CN113061187A - 一种抗人msln单克隆抗体、制备方法及其用途 - Google Patents

一种抗人msln单克隆抗体、制备方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113061187A
CN113061187A CN202110460273.4A CN202110460273A CN113061187A CN 113061187 A CN113061187 A CN 113061187A CN 202110460273 A CN202110460273 A CN 202110460273A CN 113061187 A CN113061187 A CN 113061187A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
library
variable region
supernatant
msln
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110460273.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113061187B (zh
Inventor
贺建望
谢朋辉
崔会蕊
其他发明人请求不公开姓名
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albertson Jiangsu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Albertson Jiangsu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Albertson Jiangsu Biotechnology Co ltd filed Critical Albertson Jiangsu Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110460273.4A priority Critical patent/CN113061187B/zh
Publication of CN113061187A publication Critical patent/CN113061187A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113061187B publication Critical patent/CN113061187B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Abstract

本发明公开了一种抗人MSLN单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区序列由氨基酸序列(SEQ4)组成，重链可变区序列由氨基酸序列(SEQ8)组成。制备该抗体的方法，包括以下步骤：MSLN重组蛋白表达和纯化；动物准备与免疫，免疫完成后采集脾脏；总RNA提取；RNA反转录及抗体可变区PCR；噬菌粒载体构建和转化；文库扩增与浓缩；抗原包被和细胞准备；文库筛选与再扩增；文库检测。本发明提供了快速高效开发一种特异性高亲和力MSLN单克隆抗体的方法，该抗体可应用于ADC靶向药物的开发，亦可改造为scFv单链抗体应用于CAR‑T细胞治疗的靶向抗体，提高抗体实用性。

Description

一种抗人MSLN单克隆抗体、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及噬菌体展示单克隆抗体领域，特别涉及一种抗人MSLN单克隆抗体、制备方法及其用途。
背景技术
间皮素(MSLN)是一种在细胞表面和血清中发现的糖蛋白，其基因编码一种69kDa的前体蛋白，在成熟过程中被酶水解为保留C端约40KD的膜结合蛋白即为成熟的间皮素。水解后的N端约30KD为巨核细胞促进因子(MPF)的片断脱落并释放出细胞外存在于血液及尿液中。
MSLN在正常情况下表达局限于间皮细胞(腹膜、心包膜和胸膜腔)且表达量较低，在其它组织中和细胞中基本不表达。然而在多种肿瘤类型中MSLN被发现显著高表达，包括间皮瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、输卵管癌、头和颈癌、宫颈癌和卵巢癌。研究表明MSLN的异常表达对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等特性都起到了一定的促进作用。MSLN这种在正常细胞中不表达和低表达的情况决定了其成为靶向治疗肿瘤的特异性靶点的潜在优势。临床研究表明MSLN的表达与肿瘤严重程度和生存率有相关性。针对MSLN这种表达特性和临床症状关联性，开发针对MSLN的特异性单克隆抗体应用于ADC靶向药物、CAR-T细胞治疗，MSLN将是一种非常具有潜力的靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人MSLN单克隆抗体、制备方法及其用途，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
一方面，本发明提供的一种抗人MSLN单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区序列由氨基酸序列(SEQ4)组成，所述重链可变区序列由氨基酸序列(SEQ8)组成。
在某些实施方案中，轻链可变区序列包括：CDR1序列SEQ1，CDR2序列SEQ2，CDR3序列SEQ3；重链可变区序列包括：CDR1序列SEQ5，CDR2序列SEQ6，CDR3序列SEQ7；同时抗体序列为单链抗体。
在某些实施方案中，轻链可变区序列为完整抗体或为scFv抗体片段，重链可变区序列为完整抗体或为scFv抗体片段。
在某些实施方案中，抗体片段为Fab形式或Fab2形式的抗体片段。
在某些实施方案中，抗人MSLN单克隆抗体为鼠源的、嵌合的或人源化的。
另一方面，本发明提供制备抗人MSLN单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
S1、MSLN重组蛋白表达和纯化；
S2、动物准备与免疫，免疫完成后采集脾脏；
S3、总RNA提取；
S4、RNA反转录及抗体可变区PCR；
S5、噬菌粒载体构建和转化；
S6、文库扩增与浓缩；
S7、抗原包被和细胞准备；
S8、文库筛选与再扩增；
S9、文库检测。
在某些实施方案中，步骤S1具体为：将人MSLN基因编码的蛋白片段克隆至真核表达载体中，蛋白C端添加6*his标签，经测序正确后的载体进行无内毒素中量提取质粒，将提取的无内毒素质粒使用PEI转染试剂转染HEK293F细胞，转染后进行发酵培养，收集表上清液，上清利用Ni柱亲和纯化，得到目的蛋白，将目的蛋白透析至PBS(pH为7.4)中；
步骤S3具体为：将步骤S2中采集的新鲜脾脏研磨成粉末状，称取适量加入Trizol中进行混合打碎，室温静置后，分别取2份每个样品与氯仿进行混合，静置后取上清液，并将两份所得到的上清液混合，继续加入等体积的异丙醇混合，静置离心后弃上清液，加入乙醇对沉淀进行洗涤，室温晾干后加入DEPC水完全溶解，得到脾脏总RNA。
在某些实施方案中，步骤S4具体为：总RNA使用微量分光光度计定量后，按照反转录酶试剂盒操作说明，以50μL反转录体系进行反转录，抗体重轻链可变区PCR引物进行适当修改优化，引物上下游引入酶切位点和linker引物；
步骤S5具体为：将PCR获得的抗体重轻链拼接片段和pCom3向量表达载体酶切消化后，按照T4连接酶使用说明书进行过夜连接，具体为：将感受态菌XL1-blue于4℃下化冻，同时将电击杯于4℃下预冷，将质粒与感受态菌XL1-blue混匀后加入电击杯中进行冰浴和电击，加入SOC培养基，然后取出电击感受态细胞，多次重复后将感受态细胞合并收集，复苏后再加入培养基进行培养复苏后得到菌液。
在某些实施方案中，步骤S6具体为：将步骤S5中的菌液与含氨苄、四环素和葡萄糖的培养基继续进行培养，之后加入辅助噬菌体，静置共孵育后继续培养复苏，离心去除上清，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的培养基过夜培养扩增，收集过夜培养上清，加入PEG8000和NaCl混合冰浴，离心去除上清液，加入小体积的PBS无菌缓冲液进行再溶解，并使用0.2um滤膜过滤除菌后即得到浓缩文库，最后加入DMSO防冻液混匀，并于-80℃下冻存；
步骤S7具体为：将MSLN蛋白用碳酸盐缓冲液稀释，加入96#酶标板中，于4℃过夜放置，次日取出，扣干孔内液体，加入PBST洗液洗涤扣干，随后加入BSA溶液进行室温封闭，用PBST洗涤扣干，于-20℃冻存备用；Hela细胞使用DMEM培养基复苏培养，根据筛选过程所需细胞数量按需传代扩增备用；
步骤S8具体为：取浓缩文库，适量稀释后加入脱脂奶粉混合，静置孵育，向包被了MSLN蛋白的酶标板中加入孵育后的文库，进行孵育；扣干文库溶液后，加入PBST溶液，静置，扣干，如此重复多次；洗脱并调节pH至中性，加入菌液混合，感染，静置孵育，培养复苏后离心去除上清，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的培养基过夜培养扩增，次日收集过夜培养上清，加入PEG8000和NaCl混合冰浴1h，4℃下进行离心去除上清，加入浓缩前总体积5％的PBS无菌缓冲液进行溶解，最后再加入DMSO混合，于-80℃冻存，至此完成一轮文库筛选和扩增，再次进行两轮文库筛选和扩增，获得3次筛选扩增的文库。
再一方面，本发明提供抗人MSLN单克隆抗体用于MSLN阳性癌症的治疗，包括间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌等的药物开发。
有益效果：本发明提供了快速高效开发一种特异性高亲和力MSLN单克隆抗体的方法，该抗体可应用于ADC靶向药物的开发，亦可改造为scFv单链抗体应用于CAR-T细胞治疗的靶向抗体，提高抗体实用性。
附图说明
图1为本发明的MSLN纯化蛋白电泳图；
图2为本发明的PCR抗体可变区片段电泳图；
图3为本发明的文库Elisa检测结果图；
图4为本发明的Elisa检测阳性单克隆吸光值对比图；
图5为本发明的M015噬菌体免疫荧光检测结果图。
具体实施方式
下面通过实施方式对本发明进行进一步详细的说明。
实施例1 MSLN重组蛋白表达和纯化
将人MSLN基因(采购自leadingbiology)编码的蛋白Glu296-Gly580片段克隆至pCDNA3.1真核表达载体中，蛋白C端添加6*his标签用于纯化，经测序正确后的载体进行无内毒素中量提取质粒。将提取的无内毒素质粒使用PEI转染试剂(采购自安诺伦生物)按适量的质粒比转染HEK293F细胞，转染细胞使用293-TII培养基(采购自义翘神州)培养至密度2*106，转染后37℃，165RPM，5％CO2发酵培养7天后，收集表上清液。上清利用Ni柱亲和纯化，在50mM Tris-Hcl,pH8.0,500mM NaCl，500mM咪唑中洗脱下目的蛋白，将目的蛋白透析至PBS(pH 7.4)中，经过SDS-PAGE检测验证纯化蛋白纯度和产量。具体结果见图1所示，最终得出纯化蛋白的纯度为95％，产量为2.5mg/L。
实施例2动物准备与免疫
以纯化获得的MSLN为免疫原，选取6-8周龄健康Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用MSLN按照50μg/只剂量与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，背部多点皮下注射免疫小鼠；第一次免疫后，每隔14d，用MSLN 50μg/只剂量与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，背部多点皮下注射免疫小鼠，共免4次。间接ELISA测定小鼠血清抗体效价，当效价达到81000倍稀释度，小鼠腹腔注射50μg MSLN加强免疫4天后采集脾脏。
实施例3总RNA提取
采集新鲜脾脏加液氮在研钵中碾磨，直到形成很细的粉末状，取适量加入Trizol中，迅速充分混匀，用匀浆机打碎几次。室温静置5min后，每个样品取1ml依次分别加入到2个1.5mlEP管中。加200μL氯仿到1.5mlEP管中,盖紧样品管盖。用手用力摇晃试管1min，后静置5min。每管取上清约350μL，两管上清并为一管，得到大约700μL上清。加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置20-30min。样品11000rpm，4℃离心10min，弃上清。加入700μL 75％乙醇，洗涤沉淀二次。4℃，7000rpm离心5min，弃上清。室温晾干，加入适量DEPC水完全溶解，得到脾脏总RNA。
实施例4 RNA反转录及抗体可变区PCR
总RNA使用微量分光光度计定量后，按照反转录酶试剂盒操作说明，以50μL反转录体系进行反转录。抗体重轻链可变区PCR引物参考文献[沈倍奋陈志南刘民培.重组抗体]并进行适当修改优化，引物上下游引入酶切位点和linker引物。PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃充分延申5min，30个循环。抗体重链和轻链拼接条件为：94℃预变性5min，98℃15s，58℃30s，72℃1min，共5个循环；之后98℃15s，68℃1min，72℃5min。PCR电泳结果见图2。由图2可知，PCR片段大小为500bp左右，与理论大小相符，抗体可变区片段被有效扩增。
实施例5噬菌粒载体构建和转化
将PCR获得的抗体重轻链拼接片段和pCom3向量表达载体酶切消化后，按照T4连接酶使用说明书进行过夜连接。将感受态菌XL1-blue取出于4℃化冻，同时将电击杯放入4℃预冷10分钟。将电转仪电压调为1800V/mm,将混有感受态质粒的加入到电转杯中，冰浴半分钟，之后电击5ms，迅速加入SOC培养基，然后取出电击感受态细胞。如此重复多次后将感受态合并收集，复苏后再加入2YT培养基置于37℃，250rpm培养复苏数分钟后。取100uL菌液，稀释铺板，计算库容。
实施例6文库扩增与浓缩
复苏后的菌液加入含氨苄、四环素和2％葡萄糖的2YT培养基，继续培养1小时。之后加入辅助噬菌体，37℃静置共孵育后，37℃，250rpm培养复苏2小时。随后，离心去除上清，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的2YT培养基，30℃，250rpm过夜培养扩增。收集过夜培养上清，加入4％PEG8000(生工生物)和3％Nacl，混匀后冰浴1小时，之后4℃，13000g离心40分钟，去除上清，加入浓缩前总体积5％的PBS无菌缓冲液进行溶解。最后再加入终体积7％的DMSO混匀，于-80℃冻存。
实施例7抗原包被和细胞准备
将MSLN蛋白用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至10μg/mL，按照每孔100μL加入可拆卸96#酶标板中，于4℃过夜放置，次日取出，扣干孔内液体，加入PBST洗液洗两遍扣干，随后加入2％BSA溶液进行室温封闭1小时，用PBST洗液再次洗两次，扣干，于-20℃冻存备用。Hela细胞使用DMEM培养基复苏培养，根据筛选过程所需细胞数量按需传代扩增备用。
实施例8文库筛选与再扩增
取1mL浓缩文库，适量稀释后加入3％脱脂奶粉混匀，37℃静置孵育30分钟。向包被了MSLN蛋白的酶标板中每孔加入100uL孵育后文库，37℃，60rpm孵育1.5小时。扣干文库溶液，每孔加入330μL PBST洗液，静置1分钟后，扣干；接着继续加入330μL PBST洗液，静置1分钟后，扣干，如此重复6次。最后一次将PBST洗液扣干后，每孔加入100μL甘氨酸洗脱液，37℃静置孵育10分钟，吸出洗脱液，加入2M-tris(pH8.0)中和至pH中性。中和后的洗脱液与XL1-blue菌液(OD约1.0)混匀，37℃感染30分钟，随后37℃250rpm培养2小时，37℃静置共孵育后，37℃，250rpm培养复苏1.5小时。随后，离心去除上清，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的2YT培养基，30℃，250rpm过夜培养扩增。次日收集过夜培养上清，加入4％PEG8000(生工生物)和3％Nacl，混匀后冰浴1小时，之后4℃，13000g离心40分钟，去除上清，加入浓缩前总体积5％的PBS无菌缓冲液进行溶解。最后再加入终体积7％的DMSO混匀，于-80℃冻存。至此完成一轮文库筛选和扩增，再次重复文库筛选和筛选文库过程一次，获得2nd(2次)筛选扩增的文库。从3rd筛选开始，使用Hela细胞孵育筛选一轮，获得能够与hela细胞结合的文库，洗脱后的文库感染XL1-blue菌液并参照前两轮扩增方法扩增，获得3rd筛选扩增的文库。
实施例9文库检测
将3rd扩增文库分别稀释1倍、10倍、100倍、1000倍，100μL每孔加入包被的MSLN酶标板中和2％BSA封闭的空白板中，室温孵育1小时后，PBST洗液洗两遍扣干。加入anti-M13HRP标记二抗(leading biology)，室温孵育40分钟，PBST洗液洗三遍扣干。加入TMB显色液，室温显色20分钟后，加入2M硫酸终止显色，酶标仪OD450nm读取吸光值，结果见图3。由图3可知，包被MSLN蛋白条件下在不同稀释倍数明显吸光值高于对照，说明文库中存在针对MSLN的抗体。
实施例10单克隆表达及Elisa检测
第三轮检测阳性文库适当稀释后，侵染XL1-blue大肠杆菌并进行涂板。次日从平皿板中挑取单克隆菌落进行培养。培养的菌液留存一份作为测序备份，剩下的菌液通过辅助噬菌体的孵育，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的2YT培养基，30℃，250rpm过夜培养扩增。96#酶标板50ng每孔包被MSLN，共1块板，对照为2％BSA封闭的空白板。进行封闭、洗板拍干后，加入10倍稀释的表达样品，室温孵育1小时后，PBST洗液洗两遍扣干。加入anti-M13HRP标记二抗(采购至leadingbiology)，室温孵育40分钟，PBST洗液洗三遍扣干。加入TMB显色液，室温显色20分钟后，加入2M硫酸终止显色，酶标仪OD450nm读取吸光值。检测到阳性的克隆吸光值如图4所示。
实施例11免疫荧光检测及序列分析
表达的单克隆样品Elisa检测阳性且结合值最高的前25个样品进一步进行免疫荧光检测分析靶向Hela细胞活性。将单克隆样品稀释后加入已铺好Hela细胞中的96#板中，孵育1小时后，洗板后加入兔抗M13抗体孵育1小时，然后洗板加入山羊抗兔IgG-FITC标记二抗继续孵育半小时，洗板去除未结合二抗，荧光拍照读取细胞结合结果。实验中兔抗M13抗体、山羊抗兔IgG-FITC均采购至leadingbiology。最终经过免疫荧光检测得到了与Hela细胞高亲和力结合信号的M015号克隆，如图5所示，进一步测序分析获得了其抗体可变区序列，其轻链可变区序列如SQ4所示，其包含CDR1序列如SEQ1所示，CDR2序列如SEQ2所示，CDR3序列如SEQ3所示。其重链可变区序列如SQ7所示，其包含CDR1序列如SEQ5所示，CDR2序列如SEQ6所示，CDR3序列如SEQ7所示。
综上所述：本发明提供了快速高效开发一种特异性高亲和力MSLN单克隆抗体的方法，该抗体可应用于ADC靶向药物的开发，亦可改造为scFv单链抗体应用于CAR-T细胞治疗的靶向抗体，提高抗体实用性。
以上表述仅为本发明的优选方式，应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应视为发明的保护范围之内。
序列表
<110> 艾柏森（江苏）生物科技有限公司
<120> 靶向MSLN单克隆抗体
<130> 2021
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Leu Ala Ser Lys Arg His Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Leu Gln His Trp Lys Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Ala Ser Lys Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Lys Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Asp Pro Ala Asn Gly Asp
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Thr Gly Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val His Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (10)

1.一种抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区序列由氨基酸序列(SEQ4)组成，所述重链可变区序列由氨基酸序列(SEQ8)组成。
2.根据权利要求1所述的抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区序列包括：CDR1序列SEQ1，CDR2序列SEQ2，CDR3序列SEQ3；所述重链可变区序列包括：CDR1序列SEQ5，CDR2序列SEQ6，CDR3序列SEQ7；同时抗体序列为单链抗体。
3.根据权利要求1所述的抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区序列为完整抗体或为scFv抗体片段，所述重链可变区序列为完整抗体或为scFv抗体片段。
4.根据权利要求3所述的抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，所述抗体片段为Fab形式或Fab2形式的抗体片段。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗人MSLN单克隆抗体，其特征在于，其为鼠源的、嵌合的或人源化的。
6.制备权利要求1至4中任一权利要求所述的抗人MSLN单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、MSLN重组蛋白表达和纯化；
S2、动物准备与免疫，免疫完成后采集脾脏；
S3、总RNA提取；
S4、RNA反转录及抗体可变区PCR；
S5、噬菌粒载体构建和转化；
S6、文库扩增与浓缩；
S7、抗原包被和细胞准备；
S8、文库筛选与再扩增；
S9、文库检测。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1具体为：将人MSLN基因编码的蛋白片段克隆至真核表达载体中，蛋白C端添加6*his标签，经测序正确后的载体进行无内毒素中量提取质粒，将提取的无内毒素质粒使用PEI转染试剂转染HEK293F细胞，转染后进行发酵培养，收集表上清液，上清利用Ni柱亲和纯化，得到目的蛋白，将目的蛋白透析至PBS(pH为7.4)中；
步骤S3具体为：将步骤S2中采集的新鲜脾脏研磨成粉末状，称取适量加入Trizol中进行混合打碎，室温静置后，分别取2份每个样品与氯仿进行混合，静置后取上清液，并将两份所得到的上清液混合，继续加入等体积的异丙醇混合，静置离心后弃上清液，加入乙醇对沉淀进行洗涤，室温晾干后加入DEPC水完全溶解，得到脾脏总RNA。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S4具体为：总RNA使用微量分光光度计定量后，按照反转录酶试剂盒操作说明，以50μL反转录体系进行反转录，抗体重轻链可变区PCR引物进行适当修改优化，引物上下游引入酶切位点和linker引物；
步骤S5具体为：将PCR获得的抗体重轻链拼接片段和pCom3向量表达载体酶切消化后，按照T4连接酶使用说明书进行过夜连接，具体为：将感受态菌XL1-blue于4℃下化冻，同时将电击杯于4℃下预冷，将质粒与感受态菌XL1-blue混匀后加入电击杯中进行冰浴和电击，加入SOC培养基，然后取出电击感受态细胞，多次重复后将感受态细胞合并收集，复苏后再加入培养基进行培养复苏后得到菌液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤S6具体为：将步骤S5中的菌液与含氨苄、四环素和葡萄糖的培养基继续进行培养，之后加入辅助噬菌体，静置共孵育后继续培养复苏，离心去除上清，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的培养基过夜培养扩增，收集过夜培养上清，加入PEG8000和NaCl混合冰浴，离心去除上清液，加入小体积的PBS无菌缓冲液进行再溶解，并使用0.2um滤膜过滤除菌后即得到浓缩文库，最后加入DMSO防冻液混匀，并于-80℃下冻存；
步骤S7具体为：将MSLN蛋白用碳酸盐缓冲液稀释，加入96#酶标板中，于4℃过夜放置，次日取出，扣干孔内液体，加入PBST洗液洗涤扣干，随后加入BSA溶液进行室温封闭，用PBST洗涤扣干，于-20℃冻存备用；Hela细胞使用DMEM培养基复苏培养，根据筛选过程所需细胞数量按需传代扩增备用；
步骤S8具体为：取浓缩文库，适量稀释后加入脱脂奶粉混合，静置孵育，向包被了MSLN蛋白的酶标板中加入孵育后的文库，进行孵育；扣干文库溶液后，加入PBST溶液，静置，扣干，如此重复多次；洗脱并调节pH至中性，加入菌液混合，感染，静置孵育，培养复苏后离心去除上清，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的培养基过夜培养扩增，次日收集过夜培养上清，加入PEG8000和NaCl混合冰浴1h，4℃下进行离心去除上清，加入浓缩前总体积5％的PBS无菌缓冲液进行溶解，最后再加入DMSO混合，于-80℃冻存，至此完成一轮文库筛选和扩增，再次进行两轮文库筛选和扩增，获得3次筛选扩增的文库。
10.应用权利要求1至4中任一权利要求所述的抗人MSLN单克隆抗体用于MSLN阳性癌症的治疗，包括间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌等的药物开发。
CN202110460273.4A 2021-04-27 2021-04-27 一种抗人msln单克隆抗体或其抗原结合片段 Active CN113061187B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110460273.4A CN113061187B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 一种抗人msln单克隆抗体或其抗原结合片段

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110460273.4A CN113061187B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 一种抗人msln单克隆抗体或其抗原结合片段

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113061187A true CN113061187A (zh) 2021-07-02
CN113061187B CN113061187B (zh) 2022-07-12

Family

ID=76567763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110460273.4A Active CN113061187B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 一种抗人msln单克隆抗体或其抗原结合片段

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113061187B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116925226A (zh) * 2023-03-09 2023-10-24 上海迪诺信安生物科技有限公司 抗msln抗体、方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110698562A (zh) * 2019-10-31 2020-01-17 浙江蓝盾药业有限公司 抗人msln单克隆抗体
CN110746505A (zh) * 2018-07-23 2020-02-04 上海细胞治疗集团有限公司 特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110746505A (zh) * 2018-07-23 2020-02-04 上海细胞治疗集团有限公司 特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体
CN110698562A (zh) * 2019-10-31 2020-01-17 浙江蓝盾药业有限公司 抗人msln单克隆抗体

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116925226A (zh) * 2023-03-09 2023-10-24 上海迪诺信安生物科技有限公司 抗msln抗体、方法及应用
CN116925226B (zh) * 2023-03-09 2024-03-19 上海迪诺信安生物科技有限公司 抗msln抗体、方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113061187B (zh) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104892733B (zh) 具有预定支架的多肽文库
CN110862457B (zh) 能与碳酸酐酶ix特异性结合的骆驼源纳米抗体及其应用
CN111909272B (zh) 抗pd-l1纳米抗体及其应用
CN111138533B (zh) 针对甲型肝炎病毒的单域抗体及其衍生蛋白
WO2015089881A1 (zh) 全人源抗cd26抗体及其应用
CN112028997A (zh) 抗ceacam5纳米抗体
CN109897107B (zh) 纳米抗体及其制备方法
CN110885370B (zh) 分泌番茄环斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其抗体和抗体制备方法
CN110845608B (zh) 一种番茄环斑病毒单克隆抗体及其制备方法
KR102504884B1 (ko) Sftsv에 결합 가능한 나노 항체 및 이의 응용
CN114262377B (zh) 一种阻断cd70与其配体cd27结合的抗人cd70纳米抗体的制备方法及其编码序列
CN113061187B (zh) 一种抗人msln单克隆抗体或其抗原结合片段
CN112661849B (zh) 一种艰难梭菌重组蛋白单克隆抗体的制备方法和应用
CN111138532B (zh) 针对甲型肝炎病毒的单域抗体的应用
CN112521497B (zh) 肌红蛋白单克隆抗体的制备和应用
CN112608385A (zh) 一种犬脑钠肽（bnp）单克隆抗体的制备
CN113698481B (zh) 一种抗体或其抗原结合片段及其应用
CN110423274B (zh) 抗绿脓杆菌外毒素a纳米抗体及其应用
CN113354736B (zh) 靶向人pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段及其应用
CN114213543A (zh) 抗犬胰脂肪酶特异性单链抗体、质粒载体及方法
CN110054675B (zh) 免疫原性多肽以及抗ttc36抗体cp4-3及应用
CN110066337B (zh) 一种抗TNF-α抗体
CN112079928B (zh) 一种抗pd-l1的单克隆抗体
CN114292333B (zh) 一种牛源抗金黄色葡萄球菌凝固酶Coa的单链抗体、制备方法和应用
CN113912729B (zh) 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant