JP2010511691A - 新たな特異的結合体を工学的に操作するための足場として使用されるob−フォールド - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
また、Sac7dを参照として用いて、欠失させ得る残基は、A59、R60、A61及びE64である。
Sac7d: 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1bf4A: 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 40 41 43 45 47
Sac7d: 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1r4pB: 60 59 58 9 10 12 14 17 18 20 22 X X 27 29 31
Sac7d: 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1tvxA: 25 26 27 40 41 43 45 54 55 57 59 61 63 65 67 69
Sac7d: 7 8 9 21 22 24 26 28 29 31 33 39 40 42 44 46
1h9jA: 60 61 62 86 87 89 91 93 94 96 98 105 106 108 110 112
本発明の方法の好ましい実施形態において、2、3、4又は5回の選択がリボソームディスプレイによって実施される。
(ii)細菌(例えば、コンピテントなDH5α)を前記発現ベクター(前記DNAを含んでなる)により形質転換し、個々のクローンを増殖させ;そして
(iii)前記細菌クローンから抽出したタンパク質を標的への結合及び/又は他の生物学的特性(例えば安定性など)について試験する。
以下の実験データは、下記の材料及び方法を用いて得た。
材料及び方法
一般分子生物学
酵素及び緩衝液はNew England Biolabs社(米国)又はFermentas社(リトアニア)のものであった。オリゴヌクレオチドは、MWG Biotech社(ドイツ)のものであった。全てのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)は、本文中に示されていなければ、Ventポリメラーゼを用いて行った。野生型Sac7d及び選択した変異体のためのクローニング及び発現ベクターは、Qiagen社(ドイツ)のpQE30であった。
野生型Sac7dのDNA配列は、以下の6つのオリゴヌクレオチドを用いるアセンブリPCRにより生成した:SC1(配列番号9:GAAACTCCTAGGTATTGTGCTGACGACCCCGATCGCGATCTCTAGCTTTGCGGTGAAAGTGAAATT)、SC2(配列番号10:GATCTTGCTGGTGTCCACTTCTTTTTCTTCGCCTTTATATTTAAATTTCACTTTCACCGCAAAGCTAG)、SC3(配列番号11:GAAGTGGACACCAGCAAGATCAAGAAAGTTTGGCGTGTGGGCAAAATGGTGAGCTTTACCTACGACGACAACGGCAAG)、SC4(配列番号12:CTCTTTCGGGGCATCTTTCTCGCTCACGGCGCCACGGCCGGTCTTGCCGTTGTCGTCGTA)、SC5(配列番号13:GAGAAAGATGCCCCGAAAGAGTTATTAGATATGTTAGCGCGTGCGGAAAGCTTCAACCA)、SC6(配列番号14:TGGTGGTTGAAGCTTTCCGCACG)。精製したPCR産物を、以下の2つのプライマーを用いる第2のPCR増幅用のテンプレートとして供した:SC07(配列番号15:ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAAGTGAAATTTAAATATAAAG)及びSC08(配列番号16:ATAATTGAGCTCTAAGCTTTTTTTCACGTTCCGCACGCGCTAACATATC)。PCR産物を、BamHI及びHindIII制限部位を使用してpQe30発現ベクター中にクローニングした。予測された配列を有するクローンをその後の発現に使用した。
プロトコルは、3つのライブラリ11、13、14の生成について、リボソームディスプレイと適合性のフォーマットにおいて同じであった。ライブラリは、主に、遺伝子合成及びPCRアセンブリ工程により構築した。4つの標準とNNSトリプレット(式中、N=A、C、T又はGであり、S=C又はG)をコードする3つの縮重オリゴヌクレオチドとの組合せを使用する単一工程PCRで、リボソームディスプレイに必要な5'-側方領域及びSac7dのランダム化遺伝子を含むDNA産物を得た。ライブラリ14については、以下のオリゴヌクレオチドを使用した:T7C(配列番号17:ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC)、SDA_MRGS(配列番号18:AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGAGAGGATCG)、SClib1(配列番号19:GGAGATATATCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGTCAAGGTGAAATTC)、SClib2(配列番号20:GGATCCGTCAAGGTGAAATTCNNSNNSNNSGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACTAGTAAGATC)、SClib3(配列番号21:CTTGCCGTTGTCGTCGTASNNAAASNNCACSNNTTTGCCSNNACGSNNAACSNNSNNGATCTTACTAGTGTCCACTTC)、SClib4(配列番号22:TAATAACTCTTTCGGGGCATCTTTCTCSNNCACSNNGCCSNNGCCSNNCTTGCCGTTGTCGTCGTA)、SClib5(配列番号23:CCATATAAAGCTTTTTCTCGCGTTCCGCACGCGCTAACATATCTAATAACTCTTTCGGGGCATC)。Sac7d中の残基21、22及び40に、又は残基40に対応する位置でNNSトリプレットの代わりに野生型トリプレットをコードするプライマーを、それぞれライブラリ11及び13の構築に使用した。
選択実験には、ビオチン化標的タンパク質を使用した。氷上にて1時間の、PBS中DnaK、GarA又はPulD-Nの10μM溶液と20倍モル過剰のスルホスクシンイミジル-6-(ビオチンアミド)ヘキサノエート(スルホ-NHS-LC-LC-ビオチン,Pierce)とのインキュベーションにより、ビオチン化を行った。TBS中で平衡化したPierce社のタンパク質脱塩スピンカラムを用いて、ビオチン化タンパク質の緩衝液交換を行った。ビオチン化の程度は、HABAアッセイ(Sigma)を用いて、タンパク質1分子あたり2〜3分子のビオチンと決定した。ビオチン化標的タンパク質を、Maxisorpプレート(Nunc)中の固定化ニュートラビジンに結合させ、本質的にはBinzら(2004b)に記載のとおりであるが幾らか改変して、リボソームディスプレイによる選択を4℃にて行った。簡潔には、各選択ラウンド後、溶出mRNAをcDNAに逆転写し、SDA_MRGS及びSClib5プライマーを用いて増幅させた。PCR産物を、Nuclespin extraction IIカラム(Macherey-Nagel)で脱塩し、TolAリンカーDNAフラグメント(上記参照)を用いるPCRアセンブリに使用した。これにより、5'-及び3'-側方領域が新たに付加された全長リボソームディスプレイ構築物を生成して、操作の間のmRNA末端の分解に起因するクローン喪失を最小にした。RT-PCRサイクル数は、35サイクル(ラウンド1)、30サイクル(ラウンド2)、30サイクル(ラウンド3)、25サイクル(ラウンド4)であった。ラウンド5では、Jermutusら(2001)に記載のような解離速度(off-rate)選択を使用して、選択圧を増大させた。この選択のために、10nMのビオチン化PulD-Nを、ラウンド4からのプールの停止翻訳物(stopped translation)に添加した。この混合物を1時間4℃にて平衡化し、非ビオチン化PulD-Nを10μMの最終濃度(ビオチン化PulD-Nに対して1000倍過剰)まで加えた。4℃にて撹拌しながら2時間のインキュベーション後、ビオチン化PulD-Nに結合した三つ組複合体(mRNA-リボソーム-結合体)を、4℃にて15分間、30μlの磁性ストレプトアビジン被覆ビーズ(Roche)を用いて捕捉した。ビーズを洗浄し、最初の4ラウンドと同様にmRNAを単離した。RT-PCRサイクル数は、この5番目の選択ラウンドについては35であった。選択の進行は、ラウンドごとのRT-PCR産物の量をモニターすることによって検証した。
4又は5ラウンド後、選択したプールを、Maxisorpプレート中の直接被覆標的タンパク質を使用し、1nM〜10μMの遊離標的タンパク質を競合物として使用して、Hanesら(1998)に記載のようにRIA(ラジオイムノアッセイ)により試験した。
選択したプールからのRT-PCR産物を、BamHI及びHindIII制限部位を用いてpQE30ベクター中にクローニングし、得られた結紮物(ligation)を使用してE. coli DH5α株を形質転換させた。クローンをペトリ皿から採取し、1ウェルあたり1.5mlのLB培地(100μg/mlアンピシリン,1%グルコース)を含むディープウェルプレートに接種した。250rpmで振盪させながらの37℃にて一晩の培養後、このマスタープレートからの0.2mlの各ウェルを使用して、1ウェルあたり1.3mlの2YT培地(100μg/mlアンピシリン)を含む他のディープウェルプレートに接種した。次いで、プレートを37℃にて1時間、振盪(250rpm)させながらインキュベートした。0.5mMのIPTGの添加及び振盪(250rpm)させながらの30℃にて4時間のインキュベーションで発現を誘導した。遠心分離工程(2250g)で細胞をペレット化し、上清を廃棄した。250rpmにて30分間振盪させながら1ウェルあたり50μlのBugBuster(Novagen)でタンパク質を抽出し、次いで250μlのTBS(pH7.4)(20mM Tris-HCl,150mM NaCl)を加えた。遠心分離工程(2500g)で細胞砕片をペレット化した。ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)スクリーニングについては、100μlの各上清を使用してMaxisorpプレート中に被覆した標的タンパク質への結合を試験した。結合体に由来するRGS-(His)6-タグのみを検出し、標的タンパク質に由来する(His)6-タグを検出しないRGS His抗体HRP接合体(Qiagen)及びRoche社のBM-Blue基質を用いて、検出を行った。0.1%Tween 20を有するTBS(pH7.4)中で全てのインキュベーション工程を行った。標準的な配列決定技法によりポジティブクローンを配列決定した。
PulD-Nからの解離時間に基づいて結合体のスクリーニングを行うために、クローンを5mlスケール培養物(E. coli DH5α株)中で発現させた。ディープウェル中での500μlの一晩予備培養物(LB培地,100μg/mlアンピシリン,1%グルコース,37℃)を使用して、4.5ml培養物(2YT,100μg/mlアンピシリン,37℃)に接種した。OD600=1.0で発現を0.5mMのIPTGの添加により誘導し、培養物を30℃にて19時間インキュベートした(250rpm)。細胞を遠心分離(2500g)により採集し、25mMイミダゾール、BugBuster及びBenzonase(Novagen)を含む0.5mlのTBS(pH7.4)中に細胞を再懸濁することによりタンパク質をディープウェルにおいて抽出した。4℃にて1時間の振盪後、ディープウェルを遠心分離して細胞砕片をペレット化した。20mMイミダゾールを含むTBS(pH7.4)で平衡化した100μlのNi-Fast Flow Chelating Sepharose(General Electric)を含むマイクロスピンカラムで上清を精製した。樹脂をローディング緩衝液で4回洗浄し、精製したタンパク質を400μlのTBS(pH7.4)及び250mMイミダゾールで溶出させた。
Biacore及びマイクロ熱量測定実験のために、下記のように、結合体を1リットルスケールでDH5α E. coli株において発現させ精製した。50mlの一晩予備培養物(LB培地,100μg/mlアンピシリン,1%グルコース,37℃)を使用して、1リットルの培養物(2YT,100μg/mlアンピシリン,37℃)に接種した。OD600=1.0で0.5mMのIPTGの添加により発現を誘導し、培養物を30℃にて19時間インキュベートした(250rpm)。細胞を遠心分離により採集し、25mMイミダゾールを含む30℃の30ml TBS(pH7.4)中に再懸濁した。細胞をAvestin Emulsiflexホモジナイザーで溶解させ、遠心分離工程で細胞砕片を破棄した。25mMイミダゾールを含むTBS(pH7.4)で平衡化した5mlのHiTrapキレート化カラムでタンパク質を精製した。TBS(pH7.4)及び250mMイミダゾールで溶出を行った。HBS(pH7.0)(20mM HEPES,150mM NaCl)で平衡化したSuperdex 75 26/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を更に精製した。HBS(pH7.0)(60μl/分,50μlの注入サンプル)で平衡化したSuperdex 75 3.2/20カラムを用いるSMARTシステム(GE Healthcare)で分析ゲル濾過を行った。BPTI(6.5kDa)、リボヌクレアーゼA(14.6kDa)、キモトリプシノゲンA(20.3kDa)、オボアルブミン(46.7kDa)及びアルブミン(62.9kDa)を分子量ゲル濾過較正標準として使用した。
BIAcore 2000装置を用いて25℃にてSPRを測定した。リボソームディスプレイによる選択用と同様にビオチン化PulDを調製し、SA-チップのフローセルに固定化した。動力学的測定用及び阻害測定用の固定ビオチン化PulD-Nの密度はそれぞれ200RU及び800RU(飽和チップ)であった。ランニング緩衝液はHBST(pH7.0)(20mM HEPES,150mM NaCl,0.05%Tween 20)であった。
60μl/分の流速での動力学測定用注入の前にランニング緩衝液に1/20希釈したマイクロIMAC精製タンパク質(上記参照)を用いて解離速度による結合体のスクリーニング及びランキングを行った。
以前(Hibleら,2005)に記載されたようにMicroCal VP-DSC熱量計で示差走査熱量測定を行った。組換え野生型及び変形体Sac7dのストック溶液を50mM MES緩衝液(pH5.6,300mM NaCl)に対して一晩4℃にて透析した。次いで、タンパク質サンプルを同じ緩衝液調製物中に200μg/mlに希釈し、真空下に10分間穏やかに撹拌しながら脱気した後、熱量計セル(0.5ml)中にロードした。参照セルには同じ緩衝液を満たした。130℃まで気泡形成及び蒸発を回避するためにサンプルをインサイチュで25psiの一定の外圧下に保持し、25℃にて25分間平衡化し、1度/分の一定加熱速度で加熱し、16秒のフィルターでデータを収集した。データ分析は、製造業者が提供するOrigin7TMソフトウェア(Plotnikovら,1997)で行った。熱容量関数から2つのベースライン(緩衝液参照サーモグラム及び算出化学ベースライン(アンフォールディング転位(unfolding transition)の進行から濃度に対して規格化した後に計算される))を引くことにより過剰熱容量関数(Cp,excess)が得られた。各タンパク質サンプルのアンフォールディング転位の熱力学的パラメータは、非二状態モデルを仮定した過剰熱容量曲線の非線形3パラメータ(Tm,ΔHcal,ΔHvH)回帰の結果である。
プライマーSCPhoAF(配列番号26:ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAGGTGAAATTC)及びSCPhoAR(配列番号27:ATAATTGAGCTCTAAGCTTTTTTTCACGCTCCGCAC)、並びにPhusionポリメラーゼを用いて、結合体をコードする遺伝子をPCR増幅して、5'-及び3'-末端にそれぞれKpnI及びSacIを導入した。PCR産物をKpnI及びSacIで消化し、pQUANTagenベクター(Qbiogene)中にクローニングした。こうして、アルカリホスファターゼを結合体のC末端に融合させた。DH5α E. coli株及び製造業者マニュアルの指示を使用して、アルカリホスファターゼ活性クローンのスクリーニング及びペリプラズマ抽出(periplasmic extraction)を行った。簡潔には、ポジティブクローンをLBプレート(100μg/mlアンピシリン,4μg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート)上でアルカリホスフェート活性についてスクリーニングした。8mlの一晩予備培養物(LB培地,100μg/mlアンピシリン,37℃)を用いて400ml(2YT培地,100μg/mlアンピシリン,1gのリン酸二カリウム(pH7.5),37℃)の培養物に接種した。OD600が約0.7になったときに0.5mM IPTGの添加によりtacプロモーターの誘導を行い、増殖を30℃にて4時間継続させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、40mlのTSE緩衝液(30mM Tris-HCl(pH8.0),スクロース20%,0.5mM EDTA,0.1mg/mlリゾチーム)に再懸濁した。穏やかに撹拌しながら4℃にて20分間の懸濁物のインキュベーションによりリゾチームショック(lysozymic shock)を行った。4℃にて20000gで30分間の遠心分離により細胞砕片を廃棄し、上清を0.45μm膜で濾過した後、−20℃で保存した。
発現ベクターを含まないDH5α E. coli株の10ml一晩培養物(LB培地,37℃)を遠心分離して細胞をペレット化した。細胞ペレットを1ml TBS(1×BugBuster及び1μl Benzonase)中に再懸濁した。細胞溶解を室温にて30分間生じさせ、懸濁物を20000gにて5分間遠心分離して細胞砕片を除去した。次いで、上清を精製PulD-Nの系列希釈に使用した。サンプルは、定量の上清と、5μlのサンプルをSDSゲル上にロードしたとき0.4ng〜400ng PulD-Nに対応する可変量の精製PulD-Nとで調製した。移動後、タンパク質をSDSゲルからニトロセルロース膜(Hybond-C extra,0.45μm,General Electric)に移した。膜をTBST(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5,0.1%Tween 20)中5%の粉乳でブロックした。次いで、膜を、TBST乳中に1〜15倍希釈した融合体の可溶性ペリプラズマ抽出物と共に、1時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。膜を洗浄後、反応緩衝液(100mM Tris-HCl pH9.5,100mM NaCl,5mM MgCl2)中に希釈した沈降基質NBT/BCIP(AP接合基質キット,Biorad)で検出を行った。
結合体をコードする遺伝子を、eGFPの遺伝子及び可撓性ペプチドリンカーKLGSAGSAAGSGEF(配列番号32)をコードする領域を含有するpQE30由来プラスミド(pFP3000)中に、BamHI及びHindIII部位を介してクローニングした。これは、N末端にMRGS(His)6タグを有するN-ter-結合体-リンカー-eGFP-C-ter融合体を生じた。個々のクローンの配列は、DNA配列決定により検証した。
結合体-GFP融合体の発現及び精製は、結合体単独についてと同じ条件下で(すなわち、IMAC及びサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて)行った。
プラスミドpCHAP3671(pulD)及びpCHAP580(pulS)(Guilvoutら,1999)又はプラスミドpCHAP3711(pulD-CS)(Guilvoutら,2006)及びpCHAP580を有するE. coli K-12株PAP105(Guilvoutら,1999)を、膜ベシクルの単離に使用した。培養物を、適切な抗生物質(100μg/mlアンピシリン,25μg/mlクロラムフェニコール)を含むLB培地(Miller,1992)中、30℃にて激しく撹拌しながら、対数増殖相(OD600:0.9〜1.1)まで増殖させた。細胞のフレンチプレス破壊(French press desintegration)後に膜画分を遠心分離(180,000×g、30分間)により単離し、Tris 50mM pH7.5、NaCl 150mM中に450μg/mlの最終濃度で再溶解した。
17mgのIMAC精製クローン6を0.2M炭酸緩衝液(pH8.3)(0.5M NaCl)に対して透析し、事前に6mlの1mM HClをフラッシュした1ml HiTrapNHS活性化HPカラム(General Electric)に注入した。固定化は室温にて30分間生じさせた。カラムを洗浄し、0.5Mエタノールアミン(0.5M NaCl,pH8.3)及び0.1Mアセテート(0.5M NaCl,pH8.3)で室温にて30分間残存する活性基を不活化させた後、カラムをTBS(pH8.0)(20mM Tris,500mM NaCl)で平衡化させ、精製に使用する準備を整えた。
PulS(pCHAP580;Daeflerら,1997)とPulD(pCHAP3671;Guilvoutら,1999)又はPulD-CS(pCHAP3711;Guilvoutら,2006)とを含む/含まないE. coli PAP105の外膜を、前述のように調製した。膜を、10%スクロース及び0.1mg/mlのプロテアーゼインヒビターPefabloc(Interchim,Montlucon,France)を含む50 mM Tris-HCl(pH7.5)中に再懸濁して貯蔵し、SDS/PAGEに供し、ニトロセルロースシートに移した。このシートを次いでブロックし、Sac7-PhoAキメラ産生株のペリプラズマ(浸透圧ショック)抽出物と共にインキュベートした。洗浄後、結合PhoAをPhoAに対する抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼカップリング二次抗体及び化学発光により検出した。
PAP7232株(Hardieら,1996)を空のベクター又はSac7-PhoAキメラをコードするプラスミドで形質転換した。この形質転換体を、0.4%マルトース(プルラナーゼの産生及びその分泌系(PulDを含む)を誘導するため)及び1mM IPTGを含有する培地中で増殖させてSac7-PhoA産生を誘導した。分泌レベルは、d'Enfertら(1989)に記載のように測定し、溶解細胞中で検出された酵素活性量(100%)と比較した全細胞中で検出された酵素活性量として表す。細胞抽出物もまた、PulD及びPhoAに対する抗体を用いるイムノブロッティングにより調べた。
実施例1:第1世代ライブラリ(ライブラリ11)の設計
種々のリガンドに対する結合体を得るための足場としてのSac7dの使用可能性を調べるための第1の重要な工程は、親のSac7dタンパク質の安定性及び溶解性を維持しながら、潜在的結合性領域のランダム化によりライブラリを設計することであった。
3つのタンパク質を標的として選んだ:DnaK、GarA(共に、Mycobacterium tuberculosis由来)及びPulD(Klebsiella oxytoca由来)のN末端ドメイン。PulDは、イオン性界面活性剤なしでは溶液状態に維持することができない外膜タンパク質である。したがって、可溶性単量体フラグメントを使用した。このフラグメント(PulD-Nと名付ける)は、PulDのN末端領域に相当する。特異的で貪欲(avid)な結合体はDnaK、GarA及びPulDを研究するための有用なツールとなり得るのでこれら標的を選択した。更に、これらタンパク質は、構造研究のために結晶化するのが困難である。これらタンパク質を認識する結合体は、抗体フラグメントと同じ方法で共結晶化(co-crystallization)試行に使用し得る(Ostermeierら,1995)。
親和性を改善する直感的方法は、結合領域を拡張すること、よって結合体とそのリガンドとの間の相互作用の可能な数を増大させることである。11残基のランダム化に対応する可能な結合領域は、890Å2の溶媒接近可能面を有していた。Sac7dは11置換に対して非常に寛容であるので、2又は3の更なる位置(K21及びK22(ライブラリ13)又はK21、K22及びT40(ライブラリ14)、それぞれ1130Å2及び1200Å2に対応)をランダム化することを決定した。別の説明は、凹面結合性領域はタンパク質との結合に良好に適合しておらず、よってより平坦な面の使用が最終的な親和性を改善することができるというものであり得る。これら2つの新たなライブラリ(各々3.0 1012変形体)をライブラリ11と同様に構築した。ライブラリ14からの70のランダムクローンの配列決定により、観察された残基頻度は予想された頻度に類似するが、S、L及びRアミノ酸残基の提示は僅かに低い一方、P、N、Q及びHアミノ酸残基の提示は少し多いことが確証された(データは示さず)。正確なクローン(フレームシフトも欠失もない)のパーセンテージは、ほぼ65%であることが分かった。よって、「機能的」多様性は申し分ないと考え、このライブラリを選択に使用した。
4回の選択ラウンドを、これらライブラリ及び標的タンパク質としてのPulD-Nを用いて行った。より遅い解離速度を有する結合体についてプールを富化するために、5番目のラウンドを、2時間のマイルドな解離速度選択でライブラリ11、13、14を用いて並行して行った。5番目のラウンド後のプールについてのラジオイムノアッセイ(図7)は、2つの新たなライブラリを用いた特異的PulD-N結合体についての富化を示した。結合は、固定化BSA又はニュートラビジン上では検出することができなかった。更に、このRIAにより、10nMの遊離PulD-Nは、ライブラリ13との結合シグナルの約50%を阻害するに十分であるのに対し、ライブラリ11については100nMのPulD-Nが同レベルで阻害したことが示された。1nMの競合物が結合シグナルの約20%の顕著な阻害を達成するに十分であったので、ライブラリ14は尚更良好に挙動した。よって、ライブラリ14に使用した設計により、平均親和性について程度が少なくとも1オーダー増した。
5.1.選択した結合体の配列分析、発現及び精製
最も見込みのある親和性はライブラリ14(ラウンド5)から得たプール中で見出すことができたので、このライブラリからの結合体のプールを分析した。富化したプールを発現プラスミドpQE30中にクローニングし、タンパク質産生にE. coli株DH5αを使用した。48の個々のクローンを、固定化PulD-N又はBSA及びE. coli粗抽出物を用いるELISA手順によりアッセイした。全てのクローンについて、バックグランドに対して顕著で特異的な結合が検出された。よって、更なる分析のために全ての結合体を配列決定した。
最も高い親和性を有するクローンを同定するために、微量発現及びIMAC精製に48のクローンを使用した。次いで、これら精製したタンパク質を、ストレプトアビジン被覆チップ上で固定化ビオチン化PulD-Nを用いるSPRによりスクリーニングした。全てのアッセイした結合体について、ストレプトアビジンのみを被覆したブランク面上では有意な結合は観察されなかった。このことは、結合がPulD-Nについて特異的であるという考えを支持している。解離相の分析に従って、SPRによる一価タンパク質の詳細な親和性決定のために、最も遅い解離速度を有する5つのクローンを選択した。
Sac7dは、pH7.0にて91℃のTmでアンフォールディングする超熱安定性タンパク質であり、このタンパク質の熱的安定性はより低いpHで減少する(McCraryら,1996)。示差走査熱量測定によりクローン6、33及び40の熱的安定性を野生型Sac7dの熱的安定性と比較した。DSCの上限温度(125℃)より低い温度でのこのタンパク質の完全なアンフォールディングを保証するために、全てのスキャンにpH5.6を使用した。68℃〜83℃に変性温度を有する熱的に安定であるクローンを見出した(図11及び表4)。クローン40は著しく安定であり、野生型(89.7℃)のものよりわずか5.8℃低いTm値を有していた。次にクローン33(ΔTm = -10.5℃)が続き、最も安定性が低いクローンはクローン6(ΔTm = -22.0℃)であった。しかし、クローン6のTmは、依然として、Protein Data Bankのタンパク質の平均Tm値(Freire,2001)より8℃上回っている。DSCスキャンは、高い変異負荷(14残基までの変異、すなわちSac7dの21%までの変異)を有するにもかかわらず、Sac7d変形体が野生型と同様なフォールディングした構造を採用することができたことを示す協調的アンフォールディング(cooperative unfolding)の特徴を示していた。熱量エンタルピー(1モルあたりの熱変化、ΔHcal)は、クローン40及びクローン33について、野生型(42.5kcal.mol-1)に対してそれぞれ僅か5.8及び4.8kcal.mol-1低かった(表4)。更に、両クローン40及びクローン33について、ファント・ホフエンタルピー(協調的アンフォールディング単位あたりの熱変化)対熱量エンタルピーの比値βは1に近く、野生型Sac7dのβ値に近かった。この観察は、クローン40及びクローン33のアンフォールディングがフォールディングしたタンパク質単量体のアンフォールディングに相当することを強く示した(表4)。クローン6は、野生型より(18.10kcal.mol-1)低い熱量エンタルピー及び高いβ比を示した(表4)。これら観察は、当該タンパク質がさほど安定でない(クローン6のTmはpH7で8℃高い;データは示さず)酸性pHでのクローン6タンパク質の部分的なアンフォールディングに関連しているかもしれない。まとめると、これら観察により、クローン6、33及び40は野生型タンパク質の好適な熱的安定性を大体保持していたことが示される。
これらPulD-N結合体はどのように特異的か、そして特異性が重要である生物工学的適用に使用できるか?
これら質問に答えるため、結合体6、33及び40を、E. coliアルカリホスファターゼ(PhoA)のN末端に融合させた。このキメラ(Sac7*-PhoA)を、PhoAシグナルペプチドをコードするpQUANTagenベクターを使用してDH5α株中にペリプラズマタンパク質として産生した。次いで、浸透圧ショックにより、このキメラをペリプラズマから抽出し、それらの官能性をPulD-N-又はBSA-被覆ウェルを用いるELISAによってアッセイした。結合した融合体を色素形成性p-ニトロフェニルホスフェート基質及び分光測光法により定量した(データは示さず)。3つ全てのキメラについてバックグランドに対して高いシグナルを観察した(比シグナル/バックグラウンド>10)。このことは、キメラが1)ペリプラズマに輸送され、2)依然としてPulD-Nを特異的に認識でき、3)触媒活性であることを示した。よって、これら融合体は、単一工程のELISA検出試薬として使用し得る。
次に、本発明者らは、PulD-Nに対して最高の親和性を有する3つの選択したSac7d誘導体(結合体6、33及び40)がE. coli外膜に組み込まれた完全長PulDタンパク質を認識することができるかを調べた。完全長PulDは外膜中で十二量体を形成し(一方、PulD-Nは単量体である)(Chamiら,2005)、結合体の各々により認識されるエピトープがPulDの多量体化により影響され、よって天然型PulDへの結合が妨げられることを排除できない。漸増量のE. coli PAP105(pCHAP3671 pCHAP580)由来のPulD含有膜を飽和量のGFP-タグ化結合体40又は33と混合すると、遠心分離後のペレット中に残存する結合体の量は対応して増加した(図13A)。GFP-タグ化結合体は、N-ドメインを欠いているPulD変形体を含有するPAP105(pCHAP3711 pCHAP580)(Guilvoutら,2006)由来の膜で沈澱しなかった(図13A)。よって、これらGFP-結合体キメラの膜への結合は、PulD-N-特異的であり、それらは、GFPタグの存在にもかかわらず、天然型の十二量体セクレチン複合体に結合する。結合体6はPulD含有膜に非常に弱く結合しただけであった(データは示さず)。
Sac7*-PhoAキメラ(Sac7d又はその誘導体がPhoAシグナルペプチドとPhoAの触媒部分との間に挟まれている)は、高いPhoA活性及びペリプラズマショックに際しての遊離によりモニターされるように、ペリプラズマに効率的に輸出された。Sac7*-PhoAキメラをコードするプラスミドをE. coli株PAP7232(pul遺伝子が染色体に組み込まれている)中に形質転換した。3つ全てのキメラはIPTG誘導後に類似する量で産生され、プルラナーゼ分泌を完全に阻害した一方、輸出されたSac7d-PhoAは効果がなかった。更に、PulD十二量体も単量体も、いずれかのSac7*-PhoAキメラを産生する株において検出されなかった(データは示さず)。これら現象についてのより正確な情報を得るため及びキメラを産生する株におけるPulDの運命を調べるために、pCHAP231(T2SS産生を増大させるため;Guilvoutら,2006を参照)を有するエンベローププロテアーゼ欠損株PAP5198で3つのキメラを産生させた。Sac7*-PhoA産生のIPTG誘導レベルは、プルラナーゼ分泌を>90%阻害した(図14A)。キメラを有さない又はSac7d-PhoAを有するコントロール中より、十二量体のPulDは豊富ではなく、PulD単量体は対応して豊富であった(図14B中矢印)。このことは、キメラがPulDの多量体化を妨げ、エンベローププロテアーゼによるPulD単量体分解を引き起こすことを証明する。類似の結果が非誘導レベルのSac7*33-PhoA及びSac7*40-PhoAを用いて得られたが、Sac7*6-PhoAが非誘導レベルで存在するときには実質的なプルラナーゼ分泌(>50%)及びPulDの多量体化が生じた(図14C)。
最良のライブラリ(ライブラリ14)を使用して、上記と同じ技術を用いて他の標的に特異的な結合体を得た。
選択は、第5サイクルまでの以下のタンパク質に照準を定めた抗-タンパク質リボソームディスプレイにより行った:PulDN1(26.8kDa)、NGF(13kDa)、PknG(81,6kDa)、GarA(12kDa)及びリゾチーム(14.3kDa)。第4サイクルの間、選択プロセスは標的あり及びなしを並行して行った。図15は、4つの選択サイクル後、標的が存在するとき(「+」と印されたレーン)だけPCR産物が得られることを示す。このことは、選択プールが試験した標的の各々に特異的なクローンで富化されたことを示唆する。
96ウェルマイクロ培養物を調製することによりBiacoreで最良の予想親和性(長い複合体解離時間(koff))について、ポジティブ抗-リゾチームクローンをスクリーニングして分類した。次いで、選択した24の最良クローンを配列決定した(図18)。何度も現れるので(或る位置について同じアミノ酸を異なるコドンによりコードするが)、優先的な配列(例えばLys_B11クローンの優先的配列)は明白である。第4サイクルのスクリーニングは、より大きな多様性を明らかにした(示さず)。
3つの抗-リゾチームクローン(Lys_B3、Lys_H4及びLys_H8)は、溶液状態での熱安定性及び親和性を決定するために、微量熱量測定による特徴付けの最中である。
他の選択から得られたクローンもまた、Biacoreによりスクリーニングし、配列決定して、或るクローンの親和性をBiacoreによってより正確に決定する予定である。
9.1.Fc結合体の選択
スルホスクシンイミジル-6-(ビオチンアミド)ヘキサノエートを用いて、Bio-Radにより提供されたヒトIgG Fcフラグメント(MW = 50kDa)を化学的にビオチン化した。HABAアッセイにより決定したビオチン化の程度は、1タンパク質分子あたり約2〜3分子のビオチンであった。ビオチン化FcをMaxisorpプレート(Nunc)において固定化ニュートラビジン又はストレプトアビジンに結合し、リボソームディスプレイによる選択を、Sac7dに由来するライブラリ(上記のような)を用いて4℃にて行った。4回の選択ラウンドを行って結合体を単離した。ニュートラビジン及びストレプトアビジンを回毎に交互に使用して非特異結合体を回避した。
選択ラウンド後、RGS-His6-タグを有する配列(おそらく結合体)のプールを得た。このプールを、インビトロでE. coli S30抽出物を用いて翻訳し、その結合活性を、抗-RGS-His6-タグ-HRP接合体を用いるELISAにより試験した。この選択プールにおいて、受動的に固定化したFcフラグメントに対する結合活性が検出され、BSA、ニュートラビジン及びストレプトアビジンに対しては結合シグナルは観察されなかった(示さず)。この結果は、この結合体プールがおそらくFcフラグメントに特異的であること、及び結合活性に対するニュートラビジン又はストレプトアビジンの有意な寄与はないことを示唆している。
上記の技術の可能性を増大させるために、リボソームディスプレイ選択プロトコル(図21)を、後の、同時の及び迅速な、多数標的の検査用の自動化プラットフォームに移す(ライブラリ14を依然として用いるか、又は例えばSac7dとは異なるOB-フォールドタンパク質から出発する任意の他のライブラリを用いる)。
本発明者らは、進化が数百万年の間にOB-フォールドを用いて達成した事の潜在的利益を探索して、このフォールドを広範な種々のリガンド:金属イオン、糖、核酸(RNA、一本鎖及び二本鎖DNA)及びタンパク質に結合するように適合させた。本発明者らは、OB-フォールドファミリーのメンバーをインビトロ進化によりDNA認識からタンパク質認識へ変換させ得ることを示すことができた。このことにより、所与の標的に対する高親和性、高特異性結合体の生成に成功した。
OB-フォールド構造様式が二極化しているという観察は、全てのOB-フォールドタンパク質で結合面が常に同じである(Arcus,2002)ことを意味し、野生型タンパク質の好適な生物物理学的特性を保持するSac7d変形体のライブラリの設計を可能にした。異なるOB-フォールドタンパク質は、ループ1、3及び4の長さ(これはしばしばリガンド結合に関与する)に実質的なバリエーションを示すことがある(図1b及び2)。現在までに使用されるほとんどの足場は抗体中(Binzら,2005)と同様に可撓性ループのランダム化に基づくが、本発明者らは、天然型Sac7dタンパク質の元のループ長を維持することを決定した。本発明者らは、先ず、結合領域の僅かに窪んだ部分が標的として使用するタンパク質の球形状に最も適合すると推論した。しかし、上記のように、この領域の残基のランダム化によって、高ナノモルより良好な結合体を取得することはできなかった。この潜在的結合表面は約890Å2の溶媒接近可能面積に相当し、抗体-タンパク質会合についての代表的範囲内である(777±135Å2)(Jones及びThornton,1996)。よって、この面は、高親和性を有する単量体結合体を得るに足りる相互作用エネルギーを提供するに十分であるはずである。次いで、3つの更なる置換による潜在的結合領域の拡張を試験した。
リボソームディスプレイを用いて、幾つかの異なる標的に対する結合体の選択を成功裡に行った。富化には5〜6回の選択ラウンドが必要となる(Hanesら,2000)完全に合成のナイーブscFvライブラリを用いる選択とは対照的に、Sac7dライブラリを用いると第3ラウンド後に既に有意な富化が観察された。このことは、抗体と比較して、より効率的なSac7dのフォールディングにより説明がつく。なぜならば、天然型状態に到達するためのジスルフィド結合形成も、機能的であるための2つの連結された構造ドメインの(scFvフラグメントについてと同様な)正確な会合も必要としないからである。高率での富化は、足場におけるDARPについて記載されたもの(Binzら,2004a)と同様である。最後に、PulD-Nに対する選択の結果(output)は、ライブラリが同じ標的タンパク質を認識することができる異なる結合体を提供するに十分な機能的多様性を含んでいることを証明している。このことは、本発明によるSac7dライブラリの設計の妥当性を示した。
PulD-Nに対する選択した単量体結合体の特徴付けは、Sac7dライブラリを用いてピコモル親和性が得られることを示した。これら親和性は、親和性成熟工程(概説として、Hosseら,2006及びその中の参考文献を参照)を必要とせずに足場タンパク質を用いて得られた最も高いものの1つである。結合の動力学もまた約2 107M-1.s-1の結合速度を有し驚くべきものであった。この結合速度により、PulD-N結合体はタンパク質-タンパク質相互作用についての拡散律速結合速度(Gabdoulline及びWade,1997)の上位にランク付けられる。結合速度は、静電気学的な助力を受けていないようにはみえない。よって、高い結合速度は、コンホメーション変化を必要とすることのない、標的に幾何学的に一致する結合体の「予め形成された(preformed)」形状により説明し得る。
試験した3つ全てのSac7*-PhoAキメラが単量体の完全長PulDに結合した。Sac7*40-PhoA及びSac7*33-PhoAは十二量体PulDに良好に結合し、このことはエピトープが接近可能なままであることを示している。対照的に、Sac7*6-PhoAはPulD十二量体に弱々しくのみ結合したが、インビトロでPulD-Nに対して最も高い親和性を有していた。このことは、エピトープが多量体化に際して部分的にマスクされており、Sac7*40及びSac7*33により認識されるエピトープとは異なることを示している。ITC競合実験は、Sac7*6及びSac7*40により認識されるエピトープが同一であるか又はオーバーラップしていることを示唆した(データは示さず)。PhoAに融合したときのこれら2つの結合体のインビボ効果の差は、エピトープがオーバーラップしていることを示唆する。
これら結合体は、抗体に代替する足場において要求される非常に好適な生物物理学的特性のほとんどを保持していた。それらの特性は、以前に提案された抗体代替物(例えば、アフィボディ(affibodies)(Nordら,1997)、フィブロネクチン(Xuら,2002)、又はアンキリン(Binzら,2004a))に良好に匹敵する。確かに、これら結合体はE. coliにおいて(細胞質又はペリプラズマで)非常に良好に発現し、安定で、可溶性であり、高親和性及び高い特異性でタンパク質標的を認識することができ、また異なるレポータータンパク質(PhoA及びGFP)に機能的に融合させることが可能である。換言すれば、これら結合体は、製造が安価で、精製及び取り扱いが容易である。このことは多くの生物工学的適用のための扉を開く。
高親和性及び非常に繊細な特異性で標的タンパク質を認識することができる結合体を得るためにOB-フォールドタンパク質を使用するストラテジーは、上記の結果によって成功したと確証された。出発点は一般的なDNA結合性タンパク質たるSac7dであった。Sac7d及びその誘導体は、今や、2つの構造的に無関係のファミリーのリガンド:DNA及びタンパク質を認識することができる。よって、本発明者らは、所与の標的についてOB-フォールドの結合性適合をインビトロで再現した。したがって、Sac7dはまた、OB-フォールドタンパク質の他の公知のリガンド(例えば、一本鎖DNA、RNA又は糖)に適合させ得ると考えられる。機能的ノックアウト実験における見込みのある使用に加えて、これら結合体は、アフィニティークロマトグラフィー、検出、インビボ局在化実験などに使用することができる。確かに、これら結合体の好適な生物物理学的特性は、異なるレポータータンパク質への容易な融合及び小さなサイズ(scFv及びIgGよりそれぞれ3倍及び19倍小さい)と共に、これら適用を容易にし得る。
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Claims (27)
- 標的に特異的に結合する分子をコンビナトリアル変異/選択アプローチにより得るための出発分子としてのOB-フォールドタンパク質の使用。
- 前記コンビナトリアル変異/選択アプローチが、ループ3中へのランダムな1〜15アミノ酸残基の挿入及び/又はループ4中へのランダムな1〜15アミノ酸残基の挿入及び/又はループ1中へのランダムな1〜20アミノ酸残基の挿入と組み合わされる請求項1に記載の使用。
- 前記コンビナトリアル変異/選択アプローチが1〜4アミノ酸残基の欠失と組み合わされる請求項1又は2に記載の使用。
- OB-フォールドタンパク質のその天然型リガンドとの結合界面の5〜32残基、好ましくは8〜20残基、より好ましくは11〜16残基のランダム化に対応するコンビナトリアルライブラリ。
- ループ3中へのランダムな1〜15アミノ酸残基の挿入及び/又はループ4へのランダムな1〜15アミノ酸残基の挿入及び/又はループ1中へのランダムな1〜20アミノ酸残基の挿入を更に含んでなる請求項4に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- OB-フォールドタンパク質がSulfolobus acidocaldarius由来のSac7d若しくはSac7e、又はSulfolobus solfataricus由来のSso7d、又はSulfolobus tokodaii由来のDBP 7、又はSulfolobus shibatae由来のSsh7b、又はSulfolobus shibatae由来のSsh7a、又はSulfolobus solfataricus由来のp7ssである請求項4又は5に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、T33、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50及びP51の中から選択されるSac7dの残基のランダム化に対応する請求項6に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、K28、M29、S31、T33、K39、T40、R42、A44、S46、E47及びK48の中から選択されるSac7dの11、12、13、14、15、16、17又は18残基のランダム化に対応する請求項7に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、K28、M29、S31、T33、K39、T40、R42、A44及びS46の中から選択されるSac7dの11、12、13、14、15又は16残基のランダム化に対応する請求項8に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- ランダム化された残基が少なくともSac7dのK7、Y8、K9、W24、V26、M29、S31、T33、R42、A44及びS46を含んでなる請求項9に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- Sac7dの残基K7、Y8、K9、W24、V26、M29、S31、T33、R42、A44及びS46のランダム化に対応する請求項10に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- K21、K22及びT40の中から選択されるSac7dの更なる1、2又は3残基もまたランダム化されている請求項10に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- Sac7dの残基K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、R42、A44及びS46のランダム化に対応する請求項12に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- Sac7dの残基K7、Y8、K9、K21、K22、W24、V26、M29、S31、T33、T40、R42、A44及びS46のランダム化に対応する請求項12に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- ランダムな1〜15アミノ酸残基がSac7dの25位〜30位アミノ酸に相当する領域中に、好ましくはG27とK28との間に挿入され、及び/又はランダムな1〜15アミノ酸残基がSac7dの35位〜40位アミノ酸に相当する領域中に、好ましくはN37とG38との間に挿入され、及び/又はランダムな1〜20アミノ酸残基がSac7dの7位〜12位アミノ酸に相当する領域中に、好ましくはK9とG10との間に挿入されている請求項6〜14のいずれか1項に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- A59、R60、A61及びE64の中から選択される1〜4アミノ酸残基が欠失している請求項6〜14のいずれか1項に記載のコンビナトリアルライブラリ。
- 標的に特異的に結合する分子を工学的に操作するための請求項4〜16のいずれか1項に記載のコンビナトリアルライブラリの使用。
- 請求項4〜16のいずれか1項に記載のコンビナトリアルライブラリにおいて、標的に結合するOB-フォールドタンパク質の変形体を選択する工程を含んでなる標的に特異的に結合する分子を工学的に操作する方法。
- 前記標的がペプチド、タンパク質、オリゴ多糖、一本鎖DNA、二本鎖DNA、RNA、金属イオン、又は炭水化物である請求項1、2、3若しくは17のいずれか1項に記載の使用、又は請求項18に記載の方法。
- 前記選択工程がリボソームディスプレイにより実施される請求項18又は19に記載の方法。
- 2、3、4又は5回の選択がリボソームディスプレイにより実施される請求項20に記載の方法。
- 前記標的に特異的に結合する分子を単離し特徴付ける工程を更に含んでなる請求項20又は21に記載の方法。
- 前記単離及び特徴付け工程が以下の工程:
(i)リボソームディスプレイにより選択されるプールからのmRNAを逆転写し、PCRにより増幅し、得られるDNAを発現ベクター中にクローニングする工程;
(ii)細菌を前記発現ベクターにより形質転換し、個々のクローンを成長させる工程;
(iii)前記細菌クローンから抽出したタンパク質を前記標的に対する結合について試験する工程
を含んでなる請求項22に記載の方法。 - 第1成分としての前記単離及び特徴付けられた分子と少なくとも第2の成分とを含んでなる融合タンパク質を製造する工程を更に含んでなる請求項22又は23に記載の方法。
- 前記少なくとも第2成分が、前記第1成分とは異なる特異性を有する酵素、マーカータンパク質、治療タンパク質及び結合体の中から選択される請求項24に記載の方法。
- PulDに特異的に結合すること、及び配列が配列番号2〜8の中から選択されることを特徴とする請求項16〜25のいずれか1項に記載の方法により得られるタンパク質。
- GarAに特異的に結合すること、及び配列が配列番号47であることを特徴とする請求項16〜25のいずれか1項に記載の方法により得られるタンパク質。
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