CN118271390A - 一种谍捕手突变体的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谍捕手突变体的制备方法及应用，属于生物偶联技术领域。本发明所述谍捕手突变体的制备是通过将柔性氨基酸序列连接谍捕手SpyCatcher原有的N端和C端得到谍捕手突变体SpyCatcher‑N，并将TEV蛋白酶可识别序列插入上述谍捕手突变体SpyCatcher‑N中的柔性氨基酸序列中得到谍捕手突变体SpyCatcher‑NTEV。本发明制备得到的谍捕手突变体具有一方面保持谍捕手的高反应性，另一方面连接反应后Catcher蛋白质可被蛋白酶酶切减小分子量；通过蛋白酶切的方式移除额外的分子量。
Description
技术领域
本发明属于突变体制备技术领域，尤其涉及一种谍捕手突变体的制备方法及应用。
背景技术
生物偶联技术在蛋白质-高分子复合物的构建中不可或缺。经典的构建复杂的蛋白质-高分子拓扑结构方式包括“点击”化学、天然化学连接、无痕化学连接和内含肽、分拣酶A、蝶豆粘酶1等酶介导的连接方式。化学连接方式中常常要求高反应性、非天然的反应性基团，这些反应性基团可能导致蛋白质产率或使蛋白质失活。酶介导的连接方式则只需要底物有相对短的识别序列即可介导产生天然肽键。然而，酶介导的连接方式要求识别序列在底物的特定位置，难以介导连接得到支化产物，限制了其在构建蛋白质拓扑结构和基于蛋白质材料的应用。
可基因编码的多肽-蛋白质反应对如SpyTag/SpyCatcher提供了有力的生物偶联方式。SpyTag/SpyCatcher来源于可自发形成异肽键的菌毛蛋白结构域，它们完全基于天然氨基酸。SpyTag/SpyCatcher高不可逆的反应性和稳定的连接使之广泛应用在Spy网络的蛋白质水凝胶、蛋白质拓扑结构、合成药物载体和合成生物学领域。SpyTag/SpyCatcher反应对不断发展，有超电荷、无序的SpyCatcher(-)，SpyTag-SpyCatcher反应对正交的SnoopTag-SnoopCatcher反应对和反应速率更快的SpyTag002-SpyCatcher002反应对。拆分类似CnaB2结构域的蛋白质可以得到类似的Tag-Catcher反应对，如SdyTag-SdyCatcher反应对。但是对于大部分Catcher蛋白质，反应基团常常接近蛋白质的N端，位于C端或蛋白质链段中较少见。此外，Catcher蛋白质在连接反应后常常遗留大约10kDa的分子量在复合物上，可能会影响最终产物的性质或在治疗中引起免疫原反应。最近，Howarth课题组发展了谍连接酶SpyLigase介导的多肽-多肽偶联方式，把谍捕手进一步拆分为谍连接酶和K标签。该方法显著地减小了连接部分的分子量，但是反应性受到很大的影响。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种谍捕手突变体的制备方法及应用。本发明制备得到的谍捕手突变体具有一方面保持谍捕手的高反应性，另一方面连接反应后Catcher蛋白质可被蛋白酶酶切减小分子量。通过蛋白酶切的方式移除额外的分子量。
本发明的技术方案如下：
选择的模型蛋白质黄色荧光蛋白质和青色荧光蛋白质均来源于绿色荧光蛋白质。绿色荧光蛋白质的第203位苏氨酸(T203)突变为酪氨酸得到黄色荧光蛋白质，酪氨酸的侧基与生色团的Π-Π相互作用使荧光蛋白质的激发波长和发射波长发生红移，激发波长为517nm，发射波长为530nm。绿色荧光蛋白质第66位酪氨酸(Y66)突变为色氨酸得到青色荧光蛋白质，色氨酸的侧基使生色团最终形成吲哚环而非苯酚化合物，激发波长为435nm，发射波长为477nm。
除了对原有的蛋白质结构域进行重新拆分可以得到较小的连接部分，对蛋白质结构进行循环排列(circular permutation)并进行蛋白质工程编辑也可以得到相同的效果。如对谍捕手进行循环排列和蛋白质工程编辑，将用柔性片段连接谍捕手结构中原有的N端和C端，将谍捕手结构中第二个环状结构拆分得到新的蛋白质结构域N端和C端。从蛋白质的二级结构上看，谍捕手第二个环状结构前的序列被编辑到蛋白质的C端，即反应位点赖氨酸被移至C端。在新的二级结构中，在谍捕手C端和前两个β-条连接的甘氨酸和丝氨酸柔性区域插入烟草蚀刻病毒(TEV)酶识别序列ENLYFQG，即可在谍标签和谍捕手突变体反应后进行酶切，除去谍捕手的冗余部分从而达到减小谍捕手分子量的目的。
一种谍捕手突变体，所述谍捕手突变体为SpyCatcher-NTEV，其氨基酸序列如SEQID NO:1：
Gly-Lys-Thr-Ile-Ser-Thr-Trp-Ile-Ser-Asp-Gly-Gln-Val-Lys-Asp-Phe-Tyr-Leu-Tyr-Pro-Gly-Lys-Tyr-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Ala-Ala-Pro-Gly-Asp-Tyr-Glu-Val-Ala-Thr-Ala-Ile-Thr-Phe-Thr-Val-Asn-Glu-Gln-Gly-Gln-Val-Thr-Val-Asn-Gly-Lys-Ala-Thr-Lys-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Thr-His-Ile-Lys-Phe-Ser-Lys-Arg-Asp-Glu-Asp-Gly-Lys-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Thr-Met-Glu-Leu-Arg-Asp-Ser
所述谍捕手突变体通过将柔性氨基酸序列连接谍捕手SpyCatcher原有的N端和C端得到谍捕手突变体SpyCatcher-N，并将TEV蛋白酶可识别序列插入上述谍捕手突变体SpyCatcher-N中的柔性氨基酸序列中得到谍捕手突变体SpyCatcher-NTEV，其中，谍捕手突变体SpyCatcher-N和SpyCatcher-NTEV新的N端和C端产生于谍捕手的第二个环状部分即拆分谍捕手的第二个环区，即可产生突变体新的N端和C端。
所述TEV蛋白酶可识别序列为ENLYFQG。
所述柔性氨基酸序列为(GGS)3。
所述谍捕手突变体SpyCatcher-N氨基酸序列如SEQ ID NO:2
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一种谍捕手突变体的制备方法，所述制备方法为：通过将柔性氨基酸序列连接谍捕手SpyCatcher原有的N端和C端得到谍捕手突变体SpyCatcher-N，并将TEV蛋白酶可识别序列插入上述谍捕手突变体SpyCatcher-N中的柔性氨基酸序列中得到谍捕手突变体SpyCatcher-NTEV。
一种谍捕手突变体在荧光蛋白质体系中的应用。
所述的谍捕手突变体在荧光蛋白质模型体系中的应用，所述荧光蛋白质为青色荧光蛋白质或黄色荧光蛋白质。
本发明有益的技术效果在于：
本发明主要对谍捕手进行重新设计，减小谍捕手反应后的分子量，发展“微痕”多肽-多肽偶联方法。利用循环排列的方法对谍捕手进行蛋白质工程编辑，得到谍捕手突变体SpyCatcher-N、SpyCatcher-NTEV。之后将谍标签-谍捕手突变体SpyCatcher-NTEV体系应用在荧光蛋白质体系上，进行偶联反应和酶切反应并验证相应产物的正确性，同时有效地减小了谍捕手突变体SpyCatcher-NTEV的分子量，印证循环排列方法减小谍捕手冗余部分方法的可行性。
附图说明
图1为本发明实施例中谍捕手进行循环排列的拓扑图解。
图2为本发明实施例中谍捕手、谍捕手突变体SpyCatcher-N、SpyCatcherNTEV和模型蛋白质SpyCatcher-NTEV-CFP的基因序列。
图3为本发明实施例中谍标签-黄色荧光蛋白质和谍捕手突变体-NTEV-青色荧光蛋白质反应示意图。
图4为本发明实施例中谍捕手、谍捕手-N、谍捕手-NTEV氨基酸序列对比。
图5为本发明实施例中(a)SDS-PAGE分析偶联产物和酶切产物；(b)MALDI-TOF分析偶联产物和酶切产物的分子量。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明进行具体描述。
实施例1
基因设计如下：
选择的模型蛋白质黄色荧光蛋白质和青色荧光蛋白质均来源于绿色荧光蛋白质。绿色荧光蛋白质的第203位苏氨酸(T203)突变为酪氨酸得到黄色荧光蛋白质，酪氨酸的侧基与生色团的π-π相互作用使荧光蛋白质的激发波长和发射波长发生红移，激发波长为517nm，发射波长为530nm。绿色荧光蛋白质第66位酪氨酸(Y66)突变为色氨酸得到青色荧光蛋白质，色氨酸的侧基使生色团最终形成吲哚环而非苯酚化合物，激发波长为435nm，发射波长为477nm。
除了对原有的蛋白质结构域进行重新拆分可以得到较小的连接部分，对蛋白质结构进行循环排列(circularpermutation)并进行蛋白质工程编辑也可以得到相同的效果。如对谍捕手进行循环排列和蛋白质工程编辑，将用柔性片段连接谍捕手结构中原有的N端和C端，将谍捕手结构中第二个环状结构拆分得到新的蛋白质结构域N端和C端。从蛋白质的二级结构上看，谍捕手第二个环状结构前的序列被编辑到蛋白质的C端，即反应位点赖氨酸被移至C端。在新的二级结构中，在谍捕手C端和前两个β-条连接的甘氨酸和丝氨酸柔性区域插入烟草蚀刻病毒(TEV)酶识别序列ENLYFQG，即可在谍标签和谍捕手突变体反应后进行酶切，除去谍捕手的冗余部分达到减小谍捕手分子量的目的。如图1所示。
经过循环排列的蛋白质工程方法后，谍捕手突变体SpyCatcher-N、SpyCatcher-NTEV和谍捕手的氨基酸序列对比如图4所示。柔性氨基酸(GGS)3序列连接谍捕手原有的N端和C端得到谍捕手突变体SpyCatcher-N，TEV酶识别序列ENLYFQG插入谍捕手突变体SpyCatcher-N的柔性链(GGS)3序列中得到谍捕手突变体SpyCatcher-NTEV。谍捕手突变体SpyCatcher-N和SpyCatcher-NTEV新的N端和C端产生于谍捕手的第二个环状部分-拆分谍捕手的第二个环区即可产生两个突变体新的N端和C端。谍捕手的氨基酸序列中DAHID在晶体结构中未显示，可认为是无序的序列，故在循环排列过程中舍去。
实施例2
质粒构建如下：
为探究谍标签和谍捕手-NTEV在模型体系中的应用时，选择黄色荧光蛋白质和青色荧光蛋白质作为模型蛋白质，构建谍标签-黄色荧光蛋白质(SpyTag-YFP)和谍捕手-NTEV-青色荧光蛋白质(BDTag-CFP)。以构建谍标签-黄色荧光蛋白质序列为例，以含有黄色荧光蛋白质序列的质粒为模板，含有酶切位点序列的DNA单链片段为引物，用PCR扩增含有酶切位点的谍标签-黄色荧光蛋白质目的序列。再通过双酶切的方法将谍标签-黄色荧光蛋白质片段插入含有相同酶切位点的pET-28b载体中。谍捕手-NTEV-青色荧光蛋白质(BDTag-CFP)用相同的方法构建。
表1实验质粒
表2实验菌株
| 菌株名称 | 来源 | 用途 |
| 大肠杆菌DH-5α | 康为世纪(CWBIO) | 基因克隆 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 康为世纪(CWBIO) | 蛋白质表达 |
表3引物基因序列
实施例3
蛋白纯化与表达
含有谍标签-黄色荧光蛋白质(SpyTag-YFP)和谍捕手-NTEV-青色荧光蛋白质(BDTag-CFP)的pET-28b质粒经测序确认后，转入BL21(DE3)感受态细胞中并涂板，在培养箱中过夜37℃培养。在平板上挑出单克隆菌落至含有0.33mg/mL卡那霉素的LB培养基中，在震荡培养箱中37℃培养过夜。取过夜培养的培养基按1：100比例加入新鲜的含有0.33mg/mL的硫酸卡那霉素1L LB培养基中，在37℃震荡培养至OD600为0.4-0.6，振荡培养箱温度改为16℃过夜培养，同时加入IPTG至终浓度为1mM诱导大肠杆菌表达目标蛋白质。表达结束后离心收菌并舍去上清液，用非变性条件纯化、洗脱目的蛋白质。收集目的蛋白质经过蛋白质快速纯化液相色谱系统凝胶尺寸排阻色谱柱(Superdex 200increase 10/300GL,GEHealthcare)纯化，流动相为1×磷酸缓冲盐溶液(2mM磷酸二氢钾，10mM磷酸氢二钠，137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，pH＝7.4)。
实施例4
谍捕手突变体SpyCatcher-NTEV应用在荧光蛋白质模型体系
用超微量分光光度计(P330，Implen)测量谍标签-黄色荧光蛋白质(SpyTag-YFP)、谍捕手突变体-NTEV-青色荧光蛋白质的浓度。反应按谍标签-黄色荧光蛋白质：谍捕手突变体-NTEV-青色荧光蛋白质＝1:1.2(n：n)的摩尔比在4℃反应24小时。胞外反应和TEV酶切反应的反应示意图如图3所示。
反应产物进行TEV酶酶切反应时，按照偶联产物：TEV酶＝1:3(n：n，摩尔比)在37℃酶切24小时。到达反应时间后立即加入5×上样缓冲液猝灭反应。用SDS-PAGE电泳表征反应混合液及反应进行程度，多功能荧光分析仪定量蛋白质反应液中反应物和产物的比例。
图5(a)的SDS-PAGE结果表明偶联产物加入TEV酶后，偶联产物的条带基本消失，在偶联产物条带下方出现新的蛋白质条带，推测为酶切产物。因此，可以认为在37℃条件下，酶切反应24小时酶切可将底物酶切至基本完全。对偶联产物和酶切产物条带对应的样品进行质谱表征，图5(b)的MALDI-TOF实验结果和理论值误差在允许范围内，进一步证明偶联产物和酶切产物分子量，表明偶联反应和酶切反应得到预期产物。
本发明中SpyCatcher-N氨基酸序列为GKTISTWISDGQVKDF YLYPGKYTEVETAAPGDYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGGSGGSGGSE DSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDS；
本发明中SpyCatcher-NTEV氨基酸序列为GKTISTWISDGQVKDF YLYPGKYTEVETAAPGDYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGGSENLYFQG GGSEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDS。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种谍捕手突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：通过将柔性氨基酸序列连接谍捕手SpyCatcher原有的N端和C端得到谍捕手突变体SpyCatcher-N，并将TEV蛋白酶可识别序列插入上述谍捕手突变体SpyCatcher-N中的柔性氨基酸序列中得到谍捕手突变体SpyCatcher-NTEV。
2.一种权利要求1所述制备方法制备的谍捕手突变体，其特征在于，所述谍捕手突变体为SpyCatcher-NTEV，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1。
3.根据权利要求2所述的谍捕手突变体，其特征在于，所述谍捕手突变体通过将柔性氨基酸序列连接谍捕手SpyCatcher原有的N端和C端得到谍捕手突变体SpyCatcher-N，并将TEV蛋白酶可识别序列插入上述谍捕手突变体SpyCatcher-N中的柔性氨基酸序列中得到谍TEV TEV捕手突变体SpyCatcher-NTEV，其中，谍捕手突变体SpyCatcher-N和SpyCatcher-NTEV新的N端和C端产生于谍捕手的第二个环状部分即拆分谍捕手的第二个环区，即可产生突变体新的N端和C端。
4.根据权利要求3所述的谍捕手突变体，其特征在于，所述TEV蛋白酶可识别序列为ENLYFQG。
5.根据权利要求3所述的谍捕手突变体，其特征在于，所述柔性氨基酸序列为(GGS)3。
6.根据权利要求3所述的谍捕手突变体，其特征在于，所述谍捕手突变体SpyCatcher-N氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
7.一种如权利要求2-6任一项所述谍捕手突变体在荧光蛋白质体系中的应用,其特征在于，所述荧光蛋白质为青色荧光蛋白质或黄色荧光蛋白质。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2022117039130 | 2022-12-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118271390A true CN118271390A (zh) | 2024-07-02 |
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