CN113493779A - 冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，通过将天然主蛋白酶进行重组质粒、诱导蛋白表达、纯化，生成融合蛋白，对融合蛋白进行纯化、酶切、分离，获得在N端和C端都没有多余残基的天然主蛋白酶。采用该方法可以解决现有传统方法存在实验步骤繁琐，且产量低的问题。

Description

冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种冠状病毒蛋白酶的表达纯化方法。
背景技术
冠状病毒最早于1937年被从鸡身上分离出来(Cunningham and Stuart，1947)，1967年(Estola and Weckstrom，1967)在电子显微镜下看到病毒包膜上存在棘突，病毒颗粒的外形与欧洲帝王的皇冠结构相似，因此被称为冠状病毒。人类的冠状病毒最早是在60多年前从患有呼吸道感染的患者体内分离鉴定出来的，最初从中识别出两种不同的病毒229E(Hamre and Procknow，1966)和OC43(McIntosh et al.，1967)。由于早期很难找到一种适用于培养所有类型的冠状病毒的细胞培养方法，因此许多早期的流行病学研究都是血清流行病学研究。随着逆转录聚合酶链反应(PCR)技术的发展，确定了另外两种不同的病毒，HKU1(Fouchier et al.，2004)和NL63(Woo et al.，2005)。冠状病毒的主蛋白酶Mpro(也称为3CLpro)在病毒复制及侵染过程中必不可少的，病毒基因组进入宿主后翻译产生ppla和pplab，主蛋白酶在pplab上有11个酶切位点，对多肽链进行切割后形成有生物活性的非结构蛋白。Mpro的序列在冠状病毒中是高度保守的，具有40-60％的序列同一性和60-100％的序列相似性。此外，冠状病毒MPro识别的底物位点也具有特异性，最重要的是Mpro的切割位点在人体蛋白酶中没有同源物，因此主蛋白酶Mpro是一个理想的可以用于开发光谱抗病毒抑制剂的靶标。
有研究表明，主蛋白酶N端的肽段序列对于形成Mpro二聚体来说至关重要，去除N末端第1-5个残基会导致蛋白酶的活性下降至0.3％。主蛋白酶的三维晶体结构表明该蛋白酶的第一残基对于维持底物结合口袋和抑制剂结合是必要的。如果Mpro的N和C端存在多余的氨基酸残基会导致蛋白酶的活性显著降低。目前，制备天然的冠状病毒的实验流程主要是利用饶子和课题组提出的实验方案，利用主蛋白酶的酶切位点的特性，在其N端添加Mpro识别的氨基酸序列及促进蛋白表达的融合标签GST；在C端添加HRV 3CLpro的酶切位点及用于亲和纯化的His标签。但是采用该方法存在实验步骤繁琐，且产量低的问题。
发明内容
本发明的目的提供一种全新的天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，以解决现有方法产量低且步骤繁琐的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，通过将天然主蛋白酶进行重组质粒、诱导蛋白表达、纯化，生成融合蛋白，对融合蛋白进行纯化、酶切、分离，获得在N端和C端都没有多余残基的天然主蛋白酶。
其中，表达的主蛋白酶为SARS-CoV-2天然主蛋白酶或SARS-CoV天然主蛋白酶。
其中，重组质粒采用pET28b-SUMO质粒骨架载体。
其中，诱导表达蛋白过程在E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中进行。
其中，酶切所采用的酶为Ulp1酶。
其中，Ulp1酶与主蛋白酶的摩尔比为1∶100。
其中，融合蛋白纯化采用镍柱进行纯化。
其中，分离采用凝胶过滤层析将天然的主蛋白酶分离出来。
其中，所述表达纯化方法进一步具体包括：
第一步，获得在大肠杆菌中表达的SARS-CoV-2天然主蛋白酶的全基因；
第二步，对第一步获得的天然主蛋白酶插入到pET28b-SUMO质粒骨架载体中构建重组质粒，随后在E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中诱导蛋白表达，再进行蛋白纯化，生成带有小分子泛素样修饰蛋白His6-SUMO(Small ubiquitin-like modifier)标签的融合蛋白；
第三步，采用GE公司生产的His-Trap镍柱亲和纯化第二步获得的融合蛋白；
第四步，用Ulp1酶切第三步纯化的主蛋白酶，可以有效的切除融合标签His6-SUMO；
第五步，利用凝胶过滤层析(Gel filtration)将天然的主蛋白酶分离出来，获得在N端和C端都没有多余残基的SARS-CoV-2天然主蛋白酶。
其中，所述第一步中合成编码SARS-CoV-2天然主蛋白酶的全基因，采用密码子优化技术实现在大肠杆菌中的优化表达。
本发明的有益效果
本发明提供一种全新的天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，可以解决现有方法产量低且步骤繁琐的问题。
附图说明
图1重组质粒His-SUMO(COV)在表达载体E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(Rosetta)中的表达效果比较；
图2 His-SUMO(COV)重组质粒在E.coli BL21(DE3)表达载体中，不同的诱导表达温度时的表达情况；
图3采用本发明方法以重组质粒His-SUMO(COV)构建的新型冠状病毒的主蛋白酶；
图4以重组质粒SUMO-AVLQ-COV-HRV-His构建的新型冠状病毒的主蛋白酶；
图5以重组质粒GST-AVLQ-COV-HRV-His构建的新型冠状病毒的主蛋白酶。
具体实施方式
鉴于以往实验方法生产SARS-CoV和SARS-CoV-2的产率较低，纯化流程繁琐，因此本研究开发了一种新的策略用于提高主蛋白酶的产率。首先是构建带有His-SUMO标签的重组质粒。然后将该质粒转化进入不同的表达载体中，测试不同温度诱导不同时间以及不同浓度诱导剂的条件下，重组蛋白的表达情况。通过大量实验可以得知，将重组质粒转染至E.coli BL21(DE3)表达载体中，诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度为0.2mM，在16℃诱导20小时，此时主蛋白酶的表达量最高。采用上述方法纯化蛋白，经Image J软件分析蛋白胶的灰度值，得知主蛋白酶表达量占总蛋白含量的68.11％，满足要求。
为了获得在N端和C端都没有多余残基的SARS-COV2天然主蛋白酶，利用纯化获得的Ulp1或市售的Ulp1对重组蛋白进行酶切，将Ulp1与重组蛋白按不同摩尔比混合均匀，30℃孵育1-2小时。通过SDS-PAGE观察酶切效果。实验结果表明以1∶100的摩尔比，30℃酶切1小时即可高效的切除His-SUMO标签，酶切产物经Gel filtration分离纯化，获得天然的主蛋白酶。
本发明具体提供如下一种天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，表达的主蛋白酶为SARS-CoV-2天然主蛋白酶或SARS-CoV天然主蛋白酶，其包括：
第一步，获得在大肠杆菌中表达的SARS-CoV-2天然主蛋白酶的全基因；
第二步，对第一步获得的天然主蛋白酶插入到pET28b-SUMO质粒骨架载体中构建重组质粒，随后在E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中诱导蛋白表达，再进行蛋白纯化，生成带有小分子泛素样修饰蛋白His6-SUMO(Small ubiquitin-like modifier)标签的融合蛋白；
第三步，采用GE公司生产的His-Trap镍柱亲和纯化第二步获得的融合蛋白；
第四步，用Ulp1酶切第三步纯化的主蛋白酶，Ulp1与主蛋白酶的摩尔比为1∶100时，可以有效的切除融合标签His6-SUMO，主蛋白酶相对于Ulp1的摩尔比至少为100，主蛋白酶用量多效果更好；
第五步，利用凝胶过滤层析(Gel filtration)将天然的主蛋白酶分离出来，获得在N端和C端都没有多余残基的SARS-CoV-2天然主蛋白酶。
所述第一步中合成编码SARS-CoV-2天然主蛋白酶的全基因，采用密码子优化技术实现在大肠杆菌中的优化表达。
所述第二步中的重组质粒过程具体为：
第2.1步，对pET28b-SUMO载体进行线性化处理；
第2.2步，将经过密码子优化的SARS-CoV-2的主蛋白酶的全基因插入Pet-28b-SUMO载体骨架，在插入片段正/反向PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’端和3’端分别带有和线性化载体两末端相同的序列；
第2.3步，通过同源重组将质粒骨架与插入片段连接在一起；
第2.4步，验证。
所述线性化处理可以为设计正反向引物，进行PCR扩增。
所述第二步的重组质粒过程进一步具体包括：
第a步，以pET 28b-SUMO质粒为模板，设计上下游引物，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理后的产物，作为新质粒的骨架；
第b步，以2019-nCoV-pET 30a(+)质粒为模板，设计上下游引物(上下游引物5’端分别带有骨架两端的同源序列)，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理后的产物，作为新质粒的插入片段；
第c步，将所得的PCR产物和第b步获得的线性化载体按一定比例混合，在ExnaseII重组酶的催化作用下，37℃反应30min即可进行转化，进行重组质粒，PCR产物和线性化载体混合比例优选为摩尔比3∶1；
第d步，挑取阳性克隆摇菌过夜(含0.1％Kana的LB培养基)，提取质粒，用EcoR-I单酶切验证；
第e步，在插入片段两端设计验证引物，经PCR扩增，DNA片段胶回收后，将纯化后的DNA片段送至生工测序。
所述第二步中蛋白表达过程如下：
第a’步，将His-SUMO(COV)重组质粒转化到大肠杆菌表达载体E.coli BL21(DE3)中；
第b’步，将His-SUMO(COV)in E.coli BL21(DE3)菌株接种在含有卡那霉素(Kana，100μg/mL)的100mL LB肉汤培养基中于37℃培养过夜；
第c’步，将过夜培养的菌株按1∶30的比例转接至1L的新鲜LB肉汤培养基中。当细胞生长至OD600为0.6-0.8时，向培养基中添加终浓度为0.2mM的异丙基-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，在16℃培养条件下培养20小时，诱导重组蛋白His-SUMO-COV表达；
第d’步，诱导20小时后，将菌液转移至50mL离心管中，在4500x g，4℃的条件下离心10分钟收集细胞菌体；
第e’步，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀两次，离心管中加入40mL裂解液(20mMTris，300mM NaCl，pH 8.0)重选菌体，将裂解液放入高压均质仪中破碎细胞。利用超高速冷冻离心机中4℃，30000×g离心30分钟，将上清液转移至新的离心管中，加入10％的甘油放置在-20℃储存。
所述第三步进一步具体为：
第3.1步，将蛋白质溶液加入5mL的HisTrap HP色谱柱上，该色谱柱用含有20mM咪唑的裂解液(1ysis buffer)平衡HisTrap FF色谱柱；
第3.2步，用含20mM咪唑的150mL裂解缓冲液洗涤以除去非特异性结合蛋白；
第3.3步，用100mL洗脱液(20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，10％甘油，pH 7.8)进行线性梯度洗脱，咪唑的线性梯度由20mM增至500mM积；
第3.4步，由色谱图确定目标蛋白出峰范围，合并含有目标蛋白质的流分；
第3.5步，溶液置换(buffer exchange)：使用Amicon Ultra 15超滤管(规格为10kD)在4500x g，4℃下浓缩蛋白质，向过滤器中加入适宜体积的储存液(storagebuffer)，将样品储存在-20℃冰箱。
所述第四步进一步具体为：
第4.1步，将第三步获得的上述蛋白质与SUMO蛋白酶(Ulp1)以1∶100的摩尔比混合，在30℃，1100rpm的反应条件下孵育一小时；
第4.2步，重复第三步中的步骤e对酶切后的样品进行浓缩及缓冲液(bufferexchange)冲洗，此步骤中用的缓冲液成分为(20mM Tris-HCl pH 8.0；1mM DTT；10％甘油)。
所述第五步进一步具体为：
将第四步中的蛋白样品上样到凝胶过滤层析柱上(Gel filtration，GEHealthcare)，用缓冲洗液wash buffer(330mM Na2HPO4、167mM NaH2PO4、150mM NaCl；pH7.3)进行洗脱，然后合并洗脱峰对应的样品，重复步骤e，样品最终储存在storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。
以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
合成编码SARS-CoV-2 Mpro的全基因，并对其进行了密码子优化以利于在大肠杆菌表达。
构建His-SUMO(COV)质粒：在pET 28b-SUMO质粒骨架上的SUMO基因后直接连接以丝氨基酸的SARS-CoV-2 Mpro基因连接。设计的目的是为了后续利用SUMO蛋白酶(Ulp1)识别SUMO-重组蛋白的三级结构，对其进行切割，产生天然的主蛋白酶。
具体的：a、以pET 28b-SUMO质粒为模板，设计上下游引物，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn-I处理后的产物，作为新质粒的骨架。
b、以2019-nCoV-pET 30a(+)质粒为模板，设计上下游引物(上下游引物5’端分别带有骨架两端的同源序列)，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理后的产物，作为新质粒的插入片段。
c、通过同源重组将质粒骨架与插入片段连接在一起。
d、挑取阳性克隆摇菌过夜(含0.1％kana的LB培养基)，提取质粒，用EcoR-I单酶切验证。
e、在插入片段两端设计验证引物，经PCR扩增，DNA片段胶回收后，将纯化后的DNA片段送至生工测序。
重组蛋白诱导、表达条件优化
将构建的重组质粒His-SUMO(COV)分别转化到E.coli BL21(DE3)及E.coli BL21(Rosetta)表达载体中，以检测目标蛋白的表达量。诱导表达的实验条件见表1。
表1
Figure BDA0003220768650000071
从图1可以看出，His-SUMO(COV)重组质粒在表达载体E.coli BL21(DE3)中，表达效果显著优于E.coli BL21(Rosetta)载体。因此我们选择用E.coli BL21(DE3)作为His-SUMO(COV)重组质粒的表达载体。测定His-SUMO(COV)重组质粒在E.coli BL21(DE3)表达载体中，不同的诱导表达温度、时间以及诱导剂浓度的作用下，其蛋白表达情况。实验结果显示在30℃条件下，诱导8小时，是His-SUMO(CoV)蛋白表达的适宜条件。
将His-SUMO(COV)重组质粒转化到大肠杆菌表达载体E.coli BL21(DE3)中；将His-SUMO(COV)in E.coli BL21(DE3)菌株接种在含有卡那霉素(Kana，100μg/mL)的100mLLB肉汤培养基中于37℃培养过夜；将过夜培养的菌株按1∶30的比例转接至1L的新鲜LB肉汤培养基中。当细胞生长至OD600为0.6-0.8时，向培养基中添加终浓度为0.2mM的异丙基-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，在30℃培养条件下培养8小时，诱导重组蛋白His-SUMO-COV表达；诱导8小时后，将菌液转移至50mL离心管中，在4500x g，4℃的条件下离心10分钟收集细胞菌体；用磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀两次。离心管中加入40mL裂解液(20mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)重选菌体，将裂解液放入高压均质仪中破碎细胞。利用超高速冷冻离心机中4℃，30000×g离心30分钟，将上清转移至新的离心管中，加入10％的甘油放置在-20℃储存。
将获得的蛋白质溶液加入5mL的His_Trap HP色谱柱(GE Healthcare)上，该色谱柱用含有20mM咪唑的lysis buffer平衡HisTrap FF色谱柱；用含20mM咪唑的150mL裂解缓冲液洗涤以除去非特异性结合蛋白；用100mL洗脱液(20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，10％glycerolpH 7.5)进行线性梯度洗脱，咪唑的线性梯度由20mM增至500mM；由色谱图确定目标蛋白出峰范围，合并含有目标蛋白质的流分；buffer exchange：使用Amicon Ultra15离心过滤器(10kD，Merck Millipore)在4500x g，4℃条件下浓缩蛋白质，向过滤器中加入适宜体积的storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。
将获得的上述蛋白质与SUMO蛋白酶(Ulp1)以1∶100的摩尔比混合，在30℃，1100rpm的反应条件下孵育一小时，重复进行浓缩及buffer exchange。此步骤中使用的buffer成分为(20mM Tris-HCl pH 8.0；1mM DTT；10％glycerol)。将蛋白样品上样到Superdex 16/600体积排阻柱上(Gel filtration，GE Healthcare)，用washing buffer(330mM Na2HP04、167mM NaH2P04、150mM NaCl；pH 7.3)进行洗脱，然后合并洗脱峰对应的样品，重复步骤e，样品最终储存在storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。
比较例1
合成编码SARS-CoV-2 Mpro的全基因，并对其进行了密码子优化以利于在大肠杆菌表达。
构建SUMO-AVLQ-COV-HRV-His质粒：通过引物设计在新型冠状病毒主蛋白酶基因的N端加上GCAGTTCTGCAG核酸序列(编码的氨基酸序列为AVLQ)，C端加上GGTCCG核酸序列(编码的氨基酸序列为GP)。利用同源重组的方法将该基因与pET 28b-SUMO质粒骨架连接，构建重组质粒SUMO-AVLQ-COV-HRV-His。该质粒的特点为蛋白质翻译形成重组蛋白后，主蛋白酶会识别N端的酶切位点AVLQ↓SG(↓代表酶切位点)，酶切后产生带有His标签的融合蛋白。C端带有人鼻病毒主蛋白酶(human Rhinovirus，HRV)识别的酶切位点VTFQ↓GP，使用HRV主蛋白酶对带有His标签的融合蛋白进行酶切，产生天然的新型冠状病毒的主蛋白酶。
具体的：a、以pET 28b-SUMO质粒为模板，设计上下游引物，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理后的产物，作为新质粒的骨架。
b、以2019-nCoV-pET 30a(+)质粒为模板，设计上下游引物(上下游引物5’端分别带有GCAGTTCTGCAG核酸序列和GGTCCG核酸序列)，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理，获得AVLQ-COV-GP基因序列。
c、以AVLQ-COV-GP基因为模板，设计上下游引物(上下游引物的5’端分别带有pET28b-SUMO质粒骨架两端的同源序列)，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理后的产物，作为新质粒的插入片段。
d、通过同源重组将质粒骨架与插入片段连接在一起。
e、挑取阳性克隆摇菌过夜(含0.1％Kana的LB培养基)，提取质粒，用EcoR I单酶切验证。
f、在插入片段两端设计验证引物，经PCR扩增，DNA片段胶回收后，将纯化后的DNA片段送至生工测序。
重组蛋白诱导、表达条件优化
将重组质粒SUMO-AVLQ-COV-HRV-His转化到大肠杆菌表达载体E.coli BL21(DE3)中；将SUMO-AVLQ-COV-HRV-His in E.coli BL21(DE3)菌株接种在含有卡那霉素(Kana，100g/mL)的100mL LB肉汤培养基中于37℃培养过夜；将过夜培养的菌株按1：30的比例转接至1L的新鲜LB肉汤培养基中。当细胞生长至OD600为0.6-0.8时，向培养基中添加终浓度为0.2mM的异丙基-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，在30℃培养条件下培养8小时，诱导重组蛋白His-SUMO-COV表达；诱导8小时后，将菌液转移至50mL离心管中，在4500x g，4℃的条件下离心10分钟收集细胞菌体；用磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀两次。离心管中加入40mL裂解液(20mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)重选菌体，将裂解液放入高压均质仪中破碎细胞。利用超高速冷冻离心机中4℃，30000×g离心30分钟，将上清转移至新的离心管中，加入10％的甘油放置在-20℃储存。
将获得的蛋白质溶液加入5mL的His Trap HP色谱柱(GE Healthcare)上，用含有20mM咪唑的lysis buffer平衡His Trap FF色谱柱；用含20mM咪唑的裂解缓冲液洗涤以除去非特异性结合蛋白；用100mL洗脱液(20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，10％glycerolpH 7.5)进行线性梯度洗脱，咪唑的线性梯度由20mM增至500mM；由色谱图确定目标蛋白出峰范围，合并含有目标蛋白质的流分；buffer exchange：使用Amicon Ultra 15离心过滤器(10kD，Merck Millipore)在4500x g，4℃条件下浓缩蛋白质，向过滤器中加入适宜体积的storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。
用HRV 3CL蛋白酶切除重组蛋白GST-AVLQ-COV-HRV-His C末端的多余氨基酸，用His Trap HP色谱柱亲和纯化被切割下来的GPAAAHis6以及未被切割的SARS COV Mpro-GPAAA His6，收集流穿液，进行溶液置换，将样品存置于无盐的缓冲液中，用于后续的凝胶过滤层析。
将蛋白样品上样到Superdex 16/600体积排阻柱上(Gel filtration，GEHealthcare)，用washing buffer(330mM Na2HPO4、167mM NaH2PO4、150mM NaCl；pH 7.3)进行洗脱，然后合并洗脱峰对应的样品，重复步骤e，样品最终储存在storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。此步骤中使用的buffer成分为(20mM Tris-HCl pH 8.0；1mM DTT；10％glycerol)。将蛋白样品上样到Superdex 16/600体积排阻柱上(Gel filtration，GEHealthcare)，用washing buffer(330mM Na2HPO4、167mM NaH2PO4、150mM NaCl；pH 7.3)进行洗脱，然后合并洗脱峰对应的样品，重复步骤e，样品最终储存在storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。
比较例2
合成编码SARS-CoV-2 Mpro的全基因，并对其进行了密码子优化以利于在大肠杆菌表达。
构建GST-AVLQ-COV-HRV-His质粒：通过引物设计在新型冠状病毒主蛋白酶基因的N端加上GCAGTTCTGCAG核酸序列(编码的氨基酸序列为AVLQ)，C端加上GGTCCG核酸序列(编码的氨基酸序列为GP)。利用同源重组的方法将该基因与pGex6p-1质粒骨架连接，构建重组质粒GST-AVLQ-COV-HRV-His。该质粒的特点为蛋白质翻译形成重组蛋白后，主蛋白酶会识别N端的酶切位点AVLQ↓SG(↓代表酶切位点)，酶切后产生带有His标签的融合蛋白。C端带有人鼻病毒主蛋白酶(human Rhinovirus，HRV)识别的酶切位点VTFQ↓GP，使用HRV主蛋白酶对带有His标签的融合蛋白进行切割，产生天然的新型冠状病毒的主蛋白酶。
具体的：a、以pGex6p-1质粒为模板，设计上下游引物，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理后的产物，作为新质粒的骨架。
b、以2019-nCoV-pET 30a(+)质粒为模板，设计上下游引物(上下游引物5’端分别带有GCAGTTCTGCAG核酸序列和GGTCCG核酸序列)，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理，获得AVLQ-COV-GP基因序列。
c、以AVLQ-COV-GP基因为模板，设计上下游引物(上下游引物的5’端分别带有pGex6p-1质粒骨架两端的同源序列)，进行PCR扩增，所得的PCR产物经纯化处理和Dpn I处理后的产物，作为新质粒的插入片段。
d、通过同源重组将质粒骨架与插入片段连接在一起。
e、挑取阳性克隆摇菌过夜(含0.1％Kana的LB培养基)，提取质粒，用EcoR I单酶切验证。
f、在插入片段两端设计验证引物，经PCR扩增，DNA片段胶回收后，将纯化后的DNA片段送至生工测序。
重组蛋白诱导、表达条件优化
将GST-AVLQ-COV-HRV-His重组质粒转化到大肠杆菌表达载体E.coli BL21(DE3)中；将GST-AVLQ-COV-HRV-His in E.coli BL21(DE3)菌株接种在含有卡那霉素(Kana，100g/mL)的100mL LB肉汤培养基中于37℃培养过夜；将过夜培养的菌株按1：30的比例转接至1L的新鲜LB肉汤培养基中。当细胞生长至OD600为0.6-0.8时，向培养基中添加终浓度为0.2mM的异丙基-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，在30℃培养条件下培养20小时，诱导重组蛋白His-SUMO-COV表达；诱导8小时后，将菌液转移至50mL离心管中，在4500x g，4℃的条件下离心10分钟收集细胞菌体；用磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀两次。离心管中加入40mL裂解液(20mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)重选菌体，将裂解液放入高压均质仪中破碎细胞。利用超高速冷冻离心机中4℃，30000×g离心30分钟，将上清转移至新的离心管中，加入10％的甘油放置在-20℃储存。
将获得的蛋白质溶液加入5mL的HisTrap HP色谱柱(GE Healthcare)上，该色谱柱用含有20mM咪唑的lysis buffer平衡HisTrap FF色谱柱；用含20mm咪唑的裂解缓冲液洗涤以除去非特异性结合蛋白；用100mL洗脱液(20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，10％glycerolpH 7.8)进行线性梯度洗脱，咪唑的线性梯度由20mM增至500mM积；由色谱图确定目标蛋白出峰范围，合并含有目标蛋白质的流分；buffer exchange：使用Amicon Ultra 15离心过滤器(10kD，Merck Millipore)在4500x g，4℃下浓缩蛋白质，向过滤器中加入适宜体积的storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。
用GST Trap富集N端未被切割的主蛋白酶(即：GST-AVLQ-SARS COV Mpro-GPAAAHis；GST-AVLQ-SARS COV Mpro)。用HRV 3CL蛋白酶切除重组蛋白GST-AVLQ-COV-HRV-His C末端的多余氨基酸，用镍柱亲和纯化被切割下来的GPAAAHis6以及未被切割的SARS COVMpro-GPAAA His6，收集流穿液，进行溶液置换，将样品存置于无盐的缓冲液中，用于后续的凝胶过滤层析。将蛋白样品上样到Superdex 16/600体积排阻柱上(Gel filtration，GEHealthcare)，用washing buffer(330mM Na2HPO4、167mM NaH2PO4、150mm NaCl；pH 7.3)进行洗脱，然后合并洗脱峰对应的样品，重复步骤e，样品最终储存在storage buffer，将样品储存在-20℃冰箱。
从图3至图5可以看出，实验例中可溶性表达的目标蛋白的表达量显著优于比较例1和比较例2。比较例1及比较例2的自剪切系统，切割效率低，并且去除助溶标签后，蛋白容易析出，以不可溶的形式存在。此外比较例1和比较例2的实验方案更加繁琐，所获得有活性的主蛋白酶的产量低。实施例避免了上述方案存在的问题，使用Ulp1高效去除主蛋白酶N末端携带的标签His-SUMO，确保了切割效率。并且去除助溶标签后，我们仍然能够获得获得大量的可溶的，有活性的天然蛋白。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：通过将天然主蛋白酶进行重组质粒、诱导蛋白表达、纯化，生成融合蛋白，对融合蛋白进行纯化、酶切、分离，获得在N端和C端都没有多余残基的天然主蛋白酶。
2.如权利要求1所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：表达的主蛋白酶为SARS-CoV-2天然主蛋白酶或SARS-CoV天然主蛋白酶。
3.如权利要求1或2所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：重组质粒采用pET28b-SUMO质粒骨架载体。
4.如权利要求1或2所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：诱导表达蛋白过程在E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中进行。
5.如权利要求1或2所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：酶切所采用的酶为Ulp1酶。
6.如权利要求1或2所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：Ulp1酶与主蛋白酶的摩尔比为1∶100。
7.如权利要求1或2所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：融合蛋白纯化采用镍柱进行纯化。
8.如权利要求1或2所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：分离采用凝胶过滤层析将天然的主蛋白酶分离出来。
9.如权利要求1或2所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：所述表达纯化方法进一步具体包括：
第一步，获得在大肠杆菌中表达的SARS-CoV-2天然主蛋白酶的全基因；
第二步，对第一步获得的天然主蛋白酶插入到pET28b-SUMO质粒骨架载体中构建重组质粒，随后在E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中诱导蛋白表达，再进行蛋白纯化，生成带有小分子泛素样修饰蛋白His6-SUMO(Small ubiquitin-1ike modifier)标签的融合蛋白；
第三步，采用GE公司生产的His-Trap镍柱亲和纯化第二步获得的融合蛋白；
第四步，用Ulp1酶切第三步纯化的主蛋白酶，可以有效的切除融合标签His6-SUMO；
第五步，利用凝胶过滤层析(Gel filtration)将天然的主蛋白酶分离出来，获得在N端和C端都没有多余残基的SARS-CoV-2天然主蛋白酶。
10.如权利要求9所述天然冠状病毒主蛋白酶的表达纯化方法，其特征在于：所述第一步中合成编码SARS-CoV-2天然主蛋白酶的全基因，采用密码子优化技术实现在大肠杆菌中的优化表达。
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