KR101262505B1 - 데쓰 도메인 수퍼패밀리 단백질의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합된 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질의 정제방법을 제공하고자 하며, 보다 구체적으로 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5 의 용해버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 상기 단백질을 푸는 (unfolding) 단계를 포함하는 재조합 단백질의 정제방법을 제공하는데, 상기 단백질 정제방법에 의할 때 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질은 본래의 올바른 접힘 구조를 가져서 기능을 나타낼 뿐만 아니라 높은 단백질 정제수율과 순도를 달성할 수 있다.

Description

데쓰 도메인 수퍼패밀리 단백질의 정제방법 {Method for Purifying Proteins belonging to death domain superfamily}

본 발명은 재조합된 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질의 정제방법을 제공하고자 한다.

대장균에서 생산된 많은 재조합된 타겟 단백질들은 흔히 정제과정 중 기능을 상실한 봉입체 (inclusion bodies)로 알려진 불용성의 응집체 (insoluble aggregates)를 형성하는데, 이러한 봉입체의 형성은 타겟 단백질을 사용한 생화학적 및 구조적 연구를 수행하는 것을 어렵게 한다.

이에 대한 극복방법 중 하나로 재접힘 (Refolding)을 시행하여 타겟 단백질의 발현과 정제 동안 응집체가 형성되는 것을 방지하고 있다. 전통적으로 사용하는 불용성 봉입체를 재접힘하는 방법은, 천천히 투석하거나 변성 버퍼에서 높은 농도의 우레아 (urea)나 구아니딘 클로라이드 (guanidine chloride)를 사용하여 타겟 단백질을 변성시킨 후에 많은 양의 재접힘 버퍼로 희석하는 것이다.

데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain (DD) superfamily)는 데쓰 도메인 서브패밀리 (death domain (DD) subfamily), 데쓰 이팩터 도메인 서브패밀리 (death effector domain (DED) subfamily), 카스파제 리크루먼트 도메인 서브패밀리 (caspase recruitment domain (CARD) subfamily) 및 피린 도메인 서브패밀리 (pyrin domain (PYD) subfamily)로 구성되며, 세포자살, 염증, 면역수용체 시그널에서 중요한 역할을 하기 때문에, 종래부터 재조합된 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain (DD) superfamily) 단백질에 대한 생화학적, 구조적 연구가 수행되고 이를 정제하고자 하는 많은 노력이 이루어졌으나, DD 수퍼패밀리 멤버의 발현과 정제는 불용성의 단백질 응집체의 형성으로 인해 데쓰 도메인 수퍼패밀리의 정제가 이루어지지 못하고 있다.

이러한 불용성의 단백질 응집체의 형성을 해결하고 데쓰 도메인 수퍼패밀리 단백질을 발현 및 정제하고자 종래의 재접힘 방법을 사용하였으나, 종래의 재접힘 방법을 사용할 경우 재접힘 (refolding) 산물이 바로 접히지 않고 부분적으로 변성이 남아 DD 수퍼패밀리 단백질이 재접힘 단계 동안 침전되었기에 올바른 접힘을 가진 본래의 기능적 단백질을 얻기 어려웠다.

종래의 재조합된 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily) 단백질은 정제과정 중 재접힘 (refolding) 산물이 올바르게 접히지 않고 부분적으로 변성이 남아 있기 때문에 재접힘 단계 동안 침전이 형성되었고, 정제과정이 끝나도 본래의 올바른 입체적 구조를 지닌 기능적 단백질을 정제하지 못하였다. 이에 본 발명자는 본래의 올바른 입체적 구조를 형성하여 기능을 나타내는 재조합된 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily) 단백질의 정제방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 용해버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 상기 단백질을 푸는 (unfolding) 단계를 포함하는 재조합 단백질의 정제방법을 제공한다.

상기 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질은 카스파제-1 (Caspase-1), AIM2 (Absent in melanoma 2), NALP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3) 및 RIP1 (Receptor interacting protein 1)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 용해버퍼는 15 내지 25mM 시트르산나트륨 (sodium citrate), 450 내지 550mM 염화나트륨 (NaCl), 3 내지 7mM 이미다졸 (imidazole) 및 2 내지 4M 우레아 (urea)로 이루어질 수 있다.

상기 단계 이후에 친화성 크로마토그패피를 수행하는 단계; 투석하는 단계; 및 겔여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계는, 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 용해버퍼에 용해된 단백질을 친화성 크로마토그래피에 로딩하고, 결합되지 않은 단백질을 상기 용해버퍼로 씻어낸 후, 결합된 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5 의 용출버퍼 (elution buffer)로 용출시키는 것일 수 있다.

상기 용출버퍼는 15 내지 25mM 시트르산나트륨 (sodium citrate), 450 내지 550mM 염화나트륨 (NaCl), 250 내지 350mM 이미다졸 (imidazole) 및 2 내지 4M 우레아 (urea)로 이루어질 수 있다.

상기 투석하는 단계는, 0.5 내지 2.5M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석시킨 후, 우레아가 포함되지 않은 pH 3.5 내지 5.5의 투석버퍼를 사용하여 투석하는 것일 수 있다.

본 발명의 단백질 정제방법을 이용하여 재조합된 데쓰 도메인 수퍼패밀리에 속하는 단백질은 기능을 유지하고 본래의 구조로 재접힘 (refolding)될 수 있을 뿐만 아니라 높은 정제 순도 (purity)와 수득률을 획득할 수 있었다. 이는 상기 데쓰 도메인 수퍼패밀리의 생체 외에서 구조적 및 생화학적 기능을 연구하는데 도움이 될 뿐만 아니라, 이들이 수행하는 세포자살, 염증반응, 선천적 면역 시그널 경로의 중심적 기능을 파악하고 응용함으로써 이를 근거로 다양한 질환의 치료제의 개발에 도움이 될 것이다.

도 1은 E. coli BL21 (DE3)에서 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD, 및 RIP1 DD 발현을 분석한 것이다. 도 1A는 카스파제-1, AIM2, NALP3, 및 RIP1 내의 타겟 DD 수퍼패밀리의 위치를 나타낸 것이고, 도 1B는 SDS-PAGE 후에 Coomassie blue staining한 것으로, 원이 표시된 부분은 필렛에서의 타겟 단백질을 나타낸다. (M: 마커 (marker), S: 상층액 (supernatant), P: 필렛 (pellet), F: 플루우 쓰루 (flow-through), W: 세척액 (washing), E: 300mM 이미다졸을 지닌 용출액 (elution with 300mM imidazole)).
도 2는 우레아를 사용하여 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD, 및 RIP1 DD을 용해시킨 것이다. 도 2A는 친화성 정제 (affinity purification) 동안 다양한 우레아 농도를 첨가한, 용해된 카스파제-1 CARD (left panel) 및 AIM2 PYD (right panel)의 크기를 나타낸 것이다. 도 2B는 전형적인 재용해 기술 (resolubilization technique)을 사용하여 정제 효율성을 비교한 것이다. B는 투석단계 전을 나타낸 것이고, A는 투석 단계 후를 나타낸 것이다. 도 2C는 3M 우레아 존재하에 용해된 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD, 및 RIP1 DD을 나타낸 것이다. 검은색의 박스로 표시된 부분은 부드럽게 펼쳐진, 용해된 타겟 단백질을 나타낸 것이다. (M: 마커 (marker), S: 상층액 (supernatant), P: 필렛 (pellet), F: 플루우 쓰루 (flow-through), W: 세척액 (washing), E: 300mM 이미다졸을 지닌 용출액 (elution with 300mM imidazole)).
도 3은 재접힘된 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD, 및 RIP1 DD을 정제한 것이다. 카스파제-1 CARD (A), AIM2 PYD (C), NALP3 PYD (E), 및 RIP1 DD (G)의 Superdex S-200 겔여과 컬럼 (gel-filtration column) 분석과, 카스파제-1 CARD (B), AIM2 PYD (D), NALP3 PYD (F), 및 RIP1 DD (H) Coomassie Brilliant Blue R250 염색된 피크로부터 얻은 조각 (fractions)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 붉은색 마크는 타겟 단백질을 나타낸다.
M: 마커 (marker), S: 투석하고 원심분리하여 얻은 상층액 (supernatant after dialysis followed by centrifugation), P: 투석하고 원심분리하여 얻은 침전물 (precipitants after dialysis followed by centrifugation), #: 조각의 갯수 (fraction numbers).
도 4는 재접힘된 카스파제-1 CARD (A), AIM2 PYD (B), NALP3 PYD (C), RIP1 DD (D) 및 FADD DD (E)의 원편광 이색성 분광을 나타낸 것으로, 잘 폴딩된 단백질인 FADD DD를 양성 대조군으로 사용하였다. 나선 함량 (helix contents)의 %을 GOR IV secondary structure prediction server로 계산하였다.
도 5는 재접힘된 RIP1 DD에 대해 기능적 분석한 것이다. 도 5A는 재접힘된 RIP1 DD와 FADD DD간에 복합체의 형성을 보이는 겔여과 프로파일 (Gel-filtration profile)을 나타낸 것이고, 도 5B는 RIP1 DD와 FADD DD 간의 상호작용을 Native PAGE 분석한 것이다. (lane 1, RIP1 DD only; lane 2, FADD DD only; lane 3, PIDD DD only; lane 4, RIP1 DD mixed with FADD DD; lane 5, RIP1 DD mixed with PIDD DD)
도 6은 DD 수퍼패밀리의 정제를 위한 세미-재접힘 (Semi-refolding) 전략을 나타낸 것이다. 최적화된 재접힘 과정의 도식화된 프로토콜이 재조합 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD, 및 RIP1 DD을 정제하기 위해 사용되었다.

본 발명은 재조합된 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질의 정제방법을 제공하고자 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

데쓰 도메인 수퍼패밀리의 재접힘은 비록 쉽지만, 실질적인 성공률은 매우 낮다. 종래에 재접힘을 위해 사용되었던 버퍼는 6~7M 우레아로, DD 수퍼패밀리의 멤버들은 6~7M 우레아에 의해 완전하게 펼쳐진 후에 응집을 형성하고 투석에 의해 재접힘되는 단계 동안 침전이 되는 경향이 있었다. 이러한 생리적 버퍼 상태에서의 불안정성 때문에 재접힘 (refolding)을 어렵게 되었고 정제된 단백질이 올바른 재접힘 구조를 가져서 기능을 나타내는 본래의 입체적 구조를 가지지 못하였는데, 본 발명에서는 상기 문제점을 해결하고 올바른 접힘 구조를 나타내는 단백질 정제방법을 찾고자 노력하던 중 산성의 pH, ~ 4M 우레아를 용해버퍼로 사용할 경우 데쓰 도메인 수퍼패밀리가 부분적으로 펼쳐지며 투석을 통해 우레아를 제거할 경우 본래의 온전한 구조로 재접힘 (refolding)됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

발명은 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5 의 용해버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 상기 단백질을 푸는 (unfolding) 단계를 포함하는 재조합 단백질의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 데쓰 도메인 수퍼패밀리는 세포자살, 염증반응, 선천적 면역 시그널 경로의 중심적 역할을 수행하기에 이의 구조적 및 생화학적 연구가 필요하였고, 이의 작은 크기, 이황화결합의 부재 및 6개의 나선 번들을 지닌 조밀한 구조 때문에 재접힘을 위한 이상적인 타겟이 되었다.

본 발명의 데쓰도메인 수퍼패밀리 (death domain (DD) superfamily)는 데쓰 도메인 서브패밀리 (death domain (DD) subfamily), 데쓰 이팩터 도메인 서브패밀리 (death effector domain (DED) subfamily), 카스파제 리크루먼트 도메인 서브패밀리 (caspase recruitment domain (CARD) subfamily) 및 피린 도메인 수퍼패밀리 (pyrin domain (PYD) subfamily)로 구성되는데, 이는 단백질 상호작용 모듈 (protein interaction modules)의 가장 큰 클라스들 중 하나일 수 있다.

본 발명의 데쓰도메인 수퍼패밀리에 포함하는 단백질은 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니고 데쓰 도메인 (death domain) 서브패밀리 단백질, 데쓰 이팩터 도메인 (death effector domain) 서브패밀리 단백질, 카스파제 리크루먼트 도메인 (caspase recruitment domain) 서브패밀리 단백질 및 피린 도메인 (pyrin domain) 서브패밀리에 속하는 단백질로 이루어진 군에서 선택된 단백질일 수 있으며, 상기 데쓰 도메인 수퍼패밀리에 속하는 단백질들은 대부분 유사한 구조적 특성을 지니고 있기 때문에 본 발명의 단백질 정제방법이 통용될 수 있다.

본 발명의 일례로, 데쓰도메인 수퍼패밀리는 카스파제-1 CARD (Caspase-1 caspase recruitment domain), AIM2 PYD (Absent in melanoma 2 pyrin domain), NALP3 PYD (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 pyrin domain), 및 RIP1 DD (Receptor interacting protein 1 death domain)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 카스파제-1, AIM2, 및 NALP3 단백질은 염증 및 선천적 면역반응에서 결정적인 역할을 하는 인플라마좀 (Caspase-1, AIM2, 및 NALP3)의 주요 구성성분이고, RIP1은 NF-kB 시그날 경로에서 포함된 세포의 양상 (face)을 결정하는 키나아제로, 각 단백질은 C-말단 또는 N-말단에서 상동의 단백질-단백질 상호작용을 할 수 있는 CARD (caspase recruitment domain), PYD (pyrin domain), 및 DD (death domain) 중 하나를 함유한다 (도 1A).

본 발명의 재조합 단백질은 유전공학계에서 널리 알려진 공지방법에 의해 타겟 단백질인, 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질이 발현되어 진 것일 수 있다.

본 발명에서는 재접힘 (refolding)을 성공시키는 핵심적 조건은 최적화 과정과 버퍼조건일 수 있다. 본 발명자는 2 내지 4M 우레아, 바람직하게는 2.5 내지 3.5M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5, 바람직하게는 pH 4 내지 5의 용해버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 데쓰도메인 수퍼패밀리 단백질인 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD, 및 RIP1 DD를 풀었다. 그 결과 초음파처리와 원심분리 후 봉입체 (inclusion body)내에서가 아닌, 용해성 조각 (soluble fraction)에서 DD 도메인을 얻을 수 있으며 상기 단백질은 종래와 다르게 완전히 펼쳐지지 않고, 일정부분 접힘을 유지하면서 풀려지는 (semi-unfolding) 상태로 용해되었다. 이때 풀려지는 (semi-unfolding) 상태는 단백질 내의 공유결합 부분은 유지되면서 상당한 비공유결합이 풀려지는 것일 수 있다.

상기 우레아의 농도는 상기 단백질의 공유결합 부분이 접힘 (folding)을 유지하면서 상당한 비공유결합 부분이 풀려지는 (semi-unfolding) 상태가 되는데 필요한 농도를 의미할 수 있으며, 2 내지 4M 우레아, 바람직하게는 2.5 내지 3.5M 우레아가 적절할 수 있다.

하기 도 2A에서 나타난 바와 같이, 우레아의 농도가 이보다 낮을 경우 본 발명의 표적 단백질을 용해시키기에 충분하지 못하며, 우레아의 농도가 이보다 높을 경우 투석단계 동안 무거운 응집체 (heavy aggregation)가 생성되며 적절히 재접힘 (refolding) 되지 못하였고 정제효율이 떨어졌기에 (도 2B) 효과적인 재접힘를 위해서는 2 내지 4M 우레아가 적절할 수 있으며, 바람직하게는 2.5 내지 3.5M 우레아에서 본래의 올바른 재접힘 (refolding)구조와 기능을 가지고 가장 좋은 수율과 순도를 지닌 본 발명의 단백질을 얻을 수 있었다 (도 2A).

이때, 상기 세포로부터 데쓰도메인 수퍼패밀리 단백질을 용해시키는 용해버퍼 (lysis buffer)로는 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 당업계에서 당해 용도로 쓰이는 통상적인 용해버퍼가 포함될 수 있으나, 바람직하게는 pH 3.5 내지 5.5의, 15 내지 25mM 시트르산나트륨 (sodium citrate), 450 내지 550mM 염화나트륨 (NaCl), 3 내지 7mM 이미다졸 (imidazole) 및 2 내지 4M 우레아 (urea)로 구성된 용해버퍼일 수 있다.

본 발명의 일례로, 각 단백질을 발현한 박테이라 세포를 pH 5의 30 ml 용해버퍼 (3M 우레아, 20mM 시트르산나트륨 pH 5.0, 500mM 염화나트륨 및 5mM 이미다졸)에서 원심분리하여 필렛을 만들고 이를 재현탁하고 초음파로 용해시킬 수 있다.

본 발명은 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5 의 용해버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 상기 단백질을 푸는 (unfolding) 단계 이후에, 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; 투석하는 단계; 및 겔여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 정제방법을 제공한다.

상기 과정을 통하여, 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily) 단백질은 종래의 정제방법과 비교해서 기능을 나타내는 본래의 온전한 접힘구조를 지닌 단백질을 정제하였을 뿐만 아니라, 표 1에서 나타난 바와 같이 높은 순도와 정제수율을 달성할 수 있었다.

본 발명에서 상기 친화성 크로마토그래피는 그 종류에 있어 한정되는 것은 아니나, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 (Immobilized Metal Affinity Chromatography) 일 수 있는데, 이는 아미노-말단 아미드 질소 및 골격 카보닐 산소뿐만 아니라, Glu, Tyr, Cys, His, Asp 및 Met 등과 같이, 금속 결합에 참여하는 작용기들을 갖는 단백질의 정제에 효과적일 수 있다.

본 발명의 일례로, 상기 친화성 크로마토그래피는 Ni-NTA 비드 (beads)를 사용한 His-tag 친화성 크로마토그래피일 수 있다.

상기 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계는, 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 용해버퍼에 용해된 단백질을 친화성 크로마토그래피에 로딩하고, 결합되지 않은 단백질을 상기 용해버퍼로 씻어낸 후, 결합된 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5 의 용출버퍼 (elution buffer)로 용출시키는 것일 수 있다.

이때, 상기 세포로부터 데쓰도메인 수퍼패밀리 단백질을 컬럼으로부터 용출시키는 용출버퍼 (elution buffer)로는 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 당업계에서 당해 용도로 쓰이는 통상적인 용출버퍼가 포함될 수 있으나, 바람직하게는 pH 3.5 내지 5.5의, 15 내지 25mM 시트르산나트륨 (sodium citrate), 450 내지 550mM 염화나트륨 (NaCl), 250 내지 350mM 이미다졸 (imidazole) 및 2 내지 4M 우레아 (urea)로 구성된 용출버퍼일 수 있다.

본 발명의 일례로, 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질을 3M 우레아를 포함하는 pH 5의 용해버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 세포로부터 용해시킨 용해물을 원심분리한 다음, 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진 (affinity resin)으로 채워진 중력컬럼 (gravity column)에 로딩하고 결합되지 않은 박테리아 단백질을 용해버퍼 (lysis buffer)로 제거하고, 3M 우레아를 함유한 용출버퍼 (elution buffer, 20mM sodium citrate pH 5.0, 500mM NaCl and 300mM imidazole)를 사용하여 타겟 단백질을 용출시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 투석하는 단계는, 0.5 내지 2.5M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석시킨 후, 우레아가 포함되지 않은 pH 3.5 내지 5.5의 투석버퍼를 사용할 수 있다.

상기 투석과정은 2.5M이하의 우레아를 포함하며 점차적으로 우레아의 농도를 낮춘 투석버퍼와 최종적으로 우레아가 포함되지 않은 투석버퍼에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일례로, 2M 우레아를 포함하는 pH 5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석시킨 후, 1M 우레아를 포함하는 pH 5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석시키고, 우레아가 포함되지 않은 pH 5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석될 수 있다.

본 발명의 일례로, 1M 우레아를 포함하는 pH 5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석시킨 후, 우레아가 포함되지 않은 pH 5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석될 수 있다.

본 발명은 상기 겔여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 제공한다.

상기 겔여과 크로마토그래피는 그 종류에 있어 한정되는 것은 아니나, Superdex-200 겔여과 컬럼 (gel-filtration column)을 사용한 것일 수 있다.

본 발명의 일례로, 15 내지 25 mM Tris-Cl (pH 8.0) 및 100 내지 200mM NaCl로 평형시킨 Superdex-200 겔여과 컬럼 (gel-filtration column)(GE HEALTHCARE, Sweden)에 로딩할 경우, 우레아가 포함되지 않고 기능을 나타내는 단백질을 정제할 수 있었다.

종래의 정제방법에 의할 때, 데쓰 도메인 수퍼패밀리에 속하는 단백질의 정제 자체가 어려웠을뿐더러 본래의 구조로 재접힘 (refolding)되어 기능을 나타내는 단백질을 얻지 못하였는데 반하여, 본 발명의 정제방법을 사용하면 SDS-PAGE로부터 염색된 겔과 겔-여과 크로마토그램 (gel-filtration chromatogram) 양쪽 모두의 패턴은, 손상되지 않은 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD 및 RIP1 DD가 분리되었음을 확인할 수 있었다.

하기 표 1에서 나타난 바와 같이, 각 단백질의 최종량은 카스파제-1 CARD의 경우는 8mg, AIM2 PYD 경우는 3mg, NALP3 PYD 경우는 5mg 그리고 RIP1 DD 경우는 15mg을 얻을 수 있었고, 정제 후 순도 (purity) 또한 카스파제-1 CARD의 경우는 90%, AIM2 PYD 경우는 95%, NALP3 PYD 경우는 85% 그리고 RIP1 DD 경우는 95%를 얻을 수 있어 본 발명의 단백질 정제방법이 데쓰 도메인 수퍼패밀리에 속하는 단백질의 정제에 효과적임을 확인할 수 있다.

또한, 하기 실시예 4 내지 6에서 나타난 바와 같이, 원편광 이색성 분광법 (circular dichroism (CD) spectroscopy) 및 기능 분석 (functional assay)에 의해 분석결과 상기 단백질이 기능을 나타내는 본래의 올바른 접힘을 지닌 단백질이 정제되었음을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 들은 본 발명을 예시한 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 시료의 준비

DNA 제한효소 (NdeI and XhoI), T4 DNA 리가아제, 및 Tag DNA 폴리머라아제는 NEB (New England Biolab)로부터 얻어졌다. 아이소프로필-β-D-1-티오갈락토피란노사이드 (IPTG), 우레아, 이미다졸 및 디티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT)은 Sigma (USA)로부터 구하였다. 대장균 BL21 (DE3) 세포와 플라스미드 pET 벡터는 Novagen로부터 구입하였다. 겔여과컬럼 Superdex 200은 GE health care로부터 얻었고, Inhibitor cocktail는 Roche로부터 얻었다. 모든 농축기 (concentrators)는 Millipore로부터 구입하였다.

실시예 2: E. coli 에서 타겟 단백질의 발현

완전한 길이의 인간 카스파제-1 (1-404 아미노산), AIM2 (1-356 아미노산), NALP3 (1-1036 아미노산), 및 RIP1 (1-671 아미노산)의 cDNA는 PCR을 위한 주형으로 사용된데 반해, 플라스미드 벡터 pET 26b 및 pET28a는 친화성 정제 (affinity purification)를 위해 헥사-히스티딘 태그 (hexa-hisditine tag)를 c-말단 및, N과 C-말단에 각각 첨가하는데 사용되었다. 1 (Met)-90 (Ser)에 대해 코딩하는 인간 카스파제-1의 CARD 도메인, 1 (Met)-87 (Arg)에 대해 코딩하는 NALP3의 PYD 도메인, 579 (Thr)- 664 (Ser)에 코딩하는 RIP1의 데쓰 도메인을 pET 26b에 클로닝하여 pET (target protein-6His)을 얻었다. 추가적으로, 1 (Met)-150 (Gln)을 코딩하는 AIM2의 PYD 도메인을 pET 28a에 클로닝하여 pET (6His-AIM2 PYD-6His)을 얻었다. 모든 4가지 단백질에 대한 발현 방법은 앞서 기술된 바와 동일하게 수행하였다 (Jang et al., 2010a,b).

각 클론을 적절한 항생제 (100㎕/ml ampicilin for the pET 26b clone 및 50㎕/ml kanamycin for the pET 28a clone)를 포함하는 LB 아가 플레이트상에 스트릭 (streak)하고, 이 플레이트를 37℃에서 18시간 배양하였다. 하나의 콜로니를 5ml LB 배지에 접종한 후, 37 ℃, 쉐이킹 인큐베이터 (shaking incubator)에서 배양하였다. 다음, 5ml overnight small scale 배양이 2000 ml 배양 플라스크내의 1000 ml LB에서 접종하는데 사용되고, 배양 성장 (culture growth)을 4시간 미만 동안 쉐이킹 인큐베이터 (shaking incubator)에서 지속하였다. 600nm에서의 광밀도 (optical density, OD)가 0.6-0.8에 도달하면 20℃에서 0.5mM IPTG로 밤새 처리함으로써 발현이 유도되었다.

하기 도 1A에서 나타난 바와 같이, 카스파제-1 (Caspase-1), AIM2, NALP3 및 RIP1 단백질은 C-말단 또는 N-말단에서 상동의 단백질-단백질 상호작용을 할 수 있는 DD 수퍼패밀리인, 카스파제-1의 CARD, AIM2와 NALP3의 PYD, 및 RIP1의 DD 중 하나를 함유한다.

하기 도 1B에서 나타난 바와 같이, IPTG로 유도한 다음, pET26b상의 카스파제-1 CARD (1-90 잔기) 및 pET28a 상의 AIM2 PYD (1-149 잔기)를 함유한 박테리아세포가 재조합 단백질을 발현시킴을 확인하였는데, 이러한 재조합 단백질은 초음파 처리한 후, 10 kDa 및 18 kDa 분자량을 지닌 필렛 조각에서 검출되었다. 이는 양쪽 도메인이 우선적으로 불용성 응집체 (insoluble aggregates)로서 존재함을 나타낸다. AIM2의 AIM2 PYD 도메인을 포함하는 아미노산 수 1-149 구조체 (construct)는 AIM2 PYD (1-90 잔기)자체와 비교해 볼 때 잘 발현되기에, 본 발명자는 AIM2 PYD에 대해 1-149 구조체를 사용하였다.

본 발명자는 DD 수퍼패밀리의 여러 멤버들을 테스트 하였고, NALP3 PYD와 RIP1 DD가 또한 필렛 조각에서 검출됨을 발견하였다 (도 1B). 비록, 약간의 NALP3 PYD 부분이 용출 조각 (elution fraction)에서 검출되었지만 다른 세 개의 도메인은 검출되지 않았다 (도 1B).

실시예 3: 세미 재접힘 ( semi - refolding )방법에 의한 단백질 정제

각 단백질을 발현한 박테리아 세포를 30 ml 용해버퍼 (lysis buffer, 20mM sodium citrate pH 5.0, 500mM NaCl 및 5mM imidazole)에서 원심분리하여 필렛을 만들고, 재현탁하고 초음파로 용해시켰다. 부가적으로, 1 내지 7M 우레아를 용해버퍼에 첨가하였는데, 3M 우레아를 사용하여 모든 단백질을 성공적으로 정제하였다. 이 용해물을 4℃에서 1시간 15,000×g으로 원심분리한 다음, 3M 우레아로 용해된 타겟 단백질을 함유한 상층액 조각을 Ni-NTA 친화성 레진 (affinity resin) (Qiagen)으로 충진된 중력컬럼 (gravity column, Bio-Rad)에 사용하였다. 결합되지 않은 박테리아 단백질을 100 ml 용해버퍼 (lysis buffer)로 제거하고, 3M 우레아를 함유한 용출버퍼 (elution buffer, 20mM sodium citrate pH 5.0, 500mM NaCl 및 300mM imidazole)를 사용한 컬럼으로부터 네 가지 타겟 단백질을 용출시켰다. SDS-PAGE에 의해 보여진 바처럼, 70%이상의 동종의 타겟 단백질을 함유한 조각 (Fractions)이 선택되어 졌고 결합 되었다.

결과로 얻어진 단백질 샘플을 순차적으로 2, 1 및 0M 우레아를 함유하는 재접힘 버퍼 (refolding buffer)에 대해 투석한 후, 200 volumes 투석버퍼로 4℃에서 4시간 동안 투석을 각각 수행하였다. 재접힘 단계 동안 생성된 응집체 (aggregate)를 제거하기 위해 재접힘된 타겟 단백질을 4℃에서 20분간 15,000×g으로 원심분리한 후, 그들을 10 kDa (Millipore)의 컷오프를 지닌 centriprep을 사용하여 원심분리하였다. 마지막 정제단계에서, 샘플을 20mM Tris-Cl (pH 8.0) 및 150mM NaCl로 평형시킨 Superdex-200 겔여과 컬럼 (gel-filtration column) (GE HEALTHCARE, Sweden)에 로딩시켰다. 타겟 단백질을 함유한 조각 (Fractions)을 모은(pool) 후 앞으로의 실험을 대비하여 4℃에서 저장하였다.

타겟 단백질의 순도 (purity)는 SDS-PAGE에 의해 사정한 후 눈으로 확인하였다. 타겟 단백질 밴드는 ∼20㎍ 단백질을 함유하며, SDS-PAGE의 검출한계는 0.1㎍으로 추정할 때, 타겟 단백질의 순도 (purity)는 눈으로 측정되었다.

봉입체 (inclusion bodies)에서 검출된 DD 수퍼패밀리를 용해시키고 정제하기 위해, 언폴딩 버퍼 (unfolding buffer)내에 변성제로서 7M 우레아 (urea) 또는 6M 구아니딘 (guanidine)을 사용하였으나, 투석단계 동안 무거운 응집체 (heavy aggregation)가 생성되기 때문에, 적절히 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD 및 RIP1DD를 재접힘 할 수 없었다. 이는 일단 7M 우레아 (urea) 및 6M 구아니딘 클로라이드 (guanidine chloride)와 같은 높은 농도의 변성제로 완전히 변성된다면, E. coli에서 용해되지 않는, 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD 및 RIP1 DD을 포함한 대부분의 DD 수퍼패밀리가 적절히 재접힘되지 못함을 확인하였다.

하기 도 2에서 나타난 바와 같이, 5M와 7M 용해버퍼 (lysis buffer)는 또한 카스파제-1 CARD을 용해시켰지만 (도 2A left panel), 변성제를 투석에 의해 천천히 제거하였을 때, 이러한 도메인은 심하게 침전되었다 (도 2B). 더욱이, 1M 우레아는 카스파제-1 CARD을 용해시키지 못하였다 (도 2A left panel).

그러나, 3M 우레아가 포함된 용해 버퍼 (lysis buffer)를 사용하면 카스파제-1 CARD의 정제를 위해 니켈 친화성 크로마토그래피를 수행시, 용해성 조각 (soluble fraction)에서 이러한 도메인을 얻을 수 있었다.

AIM2 PYD의 경우, 비록 이 단백질이 1M 내지 7M 우레아에 용해된다 하더라도, 3M 우레아에서 가장 좋은 수율과 순도를 얻었다 (도 2A right panel). 이러한 발견에 근거하여, Ni-NTA 비드를 사용한 His-tag 친화성 크로마토그래피를 수행하는 동안 3M 우레아를 용해 (lysis), 세척 (washing), 및 용출버퍼 (elution buffer)에 첨가함으로, 카스파제-1 CARD 와 AIM2 PYD 뿐만 아니라 NALP3 PYD와 RIP1 DD을 용해시킨 결과, 총 4 개의 단백질이 용해성 조각에서 검출되었고, 0.3M 이미다졸을 지닌 Ni-NTA 비드로부터 용출되었다 (도 2C)

하기 도 3A 및 E는 원심분리에 의해 모든 침전된 단백질을 제거한 후, 샘플들을 Superdex 200 겔-여과 컬럼 (gel-filtration column)에 대해 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 것으로, 단량체 또는 이량체 위치에 상응하는 위치에 한 개의 피크로써, 카스파제-1 CARD 및 NALP3 PYD을 용출시켰다. 역으로, AIM2 PYD 및 RIP1 DD는 18 내지 25 ml 용출부피 (elution volume) 근처에서 여러 가지 피크를 만들어졌다 (도 3C 및 G).

겔여과 크로마토그래피로부터 얻어진 조각은 SDS-PAGE로 분석되었다 (도 3B, D, F 및 H). SDS-PAGE로부터 염색된 겔과 겔-여과 크로마토그램 (gel-filtration chromatogram) 양쪽 모두의 패턴은, 손상되지 않은 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD 및 RIP1 DD가 분리되었음을 나타내었다. 각 단백질의 최종량은 카스파제-1 CARD의 경우는 8mg, AIM2 PYD 경우는 3mg, NALP3 PYD 경우는 5mg 그리고 RIP1 DD 경우는 15mg이었다. 정제 결과는 하기 표 1에 나타나 있다.

실시예 4: 원편광 이색성 분광법 ( Circular dichroism spectroscopy )

새미-재접힘 (semi-refolding) 방식을 사용하여 재접힘된 DD 수퍼패밀리가 올바른 접혔는지를 확인하기 위해, 재접힘된 카스파제-1 CARD, AIM2 PYD, NALP3 PYD 및 RIP1 DD의 α-나선 (α-helicities)을 far UV circular dichroic spectra으로 측정하여 분석하였다. FADD DD를 양성 대조군으로 사용하였다.

전체 이차구조는 J-715 분광 편광계 (spectropolarimeter, Jasco, Japan)를 사용한 원편광 이색성 분광법 (circular dichroism (CD) spectroscopy)에 의해 측정되었다. 1.0 nm 밴드위드 (bandwith), 50 mm/min 속도 및 5초간 반응시간을 사용한 0.1cm path-length quartz cuvette에서, 25℃, 200에서 250nm까지의 스펙트럼을 얻었다.

pH 8.0의 20mM TrisCl과 150mM NaCl를 함유한 버퍼내의 단백질 샘플들을 사용하기에 앞서, 0.1 mg/ml로 희석하였다. 네 가지 촬영 (scans)이 수행되고 평균되었다. α-나선 (α-helical) 함량을 222nm에서 몰 타원율 (molar ellipticity)로부터 측정되었다 (Chen et al., 1972).

하기 도 4에서 나타난 바와 같이, 모두 네 가지 정제된 도메인은, 208nm 및 222 nm에서 두 가지 최소값을 보였고 200 nm 근처에서 최대값을 나타내어 α-나선 단백질의 전형적인 CD 스펙트럼 패턴을 보였는데, 이는 데쓰 도메인 수퍼패밀리의 다른 멤버의 분자적 구조와 잘 맞았다.

실시예 5: 겔여과 크로마토그래피에 의한 복합체 분석 ( Complex assay by gel-filtration chromatography )

RIP1 DD가 FADD DD와 직접적으로 상호작용할 수 있다는 것이 알려졌기에 (Festjens et al., 2007), 본 발명자는 재접힘된 RIP1 DD가 여전히 활성을 유지하는지 여부를 테스트하였다.

정제된 FADD DD는 실온에서 1시간 동안 재접힘된 RIP1 DD와 함께 배양되었다. 배양 후, 혼합물을 concentration kit (Millipore)을 사용하여 10-15 mg/ml로 농축시켰다. 농축된 단백질 혼합물을, pH 8.0의 20mM Tris 버퍼와 50mM NaCl 용액으로 선평형시킨 (preequilibrated) Superdex 200 겔여과 컬럼 (gel-filtration column) 10/30 (GE healthcare)에 사용하였다. 이러한 복합체의 조합 (Assembly)을 280nm 파장으로 모니터한 용출 피크 (eluted peak)의 위치에 근거하여 평가하고 SDS-PAGE을 수행하였다.

하기 도 5A에서 나타난 바와 같이, Superdex 200 컬럼에서 13 ml에 위치한 하나의 피크가 얻어졌다. 각각의 성분들이 17-18 ml 부근에서 용출되기 때문에, RIP1 DD 및 FADD DD를 포함한 더 많은 분자 복합체가 이러한 복합체에 상응하였다.

실시예 6: native - PAGE 에 의한 복합체 분석

FADD DD와 재접힘된 RIP1 DD 간 복합체의 형성이 또한 native (non-denaturing) PAGE에 의해 분석되었다. RIP1 DD와 상호작용하지 않는 PIDD DD를 음성 대조군으로 사용되었다.

FADD DD 와 재접힘된 RIP1DD 사이의 복합체의 형성은 미리 만들어진 8-25% 아크릴아미드 구배겔 (acrylamide gradient gels) (GE Healthcare)로 PhastSystem (GE Healthcare)상에서 수행된 native (non-denaturing) PAGE에 의해 분석되었다.

쿠마시브릴리언트블루 (Coomassie Brilliant Blue)를 염색과 밴드 패턴의 탐색을 위해 사용하였다. 각각 정제된 FADD DD 및 RIP1 DD을 실온에서 1시간 동안 선 배양한 후, 이 혼합물을 겔에 넣었다. 복합체의 조합을 새로이 형성된 밴드와 존재하는 밴드의 사라짐에 근거하여 평가하였다.

하기 도 5B에서 나타난 바와 같이, 사라지는 RIP1 DD 밴드와 나타나는 새로운 밴드는 재접힘된 RIP1 DD가 FADD DD와 안정한 복합체를 만들 수 있음을 나타내었다.

Claims (7)

1. 카스파제-1 (Caspase-1), AIM2 (Absent in melanoma 2), NALP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3) 및 RIP1 (Receptor interacting protein 1)로 이루어진 군에서 선택된 데쓰 도메인 수퍼패밀리 (death domain superfamily)에 속하는 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5 의 용해버퍼 (lysis buffer)를 사용하여 상기 단백질을 푸는 (unfolding) 단계를 포함하는 재조합 단백질의 정제방법.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 용해버퍼는 15 내지 25mM 시트르산나트륨 (sodium citrate), 450 내지 550mM 염화나트륨 (NaCl), 3 내지 7mM 이미다졸 (imidazole) 및 2 내지 4M 우레아 (urea)로 이루어진 재조합 단백질의 정제방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 단계 이후에 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; 투석하는 단계; 및 겔여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 정제방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계는, 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 용해버퍼에 용해된 단백질을 친화성 크로마토그래피에 로딩하고, 결합되지 않은 단백질을 상기 용해버퍼로 씻어낸 후, 결합된 단백질을 2 내지 4M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5 의 용출버퍼 (elution buffer)로 용출시키는 재조합 단백질의 정제방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 용출버퍼는 15 내지 25mM 시트르산나트륨 (sodium citrate), 450 내지 550mM 염화나트륨 (NaCl), 250 내지 350mM 이미다졸 (imidazole) 및 2 내지 4M 우레아 (urea)로 이루어진 재조합 단백질의 정제방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 투석하는 단계는, 0.5 내지 2.5M 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 5.5의 투석버퍼 (dialysis buffer)를 사용하여 투석시킨 후, 우레아가 포함되지 않은 pH 3.5 내지 5.5의 투석버퍼를 사용하여 투석하는 재조합 단백질의 정제방법.
   
   
   
   
   

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