NO176996B - Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk sammensetning for beskyttelse av felin leukemivirus (FeLV) - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som kan beskytte en katt overfor felin leukemivirus (FeLV).

Katte-leukemiviruser (FeLV) er replikasjonskompetente type C retroviruser, som er epidemiologisk assosiert med den horisontale overføring av leukemi, aplastik anemi, og akutt immunosupresjon (katte-AIDS) i katter. Genomet til FeLV består av en 60-70S enkelt-trådet RNA som består av et gag-gen som koder for virale kjerneproteiner, et pol-gen som koder for revers transkriptase, og et env-gen som koder for gp70 og pl5E virale kappeproteiner.

Isolater av FeLV kan bli inndelt i subgruppene A, B og C som er basert på deres interferens-mønstre (Sarma et al., Virology 44:352-358 (1971)). FeLV-A finnes i alle isolater, mens FeLV-B finnes i omtrent 4056 av alle isolater. FeLV-C er ganske sjelden og som FeLV-B finnes den alltid i kombinasjon med FeLV-A (Jarrett et al., International Journal of Cancer 21:334-337 (1978)). FeLV-C finnes i bare omtrent 156 av alle virusinneholdende katter og bare i katter med anemi (Onions et al., Nature (London) 296:156-158 (1982)).

Mange forsøk på å fremstille en vaksine mot katte-leukemi har ikke vært vellykket. Disse forsøkene innbefatter virus drept ved bestråling, hydroksylamin, eller paraformaldehyd, og vaksiner som benytter mitomycin D inaktiverte virus (U.S. Patent nr. 3,966,907,' 4,034,081, og 4,086,134) eller basert på bruk av hele levende infekterte celler og inaktiverte infekterte celler.

Nylig har man vært interessert i bruk av rensede FeLV molekyler (Osterhaus et al., Journal of Immunology 135(1);591-596 (1985)) og på bruk av et FOCMA (Katte-on-cornavirus assosiert cellemembran-antigen) preparat (U.S. patentnummer 4,331,791 og 4,434,157). En vaksine som innbefatter et FOCMA-preparat er kommersielt tilgjengelig

(Norden Laboratories, Lincoln, Nebraska). En studie av virkningen av denne vaksinen førte til at man tviler sterkt på om den kan beskytte katter fra FeLV-sykdom (Pedersen et al., Feline Practice 15:7-20 (1985)). Det er derfor et behov for antigene preparater som kan stimulere immunsystemet til katter og indusere antistoffer til FeLV.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammesetning som kan beskytte en katt overfor felin leukemi virus (FeLV), kjennetegnet ved å blande sammen en immunologisk effektiv mengde FeLV subgruppe A gp70R-A eller en biologisk aktiv analog derav og en vesentlig ren saponin adjuvant valgt fra gruppen bestående av QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21.

Oppfinnelsen er også kjennetegnet ved å blande en fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som kan beskytte en katt overfor felin leukemi virus (FeLV), og å blande en immunologisk effektiv mengde FeLV subgruppe A gp70R eller en biologisk aktiv analog derav og en vesentlig ren saponin adjuvant valgt fra gruppen bedstående av QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21, og å blande en immunogen effektiv mengde FeLV subgruppe A gp90R eller en biologisk aktiv analog derav og en vesentlig ren saponin adjuvant valgt fra gruppen bestående av QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21. En fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som kan beskytte katt overfor felin leukemivirus (FeLV), kjennetegnet ved å blande en immunogeneffektiv mengde FeLV ved subgruppe A gp70R-A sammen med saponin adjuvant QA-21 og aluminiumhydroksid, er også beskrevet.

Kort beskrivelse av figurene.

Figur 1 skisserer konstruksjonen av pFU3 proben som brukes til å detektere tilstedeværelse av FeLV DNA-sekvenser. Restriksjonsendonuklease-seter på DNA eksisterer som vist. R:Eco RI; P:Pst I; K:Kpn; T:Tag I. Figur 2 viser restriksjonskartet til klon 32-50. Restrik-sj onsendonuklease-setene på DNA eksisterer som vist. R:Eco RI, Bg:Bgl II; S:Sac I; H:Hind III; K:Kpn I; B:Bam HI. Figur 3 viser restriksjonskartet for FeLV kappegenet som er subklonet inn i PUC-9. Figur 4 viser den virale DNA-sekvensen og den korresponderende aminosyresekvensen til gp70 og pl5E. Figur 5 viser subkloningen av gp70-pl5E fragmentet for å få ekspresjon av gp70 viralgenene for å fremstille gp70R. Figur 6 viser DNA-sekvensen som er i, og korresponderende aminosyresekvens til gp70R-A slik den blir fremstilt av ekspresjonsvektor pJLBOT. Figur 7 viser DNA-sekvensen som er i, og korresponderende aminosyresekvens til gp70R slik den blir fremstilt av ekspresjonsvektor pJLBOT. Figur 8 viser DNA-sekvensen i, og korresponderende aminosyresekvens til gp90R slik den blir fremstilt av ekspresjonsvektor pJLBOT. Figur 9 viser rensing av silika-fraksjonene til Ouillaja saponins ved bruk av revers fase HPLC. Figur 10 viser resultatene av immunisering med gp70R-A. Figur 11 viser resultatene av immunisering med alkylert gp70R-A.

Kort beskrivelse av de foretrukne fremstillinger.

Oppfinnerene har beskrevet en metode for fremstilling av polypeptiddelen av gp70 glykoprotein til FeLV ved bruk av rekombinante DNA-teknikker. Dette ble gjort ved kloning av det virale genet for gp70 inn i en plasmid-vektor som deretter ble brukt til å transformere E.coli. Når de virale gp70-genene kommer til uttrykk i E.coli, blir det produserte polypeptidet ikke glykosylert; derfor, er molekylvekten omtrent 45 Kd i steden for 70 Kd. Derfor, betegnes det virale proteinet fremstilt i prokaryoter fra de virale genene som koder for gp70 betegnet "gp70R" eller "rec-gp70". I tillegg, når et gen som koder for FeLV viral gp70 kappe-protein også koder for aminosyrene 1-40 til pl5e kappe-protein til FeLV, er molekylvekten til det polypeptidet som kommer til uttrykk i E.coli 55 Kd. Det virale proteinet fremstilt i prokaryoter fra de virale genene som koder for gp70 og de 40 aminoterminale aminosyreresidiene til pl5e-polypeptidet blir betegnet "gp70R-A" eller "rec-gp70-A". I tillegg, koder genet som koder for FeLV gp70 kappe og hele pl5e kappe-proteinet for et polypeptid som har en molekylvekt på 65-70 Kd og blir betegnet "rgp90", "gp90R", eller "rec-gp90". Disse rekombinante proteinene blir samlet betegnet "gp70 inneholdende rekombinant protein".

Betegnelsen "immunologisk relaterte viruser" betegner de virus som har en signifikant genomisk homologi med FeLV slik at produktene som kommer til uttrykk fra disse genene viser signifikante grader av immunologisk kryss-reaktivitet. Et eksempel på et slikt immunologisk relatert virus er katte sarcoma-virus (FeSV).

FeSV er et retrovirus sterkt relatert til FeLV. FeSV kan bli isolert fra svulster som kommer fra FeLV-infiserte katter. I praksis, er FeSV et defekt virus som bare kan bli propagert sammen med FeLV som et hjelpevirus. Man tror at FeLV-genomet først integreres inn i katte-DNA. Ved lytisk transformasjon, når retroviralt DNA blir fjernet fra katte-DNA, tar den med seg visse kattegener kjent som oncogener. Det resulterende retrivirus, FeSV, er veldig lik FeLV og er lik når det gjelder kappe-glykoproteiner som er tilstede på FeLV. FeSV isolert fra infiserte katter inneholder også FeLV.

Betegnelsen "vert" som det blir brukt i denne oppfinnelsen skal innbefatte ikke bare prokaryoter men også eukaryoter slik som gjær og trådformet sopp og likeledes plante og dyreceller.

Betegnelsen "prokaryot" er ment å innbefatte alle bakterier som kan bli tranformert med det virale genet for ekspresjon av gp70 kappe-proteiner til FeLV.

De virale genene for gp70-inneholdende protein kan bli avledet fra en hvilken som helst FeLV-subgruppe. Det eneste som er nødvendig er at den genetiske sekvensen for glykopro-teinet kommer til uttrykk i den prokaryote organismen. Det virale genet for gp70-inneholdende protein fra FeLV subgruppe A er å foretrekke. Spesielt å foretrekke er det virale genet for gp70 til FeLV subgruppe A fremstilt av cellelinje 3281. Denne cellelinjen er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og har aksesjonsnr. CRL 9116.

Et rekombinant DNA-molekyl som koder for det virale gp70-inneholdende proteinet kan bli brukt til å transformere en vert ved bruk av hvilke som helst av teknikkene som er kjente innenfor fagområdet. Bruk av et plasmid som inneholder det virale gp70 kodende sekvensen for prokaryot transformasjon er spesielt å foretrekke.

Det gp70-inneholdende rekombinante proteinet har mer eller mindre aminosyrer ved dets flankerende ender sammenlignet med aminosyresekvensen til nativt gp70. For eksempel, kan de flankerende aminosyresekvensene innbefatte hele eller deler av pl5E-peptidet slik som gp70R-A og gp90R polypeptidene har. Alternativt, kan det rekombinante proteinet i denne oppfinnelsen, for eksempel ha to mindre arginin-residier ved C-termini, som vist i figur 7.

Betegnelsen "vesentlig ren form" betyr når den blir brukt til å betegne polypeptid i denne oppfinnelsen at polypeptidet er vesentlig fri for andre virale proteiner som polypeptid i denne oppfinnelsen vanligvis er assosiert med i naturen.

Betegnelsen "vesentlig ren" når brukt til saponiner betyr vesentlig fri for forbindelser som vanligvis er assosiert med saponin i naturlig form og som utøver konstante og reprodu-serbare kromatografisk respons, elueringsprofiler, og biologisk aktivitet. Betegnelsen "vesentlig ren" er ikke ment å utelukke kunstige eller syntetiske blandinger av saponin med andre forbindelser.

Fremgangsmåter for fremstilling av sammensatte, opererbare sammensatte gener og uttrykking av dem i bakterier er kjent og er vist, for eksempel, i U.S. patentnummer 4,366,246. De genetiske konstruksjonene og fremgangsmåtene beskrevet deri kan bli benyttet for ekspresjon av gp70 fra FeLV i prokaryote verter.

Prokaryote verter kan innbefatte Gram negative, Gram positive bakterier, slik som E.coli, S. thmphimurium, Serratia marcescens, og Bacillus subtilis.

Generelt, blir ekspresjonsvektorer som inneholder promoter-sekvenser som letter effektiv transkripsjon av det innskutte virale genfragmentet brukt sammen med verten. Ekspresjons-vektoren inneholder vanligvis et replikasjonsorigo, promoter(e), terminator(er), likeledes spesifikke gener som medfører fenotypisk seleksjon i transformerte celler. De transformerte vertene kan bli fermentert og dyrket i henhold til fremgangsmåte som er kjent innenfor fagområdet for å oppnå optimal cellevekst.

Eksempler på promotere som kan bli anvendt i oppfinnelsen er: rec A, trp, lac, tac, og bakteriofag lambda pg eller pj^. Eksempler på plasmider som kan bli anvendt i oppfinnelsen er betegnet i Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982.

En hvilken som helst vert modifisert i henhold til metodene beskrevet, eller modifisert ved bruk av andre metoder, som er kjent innenfor fagområdet, så som, for eksempel, ved overføring av genetisk materiale ved bruk av en lysogen fag, som fører til en prokaryot som uttrykker FeLV genet for gp70-inneholdende protein kan anvendes.

Verter, helst prokaryoter, som er transformert med FeLV virale genomet for gp70-inneholdende protein er spesielt nyttige for fremstilling av gp70R, gp70R-delta og gp90R polypeptid som kan bli anvendt til immunisering av en katt. Som før nevnt, når det virale genomet for gp70-inneholdende protein blir uttrykt i bakterier, skjer det ingen glykosyler-ing. Dette medfører at det rekombinante gp70 har en molekylvekt på 45 Kd istedenfor 70 Kd som når genomet blir uttrykt i virus.

gp70R-delta inneholder hele aminosyresekvensen til FeLV viral gp70 kappe-protein og de 40 amino-terminale aminosyreresidiene til pl5e kappe-protein til FeLV subgruppe A fra cellelinje 3281. pl5e-avledete sekvensen ligger ved karboksyl termini til det rekombinante polypeptidet. Molekylvekten til gp70R-A polypeptidet som uttrykkes i E.coli er 55Kd. Det virale proteinet fremstilt i prokaryoter fra de virale genene som koder for gp70 og pl5e polypeptidet (gp70R-A) er mere hydrofobt enne gp70R på grunn av de hydrofobe egenskapene til den pl5e-avledete sekvensen. Både i den naturlig forekomm-ende (gp70) og rekombinante (gp70R, gp70R-A, og gp90R) former, er aminosyresekvensen for gp70-delen av molekylet essensielt like. En katt som er immunisert med gp70 rekombinant protein vil fremstille antistoffer som vil binde seg til

epitoper som er tilstede på gp70R, gp70R-A, gp90R og gp70 polypeptider. Derimot, kan man utføre kommersiell fremstilling av FeLV gp70-inneholdende rekombinante proteiner.

Betegnelsen "immunogen effektiv mengde", som den blir brukt i oppfinnelsen, skal betegne mengden FeLV-antigen som er nødvendig for å indusere fremstilling av antistoffer i en katt som vil bindes til FeLV-epitopene.

gp70-inneholdende rekombinante proteiner i denne oppfinnelsen er spesielt nyttig for å sensibilisere immunsystemet til en katt slik at, som et resultat derav, det fremstilles antistoffer som er reaktive til epitoper som er tilstede på FeLV. gp70R og gp70R-A proteiner avledet fra cellelinjer fremstilt av FeLV subgruppe A er å foretrekke. Spesielt å foretrekke er FeLV subgruppe A-inneholdende cellelinje 3281.

gp70-inneholdende rekombinante proteiner kan bli administrert parenteralt ved injeksjon, rask infusjon, absorbsjon gjennom nesesvelgrommet, absorbsjon gjennom hud, og oralt. Preparater for parenteral administrasjon innbefatter sterile eller vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner, og emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige løsningsmidler er propylen-glykol, polyetylenglykol, vegetabile oljer slik som olivenolje, og injiserbare organiske estere slik som etyl-oleat. Bærere for tettende dressinger kan bli brukt til å øke skinn-permeabiliteten og øke antigen-absorbsjonen. Væske-doseformer for oral administrering innbefatter generelt en liposom-løsning som inneholder væske-doseformen. Egnede former for suspendering av liposomene innbefatter emulsjoner, suspensjoner, løsninger, siruper, og eliksirer som inneholder inerte tilsetningsstoffer som vanligvis brukes innenfor fagområdet, slik som renset vann. Ved siden av inerte tilsetningsstoffer, kan slike preparater også inneholde adjuvans, fuktemidler, emulsifiserende og suspenderende midler, og søtnings-, smaks-, og parfymerende midler.

Det er også mulig å tilsette en adjuvans til de antigene preparatene som inneholder gp70-inneholdende rekombinante proteiner i denne oppfinnelsen. Adjuvans er forbindelser som kan bli brukt til å uspesifikt forsterke en spesifikk immunorespons. Normalt, blir adjuvans og antigenet blandet før presentasjonen for immunsystemet, eller presentert separat, men inn i det samme stedet i det dyret som blir immunisert. Adjuvans kan bli delt inn i forskjellige grupper basert på deres sammensetting. Disse gruppene innbefatter olje advjuvans (for eksempel, Freund's komplette og ikke-komplette), minerasalter (for eksempel, A1K(S04)2, AlNa(S04)2, A1NH4(S04), kisel, aluminium, A1(0H)3, Ca3(P04)2, kaolin og karbon), polynukleotider (for eksempel poly IC og poly AU syrer), og noen naturlige forbindelser (for eksempel, voks D fra Mycobacterium tuberculosis, likeledes forbindelser funnet i Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, og medlemmer av Brucella). Blant de forbindelser som er spesielt nyttige som adjuvanter er rå blanding av saponiner slik som, for eksempel, Quil A (Superfos A/S, Danmark) eller høyt rensede fraksjoner derav.

Betegnelsen "saponin" som det blir brukt heri innbefatter glykoside triterpenoide forbindelser som lager skum i vandige løsning, har hemolytisk aktivitet, og har immun adjuvans-aktivitet. Det innbefatter saponin per se, likeledes naturlige og farmasøytiske akseptable salter og farmasøytisk akseptable derivater. Betegnelsen "saponin" innbefatter også biologiske aktive fragmenter derav.

Saponiner er en blanding av triterpene glykosider ekstrahert fra barken av treet Quillaja saponaria. Saponiner er veldig mye brukt som adjuvanter i vaksiner mot munn- og klovsyke, og i å forsterke den beskyttende immuniteten som fremkommer ved bruk av eksperimentelle vaksiner mot protozol-parasitter slik som Trypanasoma cruzi plasmodium og den humerale responsen til saue rødt blod celler (SRBC). (Bomford, Int. Arch. Allerg. appl. Immun., 67:127 (1982)). Nylig, har saponin adjuvanter fra Quil-A, en rå blanding av saponiner, blitt renset ved bruk av høyttrykks-væske kromatografi (HPLC). De rensende fraksjonene ble fremstilt som beskrevet i U.S. patentsøknaden til Kensil et al., med tittelen "Saponin adjuvanter", som er inkorporert heri som referanse. Disse rensede fraksjonene (vesentlig rene saponiner) og blandinger derav, er spesielt nyttige i denne oppfinnelsen.

Den fysiske formen av det gp70-inneholdende rekombinante antigenet som blir brukt til å immunisere en katt kan være enten aggregert eller ikke-aggregert. Studier foreslår at immunisering med den aggregerte formen av gp70R i bakterier er mest effektiv når det gjelder forbedring av den skadelige effekten av den senere utsetting for viral infeksjon. Dette utelukker ikke fremstilling av aggregert gp70R fra ikke-aggregert form av gp70R ved bruk av vanlige teknikker, som for eksempel, behandling med glutaraldehyd eller andre kryss-bindende midler. Aggregert gp70R som fremkom på denne måten kunne deretter bli brukt for fremstilling av en viral infeksjons-forbedrende sammensetning som er effektiv i å indusere en aktiv immunreaksjon som beskytter mot senere utsetting for FeLV eller immunologisk relaterte virus.

Uansett om et dyr blir immunisert med aggregert eller ikke-aggregert gp70R, vil begge disse formene av gp70R føre til fremstilling av antistoffer dertil. Det er derfor mulig å bruke disse antig-gp70R antistoffene diagnostisk, som for eksempel i et kit som kan detektere tilstedeværelse av gp70 i en prøve.

FeLV-antigene preparater i denne oppfinnelsen kan bli brukt i en katt til å indusere fremstilling av antistoffer som vil binde seg til epitope determinanter til FeLV. Spesielt egnet metode for å øke produksjonen av katte-antistoffer til FeLV er først å immunisere en katt med FeLV-antigene preparater i denne oppfinnelsen etterfulgt av en senere immunisering. Selv om alderen på katten ved den første immuniseringen ikke er kritisk, er det ønskelig at dyret er minst åtte uker gammelt, siden kattene blir avvent når de er omtrent fire uker, og ved å vente til en alder på åtte uker, vil inter-ferensen som kan komme av sirkulerende moderlige antistoffer ha sunket.

En måte til å bestemme når en katt helst bør bli immunisert er å bestemme kattens immunstatus med hensyn på gp70. Denne evalueringen kan bli gjort ved å bruke gp70-inneholdende rekombinante proteiner i en immunanalyse så som, for eksempel, en ELISA-analyse for å detektere katte-antistoffer til gp70R. Ved å gjøre dette, er det mulig å bestemme når kattens antistoff-titer til gp70R er tilstrekkelig lav ved å fremme immunisering og beskytte mot infeksjoner av FeLV og immunologisk relaterte virus.

Mange forskjellige teknikker eksisterer for tidsbestemmelse av immuniseringene når et multippel immuniseringssystem blir benyttet. Det er mulig å bruke det antigene preparatet i denne oppfinnelsen mer enn en gang for å øke graden og diversiteten av uttrykking av immunoglobulin-repertoaret uttrykt av den immuniserte katten. Hvor multiple immuniseringer blir gitt, er det mest vanlig å immunisere med en til to måneders mellomrom.

Dosen av gp70-inneholdende rekombinant protein administrert til en katt vil variere avhengig av slike faktorer som alder, tilstand, kjønn, og grad av sykdom, hvis noen, og andre variabler som kan bli justert av en som er kjent innenfor fagområdet.

De antigene preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli administrert som enten enkelt eller flere doser og kan variere fra 10-1,000 ug/ml når det gjelder FeLV gp70R eller gp70R-A antigen per dose, helst 100-700 jjg/ml gp70R eller gp70R-A antigen per dose, aller helst 100-300 pg/ml gp70R eller gp70R-A antigen per dose. Lignende dosenivåer for gp70-inneholdende rekombinante proteiner blir benyttet.

Nå er oppfinnelsen generelt beskrevet, og en mer fullstendig forståelse kan bli oppnådd ved referanse til følgende spesifikke eksempler.

Eksempel 1

ISOLERING AV EN SUBGRUPPE AV EN GENOM KLON

Genomt DNA med høy molekylvekt ble fremstilt fra 3281-celler, kuttet fullstendig med endonuklease Eco RI, og 8-20 kilobase (kb) fragmenter isolert på en sukrosegradient. Et lambda fag bibliotek ble fremstilt fra disse fragmentene ved bruk av Charon 4A Eco RI armer. Dette biblioteket ble screenet med en probe som inneholdt U3 regionen til Gardner-Arnstein FeLV subgruppe B genome klon som beskrevet av Mullins et al., Journal of Virology 38:688-703, 1981. DNA-hybridiseringer ved bruk av dette området av FeLV lange terminale repeterende sekvens (LTR) har vist seg å være spesifikke for horisontalt overført FeLV DNA-sekvenser (Casey et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 78:7778 (1981)). Denne endogene U3 proben kryss-hybridiserer ikke med endogene FeLV-sekvenser som blir funnet i DNA fra uinfekterte katteceller. Konstruksjonen av U3 proben er beskrevet i figur 1.

Plasmid pFGB ble konstruert ved subkloning av et 9.1 kb Eco RI fragment fra FeLV DNA inneholdende genom klon lambda-HF60 (Mullins et al., supra.) inn i pBR322. Dette plasmidet inneholder 4 Kpn I seter, to i den indre regionen i det virale genomet og en i området av hver lange terminale repeterte sekvens (LTR). Kutting av pFGB med Kpn I etterfulgt av religering resulterer i en klon (pFLTR) som inneholder flankerende cellulære genetiske sekvenser og en LTR, men ingen andre virale sekvenser. Deretter ble pFLTR kuttet med endonuklease Tag I og et 550 bp fragment ble isolert. Dette fragmentet ble derfor subklonet inni restriksjonssete Cia I til pBR322. Denne klonen, pFU3, ble direkte nick-translatert og brukt som hybridiseringsprobe.

Seleksjon av rekombinante fag ble gjort ved DNA-hybridisasjon til den reaktive nick-translaterte pFU3 proben. På denne måten, ble 42 rekombinante fag selektert og isolert og deres DNA fremstilt. Disse genome klonene ble restriksjonskuttet og analysert ved Southern hybridisering ved bruk av pFU3 proben, en FeLV kappe-probe (pFGB-env) fra Gardner-Arnstein-molekylære klon, og en probe (pFGB) i tillegg som inneholder hele FeLV Gardner-Arnstein genomet. Basert på denne ana-lysen, ble 28 distinkte kloner identifisert. Av disse 28 klonene viste det seg av 24 var defekte i det at de hadde en omfattende delesjon i gag/pol gen-regionen. De gjenværende fire klonene hadde ikke denne deles j onen og var i full lengde.

Klon med full lengde (32-50), og hvor restriksjonskartet er vist i figur 2, ble valgt for videre analyse. Et 2.0 kb Pst I fragment som inneholder FeLV kappe-genet ble subklonet inn i PUC-9 og et begrenset restriksjonskart ble bestemt (figur 3). Forskjellige fragmenter ble videre subklonet inn i M13 og DNA-sekvensen bestemt (også vist i figur 4).

Eksempel 2

EKSPRESJON I E.COLI AV FeLV gp70 OG gp70-A

Det er to Bal I restriksjonsseter i kappe-genet til FeLV subgruppe A genome klon 32-50. En av disse setene ligger ved nukleotid 161 (figur 4), som er veldig nære grensen mellom ledersekvensen og sekvensen som koder for aminoenden av nativt gp70. Det andre restriksjonssetet er omtrent 120 nukleotider etter gp70/pl5E grensen. Bal I fragmentet ble isolert, Barn HI linkere ble tilsatt og det modifiserte fragmentet klonet inn i Barn HI setet til PUC-9 (penv-1) som vist i figur 5. Dette Barn HI fragmentet ble også subklonet inn i Pl,-baserte ekspresjonsvektor, pJLBOT, hvor den resulterende subklonen som blir kalt R16-38, og protein-ekspresjon indusert. Dette 55Kd proteinet blir betegnet "gp70R-delta" og er også kjent som "rec-gp70-delta" eller rgp70-delta". Hele DNA-sekvensen og den korresponderende aminosyresekvensen er vist i figur 6.

E.coli stamme R16-38, som inneholder den virale genome sekvensen for gp70-delta i plasmid pJLBOT, ble deponert 22 mai, 1987 ved the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og gitt aksesjonsnummer 67411.

Konstruksjonen av ekspresjonsplasmid pJLBOT oppsto ved modifisering av plasmid PJLA16. Konstruksjonen av plasmid pJLA16 er beskrevet i Lautenberger et al., Gene Anal. Tech. 1:63-66 (1984). pJLA16 plasmidet inneholder bakteriofag lambda Pl promoter (Pl)»°g Shine-Dalgarno sekvensen og ledersekvensen fra bakteriofag lambda Cjjgenet. Opprinnelig ble ekspresjonsplasmid pJLBO fremstilt ved kutting av pJLA16 med restriksjonsendonuklease Nru I. Etter kutting, ble en Barn HI linker ligert til det kuttede plasmidet. Denne fremgangsmåten plasserer et Bam HI restriksjonssete ved enden av Cjj bakterielederen i translasjonsleseramme hensiktsmessig for ekspresjon av gp70R. Deretter ble et syntetisk oligo-nukleotid, som inneholder translasjonsterminatorer i alle tre leserammene, klonet inn i plasmid pBR322 som deretter ble satt inn i pJLBO etter Bam HI kloningssete. Det resulterende plasmidet ble betegnet pJLBOT.

Western blot-analyser av de totale proteinekstraktene fra induserte kulturerer ved bruk av kanin-antisera med høy titer til gp70 indikerte at et FeLV protein på omtrent 55 Kd var tilstede. Dette proteinet inneholder nesten hele gp70 og 40 aminosyrer av pl5E.

For å danne kloner som fremstiller gp70 sekvenser uten de som ble avledet fra pl5E, ble penv-1 først linearisert med Eco RI. Omtrent 100 bp ble fjernet fra hver ende med Bal 31 eksonuklease, Bgl II linkere ble tilsatt og DNA-fragmentene ble resirkularisert med DNA ligase. Rekombinante kloner ble selektert og grad av nukleasekutting og posisjonen til Bgl II linkere innenfor FeLV 32-50 kappe-genet ble bestemt ved DNA-sekvenseringer ved bruk av M-13/Sanger dideoksy-metode og et kommersielt tilgjengelig kit (Amersham). pUC-R16-12 klonen hadde FeLV sekvenser som terminerte innenfor fem nukleotider av 3' enden til gp70 kodende region. Beliggenheten av denne 3' enden er vist i figur 4.

Bam HI/Bgl II fragmentet fra pUC-R6-12 ble isolert og subklonet inn i pL ekspresjonsvektor pJLBOT. Ved induksjon, ble et protein på omtrent 45 Kd fremstilt som reagerte medantisera til gp70. Den fullstendige aminosyresekvensen til dette proteinet er vist i figur 7. Den resulterende klonen ble kalt R16-12.

E.coli stamme R16-12, som inneholdt den virale genome sekvensen for gp70 i plasmid pJLBOT, ble avgitt 22 mai, 1986, ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og gitt aksesjonsnr. 67119.

Eksempel 3

EKSPRESJON AV FeLV gp90 I E.COLI

En rekombinant DNA-klon som uttrykker FeLV gp90 ble konstruert slik at den begynner med plasmid FEA-3281. FEA-3281 ble konstruert ved subkloning av det 2 kb Pst I fragmentet fra genomt klon 32-50 inn i PUC-9, og inneholder kodende sekvenser for FeLV kappe-genet. Et restriksjonskart for FEA-3281 er presentert i figur 3, og sekvensen til den FeLV avledete delen til plasmidet er presentert i figur 4. FEA-3281 ble også brukt som utgangsmateriale for dannelsen av plasmider som uttrykker gp70R og gp70R-delta.

FEA-3281 ble kuttet med Hindlll for dannelsen av to DNA-fragmenter på 3.3 og 5.5 kb. 3.3 kb fragmentet ble isolert og resirkulert ved bruk av T4 DNA ligase. Det resulterende plasmidet ble kalt FEA-env-5'.

FEA-env-5' ble kuttet med Ball. BamHI linkere ble tilsatt og plasmed resirkularisert. Dette plasmidet ble kalt FEA-env-5'-BH.

FEA-env-5'-BH ble kuttet med Hindlll, og 1.5 kb Hindlll fragmentet som ble dannet fra FEA-3281 ble subklonet inn i dette setet i den opprinnelige orienteringen. Dette plasmidet ble kalt ENV-L-.

ENV-L- ble kuttet med Pstl og svakt kuttet med Bal 31 eksonuklease. Bglll linkere ble tilsatt og plasmidet resirkularisert. Det resulterende plasmidet ble kalt PUC-gp90. Lokalisering av Bglll i FeLV kappe-genet ble bestemt ved DNA-sekvensering.

2.0 kb BamHI/Bglll fragmentet fra PUC-gp90 ble isolert og subklonet inn i BamHI setet til pLCBCOO. pLCBOO er identisk til pJLBOT med unntagelse av at pLCBCOO inneholder et PvuII restriksjonssete mellom DNA-sekvensen som stammer fra bacteriofag lambda pL og bakteriofag ell. Dette plasmidet ble kalt pCBCOOgp90. Ekspresjon ble indusert på en lignende måte som for gp70R og gp70R-delta. Et 65-70 kd protein som var reaktiv med kanin anti-gp70 antisera ble produsert ved induksjon. Dette proteinet ble kalt gp90R. Hele DNA-sekvensen som koder for gp90R og korresponderende aminosyresekvenser er presentert i figur 8.

E.coli stamme R16-12, som inneholder den virale genome sekvensen for gp90 i plasmid pLCBCOO, ble avgitt 28. mai, 1987, ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og gitt aksesjonsnummer 67412.

Eksempel 4

RENSING AV FeLV REKOMBINANT gp70

Rekombinant E.coli klon R16-12 ble tillatt vokse i LB-medium supplementert med 156 glukose og 0.156 casaminosyrer ved 32°C til en optisk tetthet (560 nm) på 0.4-0.6. Kulturen ble deretter skiftet til 42°C og inkubert i ytterligere to timer. Etter dette ble cellene samlet ved sentrifugering med 4,000 g i 30 minutter, vasket med 50 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdende 50 mM EDTA og 50 mM NaCl, og lysert ved enzymatisk kutting med lysozym (5 mg/g celler) i 25 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdende 0.5$ Triton X-100. Cellelysatet ble deretter fraksjonert ved sedimentering i 30 minutter ved 30,000 g. Cellepelleten ble resuspendert i 50 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdende 50 mM MgClg og DNase I (0.1 mg/g celler). Etter inkubasjon ved romtemperatur i 30 minutter med røring av og til, ble suspensjonen sentrifugert ved 6,000 g i 30 minutter og pelleten ble vasket to ganger 25 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdende 0.5 M NaCl, 0 , 556 Triton X100, 25 mM EDTA, og 156 beta-merkaptoetanol. Denne behandlingen ble etterfulgt av to vasker med 4 M urea i 25 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdend e0.5 M NaCl og 25 mM EDTA. Denne pelleten inneholdt mer enn 9056 av det rekombinante proteinet uttrykt i E.coli R16-12. Gelelektroforese-analyser viste at gp70R proteinet som delvis var opprenset og presentert i bakteriesammenhenger i aggregert form. Dette materialet består av 60-8056 gp70R protein mens det gjenværende materialet består av bakterielle proteiner. Dette materialet ble betegnet preparat T.

Et annet gp70R preparat (Preparat II) ble utviklet, begynn-ende med Preparat I. Den rekombinante proteinpelleten til Preparat I ble løst opp ved resuspendering av den vaskede pelleten i 50 mM Tris HC1, pH 9.0, ved tilstedeværelse av 6 M urea og 156 beta-merkaptoetanol. Suspensjonen ble gjort klar til sentrifugering ved 10<5>g i 30 minutter.

For å rense gp70R Preparat II, ble supernatanten etter sentrifugeringen applisert på en Sepharose CL-4B kolonne ekvilibrert med 50 mM Tris HC1, pH 9.0, inneholdende 6 M urea og 1 mM beta-merkaptoetanol. Kolonnen ble eluert med den samme buffer ved romtemperatur. Fraksjonene ble samlet og undersøkt ved SDS-gelelektroforese for tilstedeværelse av gp70R. Fraksjonene som inneholder antigen ble slått sammen og dialysert mot en serie buffere ved 4°C: først, 10 volumer 50 mM Tris HC1, pH 7.7, inneholdende 4 M urea; deretter, 10 volumer buffer inneholdende 2 M urea; deretter, 10 volumer buffer inneholdende 1 M urea; og deretter, 100 volumer buffer uten urea. Etter endt dialyse, omtrent 50$ av gp70R var fremdeles løselig i 50 mM Tris HC1, pH 7.5. I motsetning til gp70R i Preparat I, eksisterte ikke gp70R fra Preparat II i aggregert form.

Den aggregerte formen av gp70R er tilstede i Preparat I likeledes den løselige, ikke-aggregerte gp70R fra Preparat II ble brukt i katter for å produsere antistoff til FeLV.

Eksempel 5

RENSING AV FeLV REKOMBINANT gp70R-A

innbefattet preparat.

Rekombinant E.coli klon R16-38 ble latt vokse i LB-medium supplementert med 1% glukose og 0. 1% casaminosyrer ved 32°C til en optisk tetthet (560nm) på 0.4.-0.6. Kulturen ble deretter skiftet til 42°C og inkubert i ytterligere 2 timer. Ved slutten av denne tiden ble cellene samlet etter sentrifugering ved 4,000 g i 30 minutter, vasket med 50 mM Tris HC1, pH 7.5, og til slutt resuspendert i 200 ml 50 mM Tris HC1, til hvilket man tilsetter 1 ml 0.1 M fenylmetylsulfonylfluorid i isopropanol (final konsentrasjon = 0.5 mM) og 0.4 ml 5 mg/ml aprotinin (final konsentrasjon = 10.0 pg/ml). Cellene ble lysert ved enzymatisk kutting ved lysozym (final konsentrasjon = 0.5 mg/ml) ved tilstedeværelse av 0.2$ Triton X-100. Etter røring i 30 minutter, 2 ml MgCl2(0.5M), 5 ml DNasel (1 mg/ml) og 1 ml 0.1 M fenylmetylsulfonylfluorid ble tilsatt. Etter røring i 30 minutter til, ble 40 ml EDTA (0.25 M, pH 7.5) og 4 ml Triton X-100 (1056 w/v) tilsatt. Preparatet ble sentrifugert ved 10,000 x g i 30 minutter ved 4°C, og pelleten ble resuspendert i 50 ml 50 mM Tris HC1, pH 7.5. Pelleten ble homogenisert ved lav hastighet i 15 sekunder. Lysozym ble satt til til en konsentrasjon på 0.5 mg/ml og 0.6 ml 10% Triton X-100 ble tilsatt. Etter 15 minutters røring, ble 10 ml MgCl2(0.5 M) og 1 ml DNase I (1 mg/ml) tilsatt og røringen fortsatte i 15 minutter. Etter justering av volumet til 300 ml med 50 mM Tris, pH 9.0, 40 ml 1056 Triton X-100 og 51.2 ml EDTA (0.25 M, pH 7.5) tilsatt og det finale volumet justert til 400 ml med 50 mM Tris, pH 9.0. Etter 30 minutters røring, ble suspensjonen sentrifugert ved 10,000 x g i 30 minutter ved 4°C, og pelleten ble resuspendert i 400 ml 50 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdende 4 M urea, 50 mM EDTA, og 156 Triton X-100. Etter 15 minutters røring, ble suspensjonen sentrifugert ved 10,000 x g i 30 minutter ved 4°C, og pelleten ble resuspendert i 400 ml 50 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdende 1.0 M NaCl. Etter 15 minutters røring, ble suspensjonen sentrifugert ved 10,000 x g i 30 minutter ved 4°C, og pelleten ble resuspendert i 400 ml 50 mM Tris HC1, pH 7.5, inneholdende 6 M urea, og 5 mM EDTA. Etter 15 minutters røring, ble suspensjonen sentrifugert ved 10,000 x g i 30 minutter ved 4°C. Ved dette tidspunktet ble pelleten enten frosset for senere bruk eller løst opp i 50 mM Tris HC1, pH 9.5, inneholdende 6M guanidin HC1, 50 mM EDTA, og 0 . 556 beta-merkaptoetanol. gp70R-delta polypeptider ble deretter renset ved bruk av DNA-metoden i eksempel 6, nedenfor.

Eksempel 6

RENSING AV FeLV REKOMBINANT gp70R-A

Fremgangsmåte I.

Det oppløste proteinet i eksempel 5 ble dialysert mot 6 M urea, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 5 mM EDTA, og 1 mM Ditiotreitol (DTT). Omtrent 120 mg protein ble applisert på en CM-TSK kolonne (EM Science, 1.5 cm ID x 4 cm) ekvilibrert med samme buffer. Proteinet ble eluert med en lineær gradient bestående av NaCl (0-1.0 M i 150 ml) i den samme bufferen. Fraksjonene ble samlet og analysert ved elektroforese på 105& SDS-polyakrylamidgeler. Coomassie-blue-farging av gelen ble brukt til å identifisere gp70R-delta proteinet. Fraksjoner 25-31, som eluerte ved omtrent 0.1 M NaCl, ble slått sammen og brukt ved immunisering.

Fremgangsmåte II.

For å senke hydrofobisiteten til gp70R-A, ble sulfhydryl-gruppene alkylert med iodoacetamid og lysinresidiene ble N-acylerte med citraconic anhydrid. Proteinet fremstilt som i eksempel 5 ble løst opp i 6 M guanidin-HCl i 50 mM borat, pH 9.0, 0.556 beta-merkaptoetanol (v/v). Iodoacetamid blir tilsatt ved et molart forhold på 1:1 (iodoacetamid : totale sulfhydrylgrupper). Alkyleringen ble utført i mørke i 1 time ved romtemperatur. Alkyleringen av alle sulfhydrylgrupper (i proteinet og beta-merkaptoetanol) ble undersøkt med DTNB (Ellmans reagens) for å forsikre fullstendig alkylering. Proteinkonsentrasjonen ble justert til 2 mg/ml.

Proteinet ble citraconylert i mørke ved tilsetting av citracon-anhydrid (0.0022 ml per mg protein; omtrent 50 molart overskudd over frie lysiner). Preparatet ble dialysert flere ganger i mørket mot 50 mM borat, pH 9.0. Full-føring av acyleringen av protein-lysingruppene ble bestemt ved reaksjon med trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS) som måler gjenværende frie lysingrupper. TNBS (200 ytl av 10 mM) ble satt til 200 jjg alkylert, citraconylert, dialysert gp70R-delta i 1 ml 50 mM natriumborat, pH 9.0. Blandingen ble inkubert 2 timer i mørke ved 40°C, og reaksjonen quenchet med 0.5 ml 1 N HC1 og 0.5 ml 1% SDS, og absorbansen ble lest ved 340 nm. Den molare ekstinksjonskoeffisienten ved 340 nm for TNP-lysin er 10,4000.

Rensing av den alkylerte, citraconylerte gp70R-delta ble utført ved pH 9.0 for å forhindre deblokkering av lysingruppene. Urea med en final konsentrasjon på 4 M ble tilsatt til det modifiserte proteinet. Proteinet ble konsentrert til 3 mg/ml ved ultrafiltrering og applisert på en Sepharose 6B-C1 kolonne (1.5 x 86 cm). gp70R-delta proteinet ble eluert ved en eluer ingshastighet på 6.6 ml/hr med 4 M urea, 50 mM natriumborat, pE 9.0. Fraksjonene (5.3 ml/fraksjon) ble samlet og gp70R-delta ble bestemt ved proteinanalyse og SDS-polyakrylamidelektroforese til å være i fraksjonene 13-15.

Citraconyleringen av gp70R-delta ble reversert ved dialyser-ing av 5 ml alkylert, citraconylert gp70R-delta (1.0 mg/ml) mot 6 M urea i 50 mM natriumcitrat, pH 5.5 i 48 timer ved romtemperatur. gp70R-delta ble dialysert mot 6 M urea i 100 mM natrium bikarbonat, pH 8.0 og proteinkonsentrasjon justert til 0.8 mg/ml før absorbsjon til aluminiumhydroksyd.

Fremgangsmåte III.

En modifikasjon av ovenfor nevnte rensing av alkylert, citraconylert gp70R-A ble utviklet. Kort fortalt, alkylert, citraconylert gp70R-delta ble modifisert og dialysert mot 50 mM natriumborat, pH 9.0 som beskrevet ovenfor. Urea ble tilsatt til en final konsentrasjon på 8.0 M. Proteinet ble konsentrert ved ultrafiltrering med en PM-30 membran som ga 2.5 mg protein/ml. Proteinløsningen ble applisert på en Sephacryl S-400 kolonne (1.5 x 90 cm) i en 50 mM natrium borat-buffer, pH 9.0 inneholdende 8 M urea og eluert med samme buffer. Fraksjonene (2.9 ml/fraksjon) ble samlet og fraksjoner 34-37 inneholdende gp70R-delta ble slått sammen. 21 mg protein fra disse fraksjonene ble fortynnet til en final konsentrasjon på 4M urea med 50 mM natriumborat, pH 9.0 og applisert på en DEAE-TSK kolonne (1.5 x 11 cm). Proteinet ble eluert med en lineær gradient av NaCl (0-0.5 M) i 50 mM natriumborat, pH 9.0 inneholdende 4M urea. Tre ml fraksjoner ble samlet. Fraksjoner 89-95 inneholdende gp70R-delta ble slått sammen og 15 mg gp70R-delta ble oppnådd.

Eksempel 7

FREMSTILLING AV RENSEDE SAPONINER

Vandige ekstrakter av Quillaja saponaria molina bark ble dialysert mot vann. De dialyserte ekstraktene ble ekstrahert med metanol og det metanol-løselige ekstraktet ble videre fraksjonert på silikagel-kromatografi og ved revers fase høytrykks-væskekromatografi (RP-HPLC). De individuelle saponinene ble separert ved revers fase HPLC. Minst 22 topper som var detekterbare ved brytningsindeksen (betegnet QA-1 til QA-22) var mulig å separere. Hver topp korrespon-derte til en karbohydrat-topp og viste bare et enkelt bånd på revers fase tynn-skikt kromatografi. De individuelle komponentene ble identifiserte ved retensjonstid på en Vydac C4HPLC kolonne som følger:

Fraksjoner som inneholdt hemolytisk aktivitet, som indikerer saponinaktivitet, hie rekromatografert på RP-HPLC.Immun adjuvans-aktivitet ble testet ved å måle evnen som de rensede saponinene har til å øke immunresponsen i mus mot eksogent administrerte antigener.De rensende saponinene demonstrerte adjuvans-effekter ved lavere doser enn råekstraktene. Spesielt, de dominerende saponinene i barkekstrakt (QA-7, QA-17, og QA-18) demonstrerte adjuvans-aktivitet ved doser på 4.5 jjg karbohydrat eller mindre (analysert ved anthrone).De rensede saponinene ble viderekarakterisert vedkarbohydrat-innhold, revers fase og normal fase TLC, UV, og infrarødt spekter.

Milligrammengder av QA-7, QA-17, og QA-18 ble renset fra Superfos Quil-A ved fremgangsmåten beskrevet nedenfor.Et g "Quil-A" ble suspendert i 75 ml metanol og varmet ved 60°C i 15 minutter og filtrert.Det uoppløste materialet ble ekstrahert for annen gang med 50 ml metanol ved 60 °C og filtrert.Filtratene ble fordampet til tørrhet på en rotaeva-porator.En LiChroprep Silica Si 60 kolonne (E.M. Science, 25 mm ID x 310 mm L, 40-63 pm partikkelstørrelse) ble pre-ekvilibrert i 40 mM eddiksyre i kloroform/metanol/vann (62/32/6, v/v/v).

Den tørkede "Quil-A" ble løst opp i 5 ml kolonne-oppløsning og eluert gjennom kisel isokratisk i dette løsningssystemet ved en elueringshastighet på 1 ml/min.Karbohydratanalyser, tynn-skikt kromatografi, og HPLC ble brukt til å detektere fraksjonene for QA-7, QA-17, og QA-18.Fraksjonene 60-90 hadde forøkede mengder av QA-8 og QA-18 mens 150-190 hadde forøkede mengder av QA-7 og QA-17.Disse fraksjonene ble slått sammen og hurtigfordampet før videre rensing ved RP-HPLC på Vydac C4 (figur 9) ved bruk av en metanolgradient til å eluere de rene adjuvantene.

Eksempel 8

IMMUNISERING AV KATTUNGER MED gp70R

Ti kattunger, med alder på seks til åtte uker ble brukt i immuniseringseksperimentene.Før immuniseringen, ble alle dyrene testet og ble funnet å være negative for FeLV antistoffer .

Dyrene ble delt inn i to grupper og immunisert med enten gp70R Preparat I eller gp70R Preparat II fremstilt som beskrevet i eksempel 3.Begge dyregruppene ble immunisert med 100 jjg av den hensiktsmessige gp70R preparatet emulgert i Freund's komplette adjuvans.Dyrene ble immuniserte parenteralt tre ganger med intervaller på 21 dager.21 dager etter den siste immuniseringen, ble begge dyregruppene tilført 400 katte sarcoma virus (FeSV) partikler per dyr.

Etter hver immunisering, ble hvert dyr målt for antistoff-nivåer til FeLV og for nivåer av nøytraliserende antistoffer til FeLV.Fjorten til enogtyve dager etter utsetting for FeSV, i tillegg til antistofftesting, ble dyrene undersøkt for tilstedeværelse av virus i serum og dannelse av svulster .Tilstedeværelse av virus i serum ble målt ved virus-titrering (DeNoronha et al., Journal of the National Cancer Institute 58:129-130 (1977)), og ELISA ved bruk av antistoff som var spesifikke for gruppen antigen (p27) til FeLV som også er felles med FeSV.Resultatene av dette eksperimentet er vist i Tabell 1.

Selv om alle ni dyrene i begge gruppene, som var i live i løpet av studiet, produserte antistoff til gp70R, viste bare de dyr i Gruppe I som ble immunisert med Preparat I noen synlig motstandsgrad til utsetting for virus med FeSV.Mulig heten som et dyr hadde til å fremstille antistoffer som kunne nøytralisere FeLV hang direkte sammen med muligheten som et dyr hadde til å vise motstandsdyktig til utvikling av svulster og viremi.

Eksempel 9

IMMUNISERING MED ALUMINIUMHYDROKSYD-ABSORBERT

gp70R-A

Aluminiumhydroksyd som har en adjuvant effekt for mange proteiner og som vanligvis brukes i vaksiner ble brukt som en bærer for gp70R-A. gp70R-A fremstilt med fremgangsmåte I i eksempel 6 ovenfor absorberes sterkt til 10% aluminiumhydroksyd med tilstedeværelse av 50 mM Tris-Cl, pH 8.0 inneholdende 6 M urea. Omtrent 3 pg gp70R-A ble absorbert per 100 jjg aluminiumhydroksyd. gp70R-A absorbert til aluminiumhydroksyd ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), resuspendert i PBS og brukt til immunisering av dyr. CD-l-mus (8-10 uker gamle) ble immuniserte intradermalt med gp70R-A absorbert til A1(0H)3i et totalt volum på 200 pl PBS ved tilstedeværelse eller uten HPLC-rensede saponiner QA-17 eller QA-18 eller en blanding av QA-17 og QA-18.20 til 25 Vg gp70R-A ble injisert per dose. HPLC-rensede saponiner QA-17 eller QA-18 eller en blanding av QA-17 og QA-18 ble brukt ved en tørr vektdose på 10 pg. To mus ble injisert for hver formulering. Mus ble gitt en forsterket (booster) injeksjon bestående av gp70R-A/aluminiumhydroksyd seks uker etter den opprinnelige injeksjonen. Museserum ble analysert for reaktivitet til FEA, en FeLV subgruppe A, ved 2, 4, og 8 ukers post-immunisering ved bruk av en ELISA immunoanalyse. Fire uker etter immuniseringen, ble en anti-FeLV. respons utløst av gp70R-A observert. HPLC-renset saponin adjuvantene QA-17 og QA-18 forsterket denne responsen. Responsen var to ganger større ved fire ukers post-immunisering med tilstedeværelse av QA-17 sammenlignet med immunisering uten saponinadjuvans. Resultatene av dette eksperimentet er vist i figur 10.

Anti-FEA IgG ble analysert ved bruk av en ELISA-analyse.FEA-virus (10 pg/ml i PBS) ble absorbert til Immulon II plater over natt ved 4°C (100 pl/brønn) .Platene ble vasket med PBS og uspesifikk IgG binding ble blokkert ved 1 times inkubasjon med 10$ normal geiteserum i PBS (100 pl/brønn) ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket med 0. 05% Tween-20 i destillert vann.Serum ble fortynnet i 10% normal geiteserum i PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur på platen med serumfortynninger på 10, IO<2>, IO<3>og IO<4>(100 pl/brønn).Etter vasking av platen med 0.0556 Tween-20 i destillert vann, ble det inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med 100 pl/brønn peroksidase-konjugert geit anti-muse IgG fortynnet 1/5000 i PBS (Boehringer-Mannheim) .Etter vasking av platene med 0.0556 Tween-20 i destillert vann, ble IgG-mengden bestemt ved peroksidase-reaksjon med 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin fra absorbansen ved 450 nm bestemt på en Dynatech mikrotiter-plate-avleser.

Eksempel 10

IMMUNISERING MED ALUMINIUMHYDROKSYD-ABSORBERT

gp70R-A

CD-1 mus (8-10 uker gamle) ble immunisert intradermalt med 15 pg/dose alkylert gp70R-A renset ved fremgangsmåte II i eksempel 6 (absorbert til aluminiumhydroksyd som beskrevet i eksempel 6) i 200 pl PBS. HPLC-rensede adjuvanter QA-7, QA-17, QA-18 og blandinger av de tre adjuvantene ble brukt ved tørr vektdose på 10 pg. Tre mus ble injisert for hver formulering. Museserum ble analysert ved ELISA ved 2 og 4 ukers post-immuniseringer for reaktivitet til FEA som beskrevet i eksempel 9. Som immuniseringen med umodifisert gp70R-A vist i eksempel 9, utløste immunisering med alkylert gp70R-A en anti-FeLV viral respons etter fire ukers-immunisering. HPLC-rensede adjuvanter QA-7, QA-17, QA-18 øker immunresponsen sammenlignet med immunisering uten saponinadjuvanter. QA-17 og blandinger av QA-17 og QA-18 induserte høyest respons, med endepunkt-titere som var nesten to ganger større enn immunisering uten saponinadjuvans. Resultatene av disse eksperimentene er summert i figur 11.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammesetning som kan beskytte en katt overfor felin leukemi virus (FeLV),karakterisert vedå blande sammen en immunologisk effektiv mengde FeLV subgruppe A gp70R-A eller en biologisk aktiv analog derav og en vesentlig ren saponin adjuvant valgt fra gruppen bestående av QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som kan beskytte en katt overfor felin leukemi virus (FeLV),karakterisert vedå blande en immunologisk effektiv mengde FeLV subgruppe A gp70R eller en biologisk aktiv analog derav og en vesentlig ren saponin adjuvant valgt fra gruppen bedstående av QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som kan beskytte en katt overfor felin leukemi virus (FeLV),karakterisert vedå blande en immunogen effektiv mengde FeLV subgruppe A gp90R eller en biologisk aktiv analog derav og en vesentlig ren saponin adjuvant valgt fra gruppen bestående av QA-7, QA-17, QA-18 og QA-21.

4 . Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som kan beskytte katt overfor felin leukemi virus (FeLV),karakterisert vedå blande en immunogen effektiv mengde FeLV ved subgruppe A gp70R-A sammen med saponin adjuvant QA-21 og aluminiumhydroksid.