JPH0327400A - Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原性デターミナントを含有し且つキャリア
ーに結合したポリペプチドからなるコンジュゲート体、
その製造及び抗体誘導に用いるその用途に関する。

目標とすべき望ましいワクチンとは、持続時間が長い免
疫化であって、且つその免疫記憶が十分に長く次のワク
チン接種まであるいは感染性物質の侵入時まで継続する
免疫化を素早く生ぜしめるワクチンである。またワクチ
ン製剤は、容易に投与することができて、安定であって
、その副作用も少なく、接種した者が感染性物質から広
範囲な保護を得られるようなワクチン製剤でなければな
らない。

従来用いられているワクチンの多くはこのような要求を
おおよそ満たしている。しかしながら、感染性物質その
ものを不活性化することによって得られている従来のワ
クチンは多くの問題点を有している。例えば、免疫抗原
の特質が不確定であること、不活性化ワクチンが真に無
害であるかどうかという問題点があり、また感染性物質
を大量に取扱う際の危険性、あるいは安定性、安定性の
問題から生じる投与方法の制限などの問題点がある。

より安定で明確なワクチンを開発する試みの１つとして
、多くの感染性物質に対する免疫応答を詳細に研究して
、保護免疫を提供するのに関与しているエピトープを同
定することが行なわれている。このような試みによって
得られた知識に基づき、より短いペブチドを作威してエ
ピトープの類似体を得、これらをワクチンとして用いる
ことが現在では可能となっている。このようなベプチド
モ用いたワクチンは多くの利点を有している。即ち、こ
れらは化学的に明確なものであって、安定であり、その
製造工程で感染性物質が混入することもない。更には、
免疫応答が適度に促進されるようにデザインすることが
可能であり、また新たなデリバリーシステムを用いて抗
原を目的部位に投与できるようにすることも可能である
。製造の点から見れば、大量生産するためのプラントを
作成する必要性もなくまた複雑な加工工程も必要としな
い。

このような多くの利点があるにもかかわらず、ペブチド
ワクチンに対しても多くの問題点が指摘されている。即
ち、ペブチドワクチンの場合には化学的に不明確なキャ
リアー蛋白を必要とし、またペブチド抗原の免疫原性は
天然の生物抗原の免疫原住と同様になることはないと考
えられている。

また、多くの合成ベプチドはその分子量が比較的小さい
ためにハプテンのように機能し、従ってその免疫原性を
高めるためには大きな外来蛋白キャリアーを結合するこ
とが必要であると一般的に考えられている。このように
キャリアーと結合して得られるコンジュゲート体で免疫
した場合には、そのペブチドとキャリアーとの結合方法
によっては感染性物質あるいは天然蛋白を認識できない
抗ペブチド抗体が産生されることがしばしばある。

またワクチン接種に関連した他の問題としては、キャリ
アーに用いた外来蛋白に対する高感受性の問題、あるい
はコンジュゲート体を製造する際の各バッチ間の再現性
の問題がある。　　　′最近、キャリアー蛋白としてＢ
型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）を用いることが
検討されているｏ　Ｃｌａｒｋｅ　ａｔ　ａｌ．．Ｎａ
ｔｕｒｅ，　３　０　０，　　３　８　１−３８４．１
９８７には、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のｖＰｌカブ
シド蛋白の主要抗原部位をＨＢｃＡｇのアミノ末端に融
合した融合蛋白が記載されている。この融合蛋白は自己
集合してレギュラー２７ｎｍコア様粒子となり、天然ウ
イルス自体と同様にＦＭＤＶに関して免疫原性となる。

ＥＰ−Ａ−０２７１３０２号明細書には、ＨＢｃＡｇが
アミノ酸残基の側鎖を介してポリペプチド免疫原に結合
したポリペプチドコンジュゲート体が開示されている。

また、ＨＢｃＡｇ蛋白がペプチド結合により病原性免疫
原に結合した免疫原性融合蛋白も記載されている。Ｔ細
胞特異的促進ポリペプチドも記載されている。

本発明者らは、ＨＢｃＡｇ粒子にポリペプチドを化学的
に結合することについて研究した。しかしながら満足す
べき結果は得られなかった。

即ち、 １．本発明者らは、ＨＢｃＡｇ粒子をスクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドーメチル）一シクロヘキサン−
１−カルポキシレート（ＳＭＣＣ）で誘導体化してＨＢ
ｃＡｇ上の側鎖アミノ基を介してＢ型肝炎ウイルス表面
抗原（ＨＢｓＡｇ）をＨＢｃＡｇに結合することを試み
た。しかしながら、ＨＢｃＡｇ粒子の誘導体化はほとん
ど起こらなかった。

２．上記１の試みを、ＳＭＣＣを用いる代わりにｍ−マ
レイミドーペンゾイルーＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（ＭＢＳ）を用いて実施したが、やはりＨＢｃ
Ａｇ粒子の誘導体化はほとんど起こらなかった。

３８　グルタルアルデヒドを用いてＨＢｃＡｇ粒子にＨ
ＢｓＡｇを結合させることを試みた。高濃度のグルタル
アルデヒドを用いた場合には結合させることができた。

しかしながら、高濃度のグルタルアルデヒドを用いた場
合にはＨＢｓＡｇがダメージを受け、得られるコンプレ
ックスをマウスに投与した場合にＨＢｓＡｇに対する免
疫応答が著しく減少した。

４．本発明者らは、ビス（マレイミド）メチルエステル
（ＢＭＭＥ）を用いて、ＨＢｃＡｇの側鎖アミノ基にＣ
ｙｓ含有ＦＭＤＶ　　ＶＰ１　１４１−１６０ペブチド
を結合させることを試みた。

ＨＢｃＡｇ粒子の量は減少したがＢＭＭＨによって誘導
体化されペプチドと反応した。結合はしたが、得られる
コンプレックスを投与してもＦＭＤＶに対する免疫応答
は極めて低かった。

本発明者らは上記した困難性を克服するために、ＨＢｃ
Ａｇのアミノ末端にＬｙｓ含有短鎖配列を融合した融合
蛋白を用いた。この修正ＨＢｃＡｇ蛋白に、そのＬｙｓ
残基の側鎖アミノ基を介してベブチドを結合させた所、
結合がうまく行なわれ、得られるコンジュゲート体は抗
ペプチド抗体及び中和抗体を有効に誘導した。この方法
は簡便であって効果的であり、明確な方法によってペプ
チドを結合させることができる。

従って本発明によれば、Ｌｙｓ残基を含有するＮ末端延
長鎖を有するＨＢｃＡｇからなる粒子であって、該Ｌｙ
ｓ残基の側鎖アミノ基を介して抗原性エピトープを有す
るポリペプチドが結合された粒子が提供される。

上記の修正ＨＢｃＡｇ粒子にはいずれのポリペプチドも
結合することができる。しかしながら、ＨＢｃＡｇのＮ
末端延長鎖中のＬｙｓ残基の側鎖アミノ基に結合するこ
とのできる一Ｎ　Ｈ　２、−ＳＨなどの官能基がポリペ
プチド上に存在することが必要である。典型的には、ポ
リペプチドは、外来エピトープ、即ち、ＨＢｃＡｇのエ
ピトープでないエピトープを有することができる。

ポリペプチドは、ウィルス、バクテリア、プロトゾアな
どの感染性物質のエビトーブなどの、中和抗体を誘導す
ることのできる抗原性エピトープを含有している。ある
いは、成長ホルモン断片などの非感染性物質のエピトー
プを含有していてもよい。またポリペプチドは、例えば
エピトープの８あるいは４個９コビーまでのエビトーブ
の複数コピーを含有していてもよい。エビトーブの２個
のコピーが存在していてもよい。２つあるいはそれ以上
の異なるエビトーブ、例えば３あるいは４種類のエピト
ープが存在していてもよい。

エピトープを有するウィルスの例としては、例えば、Ａ
型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、インフルエンザウ
ィルス、口蹄疫ウィルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不
全ウィルスタイプ１（ＩＩＶ−１）　、ＨＩＶ−２、シ
ミアン免疫不全ウィルス（ＳＩｖ）、ヒトライノウィ／
ｌ／ス（ＨＲＶ）、デングウィルス、黄熱病ウィルスな
どが挙げられる。修正ＨＢｃＡｇに結合するポリベプチ
ドはＨＢｓＡｇあるいはＦＭＤＶ　　ＶＰＩ主要抗原部
位を含むポリペプチドであってもよい。エピトープを有
するプロトゾアとしてはマラリアバラサイ｝　ＰＩａｓ
ｍｏｄ１ｏｓ　ｆａｌ　ｉｐａｒｏｍが挙げられる。

ＦＭＤＶ　　ＶＰＩ主要抗原部位を含有するペプチドと
しては、ＦＭＤＶのｖＰ１、例えばいずれかのＦＭＤＶ
セロタイプの１３７−１４２番目のアミノ酸残基からス
タートして１６０−１６２番目のアミノ酸残基で終る配
列からなるペプチドを用いることができる。典型的な配
列は、ｖＰ１アミノ酸残基１４０−１６２、１４０−１
６０，１３７−１６２、１３７−１６０あるいは１４１
−１６０の配列である。このような配列のタンデムリピ
ートを含有するポリペプチドあるいはこのような配列の
混合セロタイプのタンデムリピートを含有するポリペプ
チドを、修正ＨＢｃＡｇ粒子に結合することができる。

ＦＭＤＶ　　ＶＰＩ主要抗原部位のタンデムリピートを
含有する適当なペプチドとしては、それぞれが３０個以
下のアミノ酸残基からなる配列が連続していてそれぞれ
同じ免疫原性を有している配列から構成されるペプチド
が挙げられる。この免疫原性配列とは、 入ＦＭＤＶサブタイプ０　のＶＰＩのアミノ酸ｌ 残基１３７−１４５からスタートしてアミノ酸残基１５
０−１６２で終る配列；あるいは一〇セロタイプでＯの
他のサブタイプあるいは異、なるＦＭＤＶセロタイプの
サブタイプの対応するアミノ酸残基からなる配列である
。

従って、ペプチドは免疫原性配列のタンデムリビートで
あってもよい。あるいは、連続した配列から構成される
ペプチドであって、そのうちの１つあるいはそれ以上の
配列が免疫原性配列の活性部分でない部分を更に付加的
に含んだペブチドであってもよい。このような付加的な
アミノ酸残基はそれぞれの免疫原性配列を連結するのに
用いることができる。このような連結に用いられる配列
としては、６個までのアミノ酸残基、例えば１−３個の
アミノ酸残基からなる配列が挙げられる。

このような連結用配列がなくても、それぞれの免疫原性
配列を直接結合することもできる。

ペプチドは免疫原性配列の任意のリピート数を含有して
いてもよい。例えば、’２−８、より好ましくは２−４
のリピート数が挙げられる。ベプチドは、非天然性のシ
スティン残基を有するＣ末端及び／又はＮ末端で終って
も終らなくともよい。

免疫原性ＦＭＤＶ配列を含有する配列は、３０個以下の
アミノ酸残基からなる。配列の長さは、付加的な連結用
アミノ酸残基及びＮ末端及び／又はＮ末端非天然性シス
ティンが存在していても、免疫原性配列の長に依存する
。しかしながら、連続した配列のそれぞれの配列は２６
個以下のアミノ酸残基からなるのが好ましい。・ ペブチドはＦＭＤＶ　　ＶＰＩ主要免疫原性部位のリピ
ートを有している。ＦＭＤＶ主要エピトープは、ｖＰ１
キャプシド蛋白の少なくともアミノ酸残−Ｗ１４２−１
６０によって定義される。これは特にセロタイプ０１に
適用される。従って、くり返し存在していてもよい免疫
原性配列としては、ＦＭＤＶセロタイプＯｌのＶＰＩア
ミノ酸残基１４２−１６０であって任意にＮ末端側のア
ミノ酸残基１３７及び／又はＣ末端側のアミノ酸残基１
６２まで延びていてもよいアミノ酸配列によって定義さ
れる配列、あるいは他のセロタイプの対応するアミノ酸
配列によって定義される配列が挙げられる。典型的な配
列としては、例えばサブタイプ０１及びＡｌ２などのセ
ロタイプ０またはＡのＶＰ１アミノ酸残基１４０−１６
２、１４０−１６０、１３７−１６２または１３７−１
６０が挙げられる。このような典型的配列は例えば２回
くり返し存在していてもよい。１文字コードを用いて有
用なペプチドを挙げれば以下の通りである。

（１３７｛８２，Ｏ　ｔ　）　−（１３７−１（１２，
Ｏ　ｔ　）　　Ｃ　ｙｓ　：（ＮＲＮＡＶＰＮＬＲＧＤ
ＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰＴＳ）　ｘ２Ｃ　；（１３
７−１８２．０１）　−　（１３７−１８２，Ｏｌ）　
−Ｇｌｙ：（ＮＲ’ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫ
ＶＡＲＴＬＰＴＳ）　，２Ｇ　；　及ヒ（１３７−１８
２，Ａ，２）　一（１３７−１８２，Ａ，２）　−Ｃｙ
ｓ：（ＹＳＡＳＧＳＧＶＲＧＤＬＧＳＬＡＰＲＶＡＲＱ
ＬＰＡＳ）　ｘ２Ｃ．ＦＭＤＶエピトープのより少さな
免疫原性配列であってもよい。例えば、セロタイプｏｌ
のＶＰ１アミノ酸残基１４５−１５０によって定義され
る配列でもよい。従って、くり返し存在していてもよい
ＦＭＤＶ配列は、セロタイプＯｌのＶＰＩアミノ酸残基
１４５−１５０からなるアミノ酸配列であって任意にＮ
末端側のアミノ酸残基１３７及び／又はＣ末端側のアミ
ノ酸残基１６２まで延びていてもよいアミノ酸配列、あ
るいは他の七ロタイプの対応するアミノ酸配列によって
広く定義することができる。有用な少さな配列は以下の
通りである。

（１４５−１５０．０　　）　−　（１４５−１００．
０，　）　−Ｃｙｓ：ｌ ＲＧＤＬＱＶＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰＣ　；
及び（１４５−１５０．０　　）　−　（１４５−１５
０．０１）ｌ −　（１４５−１６０，Ｏｌ）　−Ｃｙｓ：ＲＧＤＬＱ
ＶＲＧＤＬＱＶＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰＣ．
ＦＭＤＶ　　ＶＰＩ主要抗原性部位の混合セロタイプタ
ンデムリピートからなる適当なペプチドは下記式（１）
で表わされる。

Ｃ’　−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｃ’　　　　　　　（Ｉ）ここで
Ｘは、人ＦＭＤＶセロタイプＯｌのＶＰＩのアミノ酸残
基１３７−１４２からスタートしてアミノ酸残基１６０
−１６２で終るアミノ酸配列、あるいは，ｔセロタイプ
０の他のサブタイプまたは異なるＦＭＤＶセロタイプの
サブタイプの対応するアミノ酸配列を表わし、 Ｙは直接結合、あるいはアミノ酸残基６個までからなる
連結用配列を表わし、 ２は、Ｘで表わされる配列のセロタイプとは異なるセロ
タイプの配列であってＸと同様にして定義される配列を
表わし、 Ｃ′及びＣ′はそれぞれ独立に任意のシステイン残基を
表わす。

Ｘ及び２で表わされるそれぞれの免疫原性配列は、ＦＭ
ＤＶセロタイプ０１のｖＰ１アミノ酸残基１４２−１６
０のアミノ酸配列であって任意にそのＮ末端側のアミノ
酸残基１３７及び／又はそのＣ末端側のアミノ酸残基１
６２まで延びていてもよいアミノ酸配列、あるいは七ロ
タイプＯの他のサブタイプまたは異なるＦＭＤＶセロタ
イプのサブタイプの対応するアミノ酸配列によって定義
される。典型的な配列は、ＶＰＩアミノ酸残基１４０−
１６２、１４０−１６０，１３７−１６２又は１３７−
１６０である。

Ｘ及び２で表わされる免疫原住配列は、それぞれ異なる
セロタイプのアミノ酸配列である。７種類ｃ７）　Ｆ　
Ｍ　Ｄ　Ｖ　−ｔｒ　ｏ　９イプ、即ち、０、Ａ，Ｃ，
Ａｓｌａ　１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２及びＳＡＴ３がある
。有用なペプチドは、セロタイプ０１のアミノ酸配列及
び七ロタイプＡＩ２のアミノ酸配列をいずれかの順序で
含むペプチドである。免疫原性配列は、６個まで例えば
１〜３個のアミノ酸残基を介して連結することができる
。Ｃ末端に非天然性のシステイン残基が存在しているの
が好ましい。１文字コードで好ましいペプチドを表わせ
ば以下の通りである。

（１３７−ＩＢ２．Ｏｌ）　−　（１３７−１８２．Ａ
ｌ２）　−Ｃｙｓ：ＮＲＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡ
ＱＫＶＡＲＴＬＰＴＳ−　ＹＳＡＳＧＳＧＶＲＧＤＬＧ
ＳＬＡＰＲＶＡＲＱＬＰＡＳ−　Ｃ　．及び（１３７−
１０２，Ａｌ２）　−　（１３７−１８２．０ｌ）　−
Ｃｙｓ：ＹＳＡＳＧ！９ＧＶＲＧＤＬＧＳＬＡＰＲＶＡ
ＲＱＬＰＡＳ−　ＮＲＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ
ＫＶＡＲＴＬＰＴＳ−　Ｃ　．修正ＨＢｃＡｇ粒子に結
合するのに用いる好ましいポリペプチドは、ＥＰ−Ａ−
０２８７３９５号明細書に記載されたＨＲＶ　　Ｎｌｍ
−ｎエピトープからなるポリベプチドである。このエピ
トープは、ＨＲＶ２（７）ＶＰ２１７）７ミノ酸残基１
５６−１６４のアミノ酸配列あるいは他の１｛ＰＶのそ
れと等価のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列によって
定義される。これらの配列におけるアミノ酸残基は、当
該配列の抗原性に影響を与えない他のアミノ酸残基によ
って置換してもよい。ＨＲＶ　２のＮｌｍ−Ｉｆ配列は
以下の通りである。

ＶＫＡＥＴＲＬＮＰ． 他のＨＲＶのこれと等価のアミノ酸残基は、ＨＲＶ２の
ＶＰ２７ミノ酸残基１５６−１６４１．：対応するＶＰ
２アミノ酸残基である。換言すれば、それらは他のＨＲ
Ｖセロタイプの対応するＶＰ２アミノ酸残基である。こ
れらは、ＨＲＶ２のｖＰ２配列と他のＨＲＶのＶＰ２配
列とを並べることによって容易に決定することができる
。このことは、ＨＲＶの異なるタイプのＶＰ２配列間に
おいては相同性があるため、容易に行なうことができる
。

ポリペプチドは、５０個まで、例えば４ｏ又は３０個ま
でのアミノ酸残基からなる比較的短かいペブチドであっ
てもよい。あるいは、例えば１ｏＯ又は２００個のアミ
ノ酸残基の長さの長いものであってもよい。それらは蛋
白であってもよい。

それらは化学合成あるいは組換えＤＮＡ技術によって得
ることができる。

ポリペプチドが結合する粒子は、Ｌｙｓ残基を含有する
Ｎ末端延長鎖を持ったＨＢｃＡｇから本質的になるもの
である。ＨＢｃＡｇは自己集合することによって直径２
７ｎｍの粒子となる。本発明で用いる修正ＨＢｃＡｇも
自己集合することによってコア状の粒子を形成する。Ｎ
末端延長鎖上には１個より多くのＬｙｓ残基が存在して
いてもよい。６個まで、例えば４個までのＬｙｓ残基が
存在していてもよい。

Ｎ末端延長鎖は、このＮ末端延長鎖をそなえたＨＢｃＡ
ｇが自己集合してコア状の粒子を形成し該延長鎖上のＬ
ｙｓ残基が結合用に用いられるようにさらされていれば
、どのような長さであってもよい。Ｎ末端延長鎖は、２
５０個まで、例えば２００個又は１００個までのアミノ
酸残基からなる長さのものでもよい。あるいは、６０個
まで、例えば４０、２０，１０又は５個までのアミノ酸
残基からなるような短いものでもよい。

好ましいＮ末端延長鎖は、ＳａｂｌｎまたはＭａｈｏｎ
ｅｙ株などのポリオウィルスタイプ１　（ＰＶ１）株の
ＶＰＩキャプシド蛋白のアミノ酸残基９５−１０２、例
えば９５−１０４からなるアミノ酸配列である。これら
を示すと以下の通りである。

Ｓａｂｌｎ　　　ＰＶＩ　　ＶＰＩ　　９５−１０２　
　：　ＳＡＳＴＫＮＫＤＳａｂｌｎ　　　ＰＶＩ　　Ｖ
ＰＩ　　９５−１０４　　：　ＳＡＳＴＫＮ）［ＤＫＬ
Ｍａｈｏｎｅｙ　　ＰＶＩ　　ＶＰＩ　　９５−１０２
　　：　ＰＡＳＴＴＮＫＤＭａｈｏｎｅｙ　　ＰＶＩ　
　ＶＰＩ　　９５−１０４　　：　ＰＡＳＴＴＮＫＤＫ
Ｌこれらは１文字コード（Ｂｕｒ．　Ｊ．Ｂ１ｏｃｈｅ
ｍ．１３８．９−３７．１９８４）により示したもので
あってＫはＬｙｓを表わす。これらの配列は、ＰＶＩ　
　ＶＰＩの主要抗原性部位上に広がる配列である。他の
適当な延長鎖としては、ＨＲＶ２のＶＰ２キャプシド蛋
白のアミノ酸残基１５６−１６４、例えば１５６−１７
０のアミノ酸配列、あるいは他のＨＲＶのそれと等価の
アミノ酸残基からなるアミノ酸配列が挙げられる。ＨＲ
Ｖ２についてのこれらのアミノ酸配列は以下の通りであ
る。

１５Ｂ−１６４　：　ＶＫＡＥＴＲＬＮＰ１５Ｂ−１７
０　：　ＶＫＡＥＴＲＬＮＰＤＬＱＰＴＥＰＶＩあるい
はＨＲＶ由来の配列のいずれかの末端あるいは両末端に
、例えば５もしくは３個までのアミノ酸残基からなるリ
ンカー配列を設けてもよい。ＨＢｃＡｇのいずれのＮ末
端延長鎖の場合にも、最初の１４個のＮ末端側のアミノ
酸残基内に少なくとも１つのＬｙｓ残基が存在している
必要がある。即ち、例えば、最初の５個もしくは１２個
のＮ末端側のアミノ酸残基内に１個のｔ，ｙＳ残基、あ
るいは最初の１４個のＮ末端側のアミノ酸残基内に２個
のＬｙｓ残基が存在していることが必要である。結合に
用いるポリペプチドとしては、Ｎ末端延長鎖自体のＮ末
端の近くにＬｙｓ残基を有するＮ末端延長鎖を備えたＨ
ＢｃＡｇを用いるのが望ましい。またＮ末端延長鎖は親
水性であるのが望ましい。

これらの配列のうちの１つあるいは他の配列からなりＬ
ｙｓ残基を含有するＮ末端延長鎖を持った修正ＨＢｃＡ
ｇは、遺伝子工学技術、例えばＪＰ−Ａ−１９６２９９
／８８号明細書に記載された方法によって得ることがで
きる。より具体的には、このような修正ＨＢｃＡｇは、
この修正ＨＢｃＡｇをコードする遺伝子を適当な発現ベ
クター中に導入し、該ベクターで形質転換した宿主中で
該修正ＨＢｃＡｇを発現することによって得ることがで
きる。

修正ＨＢｃＡｇをコードする遺伝子は、目的とするＮ末
端延長鎖をコードするＤＮＡ配列を合成し、必要に応じ
て適当なリンヵーを用いてこのＤＮＡ配列をＨＢｃＡｇ
をコードするＤＮＡ配列の５′末端に連結することによ
って調製することができる。かくして得られるＤＮＡ配
列を、適当な転写及び翻訳調節配列のコントロール下で
発現ベクター中に導入する。修正ＨＢｃＡｇは、Ｅ．ｃ
ｏｌｌ．Ｓａｌｍｏｎｅｌ　１ａまたは酵母などの適当
な真核または原核宿主中で発現せしめて、粒子として回
収することができる。

ＨＢｃＡｇをコードするＤＮＡ配列の５′末端部位に制
限酵素部位が存在する場合には、ＨＢｃＡｇを発現ずる
ことのできるプラスミドなどの発現ベクターを用いるこ
とができる。所望のＮ末端延長鎖をコードするＤＮＡ配
列を、この制限酵素部位に挿入する。Ｎ末端延長鎖を有
しＨＢｃＡｇのアミノ末端に連結した融合蛋白が発現さ
れる。

適当な発現ベクターはプラスミドｐＢｃ４０４である。

このブラスミドを有するＥ．ｃｏｌ１　（　Ｊ　Ｍ　１
０１）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　
ｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｌａｌａｎｄ　Ｍａｒ１ｎｅ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ．　Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｃ　Ｂに１９８
９年２月９日に寄託されており、受託番号ＮＣＩＢ４０
１１１が付与されている。このプラスミドは選択マーカ
ーとしてアンビシリナーゼ遺伝子をコードしており、Ｈ
ＢｃＡｇ遺伝子の上流に強力バクテリアプロモーターｔ
ａｃを持っている。また、制限酵素部位ＥｃｏＲ１及び
ＢａｍＨＩを有しているため、所望のＮ末端延長鎖をコ
ードする合或オリゴヌクレオチドを挿入することが可能
である。

本発明のフンジュゲート体は、抗原性デターミナントを
有するポリペプチドを、修正ＨＢｃＡｇのＮ末端延長鎖
中のＬｙｓ残基の側鎖アミノ基を介して、該修正ＨＢｃ
Ａｇに結合することによって調製することができる。こ
れは、アミノ基及びスルフヒドリル基に結合することの
できる２官能性試薬と修正ＨＢｃＡｇとを反応させるこ
とによって達成することができる。かくして得られる誘
導体化された修正ＨＢｃＡｇを、ポリペプチドであって
フリーのスルフヒドリル基を持っていない場合にはスル
フヒドリル基が導入されたポリペプチドと反応させる。

適当な二官能性試薬としては、例えば、ＳＭＣＣＳＭＢ
ＳＳＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などが挙げられる。二官
能性試薬は、一般に、ペプチド結合を形成する官能基と
ジスルフィドもしくはチオエステル結合を形成する官能
基とを有している。スルフヒドリル基はポリペプチド上
に存在していてもよい。この場合には、Ｎ末端呼び／又
はＣ末端のＣｙｓ残基を介して、あるいはそのアミノ基
と２−イミノチオランまたは３−（３−ジチオビリジル
）プロビオネートもしくはＳ−アセチルチオグリコール
酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応する
ことにより、ポリペプチドが修正ＨｇｃＡｇに結合され
る。Ｓ−アセチルグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（ＳＡＴＡ）との反応後、例えばヒドロ
キシアミンでＳＡＴＡをデアセチル化することによりー
ＳＨ基が得られる。

実際には、修正ＨＢｃＡｇ粒子は、ｐＨ約７のリン酸バ
ッファーなどの緩衝液中にて得られる。過剰モルの二官
能性試薬をジメチルホルムアミドなどの非プロトン性溶
媒等の不活性溶媒に溶解し、この溶液を加える。これに
よりＨＢｃＡｇ粒子の誘導体化が起こる。次いで過剰の
ポリペプチドを加えて修正ＨＢｃＡｇ粒子に結合させる
。カップリングが起こり、修正ＨＢｃＡｇ粒子にポリペ
プチドが結合したコンジュゲート体が得られ、これを濾
過などによって回収する。

修正ＨＢｃＡｇコア粒子は使用する前にカルボキシメチ
ル化することができる。これは、コア粒子上に存在する
スルフヒドリル基を誘導体化する前にブロックして、二
官能性試薬を用いてコア粒子上のＮ末端側鎖アミノ基と
ポリペプチド上の−ＳＨ基とを結合せしめる際にコア粒
子蛋白が架橋するのを防ぐためである。カルボキシメチ
ル化は、コア粒子とヨードアセタミドとを反応すること
によって達成される。過剰の試薬はゲル濾過あるいは透
析により分離することができる。

かくして得られるコンジュゲート体は、ＨＢｃＡｇ粒子
に結合したポリペプチド上に存在する抗原性デターミナ
ントに対する抗体を誘導するのに極めて有用である。従
って、このコンジュゲート体はヒトまたは動物のワクチ
ンとして用いることができる。このコンジュゲート体の
有効量をヒトあるいは動物に投与することによってワク
チン接種を行なうことができる。経口投与、あるいは皮
下、静脈、筋肉などの非経口投与により投与することが
できる。典型的には、経口あるいは非経口投与により、
１回当り１−１．０００μｇ，好まし＜１０−１００μ
ｇの投与量で投与される。

コンジュゲート体は、投与用には薬学的に許容し得る担
体もしくは希釈剤とともに製剤化される。

慣用的に用いられている剤形、担体、希釈剤を用いるこ
とができる。これらはもちろん投与ルートによって決定
することができる。適当な担体及び希釈剤としては、例
えば、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、水
酸化アルミニウム、サボニン、ＤＥＡＥ−デキストラン
、ムラミルジ．ペプチド、ミネラルオイル、ミグリオー
ルなどの中性オイル、ピーナッツオイルなどのベジタブ
ルオイル、イスコム（ｌｓｃｏａ＋ｓ）　、リボゾーム
、プルロニック（トレードマーク）ボリオール、Ｒｉｂ
１アジュバント系（ＣＢ−Ａ−２１８９１４１）などが
挙げられる。

以下の実施例により本発明を説明する。添付した図面に
はプラスミドｐＢｃ４０４が示されている。図面におい
て、ＢＳＥ及びＰはそれぞれＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ及
びＰｓｔ１部位を示し、ｔａｅはｔａｅプロモーターを
示し、ｏｒｉは複製オリジンを示し、ｂａａはβ−ラク
タマーゼを示し、ＳＤはシャインダルガーノ配列を示す
。

例１ 図面に示した親ブラスミドｐＢｃ４０４に基づいて、Ｐ
ｖコア用の発現プラスミドを作成した。

Ｐ　Ｖ　Ｉ　ＭａｈｏｎｅｙのＶＰＩ．のアミノ酸残基
９５−１０４をコードする合成オリゴヌクレオチドを、
Ｔ４リガーゼを用いてスタンダード法によりｐＢｃ４０
４に連結した。合或オリゴヌクレオチド、それらのアニ
ール化の仕方、及びＮ末端延長鎖のコード配列は以下の
通りである。

１．　ＡＡＴｒＣＡＯＡＴＡＡＴＣＣＧＧＣＴＡＧＴＡ
（ＴＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡＡＧ　（３９）２．　
ＧＡＴＣＣＴｒＡｍＡＧＴＡＣＴＡｍＡＴＩ’ＡＴＣＴ
Ｇ　（３９）−スの透析後、そのまま誘導体化に直接用
いた。

例２ １０　　　　　２０　　　　　３０　　　　　４０ＡＴ
ＧＡＡＴｒＣＡＧＡＴＡＡＴＣＣＡＣＸ：ｒ’ＡＧＴＡ
ＣＴＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ．　．
　．　：ｌ７ＭＮ　　Ｓ　ＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＤし
−一一」 リンカー　　　　　　ポリオウイルス 組換えプラスミドを保持した、バクテリア（Ｅ．ｃｏｌ
ｌ　　ＪＭ１０１）を、イソプロピルーβ−Ｄ−チオガ
ラクトビラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）６０μｇ／ｍｌを用い
て６時間発現誘導させた。細胞を遠心分離により採取し
、リゾチーム及び非イオン性洗浄剤処理により溶解した
。１００００ｒｐ−で５分間遠心してバクテリア破片を
除去した。

上清サンプルを、２０℃で５　０　０　０　０　ｒｐ謹
で１時間１５分間、１５−４５％リニアーシュクロース
グラジエントで分画した。２　６　０　ｎｍでの光学密
度により粒子を検出した。粒子を４　０　０　０　０　
ｒｐ＠で１時間遠心して濃縮した。あるいは、シュクロ
２回の連続したシュクロースを用いた分画により精製し
たｐｖコアを、ｐｌ１７．　　２の１０ａＭリン酸バッ
ファ一溶液に溶解して５ｍｇ／ｍｌの濃度で、セファデ
ックス（トレードマーク）ＧＩＯＯ力ラムに通した。次
いで１０叶リン酸バッファ一中にＰＶコアーが２■／　
ｍｓの濃度で溶解した溶液を用いて、これに、ドライジ
メチルホルムアミドに溶解した１／２０容量のＳＭＣＣ
を加えてＰＶコアサンプル中でのＳＭＣＣの終濃度がＰ
ｖコア蛋白に対して５０倍モル過剰となーるようにして
、誘導体化を実施した。

室温で３０分後、ｐＨ７．２の１０−Ｍリン酸バッファ
一中のセファデックスＧ１００に通して濾過してＳＭＣ
Ｃを除去した。新たに溶解したＦＭＤＶ１４１−１６０
Ｃｙｓをｌ／１０容量で加えて、誘導体化したＰｖコア
に対して１０倍モル過剰となるようにした。室温で２時
間撹拌後、未結合のペプチドを、セファデックスＧ２０
０を用いた濾過により誘導体化したＰｖコアから分離し
た。ペプチドが結合したＰｖコアを回収した。

例３ ＨＲＶ２ペブチドへのＰｖコアの結合 例２に記載された方法に従って、Ｎｌｎ−ｎエピトープ
を含有し以下のアミノ酸配列を有するＨＲＶ２ベプチド
をＲＶコアに結合した。

ＶＫＡＥＴＲＬＮＰＤＬＱＰＴＣ ＨＲＶ２ベブチドが結合したＰｖコアを回収した。

例４ Ｐｖコアのカルボキシメチル化 シュクロースを透析し、遠心により濃縮後、ＰＶコアを
２００μｇ／ｍｌの量で、暗所中で室温で１時間、ｐＨ
８．　０の０．　５Ｍ　　Ｔｒｌｓに溶解した１０ｓＭ
ヨードアセトアミドと反応させた。ゲル濾過により過剰
の試薬をカルボキシメチル化Ｐｖコアから除去した。

例５ 例４で得られたカルボキシメチル化Ｐ■コアを、等モル
量のＳＭＣＣを溶解したジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）溶液で誘導体化した。ＳＭＣＣの量はＤＭＦのｌ／２
０の量であった。酵母中で発現Ｌ，たＨＢｓ＋Ａｇ粒子
を２　０　０　ｐｇ　／ｍｌｌ度で、Ｓーアセチルチオ
グリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（
ＳＡＴＡ）を用いてＤＭＦ中で等モル比で誘導体化した
。ＳＡＴＡの量はＤＭＦの量のｌ／２０であった。ヒド
ロキシアミンでＳＡＴＡをデアセチル化してフリーのー
ＳＨ基を得た後、２つの誘導体化粒子の等量（それぞれ
２００μｇ／ｍｌ）を混合した，ＨＢｓＡｇが結合した
ｐｖコアを回収した。

例６ ＦＭＤＶペプチド及びＨＲＶ２ペプチドのカルボキシメ
チル化Ｐｖコアへの結合 例５に記載された方法に従って、ＦＭＤＶ１４１−１６
０Ｃｙｓペプチドをカルボキシメチル化Ｐｖコアに結合
した。別の実験では、例３で記載したＨＲＶ２ペプチド
を同様にしてカルボキシメチル化Ｐｖコアに結合した。

しかしながら、両者の場合には、誘導体化は、ｐ１１７
．　８の５０一Ｍリン酸バッファ一中で行ない、誘導体
化後できるだけ早くマレイミド基を安定化させるために
ｐＨ６．　８の５０ｌＭリン酸バッファ一中に移した。

例７ 例２及び６で得られた、ＦＭＤｖベブチドが結合したＰ
ｖコア、及び例３及び６で得られた、ＨＲＶ２ペプチド
が結合したＰｖコアの分析テストを次のようにして実施
した。

（ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動これによって、
すべてのコア蛋白は、ペプチ〆の付加により、高分子量
側ヘシフトしたことが示された。

（ｂ）ウエスタンブロッティング ゲル電気泳動後、蛋白をニトロセルロースへ移し、抗コ
ア抗血清あるいは抗ベブチド抗血清と反応させた。得ら
れた結果により、結合後に得られたより高分子量の蛋白
が期待通りに両者の抗血清と反応したことが示された。

（ｃ）ＥＬＩＳＡ 人ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートに結合した抗コア血清を用い
て誘導体化コア粒子をトラップするサンドイッチ法によ
りアッセイを実施した。テスト後抗ペプチド抗血清と反
応させた。これにより、誘導体化拉子はコア抗原性とべ
ブチド抗原性の両者を有していた。

−ｔＨＲＶ２ペプチド配列がコア蛋白のＮ末端に融合し
た融合コア粒子に対する抗ＨＲＶ２ペブチド抗血清、及
びＨＲＶ２ベプチドが結合したＰｖコアに対する抗ＨＲ
Ｖ２ベプチド抗血清の力価をＥＬＩ　ＳＡにより測定し
た所、同じ結果が得られた。このアッセイでは、上記の
２つの粒子については同じ量を用いたため、Ｎ末端融合
粒子と化学結合した粒子の抗原性活性は実質的に同じで
あった。抗ＨＲＶ２ペプチド抗血清は、例３及び６のＨ
ＲＶ２ペプチドに対して誘導された抗血清である。

（ｄ）シュクロース密度グラジエント この分析により、ＦＭＤｖペプチドがコアに結合して粒
子凝集が起こったことが示された。これらはチューブの
底にペレット化した。ＨＲＶペブチドが結合したＰｖコ
アは、未処理コアと同様の位置に沈降し、ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａによる分析結果から、コア免疫原住及びペブチド免疫
原性の両者を有していた。

（ｅ）電子顕微鏡 ＨＲＶ２ペプチドが結合したＰｖコアを調べた所、規則
正しい粒子が蜆察された。ＨＲＶ２ペブチドに結合した
Ｐｖコアと抗ＨＲＶ２ペプチド抗血清との間で形威され
た免疫複合体を電子顕微鏡で調べた所、コア粒子は抗体
によって結合していることが判った。

（ｆ）免疫原性 人コアに結合したＦＭＤＶ粒子は２０μｇ以下で（ペプ
チドの２μｇ以下）中和活性を有していた。

ＪｌＨＲＶ２ペプチドＮ末端融合コア粒子及び化学的結
合粒子の免疫原性活性を、それぞれ２０μｇをギニアビ
ッグに投与して比較した。インジエクション後の各種時
間で、ＨＲＶ２ペプチドに対する抗血清をＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａによりテストした。結果は以下の通りである。

口数　　化学的結合コア　　融合コア ０　　　　　　＜１　　　　　　　＜１１４　　　　　
２．９　　　　　　２．３２８　　　　　３．９　　　
　　　３．３５６　　　　　３．　９　　　　　４．　
０６３　　　　　４．１　　　　　　３．９７０　　　
　　４．１　　　　　　３．９８４　　　　　４．２　
　　　　　３．９不完全フロイントアジュバントに溶解
して筋注投与した。

例８ ＦＭＤＶタンデムリピートペブチドの調製以下に示すペ
ブチドを固相法により合威した。

より具体的には、Ｈｏｖｇｌ＋ｔｅｎ，　Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　８２．　
　５１３１−５１３５．　　１９８５に記載されたＭｅ
ｒｒｉ　ｒ　ｌｅｌｄ法（ＭｅｒｒＲＩｅｌｄ．ＪＡＣ
Ｓ　８５，　２１４９−２１５４．　１９６３）の応用
法を用いて合成を行なった。それぞれのペプチドは、ペ
プチド１９９を除いてそのＣ末端に非天然性システイン
残褪を付加的に有している。ペプチド１９９はＣ末端に
非天然性のグリシン残基を有している。

それぞれのべブチドはｐ−メチルベンズヒドリルアミン
ジビニルベンゼン樹脂上で合成した。それぞれのアミノ
酸のアルファアミノ保２！基は１−プトキシ力ルボニル
（Ｂｏｃ）を用いた。それぞれのカップリング反応サイ
クルは次の通りである。

ｌ．ジクロロメタンにより樹脂の洗浄−１０分間２６５
％ジイソプロビルエチルアミンのジクロロメタン溶液に
よる洗浄−２分間×３ ３．ジクロロメタン洗浄−１分間×２ ？ｔ−プトキシ力ルポニルアミノ酸のジクロロメタン溶
液と０．３Ｍジイソプロビルカルボジイミドを用いたカ
ップリングー６０分間５．土記３と同じ ８．５０％トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用
いた脱保護−２０分間 ７．ジクロロメタン洗浄−１分間×６ ８．土記２へ戻る。

カップリングサイクルが完了した時に、アニソールスカ
ベンジャ−１０％とともに水素化フルオライドを用いて
１時間処理してペブチドを樹脂から解離させた。かくし
て、、カルボキシ末端にアミド基を有するペプチドが得
られた。次いでエーテルで洗浄して乾燥し、１５％酢酸
中に溶解して凍結乾燥した。

ウイルス　　　　　　　ペプチド　　　　　　　ＮａＦ
ＭＤＶ　　　　１３７−１８２−１３７−１０２−Ｃｙ
ｓ　　　　　　　　１９８０／Ｏ　　　Ｏ１０■ １１ （ＮＲＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＡＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬＰ
ＴＳ）　ｘ２　ＣＦＭＤＶ Ｏ１／Ｏ１ ＦＭＤＶ １３７−１０２−１３７−１［ｉ２−Ｇ　Ｉｙ　　　　
　　　　　　１９　９０１０１ （ＮＲＮＡＶＰＮＬＩ？ＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡｌ？Ｔ
ＬＰＴＳ）　，Ｇ１３７−１０２−１３７−１０２−Ｃ
ｙｓ　　　　　　　　　　３１５？■／０１０ｌＯ１ （ＮＲＮＡＶＰＮＩＪ？ＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬ
Ｐ′ｒＳ）　ｘ２Ｃ？ＭＤＶ　　　　１３７−１８２−
１３７−１６２−Ｃｙｓ　　　　　　　　　３１８ＡＢ
／ＡＢＡＡ １２　　　　１２　　　　　　１２　　　　　　１２（
ＹＳＡｇ：ＪＶＲＧＤＬＧＳＬＡＰＲＶＡＲＱＬＰＡＳ
）　，■ＣＦＭＤＶ　　　　１４５−１５０−１４５−
１５０−１４５−１８０−ＣｙｓＯｌ／Ｏｌ／０１０ｌ
ＯｌＯＩ ＲＣＤＬＱＶＲＣＤＩ，ＱＶＥＤ！，ＱＶＩ．ＡＱＫＶ
ＡＴ？ＴＬＰＣＦＭＤＶ　　　　１４５−１５０−１４
５−ＩＧＯ−ＣｙｓＯ／０００ １１１１ ＲＧＤＬＱＶＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＩ？ＴＬＰＣ１
１２ １１３ 例９ ＦＭＤＶ混合セロタイプタンデムリピートベプチドの調
製 例８に記載した固相法により以下のべブチドを合成した
。

ウイルス ＦＭＤＶ Ｏ１／Ａ１２Ｂ ベプチド １３７−１０２−１３７−１８２−Ｃｙｓ０　ｔ　　Ａ
　１２　Ｂ Ｎｏ． ３１６ ＦＭＤＶ １３７−１［ｉ２−１３７−１０２−Ｃｙｓ３１７ ？１２Ｂ／０■ Ａｌ２Ｂ　Ｏｌ 例１０ ＶＰ２アミノ酸残基１５６−１７０を含む特λ的Ｎ末端
ＨＲＶ２　　ＶＰ２エピトープをコードするキメラ融合
粒子を構築するために、５′末端にＥｃｏＲＩ及び３′
末端にＢａｍＨＩ用の粘着末端を有する合成オリゴヌク
レオチドをＡｐｐ１　１ｅｄＢｌｏｓｙｓｔｅｍｓ　　
３　８１　Ａ　　Ｄ　Ｎ　Ａシンセサイザーにより調製
した。これらのオリゴヌクレオチドを、ＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩで消化して１％低融点アガロースでスタンダー
ド法Ｐｒａｎｃｌｓ　ａｎｄ　Ｃｌａｒｋｅ．Ｍｅｔｈ
．　ｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　１７８，　　６５．９
−６７６．　　１９８９）により精製したｐＢｃ４０４
に連結した。

次いでこのＤＮＡをＥ．ｃｏｌＩ　　ＪＭＩＯＩ株に導
入し、小スケールＤＮＡ調製品から制限酵素マップを作
成した。合成オリゴヌクレオチド、これらのアニール化
の仕方、及びＮ末端延長鎖のコード配列は以下に示した
通りである。

ＧＣ’［ＴＡ１１１ｍＣＣ　Ｃ’ｒＡＧＡＴＧ　ＡＡＴ
　ＴＣＡ　０１丁ＡＡＡ　ＧｃＧＧＡＡ　Ａｃｅ　ＣＧ
Ｔ　ＴｒＧ　ＡＡＣ　ＣＣＡ　ＧＡＴＧＯ 口”Ｇ　ＣＡＡα刀＾ＣＣ　ＧＡＡ　ＴＧＣ　ＣＧＧ　
ＧＡＴの．．．．コア組換えブラスミドを有するバクテ
リアをＬ−Ａｍｐ培地中で一晩高細胞密度になるまで成
育せしめて、次の日に新鮮なＬ−プロース（１：１０）
で希釈した。ＩＰＴＧ（終濃度６０ｕｇ／ｍｌ）を添加
して発現を誘導し、更に３７℃で６−８時間複製させた
。次いでバクテリアを採取し、Ｎ末端ペブチドエピトー
プを有するキメラコア粒子を精製し、公知の方法（Ｃｌ
ａｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ３３０，３８１
−３８３，１９８７　；Ｐｒａｎｅ１ｓａｎｄ　Ｃｌａ
ｒｋｅ．　　１　９　８　９　）でその特性を調べた。

例１１ ＨＢｓＡｇのＨＲＶ２コアへの結合 ４． 例１０のＨＲＶ２コアを等モル量のＳＭＣＣを含むＤＭ
Ｆ溶液で誘導体化した。ＳＭＣＣの量はＤＭＦｆｉのｌ
／２０であった。酵母中で発現されたＨＢｓＡｇを２　
０　０．ｕｇ　／ｍｌの濃度で、等モル比のＤＭＦ中に
溶解したＳＡＴＡで誘導体化した。

ＳＡＴＡの量はＤＭＦ量のｌ／２０であった。ヒドロキ
シアミンでＳＡＴＡをデアセチル化してフリーのーＳＨ
基を得た後、等量の２つの誘導体化粒子（それぞれ２０
０μｇ／ｍｌ）を混合した。

ＨＢｓＡｇが結合したＨＲＶ’：２コアを回収した。

【図面の簡単な説明】

第１図はブラスミドｐＢｃ４０４の構成を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原性エピトープを有するポリペプチドを保持し
   たＢ型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）粒子であっ
   て、該ＨＢｃＡｇ粒子はＬｙｓ残基を有するＮ末端延長
   鎖を備えたＨＢｃＡｇから構成されており、該ポリペプ
   チドは該Ｌｙｓ残基の側鎖アミノ基を介して該粒子に結
   合している上記ＨＢｃＡｇ粒子。
2. （２）該ポリペプチドが、中和抗体を誘導できる抗原性
   エピトープを持つポリペプチドである請求項１の粒子。
3. （３）該エピトープが、ウィルス、バクテリアまたはプ
   ロトゾアのエピトープである請求項２の粒子。
4. （４）該ポリペプチドが、５０個までのアミノ酸残基か
   らなる長さのポリペプチドである請求項１から３のいず
   れかの粒子。
5. （５）該Ｎ末端延長鎖が、６０個までのアミノ酸残基か
   らなる長さのものである請求項１から４のいずれかの粒
   子。
6. （６）該Ｎ末端延長鎖が、タイプ１のポリオウイルスの
   ＶＰ１キャプシド蛋白のアミノ酸残基９５−１０２のア
   ミノ酸配列、あるいはヒトライノウイルス（ＨＲＶ）タ
   イプ２のＶＰ２キャプシド蛋白のアミノ酸残基１５６−
   １６４のアミノ酸配列もしくは他のＨＲＶのそれと等価
   のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む請求項１か
   ら５のいずれかの粒子。
7. （７）Ｎ末端延長鎖を備えたＨＢｃＡｇがカルボキシメ
   チル化されている請求項１から６のいずれかの粒子。
8. （８）抗原性エピトープを有するポリペプチドを保持し
   たＨＢｃＡｇ粒子の調製法であって、さらされたＬｙｓ
   残基を有するＮ末端延長鎖を備えたＨＢｃＡｇから構成
   されるＨＢｃＡｇ粒子に、該Ｌｙｓ残基の側鎖アミノ基
   を介して該ポリペプチドを結合させることを特徴とする
   上記調製法。
9. （９）Ｎ末端延長鎖を備えたＨＢｃＡｇを、該ポリペプ
   チドに結合する前に、カルボキシメチル化する請求項８
   の調製法。
10. （１０）活性成分としての、請求項１から７のいずれか
    のＨＢｃＡｇ粒子あるいは請求項８もしくは９の調製法
    によって得られたＨＢｃＡｇ粒子であって抗原性エピト
    ープを有するポリペプチドを保持したＨＢｃＡｇ粒子、
    及び薬学的に許容し得る担体もしくは希釈剤を含有する
    薬学的組成物。