CN115975055B - 一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系 - Google Patents
一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115975055B CN115975055B CN202310056795.7A CN202310056795A CN115975055B CN 115975055 B CN115975055 B CN 115975055B CN 202310056795 A CN202310056795 A CN 202310056795A CN 115975055 B CN115975055 B CN 115975055B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- tag
- lagtag
- pair
- lagcatcher
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 11
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 59
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- -1 small molecule organic compound Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 27
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 8
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000979 2-amino-2-oxoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系,属于生物技术领域。本发明提供的LagTag/LagCatcher是全新发现的、能够有效完全正交于其他现有Tag/Catcher的不可逆共价连接对(即与现有的Tag/Catcher对无交叉反应)。反应仅需将分别融合有LagTag和LagCathcer的分子混合即可自发进行。本发明提供的LagTag/LagCatcher增加了一锅反应底物的种类,减少固相延长蛋白链中链生长、纯化步骤的重复次数,进而用于各种蛋白质生物耦联的应用场景中,如多聚蛋白生产、活细胞蛋白标记、嵌合抗原疫苗制备等。
Description
技术领域
本发明涉及一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系,属于生物技术领域。
背景技术
SARS-CoV-2属于巢病毒目冠状病毒科的一种单股正链RNA病毒,其具有变异快、宿主多及较强宿主适应性等特点。如今已出现包括Alpha、Beta、Delta、Omicron等在内的众多突变体,他们感染能力、致病性各有不同,类型众多的突变株为抗疫工作(疫苗、特效药研发等)带来巨大挑战,已接种疫苗的人群也并非完全安全,他们仍有感染新冠的风险。2022年6月23日刊登于Cell的一篇文章证实串接不同抗原的嵌合疫苗相比同抗原二聚体疫苗拥有更广泛的免疫保护能力[2],这表明将不同受体结合结构域(RBD)共价串联是提高疫苗广谱性的有效方法之一,可使用何种方法能高效准确的将更多的疫苗抗原蛋白整合又是一大难题。
蛋白质生物耦联通常是利用天然氨基酸的化学性质(如氨基、羧基和巯基等),通过催化共价化学键的形成而实现。近些年,通过形成异肽键(iso-peptide)而催化蛋白间共价连接的Tag/Catcher体系越来越引起人们的关注,其中研究最多且深入的既是SpyTag/SpyCatcher共价连接系统[3-4]。在蛋白质内部,各氨基酸之间通过α-氨基与α-羧基脱水缩合而形成的共价键称之为肽键,而由赖氨酸侧链上的氨基(-NH2)与天冬酰胺的侧链氨基或天冬氨酸的侧链羧基(-COOH)间发生缩合反应,失去一个NH3或一个H2O分子而形成的共价键称之为异肽键,这一缩合反应通常是由邻近的谷氨酸催化而自发发生的。现有研究显示,在一些革兰氏阳性菌的菌毛蛋白和粘附蛋白中,这种自发形成的异肽键的存在极为普遍。而Tag/Catcher共价连接系统就是利用此类异肽键,对蛋白进行拆分后所开发形成的[5]。
目前比较成熟的Tag/Catcher系统主要有SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher两种。Spy系统采用的是酿脓链球菌纤连蛋白结合蛋白FbaB的CnaB2结构域,将CnaB2拆分为两部分,其一为N端含116个氨基酸残基的多肽(SpyCatcher,含第31位的赖氨酸和第77位的谷氨酸),其二为C端含13个氨基酸残基的多肽(SpyTag,含第117位的天冬氨酸)[5]。而Snoop系统采用的是肺炎链球菌的菌毛粘附素RrgA,将RrgA的D4结构域拆分为N端含106个氨基酸残基的多肽(SnoopTag,含第742位的赖氨酸)和C端含12个氨基酸残基的多肽(SnoopCatcher,含第803位的谷氨酸、第854位的天冬酰胺)两部分[6]。
Tag与Catcher在溶液中,能够快速地形成不可逆的异肽键这一共价连接,因此,将分别融合了Tag和Catcher的两种蛋白组分混合在一起,二者即可被迅速地连接起来,且由于异肽键的形成不可逆,因此这种连接极度稳定。目前,这一共价连接体系已经在蛋白质改造等工程手段中得到了广泛的应用。比如,通过在蛋白质的N端和C端分别融合Tag和Catcher,使蛋白质自发成环,能够显著提高蛋白质的稳定性;将其与水凝胶中的多聚材料进行融合,使其携带特定蛋白,能够模仿特定的细胞微环境;利用该系统使抗原与纳米颗粒融合,实现抗原聚集,能够显著增强免疫效果;将其与荧光探针融合,被用于研究革兰氏阴性菌外膜上的致病因子,探究膜蛋白的形态、动力学等[3,6]。
通过模块化生产蛋白,配合连续交替使用SpyTag/SpyCatcher与SnoopTag/SnoopCatcher,可以做到程序化生产共价连接的多聚蛋白,比如,可以藉此开发不同新冠病毒突变株RBD的共价连接嵌合疫苗等,以提高其广谱性,实现通用疫苗的研发。但仅有的两种Tag/Catcher最多只能在一锅反应(one-pot reaction)中连接3种蛋白,而通过反复使用SpyCatcher-SnoopCatcher进行链延长,虽然可以共价串联更多的目的抗原蛋白,但反应过程必须靶向每一个目的蛋白逐个进行,并且每进行一步,均需要纯化以去除未能连接的蛋白,因此无法实现一锅反应,其步骤冗长,造成大量损失。因此,我们通过开发更多的Tag/Catcher连接对,且彼此不发生交叉反应,可以实现在一锅反应中快速串联更多蛋白,或是减少链延长、纯化步骤的重复次数,在各种蛋白质生物耦联的应用场景中,尤其是不同疫苗抗原的共价连接以增强广谱性的通用疫苗研发中,具有重要的意义和潜在应用价值。
[1]WorldHealth Organization.WHO Coronavirus Disease(COVID-19)Dashboard.https://covid19.who.int/
[2]Xu K,Gao P,Liu S,Lu S,LeiW,ZhengT,Liu X,XieY,Zhao Z,Guo S,Tang C,YangY,YuW,WangJ,ZhouY,Huang Q,Liu C,AnY,Zhang R,HanY,Duan M,Wang S,Yang C,WuC,Liu X,She G,LiuY,Zhao X,Xu K,Qi J,Wu G,Peng X,Dai L,Wang P,GaoGF.Protective prototype-Beta and Delta-Omicron chimeric RBD-dimervaccinesagainst SARS-CoV-2.Cell.2022Jun23;185(13):2265-2278.e14.
[3]Hatlem D,Trunk T,Linke D,et al.Catching a SPY:Using theSpyCatcher-SpyTag and Related Systems forLabelingandLocalizingBacterialProteins.IntJMol Sci.2019,20.
[4]Reddington SC,HowarthM.Secrets ofa covalentinteractionforbiomaterials andbiotechnology:SpyTag and SpyCatcher.CurrentOpinion inChemicalBiology.
[5]Zakeri B,Fierer JO,Celik E,et al.Peptide tag forming a rapidcovalent bond to a protein,through engineeringabacterialadhesin.ProcNatlAcadSci USA.2012,109:E690-E7.
[6]Veggiani G,Nakamura T,Brenner MD,et al.Programmable polyproteamsbuilt using twin peptide superglues.ProcNatlAcadSciUSA.2016,113:1202-1207.
发明内容
本发明的第一个目的是提供一对肽连接体,包含肽标签和结合配偶体,其中肽标签和结合配偶体可以通过在包含所述结合配偶体中的一个反应残基和包含在所述肽标签中的另一个反应残基之间自发形成异肽键而彼此结合,肽连接体选自(a)或(b):
(a)肽标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,结合配偶体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示;
(b)与(a)中肽标签或结合配偶体具有至少80%同源性的变体,其中,肽标签的第9位始终为赖氨酸,结合配偶体的第113位始终为天冬酰胺,第45位始终为谷氨酸。
本发明的第二个目的是提供一种结合配偶体,所述结合配偶体能够通过一个反应残基与包含一个反应残基的肽标签通过自发形成异肽键而结合,所述结合配偶体选自(a)或(b):
(a)结合配偶体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;
(b)与(a)中结合配偶体具有至少80%同源性的变体,其中,结合配偶体的第113位始终为天冬酰胺,第45位始终为谷氨酸。
本发明的第三个目的是提供一种肽标签,所述肽标签能够通过一个反应残基与权利要求2所述的结合配偶体通过自发形成异肽键而结合,所述肽标签选自(a)或(b):
(a)肽标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
(b)与(a)中肽标签具有至少80%同源性的变体,其中,肽标签的第9位始终为赖氨酸。
本发明的第四个目的是提供一种组合物,所述组合物包括连接有上述结合配偶体的第一目标物以及连接有上述肽标签的第二目标物。
在一种实施方式中,所述第一目标物或第二目标物包括核酸分子、蛋白质、肽、小分子有机化合物、荧光团、金属-配体复合物、多糖、纳米颗粒、纳米管、聚合物、细胞、病毒、病毒样颗粒或其组合。
在一种实施方式中,所述病毒包括新冠病毒、流感病毒、轮状病毒、乙肝病毒。
本发明的第五个目的是提供编码上述肽连接体或上述肽标签或上述结合配偶体的基因。
本发明的第六个目的是提供一种载体,包括表达上述肽标签的载体或表达上述结合配偶体的载体。
在一种实施方式中,所述肽标签或结合配偶体上连接有核酸分子、蛋白质、肽、小分子有机化合物、荧光团、金属-配体复合物、多糖、纳米颗粒、纳米管、聚合物、细胞、抗原、病毒、病毒样颗粒或其组合。
本发明的第七个目的是提供一种宿主细胞,所述宿主细胞含有上述肽链接对,或上述基因,或上述组合物,或上述载体。
本发明的第八个目的是提供上述肽链接对,或上述结合配偶体,或上述肽标签用于以下任一用途:
(1)通过异肽键连接一对目标物;或
(2)通过多个不同异肽键连接一对以上目标物。
在一种实施方式中,(1)中,一对目标物包括连接有上述结合配偶体的第一目标物以及连接有肽标签的第二目标物。
在一种实施方式中,(2)中,通过多对肽链接对自发形成多个异肽键连接一对以上目标物,其中,连接一对目标物的肽链接对与另一对目标物的肽链接对之间正交。
在一种实施方式中,所述肽链接对选自spytag/spycatcher或者snooptag/snoopcatcher。
本发明的第九个目的是提供上述肽链接对,或上述结合配偶体,或上述肽标签,或上述组合物,或上述基因,或上述载体,或上述宿主细胞在制备疫苗、融合蛋白标签、检测试剂盒、药物、多聚蛋白或标记物试剂中的应用。
有益效果:
本发明提供的LagTag/LagCatcher是全新发现的、能够有效完全正交于其他现有Tag/Catcher的不可逆共价连接对(即与现有的Tag/Catcher对无交叉反应)。反应仅需将分别融合有LagTag和LagCathcer的分子混合即可自发进行。
本发明提供的LagTag/LagCatcher增加了一锅反应底物的种类,减少固相延长蛋白链中链生长、纯化步骤的重复次数,进而用于各种蛋白质生物耦联的应用场景中,如多聚蛋白生产、活细胞蛋白标记、嵌合抗原疫苗制备等。
附图说明
图1:SpaCD5结构域中形成异肽键的关键氨基酸模型。黄色棒状模型为参与形成共价连接的关键氨基酸,模型来源于PBD ID编号6M3Y的蛋白。
图2:LGG SpaCD5结构域拆分为LagCatcher与LagTag的示意图。关键氨基酸用黄色高亮棍状表示,橙色高亮位置796氨基酸脯氨酸为根据SnoopCatcher经验进行的调整,红色为LagTag部分,紫色为被删除掉的多余氨基酸残基。
图3:位置741的赖氨酸与位置849的天冬酰胺形成异肽键的示意图。
图4:MBP-LagTag蛋白和His-LagCatcher纯化分子筛和SDS/PAGE图。分子筛图中线为280nm吸收值。SDS/PAGE图中3号泳道为核酸,其余泳道均为对应蛋白。
图5:MBP-LagTag与LagCatcher自发共价连接图。
图6:LagTag/LagCatcher最佳反应条件筛选。(A)不同温度下,在Hepes Buffer中,pH 7.5下MBP-LagTag和LagCatcher各10μM孵育1、24或48小时结果。(B)不同Buffer组分下,16℃,pH7.5下MBP-LagTag和LagCatcher各10μM孵育1、24或48小时结果。(C)不同pH值下,在Hepes Buffer中16℃,MBP-LagTag和LagCatcher各10μM孵育1、24或48小时结果。(D)在pH7.5,16℃,Hepes Buffer中分别额外加入Triton X100和Tween,MBP-LagTag和LagCatcher各10μM孵育24或48小时结果。实验组各进行3次独立重复实验,误差棒已在图中显示,各实验组分别进行配对双尾t检验,无标注表示P>0.05(无显著差异),“*”表示P<0.05(存在显著差异),“**”表示P<0.01(存在极显著差异)。
图7:MBP-LagTag/LagCatcher反应的时间进程曲线。
图8:LagTag/LagCatcher反应前24小时速率常数图。
图9:MBP-LagTag/LagCatcherNA的ForteBio实时结合动力学特征分析。
图10:Lag(LA)Tag/Catcher与Snoop(SN)Tag/Catcher、Spy(SP)Tag/Catcher正交反应测试,“-”表示不添加。
具体实施方式
实施例1自发形成共价键的LagTag/LagCatcher的设计和制备
(1)肽链接对LagTag/LagCatcher的设计
鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)通过SpaC末端亚基与人肠道粘液结合,SpaC(PDB ID编号6M3Y)是鼠李糖乳杆菌LGG的菌毛蛋白。SpaC晶体结构表明,SpaCD5结构域在残基位置741的赖氨酸和位置849的天冬酰胺之间形成自发的异肽键,由相邻的位置791的谷氨酸催化(图1)。本发明将SpaCD5结构域拆分为一个名为LagTag的肽标签(残基733-744),该肽含有活性赖氨酸,另一个称为LagCatcher的蛋白质伴侣(残基747-855),该蛋白质伴侣衍生出含有活性的天冬酰胺和催化作用的谷氨酸的其余蛋白质(图2)。
进一步的,本发明将LagCatcher的位置796的天冬氨酸突变为脯氨酸,以稳定接近反应位点的β-圈(图2),最终合成得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的LagCatcher。
(2)质粒构建
将编码LagTag和LagCatcher蛋白的DNA片段(LagTag的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,LagCatcher的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)用EcoR I和Nde I酶切位点分别连入pET21a(+)载体中,并使LagTag融合MBP标签,LagCatcher融合His6(hexa-His-tag)标签,这样会得到一个N-端带有6组氨酸标签的重组LagCatcher蛋白,和一个N-端带有MBP标签的重组LagTag蛋白,分别命名为pET21a-His-LagCatcher和pET21a-MBP-GGGGS2-LagTag。重组质粒通过PCR鉴定和测序证实插入的外源片段所编码的氨基酸序列完全正确。
LagTag氨基酸序列如下:
PSMTLRVIKQDN(SEQ ID NO.1)
LagCatcher氨基酸序列如下:
QYLAGAAFTLQPSAGEAETITSSATSEGQAFATKLVADGTYTMSETKAPPGYQSNPAKI AIQVATTGKEATVTIDGEALKPGESKNGYTLAIDGSTITLQAINQPLAIL(SEQ ID NO.2)
MBP-LagTag氨基酸序列如下:
KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPD
IIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDL
LPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDV
GVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN
YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAV
ALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKD
AQTGGGGSGGGGSPSMTLRVIKQDN(SEQ ID NO.3,核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)
His-LagCatcher氨基酸序列如下:
GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMQYLAGAAFTLQPSAGEAETITSSATSEGQAFATKLVAD GTYTMSETKAPPGYQSNPAKIAIQVATTGKEATVTIDGEALKPGESKNGYTLAIDGSTITLQA INQPLAIL(SEQ ID NO.4,核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)
(3)蛋白表达与纯化:
将步骤(1)构建的重组质粒分别转化DH5α感受态细胞,涂布于LB平板上,37℃过夜培养,通过PCR鉴定出阳性克隆,测序核对正确,并提取质粒。将质粒分别转化BL21感受态细胞,涂布于LB平板上,37℃过夜培养,挑取菌落接种于20mL LB培养基中,37℃过夜培养,取10mL菌液至含有0.1mg/mL氨苄西林的1L LB培养基中培养至OD600约0.4-0.6,加入终浓度为0.5mM IPTG于16℃,220rpm下诱导培养约16-18h。将培养物在3600rpm离心16min,弃去上清,向菌体沉淀中加入适量Hepes[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonate]Buffer重悬细菌,在4℃恒温600个大气压下破菌,并于4℃,16000rpm离心40min,收集上清。将含有MBP-LagTag的上清与MBPresin结合,将含有His-LagCatcher的上清与Ni-NTAresin结合1.5h。结合完成后,MBP-LagTag先洗杂后用含20mM麦芽糖的Hepes Buffer洗脱并收集,His-LagCatcher先洗杂后用含100mM咪唑的Hepes Buffer洗脱并收集,并用10K截留(10Kcutoff)的浓缩管将洗脱液浓缩至2mL。将浓缩后的蛋白溶液进一步以分子排阻层析纯化,使用AKTA-purifier(GE)和Superdex 75Increase 10/300GL柱子(GE)纯化His-LagCatcher,使用Superdex 200Increase 10/300GL柱子(GE)纯化MBP-LagCatcher,同时监测280nm的紫外吸收值,收取目的蛋白,并通过SDS/PAGE鉴定蛋白纯度。SDS/PAGE结果显示成功制备高纯度的MBP-LagTag和His-LagCatcher,典型的目的蛋白的分子筛图谱和SDS/PAGE分析图见图4。
实施例2LagTag/LagCatcher体外结合实验
(1)评估LagTag和LagCatcher之间共价键的形成
为了评估LagTag和LagCatcher之间共价键的形成,所有反应都是在含有1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)(Biosharp)的Hepes缓冲液(pH 7.5)中,在16℃,LagTag与LagCatcher的终浓度为10μM。所有定量实验一式三份。通过使用SCILOGEX HB120-S LED Digital DryBath将样品混合5×SDS loading缓冲液中加热至105℃,10分钟来停止反应。使用MiniPROTAN Tetra MP4(Bio-Rad)和Powerpac Basic 164-5050(Bio-Rad)在180V,15%w/v聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS/PAGE。凝胶用考马斯蓝(0.1%w/v考马斯亮蓝R250、25%v/v异丙醇和10%v/v乙酸)染色,并通过ImageJ分析所有条带。结果表明,在Hepes缓冲液pH7.5条件下16℃混合孵育,MBP-LagTag与His-LagCatcher自发形成不可逆共价连接的复合物。
突变LagCatcher第849位天冬酰胺为丙氨酸合成突变体LagCatcherN849A(NA),突变LagCatcher第791位谷氨酸为谷氨酰胺合成突变体LagCatcher E791Q(EQ),将突变体NA和EQ分别与LagTag进行反应,结果显示,突变体NA和EQ并不与LagTag反应生成对应复合物,这表明反应符合预期,即只有在LagCatcher第791位谷氨酸催化下,其第849位天冬酰胺与LagTag第741位赖氨酸自发形成异肽键而不可逆共价连接。典型的LagTag/LagCatcher连接结果如图5。
(2)LagTag和LagCatcher之间共价键形成过程的条件优化
为分析异肽键形成的环境依赖性,以筛选最适反应条件,通过在一系列不同pH(pH5.5、pH6.5、pH7.5、pH8.5)、温度(4℃、16℃、37℃)、缓冲液组分(Hepes、Tris、PBS)条件下混合LagTag/LagCatcher蛋白质各10μM孵育一定时间,均加入1mM PMSF。
重组百分率(Reconstitution),重组百分率=连接产物条带强度/同一泳道内连接产物、Tag以及Catcher条带强度的总和。
下图结果表明(图6),在实验室常用缓冲剂16℃,pH 6.5条件下反应48h LagTag与LagCatcher反应产率最大,即为其最适反应条件。
通过在反应体系中额外添加洗涤剂Triton 100或Tween,检测细胞裂解或膜蛋白稳定等实验常用洗涤剂对LagTag/LagCatcher异肽键形成的影响,结果显示常用的洗涤剂不会显著影响反应的进行。
实施例3LagTag/LagCatcher反应效率表征
(1)LagTag与LagCatcher反应的时间进程曲线
收集LagTag和LagCatcher之间共价键的形成过程中多个时间点的百分率,使用平滑曲线将多个时间点,且每个时间点的三次实验对应重组百分率进行拟合,得到如图7所示结果,以分析反应速率随时间的变化趋势。结果表明,反应前期底物(LagTag/LagCatcher)充足,速率较快,产物生成与时间的关系近乎于直线,而由于反应为自发不可逆共价连接,随着反应进行,底物浓度下降,因此反应后半段速率下降,得到如下图7所示曲线。
通过拟合其反应速率常速图(图8),测算出LagTag与LagCatcher反应的速率常速约为8.19±1M-1S-1(SD,n=3)。
(2)ForteBio检测LagTag与LagCatcher分子间亲和力
在室温进行生物传感器实验,使用Octet Red96e系统(Pall ForteBio)将LagTag与突变体LagCatcher N849A(NA)在机器设定温度30℃进行实时动力学分析,测试中使用了链霉亲和素(streptavidin,SA)传感器和含0.05%吐温的Hepes Buffer(Hepes 10mM,150mM NaCl,0.05%Tween 20)。使用生物素化标签试剂盒(Genemore)在1:1摩尔比下将LagTag生物素化。突变体LagCatcher N849A(NA)的浓度选择为2μM,每组向下进行五倍梯度稀释,各实验组终浓度为2μM、400nM、80nM、16nM和0(空白对照)。
Octet仪器分析方案如下:基线(baseline)(含0.05%吐温的Hepes Buffer)120s,加载(loading)[使用10μg/ml生物素化LagTag与SA传感器结合,直到Octet Red96e系统输出纵坐标(Binding)为2.0nm],基线(baseline)(含0.05%吐温的Hepes Buffer,120s),基线2(baseline 2)(含0.05%吐温的Hepes Buffer),测试蛋白结合(association)(突变体LagCatcherN849A(NA))300s,解离(dissociation)(含0.05%吐温的Hepes Buffer)360s。
实验表明,LagTag和突变体LagCatcher N849A(NA)之间存在亲和力约为2.24μM的非共价相互作用,对于肽-蛋白质相互作用的亲和力来说是比较高的(图9)。
实施例4反应特异性表征
为了检测LagTag/LagCatcher是否完全正交于其他Tag/Catcher反应,将LagTag分别与SpyCatcher和SnoopCatcher混合,将LagCatcher分别与SpyTag和SnoopTag混合,且各自混合LagTag与LagCatcher,SpyTag与SpyCatcher,SnoopTag与SnoopCatcher,设置每个反应底物终浓度为10μM,于pH7.5,16℃,Hepes Buffer中孵育72h。结果显示,每一个蛋白伴侣(Catcher)都与其同源的肽标签(Tag)高产形成共价复合物,且与其他Catcher/Tag没有任何交叉反应迹象(图10)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一对肽连接体,其特征在于,由肽标签和结合配偶体组成,其中肽标签和结合配偶体可以通过在包含所述结合配偶体中的一个反应残基和包含在所述肽标签中的另一个反应残基之间自发形成异肽键而彼此结合,肽连接体选自(a)或(b):
(a)肽标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,结合配偶体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示;
(b)肽标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,结合配偶体为PDB ID编号6M3Y的SpaC的第747-855位残基。
2.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括连接有权利要求1所述肽连接体中的结合配偶体的第一目标物以及连接有权利要求1所述肽连接体中的肽标签的第二目标物。
3.根据权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述第一目标物或第二目标物包括核酸分子、蛋白质、肽、小分子有机化合物、荧光团、金属-配体复合物、多糖、纳米颗粒、纳米管、聚合物、细胞、病毒、病毒样颗粒或其组合。
4.编码权利要求1所述肽连接体的基因。
5.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有权利要求1所述肽连接体,或权利要求2或3所述组合物。
6.权利要求1所述肽连接体,或权利要求2或3所述组合物用于以下任一用途:
(1)通过异肽键连接一对目标物;(1)中,一对目标物包括连接有权利要求1所述肽连接体中的结合配偶体的第一目标物以及连接有权利要求1所述肽连接体中的肽标签的第二目标物;
或,
(2)通过多个不同异肽键连接一对以上目标物;(2)中,通过多对肽链接对自发形成多个异肽键连接一对以上目标物,其中,连接一对目标物的肽链接对与另一对目标物的肽链接对之间正交。
7.权利要求1所述肽连接体,或权利要求2或3所述组合物,或权利要求5所述宿主细胞在制备疫苗、融合蛋白标签、检测试剂盒、药物、多聚蛋白或标记物试剂中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310056795.7A CN115975055B (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310056795.7A CN115975055B (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115975055A CN115975055A (zh) | 2023-04-18 |
CN115975055B true CN115975055B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=85975967
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310056795.7A Active CN115975055B (zh) | 2023-01-16 | 2023-01-16 | 一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115975055B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116396398A (zh) * | 2023-01-16 | 2023-07-07 | 四川大学 | 一种实现铁蛋白纳米颗粒可控自组装的方法以及基于该方法搭建的纳米颗粒抗原展示平台 |
CN116165377A (zh) * | 2023-04-21 | 2023-05-26 | 常州伯仪生物科技有限公司 | 一种通过竞争elisa法进行标签蛋白定量的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101932593A (zh) * | 2008-01-29 | 2010-12-29 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 稳定蛋白和多肽的方法 |
CN102317311A (zh) * | 2009-02-02 | 2012-01-11 | 维利奥有限公司 | 鼠李糖乳杆菌菌毛多肽和产生它们的方法 |
CN110709412A (zh) * | 2017-04-24 | 2020-01-17 | 牛津大学创新有限公司 | 自发性异肽键形成速率提高的蛋白质和肽标签及其用途 |
CN113767111A (zh) * | 2019-03-14 | 2021-12-07 | 牛津大学科技创新有限公司 | 以增强的速率与肽标签配偶体自发形成异肽键的多肽和其用途 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201002362D0 (en) * | 2010-02-11 | 2010-03-31 | Isis Innovation | Peptide tag systems that spontaneously form an irreversible link to protein partners via isopeptide bonds |
WO2019213262A1 (en) * | 2018-05-01 | 2019-11-07 | The Regents Of The University Of California | Reagent to label proteins via lysine isopeptide bonds |
-
2023
- 2023-01-16 CN CN202310056795.7A patent/CN115975055B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101932593A (zh) * | 2008-01-29 | 2010-12-29 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 稳定蛋白和多肽的方法 |
CN102317311A (zh) * | 2009-02-02 | 2012-01-11 | 维利奥有限公司 | 鼠李糖乳杆菌菌毛多肽和产生它们的方法 |
CN110709412A (zh) * | 2017-04-24 | 2020-01-17 | 牛津大学创新有限公司 | 自发性异肽键形成速率提高的蛋白质和肽标签及其用途 |
CN113767111A (zh) * | 2019-03-14 | 2021-12-07 | 牛津大学科技创新有限公司 | 以增强的速率与肽标签配偶体自发形成异肽键的多肽和其用途 |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
Advantages and prospects of Tag/Catcher mediated antigen display on capsid-like particle-based vaccine;Kara-Lee et al;Viruses;全文 * |
Approachs for peptide and protein cyclisation;Heather C.Hayes et al;Org. Biomol. Chem;第19卷;全文 * |
SpyCatcher-SpyTag共价偶联系统中的结构特征及应用现状;孙晓萌;中国医药生物技术;第17卷(第1期);全文 * |
Spyligase peptide-peptide ligation polymerizes affibodies to enhance magnetic cancer cell capture;Jacob O.Fierer et al;PNAS;第111卷(第13期);全文 * |
利用SpyTag/SpyCatcher构建胞内自组装多酶复合体实现高效生物合成;刘璐;殷亮;黄飞;张勇;刘倩;冯雁;;中国生物工程杂志(第07期);全文 * |
利用Tag-Catcher构建自组装双酶复合物高效制备D-氨基酸;谢露露等;中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑(第12期);A006-257 * |
基于异肽键连接的分子粘合剂研究进展;高德英;曹佳雯;孙小宝;周可鑫;张铁涛;王谦;;生物工程学报(第04期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115975055A (zh) | 2023-04-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN115975055B (zh) | 一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系 | |
CA2583009C (en) | Ubiquitin or gamma-crystalline conjugates for use in therapy, diagnosis and chromatography | |
CN110582566B (zh) | 肽连接酶及其用途 | |
Guimaraes et al. | Site-specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediated reactions | |
JP2005328851A (ja) | 三量体化ポリペプチド、その製造及び使用 | |
KR20180050640A (ko) | 융합 단백질 합성용 방법 및 생성물 | |
KR102151289B1 (ko) | Abd 결합 폴리펩티드 | |
WO2006058226A9 (en) | Modified dimeric streptavidins and uses thereof | |
CN100357314C (zh) | 一种分子物质连接的方法 | |
AU2004317555B2 (en) | Library of toxin mutants, and methods of using same | |
US9481715B2 (en) | Peptides capable of forming a convalent complex, and uses thereof | |
CN114891817A (zh) | 一种多聚肽及其制备方法与应用 | |
CA2376062A1 (en) | Fusion proteins comprising a fragment of a chaperon polypeptide | |
JP4749548B2 (ja) | インテイン媒介ペプチド連結 | |
EP3845553A1 (en) | Carrier matrix comprising dodecin protein | |
EP1981978B1 (en) | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins | |
CN111073925A (zh) | 一种基于无序蛋白偶联酶的高效多肽-多肽偶联系统和方法 | |
CN116621947B (zh) | 一种基于索烃骨架的拓扑蛋白质、制备方法及应用 | |
CN106977590A (zh) | 突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白及其应用 | |
WO2008147859A2 (en) | Self-assembled proteins and related methods and protein structures | |
CN113564191A (zh) | 一种生物素结合蛋白以及亲和柱制备方法 | |
Khairil | Extending the scope of covalent peptide-protein conjugation: from purification to expanded nanoassembly | |
CN118271390A (zh) | 一种谍捕手突变体的制备方法及应用 | |
CN114685679A (zh) | 谍捕手突变体及其制备方法与其在荧光蛋白质体系中的应用 | |
Cappellini | An evaluation of an innovative technological platform for straightforward purification of recombinant proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |