CN111979214A - Sars主蛋白酶的表达和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，步骤有：构建并转化表达质粒；取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在摇床上培养过夜；加入IPTG，诱导培养；菌液离心，在重悬缓冲液中重悬；破碎离心，取上清镍柱纯化，不同咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，将含有SARS主蛋白酶的洗脱液，进行透析得到目的蛋白。本发明的优点有：利用大肠杆菌蛋白表达系统可在短时间内获得大量SARS主蛋白酶，通过特殊的纯化方法可获得纯度高、稳定性好的SARS主蛋白酶。整个SARS主蛋白酶蛋白表达和纯化过程耗费成本低、操作简单、可重复性高，可投入大量生产过程。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白表达和纯化技术领域，尤其涉及病毒蛋白酶的表达和纯化方法。
背景技术
严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)由于其高传染性和高致死率，给世界范围人类的健康和全球的经济造成了极大的威胁和重大损失。SARS病毒基因组主要编码以下三种蛋白：结构蛋白、复制酶多蛋白(即非结构蛋白前体)及附属蛋白。其中，结构蛋白是病毒壳体的基本结构亚基，它主要参与成熟病毒的组装释放及宿主的识别与侵入；非结构蛋白主要参与病毒基因组的复制和转录，复制蛋白翻译后的切割、修饰以及核酸合成等重要生命过程；附属蛋白目前认为它有可能参与辅助病毒基因租的复制或者宿主的选择。
冠状病毒复制酶多蛋白产生后需要被剪切成十六个非结构蛋白才能进行进一步的转录和复制。而这个剪切过程需要主蛋白酶及类木瓜蛋白酶结构域参与才能完成。其中，主蛋白酶是第一个从多聚蛋白中自分裂出来的成熟酶，能够特异性识别非结构蛋白前体nsp4到nsp16的11个切点，作为SARS病毒复制及转录过程中的关键蛋白，它为设计广谱抗冠状病毒药物提供了重要靶点。那么，获得SARS主蛋白酶为抗病毒药物的设计提供了物质基础。市面上制备SARS主蛋白酶主要采用哺乳动物细胞蛋白表达系统表达但蛋白纯度不高，该过程也需要耗费大量昂贵的培养基且实验周期长，因此亟需一种简单快捷可制备高纯度SARS主蛋白酶的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，以解决现有技术中制备SARS主蛋白酶纯度不能达到要求，成本高，周期长的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，包括如下步骤：
(1)构建SARS主蛋白酶表达质粒；
(2)将SARS主蛋白酶表达质粒转化；
(3)诱导培养表达SARS主蛋白酶，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间；加入IPTG，30℃，200rpm，诱导培养5h；
(4)纯化SARS主蛋白酶，操作包括：诱导后把菌液离心，收集沉淀物即菌体，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，2mM DTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后离心，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、150mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液，将含有SARS主蛋白酶的洗脱液，进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：25mM HEPES pH7.0，300mM NaCl，质量分数5％glycerol，5mM DTT。
进一步地，所述步骤(3)的详细过程是：取100μl菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为0.67mM，30℃，200rpm，诱导培养5h。
进一步地，所述步骤(4)的详细过程是：诱导后以6000rpm的转速把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，2mM DTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀。选用镍柱1～2ml进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、150mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有SARS主蛋白酶含150mM咪唑的洗脱液，进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：25mM HEPES pH7.0，300mM NaCl，质量分数5％glycerol，5mM DTT。
进一步地，所述步骤(1)的详细过程是：将SARS主蛋白酶的基因克隆到pET28a载体中，以构建表达质粒，得到SARS主蛋白酶质粒冻干粉。
进一步地，所述步骤(2)的详细过程是：将5μg主蛋白酶质粒冻干粉在12000rpm离心5min,使粉末聚集在底部，加入30μl去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。将上清液取2μl转化到Escherichia coli BL21Rosetta(DE3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μl的LB液体培养基，37℃摇床，150rpm，培养1h，取30μl培养液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan+抗生素的液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
利用大肠杆菌蛋白表达系统可在短时间内获得大量SARS主蛋白酶，通过特殊的纯化方法可获得纯度高、稳定性好的SARS主蛋白酶。整个SARS主蛋白酶蛋白表达和纯化过程耗费成本低、操作简单、可重复性高，可投入大量生产过程。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是含有SARS主蛋白酶含300mM咪唑的洗脱液的SDS-PAGE试验结果图；
图2是透析后SDS-PAGE试验结果图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
1、SARS主蛋白酶表达质粒的构建
将SARS主蛋白酶的基因克隆到pET28a载体中，以构建表达质粒，此项工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，SARS主蛋白酶蛋白大小为34kDa，编码SARS主蛋白酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
GGATCC
TCACTGAGCGGCTTTCGTAAAATGGCCTTTCCGTCAGGCAAAGTGGAAGGTTGTATGGTTCAGGTGACCTGTGGTACCACCACCTTAAATGGCCTGTGGTTAGATGATACCGTGTATTGTCCGCGTCATGTGATTTGTACCGCAGAAGATATGCTGAATCCGAATTATGAGGACCTGCTGATTCGCAAAAGTAATCATAGCTTTTTAGTTCAGGCCGGCAATGTTCAGTTACGTGTTATTGGTCATTCGATGCAGAATTGTCTGCTGCGCTTAAAAGTGGATACCTCTAATCCGAAAACCCCGAAATATAAATTTGTTCGTATTCAGCCGGGCCAGACCTTTTCAGTGTTAGCCTGTTATAATGGCTCTCCGAGCGGCGTGTATCAGTGTGCCATGCGCCCGAATCATACCATTAAAGGTAGTTTTCTGAATGGCTCTTGTGGTAGCGTGGGCTTTAATATTGATTATGATTGTGTGAGCTTTTGTTATATGCATCACATGGAACTGCCGACCGGCGTCCACGCCGGTACCGATCTGGAAGGCAAATTTTATGGCCCGTTTGTTGATCGCCAGACCGCACAGGCAGCAGGCACCGATACCACCATTACCTTAAATGTTTTAGCCTGGCTGTATGCAGCCGTGATTAATGGCGATCGTTGGTTTCTGAATCGCTTTACCACCACCCTGAATGATTTTAATTTAGTTGCCATGAAATATAATTATGAACCGTTAACCCAGGATCATGTTGATATTCTGGGTCCACTCAGTGCACAGACCGGTATTGCAGTGCTGGATATGTGTGCAGCACTGAAAGAACTGTTACAGAATGGCATGAATGGTCGCACCATTCTGGGCTCAACCATTCTGGAAGATGAATTTACCCCGTTTGATGTGGTGCGCCAGTGTAGCGGCGTGACCGAAGGTTAACTCGAG(下划线部分为酶切位点)
先构建好重组质粒，再将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中，涂板于含有50μg/ml抗生素Kan+的LB平板上培养，挑选菌落，质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆。验证成功后，构建表达质粒，最后得到SARS主蛋白酶质粒冻干粉。
2、SARS主蛋白酶质粒的转化
将5μg主蛋白酶质粒冻干粉在12000rpm离心5min,使粉末聚集在底部，加入30μl去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。将上清液取2μl转化到Escherichia coli BL21Rosetta(DE3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μl的LB液体培养基，37℃摇床，150rpm，培养1h，取30μl培养液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan+抗生素的液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
3、SARS主蛋白酶的诱导表达
取100μl菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为0.67mM，30℃，200rpm，诱导培养5h。
4、SARS主蛋白酶的纯化
诱导后以6000rpm的转速把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，2mMDTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中。高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀。选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化实验，经过数次实验，对蛋白纯化条件进行优化。镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡。再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、150mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液。将含有SARS主蛋白酶含150mM咪唑的洗脱液，进行SDS-PAGE试验，结果如图1所示。在此说明一下，洗脱液就是以平衡柱子所用的平衡缓冲液加入相应浓度的咪唑而得到的。150mM咪唑的洗脱液含有目的蛋白SARS主蛋白酶，将纯化的SARS主蛋白酶进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：25mM HEPES pH7.0，300mM NaCl，质量分数5％glycerol，5mM DTT。透析结束后得到纯度为98％的SARS主蛋白酶。随后进行SDS-PAGE试验，结果如图2所示。
使用Pet-28a载体，利用大肠杆菌表达系统得到高产量、纯度高达95％以上的SARS主蛋白酶，该制备方法耗费成本低、操作简单，可重复性高，可投入大量生产过程。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 深圳晶蛋生物医药科技有限公司
<120> SARS主蛋白酶的表达和纯化方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 939
<212> DNA
<213> 冠状病毒(SARS-CoV)
<400> 2
ggatcctcac tgagcggctt tcgtaaaatg gcctttccgt caggcaaagt ggaaggttgt 60
atggttcagg tgacctgtgg taccaccacc ttaaatggcc tgtggttaga tgataccgtg 120
tattgtccgc gtcatgtgat ttgtaccgca gaagatatgc tgaatccgaa ttatgaggac 180
ctgctgattc gcaaaagtaa tcatagcttt ttagttcagg ccggcaatgt tcagttacgt 240
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tgttataatg gctctccgag cggcgtgtat cagtgtgcca tgcgcccgaa tcataccatt 420
aaaggtagtt ttctgaatgg ctcttgtggt agcgtgggct ttaatattga ttatgattgt 480
gtgagctttt gttatatgca tcacatggaa ctgccgaccg gcgtccacgc cggtaccgat 540
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gataccacca ttaccttaaa tgttttagcc tggctgtatg cagccgtgat taatggcgat 660
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tataattatg aaccgttaac ccaggatcat gttgatattc tgggtccact cagtgcacag 780
accggtattg cagtgctgga tatgtgtgca gcactgaaag aactgttaca gaatggcatg 840
aatggtcgca ccattctggg ctcaaccatt ctggaagatg aatttacccc gtttgatgtg 900
gtgcgccagt gtagcggcgt gaccgaaggt taactcgag 939
Claims (5)
1.SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)构建SARS主蛋白酶表达质粒；
(2)将SARS主蛋白酶表达质粒转化；
(3)诱导培养表达SARS主蛋白酶，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间；加入IPTG，30℃，200rpm，诱导培养5h；
(4)纯化SARS主蛋白酶，操作包括：诱导后把菌液离心，收集沉淀物即菌体，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，2mM DTT，10mMimidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后离心，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、150mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液，将含有SARS主蛋白酶的洗脱液，进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：25mMHEPES pH7.0，300mM NaCl，质量分数5％glycerol，5mM DTT。
2.根据权利要求1所述的SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(3)的详细过程是：取100μl菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间，加入IPTG，使终浓度为0.67mM，30℃，200rpm，诱导培养5h。
3.根据权利要求1所述的SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(4)的详细过程是：诱导后以6000rpm的转速把菌液离心15min，收集沉淀物即菌体，称重为3～5g，以重悬缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HClpH7.5，300mM NaCl，2mM DTT，10mM imidazole的重悬缓冲液中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱1～2ml进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、150mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将含有SARS主蛋白酶含150mM咪唑的洗脱液，进行透析，透析袋大小为10kDa，温度为4℃，时间为12h，透析buffer为：25mM HEPESpH7.0，300mM NaCl，质量分数5％glycerol，5mM DTT。
4.根据权利要求1所述的SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(1)的详细过程是：将SARS主蛋白酶的基因克隆到pET28a载体中，以构建表达质粒，得到SARS主蛋白酶质粒冻干粉。
5.根据权利要求1所述的SARS主蛋白酶的表达和纯化方法，其特征在于：
所述步骤(2)的详细过程是：将5μg主蛋白酶质粒冻干粉在12000rpm离心5min,使粉末聚集在底部，加入30μl去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min；将上清液取2μl转化到Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μl的LB液体培养基，37℃摇床，150rpm，培养1h，取30μl培养液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan+抗生素的液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
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2020
- 2020-08-31 CN CN202010901715.XA patent/CN111979214A/zh not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20201124 |