び熱安定性が低下しないことが確認された（変異体hCSD(C3V)、及び変異体hCSD(C8S/A9S)）。
　さらに、βシート上での置換については、14番目及び16番目のPhe残基のSer残基への置換が熱安定性を低下させることが示された（変異体hCSD(F14S/F16S)）。一方で、9番目のAla残基のSer残基への置換、又は14番目、16番目、及び27番目のPhe残基のTyr残基への置換は加熱処理後の二次構造回復能及び熱安定性を低下させないことが示された（変異体hCSD(C8S/A9S)、及び変異体hCSD(F14Y/F16Y/F27Y)）。
　以上のことから、ABループ及びBCループがライブラリの変異導入箇所として利用できることが示唆された。また、βシート上では、8番目のCys残基と9番目のAla残基がランダム変異可能であることが示唆された。さらに、14番目、16番目、及び27番目のPhe残基はランダム変異には寛容ではないものの、分子接触を親和性と特異性の両方の面で媒介するために抗体模倣分子の変異導入箇所に出現頻度の高いTyr残基に置換が可能であることが示唆された。

Claims (15)

  1. 少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むコールドショックプロテイン（CSP）又はコールドショックドメイン（CSD）を骨格とし、
    前記変異が導入される前のCSP又はCSDが少なくとも10000 nM以下の強さのKdで結合しない標的分子に対して少なくとも10000 nM以下の強さのKdで結合する、抗体模倣分子。
  2. 前記変異した構造表面アミノ酸が、CSP又はCSDのループ領域に含まれる、請求項１に記載の抗体模倣分子。
  3. 前記CSPが、好熱性の菌由来である、請求項１又は２に記載の抗体模倣分子。
  4. 前記CSPが、配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、リフォールディング特性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体模倣分子。
  5. 前記CSPが、超好熱菌Thermotoga maritima由来である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体模倣分子。
  6. 前記CSDが、ヒト由来である、請求項１又は２に記載の抗体模倣分子。
  7. 前記CSDが、配列番号３～１２で表されるアミノ酸配列のいずれか一つと80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、リフォールディング特性を有する、請求項１、２、及び６のいずれか一項に記載の抗体模倣分子。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体模倣分子をコードする、核酸分子。
  9. 請求項８に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  10. 請求項８に記載の核酸分子を含む、核酸ライブラリ。
  11. 請求項１０に記載の核酸ライブラリに由来する、ペプチドディスプレイライブラリ。
  12. 少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とし、
    前記変異が導入される前のCSP又はCSDが少なくとも10000 nMの強さのKdで結合しない標的分子に対して少なくとも10000 nMの強さのKdで結合する抗体模倣分子を製造する方法であって、
    （Ａ）少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とするポリペプチドのディスプレイライブラリに標的分子を接触させ、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを選別する工程；及び
    （Ｂ）前記（Ａ）工程で選別された少なくとも1種のポリペプチドを用いて、前記（Ａ）工程を少なくとも1回繰り返すことにより、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを、前記抗体模倣分子として選別する工程
    を含む、製造方法。
  13. 前記抗体模倣分子を加熱及び／又は加圧処理する工程をさらに含む、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とする抗体模倣分子であって、
    前記変異が導入される前のCSP又はCSDが少なくとも10000 nMの強さのKdで結合しない標的分子に対して少なくとも10000 nMの強さのKdで結合し、かつ
    （Ａ）少なくとも1個の変異した構造表面アミノ酸を含むCSP又はCSDを骨格とするポリペプチドのディスプレイライブラリに標的分子を接触させ、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを選別する工程；及び
    （Ｂ）前記（Ａ）工程で選別された少なくとも1種のポリペプチドを用いて、前記（Ａ）工程を少なくとも1回繰り返すことにより、少なくとも10000 nMの強さのKdで標的分子に結合する少なくとも1種のポリペプチドを、前記抗体模倣分子として選別する工程
    を含む方法によって得られうる、抗体模倣分子。
  15. 加熱及び／又は加圧処理されている、請求項１４に記載の抗体模倣分子。
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