JP2023529026A - Ｍｈｃ－ｉ発現を調節するための方法及びその免疫療法の使用 - Google Patents

Ｍｈｃ－ｉ発現を調節するための方法及びその免疫療法の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、部分的に、がん細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ発現を調節するための組成物及び方法に関する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１日に出願された米国仮特許出願第６３／０３２，９５６号、及び２０２０年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０３９，２１１号の優先権の利益を主張し、各出願の全内容が、この参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
大きなファイル
本出願には、付属の４つの長い表の完全な内容が含まれ、これらの全ては、以下のようなＡＳＣＩＩテキストファイルである。２０２０年６月１５日に作成された３４８，５３１バイトサイズの「表＿１＿ＣＲＩＳＰＲ＿Ｐｏｓｉｔｉｖｅ．ｔｘｔ」として本明細書とともに提出される表１、２０２０年６月１５日に作成された２９２，３１８バイトサイズの「表＿２＿ＣＲＩＳＰＲ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ．ｔｘｔ」として本明細書とともに提出される表２、２０２０年６月１２日に作成された５８１，２９９バイトサイズの「表＿３＿ＯＲＦ＿Ｐｏｓｉｔｉｖｅ．ｔｘｔ」として本明細書とともに提出される表３、２０２０年６月１２日に作成された８５５，６２９バイトサイズの「表＿４＿ＯＲＦ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ．ｔｘｔ」として本明細書とともに提出される表４。これら４つの表の全ては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
政府権利の陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号Ｒ３５ ＣＡ２３２１２８、Ｐ０１ ＣＡ２０３６５５、Ｒ２１ ＣＡ２１６７７２、ＮＣＩ－ＳＰＯＲＥ－２Ｐ５０ＣＡ１０１９４２－１１Ａ１、Ｒ０１ ＣＡ１５５０１０、Ｕ２４ ＣＡ２２４３３１、及びＲ０１ ＨＬ１３１７６８に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
ウイルスは、免疫系の認識を回避する一連の機構を用い、未検出の感染及び複製を可能にする。ウイルス免疫回避のための一般的な標的は、ペプチドプロセシング（ＰＳＭＢ８／ＬＭＰ２、ＰＳＭＢ９／ＬＭＰ７）、細胞質からＥＲへのペプチド輸送（ＴＡＰ１、ＴＡＰ２）、及びＢ２Ｍ－ＨＬＡ Ｉ重鎖（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）複合体へのペプチド装填を含む、いくつかのステップの協調機能を必要とする、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ Ｉ又はＭＨＣ Ｉ）抗原提示経路である。この経路を妨害し、ウイルス抗原提示を回避するために、ウイルスは、他の機構の中で、ＥＲ（ＣＭＶ）へのＨＬＡ Ｉ重鎖挿入を遮断するか、プロテアソーム分解（ＥＢＶ）に抵抗するか、ＴＡＰ（ヘルペスウイルス）を妨害するか、又はＨＬＡ分子（ＨＩＶ）のトラフィッキング及びターンオーバーを変調する。ウイルスが免疫認識を回避するこれらの戦略は、ウイルス学及びがんに関連するクラスＩの提示及び制御の機構を明らかにすることができる。
例えば、稀で侵襲性の高い神経内分泌皮膚がんであるメルケル細胞がん（ＭＣＣ）は、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＰｙＶ）が、ＭＣＣの症例の８０％の原因物質であるため、これらの疑問を調査するための興味深い設定を提示する。ＭＣＰｙＶは、２つのウイルス抗原：ＲＢに結合し、不活性化するＬＴ、及びクロマチン修飾複合体へのＭＹＣＬの動員を含む、多数の新たな機能を有するＳＴのみからなる。注目すべきことに、ＭＣＣは、一般的に低ＨＬＡ Ｉ発現を示すが、これが媒介される機構は不明である。免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、ＭＣＣ病変の８４％が、表面ＨＬＡ Ｉ下方制御又は喪失を呈することが報告されており、同様の所見がＭＣＣ細胞株において観察されている。しかしながら、ＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉ表面発現もまた、インターフェロン又はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤によってインビトロで上方制御され得るため、高度に可塑性であるように見える。したがって、がん細胞におけるＨＬＡ発現を増加させるために、治療戦略が緊急に必要である。
本発明は、少なくとも部分的に、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、ＭＹＣＬ又は１つ以上のＰＲＣ１．１複合体メンバー（ＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、及びＵＳＰ７など）の阻害又は遮断は、がん細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子、例えば、ＨＬＡ Ｉ分子の発現の増加をもたらすという発見に基づいている。本発明は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、ＭＹＣＬ及び／又は１つ以上のＰＲＣ１．１複合体メンバー（例えば、ＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、及びＵＳＰ７）の調節（例えば、上方制御又は下方制御）を伴い、ＨＬＡ Ｉ分子などのＭＨＣクラスＩ分子の、がん細胞上での表面発現を増加させる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの高スループットスクリーニングシステム及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）スクリーニングを使用して、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、ＭＹＣＬ及び／又は１つ以上のＰＲＣ１．１複合体メンバー（例えば、ＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、及びＵＳＰ７）は、調節されると、免疫療法に対してがんを感作させる標的として特定されている。例えば、メルケル細胞がんなどのがんにおいて、ＨＬＡ ＩなどのＭＨＣクラスＩは、対照と比較して表面発現が低減し、ＰＲＣ．１．１成分ポリペプチド又はＭＹＣＬなどの標的を阻害すると、ＨＬＡ ＩなどのＭＨＣクラスＩの発現が増加し、それにより、これらの細胞の免疫療法に対する感受性が増加することが本明細書で実証される。表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、ＭＹＣＬ及び／又は１つ以上のＰＲＣ１．１複合体メンバー（例えば、ＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、及びＵＳＰ７）の阻害が、ＨＬＡ ＩなどのＭＨＣクラスＩの表面発現を増加させることができることを検証する機能的データが、本明細書に提示される。したがって、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、ＭＹＣＬ及び／又は１つ以上のＰＲＣ１．１複合体メンバー（例えば、ＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、及びＵＳＰ７）の調節因子は、特にがんに罹患した患者において、ＭＨＣクラスＩの発現を調節し、かつ免疫応答を調節する（例えば、免疫応答を増加又は減少させる）ために有用であり、同時免疫療法の設定において、がんを治療するための新規の戦略を表す。
本発明の一態様は、がんに罹患している対象を治療する方法であって、対象に、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を修飾する治療有効量の薬剤、並びに免疫療法を投与することを含む、方法を提供する。
本発明の任意の態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わされ得る多数の実施形態が更に提供される。例えば、一実施形態では、薬剤は、表１若しくは４に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を減少させる。別の実施形態では、薬剤は、ＭＹＣＬポリペプチド及び／若しくはポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチド、又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数、発現レベル、及び／又は活性を減少させる。なお別の実施形態では、ポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチドは、ＵＳＰ７、ＢＣＯＲＬ１、ＰＣＧＦ１、ＫＤＭ２Ｂ、ＳＫＰ１、ＲＩＮＧ１Ａ、ＲＩＮＧ１Ｂ、ＲＹＢＰ、ＹＡＦ２、及び／又はＢＣＯＲである。更に別の実施形態では、薬剤は、小分子阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド若しくはペプチド模倣薬阻害剤、アプタマー、抗体、又はイントラボディである。別の実施形態では、ＲＮＡ干渉剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である。なお別の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、表１～４に列挙される核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。更に別の実施形態では、薬剤は、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される１つ以上のバイオマーカー及び／又は当該１つ以上のバイオマーカーの基質に特異的に結合する、イントラボディ又はその抗原結合断片を含む。別の実施形態では、イントラボディ又はその抗原結合断片は、マウス、キメラ、ヒト化、複合体、若しくはヒトイントラボディ、又はその抗原結合断片である。別の実施形態では、イントラボディ又はその抗原結合断片は、検出可能に標識されており、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／又はＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディ断片からなる群から選択される。別の実施形態では、薬剤は、表２若しくは３に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を増加させる。なお別の実施形態では、薬剤は、免疫療法に対するがん細胞の感受性を増加させる。更に別の実施形態では、免疫療法は、薬剤の前、後、又は薬剤と同時に投与される。なお別の実施形態では、免疫療法は、抗がんワクチン及び／又はウイルスを含む。別の実施形態では、免疫療法は、細胞ベースの免疫療法であり、任意に、細胞ベースの免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）療法である。更に別の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイントを阻害する。なお別の実施形態では、免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、及びＡ２ａＲからなる群から選択される。別の実施形態では、免疫チェックポイントは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２からなる群から選択され、任意に、免疫チェックポイントは、ＰＤ－１である。更に別の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーは、表５に列挙される核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、かつ／又は表５に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。別の実施形態では、対象は、哺乳動物である。更に別の実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、又は家畜化哺乳動物である。更に別の実施形態では、薬剤は、免疫療法に対するがんの感受性を増加させ、任意に、（ｉ）免疫療法は、Ｔ細胞媒介であり、かつ／又は（ｉｉ）薬剤は、がん細胞を含む腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の量を増加させる。別の実施形態では、薬剤は、がん細胞の表面上のＭＨＣ－Ｉのレベルを増加させる。別の実施形態では、方法は、対象に、少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンを投与することも含む。更に別の実施形態では、少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンは、薬剤及び／又は免疫療法の前、後、又は同時に投与される。更に別の実施形態では、薬剤は、薬学的に許容される製剤で投与される。なお別の実施形態では、がんは、神経内分泌がんである。なお別の実施形態では、神経内分泌がんは、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がんである。
別の態様は、がん細胞における主要組織適合性複合体の発現を増加させる方法を提供し、当該方法は、がん細胞を、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を調節する薬剤と接触させることを含み、任意に、がん細胞、又はがん細胞及び免疫細胞を含む細胞の集団を、免疫療法と接触させることを更に含む。
本発明の任意の態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わされ得る多数の実施形態が更に提供される。一実施形態では、表１又は４に列挙される１つ以上のバイオマーカーのコピー数、発現レベル、及び／又は活性を減少させる薬剤。別の実施形態では、薬剤は、ＭＹＣＬポリペプチド及び／若しくはポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチド、又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピー数、発現レベル、及び／又は活性を減少させる。更に別の実施形態では、ポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチドは、ＵＳＰ７、ＢＣＯＲＬ１、ＰＣＧＦ１、ＫＤＭ２Ｂ、ＳＫＰ１、ＲＩＮＧ１Ａ、ＲＩＮＧ１Ｂ、ＲＹＢＰ、ＹＡＦ２、及び／又はＢＣＯＲである。なお別の実施形態では、薬剤は、小分子阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド若しくはペプチド模倣薬阻害剤、アプタマー、抗体、又はイントラボディである。一実施形態では、ＲＮＡ干渉剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である。別の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、表１～４に列挙される核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。更に別の実施形態では、薬剤は、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される１つ以上のバイオマーカー及び／又は当該１つ以上のバイオマーカーの基質に特異的に結合する、イントラボディ又はその抗原結合断片を含む。更に別の実施形態では、イントラボディ又はその抗原結合断片は、マウス、キメラ、ヒト化、複合体、又はヒトイントラボディである。一実施形態では、イントラボディ又はその抗原結合断片は、検出可能に標識されており、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／又はＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディ断片からなる群から選択される。別の実施形態では、薬剤は、表２又は３に列挙される１つ以上のバイオマーカーのコピー数、発現レベル、及び／又は活性を増加させる。更に別の実施形態では、薬剤は、免疫療法に対するがん細胞の感受性を増加させる。更に別の実施形態では、がん細胞は、薬剤の前、後、又は薬剤と同時に免疫療法と接触する。なお別の実施形態では、免疫療法は、抗がんワクチン及び／又はウイルスを含む。別の実施形態では、免疫療法は、細胞ベースの免疫療法であり、任意に、細胞ベースの免疫療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）療法である。別の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイントを阻害する。更に別の実施形態では、免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、及びＡ２ａＲからなる群から選択される。なお別の実施形態では、免疫チェックポイントが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される。更に別の実施形態では、免疫チェックポイントは、ＰＤ－１である。別の実施形態では、バイオマーカーは、表５に列挙される核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、かつ／又は表５に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。更に別の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーは、ヒト、マウス、キメラ、又は融合バイオマーカーである。別の実施形態では、免疫療法は、（ｉ）Ｔ細胞媒介性であり、かつ／又は（ｉｉ）薬剤は、がん細胞を含む腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の量を増加させる。更に別の実施形態では、薬剤は、がん細胞におけるＭＨＣクラスＩ表面発現のレベルを増加させる。なお別の実施形態では、方法は、対象に、少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンを投与することを更に含む。別の実施形態では、少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンは、薬剤及び／又は免疫療法の前、後、又は同時に投与される。別の実施形態では、薬剤は、薬学的に許容される製剤で投与される。一実施形態では、がん細胞は、神経内分泌がん細胞である。別の実施形態では、神経内分泌がん細胞は、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がん細胞である。
本発明の別の態様は、表１、２、３、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を調節することによって治療することができるがんに罹患しているか、又はそれを発症するリスクのある対象を特定する方法であり、当該方法は、対照と比較した対象からの細胞における主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ発現の増加又は減少レベルを検出することと、それによって、表１、２、３、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を調節することによって治療することができるがんに罹患しているか、又はそれを発症するリスクのある対象を特定することと、を含み、任意に、対象由来の細胞を含む生体試料は、対象から得られる。
本発明の任意の態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わされ得る多数の実施形態が更に提供される。一実施形態では、薬剤は、表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を減少させる。別の実施形態では、方法はまた、表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーを阻害する薬剤を、特定された対象に推奨すること、処方すること、又は投与することを含む。更に別の実施形態では、薬剤は、表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を増加させる。別の実施形態では、本方法は、特定された対象に、免疫療法を推奨する、処方する、又は投与することを更に含む。一実施形態では、免疫療法は、抗がんワクチン、抗がんウイルス、及び／又はチェックポイント阻害剤を含む。別の実施形態では、方法は、対象に、標的療法、化学療法、放射線療法、及び／又はホルモン療法からなる群から選択されるがん療法を推奨すること、処方すること、又は投与することを更に含む。更に別の実施形態では、対照は、患者又は当該患者が属する同じ種のメンバーのいずれかに由来する、がん性又は非がん性試料に由来する試料を含む。なお別の実施形態では、対照は、既知の参照値である。一実施形態では、がんは、神経内分泌がんである。別の実施形態では、神経内分泌がんは、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がんである。
別の態様では、表１、２、３、４、若しくは５に列挙された１つ以上のバイオマーカー又はその断片を発現するがんに罹患している対象の、免疫療法による治療に対する臨床転帰を予測するための方法が提供され、当該方法は、ａ）対象試料中の表１、２、３、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を決定することと、ｂ）良好な臨床転帰を有する対照中の少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を決定することと、ｃ）対象試料中及び対照中の少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を比較することと、を含み、対照中のコピー数、量、及び／又は活性を比較した、対象試料中の表１、２、３、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性の存在又はわずかな変化は、対象が不良な臨床転帰を有することを示す。
別の態様は、表１若しくは４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数及び／若しくは量を減少させ、かつ／又は活性を阻害する薬剤と、免疫療法とで、がんを有するか、又はがんを有する疑いのある対象の治療を監視するための方法を提供し、当該方法は、第１の時間点での対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現のレベル、及びその後の時間点での対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現のレベルの変化又は変化がないことを検出し、それによって、対象の治療を監視することを含む。
更に別の態様は、表２若しくは３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数及び／若しくは量を増加させ、かつ／又は活性を阻害する薬剤と、免疫療法とで、がんを有するか、又はがんを有する疑いのある対象の治療を監視するための方法を提供し、当該方法は、第１の時間点での対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現のレベル、及びその後の時間点での対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現のレベルの変化又は変化がないことを検出し、それによって、対象の治療を監視することを含む。
なお別の態様では、方法は、対象における表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を減少させる薬剤の有効性を評価するために提供され、当該方法は、対象の試料において、第１の時間点で、その後の時間点と比較した表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性の変化又は変化がないことを検出することを含み、表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性の減少は、薬剤が有効であることを示す。
別の態様は、対象における表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を増加させる薬剤の有効性を評価する方法を提供し、当該方法は、対象の試料において、第１の時間点で、その後の時間点と比較した表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性の変化又は変化がないことを検出することを含み、表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性の減少は、薬剤が有効であることを示す。
本発明の任意の態様に適用され得、かつ／又は本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わされ得る多数の実施形態が更に提供される。一実施形態では、第１の時間点と、その後の時間点との間で、対象が、がんの治療を受けた、治療を終了した、かつ／又は寛解中である。別の実施形態では、治療は、薬剤を対象に投与することを含む。更に別の実施形態では、第１及び／又はその後の試料は、エクスビボ又はインビボ試料を含む。なお別の実施形態では、第１及び／又は少なくとも１つのその後の試料は、対象から得られる単一試料又はプールされた試料の一部である。別の実施形態では、試料は、対象から得られた細胞、血清、腫瘍周辺組織、及び／又は腫瘍内組織を含む。更に別の実施形態では、表１、２、３、４、又は５に列挙される１つ以上のバイオマーカー。一実施形態では、がん又はがん細胞は、神経内分泌がんである。別の実施形態では、神経内分泌がんは、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がんである。更に別の実施形態では、がん又はがん細胞は、がんの動物モデルにある。なお別の実施形態では、動物モデルは、マウスモデルである。一実施形態では、がんは、哺乳類対象にある。別の実施形態では、哺乳類対象は、マウス又はヒトである。更に別の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
上述の態様及び実施形態は、免疫療法と組み合わせて阻害することが、免疫療法単独で観察されるかかる利益の欠如を考慮して予期しないがんを治療するための相乗的治療利益をもたらす、表１、４、及び５に列挙されるものなどの本発明のバイオマーカーの代表的な実施形態を提供するが、免疫療法と組み合わせて、阻害よりもむしろ発現の促進（例えば、枯渇させるよりもｓｇＲＮＡスクリーニングで濃縮されるように識別される）が、がんを治療するための相乗的治療利益をもたらす、本明細書（特に表１、４、及び５）で明確に記載される特定のバイオマーカーが容易に明らかである。したがって、本明細書及び上記に記載される任意の態様及び実施形態は、免疫療法及びがんに関する診断的、予後的、治療的等の用途において、かかるバイオマーカー及びそれらの促進された発現を使用することができる。例えば、一態様では、免疫療法と組み合わせて、表１、４、若しくは５に列挙される１つ以上のかかるバイオマーカー、又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を阻害するよりもむしろ促進する薬剤とがん細胞を接触させることを含む、がん細胞を死滅させる方法が提供される。別の代表的な態様では、がんに罹患しているか、又はがんを発症する危険性のある対象が、表１、４、又は５に列挙されるかかる少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を促進することから利益を受けるかどうかを決定する方法が提供され、この方法は、ａ）対象から生体試料を得ることと、ｂ）表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を決定することと、ｃ）対照における少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を決定することと、ｄ）ステップｂ）及びｃ）で検出された少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を比較することと、を含み、対照の少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性と比較して、対象試料における表１、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性の不在又は著しい減少は、がんに罹患しているか、又はがんを発症する危険性のある対象が、表１、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を促進することから利益を得るであろうことを示す。
更に、上述の態様及び実施形態は、免疫療法と組み合わせて促進することが、免疫療法単独で観察されるかかる利益の欠如を考慮して予期しないがんを治療するための相乗的治療利益をもたらす、表２及び３に列挙されるものなどの本発明のバイオマーカーの代表的な実施形態を提供するが、免疫療法と組み合わせて、促進よりもむしろ発現の阻害（例えば、枯渇させるよりもｓｇＲＮＡスクリーニングで濃縮されるように識別される）が、がんを治療するための相乗的治療利益をもたらす、本明細書（特に表２及び３）で明確に記載される特定のバイオマーカーが容易に明らかである。したがって、本明細書及び上記に記載される任意の態様及び実施形態は、免疫療法及びがんに関する診断的、予後的、治療的などの用途において、かかるバイオマーカー及びそれらの促進された発現を使用することができる。例えば、一態様では、免疫療法と組み合わせて、表２若しくは３に列挙される１つ以上のかかるバイオマーカー又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を阻害するよりもむしろ促進する薬剤とがん細胞を接触させることを含む、がん細胞を死滅させる方法が提供される。別の代表的な態様では、がんに罹患しているか、又はがんを発症する危険性のある対象が、表２又は３に列挙されるかかる少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を促進することから利益を受けるかどうかを決定する方法が提供され、この方法は、ａ）対象から生体試料を得ることと、ｂ）表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を決定することと、ｃ）対照における少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を決定することと、ｄ）ステップｂ）及びｃ）で検出された少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を比較することと、を含み、対照の少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性と比較して、対象試料における表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性の不在又は著しい減少は、がんに罹患しているか、又はがんを発症する危険性のある対象が、表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を促進することから利益を得るであろうことを示す。
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ＭＣＣの古典的な特徴を示し、それらの対応する元の腫瘍を再現する患者由来ＭＣＣ株の生成を示す。［図１Ａ］ＭＣＣ－３３６細胞株における細胞培養培地の最適化を示すグラフである。細胞は、０、４、及び７日目にカウントした。 ＭＣＣマーカーＳＯＸ２及びＣＫ２０の染色を有するＭＣＣ細胞株の免疫組織化学を示す画像である。１つの代表的なウイルス陽性（ＭＣＣ－２７７）及びウイルス陰性（ＭＣＣ－３５０）株を示す。 古典的なＭＣＣマーカーＳＯＸ２及びＣＫ２０に対する染色を用いて、新たに生成されたＭＣＣ細胞株のうちの９つに対する免疫組織化学を示す画像を含む。 ビルパネル（ｖｉｒｐａｎｅｌ）データを示す。 ビルパネル（ｖｉｒｐａｎｅｌ）データを示す。 ７つのＭＣＣ腫瘍及び細胞株対にわたって、上位５０個の最も頻繁に変異した遺伝子を表示するＣｏＭｕｔプロットである。 変異プロファイルによるＭＣＣ腫瘍及び細胞株のクラスタリングを示す。類似性スコアは、０～１スケールでの腫瘍と細胞株との間の変異の一致した存在又は不在に基づいて計算され、スコア１は、同一のプロファイルを示す。 ９つのＭＣＣ患者腫瘍及び対応する細胞株で構成される、ＲＮＡ－ｓｅｑ試料の無監督階層クラスタリングを示す。分散安定化変換発現値上の距離マトリックスを使用して、ヒートマップを構築した。上トラックは、ＭＣＰｙＶゲノムへの転写物読み取りマッピングの定量化を示す。 対応する腫瘍－細胞株対、腫瘍－腫瘍対、細胞株－細胞株対、及び全ての他の対合についてのＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づくペアワイズスピアマン相関を示すグラフである。 Ｒｉｂｏ－ｓｅｑによって翻訳され得る翻訳された注釈なしのＯＲＦを示す図である。 アイソタイプ対照（白色の棒）と比較した、ベースライン時（ピンク色の棒）及びＩＦＮ－γ応答時（赤色の棒）の両方における１１個のＭＣＣ株にわたるＨＬＡ－Ｉ表面発現のフローサイトメトリー結果（左ｙ軸）を示す。上に重ねられた黒線プロットは、対応する元の腫瘍のＩＨＣによってＨＬＡ－Ｉ陽性に染色された腫瘍細胞のパーセンテージを示す（右ｙ軸）。 ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４、及びＣＤ８のための４つの元のＭＣＣ腫瘍生検体のＩＨＣ染色を示す。 ＭＣＣ－３０１株及び２つの確立されたＭＣＰｙＶ＋株、ＭＫＬ－１及びＷａＧａにおけるＨＬＡ－ＡＢＣ表面発現（Ｗ６／３２抗体）を測定するフローサイトメトリー実験を示す。 フローサイトメトリーによるＭＣＣにおける表面ＭＨＣ Ｉ発現に対するＩ型及びＩＩ型インターフェロンの効果を示すグラフを含む。５×１０５個のＭＣＣ細胞を、示された用量のＩＦＮα２ｂ、ＩＦＮβ、又はＩＦＮγで２４時間処理した。代表的なヒストグラムプロットは、抗ＨＬＡクラスＩ又はアイソタイプ抗体で染色した細胞を示す。この実験は、ＭＣＰｙＶ－株ＭＣＣ－２９０（左）及びＭＣＰｙＶ＋株ＭＣＣ－３０１（右）において行った。 ベースライン時（薄いピンク色）及びＩＦＮ－γ処理後（赤色）の両方で、１１個のＭＣＣ株全てにおけるＨＬＡ－ＤＲ発現のフローサイトメトリー評価を示すグラフである。 ＭＣＣ腫瘍アーカイブ試料のＩＨＣを示す。左側は、利用可能な治療前（ｎ＝６）及び治療後（ｎ＝９）の腫瘍試料内のＨＬＡ Ｉ陽性であるＭＣＣ細胞のパーセントの要約である（以前の治療については、表６を参照されたい）。ＭＣＣ細胞株は、治療後の試料に由来した。ＭＣＣ－３０１及びＭＣＣ－３３６という２つのＨＬＡ Ｉ－低腫瘍の代表的なＩＨＣ画像は、右側の、ＭＣＣ細胞を同定するために、ＨＬＡクラスＩ（褐色）についてＳＯＸ２と共染色（赤色）したものである。 新しく生成されたＭＣＣ細胞株の成長曲線を示す。１００万個の細胞を０日目に３回播種し、２日目及び４日目にカウントした。 ＭＣＣ細胞を同定するために、ＨＬＡクラスＩ（褐色）についてＳＯＸ２と共染色（赤色）した、親ＭＣＣ腫瘍のＩＨＣ画像を示す。 利用可能な治療前（ｎ＝６）及び治療後（ｎ＝９）の腫瘍試料内のＨＬＡ ＩＩ陽性であるＭＣＣ細胞のパーセントの要約を示す（以前の治療については、表６を参照されたい）。ＭＣＣ細胞株は、治療後の試料に由来した。 ＭＣＣ ＦＦＰＥ腫瘍組織切片の代表的な多重免疫蛍光画像を示す。プローブとしては、ＤＡＰＩ核（青色）、ＣＤ８（白色）、ＦＯＸＰ３（黄色）、ＰＤ－１（オレンジ色）、ＰＤ－Ｌ１（緑色）、及びＳＯＸ２（マゼンタ色）が挙げられる。 このＭＣＣ株のパネルにおけるＭＨＣ Ｉ表面発現の喪失の元となる、複数のクラスＩ経路遺伝子の転写抑制及びＮＬＲＣ５の改変を示す。［図２Ａ］ＭＣＣ株及び対照におけるクラスＩ抗原提示遺伝子発現のＲＮＡ－ｓｅｑヒートマップを含む。ＲＵＶ法（Ｒｉｓｓｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ３２（９）：８９６－９０２を使用し、ハウスキーピング遺伝子（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｌｅｖａｎｏｎ ２０１３）のセットによって、カウントを正規化した。中央のヒートマップは、ベースライン時及びＩＦＮ－γ処理後の両方での、ＭＣＣ細胞株パネルのユークリッド距離による無監督のクラスタリングを示す。左のヒートマップは、以前に確立されたＭＣＣ株ＭＫＬ－１及びＷａＧａの参照ヒートマップである。右のヒートマップは、正常な表皮角質細胞及び皮膚線維芽細胞の参照ヒートマップである。 ベースラインとＩＦＮ－γで処理したＭＣＣ細胞株との間の差次的発現遺伝子（ＦＤＲカットオフ０．０１未満の遺伝子は黄色で示される）の火山プロットである。ＤＥＳｅｑ２を使用して差次的発現分析を行い、陰性ＬＦＣは、＋ＩＦＮ－γ試料中の発現の増加を示す。ＩＦＮ遺伝子は、赤色で強調表示される。 ベースライン時及びＩＦＮ－γ処理後の、ＭＣＣ株のうちの４つにおけるクラスＩ経路遺伝子のプロテオミクス発現値の無監督のクラスタリングを示す。 ベースライン時及びＩＦＮ－γ処理後の両方での、ＭＣＣ株のうちの４つにおける主要なＩＦＮ－γ経路成分の相対的発現を示すプロテオミクスヒートマップである。 未処理の細胞株とＩＦＮ－γで処理した細胞株との間の正規化されたＳＴＡＴ１ペプチドカウント（左）及びＳＴＡＴ－Ｙ７０１ｙホスホサイト（ｐｈｏｓｐｈｏｓｉｔｅ）カウント（右）の標的分析を要約するグラフを含む。 ＭＣＣ－３３６（ＭＣＰｙＶ＋）及び－３５０（ＭＣＰｙＶ－）新鮮な腫瘍試料からのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを示す。全ての細胞のＵＭＡＰ（一様多様体の近似及び投影）視覚化が表示され、クラスター（左）及び試料（中央）別に着色される。右側は、全てのクラスター（クラスター０～５＝ＭＣＣ細胞、クラスター６＝免疫細胞）にわたるＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、及びＢ２Ｍの発現レベルである。 ＭＣＣ－３３６及び－３５０腫瘍試料内のＭＣＣマーカーＳＯＸ２、ＡＴＯＨ１、及びシナプトフィシン（ＳＹＰ）、並びに免疫細胞マーカーＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ発現のチャートを含む。 全てのクラスター（クラスター０～５：ＭＣＣ、クラスター６：免疫細胞）にわたる追加のＨＬＡクラスＩ遺伝子のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ発現を示すグラフを含む。 ＮＬＲＣ５コピー数の損失が、ＭＣＣにおいて一般的であることを示す。Ｌｏｇ２コピー数の比は、クラスＩ抗原提示遺伝子（左）及びＮＬＲＣ５が位置する染色体１６（右）について表示される。赤色及び青色は、それぞれ、コピー数の獲得及び喪失を意味する。 １１個のＭＣＣ細胞株からのＲＮＡ－ｓｅｑデータから生成されたクラス１遺伝子とＮＬＲＣ５との間のピアソン相関プロットを示すグラフを含む。Ｐ値は、多重比較のために調整されていない。 全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定から生成された、ＭＣＣ株のうちの８つにおけるクラスＩ経路遺伝子のプロモーター平均メチル化値の無監督のクラスタリングを示す。 クラスＩ遺伝子のＴＳＳ＋／－５ｋｂ及びハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに焦点を当てた、ＭＣＣ株のうちの８つにおけるＡＴＡＣ－ｓｅｑ正規化読み取りカバレッジのグラフである。ＧＥＯ及びＥＮＣＯＤＥからのものを含む全てのデータセットは、ＲＰＫＭによって正規化された（方法を参照のこと）。 シストロームＤＢ上のＭＣＣ株とデータセットとの間のユニオンＤＮａｓｅ－１高感受性領域（ＤＨＳ）内に収まるピークのパーセンテージを比較するグラフである。中央値レベル（左）及び完全分布（右）との比較を示す。 ＭＣＣ株にわたる総濃縮ピーク数、５倍濃縮ピーク数、及び１０倍濃縮ピーク数を、シストロームＤＢデータセットの中央値と比較するグラフである。破線は、５００のピーク数を表す。 試料にわたるピーク保存を示すグラフである。 試料にわたるピーク保存を示すグラフである。 ＩＦＮｙが、ＨＬＡペプチドームを増加及び改変することを示す。［図３Ａ］ＭＣＣ－２７７、－２９０、及び－３０１の腫瘍及び細胞株試料中の各ＨＬＡ対立遺伝子に結合することが予測されるペプチドの頻度を示すグラフを含む。 ＨＬＡクラスＩ上に提示される検出されたペプチドの数が、原発性腫瘍及び腫瘍由来細胞株については低いが、ＩＦＮγ処理後に増加したことを示す。 モチーフ空間における腫瘍、細胞株、及び細胞株＋ＩＦＮγのペプチド配列の相関を示すヒートマップである。 ＭＣＣ２３１４の腫瘍及び細胞株において検出されたペプチドの対立遺伝子分布を示す円グラフを含む。 ＭＣＣ２９０及び３０１の腫瘍、細胞株、及び細胞株＋ＩＦＮγ試料のモチーフ変化を示すグラフを含む。この図はまた、ＭＣＣ－２９０（ＭＣＰｙＶ－）及び－３０１（ＭＣＰｙＶ＋）細胞株の未処理試料とＩＦＮ－γ処理試料との間の９ｍｅｒモチーフの変化を示す。 細胞株＋／－ＩＦＮγで検出されたペプチドの対立遺伝子分布を示すグラフを含む。細胞株で検出された提示されたペプチドのＨＬＡ対立遺伝子分布を、ベースライン時及びＩＦＮ－γ処理後に示す。各ＨＬＡ対立遺伝子は、異なる色によって表される。 ＩＦＮ処理後のＨＬＡタイプごとのペプチド提示の増加を示すグラフを含む。この図は、ＨＬＡ－Ａ（左）、－Ｂ（中央）、及び－Ｃ（右）について分析された全てのＭＣＣ株にわたるＩＦＮ－γ処理時にＨＬＡ遺伝子ごとに提示されたペプチドの変化の要約を示す。 細胞株＋／－ＩＦＮγで検出されたペプチドの対立遺伝子分布を示すグラフを含む。 ＩＦＮ処理後のＨＬＡタイプごとのペプチド提示の増加を示すグラフを含む。 ＭＣＣ３６７における大型Ｔ抗原を表すペプチドの質量スペクトルの読み出しである。 ベースライン時（灰色の棒）及びＩＦＮ－γ処理後（赤色の棒）のＭＣＣ株においてＨＬＡ－Ｉ上に提示される検出されたペプチドの数を示す。ＣＬ＝細胞株（左）。ベースライン時及びモチーフ空間におけるＩＦＮ－γ処理後のＭＣＣ株間のペプチド配列の相関ヒートマップ（右）。 ＥＬＩＳｐｏｔでＤＭＳＯ、ＨＩＶ－ＧＡＧ陰性対照ペプチド、自己ＭＣＣ－３６７腫瘍細胞、又はパネルＦのＭＣＣ－３６７ ＨＬＡペプチドームで同定された大型Ｔ抗原由来ペプチドと共培養した患者ＭＣＣ－３６７からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＦＮ－γ分泌を示す。左－ＥＬＩＳｐｏｔ条件を３回実施した。右－要約統計（平均値±標準偏差）。Ｐ値は、一元配置分散分析、続いて事後Ｔｕｋｅｙ多重比較検定によって決定された。 免疫ペプチドームワークフローの概略図を示す。ＨＬＡ分子を腫瘍及び細胞株材料から免疫沈降させ、ペプチドをＨＬＡ複合体から溶出させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析する。データベース検索後、ペプチドは、ＨＬＡｔｈｅｎａにおける予測によって、最も可能性の高い対立遺伝子に割り当てられる。 ベースライン細胞株とＩＦＮ－γ処理細胞株試料との間の９ｍｅｒのモチーフ変化を示す。 ＭＣＣにおけるＭＨＣクラスＩ表面発現の既知及び新規の制御因子を同定するための対合ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲ及びＯＲＦスクリーニングを示す。［図４Ａ］ゲノムスケールスクリーニングワークフローを示す。１億５０００万個のＭＣＣ－３０１細胞を、低い感染多重度でライブラリレンチウイルス（Ｂｒｕｎｅｌｌｏ ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯ又はヒトＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１４）で形質導入し、次いでピューロマイシンで３日間選択した。その後、細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（Ｗ６／３２クローン）で染色し、ＭＨＣ Ｉ－高集団及び低集団（上位及び下位１０％）をフローサイトメトリーで選別した。各スクリーニングを３回繰り返した。 形質導入の２日後及び２０日後に、ヒトＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１ライブラリレンチウイルスで形質導入されたＭＣＣ－３０１細胞におけるＨＬＡ Ｉ表面発現（Ｗ６／３２抗体）のフローサイトメトリー評価を示すグラフを含む。対照としては、ＧＦＰ ＯＲＦウイルスで形質導入されたＭＣＣ－３０１細胞、ウイルスなし対照（代わりに培地が添加された）、及び非形質導入細胞が挙げられる。 図４Ｆの選別された各集団について、ｌｏｇ２正規化構築物スコア［ｌｏｇ２（構築物読み取り／総読み取り＊１０６＋１）］の分布を示すチャートである。 機能獲得ＯＲＦスクリーニングの結果を示す。遺伝子を、ＭＨＣ Ｉ－高集団対低集団におけるそれらのｌｏｇ倍変化濃縮に従ってランク付けした。インセット：ＯＲＦポジティブヒットで濃縮された選択された遺伝子セットを示すＧＳＥＡ分析。 機能喪失ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯスクリーニングの結果を示す。ＭＨＣ－Ｉ－高集団対低集団におけるｌｏｇ倍率変化濃縮に基づくガイドＲＮＡランクを、ＳＴＡＲＳアルゴリズムに入力して、ネガティブ（右）ヒット及びポジティブ（左）ヒットの遺伝子レベルランキングを生成した。インセット：ＣＲＩＳＰＲポジティブヒット及びネガティブヒットで濃縮された選択された遺伝子セットを示すＧＳＥＡ分析。ＭＣＣ－３０１ ＯＲＦ株における表面ＭＨＣ Ｉのフローサイトメトリー。 ＯＲＦ（左）及びＣＲＩＳＰＲ（右）スクリーニングからの細胞の選別された集団を示す。 参照として示される対照非標的又は遺伝子間ｓｇＲＮＡのセットの分布を有する、ＵＳＰ７、ＢＣＯＲＬ１、及びＰＣＧＦ１についての３つの最高スコアのｓｇＲＮＡの平均ＬＦＣ濃縮を示すグラフである。 示される個々のＯＲＦで形質導入されたＭＣＣ－３０１（左）及びＭＣＣ－２７７（右）細胞における表面ＨＬＡ－Ｉ（Ｗ６／３２抗体）のフローサイトメトリーを示す。 ＯＲＦスクリーニング（上）及びＣＲＩＳＰＲスクリーニング（下）の２つの複製物間の遺伝子レベルのＬＦＣ（全ての構築物の平均ＬＦＣ）の散布図である。注目すべきスクリーニングヒットは、赤色又は青色で強調表示される。 ＭＣＣ－３０１ ＰＲＣ１．１ ＫＯ株における表面ＭＨＣ Ｉのフローサイトメトリー結果を要約するグラフである。ＭＣＣ－３０１細胞は、Ｃａｓ９、及び対照ｓｇＲＮＡ又はＰＲＣ１．１成分ＢＣＯＲＬ１、ＰＣＧＦ１、若しくはＵＳＰ７を標的とするｓｇＲＮＡのいずれかを含有するレンチウイルスで形質導入された。細胞をピューロマイシンで３日間選択し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定及びウエスタンブロット又はｑＲＴ－ＰＣＲを介してノックアウトを確認した。細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｗ６／３２）で染色し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで分析した。各条件を技術的に３回繰り返した。 ＰＲＣ１．１成分及びＭＹＣＬの概略図であり、黄色はスクリーニングヒットを示し、緑色はＭＣＰｙＶウイルス抗原と相互作用することも報告されているスクリーニングヒットを示す。 ＰＲＣ１．１ ＫＯ株のＴＩＤＥ分析の表及び読み出しを含む。この表は、各ノックアウト株におけるインデルを有する細胞のパーセンテージを、ＴＩＤＥソフトウェアを使用して決定したことを示す（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）。ＴＩＤＥトレーシングは、ＭＣＣ－３０１におけるＰＣＧＦ１－２ ＫＯ株の分析例である。 ＭＹＣＬのレスキュー発現を有するｄｏｘ誘導性対照ｓｈＲＮＡ、ＭＹＣＬ ｓｈＲＮＡ ＭＹＣＬ、又はＭＹＣＬ ｓｈＲＮＡで形質導入されたＭＫＬ－１細胞における表面ＨＬＡ－Ｉのフローサイトメトリーを示す。上パネルは、代表的なフローヒストグラムを示し、中央パネルは、各条件（ｎ＝３）の平均ＭＦＩ（ｄｏｘで処理されていない対応する試料に対して正規化）を示し、下パネルは、各細胞株におけるＭＹＣＬ発現レベルのウエスタンブロットを示す。Ｐ値は、一元配置分散分析、続いて事後Ｔｕｋｅｙ多重比較検定によって決定された。 スクランブル対照ｓｈＲＮＡと比較して、ＭＹＣＬに対するｓｈＲＮＡを発現するＭＫＬ－１細胞におけるＬＦＣ発現を示すＲＮＡ－ｓｅｑ火山プロットを示す。ｐ＿ａｄｊ＜０．０５及びｌｏｇ２－倍率変化（ＬＦＣ）＞１を有するクラスＩ ＡＰＭ遺伝子は、赤色で強調表示され、他の注目すべきクラスＩ遺伝子は、黒色である。 スクランブル対照ｓｈＲＮＡと比較して、ＳＴ抗原及びＬＴ抗原の両方に対するｓｈＲＮＡを発現するＷａＧａ細胞におけるＬＦＣ発現を示すＲＮＡ－ｓｅｑ火山プロットを示す。ｐ＿ａｄｊ＜０．０５及びＬＦＣ＞１を有するクラスＩ ＡＰＭ遺伝子は、赤色で強調表示され、他の注目すべきクラスＩ遺伝子は、黒色である。 ＩＦＮ－γ処理後のダブルガイドＰＣＧＦ１ ＫＯ株における表面ＨＬＡ－Ｉのフローサイトメトリーを示す。 様々な濃度のＩＦＮ－γに応答する、ＭＫＬ－１細胞におけるＴＡＰ１及びＴＡＰ２のウエスタンブロット定量を示す。 ＭＹＣＬが、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉを抑制し、ＭＣＰｙＶ－ＭＣＣ及び他のがんにおいて関連することを示す。［図５Ａ］ＭＣＰｙＶ＋ＭＫＬ－１細胞におけるＭＹＣＬ ｓｈＲＮＡノックダウン対スクランブルｓｈＲＮＡ対照の火山プロットである。ｐ＿ａｄｊ＜０．０５及びＬＦＣ＞１を有するクラスＩ遺伝子は、赤色で強調表示され、他の注目すべきクラスＩ遺伝子は、黒色である。 スクランブルｓｈＲＮＡ対照と比較した、ＭＫＬ－１ ｓｈＭＹＣＬ細胞内で上方制御された遺伝子のＧＳＥＡ分析におけるＧＯ用語ＧＯ＿ＡＮＴＩＧＥＮ＿ＢＩＮＤＩＮＧの濃縮を示す（図３Ｅ）。 ＭＣＰｙＶ＋ＷａＧａ株における、汎Ｔ抗原ｓｈＲＮＡノックダウン対スクランブル対照ｓｈＲＮＡの火山プロットである。ｐ＿ａｄｊ＜０．０５及びＬＦＣ＞１を有するクラスＩ遺伝子は、赤色で強調表示され、他の注目すべきクラスＩ遺伝子は、黒色である。 スクランブルｓｈＲＮＡ対照と比較して、ＥＰ４００に対する２つのｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰ４００－２又はｓｈＥＰ４００－３）のうちの１つで形質導入されたＭＫＬ－１細胞の差次的発現分析を示す。赤色は、ＬＦＣ＞１及びｐａｄｊ＜０．０１を有するＨＬＡ－Ｉ遺伝子を示す。三角形は、ｐａｄｊ値がＤｅＳｅｑ２によってゼロとして報告され、その後、データセット内の最も低い非ゼロｐａｄｊ値でプロットされた遺伝子を示す。 全ゲノム配列決定が行われたウイルス陰性ＭＣＣ株のうちの４つにおけるＭＹＣファミリー遺伝子のコピー数変動を示す。ＣＮの獲得及び喪失は、それぞれ赤色及び青色で示される。灰色は、ＣＮＶデータがないことを示す。 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａにおける全ての利用可能ながん細胞株にわたるクラスＩ経路遺伝子及びＭＹＣファミリー遺伝子のＲＮＡ－ｓｅｑ発現値の無監督のクラスタリングを示す。各がんタイプについて、そのがん分類の全ての細胞株からの発現中央値を使用した。カラースケールは、最小行～最大行である。 ＨＬＡクラスＩ遺伝子のＲＮＡ－ｓｅｑ分析のヒートマップと、５２個のＭＣＣ腫瘍のコホートにわたる注目すべきスクリーニングヒットと、ピアソン相関を使用した無監視の階層クラスタリングヒートマップとを含む。上トラック：ＥＳＴＩＭＡＴＥによって生成された各腫瘍の腫瘍純度スコア（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４：２６１２）。下トラック：腫瘍のウイルス状態（オレンジ色＝陽性、緑色＝陰性）。右：ＶＰ及びＶＮ試料におけるクラスＩ遺伝子とスクリーニングヒットとの間の類似性マトリックス。青色及び赤色は、それぞれ負及び正のピアソン相関係数を示し、円サイズが大きいほど、より小さいｐ値に対応する。Ｐ値は、多重比較のために補正されていない。 ＭＣＣ－３０１ ＰＲＣ１．１ ＫＯ株（ＰＣＧＦ１、ＵＳＰ７、及びＢＣＯＲＬ１）における表面ＨＬＡ－Ｉのフローサイトメトリーを示す。各遺伝子について最も高い又は２番目に高いスコアリングｓｇＲＮＡのいずれかを使用して、ノックアウト株を作製した。ＷＴ ＭＣＣ－３０１におけるＰＣＧＦ１（上）及びＵＳＰ７（下）のウエスタンブロット、非標的化ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９で形質導入された対照ＭＣＣ－３０１株、又は示されたノックアウトライン。 非標的化ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９対照で形質導入されたＭＣＣ－３０１と比較した、ＭＣＣ－３０１ ＰＣＧＦ１－ＫＯ株における遺伝子発現のＬＦＣを示すＲＮＡ－ｓｅｑ火山プロットを示す。インセット：ＰＣＧＦ１－ＫＯ株で上方制御された遺伝子内のＰＲＣ２標的の濃縮を示すＧＳＥＡプロット。 様々なＩＦＮ－γ濃度の非標的化対照及びＰＣＧＦ１－ＫＯ株におけるＴＡＰ１タンパク質レベルを示すウエスタンブロットを示す。 ＰＲＣ１．１成分ＵＳＰ７の薬理学的阻害が、ＭＣＰｙＶ＋及びＭＣＰｙＶ－ＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉを上方制御し、ＭＹＣＬ媒介性ＨＬＡ Ｉ抑制を媒介することを示す。［図６Ａ］ＭＡＸ（赤色）、ＥＰ－４００（青色）、ＭＣＰｙＶ ＳＴ抗原（ピンク色）、及び活性化ヒストンマークＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（黒色）についてのＣｈＩＰ－ｓｅｑトラックを有するＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１のゲノムブラウザ図である。 ＭＡＸ（赤色）、ＥＰ－４００（青色）、ＭＣＰｙＶ ＳＴ抗原（ピンク色）、及び活性化ヒストンマークＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７Ａｃ（黒色）についてのＣｈＩＰ－ｓｅｑトラックを有するＢＣＯＲ及びＢＣＯＲＬ１のゲノムブラウザ図である。 ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲが、ＭＡＸ（左）又はＥＰ４００（右）抗体のいずれかで免疫沈降したＭＫＬ－１クロマチンを使用して、ＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１プロモーターを標的とすることを示すグラフを含む。 ＵＳＰ７阻害剤ＸＬ１７７Ａ又は対照化合物ＸＬ１７７Ｂで処理したＭＣＣ株におけるＨＬＡ－Ｉ表面レベルを測定するフローサイトメトリー実験を示す。Ｙ軸は、阻害剤で処理した細胞においてＭＦＩ（ＨＬＡ－ＡＢＣ）を示し、ＤＭＳＯで処理した細胞の平均ＭＦＩ（ＨＬＡ－ＡＢＣ）に対して正規化される。試料調製及びフローサイトメトリー分析は、各条件について技術的に３回行った。＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊は、Ｐ＜０．０５であり、ｎ．ｓ．は、Ｐ≧０．０５である。 Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ Ｍａｐ（ＤｅｐＭａｐ）（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７２０２４３）、Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１２）：１７７９－８４）からのＣＲＩＳＰＲ依存性データを示すチャート及びプロットを含み、これは、ＴＰ５３変異状態（ＴＰ５３－ｍｕｔ（ｎ＝５３２）対ＴＰ５３－ｗｔ（ｎ＝２３５））に基づいて層別化された。左：ポリコーム遺伝子が強調表示された、ＵＳＰ７と共依存する上位遺伝子のピアソン相関係数及びＦＤＲ。右：ＴＰ５３－ＷＴ（青色）及びＴＰ５３－ｍｕｔ細胞株（赤色）におけるＵＳＰ７対ポリコーム遺伝子ＰＣＧＦ１及びＲＩＮＧ１の依存性のグラフィカルな比較。 ピアソン相関によって決定される、ＴＰ５３－ｍｕｔがん細胞株内のＵＳＰ７とのそれらの共依存度に基づく遺伝子のＧＳＥＡ分析である（図６Ｄ）。より高い共依存性を示す遺伝子は、ＧＯ＿ＨＩＳＴＯＮＥ＿ＵＢＩＱＵＩＴＩＮＡＴＩＯＮ及びＧＯ＿ＨＩＳＴＯＮＥ＿Ｈ２Ａ＿ＵＢＩＱＵＩＴＩＮＡＴＩＯＮという用語について最も高い濃縮度を有した。 ＭＡＸ（左）又はＥＰ４００（右）抗体のいずれかで免疫沈降されたＭＫＬ－１クロマチンを使用して、ＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１プロモーターを標的とするＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを示す。各条件を３回繰り返し、一元配置分散分析、続いて事後ダネット多重比較検定を行うことによってｐ値を計算した。 ＭＫＬ－１ ｐ５３－ＷＴ対照株（左）又はｐ５３－ＫＯ株（右）におけるＵＳＰ７阻害剤の効果を評価するためのＨＬＡ Ｉフローサイトメトリーを示す。細胞を、１００ｎＭのＸＬ１７７Ａ（赤色）、ＸＬ１７７Ｂ（黒色）、又はＤＭＳＯ（薄灰色）で処理した。 未処理細胞（灰色）（ｎ＝２複製）と比較した、ＸＬ１７７Ａ（赤色）又はＸＬ１７７Ｂ（黒色）で処理したＭＣＣ－３０１細胞のＨＬＡ－Ｉ提示ペプチドーム内のペプチド存在量のヒートマップを示す。任意の２つの処理群（２試料ｔ検定によって決定される）の間で著しく差次的に発現されたペプチドのみを示す。 未処理細胞と比較した、ＸＬ１７７Ａ又はＸＬ１７７Ｂで処理されたＭＣＣ－３０１細胞における各ＨＬＡ対立遺伝子上に提示されるペプチドの頻度を示す。 対照株（ＷＴ、ＳＣＲ、ＡＡＶＳ１）と比較した、３つのＭＫＬ－１ ｐ５３ＫＯ株におけるｐ５３のウエスタンブロットを示す。 フローサイトメトリーによって決定された、ＸＬ１７７Ａ、ＸＬ１７７Ｂ、又はＤＭＳＯで処理されたＭＫＬ－１ ｐ５３ＫＯ株の細胞周期相の分布を示す。
本明細書では、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＭＹＣＬ）又は１つ以上のＰＲＣ１．１複合体メンバー（ＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、及びＵＳＰ７など）の制御因子を使用して、細胞上の表面ＭＨＣ－Ｉ発現を調節し、免疫応答を調節し、腫瘍免疫及び免疫療法に対する応答性を増強することができることが決定されている。例えば、（ａ）表１若しくは表４に列挙される１つ以上のバイオマーカーのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させること、並びに／又は（ｂ）表２若しくは表３に列挙される１つ以上のバイオマーカーのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を増加させることは、細胞上のＭＨＣ－Ｉ発現の増加、及び免疫療法に対する応答性の増加を伴う免疫応答の増加をもたらし、これは、がん、感染症などの免疫応答の増加から利益を受け得る障害を治療するのに有用である。同様に、（ａ）表１若しくは表４に列挙される１つ以上のバイオマーカーのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を増加させること、並びに／又は（ｂ）表２若しくは表３に列挙される１つ以上のバイオマーカーのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させることは、細胞上のＭＨＣ－Ｉ発現の減少、及び免疫療法に対する応答性の減少を伴う免疫応答の減少をもたらし、これは、自己免疫障害のような免疫応答の減少から利益を受け得る障害を治療するのに有用である。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの陰性制御因子と免疫療法との組み合わせを用いて、がん、例えば、さもなければ免疫療法に応答しないか、又は弱応答性のがんタイプの治療などの免疫応答を増加させる方法を提供する。本発明は、かかる制御因子を阻害する例示的なＲＮＡ干渉剤及び小分子を提供し、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの機能及び／又は能力を阻害する薬剤などの、本明細書に記載される併用療法及び他の方法で使用することができる。同様に、かかる制御因子の調節因子についてスクリーニングする方法、及びかかる阻害剤／免疫療法併用療法を伴うがんを診断、予後、及びモニタリングする方法が提供される。
Ｉ．定義
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つ又は１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
「改変した量」又は「改変したレベル」という用語は、対照試料中のバイオマーカー核酸の発現レベル又はコピー数と比較して、あるがん試料中のバイオマーカー核酸のコピー数（例えば、生殖細胞系及び／若しくは体細胞系）の増加又は減少、例えば、発現レベルの増加又は減少を指す。バイオマーカーの「改変した量」という用語は、正常対照試料中のバイオマーカータンパク質の対応するタンパク質レベルと比較した、ある試料（例えば、がん試料）中のバイオマーカータンパク質のタンパク質レベルの増加又は減少も含む。更に、バイオマーカータンパク質の改変した量は、バイオマーカータンパク質の発現又は活性に影響を及ぼし得る、マーカーのメチル化状態などの翻訳後修飾を検出することによって決定され得る。
対象におけるバイオマーカーの量は、バイオマーカーの量が、それぞれ、正常レベルよりも、量を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超える量だけ、好ましくはその量よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％高いか、又は低い場合、バイオマーカーの正常量よりも「有意に」高いか、又は低い。あるいは、対象におけるバイオマーカーの量は、その量が、それぞれ、バイオマーカーの正常量よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、４倍、又は５倍高いか、又は低い場合、正常量よりも「有意に」高いか、又は低いとみなされ得る。かかる「有意性」は、例えば、発現、阻害、細胞毒性、細胞成長等についての本明細書に記載される任意の他の測定されたパラメータにも適用され得る。
バイオマーカーの「改変した発現レベル」という用語は、発現又はコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも高いか又は低く、好ましくは対照試料（例えば、関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のバイオマーカーの発現レベル又はコピー数、及び好ましくはいくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベル又はコピー数の少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、若しくは１０倍、又はそれ以上である、試験試料、例えば、がんに罹患している患者に由来する試料中のバイオマーカーの発現レベル又はコピー数を指す。改変した発現レベルは、発現又はコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも高いか又は低く、好ましくは、対照試料（例えば、関連する疾患を有していない健常対象由来の試料）中のバイオマーカーの発現レベル又はコピー数、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベル又はコピー数の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーのレベルは、バイオマーカー自体のレベル、修飾バイオマーカー（例えば、リン酸化バイオマーカー）のレベル、又は対照（例えば、リン酸化されていないバイオマーカーに対するリン酸化バイオマーカー）などの別の測定された変数に対するバイオマーカーのレベルを指す。
バイオマーカーの「改変した活性」という用語は、正常対照試料中のバイオマーカーの活性と比較した、例えば、がん試料中の疾患状態を増加又は減少させるバイオマーカーの活性を指す。バイオマーカーの改変した活性は、例えば、バイオマーカーの改変した発現、バイオマーカーの改変したタンパク質レベル、バイオマーカーの改変した構造、又は、例えば、バイオマーカーと同じ若しくは異なる経路に関与する他のタンパク質との改変した相互作用、又は転写活性化因子若しくは阻害剤との改変した相互作用の結果であり得る。
マーカーの「改変した構造」という用語は、バイオマーカー核酸又はタンパク質内の変異又は対立遺伝子バリアント、例えば、正常若しくは野生型の遺伝子又はタンパク質と比較した、バイオマーカー核酸又はタンパク質の発現又は活性に影響を及ぼす変異の存在を指す。例えば、変異には、置換、欠失、又は付加変異が含まれるが、これらに限定されない。変異は、バイオマーカー核酸のコーディング領域又は非コーディング領域に存在し得る。
本明細書で別途特定されない限り、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、「細胞内抗体」として細胞内で発現されるように適合可能な抗原結合部分を指す。（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９５－６０１）。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の使用、超安定性のための免疫グロブリンＶＬドメインの修飾、低減する細胞内環境に抵抗するための抗体の修飾、細胞内安定性を増加させ、かつ／又は細胞内局在化を変調する融合タンパク質の生成等の、細胞内部分を標的化（例えば、阻害）するために抗体を適応させる方法は、当該技術分野において周知である。細胞内抗体は、多細胞生物の１つ以上の細胞、組織又は器官において、例えば、予防及び／又は治療目的で（例えば、遺伝子療法として）導入及び発現することもできる（少なくともＰＣＴ公開第０８／０２００７９号、同第９４／０２６１０号、同第９５／２２６１８号、及び同第０３／０１４９６０号；米国特許第７，００４，９４０号；Ｃａｔｔａｎｅｏ ａｎｄ Ｂｉｏｃｃａ（１９９７）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｌａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ ｐｕｂｌｓ．）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４：１６３－１７０；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：２４４５－２４５６；Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０８：４０７－４１２；Ｓｈａｋｉ－Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３０３：１９－３９を参照のこと）。
抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル、異種、同種、若しくは同系、又はそれらの改変形態（例えば、ヒト化、キメラ等）であり得る。抗体は、完全にヒトである場合もある。好ましくは、本発明の抗体は、バイオマーカーポリペプチド又はその断片に特異的に結合するか、又は実質的に特異的に結合する。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる１種のみの抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドの集団を指し、「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる複数の種の抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一結合親和性を呈する。
抗体は、「ヒト化」されていてもよく、ヒト化とは、ヒト細胞によって作製され得る、更に厳密に似た抗体に改変された可変領域及び定常領域を有する非ヒト細胞によって作製された抗体を含むことを意図している。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を改変することにより、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を組み込む。本発明のヒト化抗体は、例えば、ＣＤＲに、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体も含む。
「割り当てられたスコア」という用語は、患者試料中で測定された後の各バイオマーカーについて指定された数値を指す。割り当てられたスコアは、試料中のバイオマーカーの不在、存在、又は推定量と相関する。割り当てられたスコアは、手動で（例えば、目視検査によって）、又は画像取得及び分析のための計装を用いて生成され得る。特定の実施形態では、割り当てられたスコアは、定性的評価、例えば、階調スケールでの蛍光読み出しの検出、又は定量的評価によって決定される。一実施形態では、複数の測定されたバイオマーカーからの割り当てられたスコアの組み合わせを指す「集計スコア」が決定される。一実施形態では、集計スコアは、割り当てられたスコアの合計である。別の実施形態では、割り当てられたスコアの組み合わせは、それらを集計スコアに組み合わせる前に、割り当てられたスコアに対して数学的演算を行うことを含む。特定の実施形態では、集計スコアは、本明細書では「予測スコア」とも称される。
「バイオマーカー」という用語は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＭＹＣＬ）並びに／又は１つ以上のＰＲＣ１．１複合体メンバー（例えば、ＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、及びＵＳＰ７）の１つ以上の阻害剤を含む、併用療法の効果を予測すると決定された本発明の測定可能な実体を指す。バイオマーカーには、表、実施例、図で示されるもの、及び他の方法で本明細書に記載されているものを含む、核酸及びタンパク質が含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書に記載されるように、コピー数、量、活性、位置、修飾（例えば、リン酸化）等の、バイオマーカーの任意の関連する特徴を使用することができる。
「遮断」抗体又は抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の少なくとも１つの生物学的活性を阻害するか、又は低減するものである。特定の実施形態では、本明細書に記載の遮断抗体又はアンタゴニスト抗体又はその断片は、抗原の所与の生物学的活性を実質的又は完全に阻害する。
「体液」という用語は、身体から排泄又は分泌される流体、並びに通常は身体から排泄又は分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液及び血漿、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）及び耳垢（ｅａｒｗａｘ）、カウパー液又は前射精液、乳糜、糜粥、糞便、雌性射出液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸膜液、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙、尿、腟粘滑液、硝子体液、嘔吐物）を指す。
「がん」又は「腫瘍」又は「過剰増殖性」という用語は、制御不能な増殖、不死性、転移能、速い成長及び増殖速度、並びにある特定の特有の形態学的特徴等のがんを引き起こす細胞に特有の特性を有する細胞の存在を指す。特に断りのない限り、これらの用語は、化生を含む。いくつかの実施形態では、かかる細胞は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーによって制御されるシグナル伝達経路の発現及び活性に起因して、かかる特徴を部分的に又は完全に示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるがん細胞は、免疫療法のうちの少なくとも１つに対して感受性ではない。いくつかの実施形態では、がん細胞は、本明細書に記載される発現及び／又は機能を阻害するなど、本明細書に記載されるバイオマーカーの制御因子を拮抗することができる薬剤で治療可能である。
がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態にあるが、かかる細胞は、動物に単独で存在し得るか、又は白血病細胞等の非腫瘍形成性がん細胞であり得る。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、前がん状態及び悪性がんを含む。がんには、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病等、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、並びに免疫球性アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳又は中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮又は子宮内膜がん、口腔又は咽頭がん、肝臓がん、腎臓がん、睾丸がん、胆道がん、小腸又は虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織がん等が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって包含される方法に適用可能ながんのタイプの他の非限定的な例には、ヒト肉腫及びがん腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、肝臓がん、絨毛腫、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、睾丸がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、例えば、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、及び真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、並びに重鎖病が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは、本来、上皮がんであり、がんには、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科がん、腎臓がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、又は皮膚がんが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、又は結腸がんである。なお他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞がん、子宮頸がん、卵巣がん（例えば、漿液性卵巣がん）、又は乳がんである。上皮がんは、漿液性、類内膜、粘液性、明細胞、ブレンナー、又は未分化を含むが、これらに限定されない様々な他の方法で特徴付けられ得る。
本明細書で使用される場合、「神経内分泌がん」又は「神経内分泌腫瘍」は、神経内分泌系から生じるか、又は発がん性プロセスを通じて神経内分泌細胞の特性を獲得する非内分泌細胞から生じるもののいずれかである。ほとんどの成人神経内分泌腫瘍は、カルチノイド、フェオクロモサイトーマ、及びメルケル細胞腫瘍を含む、既知の原発部位から生じる。カルチノイド腫瘍は、良性又は悪性であり得る。カルチノイドがんとしては、胃、膵臓、結腸、肝臓、肺（例えば、小細胞がん）、卵巣、乳がん、精巣、及び子宮頸がんが挙げられる。小細胞がんは、早期にしばしば転移する傾向がある大型の中枢を起源とする。フェオクロモサイトーマは、副腎によるカテコールアミンの過剰産生を引き起こす、副腎髄質のがんである。皮膚の神経内分泌がんであるメルケル細胞がんは、皮膚上又は皮膚下に形成されるがんである。メルケル細胞がんは、皮膚の下にある軟組織から生じ得、急速に成長し、しばしば身体の他の部分に広がる。
特定の実施形態では、がんは、メルケル細胞がんを包含する。ＭＣＣは、１９７２年にＴｏｋｅｒによって、カルチノイド特徴を有する皮膚の小梁がんとして初めて記載された（Ｔｏｋｅｒ（１９７２）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０５：１０７－１１０）。Ｔｏｋｅｒは後に、腫瘍細胞内に神経分泌顆粒、密なコアを含有する膜結合顆粒の存在を報告した。この特徴は、神経堤起源の腫瘍細胞と区別することができず、正常なメルケル細胞にも存在する（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｃａｎｃｅｒ ４２：２３１１－２３２１）。腫瘍名は、腫瘍細胞の外観がメルケル細胞に類似していることを反映するために、メルケル細胞がんに変更された（Ｔｏｋｅｒ（１９８２）Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌ．４：４９７－４９７－５００、Ｒｙｗｌｉｎ（１９８２）Ａｍ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｐａｔｈｏｌ．４：５１３－５１５）。
ＭＣＣは、肝臓、骨、膵臓、肺、及び脳を含む排出リンパ節及び遠隔臓器に頻繁に転移する、皮膚の侵襲性神経内分泌がんである（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．９：１３７４－１３８２）。ＭＣＣは、典型的には、皮膚の皮層に急速に成長する紅斑性病変として現れる。ＭＣＣの最も一般的な出現は、太陽からの強い紫外線曝露の生涯の履歴を持つ、高齢で白い肌の成人である。ＭＣＣは、日光に曝露されていない皮膚、並びに小児、若い成人、及び暗褐色の肌の人々ではあまり頻繁に起こらない。赤道に近い緯度は、北米の男性ではＭＣＣの発生率の増加と関連しているが、女性では関連しておらず、これは、おそらく職業的な太陽光の曝露パターンに起因する（Ｓｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４：４７－６０）。ＭＣＣを発症する危険性は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む重度の免疫不全状態の患者、又は自己免疫疾患、固形臓器移植、及び他のタイプのがんの医学的治療からも増加する（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｉｓ．Ｐｒｉｍｅｒｓ ３：１７０７７）。ＡＥＩＯＵニーモニックは、全てのＭＣＣ提示の９０％を占める。無症候性／圧痛の欠如、急速に拡大、免疫抑制、５０歳以上、及び紫外線曝露／白い肌（Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５８：３７５－３８１）。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）、第８版からの最近のＭＣＣステージ分類システムは、５年間の全生存率は、局所疾患で５１％、リンパ節の転移で３５％、転移性疾患で１４％と推定している（Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２３：３５６４－３５７１、Ｔｒｉｎｉｄａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．７２：３３７－３４０）。手術及び放射線療法は、局所及びリンパ節ＭＣＣに対して治癒的であり得るが、広範囲、転移性、及び再発性疾患に対しては通常、全身療法が必要である。シスプラチン及びエトポシドレジメンに基づく細胞毒性化学療法は、高い奏効率を有するが、平均無増悪生存期間がわずか９４日の短い期間によって制限される（Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．５：２２９４－２３０１）。ＭＣＣケアにおける革命は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する抗体を用いたチェックポイント遮断療法が、頻繁かつ持続的な応答を誘発する可能性があると判断されたときに始まった（Ｎｇｈｉｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７４：２５４２－２５５２、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１７：１３７４－１３８５、Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ．４：ｅ１８００７７、Ｎｇｈｉｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３７：６９３－７０２）。チェックポイント遮断療法の経験が増加するにつれて、全生存期間の予測が改善され得る。
ＭＣＣは、純粋な神経内分泌組織学から、混合された組織学的特徴を有するバリアント形態まで変化し得る。高悪性度神経内分泌ＭＣＣ細胞は、希薄な細胞質を有する高い核細胞対細胞質比を有し、ヘマトキシリン及びエオシンによって染色されたときに小さな青色細胞腫瘍の外観を与える。腫瘍核は、高い増殖速度を示す頻繁な有糸分裂の数値を伴う、開放した塩胡椒に見えるクロマチンパターンを有する）。神経内分泌マーカーのためのＭＣＣの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色は、典型的には、クロモグラニン、シナプトフィシン、ＣＤ５６、及び神経フィラメントについて陽性である。ＭＣＣはまた、典型的には核傍ドット様パターンを示すＣＫ２０に対して特異的に染色する。対照的に、正常なメルケル細胞におけるＣＫ２０染色は、細胞質全体にわたってより均一に分布している。ＣＫ２０染色は、ＭＣＣを、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）などの他のより一般的な神経内分泌腫瘍と区別することができる（Ｌｅｅｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５４：７２７－７２９）。ＳＣＬＣは、ＴＴＦ－１（ＮＫＸ２－１遺伝子によってコードされる甲状腺特異的転写因子１）陽性と染色され、一方ＭＣＣは、この染色に陰性である。ＩＮＳＭ１は、ＭＣＣ及びメルケル細胞、並びに他の神経内分泌がんに対して有用なＩＨＣマーカーである（Ｌｉｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．４２：１５４１－１５４８）。
「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’及び３’非翻訳領域）を指す。
「相補的」という用語は、２つの核酸鎖の領域間又は同じ核酸鎖の２つの領域間の相補的な配列の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミン又はウラシルである場合に第１の領域に逆平行の第２の核酸領域の残基と特異的水素結合（「塩基対合」）を形成することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合に第１の鎖に逆平行の第２の核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行様式で配置されたときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することができる場合、同じ又は異なる核酸の第２の領域に相補的である。好ましくは、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、第１の部分と第２の部分が逆平行様式で配置されたときに、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
「対照」という用語は、試験試料中の発現産物との比較を提供するのに好適な任意の参照基準を指す。一実施形態では、対照は、発現産物レベルが、検出され、試験試料由来の発現産物レベルと比較される、「対照試料」を得ることを含む。かかる対照試料は、既知の転帰を有する対照がん患者由来の試料（保管された試料若しくは先行試料測定であり得る）、健常患者若しくはがん患者等の対象から単離された正常組織若しくは細胞、がん患者の同じ臓器若しくは身体位置から得られた正常細胞／組織に隣接する、健常対象若しくはがん患者等の対象から単離された培養初代細胞／組織、健常対象から単離された組織若しくは細胞試料、又は寄託所から得られた初代細胞／組織を含むが、これらに限定されない、任意の好適な試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子、正常組織（又は他の以前に分析された対照試料）由来の発現産物レベル範囲、ある特定の転帰（例えば、１、２、３、４年等の生存期間）を有するか、又はある特定の治療（例えば、標準治療がん療法）を受けている患者群又は一組の患者由来の試験試料中の以前に決定された発現産物レベル範囲を含むが、これらに限定されない、任意の好適な源由来の参照基準発現産物レベルを含み得る。当業者であれば、かかる対照試料及び参照基準発現産物レベルが対照として本発明の方法と組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。一実施形態では、対照は、正常又は非がん性細胞／組織試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、一組の患者、例えば、一組のがん患者の発現レベル、又はある特定の治療を受けている一組のがん患者発現レベル、又はある転帰に対して別の転帰を有する一組の患者の発現レベルを含み得る。前者の場合、各患者の特異的発現産物レベルは、発現のパーセンタイルレベルに割り当てられ得るか、又は参照基準発現レベルの平均値若しくは平均よりも高い若しくは低いのいずれかとして表され得る。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、併用化学療法で治療された患者由来の細胞、及び良性がんを有する患者由来の細胞を含み得る。別の実施形態では、対照は、測定値、例えば、ある集団におけるハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較した同じ集団における特定の遺伝子の平均発現レベルも含み得る。かかる集団は、健常対象、いずれの治療も受けていない（すなわち、未治療）がん患者、標準治療療法を受けているがん患者、又は良性がんを有する患者を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、試験試料中の２つの遺伝子の発現産物レベルの比率を決定し、それを参照基準で同じ２つの遺伝子の任意の好適な比率と比較すること、試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定し、任意の好適な対照中の発現産物レベルの差を決定すること、及び試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定し、それらの発現を試験試料中のハウスキーピング遺伝子の発現に正規化し、任意の好適な対照と比較することを含むが、これらに限定されない、発現産物レベルの比率変換を含む。特に好ましい実施形態では、対照は、試験試料と同じ系統及び／又はタイプのものである対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、がんを有する全ての患者等の一組の患者試料中のパーセンタイルとして又はそれに基づいて群分けされる発現産物レベルを含み得る。一実施形態では、対照発現産物レベルが確立され、例えば特定のパーセンタイルと比較してより高い又はより低い発現産物レベルが転帰を予測するための基礎として使用される。別の好ましい実施形態では、対照発現産物レベルが既知の転帰を有するがん対照患者由来の発現産物レベルを使用して確立され、試験試料由来の発現産物レベルが転帰を予測する基礎として対照発現産物レベルと比較される。以下のデータによって実証されるように、本発明の方法は、試験試料中の発現産物レベルを対照と比較する際の特定のカットポイントの使用に限定されない。
バイオマーカー核酸の「コピー数」は、特定の遺伝子産物をコードする細胞（例えば生殖細胞系及び／又は体細胞系）中のＤＮＡ配列の数を指す。一般に、所与の遺伝子について、哺乳動物は、各遺伝子の２つのコピーを有する。しかしながら、コピー数は、遺伝子増幅若しくは複製によって増加する場合があり、又は欠失によって減少する場合がある。例えば、生殖細胞系コピー数の変化には、１つ以上のゲノム遺伝子座における変化が含まれ、この１つ以上のゲノム遺伝子座は、対照における生殖細胞系コピーの正常相補体中のコピー数（例えば、特定の生殖細胞系ＤＮＡ及び対応するコピー数が決定されたものと同じ種についての生殖細胞系ＤＮＡ中の正常コピー数）によって説明されない。体細胞系コピー数の変化には、１つ以上のゲノム遺伝子座における変化が含まれ、この１つ以上のゲノム遺伝子座は、対照の生殖細胞系ＤＮＡ中のコピー数（例えば、体細胞系ＤＮＡ及び対応するコピー数が決定されたものと同じ対象についての生殖細胞系ＤＮＡ中のコピー数）によって説明されない。
バイオマーカー核酸の「正常な」コピー数（例えば、生殖細胞系及び／若しくは体細胞系）又はバイオマーカー核酸若しくはタンパク質の「正常な」発現レベルは、生体試料、例えば、がんに罹患していない対象（例えば、ヒト）由来、又はがんを有する同じ対象における対応する非がん性組織由来の生体試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、及び骨髄を含む試料における発現又はコピー数の活性／レベルである。本明細書で使用される場合、「共刺激する」という用語は、増殖又はエフェクター機能を誘導する第２の非活性化受容体媒介性シグナル（「共刺激シグナル」）を提供する共刺激ポリペプチドの能力を含む。例えば、共刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞－受容体媒介性シグナルを受けたＴ細胞におけるサイトカイン分泌をもたらし得る。例えば、活性化受容体を介して細胞－受容体媒介性シグナルを受けた免疫細胞は、本明細書で「活性化免疫細胞」と称される。
「対象に好適な治療レジメンを決定すること」という用語は、本発明による分析の結果に基づいて又は本質的に基づいて又は少なくとも部分的に基づいて開始、変更、及び／又は終了される、対象の治療レジメン（すなわち、対象におけるがんの予防及び／又は治療のために使用される単回療法又は異なる療法の組み合わせ）の決定を意味するとみなされる。一例は、再発の危険性を低下させることを目的とする手術後にアジュバント療法を開始することであり、別の例は、特定の化学療法の投薬量を変更することであろう。決定は、本発明による分析の結果に加えて、治療される対象の個人的特徴に基づき得る。多くの場合、対象に好適な治療レジメンの実際の決定は、主治医又は医師によって行われるであろう。
「がんを診断する」という用語は、個体におけるがん又はその亜型の存在又は不在を決定するための本発明の方法、システム、及びコードの使用を含む。この用語はまた、個体における疾患活性レベルを評価するための方法、システム、及びコードを含む。
分子は、かなりの割合の分子が基質から解離することなく、基質が流体（例えば標準のクエン酸生理食塩水、ｐＨ７．４）ですすがれ得るように、分子が基質に共有結合的又は非共有結合的に会合している場合、基質に「固定」又は「付着（ａｆｆｉｘ）」されている。
「発現シグネチャ」又は「シグネチャ」という用語は、測定される表現型に関連する１つ以上の協調的に発現されるバイオマーカー群を指す。例えば、このシグネチャを構成する遺伝子、タンパク質、代謝物等は、特定の細胞系統、分化の段階、又は特定の生物学的応答中に発現され得る。バイオマーカーは、それらが発現する腫瘍の生物学的側面、例えば、がんの起源細胞、生検における非悪性細胞の性質、及びがんに関与するがん発生機構を反映することができる。発現データ及び遺伝子発現レベルは、コンピュータ可読媒体、例えば、マイクロアレイ又はチップ読み取りデバイスと組み合わせて使用されるコンピュータ可読媒体に記憶され得る。そのような発現データは、発現シグネチャを生成するように操作され得る。
本明細書で使用される「相同」とは、同じ核酸鎖の２つの領域間又は２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両領域におけるヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有されている場合、それらの領域は、その位置で相同である。第１の領域は、各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占有されている場合、第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有されている２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表される。一例として、ヌクレオチド配列５’－ＡＴＴＧＣＣ－３’を有する領域及びヌクレオチド配列５’－ＴＡＴＧＧＣ－３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、それらの部分の各々のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が同じヌクレオチド残基によって占有される。より好ましくは、それらの部分の各々の全てのヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有される。
「免疫細胞」という用語は、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は造血起源のものであり、免疫細胞には、リンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球が含まれる。
「免疫療法（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」又は「免疫療法（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」という用語は、対象の免疫系の特定の部分を使用して、がんなどの疾患と戦うための任意の治療を指す。対象自身の免疫系は、その目的のための１つ以上の薬剤の投与の有無にかかわらず、刺激される（又は抑制される）。免疫応答を誘発又は増幅するように設計された免疫療法は、「活性化免疫療法」と称される。免疫応答を低下又は抑制するように設計された免疫療法は、「抑制免疫療法」と称される。遺伝学的に修飾された移植がん細胞に免疫系効果をもたらすと考えられる任意の薬剤をアッセイして、薬剤が免疫療法であるかを決定し、所与の遺伝子修飾が免疫応答の調節にもたらす効果を決定することができる。いくつかの実施形態では、免疫療法は、がん細胞特異的である。いくつかの実施形態では、免疫療法は、「非標的」であり得、これは、免疫系細胞と選択的に相互作用しないが、免疫系機能を調節する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子療法、及び放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫療法は、例えば、がんワクチン及び／又は感作抗原提示細胞の使用を含み得る、標的療法の一形態である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞を無傷のまま残しながらがん細胞に感染して溶解させることができるウイルスであり、それらをがん療法に潜在的に有用なものにする。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞破壊を促進し、腫瘍部位での用量増幅ももたらす。それらは、抗がん遺伝子のベクターとして作用することもでき、それらを腫瘍部位に特異的に送達させる。この免疫療法は、がん抗原又は疾患抗原に対して産生された予め形成された抗体の投与（例えば、任意に化学療法剤又は毒素に結合しているモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって達成される宿主を短期間保護するために受動免疫を伴い得る。例えば、抗ＶＥＧＦ及びｍＴＯＲ阻害剤は、腎細胞がんの治療に有効であることが既知である。この免疫療法は、がん細胞株の細胞毒性リンパ球によって認識されるエピトープの使用にも焦点を合わせることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチド等を使用して、腫瘍又はがんの発症、進行、及び／又は病理に関連した生体分子を選択的に調節することができる。
免疫療法は、がん抗原又は疾患抗原に対して産生された予め形成された抗体の投与（例えば、任意に化学療法剤又は毒素に結合しているモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって達成される宿主の短期間保護のための受動免疫を伴い得る。この免疫療法は、がん細胞株の細胞毒性リンパ球によって認識されるエピトープの使用にも焦点を合わせることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチド等を使用して、腫瘍又はがんの発症、進行、及び／又は病理に関連した生体分子を選択的に調節することができる。
「免疫原性化学療法」という用語は、カルレチクリン、ＡＴＰ及びＨＭＧＢ１を含むが、これらに限定されない１つ以上の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）分子の放出によって検出可能な状態である、免疫原性細胞死を誘発することが実証されている任意の化学療法を指す（Ｋｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：５１－７２）。コンセンサス免疫原性化学療法の具体的な代表例としては、とりわけ、５’－フルオロウラシル、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン、及び白金製剤オキサリプラチンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、免疫療法は、１つ以上の免疫チェックポイントの阻害剤を含む。「免疫チェックポイント」という用語は、抗腫瘍免疫応答を下方調節又は阻害することによって免疫応答を微調整するＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子群を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、当該技術分野で周知であり、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、及びＡ２ａＲが含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照のこと）。この用語は、生物学的に活性なタンパク質断片、並びに全長免疫チェックポイントタンパク質及びそれらの生物学的に活性なタンパク質断片をコードする核酸を更に包含する。いくつかの実施形態では、この用語は、本明細書に提供される相同性の説明に従う任意の断片を更に包含する。一実施形態では、免疫チェックポイントは、ＰＤ－１である。
免疫チェックポイント及びそれらの配列は当該技術分野で周知であり、代表的な実施形態が以下に記載される。例えば、「ＰＤ－１」という用語は、既知のリガンドとしてＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を有する共阻害受容体として機能する免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーを指す。ＰＤ－１は、ＴＣＲ誘導性活性化Ｔ細胞死中に上方制御された遺伝子を選択するためのクローニングベースの減算アプローチを使用して以前に特定された。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１に結合するその能力に基づいた分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４と同様に、ＰＤ－１は、抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面上で迅速に誘導される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．２５（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５）。しかしながら、ＣＴＬＡ－４とは対照的に、ＰＤ－１はＢ細胞上でも誘導される（抗ＩｇＭに応答して）。ＰＤ－１は、胸腺細胞及び骨髄細胞のサブセット上でも発現される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）（上記参照）、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７７３）。
代表的なヒトＰＤ－１バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列は、ＮＭ＿００５０１８．２及びＮＰ＿００５００９．２の下、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで一般公開されており、表１に示されている（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）２０ ＥＭＢＯ Ｊ １１：３８８７、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：７０４、米国特許第５，６９８，５２０号も参照のこと）。ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメイン、及び免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内領域（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：７０４、及び米国特許第５，６９８，５２０号）、並びに免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を有する。これらの特徴はまた、免疫阻害性受容体と呼ばれる、ポリペプチドのより大きなファミリー（これもまた、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂを含む）、及びキラー阻害性受容体（ＫＩＲ）を定義する（Ｖｉｖｉｅｒ ａｎｄ Ｄａｅｒｏｎ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：２８６）。これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭ及びＩＴＳＭモチーフは、ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼと相互作用し、これが阻害シグナルをもたらすと想定されることが多い。これらの免疫阻害性受容体のサブセットは、ＭＨＣポリペプチド、例えば、ＫＩＲに結合し、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７－１及びＢ７－２に結合する。ＭＨＣ遺伝子とＢ７遺伝子との間に系統発生関係があることが提案されている（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２０（６）：２８５－８）。ヒト以外の生物中のＰＤ－１オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、マウスＰＤ－１（ＮＭ＿００８７９８．２及びＮＰ＿０３２８２４．１）、ラットＰＤ－１（ＮＭ＿００１１０６９２７．１及びＮＰ＿００１１００３９７．１）、イヌＰＤ－１（ＸＭ＿５４３３３８．３及びＸＰ＿５４３３３８．３）、ウシＰＤ－１（ＮＭ＿００１０８３５０６．１及びＮＰ＿００１０７６９７５．１）、並びにニワトリＰＤ－１（ＸＭ＿４２２７２３．３及びＸＰ＿４２２７２３．２）が含まれる。
ＰＤ－１ポリペプチドは、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達し、それにより、免疫細胞エフェクター機能を阻害することができる阻害性受容体であるか、又は、例えば、可溶性モノマー形態で存在するときに、免疫細胞の共刺激（例えば、競合阻害による）を促進することができる。好ましいＰＤ－１ファミリーメンバーは、ＰＤ－１と配列同一性を共有し、１つ以上のＢ７ファミリーメンバー、例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１リガンド、及び／又は抗原提示細胞上の他のポリペプチドに結合する。
「ＰＤ－１活性」という用語は、例えば、抗原提示細胞上の天然ＰＤ－１リガンドを連結することによって、活性化免疫細胞における阻害性シグナルを調節するＰＤ－１ポリペプチドの能力を含む。免疫細胞における阻害性シグナルの調節により、免疫細胞の増殖及び／又は免疫細胞によるサイトカイン分泌の調節がもたらされる。したがって、「ＰＤ－１活性」という用語には、ＰＤ－１ポリペプチドのその天然リガンドに結合する能力、免疫細胞における共刺激又は阻害性シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力が含まれる。
「ＰＤ－１リガンド」という用語は、ＰＤ－１受容体の結合パートナーを指し、ＰＤ－Ｌ１（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７－１０３４）及びＰＤ－Ｌ２（Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６１）の両方を含む。少なくとも２つのタイプのヒトＰＤ－１リガンドポリペプチドが存在する。ＰＤ－１リガンドタンパク質は、シグナル配列、並びにＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン、膜貫通ドメイン、及び短い細胞質尾部を含む。ＰＤ－Ｌ１（配列データについては、Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）を参照のこと）及びＰＤ－Ｌ２（配列データについては、Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６１を参照のこと）の両方が、ポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方が、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、及び心臓で発現される。ＰＤ－Ｌ２のみが、膵臓、肺、及び肝臓で発現され、ＰＤ－Ｌ１のみが胎児肝臓で発現される。ＰＤ－Ｌ１発現はより広いが、両方のＰＤ－１リガンドは、活性化された単球及び樹状細胞上で上方制御される。例えば、ＰＤ－Ｌ１は、マウス造血細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、及び骨髄由来肥満細胞）並びに非造血細胞（例えば、内皮細胞、上皮細胞、及び筋肉細胞）で構成的に発現され、より高いレベルに上方制御されることが知られているが、ＰＤ－Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、及び骨髄由来肥満細胞上で誘導的に発現される（Ｂｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７：１１１を参照のこと）。
ＰＤ－１リガンドは、特定の保存された構造的及び機能的特徴を有するポリペプチドのファミリーを含む。「ファミリー」という用語は、タンパク質又は核酸分子を指すために使用されるとき、本明細書で定義されるように、共通の構造ドメイン又はモチーフを有し、かつ十分なアミノ酸又はヌクレオチド配列相同性を有する２つ以上のタンパク質又は核酸分子を意味するように意図される。かかるファミリーメンバーは、天然又は非天然に存在し得、同じ種又は異なる種のいずれかに由来し得る。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第１のタンパク質、並びにヒト起源の他の別個のタンパク質を含有し得るか、又は代替的に、非ヒト起源の相同体を含有し得る。ファミリーメンバーは、共通の機能的特徴を有する場合もある。ＰＤ－１リガンドは、ポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーである。本明細書で使用される「Ｂ７ファミリー」又は「Ｂ７ポリペプチド」という用語には、Ｂ７ポリペプチド、例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７ｈ（Ｓｗａｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：４２３）、及び／又はＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２）、と配列相同性を共有する共刺激ポリペプチドが含まれる。例えば、ヒトＢ７－１及びＢ７－２は、ＮＣＢＩでのＢＬＡＳＴプログラムをデフォルトパラメータ（存在１１及び延長１で設定されたギャップペナルティを有するＢｌｏｓｕｍ６２マトリックス）と比較したとき、約２６％のアミノ酸配列同一性を共有する（ＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと）。Ｂ７ファミリーという用語はまた、免疫細胞機能を調節することができるこれらのポリペプチドのバリアントを含む。Ｂ７ファミリーの分子は、シグナルドメイン、ＩｇＶドメイン、及びＩｇＣドメインを含む、いくつかの保存領域を共有する。ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメインは、当該技術分野で認識されているＩｇスーパーファミリーメンバードメインである。これらのドメインは、Ｉｇフォールドと呼ばれる明確なフォールディングパターンを有する構造単位に対応する。Ｉｇフォールドは、２つのｆ３シートのサンドイッチで構成され、各々が、Ｉｇ、ＴＣＲ、及びＭＨＣ分子のＩｇＣドメインが、同じタイプの配列パターンを共有し、Ｉｇスーパーファミリー内でＣ１セットと呼ばれる、２つのシート間の保存されたジスルフィド結合を有する５～１０個のアミノ酸の逆平行ｆ３鎖からなる。他のＩｇＣドメインは、他のセット内に入る。ＩｇＶドメインはまた、配列パターンを共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインは、ＩｇＣドメインよりも長く、追加の一対のβ鎖を含む。
好ましいＢ７ポリペプチドは、共刺激又は阻害性シグナルを免疫細胞に提供し、それにより、免疫細胞応答を促進又は阻害することができる。例えば、共刺激受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーがＴ細胞活性化及び増殖を増加させる一方で、阻害性受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーは共刺激を減少させる。更に、同じＢ７ファミリーメンバーがＴ細胞共刺激を増加させる場合も減少させる場合もある。例えば、共刺激受容体に結合すると、ＰＤ－１リガンドは、例えば、可溶性形態で存在する場合、免疫細胞の共刺激を誘導することができるか、又は免疫細胞の共刺激を阻害することができる。阻害性受容体に結合すると、ＰＤ－１は、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達することができる。
好ましいＢ７ファミリーメンバーには、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７ｈ、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２、及びそれらの可溶性断片又は誘導体が含まれる。一実施形態では、免疫細胞上の１つ以上の受容体、例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、及び／又は他の受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーは、受容体に応じて、阻害性シグナル又は共刺激シグナルを免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞に伝達する能力を有する。
共刺激シグナルの調節により、免疫細胞のエフェクター機能の調節がもたらされる。したがって、「ＰＤ－１リガンド活性」という用語には、ＰＤ－１リガンドポリペプチドのその天然受容体（例えば、ＰＤ－１若しくはＢ７－１）に結合する能力、免疫細胞の共刺激又は阻害性シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力が含まれる。
「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、特定のＰＤ－１リガンドを指す。ヒトＰＤ－Ｌ１分子の２つの形態が同定されている。１つの形態は、天然に存在するＰＤ－Ｌ１可溶性ポリペプチド、すなわち、短い親水性ドメインを有し、膜貫通ドメインを有しないポリペプチドであり、本明細書ではＰＤ－Ｌ１Ｓと称される。第２の形態は、細胞関連ポリペプチドであり、すなわち、本明細書でＰＤ－Ｌ１Ｍと称される膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有する。ＰＤ－Ｌ１Ｍに関する代表的なヒトＰＤ－Ｌ１バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列は、ＮＭ＿０１４１４３．３及びＮＰ＿０５４８６２．１の下、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで一般に公開されている。ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、シグナル配列、並びにＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメインを含む。ＰＤ－Ｌ１Ｓのシグナル配列は、約アミノ酸１～約アミノ酸１８で示される。ＰＤ－Ｌ１Ｍのシグナル配列は、約アミノ酸１～約アミノ酸１８で示される。ＰＤ－Ｌ１ＳのＩｇＶドメインは、約アミノ酸１９～約アミノ酸１３４を示し、ＰＤ－Ｌ１ＭのＩｇＶドメインは、約アミノ酸１９～約アミノ酸１３４を示す。ＰＤ－Ｌ１ＳのＩｇＣドメインは、約アミノ酸１３５～約アミノ酸２２７を示し、ＰＤ－Ｌ１ＭのＩｇＣドメインは、約アミノ酸１３５～約アミノ酸２２７を示す。ＰＤ－Ｌ１Ｓに例示されるＰＤ－Ｌ１の親水性尾部は、約アミノ酸２２８～約アミノ酸２４５に示される親水性尾部を含む。ＰＤ－Ｌ１Ｍに例示されるＰＤ－Ｌ１ポリペプチドは、約アミノ酸２３９～約アミノ酸２５９に示される膜貫通ドメイン、及び約３０アミノ酸２６０～約アミノ酸２９０に示される細胞質ドメインを含む。加えて、ヒト以外の生物中のＰＤ－Ｌ１オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、マウスＰＤ－Ｌ１（ＮＭ＿０２１８９３．３及びＮＰ＿０６８６９３．１）、ラットＰＤ－Ｌ１（ＮＭ＿００１１９１９５４．１及びＮＰ＿００１１７８８８３．１）、イヌＰＤ－Ｌ１（ＸＭ＿５４１３０２．３及びＸＰ＿５４１３０２．３）、ウシＰＤ－Ｌ１（ＮＭ＿００１１６３４１２．１及びＮＰ＿００１１５６８８４．１）、並びにニワトリＰＤ－Ｌ１（ＸＭ＿４２４８１１．３及びＸＰ＿４２４８１１．３）が含まれる。
「ＰＤ－Ｌ２」という用語は、別の特定のＰＤ－１リガンドを指す。ＰＤ－Ｌ２は、樹状細胞、マクロファージ及び骨髄由来肥満細胞を含む、様々なＡＰＣ上に発現されるＢ７ファミリーメンバーである（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：２４０５を参照のこと）。ＡＰＣ発現ＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－１のライゲーションを介してＴ細胞活性化を阻害することができ、ＰＤ－１非依存的機構を介してＴ細胞活性化を共刺激することができる（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１５３１を参照のこと）。更に、樹状細胞発現ＰＤ－Ｌ２のライゲーションは、樹状細胞サイトカイン発現及び生存の増強をもたらす（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：１８２７、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１３９３を参照のこと）。代表的なヒトＰＤ－Ｌ２バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列は、当該技術分野で周知であり、またＮＭ＿０２５２３９．３及びＮＰ＿０７９５１５．２の下、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで一般に公開されている。ＰＤ－Ｌ２タンパク質は、共通の構造要素を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２タンパク質は、以下のドメイン：シグナルペプチドドメイン、膜貫通ドメイン、ＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインのうちの少なくとも１つ以上を含む。例えば、ＰＤ－Ｌ２のアミノ酸１～１９は、シグナル配列を含む。本明細書で使用される場合、「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、かかる配列を含有するポリペプチドを脂質二重層に導く役割を果たし、分泌ポリペプチド及び膜結合ポリペプチドで切断され、分泌ポリペプチド及び膜結合ポリペプチドのＮ末端で発生し、多数の疎水性アミノ酸残基を含有する約１５個以上のアミノ酸を含有するペプチドを含む。例えば、シグナル配列は、少なくとも約１０～３０個のアミノ酸残基、好ましくは約１５～２５個のアミノ酸残基、より好ましくは約１８～２０個のアミノ酸残基、更により好ましくは約１９個のアミノ酸残基を含み、少なくとも約３５～６５％、好ましくは約３８～５０％、より好ましくは約４０～４５％の疎水性アミノ酸残基（例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニン）を有する。別の実施形態では、天然ヒトＰＤ－Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基２２０－２４３及び成熟ポリペプチドのアミノ酸残基２０１－２４３は、膜貫通ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」という用語は、形質膜を貫通する約１５アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、膜貫通ドメインは、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、又は４５個のアミノ酸残基を含み、形質膜を貫通する。膜貫通ドメインは、疎水性残基が豊富であり、典型的には、アルファらせん構造を有する。好ましい実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上は、疎水性、例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシン、又はトリプトファンである。膜貫通ドメインは、例えば、Ｚａｇｏｔｔａ，Ｗ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２３５－２６３に記載されている。なお別の実施形態では、天然ヒトＰＤ－Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基２０～１２０及び成熟ポリペプチドのアミノ酸残基１～１０１は、ＩｇＶドメインを含む。天然ヒトＰＤ－Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１２１～２１９及び成熟ポリペプチドのアミノ酸残基１０２～２００は、ＩｇＣドメインを含む。本明細書で使用される場合、ＩｇＶ及びＩｇＣドメインは、当該技術分野において、Ｉｇスーパーファミリーメンバードメインとして認識される。これらのドメインは、Ｉｇフォールドと呼ばれる明確なフォールディングパターンを有する構造単位に対応する。Ｉｇフォールドは、２つのβシートのサンドイッチで構成され、各々が、全てではないがほとんどのドメインで、２つのシート間の保存されたジスルフィド結合を有する５～１０個のアミノ酸の逆平行（３鎖からなる。Ｉｇ、ＴＣＲ、及びＭＨＣ分子のＩｇＣドメインは、同じタイプの配列パターンを共有し、Ｉｇスーパーファミリー内のＣｌセットと呼ばれる。他のＩｇＣドメインは、他のセット内に入る。ＩｇＶドメインは配列パターンも共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインは、Ｃドメインよりも長く、追加の一対の鎖を形成する。更に別の実施形態では、天然ヒトＰＤ－Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１～２１９及び成熟ポリペプチドのアミノ酸残基１～２００は、細胞外ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「細胞外ドメイン」という用語は、細胞の表面から尾として延びるＮ末端アミノ酸を表す。本発明の細胞外ドメインは、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメインを含み、シグナルペプチドドメインを含み得る。なお別の実施形態では、天然ヒトＰＤ－Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基２４４～２７３及び成熟ポリペプチドのアミノ酸残基２２５～２７３は、細胞質ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「細胞質ドメイン」という用語は、細胞の細胞質内に尾部として延びるＣ末端アミノ酸を表す。加えて、ヒト以外の生物中のＰＤ－Ｌ２オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、マウスＰＤ－Ｌ２（ＮＭ＿０２１３９６．２及びＮＰ＿０６７３７１．１）、ラットＰＤ－Ｌ２（ＮＭ＿００１１０７５８２．２及びＮＰ＿００１１０１０５２．２）、イヌＰＤ－Ｌ２（ＸＭ＿８４７０１２．２及びＸＰ＿８５２１０５．２）、ウシＰＤ－Ｌ２（ＸＭ＿５８６８４６．５及びＸＰ＿５８６８４６．３）、並びにチンパンジーＰＤ－Ｌ２（ＸＭ＿００１１４０７７６．２及びＸＰ＿００１１４０７７６．１）が含まれる。
「ＰＤ－Ｌ２活性」、「ＰＤ－Ｌ２の生物学的活性」、又は「ＰＤ－Ｌ２の機能的活性」という用語は、標準的な技法に従って、インビボ又はインビトロで決定される、ＰＤ－Ｌ２応答性細胞若しくは組織上、又はＰＤ－Ｌ２ポリペプチド結合パートナー上でＰＤ－Ｌ２タンパク質、ポリペプチド、又は核酸分子によって発揮される活性を指す。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ２活性は、ＰＤ－Ｌ２結合パートナーとの会合などの直接的な活性である。本明細書で使用される場合、「標的分子」又は「結合パートナー」は、ＰＤ－Ｌ２を媒介する機能が達成されるように、ＰＤ－Ｌ２ポリペプチドが自然界で結合又は相互作用する分子である。例示的な実施形態では、ＰＤ－Ｌ２標的分子は、受容体ＲＧＭｂである。あるいは、ＰＤ－Ｌ２活性は、ＰＤ－Ｌ２ポリペプチドとその天然結合パートナー（すなわち、免疫機能又は他の生物学的に関連する機能に関与する生理学的に関連する相互作用巨大分子）、例えば、ＲＧＭｂとの相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達活性などの間接的活性である。ＰＤ－Ｌ２の生物学的活性は、本明細書に記載されている。例えば、本発明のＰＤ－Ｌ２ポリペプチドは、以下の活性のうちの１つ以上を有することができる：１）受容体ＲＧＭｂ、ＰＤ－１、又は他のＰＤ－Ｌ２天然結合パートナーに結合し、かつ／又はその活性を調節する、２）細胞内又は細胞間シグナル伝達を調節する、３）免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球の活性化を調節する、及び４）生物、例えば、マウス又はヒト生物の免疫応答を調節する。
「抗免疫チェックポイント療法」は、免疫チェックポイント核酸及び／又はタンパク質を阻害する薬剤の使用を指す。１つ以上の免疫チェックポイントの阻害により、阻害性シグナル伝達が遮断又はさもなければ中和され、それにより、がんをより有効に治療するために、免疫応答が上方制御され得る。免疫チェックポイントを阻害するのに有用な例示的な薬剤としては、免疫チェックポイントタンパク質に結合し、及び／又はこれを不活性化するか、又は阻害することが可能な抗体、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然リガンド、及び天然リガンドの誘導体、又はこれらの断片、並びに免疫チェックポイント核酸の発現及び／又は活性を下方制御することが可能なＲＮＡ干渉、アンチセンス、核酸アプタマーなど、又はこれらの断片が挙げられる。免疫応答を上方制御するための例示的な薬剤としては、タンパク質とその天然受容体との間の相互作用を遮断する１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質の非活性化形態（例えば、ドミナントネガティブポリペプチド）、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質とその天然受容体との間の相互作用を遮断する小分子又はペプチド、その天然受容体に結合する融合タンパク質（例えば、抗体又は免疫グロブリンのＦｃ部分に融合した免疫チェックポイント阻害タンパク質の細胞外部分）、免疫チェックポイント核酸転写又は翻訳を遮断する核酸分子などが挙げられる。かかる薬剤は、１つ以上の免疫チェックポイントとその天然受容体（例えば、抗体）との間の相互作用を直接的に遮断し、阻害性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御することができる。あるいは、薬剤は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質とその天然受容体との間の相互作用を間接的に遮断し、阻害性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御することができる。例えば、安定化した細胞外ドメインなどの免疫チェックポイントタンパク質リガンドの可溶性態様は、その受容体に結合して、適切なリガンドに結合するための受容体の有効濃度を間接的に低減することができる。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び／又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体を単独で、又は組み合わせて使用して、免疫チェックポイントを阻害する。これらの実施形態はまた、特定の免疫チェックポイントに対する特定の療法、例えば、ＰＤ－１経路（例えば、抗ＰＤ－１経路療法、別途ＰＤ－１経路阻害剤療法としても知られる）にも適用可能である。
「ユビキチン特異的ペプチダーゼ７」としても知られる「ＵＳＰ７」という用語は、ユビキチニルヒドロラーゼを含むＣ１９ペプチダーゼファミリーのメンバーを指す。ＵＳＰ７は、標的タンパク質（例えば、ＦＯＸＯ４、ｐ５３／ＴＰ５３、ＭＤＭ２、ＥＲＣＣ６、ＤＮＭＴ１、ＵＨＲＦ１、ＰＴＥＮ、ＫＭＴ２Ｅ／ＭＬＬ５、及びＤＡＸＸ）を脱ユビキチン化し、これは、脱ユビキチン化した標的タンパク質の分解を防止する。したがって、ＵＳＰ７は、ユビキチンリガーゼの活性に対抗する。
代表的なヒトＵＳＰ７の核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ７８７４）で一般に公開されており、表１に示される。いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＵＳＰ７について見出されている。ヒトＵＳＰ７バリアントとしては、アイソフォーム１をコードする転写バリアント１（ＮＭ＿００３４７０．３及びＮＰ＿００３４６１．２）、アイソフォーム２をコードする転写バリアント２（ＮＭ＿００１２８６４５７．２及びＮＰ＿００１２７３３８６．２）、アイソフォーム３をコードする転写バリアント３（ＮＭ＿００１２８６４５８．２及びＮＰ＿００１２７３３８７．１）、及びアイソフォーム４をコードする転写バリアント４（ＮＭ＿００１３２１８５８．１及びＮＰ＿００１３０８７８７．１）が挙げられる。
ヒト以外の生物におけるＵＳＰ７オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿０２４３４９７５３．１及びＸＰ＿０２４２０５５２１．１、ＸＭ＿０１６９２９３８４．２及びＸＰ＿０１６７８４８７３．１、ＸＭ＿０１６９２９３８５．２及びＸＰ＿０１６７８４８７４．１、並びにＸＭ＿０１６９２９３８８．２及びＸＰ＿０１６７８４８７７．１）、マカク（ＸＭ＿０１５１２５５９１．２及びＸＰ＿０１４９８１０７７．１、ＸＭ＿０１５１２５５９２．２及びＸＰ＿０１４９８１０７８．１、ＸＭ＿００２８０２３８９．３及びＸＰ＿００２８０２４３５．１、並びにＸＭ＿００２８０２３８８．３及びＸＰ＿００２８０２４３４．１）、オオカミ（ＸＭ＿００５６２１５５８．３及びＸＰ＿００５６２１６１５．１、並びにＸＭ＿００５６２１５５９．３及びＸＰ＿００５６２１６１６．１）、ウシ（ＸＭ＿０２４９８５４１４．１及びＸＰ＿０２４８４１１８２．１、並びにＸＭ＿００５２２４６６７．４及びＸＰ＿００５２２４７２４．１）、マウス（ＮＭ＿００１００３９１８．２及びＮＰ＿００１００３９１８．２、ＸＭ＿００６５２２１３８．３及びＸＰ＿００６５２２２０１．１、ＸＭ＿００６５２２１４１．３及びＸＰ＿００６５２２２０４．１、ＸＭ＿００６５２２１３９．３及びＸＰ＿００６５２２２０２．１、並びにＸＭ＿０３０２４９１１６．１及びＸＰ＿０３０１０４９７６．１）、ラット（ＮＭ＿００１０２４７９０．１及びＮＰ＿００１０１９９６１．１、ＸＭ＿００６２４５７５６．２及びＸＰ＿００６２４５８１８．１、ＸＭ＿００６２４５７５８．３及びＸＰ＿００６２４５８２０．１、ＸＭ＿００６２４５７５７．３及びＸＰ＿００６２４５８１９．１、並びにＸＭ＿００６２４５７５９．１及びＸＰ＿００６２４５８２１．１）、ニワトリ（ＮＭ＿００１３４８０１２．１及びＮＰ＿００１３３４９４１．１、ＮＭ＿２０４４７１．２及びＮＰ＿９８９８０２．２、並びにＸＭ＿０２５１５５０４３．１及びＸＰ＿０２５０１０８１１．１）、カエル（ＸＭ＿０１２９７０９２０．３及びＸＰ＿０１２８２６３７４．１、並びにＸＭ＿００２９３９４４９．５及びＸＰ＿００２９３９４９５．２）、ゼブラフィッシュ（ＸＭ＿００５１６３９５７．３及びＸＰ＿００５１６４０１４．１、ＸＭ＿６８６１２３．９及びＸＰ＿６９１２１５．４、ＸＭ＿０２１４７３８７１．１及びＸＰ＿０２１３２９５４６．１、ＸＭ＿００９２９９４６６．３及びＸＰ＿００９２９７７４１．１、ＸＭ＿００９２９９４６４．３及びＸＰ＿００９２９７７３９．２、並びにＸＭ＿００９２９９４６５．３及びＸＰ＿００９２９７７４０．２）、並びにミバエ（ＮＭ＿１３２５５１．３及びＮＰ＿５７２７７９．２、並びにＮＭ＿００１２９８２２０．１及びＮＰ＿００１２８５１４９．１）が含まれる。
「ＵＳＰ７活性」という用語は、ＵＳＰ７ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はユビキチナーゼ活性を触媒する能力を含む。
「ＵＳＰ７阻害剤」という用語には、ＵＳＰ７ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の能力を低減、阻害、遮断、予防、及び／又は阻害することができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製される任意の天然又は非天然の薬剤が含まれる。一実施形態では、かかる阻害剤は、ＵＳＰ７とその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を低減又は阻害し得る。なお別の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加又は促進し、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を低減若しくは阻害し、かつ／又はＵＳＰ７の細胞局在を変化させ、少なくともＵＳＰ７レベル及び／又は活性の減少をもたらし得る。更に別の実施形態では、かかる阻害剤は、ＵＳＰ７の触媒活性を損ない得る。なお別の実施形態では、阻害剤は、ＵＳＰ７のデユビキチナーゼ活性を阻害する。かかる阻害剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる阻害剤は、ＵＳＰ７に特異的であり得るか、又は結合パートナーのうちの少なくとも１つを阻害してもよい。かかる阻害剤としては、ＸＬ１７７Ａ及び／又はＸＬ１８８を含み得る（Ｓｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，５３２４（２０２０））。したがって、一実施形態では、ＵＳＰ７阻害剤は、ＸＬ１７７Ａであり、これは以下の構造を有する。
別の実施形態では、ＵＳＰ７阻害剤は、ＸＬ１８８であり、これは以下の構造を有する。
Figure 2023529026000002
 かかる阻害剤は、Ｐ－２２０７７（Ｃａｓ番号１２４７８１９－５９－５）を含んでもよい。追加のＵＳＰ７阻害剤は、当該技術分野において、例えば、ＰＣＴ公開第２０１９／０６７５０３号、ＵＳＳＮ１６／６５０，７２７、及びＰＣＴ公開第２０２０／０８６５９５号において知られている。
ＵＳＰ７ポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（カタログ番号ＴＬ３０８４５４Ｖ、ＴＲ３０８４５４、ＳＲ３０５３０１、ＴＬ３０８４５４、ＳＲ４２２０７６、ＴＬ３０８４５４Ｖ、ＴＦ３０８４５４、ＴＬ５１３４９６、ＳＲ５１３２１５、ＴＲ５１３４９６、ＴＲ７０２７０１、ＴＬ７０２７０１、ＴＬ７０２７０１Ｖ、及びＴＬ５１３４９６Ｖ、並びにＯｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ４１３９８６、ＫＮ５１８８１４、ＫＮ２１３９８６、ＫＮ３１８８１４、ＫＮ２１３９８６ＬＰ、ＫＮ２１３９８６ＲＢ、ＫＮ２１３９８６ＢＮ、ＫＮ３１８８１４ＬＰ、ＫＮ３１８８１４ＢＮ、及びＫＮ３１８８１４ＲＢ）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－４１５２１及びｓｃ－７７３７３）。（例えば、抗ＵＳＰ７抗体による）ＵＳＰ７の検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙからの複数のＵＳＰ７抗体（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐａｒｋ，ＭＤ、カタログ番号３８４０１、２７０４１、及び４３１７８）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｗａｙｎｅ，ＰＡ、カタログ番号１１６８１－ＭＭ０１）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、カタログ番号カタログ番号ＰＡ５－１７１７９、カタログ番号ＭＡ５－１５５８５等）。ＵＳＰ７ノックアウトヒト細胞株もまた、周知であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ＨＤ１１５－０２８、ＨＤＲ０２－０２９、及びＨＤＲ０２－０２８）で入手可能である。
「ＭＹＣＬがん原遺伝子、ｂＨＬＨ転写因子」としても知られる「ＭＹＣＬ」という用語は、ＤＮＡ結合及び転写因子活性を有するｂＨＬＨタンパク質及びポリコーム抑制複合体（ＰＲＣ）１．１のメンバーを指す。効率的なＤＮＡ結合は、別のｂＨＬＨタンパク質（例えば、ＭＡＸ）との二量体化を必要とする。
「ＭＹＣＬ」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。代表的なヒトＭＹＣＬの核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ４６１０）で一般に公開されており、表１に示される。ＭＹＣＬについては、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが見出されている。ヒトＭＹＣＬバリアントとしては、アイソフォーム１をコードする転写バリアント１（ＮＭ＿００１０３３０８１．３及びＮＰ＿００１０２８２５３．１）、アイソフォーム２をコードする転写バリアント２（ＮＭ＿００５３７６．５及びＮＰ＿００５３６７．２）、及びアイソフォーム３をコードする転写バリアント３（ＮＭ＿００１０３３０８２．３及びＮＰ＿００１０２８２５４．２）が挙げられる。
ヒト以外の生物におけるＭＹＣＬオルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿０１６９５９８１４．２及びＸＰ＿０１６８１５３０３．２）、アカゲザル（ＸＭ＿０２８８３５４９７．１及びＸＰ＿０２８６９１３３０．１、並びにＸＭ＿０１５１３６０１９．２及びＸＰ＿０１４９９１５０５．２）、イヌ（ＸＭ＿０２２４２７７６８．１及びＸＰ＿０２２２８３４７６．１、ＸＭ＿０２２４２７７６９．１及びＸＰ＿０２２２８３４７７．１、ＸＭ＿０２２４２７７７５．１及びＸＰ＿０２２２８３４８３．１、ＸＭ＿０２２４２７７７４．１及びＸＰ＿０２２２８３４８２．１、ＸＭ＿０２２４２７７７８．１及びＸＰ＿０２２２８３４８６．１、ＸＭ＿０２２４２７７６７．１及びＸＰ＿０２２２８３４７５．１、ＸＭ＿０２２４２７７７２．１及びＸＰ＿０２２２８３４８０．１、ＸＭ＿００５６２８８８７．３及びＸＰ＿００５６２８９４４．１、ＸＭ＿０２２４２７７７７．１及びＸＰ＿０２２２８３４８５．１、ＸＭ＿０２２４２７７８０．１及びＸＰ＿０２２２８３４８８．１、ＸＭ＿０２２４２７７７１．１及びＸＰ＿０２２２８３４７９．１、ＸＭ＿０１４１１９３３３．２及びＸＰ＿０１３９７４８０８．１、ＸＭ＿０２２４２７７７９．１及びＸＰ＿０２２２８３４８７．１、ＸＭ＿０２２４２７７７３．１及びＸＰ＿０２２２８３４８１．１、ＸＭ＿０２２４２７７７６．１及びＸＰ＿０２２２８３４８４．１、ＸＭ＿０２２４２７７８１．１及びＸＰ＿０２２２８３４８９．１、ＸＭ＿００５６２８８８８．３及びＸＰ＿００５６２８９４５．１、並びにＸＭ＿５３９５７８．６及びＸＰ＿５３９５７８．２）、ウシ（ＸＭ＿００５２０４９２８．４及びＸＰ＿００５２０４９８５．１）、マウス（ＮＭ＿００１３０３１２１．１及びＮＰ＿００１２９００５０．１、並びにＮＭ＿００８５０６．３及びＮＰ＿０３２５３２．１）、並びにラット（ＮＭ＿００１１９１７６３．１及びＮＰ＿００１１７８６９２．１）、ニワトリ（ＸＭ＿４２５７９０．６及びＸＰ＿４２５７９０．２）、カエル（ＮＭ＿００１０１１１４４．１及びＮＰ＿００１０１１１４４．１）、並びにゼブラフィッシュ（ＮＭ＿００１０４５１４２．１及びＮＰ＿００１０３８６０７．１）が含まれる。
「ＭＹＣＬ活性」という用語は、ＭＹＣＬポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）がＤＮＡに結合し、かつ／又は転写を活性化する能力を含む。
「ＭＹＣＬ制御経路」という用語は、ＭＹＣＬ（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、テンプレートＤＮＡに結合し、経路内の少なくとも１つの遺伝子の転写を活性化する経路を含む。ＭＹＣＬ制御経路には、少なくとも本明細書に記載されるもの、例えば、ＨＬＡ ＩなどのＭＨＣクラスＩ、がん細胞における表面発現を抑制する遺伝子の発現の制御が含まれる。
「ＭＹＣＬ阻害剤」という用語には、ＭＹＣＬポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の能力を低減、阻害、遮断、予防、及び／又は阻害することができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製される任意の天然又は非天然の薬剤が含まれる。一実施形態では、かかる阻害剤は、ＭＹＣＬとＤＮＡ又はＭＹＣＬとその結合パートナーとの間の結合／相互作用を低減又は阻害し得る。別の実施形態では、かかる阻害剤は、転写因子としてＭＹＣＬを低減又は阻害し得る。なお別の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加又は促進し、発現及び／又は安定性（例えば、半減期）を低減又は阻害し、かつ／又はＭＹＣＬの細胞局在を変化させ、少なくともＭＹＣＬレベル及び／若しくは活性の減少をもたらし得る。更に別の実施形態では、かかる阻害剤は、ＭＣＹＬの触媒活性を損ない得る。なお別の実施形態では、阻害剤は、ＭＹＣＬの転写活性を阻害する。かかる阻害剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる阻害剤は、ＭＹＣＬに特異的であり得るか、又は結合パートナーのうちの少なくとも１つを阻害してもよい。ＭＹＣＬポリペプチドに対するＲＮＡ干渉分子は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅからのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（カタログ番号ＴＬ３１１３２１Ｖ、ＳＲ３０３０２６、ＴＬ５１３６１２、ＳＲ４１２４１６、ＴＲ５１３６１２、ＴＲ３１１３２１、ＳＲ３０３０２６、ＴＬ３１１３２１、ＴＬ５１３６１２Ｖ、ＴＬ３１１３２１Ｖ、及びＴＬ３１６６２６Ｖ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙからのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－３８０７１）。（例えば、抗ＭＹＣＬ抗体による）ＭＹＣＬの検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（カタログ番号ＴＡ３３９１１０及びＴＡ５９０６０４）、Ｂｉｏｒｙｂｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ｏｒｂ３２４６１９ ｏｒｂ５４０５２０）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号ＰＡ１－３００４５、ＰＡ５－１０９９９８等）、ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、カタログ番号ａｂ２８７３９、ａｂ１６７３１５など）からの複数のＭＹＣＬ抗体等）。ＭＹＣＬノックアウトヒト細胞株もまた周知であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ（カタログ番号ＨＺＧＨＣ４６１０）で入手可能である。
「リジンデメチラーゼ２Ｂ」としても知られる「ＫＤＭ２Ｂ」という用語は、ヒストンＨ３の「Ｌｙｓ－４」及び「Ｌｙｓ－３６」を脱メチル化するヒストンデメチラーゼを指す。ＫＤＭ２Ｂは、「Ｆ－ｂｏｘ」を特徴とするＦ－ｂｏｘタンパク質ファミリーのメンバーであり、およそ４０個のアミノ酸モチーフＦ－ｂｏｘタンパク質は、ＳＣＦ（ＳＫＰ１－キュリン－Ｆ－ｂｏｘ）と呼ばれるユビキチンタンパク質リガーゼ複合体の構成要素である。Ｆ－ｂｏｘタンパク質には、３つのクラスがある。Ｆｂｗｓ Ｆ－ｂｏｘタンパク質は、ＷＤ－４０ドメインを含み、Ｆｂｌｓ Ｆ－ｂｏｘタンパク質は、ロイシンリッチリピートを含有することを含み、Ｆｂｘｓ Ｆ－ｂｏｘタンパク質は、異なるタンパク質－タンパク質相互作用モジュールを含むか、又は認識可能なモチーフを含まない。ＫＤＭ２Ｂは、Ｆｂｌｓクラスに属する。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。
「ＫＤＭ２Ｂ」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＫＤＭ２Ｂの核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ８４６７８）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも５つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＫＤＭ２Ｂについて見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８ＮＨＭ５でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＫＤＭ２Ｂバリアントには、アイソフォームｂをコードする転写バリアント１（ＮＭ＿００１００５３６６．２及びＮＰ＿００１００５３６６．１）、アイソフォームａをコードする転写バリアント２（ＮＭ＿０３２５９０．５及びＮＰ＿１１５９７９．３）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアント３（ＸＭ＿０１１５３８８６７．３及びＸＰ＿０１１５３７１６９．１）、アイソフォームＸ２をコードする転写バリアント４（ＸＭ＿０１１５３８８６８．３及びＸＰ＿０１１５３７１７０．１）、アイソフォームＸ４をコードする転写バリアント５（ＸＭ＿００５２５３９５５．４及びＸＰ＿００５２５４０１２．１）、アイソフォームＸ５をコードする転写バリアント６（ＸＭ＿００５２５３９５６．４及びＸＰ＿００５２５４０１３．１）、アイソフォームＸ７をコードする転写バリアント７（ＸＭ＿００５２５３９６１．５及びＸＰ＿００５２５４０１８．１）、アイソフォームＸ６をコードする転写バリアント８（ＸＭ＿０１１５３８８７５．３及びＸＰ＿０１１５３７１７７．１）、並びにアイソフォームＸ３をコードする転写バリアント９（ＸＭ＿０１１５３８８６９．２及びＸＰ＿０１１５３７１７１．１）が含まれる。ヒト以外の生物におけるＫＤＭ２Ｂオルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿０２４３４８０８７．１及びＸＰ＿０２４２０３８５５．１、ＸＭ＿０２４３４８０８２．１及びＸＰ＿０２４２０３８５０．１、ＸＭ＿０２４３４８０８０．１及びＸＰ＿０２４２０３８４８．、ＸＭ＿０２４３４８０７９．１及びＸＰ＿０２４２０３８４７．１、ＸＭ＿００９４２６４２６．３及びＸＰ＿００９４２４７０１．１、ＸＭ＿００９４２６４３６．３及びＸＰ＿００９４２４７１１．１、ＸＭ＿０２４３４８０８５．１及びＸＰ＿０２４２０３８５３．１、ＸＭ＿０２４３４８０８８．１及びＸＰ＿０２４２０３８５６．１、ＸＭ＿０２４３４８０９０．１及びＸＰ＿０２４２０３８５８．１、ＸＭ＿０２４３４８０８６．１及びＸＰ＿０２４２０３８５４．１、ＸＭ＿０２４３４８０８３．１及びＸＰ＿０２４２０３８５１．１、ＸＭ＿０２４３４８０９４．１及びＸＰ＿０２４２０３８６２．１、ＸＭ＿０２４３４８０８９．１及びＸＰ＿０２４２０３８５７．１、ＸＭ＿０２４３４８０９１．１及びＸＰ＿０２４２０３８５９．１、ＸＭ＿０２４３４８０９２．１及びＸＰ＿０２４２０３８６０．１、ＸＭ＿０２４３４８０９３．１及びＸＰ＿０２４２０３８６１．１、ＸＭ＿００９４２６４４０．３及びＸＰ＿００９４２４７１５．１、ＸＭ＿０２４３４８０８４．１及びＸＰ＿０２４２０３８５２．１、ＸＭ＿００１１６４９９６．５及びＸＰ＿００１１６４９９６．１、ＸＭ＿０１６９２４４１９．２及びＸＰ＿０１６７７９９０８．、ＸＭ＿０２４３４８０８１．１及びＸＰ＿０２４２０３８４９．１、ＸＭ＿００９４２６４２９．３及びＸＰ＿００９４２４７０４．１、並びにＸＭ＿００９４２６４３１．３及びＸＰ＿００９４２４７０６．１）、アカゲザル（ＸＭ＿０２８８３０００２．１及びＸＰ＿０２８６８５８３５．、ＸＭ＿０１５１５２９９２．２及びＸＰ＿０１５００８４７８．、ＸＭ＿０１５１５２９９６．２及びＸＰ＿０１５００８４８２．、ＸＭ＿０１５１５２９９１．２及びＸＰ＿０１５００８４７７．、ＸＭ＿０１５１５３０００．２及びＸＰ＿０１５００８４８６．、ＸＭ＿０１５１５２９９８．２及びＸＰ＿０１５００８４８４．、ＸＭ＿０１５１５２９９３．２及びＸＰ＿０１５００８４７９．、ＸＭ＿０１５１５２９９４．２及びＸＰ＿０１５００８４８０．、ＸＭ＿０１５１５２９９９．２及びＸＰ＿０１５００８４８５．、ＸＭ＿０１５１５２９９７．２及びＸＰ＿０１５００８４８３．、ＸＭ＿０１５１５２９９５．２及びＸＰ＿０１５００８４８１．、ＸＭ＿０２８８３０００４．１及びＸＰ＿０２８６８５８３７．、ＸＭ＿０１５１５３００３．２及びＸＰ＿０１５００８４８９．、ＸＭ＿０１５１５３００２．２及びＸＰ＿０１５００８４８８．、ＸＭ＿０１５１５３００１．２及びＸＰ＿０１５００８４８７．、並びにＸＭ＿０２８８３０００３．１及びＸＰ＿０２８６８５８３６．１）、イヌ（ＸＭ＿００５６３６１９３．３及びＸＰ＿００５６３６２５０．、ＸＭ＿０２２４１０６８３．１及びＸＰ＿０２２２６６３９１．、ＸＭ＿０２２４１０６８２．１及びＸＰ＿０２２２６６３９０．、ＸＭ＿００５６３６１８６．３及びＸＰ＿００５６３６２４３．、ＸＭ＿００５６３６１９１．３及びＸＰ＿００５６３６２４８．、ＸＭ＿００５６３６１８７．３及びＸＰ＿００５６３６２４４．、ＸＭ＿０２２４１０６８７．１及びＸＰ＿０２２２６６３９５．、ＸＭ＿００５６３６１８８．３及びＸＰ＿００５６３６２４５．、ＸＭ＿００５６３６１８９．３及びＸＰ＿００５６３６２４６．、ＸＭ＿０２２４１０６８８．１及びＸＰ＿０２２２６６３９６．、ＸＭ＿００５６３６１９２．１及びＸＰ＿００５６３６２４９．、ＸＭ＿０２２４１０６８６．１及びＸＰ＿０２２２６６３９４．、ＸＭ＿０２２４１０６８５．１及びＸＰ＿０２２２６６３９３．、ＸＭ＿０２２４１０６８９．１及びＸＰ＿０２２２６６３９７．、ＸＭ＿００５６３６１９４．３及びＸＰ＿００５６３６２５１．、ＸＭ＿００５６３６１９５．１及びＸＰ＿００５６３６２５２．、ＸＭ＿００５６３６１９７．３及びＸＰ＿００５６３６２５４．１、並びにＸＭ＿００５６３６１９６．２及びＸＰ＿００５６３６２５３．２）、ウシ（ＸＭ＿０１０８１４０３０．３及びＸＰ＿０１０８１２３３２．、ＸＭ＿００５２１７９８０．４及びＸＰ＿００５２１８０３７．、ＸＭ＿００５２１７９８３．４及びＸＰ＿００５２１８０４０．、ＸＭ＿０２４９７７７０８．１及びＸＰ＿０２４８３３４７６．、ＸＭ＿０２４９７７７０９．１及びＸＰ＿０２４８３３４７７．、ＸＭ＿００５２１７９８２．２及びＸＰ＿００５２１８０３９．、ＸＭ＿００５２１７９８５．２及びＸＰ＿００５２１８０４２．、ＸＭ＿０２４９７７７０４．１及びＸＰ＿０２４８３３４７２．、ＸＭ＿０２４９７７７０５．１及びＸＰ＿０２４８３３４７３．、ＸＭ＿０２４９７７７０６．１及びＸＰ＿０２４８３３４７４．、ＸＭ＿０２４９７７７０７．１及びＸＰ＿０２４８３３４７５．、ＸＭ＿０２４９７７７１１．１及びＸＰ＿０２４８３３４７９．、並びにＸＭ＿０２４９７７７１０．１及びＸＰ＿０２４８３３４７８．１）、マウス（ＮＭ＿００１００３９５３．２及びＮＰ＿００１００３９５３．、ＮＭ＿００１３７８８６３．１及びＮＰ＿００１３６５７９２．１、ＮＭ＿００１３７８８６４．１及びＮＰ＿００１３６５７９３．１、ＮＭ＿００１３７８８６５．１及びＮＰ＿００１３６５７９４．１、ＮＭ＿０１３９１０．２及びＮＰ＿０３８９３８．、ＸＭ＿００６５３０３７６．４及びＸＰ＿００６５３０４３９．、ＸＭ＿０１１２４８２１０．３及びＸＰ＿０１１２４６５１２．、ＸＭ＿０１１２４８２０８．３及びＸＰ＿０１１２４６５１０．、ＸＭ＿０１１２４８２１２．３及びＸＰ＿０１１２４６５１４．、ＸＭ＿０１１２４８２１１．３及びＸＰ＿０１１２４６５１３．、ＸＭ＿０３０２５４５５８．１及びＸＰ＿０３０１１０４１８．、ＸＭ＿０１１２４８２１５．２及びＸＰ＿０１１２４６５１７．、ＸＭ＿０１１２４８２１４．３及びＸＰ＿０１１２４６５１６．、ＸＭ＿０１１２４８２１３．３及びＸＰ＿０１１２４６５１５．、ＸＭ＿０１１２４８２１６．２及びＸＰ＿０１１２４６５１８．、ＸＭ＿０１１２４８２１７．３及びＸＰ＿０１１２４６５１９．、並びにＸＭ＿０３０２５４５６０．１及びＸＰ＿０３０１１０４２０．１）、ラット（ＮＭ＿００１１００６７９．１及びＮＰ＿００１０９４１４９．１、並びにＸＭ＿０１７５９８３３７．１及びＸＰ＿０１７４５３８２６．１）、ニワトリ（ＸＭ＿０２５１５５６３１．１及びＸＰ＿０２５０１１３９９．、ＸＭ＿００４９４５５５９．３及びＸＰ＿００４９４５６１６．、ＸＭ＿００４９４５５５５．３及びＸＰ＿００４９４５６１２．、ＸＭ＿００４９４５５５３．３及びＸＰ＿００４９４５６１０．、ＸＭ＿００４９４５５５７．３及びＸＰ＿００４９４５６１４．、ＸＭ＿０１５２７５５９４．２及びＸＰ＿０１５１３１０８０．、ＸＭ＿００４９４５５５８．３及びＸＰ＿００４９４５６１５．、ＸＭ＿００４９４５５５６．３及びＸＰ＿００４９４５６１３．、ＸＭ＿０１５２７５５９３．２及びＸＰ＿０１５１３１０７９．、ＸＭ＿００４９４５５６２．２及びＸＰ＿００４９４５６１９．、ＸＭ＿００４９４５５６３．３及びＸＰ＿００４９４５６２０．、並びにＸＭ＿００４９４５５６１．１及びＸＰ＿００４９４５６１８．１）、並びにカエル（ＸＭ＿０３１８９２６３０．１及びＸＰ＿０３１７４８４９０．１、ＸＭ＿０３１８９２６３１．１及びＸＰ＿０３１７４８４９１．１、ＸＭ＿０３１８９２６３８．１及びＸＰ＿０３１７４８４９８．１、ＸＭ＿０３１８９２６４６．１及びＸＰ＿０３１７４８５０６．１、並びにＸＭ＿０３１８９２６５５．１及びＸＰ＿０３１７４８５１５．１）が含まれる。
「ＫＤＭ２Ｂ活性」という用語は、ＫＤＭ２Ｂポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はそのデメチラーゼ活性を媒介する能力を含む。
「ＫＤＭ２Ｂ基質」という用語は、ＫＤＭ２Ｂポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）、例えば、ＳＫＰ１及びキュリンタンパク質を含む、本明細書に列挙されるタンパク質の結合パートナーを指す。「ＫＤＭ２Ｂ制御経路」という用語は、ＫＤＭ２Ｂ（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＫＤＭ２Ｂ制御経路には、ヒストン修飾の正又は負の制御など、少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＫＤＭ２Ｂのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＫＤＭ２Ｂの量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＫＤＭ２Ｂポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＫＤＭ２Ｂとその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。例えば、薬剤は、ヒストンに対するＫＤＭ２Ｂの認識及び／又は結合を増加させ、それによってヒストンの脱メチル化を減少させ得る。他の実施形態では、薬剤は、ＫＤＭ２Ｂポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＫＤＭ２Ｂの活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＫＤＭ２Ｂの細胞局在を変化させ、少なくともＫＤＭ２Ｂレベル及び／若しくは活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＫＤＭ２Ｂ又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＳＣＦ又はキュリンポリペプチドを含むが、これらに限定されない、ＫＤＭ２Ｂ又は結合パートナーのうちの少なくとも１つに特異的であってもよい。ＫＤＭ２Ｂの検出のための抗体は、市販されている（カタログ番号ＡＰ０８５９２ＰＵ－Ｎ ＡＰ５１６２０ＰＵ－Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ａｂ２３４０８２、ａｂ５１９９（Ａｂｃａｍ）；ａｂ２３４０８２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ＫＤＭ２Ｂポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（カタログ番号ＴＬ３１３０４６Ｖ、ＳＲ３２５３６４、ＳＲ４２００３５、ＳＲ３２５３６４、ＴＬ３１３０４６、ＴＧ３１３０４６、ＴＦ５１４０１７、ＴＬ３１３０４６Ｖ、ＴＲ３１３０４６、ＴＲ５１４０１７、ＴＬ５１４０１７Ｖ、ＴＬ５１４０１７、及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ４１３９９９、ＫＮ５０８７３１）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－７５００５及びｓｃ－７５００６）。（例えば、抗ＫＤＭ２Ｂ抗体による）ＫＤＭ２Ｂの検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（カタログ番号ＡＰ０８５９２ＰＵ－Ｎ ＡＰ５１６２０ＰＵ－Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ａｂ２３４０８２、ａｂ５１９９（Ａｂｃａｍ）；ａｂ２３４０８２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。加えて、ヒトＫＤＭ２Ｂノックアウト細胞株は、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ＨＺＧＨＣ０１４７３０ｃ０１２）から市販されている。
「ＢＣＯＲＬ１」という用語は、「ＢＣＬ６コリプレッサー様１」としても知られており、ＤＮＡ結合タンパク質によってプロモーター領域につながれていることが見出される転写コリプレッサーを指す。ＢＣＯＲＬ１は、いくつかのクラスＩＩヒストンデアセチラーゼと相互作用して、転写を抑制することができる。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。「ＢＣＯＲＬ１」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＢＣＯＲＬ１の核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ６３０３５）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも３つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＢＣＯＲＬ１について見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ５Ｈ９Ｆ３でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＢＣＯＲＬ１バリアントには、アイソフォーム１ａをコードする転写バリアント１（ＮＭ＿００１１８４７７２．３及びＮＰ＿００１１７１７０１、ＮＭ＿００１３７９４５０．１及びＮＰ＿００１３６６３７９、並びにＮＭ＿００１３７９４５１．１及びＮＰ＿００１３６６３８０．）、アイソフォーム１をコードする転写バリアント２（ＮＭ＿０２１９４６．５及びＮＰ＿０６８７６５．３）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアント３（ＸＭ＿００５２６２４５３．４及びＸＰ＿００５２６２５１０．１、ＸＭ＿００６７２４７７７．３及びＸＰ＿００６７２４８４０．１、ＸＭ＿０１７０２９７２１．１及びＸＰ＿０１６８８５２１０．１、ＸＭ＿００６７２４７７６．３及びＸＰ＿００６７２４８３９．１、ＸＭ＿００５２６２４５５．４及びＸＰ＿００５２６２５１２．２、並びにＸＭ＿０１７０２９７２２．１及びＸＰ＿０１６８８５２１１．１）、アイソフォームＸ３をコードする転写バリアント４（ＸＭ＿００５２６２４５６．４及びＸＰ＿００５２６２５１３．２）、並びにアイソフォームＸ２をコードする転写バリアント４（ＸＭ＿００６７２４７７９．２及びＸＰ＿００６７２４８４２．１）が含まれる。
ヒト以外の生物におけるＢＣＯＲＬ１オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿０１６９４３８６３．２及びＸＰ＿０１６７９９３５２．１、ＸＭ＿０１６９４３８６７．１及びＸＰ＿０１６７９９３５６．１、ＸＭ＿０１６９４３８６１．１及びＸＰ＿０１６７９９３５０．１、ＸＭ＿０１６９４３８７０．１及びＸＰ＿０１６７９９３５９．、ＸＭ＿０１６９４３８６２．１及びＸＰ＿０１６７９９３５１．１、ＸＭ＿０２４３５３３２７．１及びＸＰ＿０２４２０９０９５．１、ＸＭ＿０１６９４３８６４．２及びＸＰ＿０１６７９９３５３．１、ＸＭ＿０１６９４３８６８．２及びＸＰ＿０１６７９９３５７．１、ＸＭ＿０１６９４３８６６．２及びＸＰ＿０１６７９９３５５．１、並びにＸＭ＿０１６９４３８６５．１及びＸＰ＿０１６７９９３５４．１）、アカゲザル（ＸＭ＿０２８８４２４８７．１及びＸＰ＿０２８６９８３２０．、ＸＭ＿０２８８４２４８２．１及びＸＰ＿０２８６９８３１５．、ＸＭ＿０２８８４２４８６．１及びＸＰ＿０２８６９８３１９．、ＸＭ＿０２８８４２４８４．１及びＸＰ＿０２８６９８３１７．、ＸＭ＿０２８８４２４８３．１及びＸＰ＿０２８６９８３１６．、ＸＭ＿０１５１２８１８１．２及びＸＰ＿０１４９８３６６７．２、ＸＭ＿０１５１２８１８３．２及びＸＰ＿０１４９８３６６９．２、並びにＸＭ＿０２８８４２４８５．１及びＸＰ＿０２８６９８３１８．１）、イヌ（ＸＭ＿００５６４１７９４．３及びＸＰ＿００５６４１８５１．１、ＸＭ＿０２２４１６３２５．１及びＸＰ＿０２２２７２０３３．１、ＸＭ＿５３８１６９．６及びＸＰ＿５３８１６９．３、並びにＸＭ＿００５６４１７９３．３及びＸＰ＿００５６４１８５０．１）、ウシ（ＸＭ＿００５２２７５０４．４及びＸＰ＿００５２２７５６１．１、ＸＭ＿００５２２７５０５．４及びＸＰ＿００５２２７５６２．１、並びにＸＭ＿００２６９９５１８．５及びＸＰ＿００２６９９５６４．２）、マウス（ＮＭ＿１７８７８２．４及びＮＰ＿８４８８９７．３）、ラット（ＮＭ＿００１１９１５８７．１及びＮＰ＿００１１７８５１６．１）、ニワトリ（ＸＭ＿０１５２７８３６３．２及びＸＰ＿０１５１３３８４９．１、ＸＭ＿０１５２７８３６２．２及びＸＰ＿０１５１３３８４８．１、並びにＸＭ＿０２５１５０３２３．１及びＸＰ＿０２５００６０９１．１）、並びにカエルＮＭ＿００１１４２０７０．１及びＮＰ＿００１１３５５４２．１、ＸＭ＿０１２９６８１１１．３及びＸＰ＿０１２８２３５６５．１、ＸＭ＿０１８０９６１７４．２及びＸＰ＿０１７９５１６６３．１、ＸＭ＿０１２９６８１０９．３及びＸＰ＿０１２８２３５６３．１、並びにＸＭ＿０１２９６８１１２．３及びＸＰ＿０１２８２３５６６．１が含まれる。
「ＢＣＯＲＬ１活性」という用語は、ＢＣＯＲＬ１ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はその転写抑制活性を媒介する能力を含む。
「ＢＣＯＲＬ１基質」という用語は、本明細書で論じられるＢＣＯＲＬ１ポリペプチド（並びに及びその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）の結合パートナーを指す。
「ＢＣＯＲＬ１制御経路」という用語は、ＢＣＯＲＬ１（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、それを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＢＣＯＲＬ１制御経路には、転写制御などの少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＢＣＯＲＬ１のコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＢＣＯＲＬ１の量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＢＣＯＲＬ１ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＢＣＯＲＬ１とその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＢＣＯＲＬ１ポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＢＣＯＲＬ１の活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＢＣＯＲＬ１の細胞局在を変化させ、少なくともＢＣＯＲＬ１レベル及び／若しくは活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＢＣＯＲＬ１又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＢＣＯＲＬ１に特異的であり得るか、又はその結合パートナーの少なくとも１つにも特異的であり得る。ＢＣＯＲＬ１ポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（カタログ番号ＴＬ３０６４１４Ｖ、ＴＦ３０６４１４、ＴＲ５１９８３９、ＴＲ３０６４１４、ＳＲ３１１８６７、ＴＬ３０６４１４、ＳＲ４２３２０１）、及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ４１９２９７、ＫＮ５０２１２１）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－１４１６８０）。（例えば、抗ＢＣＯＲＬ１抗体による）ＢＣＯＲＬ１の検出、精製、及び／又は阻害のための方法も周知であり、市販されている（カタログ番号ａｂ２５１８１６）、ａｂ２５１８１７）（Ａｂｃａｍ）。（ＢＣＯＲＬ１ノックアウトヒト細胞株もまた周知であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ＨＺＧＨＣ６３０３５８）で入手可能である。
「ｒｉｎｇフィンガータンパク質１」としても知られる「ＲＩＮＧ１Ａ」という用語は、ＲＩＮＧファミリーに属する遺伝子又はタンパク質を指す。Ｒｉｎｇファミリーメンバーは、亜鉛フィンガードメインに関連する亜鉛結合モチーフであるＲＩＮＧドメインを有することを特徴とする。ＲＩＮＧ１Ａは、ポリコーム基複合体タンパク質ＢＭＩ、ＥＤＲ１、及びＣＢＸ４と相互作用する。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。「ＲＩＮＧ１Ａ」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＲＩＮＧ１Ａの核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ６０１５）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも２つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＲＩＮＧ１Ａについて見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ０６５８７でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＲＩＮＧ１Ａバリアントは、アイソフォーム１をコードする転写バリアント１（ＮＭ＿００２９３１．４及びＮＰ＿００２９２２．２）を含む。
ヒト以外の生物におけるＲＩＮＧ１Ａオルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＮＭ＿００１０８１４８２．１及びＮＰ＿００１０７４９５１．１、ＸＭ＿００９４５０８４９．３及びＸＰ＿００９４４９１２４．１、並びにＸＭ＿０１６９５４６５８．２及びＸＰ＿０１６８１０１４７．１）、アカゲザル（ＮＭ＿００１１１４９５９．１及びＮＰ＿００１１０８４３１．１、ＸＭ＿０２８８４６８５６．１及びＸＰ＿０２８７０２６８９．１、並びにＸＭ＿０１５１３６０６７．２及びＸＰ＿０１４９９１５５３．１）、イヌ（ＮＭ＿００１０４８１２８．１及びＮＰ＿００１０４１５９３．１）、ウシ（ＮＭ＿００１１０５０５１．１及びＮＰ＿００１０９８５２１．１）、マウス（ＮＭ＿００９０６６．３及びＮＰ＿０３３０９２．３）、ラット（ＮＭ＿２１２５４９．２及びＮＰ＿９９７７１４．２、ＸＭ＿０１７６０１６４０．１及びＸＰ＿０１７４５７１２９．１）、並びにカエル（ＮＭ＿００１０９７３２５．１及びＮＰ＿００１０９０７９４．１）が含まれる。
「ＲＩＮＧ１Ａ活性」という用語は、ＲＩＮＧ１Ａポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はその転写抑制活性を媒介する能力を含む。
「ＲＩＮＧ１Ａ基質」という用語は、ＲＩＮＧ１Ａポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）、例えば、ＢＭＩ１、ＥＤＲ１、及びＣＢＸ４を含む、本明細書に列挙されるタンパク質の結合パートナーを指す。
「ＲＩＮＧ１Ａ制御経路」という用語は、ＲＩＮＧ１Ａ（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＲＩＮＧ１Ａ制御経路には、転写抑制などの少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＲＩＮＧ１Ａのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＲＩＮＧ１Ａの量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＲＩＮＧ１Ａポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＲＩＮＧ１Ａとその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＲＩＮＧ１Ａポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＲＩＮＧ１Ａの活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＲＩＮＧ１Ａの細胞局在を変化させ、少なくともＲＩＮＧ１Ａレベル及び／若しくは活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＲＩＮＧ１Ａ又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＲＩＮＧ１Ａに特異的であり得るか、又はＢＭＩ１、ＥＤＲ１、及びＣＢＸ４を含むが、これらに限定されない結合パートナーのうちの少なくとも１つにも特異的であり得る。ＲＩＮＧ１Ａポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（とりわけ、カタログ番号ＴＬ３０９８１０Ｖ、ＳＲ３０４０７１、ＳＲ３０４０７１、ＳＲ３０４０８２、ＴＧ３０９７８７、ＴＧ５１２４８９、ＴＬ３０９７８７、及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ５１４８３４、ＫＮ４０２６５０）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－３８１９８、ｓｃ－７７３７９、ｓｃ－１０６７５１、ｓｃ－３８１９７、ｓｃ－６２９４６、ｓｃ－６２９４７）。（例えば、抗ＲＩＮＧ１Ａ抗体による）ＲＩＮＧ１Ａの検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（カタログ番号Ｃ４８４３９（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＣＦ８０９２３９ ＣＦ８０９２５６（ＯｒｉＧｅｎｅ）；とりわけ、ａｂ１７５１４９、ａｂ１８０１７０、ａｂ３２６４４（Ａｂｃａｍ）；ｓｃ－５１７２２１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。加えて、ヒトＲＩＮＧ１Ａノックアウト細胞株は、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ＨＺＧＨＣ００１１１１ｃ００３、ＨＺＧＨＣ００１１１１ｃ０１２、及びＨＺＧＨＣ００１１１１ｃ００１）から市販されている。
「ｒｉｎｇフィンガータンパク質２」としても知られる「ＲＩＮＧ１Ｂ」という用語は、ＲＮＦ２遺伝子によってコードされるポリコーム基複合体（例えば、ＰＲＣ１．１）のメンバーを指す。ＲＩＮＧ１Ｂは、転写因子であるＣＰ２と相互作用し、それを阻害することが示されている。ＲＩＮＧ１Ｂはまた、ユビキチン結合酵素であるハンチンチン相互作用タンパク質２（ＨＩＰ２）と相互作用し、ユビキチンリガーゼ活性を有する。このタンパク質は、クロマチン結合及びユビキチン－タンパク質トランスフェラーゼを有する。「ＲＩＮＧ１Ｂ」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＲＩＮＧ１Ｂの核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ６０４５）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも２つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＲＩＮＧ１Ｂについて見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９９４９６でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＲＩＮＧ１Ｂは、正準配列（ＮＭ＿００７２１２．４及びＮＰ＿００９１４３．１）をコードする。ヒトＲＩＮＧ１Ｂバリアントにはまた、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアント（ＸＭ＿０１１５０９８５２．２及びＸＰ＿０１１５０８１５４．１、並びにＸＭ＿０１１５０９８５１．３及びＸＰ＿０１１５０８１５３．１）、並びにアイソフォームＸ２をコードする転写バリアント（ＸＭ＿００５２４５４１３．３及びＸＰ＿００５２４５４７０．１）が含まれる。ヒト以外の生物におけるＲＩＮＧ１Ｂオルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿５１４０５７．６及びＸＰ＿５１４０５７．３、ＸＭ＿００３３０８６３８．４及びＸＰ＿００３３０８６８６．１、ＸＭ＿００９４３９６０５．３及びＸＰ＿００９４３７８８０．１、並びにＸＭ＿００９４３９６１０．３及びＸＰ＿００９４３７８８５．１）、イヌ（ＸＭ＿０２２４２０９６９．１及びＸＰ＿０２２２７６６７７．１）、ウシ（ＮＭ＿００１１０１２０３．１及びＮＰ＿００１０９４６７３．１、ＸＭ＿０２４９７６３９７．１及びＸＰ＿０２４８３２１６５．１、並びにＸＭ＿０２４９７６３９８．１及びＸＰ＿０２４８３２１６６．１）、マウス（ＮＭ＿００１３６０８４４．１及びＮＰ＿００１３４７７７３．１、ＮＭ＿００１３６０８４５．１及びＮＰ＿００１３４７７７４．１、ＮＭ＿００１３６０８４７．１及びＮＰ＿００１３４７７７６．１、並びにＮＭ＿０１１２７７．３及びＮＰ＿０３５４０７．１）、ラット（ＮＭ＿００１０２５６６７．１及びＮＰ＿００１０２０８３８．１、ＸＭ＿００６２４９９９１．３及びＸＰ＿００６２５００５３．１、並びにＸＭ＿００６２４９９９０．３及びＸＰ＿００６２５００５２．１）、ニワトリ（ＸＭ＿０１５２９０５５０．２及びＸＰ＿０１５１４６０３６．１、並びにＸＭ＿０１５２９０５５１．２及びＸＰ＿０１５１４６０３７．１）、カエル（ＮＭ＿２１３７０７．２及びＮＰ＿９９８８７２．１）、ゼブラフィッシュ（ＮＭ＿１３１２１３．２及びＮＰ＿５７１２８８．２）、ミバエ（ＮＭ＿０５８１６１．４及びＮＰ＿４７７５０９．１），及び蚊（ＸＭ＿３２０９７４．５及びＸＰ＿３２０９７４．３）が含まれる。
「ＲＩＮＧ１Ｂ活性」という用語は、ＲＩＮＧ１Ｂポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はそのユビキチンリガーゼ活性を媒介する能力を含む。
「ＲＩＮＧ１Ｂ基質」という用語は、ＲＩＮＧ１Ｂポリペプチド（及び本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）、例えば、Ｃ２及びＨＩＰ２を含む、本明細書に列挙されるタンパク質の結合パートナーを指す。
「ＲＩＮＧ１Ｂ制御経路」という用語は、ＲＩＮＧ１Ｂ（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＲＩＮＧ１Ｂ制御経路には、発生及び細胞増殖などの少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＲＩＮＧ１Ｂのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＲＩＮＧ１Ｂの量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＲＩＮＧ１Ｂポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＲＩＮＧ１Ｂとその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＲＩＮＧ１Ｂポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＲＩＮＧ１Ｂの活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＲＩＮＧ１Ｂの細胞局在を変化させ、少なくともＲＩＮＧ１Ｂレベル及び／若しくは活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＲＩＮＧ１Ｂ又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＲＩＮＧ１Ｂに特異的であり得るか、又はＣ２及びＨＩＰ２を含むが、これらに限定されない、結合パートナーのうちの少なくとも１つにも特異的であり得る。ＲＩＮＧ１Ｂの検出のための抗体は、市販されている（カタログ番号Ｒ１５０２Ｐ ＴＡ３０２５９２（ＯｒｉＧｅｎｅ）；とりわけ、ａｂ１８７５０９、ａｂ１８１１４０、ａｂ１０１２７３（Ａｂｃａｍ）；ｓｃ－１０１１０９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ＲＩＮＧ１Ｂポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（とりわけ、カタログ番号ＴＬ３０９７８７Ｖ、ＳＲ３０４０８２、ＳＲ３０４０８２、ＴＧ３０９７８７、ＴＧ５１２４８９、及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ５１４９３４、ＫＮ４０３０８９）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－６２９４６、ｓｃ－６２９４７）。（例えば、抗ＲＩＮＧ１Ｂ抗体による）ＲＩＮＧ１Ｂの検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（カタログ番号Ｃ４９７９０（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＡＢＩＮ２７８１３６８、ＡＢＩＮ６２０７３４９（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ，Ｌｉｍｅｒｉｃｋ，ＰＡ）。ＲＩＮＧ１Ｂノックアウトヒト細胞株もまた、周知であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、とりわけ、カタログ番号ＨＺＧＨＣ００１１８１ｃ００２、ＨＺＧＨＣ００１１８１ｃ００７、ＨＺＧＨＣ００１１８１ｃ００５、ＨＺＧＨＣ００１１８１ｃ００１、ＨＺＧＨＣ００１１８１ｃ００３）。
「ＲＩＮＧ１及びＹＹ１結合タンパク質」としても知られる「ＲＹＢＰ」という用語は、ポリコーム抑制複合体１（及び１．１）のメンバーを指す。ＲＹＢＰは、転写コリプレッサーである。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。「ＲＹＢＰ」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＲＹＢＰの核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ２３４２９）で一般に公開されており、表１に示される。ＲＹＢＰをコードする単一の転写バリアントが同定されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８Ｎ４８８でのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと、ＮＭ＿００１００５３６６．２及びＮＰ＿００１００５３６６．１）。
ヒト以外の生物におけるＲＹＢＰオルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿０１６９４１４８８．２及びＸＰ＿０１６７９６９７７．１）、イヌ（ＸＭ＿０２２４０７３３９．１及びＸＰ＿０２２２６３０４７．１）、マウス（ＮＭ＿０１９７４３．３及びＮＰ＿０６２７１７．２）、並びにニワトリ（ＸＭ＿０１５２９３２３２．２及びＸＰ＿０１５１４８７１８．１）が含まれる。
ＲＹＢＰ「ＲＹＢＰ基質」という用語は、本明細書で論じられるＲＹＢＰポリペプチド（並びにその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）の結合パートナーを指す。
「ＲＹＢＰ制御経路」という用語は、ＲＹＢＰ（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／又は活性及び／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＲＹＢＰ制御経路には、Ｅ２Ｆ転写因子ネットワーク及びクロマチン制御並びにアセチル化などの少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＲＹＢＰのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＲＹＢＰの量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＲＹＢＰポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＲＹＢＰとその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＲＹＢＰポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＲＹＢＰの活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＲＹＢＰの細胞局在を変化させ、少なくともＲＹＢＰレベル及び／又は活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＲＹＢＰ又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＲＹＢＰに特異的であり得るか、又はその結合パートナーのうちの少なくとも１つにも特異的であり得る。ＲＹＢＰポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（とりわけ、カタログ番号ＴＬ３０９６７５Ｖ、ＳＲ３０８２７０、ＴＬ５０３１５６、ＳＲ３０８２７０、ＴＲ３０９６７５、Ｒ４０４９３３、及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ４０６１８６、ＫＮ５１５２２８）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－７７３７９、ｓｃ－１０６７５１）。（例えば、抗ＲＹＢＰ抗体による）ＲＹＢＰの検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（カタログ番号２８６４５（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；ＡＢＩＮ１１５６０５９、ＡＢＩＮ１１５６０５８（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）；ＲＹＢＰ（Ａ－１）、ＲＹＢＰ（Ａ－１）Ｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ＲＹＢＰに特異的に結合する抗体は、市販されている（カタログ番号ＡＰ０００９５ＰＵ－Ｎ、ＡＰ０７７２９ＰＵ－Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ａｂ１８５９７１、ａｂ２５０８７１、ａｂ５９７６、ａｂ１０７８９６、ａｂ８９６０３（Ａｂｃａｍ）；ＲＹＢＰ（Ａ－１）、ＲＹＢＰ（Ａ－１）Ｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ＲＹＢＰノックアウトヒト細胞株もまた、周知であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ＨＺＧＨＣ２３４２９）で入手可能である。
「ポリコーム群Ｒｉｎｇフィンガー１」としても知られている「ＰＣＧＦ１」という用語は、ＰＲＣ１．１複合体のメンバーを指す。この遺伝子の重要なパラログは、ＣＯＭＭＤ３－ＢＭＩ１である。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。「ＰＣＧＦ１」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＰＣＧＦ１の核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ８４７５９）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも２つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＰＣＧＦ１について見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＢＳＭ１でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＰＣＧＦ１バリアントとしては、アイソフォーム１をコードする転写バリアント１（ＮＭ＿０３２６７３．３及びＮＰ＿１１６０６２．２）、並びにアイソフォームＸ１をコードする転写バリアント２（ＸＭ＿０２４４５３１８１．１及びＸＰ＿０２４３０８９４９．１）が挙げられる。
ヒト以外の生物におけるＰＣＧＦ１オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿５１５５６２．６及びＸＰ＿５１５５６２．２）、アカゲザル（ＸＭ＿０１５１１２６９６．２及びＸＰ＿０１４９６８１８２．１）、イヌ（ＸＭ＿０２２４０４７９７．１及びＸＰ＿０２２２６０５０５．１、ＸＭ＿００５６３０５２７．３及びＸＰ＿００５６３０５８４．１、ＸＭ＿００５６３０５２４．３及びＸＰ＿００５６３０５８１．１、ＸＭ＿００５６３０５２６．３及びＸＰ＿００５６３０５８３．１、ＸＭ＿００５６３０５２９．３及びＸＰ＿００５６３０５８６．１、ＸＭ＿５３２９９５．６及びＸＰ＿５３２９９５．２、並びにＸＭ＿０２２４０４７９６．１及びＸＰ＿０２２２６０５０４．１）、ウシ（ＮＭ＿００１０４６４４７．２及びＮＰ＿００１０３９９１２．２）、マウス（ＸＭ＿０３０２５５５８８．１及びＸＰ＿０３０１１１４４８．１、ラット（ＮＭ＿００１００７０００．１及びＮＰ＿００１００７００１．１）、ニワトリ（ＸＭ＿０１５２７３１４６．２及びＸＰ＿０１５１２８６３２．１）、ゼブラフィッシュ（ＮＭ＿００１００７１５８．２及びＮＰ＿００１００７１５９．１、並びにＸＭ＿００９３０７６９５．３及びＸＰ＿００９３０５９７０．１）が含まれる。「ＰＣＧＦ１活性」という用語は、ＰＣＧＦ１ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はその活性を媒介する能力を含む。
「ＰＣＧＦ１基質」という用語は、本明細書で論じられるＰＣＧＦ１ポリペプチド（並びに及びその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）の結合パートナーを指す。
「ＰＣＧＦ１制御経路」という用語は、ＰＣＧＦ１（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。
「ＰＣＧＦ１のコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＰＣＧＦ１の量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＰＣＧＦ１ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＰＣＧＦ１とその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＰＣＧＦ１ポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＰＣＧＦ１の活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／又は安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＰＣＧＦ１の細胞局在を変化させ、少なくともＰＣＧＦ１レベル及び／又は活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＰＣＧＦ１又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＰＣＧＦ１に特異的であり得るか、又は結合パートナーのうちの少なくとも一方にも特異的であり得る。ＰＣＧＦ１の検出のための抗体は、市販されている（カタログ番号ＴＡ３３０４８８（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ａｂ８４１０８、ａｂ１９４５５６）（Ａｂｃａｍ）；ｓｃ－５１５３７１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ＰＣＧＦ１ポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（とりわけ、カタログ番号ＴＬ３０２５９０Ｖ、ＳＲ３１３６５８、ＴＲ３０２５９０、ＳＲ４０６９２９、ＳＲ３１３６５８、ＴＬ３０２５９０）及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ５１２９４８、ＫＮ４１６３２２）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－１５２１０７、ｓｃ－９４３５３）。（例えば、抗ＰＣＧＦ１抗体による）ＰＣＧＦ１の検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（カタログ番号ＢＩＮ６２０８９７０、ＡＢＩＮ６２０８９７１（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）；３０７１３、Ｃ３０７１３（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＰＣＧＦ１ノックアウトヒト細胞株もまた、周知であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ＨＺＧＨＣ８４７５９）で入手可能である。
「Ｓ相キナーゼ関連タンパク質１」としても知られる「ＳＫＰ１」という用語は、タンパク質基質のユビキチン化に関与する、ＳＣＦ複合体の構成要素であるタンパク質を指す。これらの複合体については、上で記載されている。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。「ＳＫＰ１」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＳＫＰ１の核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ６５００）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも２つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＳＫＰ１について見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ６３２０８でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＳＫＰ１バリアントとしては、アイソフォームａをコードする転写バリアント１（ＮＭ＿００６９３０．３及びＮＰ＿００８８６１．２）及びアイソフォームｂをコードする転写バリアント２（ＮＭ＿１７０６７９．３及びＮＰ＿７３３７７９．１）が挙げられる。
ヒト以外の生物におけるＳＫＰ１オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿００１１６６４０１．６及びＸＰ＿００１１６６４０１．１）、イヌ（ＮＭ＿００１２５２４０８．１及びＮＰ＿００１２３９３３７．１）、ウシ（ＮＭ＿００１０３４７８１．２及びＮＰ＿００１０２９９５３．１）、マウス（ＮＭ＿０１１５４３．４及びＮＰ＿０３５６７３．３、並びにＸＭ＿００６５３２７８６．２及びＸＰ＿００６５３２８４９．１）、ラット（ＮＭ＿００１００７６０８．２及びＮＰ＿００１００７６０９．１）、ニワトリ（ＮＭ＿００１００６１５３．１及びＮＰ＿００１００６１５３．１、ＸＭ＿０２５１５４８５６．１及びＸＰ＿０２５０１０６２４．１、ＸＭ＿０２５１５４８５７．１及びＸＰ＿０２５０１０６２５．１）、カエル（ＮＭ＿００１０１６５１９．３及びＮＰ＿００１０１６５１９．１、ＸＭ＿０１２９５９０２６．３及びＸＰ＿０１２８１４４８０．１）、ミバエ（ＮＭ＿１６６８５８．３及びＮＰ＿７２６６９２．１、ＮＭ＿０５８０４２．５及びＮＰ＿４７７３９０．１、ＮＭ＿００１０３８７２９．３及びＮＰ＿００１０３３８１８．１、ＮＭ＿１６６８５７．３及びＮＰ＿７２６６９１．１、ＮＭ＿１６６８５６．３及びＮＰ＿７２６６９０．１、ＮＭ＿１６６８６１．３及びＮＰ＿７２６６９５．１、ＮＭ＿１６６８６０．３及びＮＰ＿７２６６９４．１、ＮＭ＿１６６８５９．３及びＮＰ＿７２６６９３．１、ＮＭ＿００１２９７８２６．１及びＮＰ＿００１２８４７５５．１）が含まれる。「ＳＫＰ１活性」という用語は、ＳＫＰ１ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）がその基質に結合する能力を含み、これは、ＳＣＦ複合体として、細胞周期の進行、シグナル伝達、及び転写に関与する。
「ＳＫＰ１基質」という用語は、ＳＫＰ１ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）、例えば、Ｃｕｌ１及びＦ－ｂｏｘタンパク質を含む、本明細書に列挙されるタンパク質の結合パートナーを指す。
「ＳＫＰ１制御経路」という用語は、ＳＫＰ１（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＳＫＰ１制御経路には、少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＳＫＰ１のコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＳＫＰ１の量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＳＫＰ１ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＳＫＰ１とその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＳＫＰ１ポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＳＫＰ１の活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＳＫＰ１の細胞局在を変化させ、少なくともＳＫＰ１レベル及び／若しくは活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＳＫＰ１又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＳＫＰ１に特異的であり得るか、又はＦ－ｂｏｘタンパク質及びキュリン（例えば、ＣＵＬ１）を含むが、これらに限定されない結合パートナーのうちの少なくとも１つにも特異的であり得る。ＳＫＰ１の検出のための抗体は、市販されている（カタログ番号ＡＭ０６７０４ＳＵ－Ｎ、ＡＭ０６７２０ＳＵ－Ｎ（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ａｂ７６５０２、ａｂ２３３４８４、ａｂ２２８６３７（Ａｂｃａｍ）；ｓｃ－１３６３０１、ｓｃ－５２８１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ＳＫＰ１ポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（カタログ番号ＴＬ３０１６８５Ｖ、ＳＲ３０４３８７、ＴＲ３０１６８５、ＳＲ３０４３８７、ＴＦ５０２２２６、ＴＲ５０２２２６及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ４０６５０９）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）．からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－２９４８２、ｓｃ－１５３９１６、ｓｃ－３６４９８、ｓｃ－７６６０５）。（例えば、抗ＳＫＰ１抗体による）ＳＫＰ１の検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（カタログ番号ＡＢＩＮ８２２７７０ ＡＢＩＮ４２１４８７（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）；ＥＫ７３２４、ＥＫ１６６３６（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ．
「ＢＣＬ６コリプレッサー」としても知られる「ＢＣＯＲ」という用語は、ＢＣＬ６のＰＯＺドメインと相互作用するコリプレッサーを指す。ＢＣＯＲはまた、ヒストンデアセチラーゼのクラスと相互作用することが知られている。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。「ＢＣＯＲ」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＢＣＯＲの核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ ５４８８０）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも４つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＢＣＯＲについて見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ６Ｗ２Ｊ９でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＢＣＯＲバリアントとしては、アイソフォームａをコードする転写バリアント３（ＮＭ＿００１１２３３８３．１及びＮＰ＿００１１１６８５５．１）、アイソフォームｂをコードする転写バリアント４（ＮＭ＿００１１２３３８４．２及びＮＰ＿００１１１６８５６．１）、アイソフォームｃをコードする転写バリアント５（ＮＭ＿００１１２３３８５．２及びＮＰ＿００１１１６８５７）、アイソフォームａをコードする転写バリアント１（ＮＭ＿０１７７４５．６及びＮＰ＿０６０２１５．４）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアント（ＸＭ＿００５２７２６１６．１及びＸＰ＿００５２７２６７３．１）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアントＸ６（ＸＭ＿０１１５４３９３１．２及びＸＰ＿０１１５４２２３３．１）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアントＸ５（ＸＭ＿０１１５４３９３０．１及びＸＰ＿０１１５４２２３２．１）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアントＸ２（ＸＭ＿０１１５４３９２９．２及びＸＰ＿０１１５４２２３１．１）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアントＸ４（ＸＭ＿００５２７２６１８．３及びＸＰ＿００５２７２６７５．１）、アイソフォームＸ３をコードする転写バリアントＸ８（ＸＭ＿０１７０２９６１５．１及びＸＰ＿０１６８８５１０４．１）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアントＸ３（ＸＭ＿００６７２４５３６．３及びＸＰ＿００６７２４５９９．１）、アイソフォームＸ４をコードする転写バリアントＸ９（ＸＭ＿００５２７２６２０．４及びＸＰ＿００５２７２６７７．１）、アイソフォームＸ２をコードする転写バリアントＸ７（ＸＭ＿００５２７２６１９．４及びＸＰ＿００５２７２６７６．１）、アイソフォームＸ５をコードする転写バリアントＸ１０（ＸＭ＿０１７０２９６１６．２及びＸＰ＿０１６８８５１０５．１）が挙げられる。ヒト以外の生物におけるＢＣＯＲオルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿０１６９４３４３１．２及びＸＰ＿０１６７９８９２０．１、ＸＭ＿０１６９４７５３４．２及びＸＰ＿０１６８０３０２３．１、ＸＭ＿０１６９４７５３６．２及びＸＰ＿０１６８０３０２５．１、ＸＭ＿０１６９４３４３２．１及びＸＰ＿０１６７９８９２１．１、ＸＭ＿０１６９４３４３３．１及びＸＰ＿０１６７９８９２２．１、ＸＭ＿０１６９４３４３６．１及びＸＰ＿０１６７９８９２５．１、ＸＭ＿０１６９４３４３０．１及びＸＰ＿０１６７９８９１９．１、ＸＭ＿０１６９４３４３７．１及びＸＰ＿０１６７９８９２６．１、並びにＸＭ＿０１６９４３４３５．１及びＸＰ＿０１６７９８９２４．１、ＸＭ＿０１６９４３４３４．２及びＸＰ＿０１６７９８９２３．１．）、アカゲザル（ＸＭ＿０１５１２７２０７．２及びＸＰ＿０１４９８２６９３．２、ＸＭ＿０１５１２７２０３．２及びＸＰ＿０１４９８２６８９．２、ＸＭ＿０２８８４２３８７．１及びＸＰ＿０２８６９８２２０．１、ＸＭ＿０２８８４２３８８．１及びＸＰ＿０２８６９８２２１．１、ＸＭ＿０２８８４２３８９．１及びＸＰ＿０２８６９８２２２．１、ＸＭ＿０１５１２７２０４．２及びＸＰ＿０１４９８２６９０．２、ＸＭ＿０１５１２７２０２．２及びＸＰ＿０１４９８２６８８．２、ＸＭ＿０１５１２７２０８．２及びＸＰ＿０１４９８２６９４．２、ＸＭ＿０１５１２７２０６．２及びＸＰ＿０１４９８２６９２．２、ＸＭ＿０１５１２７２１２．２及びＸＰ＿０１４９８２６９８．２、ＸＭ＿０１５１２７２１０．２及びＸＰ＿０１４９８２６９６．２、ＸＭ＿０１５１２７２０５．２及びＸＰ＿０１４９８２６９１．２、ＸＭ＿０１５１２７２１１．２及びＸＰ＿０１４９８２６９７．２、ＸＭ＿０１５１２７２０９．２及びＸＰ＿０１４９８２６９５．２）、イヌ（ＸＭ＿５３７９９７．６及びＸＰ＿５３７９９７．２、ＸＭ＿０２２４１５５７６．１及びＸＰ＿０２２２７１２８４．１、ＸＭ＿０２２４１５５７５．１及びＸＰ＿０２２２７１２８３．１、ＸＭ＿００５６４１２４９．３及びＸＰ＿００５６４１３０６．１、ＸＭ＿００５６４１２５０．３及びＸＰ＿００５６４１３０７．１、ＸＭ＿８５５９９８．５及びＸＰ＿８６１０９１．１、ＸＭ＿００５６４１２４７．３及びＸＰ＿００５６４１３０４．１、ＸＭ＿８５５９４５．５及びＸＰ＿８６１０３８．１、ＸＭ＿００５６４１２４８．３及びＸＰ＿００５６４１３０５．１）、ウシ（ＮＭ＿００１１９１５４４．３及びＮＰ＿００１１７８４７３．３、ＸＭ＿０２４９８８３１５．１及びＸＰ＿０２４８４４０８３．１、ＸＭ＿００５２２８２９５．４及びＸＰ＿００５２２８３５２．２、ＸＭ＿００５２２８２９６．４及びＸＰ＿００５２２８３５３．２、ＸＭ＿０２４９８８３１６．１及びＸＰ＿０２４８４４０８４．１、ＸＭ＿０２４９８８３１４．１及びＸＰ＿０２４８４４０８２．１、ＸＭ＿０２４９８８３２２．１及びＸＰ＿０２４８４４０９０．１、ＸＭ＿０２４９８８３１９．１及びＸＰ＿０２４８４４０８７．１、ＸＭ＿０２４９８８３２３．１及びＸＰ＿０２４８４４０９１．１、ＸＭ＿０２４９８８３２０．１及びＸＰ＿０２４８４４０８８．１、ＸＭ＿０２４９８８３２４．１及びＸＰ＿０２４８４４０９２．１、ＸＭ＿０２４９８８３２５．１及びＸＰ＿０２４８４４０９３．１、ＸＭ＿０２４９８８３１７．１及びＸＰ＿０２４８４４０８５．１、ＸＭ＿０２４９８８３１８．１及びＸＰ＿０２４８４４０８６．１）、マウス（ＮＭ＿００１１６８３２１．１及びＮＰ＿００１１６１７９３．１、ＮＭ＿０２９５１０．３及びＮＰ＿０８３７８６．２、ＮＭ＿１７５０４４．３及びＮＰ＿７７８２０９．２、ＮＭ＿１７５０４５．３及びＮＰ＿７７８２１０．２、ＮＭ＿１７５０４６．３及びＮＰ＿７７８２１１．２、ＸＭ＿０１７３１８６２３．２及びＸＰ＿０１７１７４１１２．１、ＸＭ＿０１７３１８６２１．２及びＸＰ＿０１７１７４１１０．１、ＸＭ＿０３０２５１５０２．１及びＸＰ＿０３０１０７３６２．１、ＸＭ＿０１７３１８６２２．２及びＸＰ＿０１７１７４１１１．１、ＸＭ＿０３０２５１５０３．１及びＸＰ＿０３０１０７３６３．１、ＸＭ＿０３０２５１５００．１及びＸＰ＿０３０１０７３６０．１、ＸＭ＿０３０２５１５０１．１及びＸＰ＿０３０１０７３６１．１、ＸＭ＿０３０２５１４９９．１及びＸＰ＿０３０１０７３５９．１、ＸＭ＿０１７３１８６２４．２及びＸＰ＿０１７１７４１１３．１）、ラット（ＮＭ＿００１１９１５８６．１及びＮＰ＿００１１７８５１５．１、ＸＭ＿００６２５６６６０．３及びＸＰ＿００６２５６７２２．１、ＸＭ＿００６２５６６５９．３及びＸＰ＿００６２５６７２１．１、ＸＭ＿００６２５６６６４．３及びＸＰ＿００６２５６７２６．１、ＸＭ＿００６２５６６６３．３及びＸＰ＿００６２５６７２５．１、ＸＭ＿００６２５６６６５．３及びＸＰ＿００６２５６７２７．１、ＸＭ＿００６２５６６６１．３及びＸＰ＿００６２５６７２３．１）、ニワトリ（ＸＭ＿０２５１４６０５７．１及びＸＰ＿０２５００１８２５．１、ＸＭ＿０２５１４６０７６．１及びＸＰ＿０２５００１８４４．１、ＸＭ＿０２５１４６０８６．１及びＸＰ＿０２５００１８５４．１、ＸＭ＿０２５１４６０７０．１及びＸＰ＿０２５００１８３８．１、ＸＭ＿０２５１４６０８２．１及びＸＰ＿０２５００１８５０．１、ＸＭ＿０２５１４６０９２．１及びＸＰ＿０２５００１８６０．１、ＸＭ＿０２５１４６０６２．１及びＸＰ＿０２５００１８３０．１、ＸＭ＿０１５３０２０８０．２及びＸＰ＿０１５１５７５６６．２）、ゼブラフィッシュ（ＸＭ＿００５１７３９４３．４→ＸＰ＿００５１７４０００．１）、並びにカエル（ＮＭ＿００１１２６６７９．１及びＮＰ＿００１１２０１５１．１、ＸＭ＿０１２９５６４５３．３及びＸＰ＿０１２８１１９０７．１、ＸＭ＿０１２９５６４５６．３及びＸＰ＿０１２８１１９１０．１、ＸＭ＿０１２９５６４５０．３及びＸＰ＿０１２８１１９０４．１、ＸＭ＿０１２９５６４５２．３及びＸＰ＿０１２８１１９０６．１、ＸＭ＿０１８０９１０８６．１及びＸＰ＿０１７９４６５７５．１、ＸＭ＿０３１８９５６８１．１及びＸＰ＿０３１７５１５４１．１）が含まれる。
「ＢＣＯＲ活性」という用語は、ＢＣＯＲポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はそのコリプレッサー活性を媒介する能力を含む。
「ＢＣＯＲ基質」という用語は、ＢＣＯＲポリペプチド（及び本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）、例えば、ＢＣＬ６を含む本明細書に列挙されるタンパク質の結合パートナーを指す。
「ＢＣＯＲ制御経路」という用語は、ＢＣＯＲ（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＢＣＯＲ制御経路には、ヒストン修飾の陽性又は陰性制御など、少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＢＣＯＲのコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＢＣＯＲの量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＢＣＯＲポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＢＣＯＲとその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＢＣＯＲポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＢＣＯＲの活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性を低下させ（例えば、半減期）、及び／又はＢＣＯＲの細胞局在を変化させ、少なくともＢＣＯＲレベル及び／又は活性の低下をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＢＣＯＲ又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＢＣＯＲに特異的であり得るか、又はＢＬ６を含むが、これらに限定されない、結合パートナーのうちの少なくとも１つにも特異的であり得る。ＢＣＯＲの検出のための抗体は、市販されている（カタログ番号ＡＰ３３２９７ＰＵ－Ｎ、ＣＦ８０７７２４（ＯｒｉＧｅｎｅ）；とりわけ、ａｂ１３５８０１、ａｂ８８１１２、ａｂ１２９７７７、ａｂ２４５４２３（Ａｂｃａｍ）；ｓｃ－５１４５７６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。ＢＣＯＲポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（とりわけ、カタログ番号ＴＬ３０６４１５Ｖ、ＳＲ３１０３１１、ＴＬ５０４５５２、ＴＬ３０６４１５、ＴＬ３０６４１５Ｖ、ＴＦ３０６４１４、ＴＬ５１９８３９Ｖ、及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ４１３４６８， ＫＮ５０２１２０）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－７２６３５、ｓｃ－７２６３６、ｓｃ－９０８６１、ｓｃ－１４１６８０）。（例えば、抗ＢＣＯＲ抗体による）ＢＣＯＲの検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（とりわけ、カタログ番号ＲＣ２２６４２４、ＲＣ２１３４６８Ｌ１Ｖ、ＲＣ２２６４２７（ＯｒｉＧｅｎｅ）。ＢＣＯＲノックアウトヒト細胞株もまた、周知であり、Ｈｏｒｉｚｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ＨＺＧＨＣ００４８９５ｃ００５、ＨＺＧＨＣ００４８９５ｃ０１０）で入手可能である。
「ＹＹ１関連因子２」としても知られる「ＹＡＦ２」という用語は、転写の制御に関与するジンクフィンガーポリペプチド又はＹＡＦ２をコードするポリヌクレオチドを指す。ＹＡＦ２はＹｙ１と相互作用し、そのタンパク質分解を促進することができる。ＹＡＦ２は、ＭＹＣにも結合し、ＭＹＣ媒介性トランス活性化を阻害する。複数の代替的にスプライシングされた転写バリアントが知られている。「ＹＡＦ２」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、及び誘導体を含むよう意図されている。
代表的なヒトＹＡＦ２の核酸及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（遺伝子ＩＤ １０１３８）で一般に公開されており、表１に示される。代替的スプライシングによって生成された少なくとも４つの異なるヒト転写バリアントを含む、いくつかの異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントが、ＹＡＦ２について見出されている（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ８ＩＹ５７でＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと）。ヒトＹＡＦ２バリアントとしては、アイソフォーム３をコードする転写バリアント３（ＮＭ＿００１１９０９７７．２及びＮＰ＿００１１７７９０６．１）、アイソフォーム１をコードする転写バリアント１（ＮＭ＿００１１９０９７９．２及びＮＰ＿００１１７７９０８．１）、アイソフォーム４をコードする転写バリアント４（ＮＭ＿００１１９０９８０．２及びＮＰ＿００１１７７９０９．１）、アイソフォーム５をコードする転写バリアント５（ＮＭ＿００５７４８．６及びＮＰ＿００５７３９．２）、アイソフォームＸ１をコードする転写バリアントＸ１（ＸＭ＿０１１５３７７２８．３及びＸＰ＿０１１５３６０３０．１）、アイソフォームＸ２をコードする転写バリアントＸ２（ＸＭ＿０２４４４８７９２．１及びＸＰ＿０２４３０４５６０．１）、アイソフォームＸ３をコードする転写バリアントＸ３（ＸＭ＿００６７１９１８５．３及びＸＰ＿００６７１９２４８．１）、アイソフォームＸ４をコードする転写バリアントＸ４（ＸＭ＿０１１５３７７２９．２及びＸＰ＿０１１５３６０３１．１）、並びに転写物Ｘ５をコードする転写バリアントＸ５（ＸＭ＿０１７０１８６７０．２及びＸＰ＿０１６８７４１５９．１）が挙げられる。
ヒト以外の生物におけるＹＡＦ２オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えば、チンパンジー（ＸＭ＿００１１６７７２３．５及びＸＰ＿００１１６７７２３．１、ＸＭ＿０１６９２３６３６．１及びＸＰ＿０１６７７９１２５．１、ＸＭ＿０１６９２３６３３．１及びＸＰ＿０１６７７９１２２．１、ＸＭ＿０１６９２３６３５．１及びＸＰ＿０１６７７９１２４．１、並びにＸＭ＿０１６９２３６３４．２及びＸＰ＿０１６７７９１２３．１）、アカゲザル（ＸＭ＿０１５１５１４５７．２及びＸＰ＿０１５００６９４３．１）、並びにイヌ（ＸＭ＿０２２４１０９０１．１及びＸＰ＿０２２２６６６０９．１、ＸＭ＿０１４１０８５８７．２及びＸＰ＿０１３９６４０６２．１）が含まれる。
「ＹＡＦ２活性」という用語は、ＹＡＦ２ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）がその基質に結合し、かつ／又はその転写抑制活性を媒介する能力を含む。
「ＹＡＦ２基質」という用語は、ＹＡＦ２ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）、例えば、ＭＹＣ及びＹｙ１を含む、本明細書に列挙されるタンパク質の結合パートナーを指す。
「ＹＡＦ２制御経路」という用語は、ＹＡＦ２（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／又はモチーフ）が、その基質のうちの少なくとも１つに結合する経路を含み、これを通じて、少なくとも１つの細胞機能及び／若しくは活性並びに／又は細胞タンパク質プロファイルが変化する。ＹＡＦ２制御経路には、ヒストン修飾の陽性又は陰性調節など、少なくとも本明細書に記載されるものが含まれる。
「ＹＡＦ２のコピー数、発現レベル、及び／若しくは活性を減少させる薬剤」、又は「ＹＡＦ２の量及び／若しくは活性を減少させる薬剤」という用語は、ＹＡＦ２ポリペプチド（並びに本明細書で論じられるその断片、ドメイン、及び／若しくはモチーフ）の発現レベル及び／又は活性を減少させることができる、ヒトによって調製、合成、製造、及び／又は精製された任意の天然又は非天然の薬剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＹＡＦ２とその基質又は他の結合パートナーとの間の結合／相互作用を減少させてもよい。他の実施形態では、薬剤は、ＹＡＦ２ポリペプチドの発現を減少させ得る。更に他の実施形態では、かかる薬剤は、腫瘍に対する免疫応答を増強する際のＹＡＦ２の活性を減少させ得る。なお他の実施形態では、かかる阻害剤は、ターンオーバー率を増加させ、発現及び／若しくは安定性（例えば、半減期）を減少させ、かつ／又はＹＡＦ２の細胞局在を変化させ、少なくともＹＡＦ２レベル及び／若しくは活性の減少をもたらし得る。かかる薬剤は、小分子化合物、抗体又はイントラボディ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（少なくともｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ、及び他の周知の薬剤を含む）、並びにがん細胞内のＹＡＦ２又はその断片の内因性産生を阻害する遺伝子構築物を含むが、これらに限定されない任意の分子であってよい。かかる薬剤は、ＹＡＦ２に特異的であり得るか、又はＭＹＣ及びＹｙ１を含むが、これらに限定されない結合パートナーのうちの少なくとも１つに特異的であり得る。ＹＡＦ２の検出のための抗体は、市販されている（カタログ番号ＴＡ３２９２９５ ＴＡ３２９９２８（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ａｂ２３９１５０、ａｂ１７７９４５、及びａｂ２５００１７（Ａｂｃａｍ）；ＡＢＩＮ２０３３５２、ＡＢＩＮ１５０１７８５、ＡＢＩＮ５６２１０９６、ＡＢＩＮ６７４２３０２、ＡＢＩＮ６７３６１２３、ＡＢＩＮ２５６８９８５、ＡＢＩＮ２８９５１８７（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）。ＹＡＦ２ポリペプチドに対するＲＮＡ干渉は、周知であり、市販されている（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのヒト、ラット、又はマウスのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ製品（カタログ番号ＴＬ３１６８９８Ｖ、ＳＲ３０６８３８、ＴＲ３１６８９８、ＴＬ５０３８０８Ｖ、ＴＬ７０８８７０Ｖ、ＴＲ７０８８７０、ＳＲ４０４２９５、ＴＬ７０８８７０、ＳＲ３０６８３８、ＴＲ５０３８０８、ＴＬ３１６８９８、ＴＬ５０３８０８、ＴＬ３１６８９８Ｖ）及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（カタログ番号ＫＮ４１４０７１、ＫＮ５１９５３５）、並びにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）からのｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ製品（カタログ番号ｓｃ－９５９１６、ｓｃ－１５５３９９）及びＣＲＩＳＰＲによるヒト又はマウス遺伝子ノックアウトキット（とりわけ、カタログ番号ｓｃ－４１７２７４）。（例えば、抗ＹＡＦ２抗体による）ＹＡＦ２の検出、精製、及び／又は阻害のための方法もまた、周知であり、市販されている（例えば、（カタログ番号ＴＡ３３１１０８（ＯｒｉＧｅｎｅ）；ＨＧ２２８３５－ＡＣＧＬＮ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＵＳ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ）；４４４８９、Ｃ４４４８９（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）。
「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示の免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞毒性が含まれる。加えて、免疫応答という用語には、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化によって間接的にもたらされる免疫応答が含まれる。
「免疫治療薬」という用語は、対象における腫瘍又はがんに対する免疫応答をもたらすように宿主免疫系を刺激することができる任意の分子、ペプチド、抗体、又は他の薬剤を含み得る。様々な免疫治療薬が本明細書に記載の組成物及び方法で有用である。
「阻害する」という用語は、例えば、特定の作用、機能、又は相互作用の低減、減少、制限、又は遮断を含む。いくつかの実施形態では、がんの少なくとも１つの症状が緩和、終了、減速、又は予防される場合、がんは「阻害される」。本明細書で使用される場合、がんの再発又は転移が低減、減速、遅延、又は予防される場合もまた、がんは「阻害される」。
「相互作用」という用語は、２つの分子間の相互作用を指すとき、分子のお互いとの物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、かかる相互作用は、当該分子の一方又は両方の活性をもたらす（それにより、生物学的効果がもたらされる）。
「単離されたタンパク質」とは、他のタンパク質、細胞物質、分離培地、及び培養培地（細胞から単離される場合又は組換えＤＮＡ技法によって産生される場合）、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」又は「精製された」タンパク質又はその生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、若しくは融合タンパク質が由来する細胞若しくは組織源由来の細胞物質若しくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない。
「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、タンパク質が、それが単離されるか、又は組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離されるバイオマーカーポリペプチド又はその断片の調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満（乾燥重量で）の非バイオマーカータンパク質（本明細書で「夾雑タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非バイオマーカータンパク質、なおより好ましくは約１０％未満の非バイオマーカータンパク質、最も好ましくは約５％未満の非バイオマーカータンパク質を有するバイオマーカータンパク質又はその断片の調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチド、若しくは融合タンパク質、又はそれらの断片、例えば、それらの生物学的に活性な断片が組換え的に産生される場合、これは、好ましくは、培養培地、すなわち、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する培養培地を実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ｃ等）を指す。
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指すよう意図されている。開示される本発明の抗体の結合親和性は、標準の抗体－抗原アッセイ、例えば、競合的アッセイ、飽和アッセイ、又はＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡ等の標準の免疫アッセイによって測定又は決定され得る。
「キット」とは、本発明のマーカーの発現を特異的に検出及び／又は行うための少なくとも１つの試薬、例えば、プローブ又は小分子を含む任意の製品（例えば、パッケージ又は容器）である。本キットは、本発明の方法を行うための装置として販売促進、流通、又は販売され得る。本キットは、本発明の方法で有用な組成物を発現するために必要な１つ以上の試薬を含み得る。特定の実施形態では、キットは、参照標準物、例えば、細胞成長、分裂、移行、生存又はアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に影響を及ぼさないか、又は調節しないタンパク質をコードする核酸を更に含んでもよい。当業者は、多くのこのような対照タンパク質を想定することができ、対照タンパク質としては、限定されないが、一般的な分子タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質及びβ－ガラクトシダーゼ）、ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙリファレンスによって細胞成長、分裂、遊走、生存若しくはアポトーシスを包含する経路のいずれにも分類されないタンパク質、又はユビキタスハウスキーピングタンパク質が挙げられる。キット内の試薬は、個々の容器内で、又は単一の容器内の２つ以上の試薬の混合物として提供されてもよい。加えて、キット内の組成物の使用を記載する教材を含むことができる。
「ネオアジュバント療法」という用語は、一次治療の前に施される治療を指す。ネオアジュバント療法の例には、化学療法、放射線療法、及びホルモン療法が挙げられ得る。例えば、乳がんの治療において、ネオアジュバント療法は、大きな乳がんを有する患者が乳房保存手術を受けることを可能にすることができる。
バイオマーカーの「過剰発現」又は「著しくより高い発現レベル」とは、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超え、好ましくは、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）におけるバイオマーカーの発現活性又はレベル、好ましくはいくつかの対照試料におけるバイオマーカーの平均発現レベルよりも好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、又はそれ以上に高い、試験試料における発現レベルを指す。バイオマーカーの「著しく低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）におけるバイオマーカーの発現活性又はレベル、好ましくはいくつかの対照試料におけるバイオマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも１０％、より好ましくは１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、又はそれ以上に低い、試験試料における発現レベルを指す。
「所定の」バイオマーカー量及び／又は活性測定値という用語は、ほんの一例として、特定の治療のために選択され得る対象を評価するため、免疫療法と組み合わせての、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの制御因子の阻害剤などの治療に対する応答を評価するため、かつ／又は病状を評価するために使用されるバイオマーカー量及び／又は活性測定値であり得る。所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、がんを有する患者集団又はがんを有しない患者集団において決定され得る。所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、あらゆる患者に平等に適用可能な単数であり得るか、又は所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、特定の患者亜集団により異なり得る。対象の年齢、体重、身長、及び他の因子は、その個体の所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値に影響を及ぼし得る。更に、所定のバイオマーカー量及び／又は活性は、対象毎に個別に決定され得る。一実施形態では、本明細書に記載の方法で決定及び／又は比較される量は、絶対測定値に基づいている。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で決定及び／又は比較される量は、比率（例えば、ハウスキーピング又はさもなければ概ね一定のバイオマーカーの発現に正規化された血清バイオマーカー）などの相対測定値に基づいている。所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、任意の好適な基準であり得る。例えば、所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、患者選択が評価される同じ又は異なるヒトから得られ得る。一実施形態では、所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、同じ患者の以前の評価から得られ得る。かかる様式で、患者の選択の経過が経時的に監視され得る。加えて、対照は、別のヒト又は複数のヒト、例えば、対象がヒトである場合、選択されたヒト群の評価から得られ得る。かかる様式で、選択が評価されるヒトの選択の程度が、好適な他のヒト、例えば、同様若しくは同じ状態に罹患しているヒト及び／又は同じ民族集団のヒト等の目的とするヒトと同様の状況下にある他のヒトと比較され得る。
「予測的」という用語は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤に対するがんの応答の可能性を、免疫療法（例えば、かかる阻害剤と免疫療法、例えば、免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせによる治療）と組み合わせて決定するための、療法前、療法中、又は療法後のバイオマーカー核酸及び／又はタンパク質状態、例えば、腫瘍の過剰若しくは過小活性、出現、発現、成長、寛解、再発、又は抵抗性の使用を含む。バイオマーカーのかかる予測的使用は、例えば、（１）増加若しくは減少したコピー数（例えば、ＦＩＳＨ、ＦＩＳＨ＋ＳＫＹ、単一分子配列決定、例えば、当該技術分野において少なくともＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６：２８９－３０１に記載されるもの、若しくはｑＰＣＲによる）、バイオマーカー核酸の過剰発現若しくは過小発現（例えば、ＩＳＨ、ノーザンブロット、若しくはｑＰＣＲによる）、増加若しくは減少したバイオマーカータンパク質（例えば、ＩＨＣによる）、又は増加若しくは減少した活性（例えば、アッセイされたヒトがんタイプ又はがん試料の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％超、若しくはそれ以上における）、（２）生体試料、例えば、がんに罹患している対象、例えば、ヒト由来の組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、若しくは骨髄を含有する試料におけるその絶対又は比較的調節された存在又は不在、（３）がんを有する患者（例えば、特定の阻害剤／免疫療法の併用療法に応答する患者若しくはそれに対する抵抗性を発症する患者）の臨床サブセットにおけるその絶対又は比較的調節された存在又は不在によって確認され得る。
「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等の用語は、疾患、障害、又は状態を有しないが、それを発症する危険性があるか、又はそれに罹患し易い対象における疾患、障害、又は状態を発症する可能性を低下させることを指す。
「プローブ」という用語は、特定的に意図される標的分子、例えば、バイオマーカー核酸によってコードされるか、又はこれに対応するヌクレオチド転写物又はタンパク質に対して選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成されるか、又は適切な生物学的調製物に由来するかのいずれかであり得る。標的分子の検出のために、プローブは、本明細書に記載されるように、標識されるように特異的に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。「予後」という用語は、がんの起こり得る経過及び転帰又は疾患からの回復の可能性の予測を含む。いくつかの実施形態では、統計的アルゴリズムの使用により、個体におけるがんの予後が提供される。例えば、予後は、手術、がんの臨床亜型（例えば、食道がん及び胃がんなどの固形腫瘍）の発症、１つ以上の臨床的因子の発症、又は疾患からの回復であり得る。
「免疫療法に対する応答」又は「免疫療法と組み合わせての、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤に対する応答」という用語は、抗がん剤、例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法、好ましくは、ネオアジュバント又はアジュバント療法の開始後の腫瘍質量及び／又は体積の変化に対する、過剰増殖性障害（例えば、がん）の任意の応答に関する。過剰増殖性障害応答が、例えば、有効性について又はネオアジュバント若しくはアジュバント状況で評価され得、全身介入後の腫瘍サイズが、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、又は触診によって測定される初期サイズ及び寸法と比較され得る。応答は、生検又は外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定又は病理学検査によっても評価され得る。応答は、腫瘍体積のパーセンテージ変化等の量的様式で、又は「病理学的完全寛解」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、若しくは他の質的基準等の質的様式で記録され得る。過剰増殖性障害応答の評価は、ネオアジュバント又はアジュバント療法開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、又は好ましくは数ヶ月後に行われ得る。応答評価の典型的なエンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終了時又は残留腫瘍細胞及び／若しくは腫瘍床の外科的除去時である。これは、典型的には、ネオアジュバント療法開始の３ヶ月後である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的治療の臨床的有効性は、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することによって決定され得る。臨床的有用率は、療法終了の少なくとも６ヶ月後の時点での完全寛解（ＣＲ）にある患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）にある患者の数、及び安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の合計を決定することによって測定される。この公式の省略表現は、６ヶ月にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。いくつかの実施形態では、特定のがん治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又はそれ以上である。がん療法に対する応答を評価するための追加の基準は、「生存期間」に関連し、これには、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、又は腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（疾患という用語は、がん及びそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時又は治療開始時）及び終了点（例えば、死、再発、又は転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、及び腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。例えば、適切な閾値を決定するために、特定のがん治療レジメンが対象集団に投与され得、転帰が任意のがん療法の投与前に決定されたバイオマーカー測定値と相関付けられ得る。転帰測定値は、ネオアジュバント状況で施される療法に対する病理学的応答であり得る。あるいは、バイオマーカー測定値が既知であるがん療法後の対象について、全生存期間及び無病生存期間などの転帰測定値がある期間にわたって監視され得る。ある特定の実施形態では、投与される用量は、当該技術分野で既知のがん治療薬の標準用量である。対象が監視される期間は異なり得る。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０ヶ月間監視され得る。がん療法の転帰と相関するバイオマーカー測定閾値は、実施例の節に記載の方法などの、当該技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。
「抵抗性」という用語は、がん療法に対するがん試料又は哺乳動物の獲得抵抗性又は自然抵抗性（すなわち、治療的治療に対して無応答性であるか、又は治療的治療に対する低減した又は限定された応答を有すること）を指し、例えば、治療的治療に対して２５％以上、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれ以上低減した応答を有する。応答の低減は、抵抗性が獲得される前に同じがん試料若しくは哺乳動物と比較することによって、又は治療的治療に対する抵抗性を有しないことが知られている異なるがん試料若しくは哺乳動物と比較することによって測定され得る。化学療法に対する典型的な獲得抵抗性は、「多剤抵抗性」と呼ばれる。多剤抵抗性は、Ｐ糖タンパク質によって媒介され得るか、又は他の機構によって媒介され得るか、又は哺乳動物が多剤抵抗性微生物又は微生物の組み合わせに感染したときに生じ得る。治療的治療に対する抵抗性の決定は、当該技術分野で通例であり、当業者の技術の範囲内であり、例えば、「感作」として本明細書に記載の細胞増殖性アッセイ及び細胞死アッセイによって測定され得る。いくつかの実施形態では、「抵抗性を逆転させる」という用語は、一次がん療法（例えば、化学療法又は放射線療法）単独では治療されていない腫瘍の腫瘍体積と比較して腫瘍体積の統計的に有意な減少をもたらすことができない状況下で、一次がん療法（例えば、化学療法又は放射線療法）と組み合わせた第２の薬剤の使用が、治療されていない腫瘍の腫瘍体積と比較して統計的に有意なレベル（例えば、ｐ＜０．０５）で腫瘍体積の有意な減少をもたらすことができることを意味する。これは、一般に、治療されていない腫瘍が対数律動的に成長しているときに行われる腫瘍体積測定に適用される。
「応答」又は「応答性」という用語は、例えば、腫瘍サイズの低減又は腫瘍成長の阻害の意味での抗がん応答を指す。これらの用語は、例えば、再発までの時間（第１のイベントとしての第２の原発性がん若しくは再発の証拠のない死の時点で打ち切る第１の再発までの期間）の延長、又は全生存期間（治療から任意の原因による死までの期間）の延長によって反映される、改善された予後も指し得る。応答する又は応答を有するとは、刺激に曝露されたときに有益なエンドポイントが得られることを意味する。あるいは、陰性症状又は有害な症状は、刺激への曝露時に最小限に抑えられるか、緩和されるか、又は軽減される。腫瘍又は対象が好ましい応答を呈する可能性を評価することが、腫瘍又は対象が好ましい応答を呈しない（すなわち、応答の欠如を呈するか、又は非応答性である）可能性を評価することと同等であることが理解される。
本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的バイオマーカー遺伝子の発現に干渉するか、又はそれを阻害する任意の薬剤として定義される。かかるＲＮＡ干渉剤には、本発明の標的バイオマーカー遺伝子と相同のＲＮＡ分子を含む核酸分子又はその断片、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的バイオマーカー核酸の発現に干渉するか、又はそれを阻害する小分子が含まれるが、これらに限定されない。
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」とは、標的バイオマーカー核酸と同一又は極めて同様の配列のＲＮＡの発現又は導入により、標的とされた遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解又は特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）がもたらされ（Ｃｏｂｕｒｎ ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７６：９２２５を参照のこと）、それにより、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害する、進化的に保存されたプロセスである。一実施形態では、ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。このプロセスは、植物、脊椎動物、及び哺乳類細胞で説明されている。自然界では、ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって開始され、それにより、長いｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡと呼ばれる二本鎖断片への前進的な切断が促進される。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識して切断するタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＮＡｉは、核酸分子、例えば、合成ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡ干渉剤を導入することによって開始され、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害又はサイレンシングすることもできる。本明細書で使用される場合、「標的バイオマーカー核酸発現の阻害」又は「マーカー遺伝子発現の阻害」は、標的バイオマーカー核酸又は標的バイオマーカー核酸によってコードされるタンパク質の発現又はタンパク質活性若しくはレベルの任意の減少を含む。この減少は、ＲＮＡ干渉剤によって標的とされていない標的バイオマーカー核酸の発現又は標的バイオマーカー核酸によってコードされるタンパク質の活性若しくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％、又はそれ以上の減少である。
少なくとも１つのバイオマーカーの存在又はレベルを検出又は決定するために使用される「試料」という用語は、典型的には、脳組織、脳髄液、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便（例えば、糞）、涙、及び任意の他の体液（例えば、上の「体液」の定義下で記載されたもの）、又は組織試料（例えば、生検）、例えば、小腸、結腸試料、又は外科的切除組織である。ある特定の例では、本発明の方法は、試料中の少なくとも１つのマーカーの存在又はレベルの検出又は決定前に個体から試料を得ることを更に含む。
「感作させる」という用語は、がん療法（例えば、抗免疫チェックポイント、化学療法、及び／又は放射線療法）を用いて関連するがんをより有効に治療することを可能にする方法で、がん細胞又は腫瘍細胞を改変することを意味する。いくつかの実施形態では、正常細胞は、療法によって正常細胞を過度に損傷させる程度には影響されない。治療的治療に対する感受性の増加又は感受性の低減は、細胞増殖性アッセイ（Ｔａｎｉｇａｗａ Ｎ，Ｋｅｒｎ Ｄ Ｈ，Ｋｉｋａｓａ Ｙ，Ｍｏｒｔｏｎ Ｄ Ｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８２；４２：２１５９－２１６４）、細胞死アッセイ（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ Ｒ Ｈ，Ｍａｒｓｄｅｎ Ｊ Ａ，Ｄｉｌｌ Ｐ Ｌ，Ｂａｋｅｒ Ｊ Ａ，Ｍｏｒａｎ Ｅ Ｍ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８４；９４：１６１－１７３、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｌｉｐｐｍａｎ Ｍ Ｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ １９８５；６９：６１５－６３２、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｉｎ：Ｋａｓｐｅｒｓ Ｇ Ｊ Ｌ，Ｐｉｅｔｅｒｓ Ｒ，Ｔｗｅｎｔｙｍａｎ Ｐ Ｒ，Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｖｅｅｒｍａｎ Ａ Ｊ Ｐ，ｅｄｓ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐ Ａ：Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３：４１５－４３２、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｃｏｎｔｒｉｂ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ １９９４；１９：８２－９０）を含むが、これらに限定されない、以下の本明細書に記載の特定の治療及び方法について当該技術分野で既知の方法に従って測定される。感受性又は抵抗性は、腫瘍サイズの低減をある期間、例えば、ヒトの場合６ヶ月及びマウスの場合４～６週間にわたって測定することによって動物においても測定され得る。組成物又は方法は、治療感受性の増加又は抵抗性の低減が、かかる組成物又は方法の不在下での治療感受性又は抵抗性と比較して、２５％以上、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上～２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれ以上である場合、治療的治療に対する応答を感作させる。治療的治療に対する感受性又は抵抗性の決定は、当該技術分野で通例であり、当業者の技術の範囲内である。がん療法の有効性を増強するための本明細書に記載のいずれの方法も、過剰増殖性又はさもなければがん性細胞（例えば、耐性細胞）をがん療法に対して感作させるための方法に同等に適用され得ることを理解されたい。
本明細書で「低分子干渉ＲＮＡ」とも称される「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、例えば、ＲＮＡｉによって標的バイオマーカー核酸の発現を阻害する機能を果たす薬剤として定義される。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成され得るか、インビトロ転写によって産生され得るか、又は宿主細胞中に産生され得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５～約４０ヌクレオチド長、好ましくは約１５～約２８ヌクレオチド長、より好ましくは約１９～約２５ヌクレオチド長、より好ましくは約１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、約０、１、２、３、４、又は５ヌクレオチド長を有する３’及び／又は５’オーバーハングを各鎖に有し得る。オーバーハングの長さは、これらの２つの鎖間で独立しており、すなわち、一方の鎖上のオーバーハングの長さは、第２の鎖上のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解又は特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によりＲＮＡ干渉を促進することができる。
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、小ヘアピン（ステムループとも呼ばれる）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは、短い（例えば、１９～２５ヌクレオチドの）アンチセンス鎖、続いて、５～９ヌクレオチドのループ、及び類似センス鎖から成る。あるいは、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行する場合があり、アンチセンス鎖が続き得る。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルス、及びレンチウイルス中に含まれ得、例えば、ポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６プロモーター、又は別のプロモーターから発現され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＲＮＡ Ａｐｒ；９（４）：４９３－５０１を参照のこと）。
ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、がんにおいてＨＬＡクラスＩ表面発現などのＭＨＣクラスＩ表面発現を下方制御することに関与するバイオマーカー遺伝子の発現を阻害し、それにより、対象におけるがんを治療、予防、又は阻害するために、がんを有するか、又はがんを有する危険性のある患者に投与され得る。
「小分子」という用語は、当該技術分野の用語であり、約１０００分子量未満又は約５００分子量未満の分子を含む。一実施形態では、小分子は、ペプチド結合を排他的に含まない。別の実施形態では、小分子は、オリゴマーではない。活性についてスクリーニングされ得る例示的な小分子化合物としては、限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸、炭水化物、有機小分子（例えば、ポリケチド）（Ｃａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：６３）、及び天然産物抽出物ライブラリが挙げられる。別の実施形態では、これらの化合物は、非ペプチド性有機小分子化合物である。更なる実施形態では、小分子は、生合成のものではない。
「特異的結合」という用語は、所定の抗原に対する抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、分析物としての目的の抗原及びリガンドとしての抗体を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、およそ１０－７Ｍ未満、例えば、およそ１０－８Ｍ、１０－９Ｍ若しくは１０－１０Ｍ未満、又はそれよりも低い親和性（ＫＤ）で結合し、所定の抗原若しくは密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、若しくは１０．０倍、又はそれ以上の親和性で、所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書で「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義に使用され得る。選択的結合は、別の抗原を上回る、ある抗原の結合を識別する抗体の能力を指す相対的な用語である。
本明細書で使用される場合、「タンパク質複合体」という用語は、タンパク質間の相互作用によって形成される２つ以上のタンパク質の組み合わせである複合単位を意味する。典型的には、必ずしもそうではないが、「タンパク質複合体」は、２つ以上のタンパク質が、特定の非共有結合相互作用を通じて一緒に結合することによって形成される。しかしながら、共有結合は、相互作用するパートナー間にも存在し得る。例えば、２つの相互作用パートナーは、タンパク質複合体がより安定になるように共有結合的に架橋され得る。タンパク質複合体は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡなどの核酸、又は金属イオン、ホルモン、第２のメッセンジャー、リン酸塩、糖から選択される脂質若しくは更なる補因子若しくは部分などの他の分子を含んでも含んでいなくてもよく、かつ／又はそれらと会合してもよい。本発明によって包含される「タンパク質複合体」は、より大きな生理学的タンパク質アセンブリの一部又は単位であってもよい。
「単離されたタンパク質複合体」という用語は、その天然又は元の細胞環境又は身体環境において、自然界で見られるものとは異なる組成物又は環境中に存在するタンパク質複合体を意味する。好ましくは、「単離されたタンパク質複合体」は、他の天然に共存する細胞又は組織成分の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％から分離される。したがって、「単離されたタンパク質複合体」はまた、人工調製物中に天然に存在するタンパク質複合体又は非天然宿主細胞であり得る。「単離されたタンパク質複合体」はまた、「精製されたタンパク質複合体」、すなわち、他の細胞成分、他のポリペプチド、ウイルス物質、若しくは培養培地を実質的に含まない実質的に均質な調製物中で、又はタンパク質複合体中のタンパク質成分が化学的に合成される場合、化学的前駆体又は化学的合成に関連する副生成物を含まない実質的に精製された形態であってもよい。「精製されたタンパク質複合体」とは、典型的には、特定のタンパク質複合体の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％を含有する調製物を意味する。「精製されたタンパク質複合体」は、標準的な精製技法によって、又は化学合成によって、天然又は組換え宿主細胞又は他の身体試料から得ることができる。
「修飾ポリペプチド」又は「修飾タンパク質複合体」という用語は、その天然又は元の細胞又は身体環境において、自然界で見られるものとは異なる組成物中に存在するポリペプチド又はタンパク質複合体を指す。本明細書で使用される「修飾」という用語は、基の切断及び付加又は除去を含む、本発明によって包含されるタンパク質又はタンパク質複合体の全ての修飾を指す。いくつかの実施形態では、「修飾ポリペプチド」又は「修飾タンパク質複合体」は、その天然又は元の細胞又は身体環境において修飾される、すなわち、自然界で見られるものとは異なる、少なくとも１つの修飾（例えば、断片、変異等）又はサブユニットを含む。「修飾サブユニット」は、例えば、それが由来する天然サブユニットの誘導体又は断片であってもよい。
「活性」という用語は、タンパク質又はタンパク質複合体と関連して使用される場合、特定のタンパク質又はタンパク質複合体によって示されるか、又はそれと関連付けられる任意の生理学的又は生化学的活性を意味し、生物学的プロセス及び細胞機能示されるにおいて活性、別の分子又はその部分と相互作用又は結合する能力、特定の分子に対する結合親和性又は特異性、インビトロ又はインビボ安定性（例えば、タンパク質分解速度、若しくはタンパク質複合体の場合は、タンパク質複合体の形態を維持する能力）、抗原性及び免疫原性、酵素活性等を含むがこれらに限定されない。かかる活性は、当業者には明らかであろうように、様々な好適な方法のうちのいずれかによって検出又はアッセイされ得る。
本明細書で使用される場合、「相互作用アンタゴニスト」という用語は、タンパク質－タンパク質相互作用を干渉する、遮断する、妨害する、若しくは不安定化する；タンパク質複合体の形成を遮断する、若しくは干渉する、又は既存のタンパク質複合体を不安定化する、妨害する、若しくは解離する化合物を意味する。
本明細書で使用される「相互作用アゴニスト」という用語は、タンパク質相互作用の形成を引き起こす、開始させる、増殖させる、核生成させる、若しくは他の方法で増強させる；タンパク質複合体の形成を引き起こす、開始させる、増殖させる、核形成させる、若しくは他の方法で増強させる；又は既存のタンパク質複合体を安定化させる化合物を意味する。
「ＰＲＣ１．１複合体」又は「ポリコーム抑制複合体１．１」という用語は、ＵＳＰ７、ＫＤＭ２Ｂ、ＢＣＯＲ又はＢＣＯＲＬ１、ＲＩＮＧ１Ａ、ＲＩＮＧ１Ｂ、ＲＹＢＰ／ＹＡＦ２、ＰＣＧＦ１、及びＳＫＰ１を含むタンパク質の複合体を指す。ＰＲＣ１．１の喪失は、音波ヘッジホッグ駆動髄芽腫の発達を加速させることが示されている（Ｋｕｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０２．０６．９３８０３５）。この複合体は、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）のコミットメントとの関連で研究されている。これらの細胞におけるＰＲＣ１．１不全は、骨髄系分化を誘導し、骨髄系悪性腫瘍をもたらした（Ｉｗａｍａ（２０１８）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６４：Ｓ３９）。
「対象」という用語は、任意の健常な動物、哺乳動物若しくはヒト、又はがん、例えば、脳、肺、卵巣、膵臓、肝臓、乳房、前立腺、及び／若しくは結腸直腸がん、黒色腫、多発性骨髄腫等に罹患している任意の動物、哺乳動物、若しくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と同義である。
「生存期間」という用語には、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、又は腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（病という用語は、がん及びそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時又は治療開始時）及び終点（例えば、死、再発、又は転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、及び腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。
「相乗効果」という用語は、２つ以上の抗がん剤（例えば、免疫療法と組み合わせての、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤）の併用効果が、抗がん剤／療法単独の個別の効果の合計を上回り得ることを指す。
「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞という用語は、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞及びＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方も含む。「抗原提示細胞」という用語は、専門的な抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）、並びに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を含む。
「治療効果」という用語は、薬理学的に活性な物質によって引き起こされる動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトにおける局所又は全身効果を指す。したがって、この用語は、動物若しくはヒトにおける疾患の診断、治癒、緩和、治療、若しくは予防、又は望ましい身体若しくは精神発達及び状態の増強における使用を目的とした任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、いずれの治療にも適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でいくらかの所望の局所又は全身効果をもたらすかかる物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度等に依存するであろう。例えば、本発明の方法によって見出されたある特定の化合物が、かかる治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。
いくつかの実施形態では、「治療有効量」及び「有効量」という用語は、いずれの医学的治療にも適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で動物における細胞の少なくとも亜集団にいくらかの所望の治療効果をもたらすのに有効である薬剤を含む、化合物、材料、又は組成物の量であり得る。対象化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０及びＥＤ５０を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準の医薬品手順によって決定され得る。高い治療指数を呈する組成物が好ましい。いくつかの実施形態では、ＬＤ５０（致死投薬量）が測定され得、薬剤の投与なしと比較して、薬剤に対して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又はそれ以上低減し得る。同様に、ＥＤ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する濃度）が測定され得、薬剤の投与なしと比較して、薬剤に対して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又はそれ以上増加し得る。また、同様に、ＩＣ５０（すなわち、がん細胞への半最大細胞毒性又は細胞増殖抑制効果を達成する濃度）が測定され得、薬剤の投与なしと比較して、薬剤に対して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又はそれ以上増加し得る。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるがん細胞成長が、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は更には１００％阻害され得る。別の実施形態では、固体悪性腫瘍における少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は更には１００％の減少が達成され得る。
「転写されたポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド転写物」は、バイオマーカー核酸の転写、及びＲＮＡ転写物（存在する場合）の正常な翻訳後プロセシング（例えば、スプライシング）、及びＲＮＡ転写物の逆転写によって作製される成熟ｍＲＮＡの全て又は一部と相補的であるか、又はこれらと相同であるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はこのようなＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの類似体）である。
本明細書で使用されるとき、「無応答性」という用語は、療法に対するがん細胞の屈折性、又は刺激、例えば、活性化受容体若しくはサイトカインによる刺激に対する免疫細胞などの治療細胞の屈折性を含む。無応答性は、例えば、免疫抑制剤への曝露又は高用量の抗原への曝露により生じ得る。本明細書で使用される場合、「アネルギー」又は「耐性」という用語は、受容体媒介性刺激の活性化に対する屈折性を含む。かかる屈折性は、一般に、抗原特異的であり、耐性化抗原への曝露が終了した後に持続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギー（非応答性とは反対）は、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ－２の欠如を特徴とする。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、第１のシグナル（Ｔ細胞受容体又はＣＤ－３媒介性シグナル）を第２のシグナル（共刺激シグナル）の不在下で受けるときに生じる。これらの条件下で、細胞の同じ抗原への再曝露（再曝露が共刺激ポリペプチドの存在下で生じる場合でさえも）により、サイトカインの産生に失敗し、それ故に、増殖に失敗する。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）で培養された場合、増殖することができる。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡ又は指標細胞株を使用した増殖アッセイによって測定されるＴリンパ球によるＩＬ－２産生の欠如によっても観察され得る。あるいは、レポーター遺伝子構築物が使用され得る。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ－２遺伝子エンハンサーの制御下で異種プロモーターによって又はエンハンサー中に見られ得るＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩＬ－２遺伝子転写を開始することができない（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１１３４）。
特定のタンパク質のアミノ酸配列と、遺伝子コード（以下に示される）によって定義されるタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、遺伝子コードによって定義される核酸によってコードされるアミノ酸配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。
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遺伝子コードの重要な周知の特徴は、その冗長性であり、それにより、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸の大半には、１つより多くのコーディングヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上で例証される）。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。かかるヌクレオチド配列は、全ての生物における同じアミノ酸配列の産生をもたらすため（ある特定の生物はいくつかの配列を他の配列よりも効率的に翻訳し得るが）、機能的に同等であるとみなされる。更に、時折、プリン又はピリミジンのメチル化バリアントが所与のヌクレオチド配列に見られ得る。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響を及ぼさない。
前述を考慮して、バイオマーカー核酸（又はその任意の部分）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳するための遺伝子コードを使用してポリペプチドアミノ酸配列を得るために使用され得る。同様に、ポリペプチドアミノ酸配列について、ポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列が遺伝子コードから推定され得る（その冗長性のため、任意の所与のアミノ酸配列に対して複数の核酸配列がもたらされる）。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の本明細書における説明及び／又は開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の説明及び／又は開示も含むとみなされるべきである。同様に、本明細書におけるポリペプチドアミノ酸配列の説明及び／又は開示は、アミノ酸配列をコードすることができる全ての可能なヌクレオチド配列の説明及び／又は開示も含むとみなされるべきである。
最後に、本発明の遺伝子座及びバイオマーカー（表１及び２に列挙されるバイオマーカー）についての核酸及びアミノ酸配列情報は、当該技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などの一般に公開されているデータベースで容易に入手可能である。例えば、一般に公開されている配列データベースに由来する例示の核酸及びアミノ酸配列が、以下に提供され、例えば、ＰＣＴ公開第２０１４／０２２７５９号が含まれ、これは、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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 ＊ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンがウリジンで置き換えられたもの）、コードされたタンパク質のオルソログをコードする核酸分子、並びに本明細書に記載の表５、及び表１～４に列挙されるいずれかの配列番号の核酸配列又はその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列が、本明細書に記載の表５、及び表１～４に含まれる。かかる核酸分子は、本明細書に更に記載される全長核酸の機能を有し得る。
＊例えば、ヒト、マウス、サル等におけるタンパク質のオルソログ、並びに本明細書に記載の表５、及び表１～４に列挙されるいずれかの配列番号のアミノ酸配列又はその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が、本明細書に記載の表５、及び表１～４に含まれる。かかるポリペプチドは、本明細書に更に記載される全長ポリペプチドの機能を有し得る。
ＩＩ．対象
一実施形態では、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤及び免疫療法併用治療の有効性の予測可能性が決定される対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、家畜、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等）であり、好ましくはヒトである。別の実施形態では、対象は、がんの動物モデルである。例えば、動物モデルは、ヒト由来のがんの同所性異種移植片動物モデルであり得る。
本発明の方法の別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び／又は免疫療法などの治療を受けていない。なお別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び／又は免疫療法などの治療を受けている。
ある特定の実施形態では、対象は、がん性又は前がん性組織を取り除くための手術を受けている。他の実施形態では、がん性組織は取り除かれておらず、例えば、がん性組織は、生命に不可欠な組織又は外科的手技が患者に危害を及ぼすかなりの危険性を引き起こすであろう領域等の身体の手術不能な領域に位置し得る。本発明の方法を使用して、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤に対する応答性を決定することができ、本明細書に記載のものなどの対象における多くの異なるがんの免疫療法併用治療を決定することができる。
ＩＩＩ．試料の収集、調製、及び分離
いくつかの実施形態では、対象由来の試料中のバイオマーカー量及び／又は活性測定値が、所定の対照（基準）試料と比較される。対象由来の試料は、典型的には、がん細胞又は組織等の罹患組織由来である。対照試料は、同じ対象又は異なる対象由来であり得る。対照試料は、典型的には、罹患していない正常試料である。しかしながら、いくつかの実施形態では、疾患の病期分類又は治療の有効性の評価等のために、対照試料は罹患組織由来であり得る。対照試料は、いくつかの異なる対象由来の試料の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、対象由来のバイオマーカー量及び／又は活性測定値が所定のレベルと比較される。この所定のレベルは、典型的には、正常試料から得られる。本明細書に記載される場合、「所定の」バイオマーカー量及び／又は活性測定値は、ほんの一例として、治療に選択され得る対象を評価する（例えば、ゲノム変異の数及び／又はＤＮＡ修復遺伝子の非機能性タンパク質を引き起こすゲノム変異の数に基づいて）、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤に対する応答を評価し、かつ／又は表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤及び１つ以上の追加の抗がん療法を伴う免疫療法併用治療に対する応答を評価するために使用されるバイオマーカー量及び／又は活性測定値であり得る。所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、がんを有する患者集団又はがんを有しない患者集団において決定され得る。所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、あらゆる患者に平等に適用可能な単数であり得るか、又は所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、特定の患者亜集団により異なり得る。対象の年齢、体重、身長、及び他の因子は、その個体の所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値に影響を及ぼし得る。更に、所定のバイオマーカー量及び／又は活性は、対象毎に個別に決定され得る。
一実施形態では、本明細書に記載の方法で決定及び／又は比較される量は、絶対測定値に基づいている。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で決定及び／又は比較される量は、比率等の相対的測定（例えば、治療前対治療後のバイオマーカーコピー数、レベル、及び／又は活性、スパイク又は人工対照に対するかかるバイオマーカー測定値、ハウスキーピング遺伝子の発現に対するかかるバイオマーカー測定値等）に基づいている。例えば、相対的分析は、治療後バイオマーカー測定と比較した治療前バイオマーカー測定の比率に基づき得る。治療前バイオマーカー測定は、抗がん療法開始前の任意の時点で行われ得る。治療後バイオマーカー測定は、抗がん療法開始後の任意の時点で行われ得る。いくつかの実施形態では、治療後バイオマーカー測定は、抗がん療法開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、又はそれ以上後に、継続的監視のために無期限に近い更に長い期間後に行われる。治療は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの１つ以上の阻害剤、及び免疫療法併用治療を単独で、又は免疫チェックポイント阻害剤などの他の抗がん剤と組み合わせて含む、治療レジメンなどの抗がん療法を含み得る。
所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、任意の好適な基準であり得る。例えば、所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、患者選択が評価される同じ又は異なるヒトから得られ得る。一実施形態では、所定のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、同じ患者の以前の評価から得られ得る。かかる様式で、患者の選択の経過が経時的に監視され得る。加えて、対照は、別のヒト又は複数のヒト、例えば、対象がヒトである場合、選択されたヒト群の評価から得られ得る。かかる様式で、選択が評価されるヒトの選択の程度が、好適な他のヒト、例えば、同様若しくは同じ状態に罹患しているヒト及び／又は同じ民族集団のヒト等の目的とするヒトと同様の状況下にある他のヒトと比較され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、所定のレベルからのバイオマーカー量及び／又は活性測定値の変化は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、若しくは５．０倍、又はそれ以上、又はそれらの間の任意の範囲（境界値も含む）である。測定値が相対的変化に基づいている、例えば、治療前バイオマーカー測定を治療後バイオマーカー測定と比較した比率に基づいている場合に、かかるカットオフ値が平等に適用される。生物学的試料は、核酸及び／又はタンパク質を含む体液試料、細胞試料、又は組織試料を含む患者由来の様々な源から収集され得る。「体液」とは、身体から排泄又は分泌される流体、並びに通常は身体から排泄又は分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液及び血漿、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）及び耳垢（ｅａｒｗａｘ）、カウパー液又は前射精液、乳糜、糜粥、糞便、雌性射出液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸膜液、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙、尿、腟粘滑液、硝子体液、嘔吐物）を指す。好ましい実施形態では、対象試料及び／又は対照試料は、細胞、細胞株、組織学的スライド、パラフィン包埋組織、生検、全血、乳頭吸引液、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、及び骨髄からなる群から選択される。一実施形態では、試料は、血清、血漿、又は尿である。別の実施形態では、試料は、血清である。
試料は、長期間にわたって個体から繰り返し収集され得る（例えば、約数日間、数週間、数ヶ月に１回以上、年１回、年２回等）。ある期間にわたって個体から多数の試料を得ることは、早期検出からの結果を検証し、かつ／又は生物学的パターンの変化を、例えば、疾患進行、薬物治療等の結果として特定するために使用され得る。例えば、対象試料は、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、又は本発明による１、２、若しくは３ヶ月間隔の組み合わせで採取及び監視され得る。加えて、経時的に得られた対象のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、監視期間中に、互いに、かつ正常対照のものと好都合に比較され、それにより、対象自身の値を長期監視のための内部対照又は個人的対照として提供することができる。
試料調製及び分離は、収集された試料のタイプ及び／又はバイオマーカー測定値の分析に応じて、手順のうちのいずれかを含み得る。かかる手順には、ほんの一例として、濃縮、希釈、ｐＨの調整、高濃度ポリペプチド（例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、及びトランスフェリン等）の除去、保存料及び検量体の添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、変性剤の添加、試料の脱塩、試料タンパク質の濃縮、脂質の抽出及び精製が含まれる。
試料調製は、非共有結合複合体中で他のタンパク質（例えば、担体タンパク質）に結合した分子を単離することもできる。このプロセスは、特定の担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合したこれらの分子を単離することができるか、又はタンパク質変性による、例えば、酸を使用した、全ての担体タンパク質からの結合した分子の放出、その後の担体タンパク質の除去等のより一般的なプロセスを使用することができる。
望ましくないタンパク質（例えば、高濃度の、無益な、又は検出不能なタンパク質）の試料からの除去は、高親和性試薬、高分子量フィルター、超遠心分離及び／又は電気透析を使用して達成され得る。高親和性試薬には、高濃度タンパク質に選択的に結合する抗体又は他の試薬（例えば、アプタマー）が含まれる。試料調製には、イオン交換クロマトグラフィー、金属イオン親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、クロマト分画、吸着クロマトグラフィー、等電点分画、及び関連技法も含まれ得る。分子量フィルターには、サイズ及び分子量に基づいて分子を分離する膜が含まれる。かかるフィルターは、逆浸透、ナノ濾過、限外濾過、及び精密濾過を更に用い得る。
超遠心分離とは、望ましくないポリペプチドを試料から除去するための方法である。超遠心分離とは、光学系で粒子の沈降（又はその欠如）を監視しながら、約１５，０００～６０，０００ｒｐｍで試料を遠心分離することである。
電気透析とは、イオンが電位勾配の影響下で半透性膜を通して１つの溶液から別の溶液に輸送されるプロセスにおいて電気膜又は半透性膜を使用する手技である。電気透析に使用される膜は、正電荷又は負電荷を有するイオンを選択的に輸送するか、反対電荷のイオンを拒絶するか、又は種がサイズ及び電荷に基づいて半透性膜を通って移動することを可能にする能力を有し得るため、電気透析を電解質の濃縮、除去、又は分離に有用なものにする。
本発明における分離及び精製は、当該技術分野で既知の任意の手技、例えば、キャピラリー電気泳動（例えば、キャピラリー内若しくはチップ上）又はクロマトグラフィー（例えば、キャピラリー内、カラム、若しくはチップ上）を含み得る。電気泳動とは、電場の影響下でイオン性分子を分離するために使用され得る方法である。電気泳動は、ゲル中、キャピラリー内、又はチップ上のマイクロチャネル内で行われ得る。電気泳動に使用されるゲルの例には、デンプン、アクリルアミド、ポリエチレンオキシド、アガロース、又はそれらの組み合わせが挙げられる。ゲルは、その架橋結合、洗剤又は変性剤の添加、酵素又は抗体（アフィニティー電気泳動）又は基質（ザイモグラフィー）の固定化、及びｐＨ勾配の組み込みによって修飾され得る。電気泳動に使用されるキャピラリーの例には、エレクトロスプレーと連動するキャピラリーが挙げられる。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、複合親水性分子と高度に荷電された溶質の分離に好ましい。ＣＥ技術は、マイクロ流体チップ上に実装される場合もある。使用されるキャピラリー及び緩衝液のタイプに応じて、ＣＥは、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ｃＩＴＰ）、及びキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）等の分離技法に更に分けられ得る。ＣＥ技法をエレクトロスプレーイオン化に連結するための実施形態は、揮発性溶液、例えば、揮発性酸及び／又は塩基を含有する水性混合物並びにアルコール又はアセトニトリル等の有機物の使用を含む。
キャピラリー等速電気泳動（ｃＩＴＰ）とは、分析物がキャピラリーを通って一定速度で移動するが、それにもかかわらずそれらのそれぞれの移動度によって分離される技法である。キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、別名、自由溶液ＣＥ（ＦＳＣＥ）とは、分子上の電荷によって決定される種の電気泳動移動度の差及び分子が移動中に遭遇する摩擦抵抗（多くの場合、分子のサイズに正比例する）に基づいている。キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、弱イオン性両性分子がｐＨ勾配で電気泳動によって分離されることを可能にする。ＣＥＣは、伝統的な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＣＥとの間のハイブリッド技法である。
本発明で使用される分離及び精製技法は、当該技術分野で既知の任意のクロマトグラフィー手順を含む。クロマトグラフィーは、ある特定の分析物の示差的吸着及び溶出又は移動相と固定相との間での分析物の分配に基づき得る。クロマトグラフィーの異なる例としては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＶ．バイオマーカー核酸及びポリペプチド
本発明の一態様は、バイオマーカーポリペプチド又はかかるポリペプチドの一部をコードするバイオマーカー核酸に対応する単離された核酸分子の使用に関する。本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、並びにヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むことが意図されている。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸の由来となる生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然で隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を含まない配列（好ましくは、タンパク質をコードする配列）である。例えば、様々な実施形態では、単離された核酸分子は、核酸の由来となる細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然で隣接する約５ｋＢ、４ｋＢ、３ｋＢ、２ｋＢ、１ｋＢ、０．５ｋＢ、又は０．１ｋＢ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。更に、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技法によって産生される場合には他の細胞物質若しくは培養培地を実質的に含み得ないか、又は化学的に合成される場合には化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含み得ない。
本発明のバイオマーカー核酸分子は、標準の分子生物学技法及び本明細書に記載のデータベース記録の配列情報を使用して単離され得る。かかる核酸配列の全て又は一部を使用して、本発明の核酸分子は、標準のハイブリダイゼーション及びクローニング技法を使用して単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるように）。
本発明の核酸分子は、標準のＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡ、及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅され得る。このように増幅された核酸分子は、適切なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列分析によって特性決定され得る。更に、本発明の核酸分子の全て又は一部に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して、標準の合成技法によって調製され得る。
更に、本発明の核酸分子は、核酸配列の一部のみを含むことができ、全長核酸配列は、本発明のマーカーを含むか、又は本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする。かかる核酸分子は、例えば、プローブ又はプライマーとして使用することができる。プローブ／プライマーは、典型的には、１つ以上の実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴヌクレオチドは、典型的には、バイオマーカー核酸配列の少なくとも約７、好ましくは約１５、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００以上の連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。バイオマーカー核酸分子の配列に基づくプローブを使用して、本発明の１つ以上のマーカーに対応する転写物又はゲノム配列を検出することができる。プローブは、それに付着した標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子を含む。
遺伝子コードの縮重に起因して、バイオマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列とは異なり、したがって、同じタンパク質をコードするバイオマーカー核酸分子もまた企図される。
加えて、アミノ酸配列において変化を生じさせるＤＮＡ配列多型が、ある集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることは、当業者には理解されるであろう。かかる遺伝子多型は、天然対立遺伝子多様性に起因して、ある集団内の個体間に存在し得る。対立遺伝子は、あるいは所与の遺伝子座で生じる遺伝子群のうちの１つである。加えて、ＲＮＡ発現レベルに影響を与えるＤＮＡ多型もまた存在し得、これが（例えば、制御又は分解に影響を与えることによって）その遺伝子の全体的な発現レベルに影響を与え得ることが理解されるであろう。
本明細書で「対立遺伝子バリアント」と同義に使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子又はその部分の代替形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上で同じ遺伝子座又は位置を占める。対象が遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合、対象は、遺伝子又は対立遺伝子に対してホモ接合であると言われる。対象が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、対象は、遺伝子又は対立遺伝子に対してヘテロ接合であると言われる。例えば、バイオマーカー対立遺伝子は、単一のヌクレオチド又はいくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失、及び挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、１つ以上の変異を含有する遺伝子の形態であり得る。
本明細書で互換的に使用される、「遺伝子の多型領域の対立遺伝子バリアント」又は「対立遺伝子バリアント」という用語は、集団中の遺伝子のその領域に見出されるいくつかの可能なヌクレオチド配列のうちの１つを有する遺伝子の代替形態を指す。本明細書で使用される場合、対立遺伝子バリアントは、機能的対立遺伝子バリアント、非機能的対立遺伝子バリアント、ＳＮＰ、変異及び多型を包含することを意味する。
「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）という用語は、対立遺伝子配列間の変化の部位である単一ヌクレオチドによって占められる多型部位を指す。この部位は、通常、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１／１００又は１／１０００未満のメンバーで変化する配列）が前にあり、後に続く。ＳＮＰは、通常、多型部位におけるあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換に起因して生じる。ＳＮＰは、参照対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失又はヌクレオチドの挿入からも生じ得る。典型的には、多型部位は、参照塩基以外の塩基によって占有される。例えば、参照対立遺伝子が多型部位に塩基「Ｔ」（チミジン）を含有する場合、改変した対立遺伝子は、多型部位に「Ｃ」（シチジン）、「Ｇ」（グアニン）、又は「Ａ」（アデニン）を含有することができる。ＳＮＰは、タンパク質コード核酸配列において生じ得るが、その場合、それらは、欠陥若しくは他のバリアントタンパク質、又は遺伝疾患を引き起こし得る。かかるＳＮＰは、遺伝子のコーディング配列を改変させることができ、したがって、別のアミノ酸（「ミスセンス」ＳＮＰ）を特定し得るか、又はＳＮＰは、停止コドン（「ナンセンス」ＳＮＰ）を導入し得る。ＳＮＰがタンパク質のアミノ酸配列を改変しない場合、ＳＮＰは「サイレント」と呼ばれる。ＳＮＰはまた、ヌクレオチド配列の非コーディング領域においても生じ得る。これは、例えば、代替的なスパイシングの結果として、欠陥タンパク質発現をもたらし得るか、又はタンパク質の機能に影響を与えない場合がある。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。かかる天然対立遺伝子多様性は、典型的には、所与の遺伝子のヌクレオチド配列中に１～５％の変異をもたらし得る。いくつかの異なる個体における目的の遺伝子を配列決定することによって、代替対立遺伝子を同定することができる。これは、様々な個体における同じ遺伝子座を同定するためにハイブリダイゼーションプローブを使用することによって容易に実行することができる。天然の対立遺伝子多様性の結果であり、機能活性を改変しない、任意及び全てのかかるヌクレオチド多様性、並びに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であることが意図される。
別の実施形態では、バイオマーカー核酸分子は、少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００、又はそれ以上のヌクレオチド長であり、本発明のマーカーに対応する核酸分子、又は本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも６０％（６５％、７０％、７５％、８０％、好ましくは８５％）同一のヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を説明することが意図されている。かかるストリンジェントな条件は、当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）の節６．３．１～６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃での６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション、続いて、５０～６５℃での０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中の１つ以上の洗浄である。
集団に存在し得る本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子バリアントに加え、当業者は、それによってコードされるタンパク質の生物学的活性を改変することなく、変異によって配列変化を導入することができ、それによって、コードされるタンパク質のアミノ酸配列における変化につながることを更に理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換につながるヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変することなく、野生型配列から改変され得る残基であり、一方で、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、様々な種の相同体の間で保存されていないか、又は半保存されているだけのアミノ酸残基は、活性に必須ではなくてもよく、したがって、改変の標的である可能性が高い。あるいは、様々な種（例えば、マウス及びヒト）の相同体間で保存されるアミノ酸残基は、活性に必須であり得、したがって、改変のための標的ではあり得ない。
したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含有する本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。かかるポリペプチドは、アミノ酸配列が、本発明のマーカーに対応するが、生物学的活性を保持する天然に存在するタンパク質とは異なる。一実施形態では、バイオマーカータンパク質は、本明細書に記載のバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約４０％同一、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は同一であるアミノ酸配列を有する。
バリアントタンパク質をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を、１つ以上のアミノ酸残基置換、付加、又は欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、本発明の核酸のヌクレオチド配列に導入することによって作成され得る。変異は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準の技法によって導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐状側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。あるいは、変異は、例えば、飽和変異誘発によって、コーディング配列の全て又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされたタンパク質は、組換え的に発現することができ、タンパク質の活性を決定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、抗バイオマーカーアンチセンス核酸分子、すなわち、本発明のセンス核酸に相補的である分子、例えば、本発明のマーカーに対応する二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的である分子、又は本発明のマーカーに対応するｍＲＮＡ配列に相補的である分子の使用を更に企図する。したがって、本発明のアンチセンス核酸分子は、本発明のセンス核酸に水素結合する（すなわち、アニールする）ことができる。アンチセンス核酸は、コード鎖全体若しくはその一部のみ、例えば、タンパク質コーディング領域の全て若しくは一部（又はオープンリーディングフレーム）に相補的であり得る。アンチセンス核酸分子はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コーディング領域の全て又は一部に対してアンチセンスであり得る。非コーディング領域（「５’及び３’非翻訳領域」）は、コーディング領域に隣接し、アミノ酸に翻訳されない５’及び３’配列である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０以上のヌクレオチド長であり得る。アンチセンス核酸は、化学合成及び酵素ライゲーション反応を使用して、当該技術分野で既知の手順を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド若しくは分子の生物学的安定性を増加させるか、又はアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に産生することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、次のサブセクションで更に説明される、目的とする標的核酸に対するアンチセンス配向である）。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、例えば、転写及び／又は翻訳を阻害することによって、マーカーの発現を阻害するように、本発明の選択されたマーカーに対応するポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズ又は結合するように、対象に投与されるか、又は原位置で生成される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によるものであり得るか、又は例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主要な溝における特異的な相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注射、又はアンチセンス核酸の血液若しくは骨髄関連体液への注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾され、次いで全身的に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に結合することによって、選択された細胞表面上で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように修飾することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを使用して細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
本発明のアンチセンス核酸分子は、α－アノマー核酸分子であり得る。α－アノマー核酸分子は、通常のα単位とは対照的に、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５－６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１－６１４８）又はキメラＲＮＡ－ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７－３３０）を含むことができる。
本発明は、リボザイムも包含する。リボザイムは、それらが相補性領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５－５９１に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム）を使用して、ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断し、それにより、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムは、マーカーに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ－１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が、切断されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築することができる（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，９８７，０７１号、及びＣｅｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと）。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる（例えば、Ｂａｒｔｅｌ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１－１４１８を参照のこと）。
本発明は、三重らせん構造を形成する核酸分子も包含する。例えば、バイオマーカータンパク質の発現は、ポリペプチド（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）をコードする遺伝子の制御領域に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞における遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。概して、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）：５６９－８４、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７－３６、及びＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７－１５を参照のこと。
様々な実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解性を向上させるために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾され得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸分子を生成するように修飾され得る（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４（１）：５－２３を参照のこと）。本明細書で使用される場合、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸骨格がプソイドペプチド骨格によって置き換えられ、４つの天然核酸塩基のみが保持される、核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡ及びＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）（上記参照）、Ｐｅｒｒｙ－Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０－６７５に記載される標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して行うことができる。
ＰＮＡは、治療及び診断用途に使用することができる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写又は翻訳停止を誘導するか、又は複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス又はアンチゲン剤として使用され得る。ＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子の単一塩基対変異の分析において、他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）、上記と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として、又はＤＮＡ配列及びハイブリダイゼーションのためのプローブ若しくはプライマーとしても使用され得る（Ｈｙｒｕｐ，１９９６（上記参照）、Ｐｅｒｒｙ－Ｏ‘Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０－６７５）。
別の実施形態では、ＰＮＡは、例えば、それらの安定性若しくは細胞取り込みを向上させるために、親油性若しくは他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることによって、ＰＮＡ－ＤＮＡキメラの形成によって、又はリポソーム若しくは当該技術分野で知られている薬物送達の他の技法の使用によって修飾され得る。例えば、ＰＮＡ及びＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができる、ＰＮＡ－ＤＮＡキメラを生成することができる。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ及びＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ部分と相互作用することを可能にする一方で、ＰＮＡ部分は、高い結合親和性及び特異性を提供するであろう。ＰＮＡ－ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、及び配向の観点から選択される適切な長さのリンカーを使用して連結することができる（Ｈｙｒｕｐ，１９９６（上記参照））。ＰＮＡ－ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）（上記参照）、及びＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７－６３に記載されるように行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホロアミダイトカップリング化学反応及び修飾ヌクレオシド類似体を使用して固体支持体上で合成され得る。５’－（４－メトキシトリチル）アミノ－５’－デオキシ－チミジンホスホロアミダイトなどの化合物は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間の連結として使用することができる（Ｍａｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５９７３－８８）。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメント及び３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を産生する（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７－６３）。あるいは、キメラ分子を５’ＤＮＡセグメント及び３’ＰＮＡセグメントで合成することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９－１１１２４）。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体をインビボで標的化するための）、又は細胞膜を横切る輸送を促進する薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３－６５５６、Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６４８－６５２、ＰＣＴ公開第８８／０９８１０号を参照のこと）、又は血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開第８９／１０１３４号を参照のこと）などの他の付加基を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８－９７６を参照のこと）又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９－５４９を参照のこと）で修飾され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤等にコンジュゲートされ得る。
本発明の別の態様は、バイオマーカータンパク質及びその生物学的に活性な部分の使用に関する。一実施形態では、マーカーに対応する天然ポリペプチドは、標準のタンパク質精製技法を使用して適切な精製スキームによって細胞源又は組織源から単離され得る。別の実施形態では、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって産生される。組換え発現の代替案として、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、標準のペプチド合成技法を使用して化学的に合成され得る。
「単離された」又は「精製された」タンパク質又はその生物学的に活性な部分は、タンパク質が由来する細胞若しくは組織源由来の細胞物質若しくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、タンパク質が、それが単離されるか、又は組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離される、タンパク質の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、又は５％未満（乾燥重量で）の異種タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも称される）を有するタンパク質の調製物を含む。タンパク質又はその生物学的に活性な部分が組換え的に産生される場合、好ましくは、培養培地、すなわち、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、又は５％未満に相当する培養培地を実質的に含まない。タンパク質が化学合成によって産生される場合、タンパク質は、好ましくは、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、タンパク質のかかる調製物は、目的とするポリペプチド以外の化学的前駆体又は化合物の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％未満を有する。
バイオマーカーポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本明細書に記載のバイオマーカータンパク質アミノ酸配列と十分に同一であるか、又はそれに由来するアミノ酸配列を含むが、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を呈するポリペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、又はそれ以上のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。更に、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技法によって調製され、本発明のポリペプチドの天然形態の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
好ましいポリペプチドは、本明細書に記載の核酸分子によってコードされるバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、これらの配列のうちの１つと実質的に同一であり（例えば、少なくとも約４０％、好ましくは５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）、対応する天然に存在するタンパク質のタンパク質の機能的活性を保持するが、天然対立遺伝子変異又は変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、配列が最適比較目的のためにアラインされる（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適アライメントのために第１のアミノ酸又は核酸配列の配列にギャップが導入され得る）。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されている場合、それらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／総位置数（例えば、重複している位置）×１００）である。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５８７７と同様に修飾された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行われ得る。本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行われ得る。比較目的のためにギャップドアライメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを参照のこと。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ，４：１１－７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４が使用され得る。局所配列類似性及びアライメントの領域の特定に有用な更に別のアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４－２４４８に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するためにＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０重み残基表がｋ－タプル値２で使用され得る。
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容して又はギャップを許容することなく、上述の技法と同様の技法を使用して決定され得る。同一性パーセントを計算する際、正確な一致のみが計数される。本発明は、バイオマーカータンパク質に対応するキメラ又は融合タンパク質も提供する。本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、マーカーに対応するポリペプチド以外のポリペプチド）に作動可能に連結された本発明のマーカーに対応するポリペプチドの全て又は一部（好ましくは、生物学的に活性な部分）を含む。融合タンパク質において、「作動可能に連結される」という用語は、本発明のポリペプチドと異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すよう意図されている。異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に融合し得る。
１つの有用な融合タンパク質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドがＧＳＴ配列のカルボキシル末端に融合しているＧＳＴ融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を容易にし得る。
別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列、免疫グロブリン融合タンパク質、毒素、又は他の有用なタンパク質配列を含む。本発明のキメラ及び融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技法によって産生され得る。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法によって合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間の相補的オーバーハングをもたらすアンカープライマーを使用して行われ得、その後、これがアニール及び再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記参照）を参照のこと）。更に、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明によって包含されるポリペプチドにインフレームで連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングされ得る。
シグナル配列を使用して、分泌タンパク質又は目的とする他のタンパク質の分泌及び単離を容易にすることができる。シグナル配列は、典型的には、一般に１つ以上の切断事象において分泌中に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とする。かかるシグナルペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にする処理部位を含む。したがって、本発明は、シグナル配列を有する記載のポリペプチド、並びにシグナル配列がタンパク質分解的に切断されたポリペプチド（すなわち、切断産物）に関する。一実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列は、通常は分泌されないか、又はさもなければ単離が困難なタンパク質等の目的とするタンパク質に発現ベクター内で作動可能に連結され得る。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換される真核宿主等からのタンパク質の分泌を指示し、シグナル配列がその後に又は同時に切断される。その後、タンパク質は、当該技術分野によって認識された方法によって細胞外培地から容易に精製され得る。あるいは、シグナル配列は、ＧＳＴドメイン等の精製を容易にする配列を使用して目的とするタンパク質に連結され得る。
本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーポリペプチドのバリアントにも関する。かかるバリアントは、アゴニスト（模倣物）又はアンタゴニストのいずれかとして機能し得る改変されたアミノ酸配列を有し得る。バリアントは、変異誘発、例えば、離散点変異又は切断によって生成され得る。アゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同じもの又はそのサブセットを保持し得る。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的とするタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流又は上流メンバーに競合的に結合することによって、タンパク質の天然に存在する形態の活性のうちの１つ以上を阻害し得る。したがって、特定の生物学的効果が限定された機能を有するバリアントでの処理によって誘発され得る。タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有するバリアントでの対象の治療は、タンパク質の天然に存在する形態での治療と比較して対象におけるより少ない副作用を有し得る。
アゴニスト（模倣物）又はアンタゴニストのいずれかとして機能するバイオマーカータンパク質のバリアントは、本発明のタンパク質の変異体、例えば、切断変異体のコンビナトリアルライブラリをアゴニスト又はアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定され得る。一実施形態では、バリアントの多様化ライブラリが核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、多様化遺伝子ライブラリによってコードされる。バリアントの多様化ライブラリは、潜在的なタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして又はあるいはより大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイ用に）発現可能であるように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的なバリアントのライブラリを産生するために使用され得る様々な方法が存在する。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
加えて、本発明のマーカーに対応するポリペプチドのコーディング配列の断片のライブラリを使用して、バリアントのスクリーニング及びその後の選択のためのポリペプチドの多様化集団を生成することができる。例えば、コーディング配列断片のライブラリは、ニッキングが１分子当たり約１回のみ生じる条件下で目的とするコーディング配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、結果として生じた断片ライブラリを発現ベクターにライゲートすることによって生成され得る。この方法により、目的とするタンパク質の様々なサイズのアミノ末端及び内部断片をコードする発現ライブラリが得られ得る。
点変異又は切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、かつ選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該技術分野で既知である。大きい遺伝子ライブラリをスクリーニングするためのハイスループット分析に従う最も広く使用されている技法は、典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングすることと、適切な細胞をベクターの結果として生じたライブラリで形質転換することと、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることとを含む。ライブラリにおける機能的変異体の頻度を高める技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）が、本発明のタンパク質のバリアントを同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７８１１－７８１５、Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７－３３１）。表１～５に列挙されるバイオマーカー又はそれらの断片を含む、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカーに対応する単離されたポリペプチド若しくはその断片（又はかかるポリペプチドをコードする核酸）は、当該技術分野で周知の方法に従ってポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を調製するための標準の技法を使用して、当該免疫原に結合する抗体を生成するために、免疫原として使用され得る。抗原ペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生された抗体がそれぞれの全長分子と特異的免疫複合体を形成するように、それぞれの全長分子中に存在するエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、かかるエピトープは、マウス又はヒト等の１つの種由来の所与のポリペプチド分子に対して特異的であり得る（すなわち、種にわたって保存されていないポリペプチド分子の領域にわたる抗原ペプチドが免疫原として使用され、かかる保存されていない残基が本明細書に提供されるアライメント等のアライメントを使用して決定され得る）。
いくつかの実施形態では、免疫療法は、ＰＤ－１などの免疫チェックポイントに実質的に特異的に結合する抗体などの少なくとも１つの免疫チェックポイントの阻害剤を利用し、例えば、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２結合パートナーなどの免疫チェックポイントの結合パートナーとの相互作用を妨害することによって、その免疫阻害機能を阻害又は遮断する。一実施形態では、抗体、特にイントラボディは、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーに実質的に特異的に結合し、その生物学的機能を阻害又は遮断する。別の実施形態では、抗体、特にイントラボディは、本明細書に記載されるかかる１つ以上のバイオマーカーの基質などの表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの結合パートナーに実質的に特異的に結合し、例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーとの相互作用を妨害することによって、その生物学的機能を阻害又は遮断する。
例えば、ポリペプチド免疫原は、典型的には、好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、又は他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することによって抗体を調製するために使用される。好ましい動物は、所望の標的抗原が欠損したマウスである。例えば、所望の抗体が抗ＰＤ－１抗体である場合、ＰＤ－１ノックアウトマウスが使用され得る。これにより、一般的なマウス及びヒトのエピトープに反応する抗体が許容機構によって除去されないため、より広い範囲の抗体認識可能性がもたらされる。適切な免疫原性調製物は、例えば、免疫応答が生成される組換え的に発現された又は化学的に合成された分子又はその断片を含み得る。この調製物は、フロインド完全若しくは不完全アジュバント等のアジュバント、又は同様の免疫刺激剤を更に含む。好適な対象の免疫原性調製物での免疫化により、内部に含まれる抗原ペプチドに対するポリクローナル抗体の応答が誘導される。
ポリクローナル抗体は、好適な対象をポリペプチド免疫原で免疫化することによって上述のように調製され得る。免疫化された対象におけるポリペプチド抗体力価が、固定化ポリペプチドを使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の標準の技法によって経時的に監視され得る。所望の場合、抗原に対して産生された抗体が哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、タンパク質Ａクロマトグラフィー等の周知の技法によって更に精製されて、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化後の適切な時点で、例えば、抗体力価が最も高い時点で、抗体を産生する細胞が対象から得られ、それを使用して、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７によって最初に説明された）（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９－４６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０－８３、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：２９２７－３１、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９－７５も参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶ－ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）、又はトリオーマ技法等の標準の技法によってモノクローナル抗体を調製する。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術が周知である（概して、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）、Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７－４０２、Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１－３６を参照のこと）。簡潔には、不死細胞株（典型的には、骨髄腫）が上述のように免疫原で免疫化された哺乳動物由来のリンパ球（典型的には、脾細胞）に融合し、結果として生じたハイブリドーマ細胞の培養上清がスクリーニングされて、ポリペプチド抗原に好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが特定される。いくつかの実施形態では、免疫化は、目的とする標的抗原のノックアウトを有する（例えば、免疫化前に抗原を産生しない）細胞又は動物宿主で行われる。
リンパ球を不死化細胞株に融合させるために使用される多くの周知のプロトコルのうちのいずれか、表１～５に列挙されるバイオマーカーを含む、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカー又はその断片に対するモノクローナル抗体を生成する目的のために適用され得る（例えば、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２、Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）（上記参照）、Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）（上記参照）、Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）（上記参照）を参照のこと）。更に、当業者であれば、同様に有用であろうかかる方法の多くの変形が存在することを理解する。
典型的には、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫化されたマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞株に融合させることによって作製され得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のマウス骨髄腫細胞株である。Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４－１、Ｐ３－ｘ６３－Ａｇ８．６５３、又はＳｐ２／Ｏ－Ａｇ１４骨髄腫株等のいくつかの骨髄腫細胞株のうちのいずれかが、標準の技法に従って融合パートナーとして使用され得る。これらの骨髄腫株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合する。その後、この融合から生じたハイブリドーマ細胞が、融合していない骨髄腫細胞及び非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択される（融合していない脾細胞は形質転換されていないため、数日後に死ぬ）。本発明によって包含されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ハイブリドーマ培養上清を所与のポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることによって検出される。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代替案として、上述のポリペプチドのうちの１つに特異的なモノクローナルは、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）を適切なポリペプチドでスクリーニングし、それにより、ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することによって特定及び単離される。ファージディスプレイライブラリを生成及びスクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号２７－９４００－０１）、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット（カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングにおける使用に特に従う方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９２／１８６１９号）、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９１／１７２７１号）、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９２／２０７９１号）、Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９２／１５６７９号）、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９３／０１２８８号）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９２／０１０４７号）、Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９２／０９６９０号）、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開第９０／０２８０９号）、Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（ＮＹ）９：１３６９－１３７２号、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５－７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３５７６－３５８０、Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（ＮＹ）９：１３７３－１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３－ ４１３７、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：７９７８－７９８２、及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４において見出すことができる。
抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３ドメインが、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことが当該技術分野で周知であるため、上述のように調製された本発明の組換えモノクローナル抗体は、好ましくは、本明細書に記載され、かつ当該技術分野で周知の抗体の可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３を含む。同様に、本抗体は、当該抗体の可変領域のＣＤＲ２を更に含み得る。本抗体は、当該抗体の可変領域のＣＤＲ１を更に含み得る。他の実施形態では、本抗体は、これらのＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る。
上述の操作された抗体のＣＤＲ１、２、及び／又は３領域は、本明細書に記載される本発明の可変領域と全く同じアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、当業者であれば、抗体、特にイントラボディが、所望の標的、例えば、表１～５に列挙されている１つ以上のバイオマーカー、及び／又はその結合パートナーに、単独で、又は免疫療法、例えば、１つ以上のバイオマーカー、かかるバイオマーカーの結合パートナー／基質、又は免疫療法と組み合わせて有効に結合する能力を依然として保持しつつ（例えば、保存的配列修飾）、正確なＣＤＲ配列からのいくらかの逸脱が可能であり得ることを理解するであろう。したがって、別の実施形態では、操作された抗体は、例えば、本明細書に記載される、又はさもなければ一般に公開されている本発明の１つ以上のＣＤＲと５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一である、１つ以上のＣＤＲで構成され得る。
例えば、非ヒト抗体又はヒト抗体（例えば、ラット抗マウス／抗ヒト抗体）の構造的特徴を使用して、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性、例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、かかる１つ以上のバイオマーカーの結合パートナー／基質、及び／又は免疫チェックポイントへの結合を保持する構造的に関連するヒト抗体、特にイントラボディを生成することができる。別の機能的特性には、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおける本来の既知の非ヒト又はヒト抗体の結合の阻害が含まれる。
本発明によって包含される抗体、免疫グロブリン、及びポリペプチドは、単離された（例えば、精製された）形態で使用され得るか、又は膜若しくは脂質小胞（例えば、リポソーム）などのベクター中に含まれ得る。更に、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。ヒト化抗体が非ヒト動物に由来する抗体のＶＨ及びＶＬ内のＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに単にグラフトすることによって産生された場合、抗原結合活性は、非ヒト動物に由来する元の抗体と比較して減少することが知られている。ＣＤＲ内のみならずＦＲ内の非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのいくつかのアミノ酸残基が抗原結合活性に直接又は間接的に関連するとみなされる。したがって、これらのアミノ酸残基の、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基での置換により、結合活性が減少し、アミノ酸を、非ヒト動物に由来する元の抗体のアミノ酸残基で置き換えることによって補正され得る。
同様に、修飾及び変化が本明細書に記載の抗体の構造及びそれらをコードするＤＮＡ配列においてなされ得、望ましい特徴を有する抗体及びポリペプチドをコードする機能的分子を依然として得ることができる。例えば、抗体グリコシル化パターンを調節して、例えば、安定性を増加させることができる。「改変させる」とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、及び／又は抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合であり得る。「Ｎ結合」とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位について）上に記載されるトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。共有結合的修飾の別のタイプは、グリコシドを抗体に化学的又は酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、Ｎ結合又はＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に応じて、糖が、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、若しくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合していてもよい。例えば、かかる方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
同様に、抗体上に存在するいずれの炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理により、抗体をインタクトに保った状態で、結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除く大半又は全ての糖の切断がもたらされる。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）によって、またＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）によって記載される。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）によって記載される様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
他の修飾は、イムノコンジュゲートの形成を含み得る。例えば、１つのタイプの共有結合的修飾では、抗体又はタンパク質が、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、又は同第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン等の様々な非タンパク質性ポリマーのうちの１つに共有結合的に連結される。
本発明の抗体又は他のタンパク質の異種薬剤とのコンジュゲーションは、Ｎ－スクシンイミジル（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６ジイソシアネートなど）、及びビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）を含むが、これらに限定されない、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して行われ得る。例えば、炭素標識１－イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示のキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。
別の態様では、本発明は、細胞毒素、薬物、及び／又は放射性同位体などの治療的部分にコンジュゲートされた抗体を特色とする。細胞毒素にコンジュゲートされると、これらの抗体コンジュゲートは、「免疫毒素」と称される。細胞毒素又は細胞毒性薬剤には、細胞に有害な（例えば、細胞を死滅させる）任意の薬剤が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。治療薬には、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、放射性同位体、例えば、放射性ヨウ素にコンジュゲートされて、がん等の関連障害を治療するための細胞毒性放射性医薬品を生成することができる。
治療的有用性に加えて、コンジュゲートされた抗体は、臨床検査手順の一部として組織におけるポリペプチドレベルを監視して、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定するために、診断的又は予後的に有用であり得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合（すなわち、物理的に連結）することによって促進することができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例には、フラッグタグ、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが挙げられる。本明細書で使用される場合、抗体に関して「標識される」という用語は、検出可能な物質、例えば、放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体の直接標識、並びに検出可能な物質との反応による抗体の間接的標識を包含するよう意図されている。
本発明の抗体コンジュゲートを使用して、所与の生物学的応答を修飾することができる。治療的部分が古典的な化学的治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。かかるタンパク質には、例えば、酵素的に活性な毒素、又はその活性断片（例えば、アブリン、リシンＡ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、又はジフテリア毒素）、タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子又はインターフェロン－γ）、又は生物学的応答調整因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、又は他のサイトカイン若しくは成長因子）が含まれ得る。
一実施形態では、本発明で使用するための抗体は、二重特異性又は多重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一の抗体ポリペプチド内に２つの異なる抗原に対する結合部位を有する。抗原結合は、同時又は順次であり得る。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマ又はトリオーマによって産生された二重特異性抗体の例は、米国特許第４，４７４，８９３号に開示されている。二重特異性抗体は、化学的手段（Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：６２８、及びＰｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：３５４）並びにハイブリドーマ技術（Ｓｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：１４５３、及びＳｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ７：２４１）によって構築されている。二重特異性抗体は、米国特許第５，９５９，０８４号にも記載されている。二重特異性抗体の断片は、米国特許第５，７９８，２２９号に記載されている。
二重特異性薬剤は、異なる抗体を作製するハイブリドーマ又は他の細胞を融合させることによりヘテロハイブリドーマを作製し、その後、これらの両方の抗体を産生して共集合させるクローンを特定することによっても生成され得る。それらは、完全免疫グロブリン鎖又はＦａｂ及びＦｖ配列等のその一部の化学的又は遺伝的コンジュゲーションによっても生成され得る。抗体成分は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片を含む、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカーのポリペプチド又はその断片に結合することができる。一実施形態では、二重特異性抗体は、ポリペプチド又はその断片及びその天然結合パートナー又はその断片の両方に特異的に結合し得る。例えば、ヒト化、コンジュゲーション、組換え技法等の抗体を調節するための技法は、当該技術分野で周知である。
本発明の別の態様では、ペプチド又はペプチド模倣物を使用して、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーを含む、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカー、又はその断片の発現を調節し（例えば、発現を増加させるか、若しくは発現を減少させる）、かつ／又は活性を調節する（アゴナイズするか、若しくはアンタゴナイズする）ことができる。一実施形態では、それぞれの全長タンパク質の調節剤として機能する表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーのバリアントは、変異体、例えば、切断変異体のコンビナトリアルライブラリをアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定され得る。一実施形態では、バリアントの多様化ライブラリが核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、多様化遺伝子ライブラリによってコードされる。バリアントの多様化ライブラリは、潜在的なポリペプチド配列の縮重セットがポリペプチド配列のセットを内部に含む個々のポリペプチドとして発現可能であるように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列からポリペプチドバリアントのライブラリを産生するために使用され得る様々な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成が自動ＤＮＡ合成機で行われ、その後、合成遺伝子が適切な発現ベクターにライゲートされ得る。遺伝子の縮重セットの使用により、１つの混合物における、潜在的なポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列の全ての提供が可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
加えて、ポリペプチドコーディング配列の断片のライブラリを使用して、所与のポリペプチドのバリアントのスクリーニング及びその後の選択のためのポリペプチド断片の多様化集団を生成することができる。一実施形態では、コーディング配列断片のライブラリは、ニッキングが１ポリペプチド当たり約１回のみ生じる条件下でポリペプチドコーディング配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、結果として生じた断片ライブラリを発現ベクターにライゲートすることによって生成され得る。この方法により、ポリペプチドの様々なサイズのＮ末端、Ｃ末端、及び内部断片をコードする発現ライブラリが得られ得る。
点変異又は切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、かつ選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該技術分野で既知である。かかる技法は、ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適応可能である。大きい遺伝子ライブラリをスクリーニングするためのハイスループット分析に従う最も広く使用されている技法は、典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングすることと、適切な細胞をベクターの結果として生じたライブラリで形質転換することと、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることとを含む。ライブラリにおける機能的変異体の頻度を高める技法である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）が、目的とするバリアントを同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７８１１－７８１５、Ｄｅｌａｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６（３）：３２７－３３１）。一実施形態では、細胞ベースのアッセイが、多様化ポリペプチドライブラリを分析するために利用され得る。例えば、発現ベクターのライブラリは、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーを含む、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカー、又はその断片を通常で合成する細胞株にトランスフェクトされてもよい。その後、トランスフェクト細胞は、全長ポリペプチド及び特定の変異体ポリペプチドが産生されるように培養され、細胞上清における全長ポリペプチド活性への変異体の発現の影響が、例えば、いくつかの機能的アッセイのうちのいずれかによって検出され得る。その後、プラスミドＤＮＡが、全長ポリペプチド活性の阻害、又はあるいは増強をスコア化する細胞から回収され、個々のクローンが更に特徴付けられ得る。
ポリペプチドアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ－アミノ酸での系統的置換（例えば、Ｌ－リジンの代わりにＤ－リジン）を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。加えて、目的とするポリペプチドアミノ酸配列又は実質的に同一の配列変形を含む制限ペプチドが、当該技術分野で既知の方法（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって生成され得る。本明細書に記載されるアミノ酸配列は、当業者がペプチド配列及びその配列バリアントに対応するポリペプチドを産生することを可能にするであろう。かかるポリペプチドは、多くの場合、より大きいポリペプチドの一部として、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって原核又は真核宿主細胞中に産生され得る。あるいは、かかるペプチドは、化学的方法によって合成され得る。組換え宿主で異種タンパク質を発現させるための方法、ポリペプチドの化学的合成、及びインビトロ翻訳は、当該技術分野で周知であり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９），２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．（１９６９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：５０１、Ｃｈａｉｋｅｎ Ｉ．Ｍ．（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２５５、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１８７、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４２、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７、及びＯｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．（１９８０）Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）に更に記載されている。
ペプチドは、典型的には、直接化学合成によって産生され得る。ペプチドは、非ペプチド部分がＮ末端及び／又はＣ末端への共有結合的結合によって結合している修飾ペプチドとして産生され得る。ある特定の好ましい実施形態では、カルボキシ末端若しくはアミノ末端のいずれか、又は両方が、化学的に修飾されている。末端アミノ基及び末端カルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれ、アセチル化及びアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）又はアルキル化（例えば、メチル化）などのアミノ末端修飾及びアミド化などのカルボキシ末端修飾、並びに環化を含む他の末端修飾が、本発明によって包含される種々の実施形態に組み込まれ得る。コア配列に対するある特定のアミノ末端修飾及び／若しくはカルボキシ末端修飾並びに／又はペプチド伸長により、増強された安定性、増加した効力及び／又は有効性、血清プロテアーゼに対する抵抗性、望ましい薬物動態学的特性等の有利な物理的、化学的、生化学的、及び薬理学的特性が提供され得る。本明細書に記載のペプチドは、例えば、患者における共刺激を改変することによって、疾患を治療するために治療的に使用され得る。
ペプチド模倣薬（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ ｐ．３９２、及びＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）は、通常、コンピュータ化された分子モデリングを用いて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に同様のペプチド模倣物を使用して、同等の治療又は予防効果をもたらすことができる。一般に、ペプチド模倣薬は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に同様であるが、当該技術分野で既知であり、かつ以下の参考文献：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”（一般概説）、Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ｐｐ．４６３－４６８（一般概説）、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７－１８５（－ＣＨ２ＮＨ－、ＣＨ２ＣＨ２－）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３－１２４９（－ＣＨ２－Ｓ）、Ｈａｎｎ，Ｍ．Ｍ．（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．３０７－３１４（－ＣＨ－ＣＨ－、シス及びトランス）、Ａｌｍｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２－１３９８（－ＣＯＣＨ２－）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（－ＣＯＣＨ２－）、Ｓｚｅｌｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ．ＥＰ ４５６６５（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－）、Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８３）２４：４４０１－４４０４（－Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２－）、及びＨｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．（１９８２）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９８２）３１：１８９－１９９（－ＣＨ２－Ｓ－）に更に記載される方法により、－ＣＨ２ＮＨ－、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シス及びトランス）、－ＣＯＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、及び－ＣＨ２ＳＯ－からなる群から選択される結合によって任意に置き換えられる１つ以上のペプチド結合を有する。特に好ましい非ペプチド結合は、－ＣＨ２ＮＨ－である。かかるペプチド模倣物は、例えば、より経済的な産生、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性等）、改変された特異性（例えば、生物学的活性の広域スペクトル）、低下した抗原性等を含む、ポリペプチド実施形態に優る重大な利点を有し得る。ペプチド模倣薬の標識は、通常、定量的構造活性データ及び／又は分子モデリングによって予測されるペプチド模倣薬上の非干渉位置への１つ以上の標識の直接又はスペーサー（例えば、アミド基）を介した共有結合的結合を伴う。かかる非干渉位置は、概して、ペプチド模倣薬が結合して治療効果をもたらすマクロポリペプチドとの直接接触を形成しない位置である。ペプチド模倣薬の誘導体化（例えば、標識）は、ペプチド模倣薬の所望の生物学的又は薬理学的活性に実質的に干渉してはならない。
例えば、本明細書に記載の又は表１～５に列挙されるバイオマーカーとそれらの天然結合パートナーとの間の相互作用を調節する（増強又は阻害のいずれか）ことができる小分子も本発明によって包含される。本発明の小分子は、空間的にアドレス可能な並列固相又は溶液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、及び親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリ法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのうちのいずれかを使用して得られ得る。（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリを合成するための方法の例は、当該技術分野で、例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９、Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３、Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１、及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３で見つけることができる。
化合物のライブラリは、溶液中に（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２－４２１）、又はビーズ上に（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－８４）、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５－５５６）、細菌上に（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ５，２２３，４０９）、胞子上に（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ‘４０９）、プラスミド上に（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１８６５－１８６９）、又はファージ上に（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－３９０）、（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４－４０６）、（Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８－６３８２）、（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１－３１０）（Ｌａｄｎｅｒ（上記参照））提示され得る。化合物は、細胞ベースのアッセイ又は非細胞ベースのアッセイでスクリーニングされ得る。化合物は、プール中で（例えば、各試験試料中の複数の化合物）又は個別の化合物としてスクリーニングされ得る。
キメラ又は融合タンパク質は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び／又は表１～５に列挙されるバイオマーカーを含む、本発明によって包含されるバイオマーカー、若しくはその断片への阻害剤などの本明細書に記載される免疫療法のための薬剤のために調製することができる。本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、それぞれのバイオマーカーと実質的に相同ではないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する別のポリペプチドに作動可能に連結された、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーを含む、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカー、又はその断片を含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーを含む、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカー、又はその断片の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、「作動可能に連結される」という用語は、融合から独立して発現されたときに呈される機能を保存する方法で、バイオマーカー配列及び非バイオマーカー配列が互いにインフレームで融合していることを指すよう意図されている。「別の」配列が、それぞれ、バイオマーカー配列のＮ末端又はＣ末端に融合し得る。
かかる融合タンパク質は、第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列及び第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列の組換え発現によって産生され得る。第２のペプチドは、任意に、第１のペプチドの溶解度、親和性、安定性、又は原子価を改変する部分、例えば、免疫グロブリン定常領域に対応し得る。別の好ましい実施形態では、第１のペプチドは、生物学的に活性な分子の一部（例えば、ポリペプチドの細胞外部分又はリガンド結合部分）からなる。第２のペプチドは、免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＣγ１ドメイン又はＣγ４ドメイン（例えば、ヒトＩｇＣγ１又はヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，１１６，９６４号、同第５，５８０，７５６号、同第５，８４４，０９５号等を参照のこと）を含み得る。かかる定常領域は、エフェクター機能（例えばＦｃ受容体結合）を媒介する領域を保持し得るか、又はエフェクター機能を低下させるように改変され得る。結果として生じた融合タンパク質は、独立して発現された第１のペプチドと比較して改変された溶解度、結合親和性、安定性、及び／又は原子価（すなわち、１ポリペプチド当たりの利用可能な結合部位の数）を有し得、タンパク質精製の効率を高め得る。組換え技法によって産生された融合タンパク質及びペプチドが分泌され、細胞とそのタンパク質又はペプチドを含有する培地との混合物から単離され得る。あるいは、タンパク質又はペプチドは、細胞質的に保持され、細胞が採取され、溶解し、タンパク質が単離され得る。細胞培養物は、典型的には、宿主細胞、培地、及び他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は、当該技術分野で周知である。タンパク質及びペプチドは、タンパク質及びペプチドを精製するための当該技術分野で公知の技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、又は両方から単離され得る。宿主細胞をトランスフェクトするための技法及びタンパク質及びペプチドを精製するための技法は、当該技術分野で既知である。
好ましくは、本発明によって包含される融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技法によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片が、従来の技法に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端化又はスタッガー末端化末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及び酵素的ライゲーションを用いて、一緒にインフレームでライゲートされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法によって合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間の相補的オーバーハングをもたらすアンカープライマーを使用して行われ得、その後、これがアニール及び再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
本発明によって包含される融合タンパク質を免疫原として使用して、対象において抗体を産生することができる。かかる抗体は、融合タンパク質が生成されたそれぞれの天然ポリペプチドを精製するために使用され得るか、又はスクリーニングアッセイにおいて１つ以上のバイオマーカーポリペプチド又はその断片とその天然結合パートナー又はその断片との間の相互作用を阻害するポリペプチドを特定するために使用され得る。
少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０個、又はもっと多くの小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体を含むか、又は発現することができる１つ以上の核酸を含み、細胞における上述の小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体が、細胞条件下で細胞核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、そのバリアント及び／又は機能的バリアント、細胞ｍＲＮＡ又はそれらの断片などの小さな非コードＲＮＡＳ）と特異的にハイブリダイズする（例えば、結合する）組成物も本明細書に提供される。一実施形態では、細胞における小核酸若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体の発現は、例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーを含む、例えば、本発明によって包含される１つ以上のバイオマーカー、又はその断片の転写、翻訳、及び／又は小核酸処理を阻害することによって、細胞核酸及び／又はタンパク質の発現又は生物学的活性を阻害することができる。一実施形態では、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体は、小ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）又は小ＲＮＡの相補体である。別の実施形態では、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、少なくとも６ヌクレオチド長であり、約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２４、２３、２２、２１，２０、１９、１８、１７、１６、１５、又は１０ヌクレオチド長未満である。別の実施形態では、組成物は、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体を含むか、又は発現することができる核酸のライブラリ、あるいは上述の小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体のプールを含み得る。核酸プールは、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの誘導体を含むか、又は発現することができる約２～５、５～１０、１０～２０、１０～３０、又はもっと多くの核酸を含み得る。一実施形態では、結合は、従来の塩基対相補性によるものであってもよく、又は例えば、ＤＮＡ二本鎖への結合の場合、二重らせんの主要な溝における特異的な相互作用を介するものであってもよい。一般に、「アンチセンス」は、当該技術分野で一般的に用いられる範囲の技術を指し、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存する任意のプロセスを含む。
ｍｉＲＮＡ活性を妨げることなくｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡの配列に修飾が行われ得ることが当該技術分野で周知である。本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡ配列の「機能的バリアント」という用語は、天然ｍｉＲＮＡ配列とは異なるが、ｍＲＮＡの１つ以上の機能的特徴（例えば、がん細胞増殖阻害、がん細胞アポトーシスの誘導、化学療法剤に対するがん細胞感受性の増強、特異的なｍｉＲＮＡ標的阻害）を保持するオリゴヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列の機能的バリアントは、ｍｉＲＮＡの機能的特徴の全てを保持する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列の機能的バリアントは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はもっと多くの核酸塩基の領域にわたって、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか、又は機能的バリアントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｍｉＲＮＡ又はその前駆体の相補体にハイブリダイズする、核酸塩基配列を有する。したがって、特定の実施形態では、機能的バリアントの核酸塩基配列は、ｍｉＲＮＡの１つ以上の標的配列にハイブリダイズすることができる。
本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ及びそれらの対応するステムループ配列は、ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ．でのワールドワイドウェブ上に見出される、ｍｉＲＮＡ配列及びアノテーションのオンライン検索可能なデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ中に見出されてもよい。ｍｉＲＢａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベース中のエントリは、ｍｉＲＮＡ転写物の予測ヘアピン部分（ステムループ）を表し、成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置及び配列に関する情報を有する。このデータベース中のｍｉＲＮＡステムループ配列は、厳密には前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）ではなく、いくつかの例では、推定一次転写物由来のプレｍｉＲＮＡ及びいくつかの隣接配列を含み得る。本明細書に記載のｍｉＲＮＡ核酸塩基配列は、ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースのリリース１０．０に記載される配列、及び任意のそれより前のリリースのｍｉＲＢａｓｅ配列データベースに記載される配列を含む、任意のバージョンのｍｉＲＮＡを包含する。配列データベースのリリースは、特定のｍｉＲＮＡの再命名が生じる場合がある。配列データベースのリリースは、成熟ｍｉＲＮＡ配列の多様性を生じる場合がある。
いくつかの実施形態では、本発明によって包含されるｍｉＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ配列と同じＲＮＡ分子上又は別個のＲＮＡ分子上に位置し得る第２のＲＮＡ配列と関連付けられ得る。このような場合、ｍｉＲＮＡ配列は、活性鎖と呼ばれてもよく、一方、ｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的である第２のＲＮＡ配列は、相補鎖と呼ばれてもよい。活性鎖及び相補鎖をハイブリダイゼーションして、天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体に類似する二本鎖ＲＮＡを作製する。ｍｉＲＮＡの活性は、活性鎖の取り込みを最大化し、遺伝子翻訳を制御するｍｉＲＮＡタンパク質複合体による相補鎖の取り込みを最小化することによって最適化され得る。これは、相補鎖の修飾及び／又は設計を通じて行うことができる。
いくつかの実施形態では、相補鎖は、その５’末端にリン酸又はヒドロキシル以外の化学基が存在するように修飾される。５’修飾の存在は、相補鎖の取り込みを明らかに除外し、その後、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取り込みに有利になる。５’修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、及びビオチンを含む、当該技術分野で知られている様々な分子のうちのいずれかであり得る。
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ経路による相補鎖の取り込みは、相補鎖の最初の２～６ヌクレオチドに糖修飾を有するヌクレオチドを組み込むことによって低減される。かかる糖修飾は、ｍｉＲＮＡ活性を更に増強するために、上述の５’末端修飾と組み合わせることができることに留意されたい。
いくつかの実施形態では、相補鎖は、相補鎖の３’末端のヌクレオチドが活性鎖に相補的ではないように設計される。これにより、活性鎖の３’末端において安定であるが、活性鎖の５’末端において比較的不安定な二本鎖ハイブリッドＲＮＡが生じる。この安定性の差は、ｍｉＲＮＡ経路による活性鎖の取り込みを増強する一方で、相補鎖の取り込みを減少させ、それによってｍｉＲＮＡ活性を増強する。
本明細書に提示される方法及び組成物の小核酸及び／又はアンチセンス構築物は、例えば、細胞内で転写されると、細胞核酸（例えば、小ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び／又はゲノムＤＮＡ）の少なくとも固有の部分に相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミドとして送達され得る。あるいは、小核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はそれらのバリアントをコードするＲＮＡを産生することができる。例えば、ｍｉＲＮＡを発現するのに好適なプラスミドの選択、核酸配列をプラスミドに挿入する方法、及び目的の細胞に組換えプラスミドを送達する方法は、当該技術分野の技術範囲内である。例えば、開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ９：１３２７－１３３３、Ｔｕｓｃｈｌ（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６－４４８、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０－５５３、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７－５００、Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９４８－９５８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００－５０５、及びＰａｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５－５０８を参照のこと。
あるいは、小核酸及び／又はアンチセンス構築物は、エクスビボで生成され、細胞に導入されると、細胞核酸とのハイブリダイゼーションを生じる、オリゴヌクレオチドプローブである。かかるオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに耐性があり、したがってインビボで安定である、修飾オリゴヌクレオチドである。小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための例示的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホラミデート、ホスホチオエート及びメチルホスホネート類似体である（米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，２６４，５６４号、及び同第５，２５６，７７５号も参照されたい）。更に、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築する一般的なアプローチは、例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８－９７６、及びＳｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９－２６６８によって概説されている。
アンチセンスアプローチは、細胞核酸に相補的である（例えば、表１～５に列挙されるバイオマーカーに相補的である）オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）の設計を伴っていてもよい。絶対的な相補性は必要とされない。したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、又は三本鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、核酸（例えば、ＲＮＡ）との塩基ミスマッチが多くなり、安定な二本鎖（又は場合によっては、三本鎖）を含有し、依然として形成し得る。当業者であれば、ハイブリダイゼーション複合体の融点を決定するための標準手順を使用することによって、許容可能な程度のミスマッチを確認することができる。
ｍＲＮＡの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド、例えば、ＡＵＧ開始コドンまで、及びそれを含む５’非翻訳配列は、翻訳の阻害において最も効率的に作用するべきである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、近年、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのにも有効であることが示されている（Ｗａｇｎｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３）。したがって、遺伝子の５’又は３’非翻訳非コーディング領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドが、アンチセンスアプローチで使用され、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドとしては、ＡＵＧ開始コドンの相補体が挙げられ得る。ｍＲＮＡコーディング領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳の効率的な阻害剤ではないが、本明細書に提示される方法及び組成物に従って使用することもできる。細胞ｍＲＮＡの５’、３’又はコーディング領域にハイブリダイズするように設計されているかどうかにかかわらず、小核酸及び／又はアンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、又は１０ヌクレオチド長未満であり得る。
標的配列の選択にかかわらず、遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量化するために、インビトロ研究が最初に行われることが好ましい。一実施形態では、これらの研究は、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果とを区別する対照を利用する。別の実施形態では、これらの研究は、標的核酸又はタンパク質のレベルを、内部対照核酸又はタンパク質のレベルと比較する。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られた結果を、対照オリゴヌクレオチドを使用して得られた結果と比較することが想定される。対照オリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを防止するために必要なものを越えないようにアンチセンス配列と異なることが好ましい。
小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、若しくはキメラ混合物若しくは誘導体、又はその修飾態様、一本鎖又は二本鎖であり得る。小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善するために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾されていてもよく、他の付加基、例えば、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体を標的とするための）、又は細胞膜を横切る輸送を促進する薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３－６５５６、Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６４８－６５２、ＰＣＴ公開第８８／０９８１０号を参照のこと）、又は血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開第８９／１０１３４号を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘発切断剤。（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈ．６：９５８－９７６を参照のこと）又は挿入剤。（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９－５４９）を含み得る。この目的のために、小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などにコンジュゲートされ得る。
小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシチエチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルルラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルイノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでいてもよい。小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２－フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、化合物は、得られるオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強する１つ以上の部分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドをコードするｍｉＲＮＡ）を含む。特定のそのような実施形態では、その部分は、コレステロール部分（例えばアンタゴミル）又は脂質部分又はリポソームコンジュゲートである。コンジュゲーションのための更なる部分としては、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。特定の実施形態では、共役基は、オリゴヌクレオチドに直接結合する。特定の実施形態では、共役基は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重又は三重結合）、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、６－アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸ又はＡＨＡ）、置換Ｃ１－Ｃ１０アルキル、置換又は非置換Ｃ２－Ｃ１０アルケニル、及び置換又は非置換Ｃ２－Ｃ１０アルキニルから選択される連結部分によってオリゴヌクレオチドに結合する。特定のそのような実施形態では、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択される。特定のそのような実施形態では、化合物は、オリゴヌクレオチドの一方又は両方の末端に接続して、例えばヌクレアーゼ安定性などの特性を増強する１つ以上の安定化基を有するオリゴヌクレオチドを含む。安定化基には、キャップ構造が含まれる。これらの末端修飾は、オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達及び／又は局在化を補助することができる。キャップは、５’末端（５’キャップ）、又は３’末端（３’キャップ）に存在し得るか、又は両方の末端に存在し得る。キャップ構造には、例えば、逆デオキシ脱塩基性キャップが含まれる。
好適なキャップ構造としては、４’，５’－メチレンヌクレオチド、１－（β－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、アルファ－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、トレオペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’－セコヌクレオチド、非環状３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－反転ヌクレオチド部分、３’－３’－反転脱塩基部分、３’－２’－反転ヌクレオチド部分、３’－２’－反転脱塩基部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホラミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’－ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、架橋メチルホスホネート部分、及び非架橋メチルホスホネート部分、５’－アミノ－アルキルホスフェート、１，３－ジアミノ－２－プロピルホスフェート、３－アミノプロピルホスフェート、６－アミノヘキシルホスフェート、１，２－アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、５’－５’－反転ヌクレオチド部分、５’－５’－反転脱塩基部分、５’－ホスホラミデート、５’－ホスホロチオエート、５’－アミノ、架橋及び／又は非架橋５’－ホスホラミデート、ホスホロチオエート、及び５’－メルカプト部分が挙げられる。
小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、中性ペプチド様骨格も含有し得る。かかる分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）－オリゴマーと称され、例えば、Ｐｅｒｒｙ－Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０及びＥｇｌｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６に記載される。ＰＮＡオリゴマーの１つの利点は、ＤＮＡの中性骨格に起因する培地のイオン強度から本質的に独立して相補的ＤＮＡに結合するそれらの能力である。更に別の実施形態では、小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール又はそれらの類似体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。更なる実施形態では、小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α－アノマーオリゴヌクレオチドである。α－アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のｂ単位とは対照的に鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５－６６４１）。オリゴヌクレオチドは、２’－０－メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１－６１４８）、又はキメラＲＮＡ－ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７－３３０）である。
本明細書に提示される方法及び組成物の小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用によって合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９の方法によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、孔径が制御されたガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８－７４５１）などの使用によって調製することができる。例えば、単離されたｍｉＲＮＡは、当該技術分野で既知の方法を使用して化学合成又は組換え産生され得る。いくつかの例では、ｍｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して、化学合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の商業的供給業者としては、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｃｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）、及びＥｘｉｑｏｎ（Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）が挙げられる。
小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで細胞に送達され得る。小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に送達するためのいくつかの方法が開発されており、例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注入することができ、又は所望の細胞を標的にするように設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に接続するアンチセンス）を系統的に投与することができる。
一実施形態では、小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内で発現されると、細胞核酸（例えば、ｍＲＮＡ）配列に完全に相補的な配列が分解を媒介するか、又は細胞核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に不完全に相補的な配列が翻訳抑制を媒介する、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はｐｉｗｉＲＮＡを含み得るか、又はそれから生成され得る。別の実施形態では、二本鎖ｓｉＲＮＡは、一本鎖細胞ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）に結合し、それらの発現を阻害する一本鎖アンチセンスＲＮＡに処理され得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、サイレンシングされた遺伝子に対して配列が相同の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される、動物及び植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。インビボでは、長いｄｓＲＮＡが、リボヌクレアーゼＩＩＩによって切断され、２１及び２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを生成する。２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖が、ヒト胚腎臓（２９３）及びＨｅＬａ細胞を含む異なる哺乳動物細胞株において、内因性及び異種遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－４９８）。したがって、細胞内の遺伝子の翻訳は、細胞を、約１５～３０ヌクレオチド又は約１８～２１ヌクレオチド又は約１９～２１ヌクレオチドの長さを有する短い二本鎖ＲＮＡと接触させることによって阻害することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡに代謝されるかかるｓｉＲＮＡ又は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを標的細胞に導入することができる（例えば、ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＲＮＡ ８：８４２、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１００６、及びＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０を参照のこと）。使用することができるベクターは、例えば、ｐＳｕｐｅｒ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）という名称でＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅから市販されている。
細胞ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は、細胞ｍＲＮＡの翻訳及び細胞ポリペプチドの発現、又はその両方を防止するためにも使用され得る（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開第９０／１１３６４号、Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２－１２２５及び米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して細胞ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域により指示された位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要性は、２つの塩基の配列：５’－ＵＧ－３’を標的ｍＲＮＡが有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び産生は、当該技術分野で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５－５９１に更に完全に記載されている。リボザイムは、切断認識部位が細胞ｍＲＮＡの５’末端近くに位置するように、すなわち、効率を高め、非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限に抑えるように操作され得る。
本明細書に提示される方法のリボザイムにはまた、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）、例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａにおいて天然に存在し（ＩＶＳ、又はＬ－１９ ＩＶＳ ＲＮＡとしても知られる）、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈ及び共同研究者（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：５７４－５７８、Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：４７０－４７５、Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：４２９－４３３、ＷＯ８８／０４３００、Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ ４７：２０７－２１６）によって広範に記載されているものも含まれる。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後、標的ＲＮＡの切断が行われる８塩基対活性部位を有する。本明細書に提示される方法及び組成物は、細胞遺伝子中に存在する８塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
アンチセンスアプローチと同様に、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドから構成され得る（例えば、改善された安定性、標的化などのために）。好ましい送達方法は、形質転換細胞が内因性細胞メッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力な構成的ｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを伴う。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり、触媒的であるため、効率のために必要なのは、より低い細胞内濃度である。
細胞遺伝子の転写の阻害のために三重らせん形成に使用される核酸分子は、好ましくは一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合規則によって三重らせん形成を促進すべきであり、これは一般に、プリン又はピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長部が二本鎖の１つの鎖上に存在することを必要とする。ヌクレオチド配列は、ピリミジン系であってもよく、これは得られた三重らせんの３つの会合する鎖にわたるＴＡＴ及びＣＧＣ三重鎖を生じる。ピリミジンを豊富に含む分子は、その鎖と平行な配向で二本鎖のうちの一本鎖のプリンを豊富に含む領域に対する塩基相補性を提供する。加えて、核酸分子は、例えば、Ｇ残基の伸長部を含有する、プリンを豊富に含むものを選択することができる。これらの分子は、プリン残基の大部分が標的二本鎖のうちの一本鎖上に位置する、ＧＣ対が豊富なＤＮＡ二本鎖を有する三重らせんを形成し、三本鎖中の３つの鎖にわたってＣＧＣ三本鎖を生じる。
あるいは、三重らせん形成のために標的化され得る潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加し得る。スイッチバック分子は、交互に５’－３’、３’－５’様式で合成され、その結果、それらが二本鎖の第１の鎖と塩基対になり、次いで他方と対になり、プリン又はピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長部が二本鎖の１つの鎖上に存在する必要性を除外する。本明細書に提示される方法及び組成物の小核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はそれらのバリアント）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及び三重らせん分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の合成のための当該技術分野で知られている任意の方法によって調製され得る。これらには、例えば固相ホスホラミダイト化学合成などの当該技術分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための技法が含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によって生成され得る。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様なベクターに組み込まれ得る。あるいは、使用されるプロモーターに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的又は誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株に安定的に導入することができる。
更に、核酸分子への様々な周知の修飾が、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入され得る。考えられる修飾としては、限定されないが、分子の５’末端及び／又は３’末端に対するリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、又はオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合以外のホスホロチオエート若しくは２’Ｏ－メチルの使用が挙げられる。当業者は、ポリペプチド、小核酸、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドが、例えば、タンパク質検出手段として機能する別のペプチド又はポリペプチド（例えば、異種ペプチド）に更に連結され得ることを容易に理解するであろう。本発明における検出に有用な標識ペプチド又はポリペプチド部分の非限定的な例としては、限定されないが、好適な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼ；エピトープタグ、例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＨＡ、又はＨＩＳタグ；フルオロフォア、例えば、緑色蛍光タンパク質；染料；放射性同位体；ジゴキシゲニン；ビオチン；抗体；ポリマー、並びに当該技術分野で既知の他のもの、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ Ｃｏｒｐ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ １９９９）におけるものが挙げられる。
本明細書に記載の調節剤（例えば、抗体、小分子、ペプチド、融合タンパク質、又は小核酸）が薬学的組成物に組み込まれ、インビボで対象に投与され得る。本組成物は、単一のかかる分子若しくは薬剤又は本明細書に記載の薬剤の任意の組み合わせを含み得る。本明細書に記載の「単一の活性薬剤」は、本明細書に提供される方法及び組成物による当該技術分野で既知の他の薬理学的に活性な化合物（「第２の活性薬剤」）と組み合わせられ得る。
本明細書に記載のバイオマーカー核酸及び／又はバイオマーカーポリペプチド分子の産生及び使用は、標準の組換え技法を使用することによって容易になり得る。いくつかの実施形態では、かかる技法は、バイオマーカーポリペプチド又はかかるポリペプチドの一部をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターを使用する。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクター、すなわち、発現ベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミド（ベクター）の形態にある。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態を含むよう意図されている。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、目的とするヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系での、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞での）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されることを意味するよう意図されている。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現対照要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むよう意図されている。かかる制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９１）に記載されている。制御配列には、多くの種類の宿主細胞でのヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの及びある特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子に依存し得ることを理解するであろう。本発明の発現ベクターが宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチドを産生することができる。
本発明における使用のための組換え発現ベクターは、原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）又は真核細胞（例えば、昆虫細胞｛バキュロウイルス発現ベクターを使用｝、酵母細胞、又は哺乳類細胞）での本発明のマーカーに対応するポリペプチドの発現のために設計され得る。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（上記参照）に詳述されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳され得る。
原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉで行われる。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。１）組換えタンパク質の発現を増加させる、２）組換えタンパク質の溶解度を増加させる、及び３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けるという３つの目的を果たす。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解的切断部位が融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されて、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。かかる酵素、及びそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、それぞれ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａを標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれる。
好適な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｐ．６０－８９，Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９１）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的バイオマーカー核酸発現は、ハイブリッドｔｒｐ－ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的バイオマーカー核酸発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介されたＴ７ ｇｎ１０－ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下でＴ７ ｇｎ１遺伝子を保有する常在性プロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
Ｅ．ｃｏｌｉでの組換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌でタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ｐ．１１９－１２８，Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉで優先的に利用されるものになるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１－２１１８）。本発明の核酸配列のかかる改変は、標準のＤＮＡ合成技法によって行われ得る。
別の実施形態では、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
あるいは、発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。昆虫培養細胞（例えば、Ｓｆ ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が含まれる。
更に別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス制御要素によって提供される。例えば、一般に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記参照）の第１６章及び第１７章を参照されたい。別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御要素を使用して核酸を発現させる）。組織特異的制御要素は、当該技術分野で既知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、具体的にはＴ細胞受容体プロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリンプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３，Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、並びに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に制御されたプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びα－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｒ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も包含される。
本発明は、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングされたＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを更に提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にする様式で制御配列に作動可能に連結される。様々な細胞型でのアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指示する、アンチセンス配向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された制御配列、例えば、ウイルスプロモーター及び／又はエンハンサーが選択され得るか、又はアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的、若しくは細胞型特異的発現を指示する制御配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、又は弱毒化ウイルスの形態にあり得、そこで、アンチセンス核酸が高効率制御領域の制御下で産生され、その活性が、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の制御の考察については、（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）を参照されたい）。
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同義に使用される。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解される。変異又は環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。
宿主細胞は、任意の原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞又は真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母、若しくは哺乳類細胞）であり得る。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技法によって原核又は真核細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、又は電気穿孔を含む、外来核酸を宿主細胞に導入するための様々な当該技術分野で認識されている技法を指すよう意図されている。宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションに好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（（上記参照））及び他の研究室マニュアルで見つけることができる。
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、わずかな細胞のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込むことができることが既知である。これらの組み込み体を特定及び選択するために、一般に、（例えば、抗生物質に対する抵抗性のための）選択可能なマーカーをコードする遺伝子が目的とする遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキサート等の薬物に対する抵抗性を付与するものが含まれる。導入された核酸で安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生存する一方で、他の細胞は死ぬ）。
Ｖ．バイオマーカー核酸及びポリペプチドの分析
バイオマーカー核酸及び／又はバイオマーカーポリペプチドを、本明細書に記載の方法及び当業者に既知の技法に従って分析して、１）バイオマーカー転写物又はポリペプチドのレベルの改変、２）バイオマーカー遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は付加、４）バイオマーカー遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、５）発現制御領域等のバイオマーカー遺伝子の異常な修飾を含むが、これらに限定されない、本発明に有用な遺伝子改変又は発現改変を特定することができる。
ａ．コピー数の検出のための方法
バイオマーカー核酸のコピー数を評価する方法は、当業者に周知である。染色体獲得又は喪失の存在又は不在は、単に本明細書で特定された領域又はマーカーのコピー数を決定することによって評価される。
一実施形態では、生体試料は、ゲノムマーカーを含むゲノム遺伝子座のコピー数変化の存在について試験される。少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０のコピー数が、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用療法のより不良な転帰を予測する。
バイオマーカー遺伝子座のコピー数を評価する方法には、ハイブリダイゼーションベースのアッセイが含まれるが、これに限定されない。ハイブリダイゼーションベースのアッセイには、伝統的な「直接プローブ」法、例えば、サザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ及びＦＩＳＨプラスＳＫＹ）法、及び「比較プローブ」法、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡベース又はオリゴヌクレオチドベースのＣＧＨが含まれるが、これらに限定されない。これらの方法は、基質（例えば、膜若しくはガラス）結合方法又はアレイベースのアプローチを含むが、これらに限定されない多種多様の形式で使用され得る。
一実施形態では、試料中のバイオマーカー遺伝子のコピー数の評価は、サザンブロットを伴う。サザンブロットでは、ゲノムＤＮＡ（典型的には、電気泳動ゲル上で断片及び分離されたもの）が標的領域に特異的なプローブにハイブリダイズされる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと、正常ゲノムＤＮＡ（例えば、同じ又は関連細胞、組織、臓器等の非増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの強度の比較により、標的核酸の相対コピー数の推定値が提供される。あるいは、試料中のコード核酸のコピー数を評価するためにノーザンブロットが利用され得る。ノーザンブロットでは、ｍＲＮＡが標的領域に特異的なプローブにハイブリダイズされる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと、正常ＲＮＡ（例えば、同じ又は関連細胞、組織、臓器等の非増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの強度の比較により、標的核酸の相対コピー数の推定値が提供される。あるいは、適切な対照（例えば、同じ又は関連細胞組織、臓器等の非増幅部分）と比較してより高い又はより低い発現により、標的核酸の相対コピー数の推定値が提供されるように、ＲＮＡを検出するための当該技術分野で周知の他の方法が使用され得る。ゲノムコピー数を決定するための代替手段は、インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：６４９）である。一般に、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下のステップ：（１）分析される組織又は生物学的構造の固定、（２）標的ＤＮＡのアクセス可能性を高め、かつ非特異的結合を減少させるための生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理、（３）生物学的構造又は組織における核酸混合物の核酸へのハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸断片を除去するためのポストハイブリダイゼーション洗浄、及び（５）ハイブリダイズされた核酸断片の検出を含む。これらのステップの各々で使用される試薬及び使用条件は、特定の用途に応じて異なる。典型的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞が、固体支持体、典型的には、スライドガラスに固定される。核酸がプローブされる場合、細胞は、典型的には、熱又はアルカリで変性される。その後、これらの細胞は適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触して、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能にする。その後、標的（例えば、細胞）は、典型的には、適切なシグナル対ノイズ比が得られるまで所定のストリンジェンシーで又は増加するストリンジェンシーで洗浄される。プローブは、典型的には、例えば、放射性同位体又は蛍光レポーターで標識される。一実施形態では、プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分に長い。プローブは、一般に、約２００塩基長～約１０００塩基長の範囲である。いくつかの用途では、反復配列のハイブリダイゼーション能力を阻止することが必要である。したがって、いくつかの実施形態では、非特異的ハイブリダイゼーションを阻止するために、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、又はＣｏｔ－Ｉ ＤＮＡが使用される。
ゲノムコピー数を決定するための代替手段は、比較ゲノムハイブリダイゼーションである。一般に、ゲノムＤＮＡは、正常参照細胞及び試験細胞（例えば、腫瘍細胞）から単離され、必要に応じて増幅される。これらの２つの核酸は、差次的に標識され、その後、参照細胞の分裂中期の染色体にインサイチュでハイブリダイズされる。参照ＤＮＡ及び試験ＤＮＡの両方の反復配列は、ある手段によって、例えば、適切な遮断核酸とのプレハイブリダイゼーションによって、かつ／又は当該ハイブリダイゼーション中に当該反復配列に対するかかる遮断核酸配列を含むことによって除去されるか、又はそれらのハイブリダイゼーション能力が低下するかのいずれかである。その後、結合した標識ＤＮＡ配列は、必要に応じて、視覚可能な形態にされる。コピー数が増加又は減少した試験細胞における染色体領域は、２つのＤＮＡからのシグナル比が変化する領域を検出することによって特定され得る。例えば、試験細胞におけるコピー数が減少した領域は、ゲノムの他の領域と比較して参照よりも試験ＤＮＡから比較的より低いシグナルを示すであろう。
試験細胞におけるコピー数が増加した領域は、試験ＤＮＡから比較的より高いシグナルを示すであろう。染色体の欠失又は増倍が存在する場合、２つの標識からのシグナルの比率の差が検出され、この比率により、コピー数の尺度が提供される。ＣＧＨの別の実施形態であるアレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、固定化された染色体要素がアレイ上の一群の固体支持体に結合した標的核酸で置き換えられ、ゲノムの大部分又は全てが一群の固体支持体に結合した標的に表されることを可能にする。標的核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（例えば、単一ヌクレオチド多型を検出するため）等を含み得る。アレイベースのＣＧＨは、（対照及び可能な腫瘍試料を２つの異なる色素で標識し、ハイブリダイゼーション前にそれらを混合し、それにより、アレイ上のプローブの競合的ハイブリダイゼーションに起因する比率がもたらされることとは対照的に）単色標識で行われる場合もある。単色ＣＧＨでは、対照が標識され、１つのアレイにハイブリダイズされ、絶対シグナルが読み取られ、可能な腫瘍試料が標識され、第２のアレイ（同一の含有量）にハイブリダイズされ、絶対シグナルが読み取られる。コピー数の差が２つのアレイからの絶対シグナルに基づいて計算される。固定化された染色体又はアレイを調製する方法及び比較ゲノムハイブリダイゼーションを行う方法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，３３５，１６７号、同第６，１９７，５０１号、同第５，８３０，６４５号、及び同第５，６６５，５４９号、並びにＡｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１２２７－１２３４、Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：９１３８－９１４２、ＥＰＯ公開第４３０，４０２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３：Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（１９９４）等を参照のこと）。別の実施形態では、Ｐｉｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：２０７－２１１、又はＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５３２１－５３２５（１９９２）のハイブリダイゼーションプロトコルが使用される。
なお別の実施形態では、増幅ベースのアッセイを使用して、コピー数を測定することができる。かかる増幅ベースのアッセイでは、核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において鋳型としての機能を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量に比例するであろう。適切な対照、例えば、健常組織との比較により、コピー数の尺度が提供される。
「定量的」増幅法は、当業者に周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同じプライマーを使用して既知の量の対照配列を同時に共増幅することを含む。これにより、ＰＣＲ反応を較正するために使用され得る内部標準が提供される。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に提供されている。定量的ＰＣＲ分析を使用したマイクロサテライト遺伝子座でのＤＮＡコピー数の測定は、Ｇｉｎｚｏｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：５４０５－５４０９に記載されている。遺伝子の既知の核酸配列は、当業者が遺伝子の任意の部分を増幅するためにプライマーを通例的に選択することを可能にするのに十分である。蛍光発生的定量的ＰＣＲも本発明の方法で使用され得る。蛍光発生的定量的ＰＣＲでは、定量は、蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎ及びＳＹＢＲグリーンの量に基づいている。
他の好適な増幅法には、限定されないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、及びＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７を参照のこと）、転写増幅（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３）、自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４）、ドットＰＣＲ、及びリンカーアダプターＰＣＲ等が含まれる。
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）及び主要コピー比率（ＭＣＰ）マッピング（Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４（１）：６４－７１、Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４，２７６１－４、Ｈａｈｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５，４６７０－５、Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １７，８８－９３、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００８）ＭＢＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．９，２０４－２１９）も、増幅又は欠失の領域を特定するために使用され得る。
ｂ．バイオマーカー核酸発現を検出するための方法
バイオマーカー発現は、転写分子又はタンパク質の発現を検出するための多種多様の周知の方法のうちのいずれかによって評価され得る。かかる方法の非限定的な例には、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、又は核タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能又は活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、及び核酸増幅法が挙げられる。
好ましい実施形態では、特定の遺伝子の活性は、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の尺度、翻訳されたタンパク質の量の尺度、又は遺伝子産物活性の尺度によって特徴付けられる。マーカー発現は、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、又はタンパク質活性（これらはいずれも標準の技法を使用して測定され得る）を検出することを含む様々な方法で監視され得る。検出は、遺伝子発現（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、又は酵素活性）レベルの定量化を含むか、又はあるいは、具体的には対照レベルと比較した遺伝子発現レベルの質的評価であり得る。検出されるレベルのタイプは、文脈から明らかであろう。
別の実施形態では、バイオマーカー及びその機能的に同様の相同体（その断片又は遺伝子改変を含む）の（例えば、その制御領域又はプロモーター領域における）発現レベルの検出又は決定は、目的とするマーカーのＲＮＡレベルを検出又は決定することを含む。一実施形態では、１つ以上の細胞が試験される対象から得られ、その細胞からＲＮＡが単離される。好ましい実施形態では、乳房組織細胞の試料が対象から得られる。
一実施形態では、ＲＮＡは、単一細胞から得られる。例えば、細胞は、レーザーキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって組織試料から単離され得る。この技法を使用して、細胞が、染色された組織切片を含む組織切片から単離され、それにより、所望の細胞が単離されることを確実にすることができる（例えば、Ｂｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４８１、Ｅｍｍｅｒｔ－Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９８、Ｆｅｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５４：６１、及びＭｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５８：１３４６を参照のこと）。例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（上記参照）は、事前に免疫染色された組織切片からの細胞の単離について説明している。
対象から細胞を得て、その細胞をインビトロで培養すること、例えば、ＲＮＡが抽出され得るより大きい細胞集団を得ることも可能である。非形質転換細胞の培養物、すなわち、初代細胞培養物を確立するための方法が当該技術分野で既知である。
個体由来の組織試料又は細胞からＲＮＡを単離する際に、組織又は細胞が対象から採取された後に遺伝子発現のいかなる更なる変化も阻止することが重要であり得る。発現レベルの変化は、撹乱後に、例えば、熱ショック又はリポ多糖（ＬＰＳ）若しくは他の試薬での活性化後に急速に変化することが知られている。加えて、組織及び細胞中のＲＮＡは、急速に分解し得る。したがって、好ましい実施形態では、対象から得られた組織又は細胞は、可能な限り迅速に瞬間凍結される。
ＲＮＡは、様々な方法、例えば、チオシアン酸グアニジウム溶解に続くＣｓＣｌ遠心分離によって組織試料から抽出され得る。（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４－５２９９）。単一細胞由来のＲＮＡは、例えば、Ｄｕｌａｃ，Ｃ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６、２４５及びＪｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９０：１９９に記載の単一細胞からｃＤＮＡライブラリを調製するための方法に記載されるように得られ得る。例えば、ＲＮＡｓｉｎの包含により、ＲＮＡ分解を回避するために注意を払われなければならない。その後、ＲＮＡ試料は、特定の種で濃縮され得る。一実施形態では、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがＲＮＡ試料から単離される。一般に、かかる精製は、ｍＲＮＡ上のポリ－Ａ尾部を利用する。具体的には、上述のように、ポリ－Ｔオリゴヌクレオチドは、固体支持体内に固定化されて、ｍＲＮＡに対する親和性リガンドとしての機能を果たし得る。この目的のためのキット、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が市販されている。
好ましい実施形態では、ＲＮＡ集団は、マーカー配列で濃縮される。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成によって、又はｃＤＮＡ合成及び鋳型特異的インビトロ転写に基づく複数回の線形増幅によって行われ得る（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：９７１７、Ｄｕｌａｃ ｅｔ ａｌ．（上記参照）、及びＪｅｎａ ｅｔ ａｌ．（上記参照）を参照）。
特定の種又は配列で濃縮されたＲＮＡ集団又は濃縮されていないＲＮＡ集団が更に増幅され得る。本明細書で定義される場合、「増幅プロセス」は、ＲＮＡ中の分子を強化するか、増加させるか、又は増大させるように設計されている。例えば、ＲＮＡがｍＲＮＡである場合、シグナルが検出可能であるか、又は検出が増強されるように、ＲＴ－ＰＣＲ等の増幅プロセスが利用されて、ｍＲＮＡを増幅することができる。かかる増幅プロセスは、特に生体試料、組織試料、又は腫瘍試料のサイズ又は体積が小さい場合に有益である。
様々な増幅法及び検出法が使用され得る。例えば、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、又は米国特許第５，３２２，７７０号に記載される両ステップでの単一の酵素の使用、又はＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４：８０－８４（１９９４）に記載されるｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写に続く対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＡＧＬＣＲ）は本発明の範囲内である。リアルタイムＰＣＲも使用され得る。
本明細書で利用され得る他の既知の増幅法には、限定されないが、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４－１８７８（１９９０）に記載され、Ｎａｔｕｒｅ ３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１－９２（１９９１）にも記載されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」又は「３ＳＲ」技法；公開されている欧州特許出願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載されているＱ－ベータ増幅；鎖置換増幅（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９－１３（１９９６）及び欧州特許出願第６８４３１５号に記載されている）；ＰＣＴ公開第９３２２４６１号に記載されている標的媒介増幅；ＰＣＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）を参照のこと）；自立配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，１８７４（１９９０）を参照のこと）；及び転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６，１１７３（１９８９）を参照のこと）が挙げられる。
遺伝子発現の絶対レベル及び相対レベルを決定するための多くの技法が当該技術分野で既知であり、本発明での使用に好適な一般に使用されている技法には、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲベースの技法、例えば、定量的ＰＣＲ及び差次的発現ＰＣＲが含まれる。例えば、ノーザンブロッティングは、ＲＮＡ調製物を変性アガロースゲル上に泳動させ、それを、活性化セルロース、ニトロセルロース、又はガラス若しくはナイロン膜等の好適な支持体に移送することを含む。その後、放射性標識ｃＤＮＡ又はＲＮＡが調製物にハイブリダイズされ、洗浄され、オートラジオグラフィーによって分析される。
放射活性的に標識されたアンチセンスＲＮＡプローブが生検試料の薄切片とハイブリダイズされ、洗浄され、ＲＮａｓｅで切断され、オートラジオグラフィーのために感受性乳剤に曝露されるインサイチュハイブリダイゼーション視覚化も用いられ得る。試料がヘマトキシリンで染色されて、試料の組織学的組成が示され、好適な光フィルターを用いた暗視野撮像により、現像された乳剤が示される。ジゴキシゲニン等の非放射性標識も使用され得る。
あるいは、ｍＲＮＡ発現は、ＤＮＡアレイ、チップ、又はマイクロアレイ上で検出され得る。対象から得られた試験試料の標識核酸が、バイオマーカーＤＮＡを含む固体表面にハイブリダイズされ得る。正のハイブリダイゼーションシグナルがバイオマーカー転写物を含有する試料で得られる。ＤＮＡアレイを調製する方法及びそれらを使用する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６１８，６７９６号、同第６，３７９，８９７号、同第６，６６４，３７７号、同第６，４５１，５３６号、同第５４８，２５７号、米国２００３／０１５７４８５号、並びにＳｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０，４６７－４７０、Ｇｅｒｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４，１６８－１７３、及びＬｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５，５９－６５を参照のこと）。遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）も行われ得る（例えば、米国特許出願第２００３／０２１５８５８号を参照のこと）。
ｍＲＮＡレベルを監視するために、例えば、ｍＲＮＡが試験される生体試料から抽出され、逆転写され、蛍光標識ｃＤＮＡプローブが生成される。その後、マーカーｃＤＮＡにハイブリダイズすることができるマイクロアレイが標識ｃＤＮＡプローブでプローブされ、スライドがスキャンされ、蛍光強度が測定される。この強度は、ハイブリダイゼーション強度及び発現レベルと相関する。
本明細書に記載の方法で使用され得るプローブのタイプには、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド、及びゲノムプローブが含まれる。使用されるプローブのタイプは、一般に、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションの場合にはリボプローブ及びノーザンブロッティングの場合にはｃＤＮＡ等の特定の状況によって決定される。一実施形態では、プローブは、ＲＮＡに特有のヌクレオチド領域に向けられる。プローブは、マーカーｍＲＮＡ転写物を差次的に認識するのに必要な程度に短くてもよく、例えば、１５塩基程度に短くてもよいが、少なくとも１７、１８、１９、若しくは２０塩基、又はそれ以上の塩基のプローブが使用されてもよい。一実施形態では、プライマー及びプローブは、ストリンジェントな条件下で、マーカーに対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ヌクレオチド配列に少なくとも９５％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味する。別の実施形態では、「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションは、配列間に少なくとも９７％の同一性が存在する場合に生じる。
プローブの標識の形態は、放射性同位体、例えば、３２Ｐ及び３５Ｓの使用等の任意の適切なものであり得る。好適に標識された塩基の使用により、プローブが化学的に合成されるか生物学的に合成されるかにかかわらず、放射性同位体での標識が達成され得る。
一実施形態では、生体試料は、試験対象由来のポリペプチド分子を含有する。あるいは、生体試料は、試験対象由来のｍＲＮＡ分子又は試験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。
別の実施形態では、本方法は、対照対象から対照生体試料を得ることと、マーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの断片の存在が生体試料中で検出されるように、対照試料を、マーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの断片を検出することができる化合物又は薬剤と接触させることと、対照試料中のマーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの断片の存在を、試験試料中のマーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの断片の存在と比較することとを更に含む。
ｃ．バイオマーカータンパク質発現を検出するための方法
バイオマーカータンパク質の活性又はレベルは、発現されたポリペプチドを検出又は定量化することによって検出及び／又は定量化され得る。ポリペプチドは、当業者に周知のいくつかの手段のうちのいずれかによって検出及び定量化され得る。バイオマーカー核酸及びその機能的に同様の相同体（その断片又は遺伝子改変を含む）によってコードされるポリペプチドの（例えば、その制御領域又はプロモーター領域における）異常なポリペプチド発現レベルは、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤及び免疫療法併用治療に対するがんの応答の可能性と関連付けられる。ポリペプチドを検出するための当該技術分野で既知の任意の方法が使用され得る。かかる方法には、免疫拡散、免疫電気泳動、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロッティング、結合剤リガンドアッセイ、免疫組織化学的技法、凝集、補体アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー等が含まれるが、これらに限定されない（例えば、参照により組み込まれる、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｉｔｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．ｐｐ ２１７－２６２，１９９１）。抗体をエピトープ（複数可）と反応させることと、標識ポリペプチド又はその誘導体を競合的に置き換えることとを含む、結合剤リガンド免疫アッセイ法が好ましい。
例えば、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ手順は、所望のバイオマーカータンパク質標準が（１２５Ｉ若しくは３５Ｓ等の放射性同位体、又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリ性ホスファターゼ等のアッセイ可能な酵素で）標識され、非標識試料と一緒に、対応する抗体と接触させられるように行われ得、そこで、第２の抗体が第１の抗体に結合するために使用され、放射活性又は固定化酵素がアッセイされる（競合的アッセイ）。あるいは、試料中のバイオマーカータンパク質が対応する固定化抗体と反応させられ、放射性同位体標識又は酵素標識抗バイオマーカータンパク質抗体がこの系と反応させられ、放射活性又は酵素がアッセイされる（ＥＬＩＳＡ－サンドイッチアッセイ）。好適な場合、他の従来の方法も用いられ得る。
上述の技法は、「一段階」アッセイ又は「二段階」アッセイとして本質的に行われ得る。「一段階」アッセイは、抗原を固定化抗体と接触させ、洗浄することなく、混合物を標識抗体と接触させることを含む。「二段階」アッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。好適な場合、他の従来の方法も用いられ得る。
一実施形態では、バイオマーカータンパク質レベルを測定するための方法は、生物学的検体を、バイオマーカータンパク質に選択的に結合する抗体又はそのバリアント（例えば、断片）と接触させるステップと、当該抗体又はそのバリアントが当該試料に結合しているかを検出するステップと、それにより、バイオマーカータンパク質レベルを測定するステップとを含む。
バイオマーカータンパク質及び／又は抗体の酵素標識及び放射標識は、従来の手段によって達成され得る。かかる手段は、一般に、特に酵素の活性に悪影響を及ぼさないように、例えば、グルタルアルデヒドによる、問題となっている抗原又は抗体への酵素の共有結合的連結を含み、これは、酵素がその基質と依然として相互作用することができなければならないことを意味するが、酵素の全てが活性である必要はないが、但し、アッセイの達成を可能するのに十分な活性のままであることを条件とする。実際には、酵素に結合するためのいくつかの技法は非特異的であり（例えば、ホルムアルデヒドを使用して）、ある割合の活性酵素しかもたらさない。
アッセイ系の１つの成分を支持体上に固定化し、それにより、系の他の成分がその１つの成分と接触し、多大な労力と時間を必要とすることなく容易に除去されることを可能にすることが通常望ましい。第２の相が第１の相から離れて固定化されることが可能であるが、通常、１つの相で十分である。
酵素自体を支持体上に固定化することが可能であるが、固相酵素が必要とされる場合、これは、通常、抗体に結合し、その抗体を当該技術分野で周知の支持体、モデル、及び系に付着することによって最も良好に達成される。単純なポリエチレンが好適な支持体を提供し得る。
標識に用いられ得る酵素は特に限定されていないが、例えばオキシダーゼ群のメンバーから選択され得る。これらは、それらの基質との反応により過酸化水素の産生を触媒し、グルコースオキシダーゼは、その良好な安定性、入手の容易さ及び安価、並びにその基質（グルコース）の入手し易さのため、使用されることが多い。オキシダーゼの活性は、当該技術分野で周知の制御された条件下で酵素標識抗体と基質との反応後に形成された過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。
他の技法を使用して、本開示に基づいて専門家の選好に従ってバイオマーカータンパク質を検出することができる。かかる技法の１つは、好適に処理された試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた後にニトロセルロースフィルター等の固体支持体に移すウエスタンブロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：４３５０（１９７９））である。その後、抗バイオマーカータンパク質抗体（非標識）を支持体と接触させ、標識タンパク質Ａ又は抗免疫グロブリン（１２５Ｉ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、及びアルカリ性ホスファターゼを含む好適な標識）等の二次免疫学的試薬によってアッセイする。クロマトグラフ検出も使用され得る。
免疫組織化学を使用して、例えば、生検試料中のバイオマーカータンパク質の発現を検出することができる。好適な抗体が、例えば、細胞の薄層と接触させられ、洗浄され、その後、第２の標識抗体と接触させられる。標識は、蛍光マーカー、酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、アビジン、又は放射標識により得る。このアッセイは、顕微鏡を使用して視覚的にスコア化される。
抗バイオマーカータンパク質抗体、例えば、イントラボディも、撮像目的のために、例えば、対象の細胞及び組織中のバイオマーカータンパク質の存在を検出するために使用することができる。好適な標識には、放射性同位体、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９ｍＴｃ）、フルオレセイン及びローダミン等の蛍光標識、並びにビオチンが含まれる。
インビボ撮像の目的のために、抗体は、それ自体が体外から検出不能であるため、検出を可能にするために標識されるか、又は別様に修飾されなければならない。この目的のためのマーカーは、抗体結合を実質的に妨害しないが、外部検出を可能にする任意のマーカーであり得る。好適なマーカーには、Ｘ線ラジオグラフィー、ＮＭＲ、又はＭＲＩによって検出され得るものが含まれ得る。Ｘ線ラジオグラフィー技法の場合、好適なマーカーには、検出可能な放射線を放出するが、対象に明らかに有害ではない任意の放射性同位体（例えば、バリウム又はセシウム等）が含まれる。ＮＭＲ及びＭＲＩに好適なマーカーには、一般に、例えば、関連ハイブリドーマの栄養素の好適な標識によって抗体に組み込まれ得る重水素等の検出可能な特徴的スピンを有するものが含まれる。
対象のサイズ及び使用される撮像システムにより、診断的画像を生成するのに必要な撮像部分の量が決定される。放射性同位体部分の場合、ヒト対象について、注射される放射活性の量は、通常、テクネチウム－９９約５～２０ミリキュリーの範囲である。その後、標識された抗体又は抗体断片は、バイオマーカータンパク質を含有する細胞の場所に優先的に蓄積する。その後、標識された抗体又は抗体断片が既知の技法を使用して検出され得る。
バイオマーカータンパク質を検出するために使用され得る抗体には、天然であるか、又は合成であるか、全長であるか、又はその断片であるか、モノクローナルであるか、又はポリクローナルであるかにかかわらず、検出されるバイオマーカータンパク質に十分に強くかつ特異的に結合する任意の抗体が含まれる。抗体は、最大約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－１２ＭのＫｄを有し得る。「特異的に結合する」という語句は、例えば、結合が、同一又は同様のエピトープ、抗原、又は抗原決定基の第２の調製物で置き換えられ得るか、又はそれと競合され得るような様式での、抗体のエピトープ又は抗原又は抗原決定基への結合を指す。抗体は、関連タンパク質等の他のタンパク質と比較してバイオマーカータンパク質に優先的に結合し得る。抗体は、市販されているか、又は当該技術分野で既知の方法に従って調製され得る。
使用され得る抗体及びその誘導体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、キメラ、ヒト、ヒト化、霊長類化（ＣＤＲ－グラフト化）、ベニヤ化、又は一本鎖抗体、並びに抗体の機能的断片、すなわち、バイオマーカータンパク質結合断片を包含する。例えば、バイオマーカータンパク質又はその一部（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片を含むが、これらに限定されない）に結合することができる抗体断片が使用され得る。かかる断片は、酵素的切断又は組換え技法によって産生され得る。例えば、パパイン又はペプシン切断により、それぞれ、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片が生成され得る。必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼもＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片を生成するために使用され得る。抗体は、１つ以上の終止コドンが天然終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して様々な切断形態で産生される場合もある。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ、ドメイン、及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計され得る。
合成抗体及び操作された抗体は、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号）、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，８１６，３９７号）、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（ＷＯ８６／０１５３３）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号）、Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）、Ｗｉｎｔｅｒ（欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０４５１２１６Ｂ１号）、及びＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０５１９５９６Ａ１号）に記載されている。また、霊長類化抗体については、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１０：１４５５－１４６０（１９９２）、一本鎖抗体については、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，９４６，７７８号）及びＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６（１９８８））も参照のこと。ライブラリ、例えば、ファージディスプレイライブラリから産生された抗体も使用され得る。
いくつかの実施形態では、抗体以外のバイオマーカータンパク質に特異的に結合する薬剤、例えば、ペプチドが使用される。バイオマーカータンパク質に特異的に結合するペプチドは、当該技術分野で既知の任意の手段によって特定され得る。例えば、バイオマーカータンパク質の特異的ペプチド結合剤は、ペプチドファージディスプレイライブラリの使用についてスクリーニングされ得る。
ｄ．バイオマーカーの構造的改変を検出するための方法
以下の例証的な方法を使用して、例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカー、又は過剰発現、過機能性などである本明細書に記載の免疫療法で使用される他のバイオマーカーを特定するために、バイオマーカー核酸及び／又はバイオマーカーポリペプチド分子中の構造的改変の存在を特定することができる。
特定の実施形態では、改変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、例えば、アンカーＰＣＲ若しくはＲＡＣＥ ＰＣＲ、又はあるいはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７－１０８０、及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：３６０－３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、バイオマーカー遺伝子などのバイオマーカー核酸の点変異の検出に特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５－６８２を参照のこと）。この方法は、対象から細胞試料を収集するステップ、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、又は両方）を単離するステップ、バイオマーカー遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーション及び増幅が生じるような条件下で、核酸試料を、バイオマーカー遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させるステップ、増幅産物の存在若しくは不在を検出するステップ、又は増幅産物のサイズを検出して、対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲを予備的増幅ステップとして本明細書に記載の変異を検出するために使用される技法のうちのいずれかと併せて使用することが望ましくあり得ることが理解される。
代替の増幅法には、自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、又は任意の他の核酸増幅法が含まれ、その後に、当業者に周知の技法を使用した増幅された分子の検出が続く。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合の核酸分子の検出に特に有用である。
代替の実施形態では、試料細胞由来のバイオマーカー核酸の変異は、制限酵素切断パターンの改変によって特定され得る。例えば、試料ＤＮＡ及び対照ＤＮＡが単離され、増幅され（任意に）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと消化され、断片長サイズがゲル電気泳動によって決定され、比較される。試料ＤＮＡと対照ＤＮＡとの間の断片長サイズの差が、試料ＤＮＡの変異を示す。更に、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生又は喪失による特異的変異の存在についてスコア化することができる。
他の実施形態では、バイオマーカー核酸の遺伝子変異は、試料核酸及び対照核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを、何百又は何千ものオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることによって特定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．７：２４４－２５５、Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３－７５９）。例えば、バイオマーカーの遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）（上記参照）に記載されるように、光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイで特定され得る。簡潔には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを使用して、試料及び対照中のＤＮＡの長いストレッチを走査して、連続的な重複プローブの線形アレイを作製することによって配列間の塩基の変化を特定することができる。このステップにより、点変異の特定が可能になる。このステップの後に、検出される全てのバリアント又は変異に相補的なより小さい特殊化されたプローブアレイを使用することによって特異的変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイが続く。変異アレイは各々、並列プローブセットから成り、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は変異体遺伝子に相補的である。かかるバイオマーカーの遺伝子変異は、例えば、生殖系列及び体細胞変異を含む様々な状況で特定され得る。
更に別の実施形態では、当該技術分野で既知の様々な配列決定反応のうちのいずれかを使用して、バイオマーカー遺伝子を直接配列決定し、試料バイオマーカーの配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって変異を検出することができる。配列決定反応の例としては、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５６０又はＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３によって開発された技法に基づくものが挙げられる。質量分析による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開第９４／１６１０１号、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７－１６２、及びＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７－１５９を参照のこと）を含み、診断アッセイが行われるとき、任意の様々な自動化された配列決定手順が利用され得ることもまた企図される（Ｎａｅｖｅ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８－５３）。
バイオマーカー遺伝子の変異を検出するための他の方法には、切断薬剤からの保護を使用してＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、当該技術分野の技法である「ミスマッチ切断」は、野生型バイオマーカー配列を含有する（標識された）ＲＮＡ又はＤＮＡを組織試料から得られた潜在的に変異のＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズすることによって形成されたヘテロ二重鎖を提供することから開始する。二本鎖二重鎖は、対照鎖と試料鎖との間の塩基対ミスマッチにより存在するもの等の二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖がＲＮａｓｅで処理され、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドがＳＩヌクレアーゼで処理されて、ミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。他の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかがヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジンで処理されて、ミスマッチ領域を消化することができる。ミスマッチ領域を消化した後、結果として生じた物質が変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離されて、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４３９７及びＳａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６－２９５を参照のこと。好ましい実施形態では、対照ＤＮＡ又はＲＮＡが検出のために標識され得る。
なお別の実施形態では、ミスマッチ切断反応は、細胞試料から得られたバイオマーカーｃＤＮＡの点変異を検出及びマッピングするための定義された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を用いる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７－１６６２）。例示の実施形態に従って、バイオマーカー配列、例えば、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理された野生型バイオマーカー及び切断産物（存在する場合）に基づくプローブが、電気泳動プロトコル等から検出され得る（例えば、米国特許第５，４５９，０３９号）。
他の実施形態では、電気泳動移動度の改変を使用して、バイオマーカー遺伝子の変異を特定することができる。例えば、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差を検出することができる（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５－１４４及びＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３－７９も参照のこと）。試料及び対照バイオマーカー核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は変性され、復元され得る。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり、電気泳動移動度の結果として生じた改変は、単一塩基の変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡ断片は、標識プローブで標識又は検出され得る。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化により敏感である（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。好ましい実施形態では、主題の方法は、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するためのヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５）。
更に別の実施形態では、変性剤勾配を有するポリアクリルアミドゲル中での変異断片又は野生型断片の移動が変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥが分析法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによっておよそ４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全に変性しないことを確実にするように修飾される。更なる実施形態では、温度勾配が変性勾配の代わりに使用されて、対照ＤＮＡと試料ＤＮＡとの移動度の差を特定する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと）。
点変異を検出するための他の技法の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、又は選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心に配置されるように調製され得、その後、完全マッチが見出された場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされ得る（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６２３０）。かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡ又はいくつかの異なる変異にハイブリダイズされる。
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術が、本発明と併せて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、目的とする変異を、分子の中心に（これにより、増幅が差次的ハイブリダイゼーションに依存するようになる）（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７－２４４８）、又は適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止又は低減する１つのプライマーの最も３’側に（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）有し得る。加えて、切断ベースの検出を行うために変異の領域内に新規制限部位を導入することが望ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。特定の実施形態では、増幅が増幅用のＴａｑリガーゼを使用して行われる場合もあることが理解される（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１８９）。そのような場合、５’配列の３’末端に完全マッチが存在する場合にのみライゲーションが生じ、増幅の存在又は不在を探すことによって特定の部位での既知の変異の存在を検出することを可能にする。
ＶＩ．抗がん療法
表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤及び免疫療法併用治療の有効性は、本明細書に記載の方法による対象におけるがんに関連するバイオマーカー量及び／又は活性に従って予測される。一実施形態では、かかる阻害剤及び免疫療法併用治療（例えば、別の免疫チェックポイント阻害剤などの１つ以上の追加の抗がん療法と組み合わせた１つ以上の阻害剤及び免疫療法併用治療）は、特に対象が最初に阻害剤及び免疫療法併用治療に応答する可能性の高い者として示された場合に投与され得る。別の実施形態では、かかる阻害剤及び免疫療法併用治療は、対象が阻害剤及び免疫療法併用治療に応答する可能性の低い者として示されたときに避けられ得、標的及び／又は非標的抗がん療法などの代替の治療レジメンが投与され得る。
併用療法も企図され、これは、例えば、１つ以上の化学療法剤及び放射線、１つ以上の化学療法剤及び免疫療法、又は１つ以上の化学療法剤、放射線、及び化学療法を含み得、これらの組み合わせは各々、抗免疫チェックポイント療法との併用であり得る。加えて、特定の標的を調節するための薬剤の任意の代表的な実施形態は、当業者によって本明細書に記載の任意の他の標的に適応され得る。
「標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用し、それにより、がんを治療する薬剤の投与を指す。一例としては、当該技術分野で周知である、免疫チェックポイント阻害剤などの免疫療法が挙げられる。例えば、当該技術分野で周知であり、かつ上に記載されている治療用モノクローナル遮断抗体などの抗ＰＤ－１経路剤を使用して、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２などのＰＤ－１経路の望ましくない成分を発現する腫瘍微小環境及び細胞を標的とすることができる。
例えば、「ＰＤ－１経路」という用語は、ＰＤ－１受容体及びそのリガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を指す。「ＰＤ－１経路阻害剤」は、相互作用によって別様に生成された免疫阻害性シグナル伝達が遮断されるか、又はさもなければ低下するように、ＰＤ－１とそのリガンドの一方又は両方との間の相互作用を遮断するか、又はさもなければ低下させる。抗免疫チェックポイント阻害剤は、直接又は間接的であり得る。直接抗免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントとそのリガンドの少なくとも一方との間の相互作用を遮断するか、又はさもなければ低下させる。例えば、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１のそのリガンドの一方又は両方との結合を遮断することができる。直接ＰＤ－１組み合わせ阻害剤は、特にＰＤ－１（例えば、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ＰＤ－１及びＢ７－１）、及びＰＤ－Ｌ２（例えば、ＰＤ－１及びＲＧＭｂ）の天然結合パートナーが既知であるため、当該技術分野で周知である。
例えば、二重特異性抗体などのＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方との間の相互作用を直接遮断する薬剤は、阻害性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御することができる（すなわち、ＰＤ－１経路阻害剤として）。あるいは、ＰＤ－１とそのリガンドの一方又は両方との間の相互作用を間接的に遮断する薬剤は、阻害性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御することができる。例えば、Ｂ７－１又はその可溶性形態は、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドへの結合により、ＰＤ－１への結合に利用可能なＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの有効濃度を間接的に低減させる。例示の薬剤には、受容体とリガンドとの間の相互作用を遮断するＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２に対する単一特異性又は二重特異性遮断抗体；ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２の非活性化形態（例えば、優性阻害性若しくは可溶性ポリペプチド）；ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２の間の相互作用を遮断する小分子又はペプチド；ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合し、その受容体とリガンドとの間の相互作用を阻害する融合タンパク質（例えば、抗体又は免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２の細胞外部分）；天然ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、及び／又はＰＤ－Ｌ２リガンドの非活性化形態、並びに天然ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、及び／又はＰＤ－Ｌ２リガンドの可溶性形態が挙げられる。
間接的抗免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントとそのリガンドの少なくとも一方との間の相互作用によって生成された免疫阻害性シグナル伝達を遮断するか、又はさもなければ低下させる。例えば、阻害剤は、ＰＤ－１とそのリガンドの一方又は両方との間の相互作用を必ずしも直接遮断することなく、ＰＤ－１とそのリガンドの一方又は両方との間の相互作用を遮断することができる。例えば、間接的阻害剤には、免疫阻害性シグナル伝達を遮断するか、又はさもなければ低下させるために、シグナル伝達することを必要とされるＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１の細胞内部分に結合するイントラボディが含まれる。同様に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２の発現を低下させる核酸は、相互作用のための成分の利用可能性を除去することによって、ＰＤ－１とそのリガンドの一方又は両方との間の相互作用を間接的に阻害することができる。かかる核酸分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及び／又はＰＤ－Ｌ２転写又は翻訳を遮断することができる。
同様に、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーと、かかる１つ以上のバイオマーカーの結合パートナー及び／又は基質との間の相互作用を直接遮断する薬剤は、インターフェロンシグナル伝達に対する感受性を増加させるなどの、かかる１つ以上のバイオマーカーによって制御されるシグナル伝達及びその下流免疫応答に対する阻害を除去することができる。
あるいは、かかる１つ以上のバイオマーカーとその結合パートナー／基質との間の相互作用を間接的に遮断する薬剤は、かかる１つ以上のバイオマーカーによって制御されるシグナル伝達及びその下流免疫応答に対する阻害を除去することができる。例えば、かかる１つ以上のバイオマーカーの基質に結合し、かつ細胞内の１つ以上のバイオマーカーへの結合に利用可能なかかる基質の有効濃度を間接的に低下させることにより、機能活性を有しないバイオマーカー断片などのかかる１つ以上のバイオマーカーの切断された又は優性阻害性形態。例示の薬剤には、１つ以上のバイオマーカーとその基質との間の相互作用を遮断する１つ以上のバイオマーカー及び／又はその基質に対する単一特異性又は二重特異性遮断抗体、特にイントラボディ；かかる１つ以上のバイオマーカー及び／又はその基質の非活性形態（例えば、優性阻害性ポリペプチド）、かかる１つ以上のバイオマーカーとその基質との間の相互作用又はかかる１つ以上のバイオマーカーの活性を遮断する小分子又はペプチド；並びに天然バイオマーカー及び／又はその基質の非活性化形態が挙げられる。
免疫応答を誘発又は増幅するように設計された免疫療法は、「活性化免疫療法」と称される。免疫応答を低下又は抑制するように設計された免疫療法は、「抑制免疫療法」と称される。遺伝学的に修飾された移植がん細胞に免疫系効果をもたらすと考えられる任意の薬剤をアッセイして、薬剤が免疫療法であるかを決定し、所与の遺伝子修飾が免疫応答の調節にもたらす効果を決定することができる。いくつかの実施形態では、免疫療法は、がん細胞特異的である。いくつかの実施形態では、免疫療法は、「非標的」であり得、これは、免疫系細胞と選択的に相互作用しないが、免疫系機能を調節する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子療法、及び放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫療法は、がん抗原又は疾患抗原に対して産生された予め形成された抗体の投与（例えば、任意に化学療法剤又は毒素に結合しているモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって達成される宿主の短期間保護のための受動免疫を伴い得る。この免疫療法は、がん細胞株の細胞毒性リンパ球によって認識されるエピトープの使用にも焦点を合わせることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチド等を使用して、腫瘍又はがんの発症、進行、及び／又は病理に関連した生体分子を選択的に調節することができる。
一実施形態では、免疫療法は、養子細胞ベースの免疫療法を含む。照射自己又は同種腫瘍細胞、腫瘍溶解物又はアポトーシス腫瘍細胞、抗原提示細胞ベースの免疫療法、樹状細胞ベースの免疫療法、養子Ｔ細胞移入、養子ＣＡＲ Ｔ細胞療法、自己免疫増強療法（ＡＩＥＴ）、がんワクチン、及び／又は抗原提示細胞を含むが、これらに限定されない、周知の養子細胞ベースの免疫療法様式。かかる細胞ベースの免疫療法は、１つ以上の遺伝子産物を発現して免疫応答を更に調節する、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカインを発現するように、かつ／又はＭａｇｅ－１、ｇｐ－１００、患者特異的ネオ抗原ワクチン等の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原を発現するように更に修正され得る。
別の実施形態では、免疫療法は、非細胞ベースの免疫療法を含む。一実施形態では、ワクチン増強アジュバントを有する又は有しない抗原を含む組成物が使用される。かかる組成物は、ペプチド組成物、腫瘍溶解性ウイルス、融合タンパク質を含む組換え抗原等の多くの周知の形態で存在する。なお別の実施形態では、免疫調節インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３等、並びにそのモジュレーター（例えば、遮断抗体又はより強力な形態若しくはより長い時間持続する形態）が使用される。更に別の実施形態では、免疫調節サイトカイン、例えば、インターフェロン、Ｇ－ＣＳＦ、イミキモド、ＴＮＦアルファ等、並びにそのモジュレーター（例えば、遮断抗体又はより強力な形態若しくはより長い時間持続する形態）が使用される。別の実施形態では、免疫調節ケモカイン、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、及びＣＸＣＬ７等、並びにそのモジュレーター（例えば、遮断抗体又はより強力な形態若しくはより長い時間持続する形態）が使用される。別の実施形態では、免疫抑制を標的とする免疫調節分子、例えば、ＳＴＡＴ３シグナル伝達モジュレーター、ＮＦカッパＢシグナル伝達モジュレーター、及び免疫チェックポイントモジュレーターが使用される。「免疫チェックポイント」及び「抗免疫チェックポイント療法」という用語は、上で説明されている。
なお別の実施形態では、免疫調節薬、例えば、免疫細胞増殖抑制薬、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、イムノフィリン、及びそのモジュレーター（例えば、ラパマイシン、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）（シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ））、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、リダフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス等）、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベータメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ｄｏｃａ）アルドステロン、非グルココルチコイドステロイド、ピリミジン合成阻害剤、レフルノミド、テリフルノミド、葉酸類似体、メトトレキサート、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、サリドマイド、レナリドミド、ペントキシフィリン、ブプロピオン、クルクミン、カテキン、オピオイド、ＩＭＰＤＨ阻害剤、ミコフェノール酸、ミリオシン、フィンゴリモド、ＮＦ－ｘＢ阻害剤、ラロキシフェン、ドロトレコギンアルファ、デノスマブ、ＮＦ－ｘＢシグナル伝達カスケード阻害剤、ジスルフィラム、オルメサルタン、ジチオカルバメート、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２、Ｐｒｏｌ、ＮＰＩ－００５２、クルクミン、ゲニステイン、レスベラトロル、パルテノリド、サリドマイド、レナリドミド、フラボピリドール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三酸化ヒ素、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、Ｉ３Ｃ（インドール－３－カルビノール）／ＤＩＭ（ジインドールメタン）（１３Ｃ／ＤＩＭ）、Ｂａｙ １１－７０８２、ルテオリン、細胞透過性ペプチドＳＮ－５０、ＩＫＢａ．－スーパーリプレッサー過剰発現、ＮＦＫＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、又はそれらのいずれかの誘導体若しくは類似体が使用される。更に別の実施形態では、免疫調節抗体又はタンパク質が使用される。例えば、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、又は４－１ＢＢ、Ｔ細胞二重特異性抗体、抗ＩＬ－２受容体抗体、抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３（ムロモナブ）、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、抗ＣＤ４抗体、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ザノリムマブ、抗ＣＤ１１抗体、エファリズマブ、抗ＣＤ１８抗体、エルリズマブ、ロベリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、アフツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、パスコリズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ２３抗体、ルミリキシマブ、抗ＣＤ４０抗体、テネリキシマブ、トラリズマブ、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ルプリズマブ、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、アセリズマブ、抗ＣＤ８０抗体、ガリキシマブ、抗ＣＤ１４７抗体、ガビリモマブ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）阻害抗体、ベリムマブ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質、アバタセプト、ベラタセプト、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、トレメリムマブ、抗エオタキシン１抗体、ベルチリムマブ、抗ａ４－インテグリン抗体、ナタリズマブ、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、トシリズマブ、抗ＬＦＡ－１抗体、オデュリモマブ、抗ＣＤ２５抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ、抗ＣＤ５抗体、ゾリモマブ、抗ＣＤ２抗体、シプリズマブ、ネレリモマブ、ファラリモマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、セデリズマブ、ドルリモマブアリトクス、ドルリキシズマブ、フォントリズマブ、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ、レブリリズマブ、マスリモマブ、モロリムマブ、パキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトクス、バパリキシマブ、ベパリモマブ、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、アナキンラ、抗ＩＬ－５抗体、メポリズマブ、ＩｇＥ阻害剤、オマリズマブ、タリズマブ、ＩＬ１２阻害剤、ＩＬ２３阻害剤、ウステキヌマブ等に結合する抗体。ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ等の免疫応答を増強する栄養補助剤が当該技術分野で周知であり（例えば、米国特許第４，９８１，８４４号及び同第５，２３０，９０２号並びにＰＣＴ公開第２００４／００４４８３号を参照のこと）、本明細書に記載の方法で使用され得る。
同様に、免疫療法以外の薬剤及び療法、又はそれらの組み合わせを、免疫療法の有無にかかわらず、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤と組み合わせて使用して免疫応答を刺激し、それによって、それらから利益を受け得る状態を治療することができる。例えば、化学療法、放射線、後成的修飾因子（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）修飾因子、メチル化修飾因子、リン酸化修飾因子等）、標的療法等が当該技術分野で周知である。
「非標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しないが、がんを治療する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子療法、及び放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、化学療法が使用される。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。かかる化学療法剤は、以下の化合物の群：白金化合物、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗剤、抗分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、及び毒素、並びにそれらの合成誘導体から選択されるものであり得るが、これらに限定されない。例示の化合物としては、限定されないが、アルキル化剤：シスプラチン、トレオスルファン、及びトロホスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：テニポシド、クリスナトール、及びマイトマイシン；抗葉酸剤：メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びヒドロキシウレア；ピリミジン類似体：５－フルオロウラシル、ドキシフルリジン、及びシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリン及びチオグアニン；ＤＮＡ代謝拮抗剤：２’－デオキシ－５－フルオロウリジン、アフィジコリングリシネート、及びピラゾロイミダゾール；並びに有糸分裂阻害剤：ハリコンドリン、コルヒチン、及びリゾキシンが挙げられる。１つ以上の化学療法剤（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物も使用され得る。ＦＬＡＧには、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、及びＧ－ＣＳＦが含まれる。ＣＨＯＰには、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾンが含まれる。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ－１及び／又はＰＡＲＰ－２）阻害剤が使用され、かかる阻害剤は当該技術分野で周知である（例えば、Ｏｌａｐａｒｉｂ、ＡＢＴ－８８８、ＢＳＩ－２０１、ＢＧＰ－１５（Ｎ－Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＩＮＯ－１００１（Ｉｎｏｔｅｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ）、３－アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、４－アミノ－１，８－ナフタルイミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、６（５Ｈ）－フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、ベンズアミド（米国特許Ｒｅ第３６，３９７号）、及びＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．）。作用機構は、一般に、ＰＡＲＰに結合し、その活性を低下させるＰＡＲＰ阻害剤の能力に関連する。ＰＡＲＰは、β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のニコチンアミド及びポリ－ＡＤＰ－リボース（ＰＡＲ）への変換を触媒する。ポリ（ＡＤＰ－リボース）及びＰＡＲＰはいずれも、転写制御、細胞増殖、ゲノム安定性、及び発がんに関連付けられている（Ｂｏｕｃｈａｒｄ Ｖ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３１，Ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ ２００３，ｐｐ．４４６－４５４（９）、Ｈｅｒｃｅｇ Ｚ．；Ｗａｎｇ Ｚ．－Ｑ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４７７，Ｎｕｍｂｅｒ １，２ Ｊｕｎ．２００１，ｐｐ．９７－１１０（１４））。ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖破壊（ＳＳＢ）の修復における重要な分子である（ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：７３０３－７３０７、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ Ｖ，Ｄａｎｔｚｅｒ Ｆ，Ａｍｅ Ｊ Ｃ，ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ Ｇ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：５１７－５２８、Ｗａｎｇ Ｚ Ｑ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １１：２３４７－２３５８）。ＰＡＲＰ１機能の阻害によるＳＳＢ修復のノックアウトにより、相同性指向ＤＳＢ修復に欠陥のあるがん細胞における合成致死を誘発し得るＤＮＡ二本鎖破壊（ＤＳＢ）が誘導される（Ｂｒｙａｎｔ Ｈ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３４：９１３－９１７、Ｆａｒｍｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３４：９１７－９２１）。化学療法剤の前述の例は例示的なものであり、限定するようには意図されていない。
別の実施形態では、放射線療法が使用される。放射線療法で使用される放射線は、電離放射線であり得る。放射線療法は、ガンマ線、Ｘ線、又は陽子ビームでもあり得る。放射線療法の例には、外部ビーム放射線療法、放射性同位体（Ｉ－１２５、パラジウム、イリジウム）、ストロンチウム－８９等の放射性同位体の間質埋め込み、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ－３２放射線療法、並びに／又は全腹部及び骨盤放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。放射線療法の一般概要については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。放射線療法は、放射線が遠隔源から向けられる外部ビーム放射線又は遠隔療法として施され得る。放射線治療は、放射性源ががん細胞又は腫瘍塊に近接して体内に設置される内部療法又は小線源療法として施される場合もある。ヘマトポルフィリン及びその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ－ＭＡ）、フタロシアニン、感光剤Ｐｃ４、デメトキシ－ヒポクレリンＡ、並びに２ＢＡ－２－ＤＭＨＡ等の感光剤の投与を含む光線力学的療法の使用も包含される。
別の実施形態では、がん性細胞及び／又は組織を物理的に取り除くために外科的介入が行われ得る。なお別の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモン治療的治療は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ－ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成及び処理阻害剤、並びにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベータメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））、ビタミンＤ３類似体、抗ゲスターゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、又は抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含み得る。
更に別の実施形態では、身体組織が高温（最大１０６°Ｆ）に曝露される手技である温熱療法が使用される。熱は、細胞を損傷するか、又はそれらが生きるのに必要な物質をそれらから取り除くことによって腫瘍を縮小させる助けとなり得る。温熱療法は、外部及び内部加熱デバイスを使用した局部、局所、及び全身温熱療法であり得る。温熱療法は、ほとんどの場合、他の療法形態（例えば、放射線療法、化学療法、及び生物学的療法）とともに使用されて、それらの有効性を向上させるよう試みる。局部温熱とは、腫瘍等の非常に小さい領域に適用される熱を指す。その領域は、体外のデバイスから腫瘍に向けられた高周波で外部から加熱され得る。内部加熱を達成するために、細い加熱ワイヤ又は温水が充填された中空管、埋め込み型マイクロ波アンテナ、及び高周波電極を含む滅菌プローブのいくつかのタイプのうちの１つが使用され得る。局所温熱療法では、臓器又は肢が加熱される。高エネルギーを生み出す磁石及びデバイスが加熱される領域上に配置される。灌流と呼ばれる別のアプローチでは、患者の血液のいくらかが取り除かれ、加熱され、その後、内部加熱される領域にポンプ注入（灌流）される。全身加熱は、全身に広がった転移がんを治療するために使用される。これは、温水毛布、温ワックス、誘導コイル（電気毛布中のもの等）、又は熱チャンバ（大型インキュベーターと同様のもの）を使用して達成され得る。温熱療法は、放射線副作用又は合併症の著しい増加を引き起こさない。しかしながら、皮膚に直接適用される熱は、治療される患者の約半数に不快感又は更には著しい局所疼痛をもたらし得る。これは、通常は急速に治癒する水疱も引き起こし得る。
なお別の実施形態では、光線力学的療法（別名、ＰＤＴ、光線照射療法、光線療法、又は光化学療法）が、いくつかのがんタイプの治療に使用される。これは、単細胞生物が特定のタイプの光に曝露されたときに感光剤として既知のある特定の化学物質がその生物を死滅させることができるという発見に基づいている。ＰＤＴは、感光剤と組み合わせて固定周波数レーザー光を使用することによってがん細胞を破壊する。ＰＤＴでは、感光剤は、血流に注射され、全身の細胞によって吸収される。この薬剤は、正常細胞で残存するよりも長い時間にわたってがん細胞で残存する。処理されたがん細胞がレーザー光に曝露されると、感光剤は光を吸収し、処理されたがん細胞を破壊する酸素の活性形態を産生する。露光は、感光剤の大半が健常細胞を去っているが、依然としてがん細胞中に存在しているときに生じるように、慎重に時間調節されなければならない。ＰＤＴで使用されるレーザー光は、光ファイバー（極細ガラスストランド）を通して方向付けられ得る。光ファイバーは、適切な量の光を送達するためにがんに近接して設置される。光ファイバーは、肺がんの治療の場合には気管支鏡を通して肺内に方向付けられ得、食道がんの治療の場合には内視鏡を通して食道内に方向付けられ得る。ＰＤＴの利点は、健常組織に最小限の損傷しか引き起こさないことである。しかしながら、現在使用されているレーザー光が約３センチメートル（１と１／８インチをわずかに超える）を超える組織を通過することができないため、ＰＤＴは、皮膚上若しくは皮膚真下又は内臓器官の内膜上の腫瘍の治療に主に使用されている。光線力学的療法により、治療後６週間以上にわたって皮膚及び目が光に敏感になる。患者は、直射日光及び明るい室内照明を少なくとも６週間避けるよう忠告される。患者が屋外に出なければならない場合、サングラスを含む防護衣類を着用しなければならない。ＰＤＴの他の一時的な副作用は、特定の領域の治療に関連しており、咳嗽、嚥下困難、腹痛、及び痛みを伴う呼吸又は息切れが含まれ得る。１９９５年１２月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、閉塞を引き起こしている食道がん及びレーザーのみでは満足に治療することができない食道がんの症状を緩和するためのポルフィマーナトリウムと呼ばれる感光剤又はＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）を承認した。１９９８年１月、ＦＤＡは、通常の肺がん治療が適切ではない患者における早期非小細胞肺がんの治療のためにポルフィマーナトリウムを承認した。国立がん研究所及び他の機関は、膀胱がん、脳がん、喉頭がん、及び口腔がんを含むいくつかのがんタイプに対する光線力学的療法の使用を評価するための臨床試験（調査研究）を支援している。
更に別の実施形態では、レーザー療法は、高強度光を利用してがん細胞を破壊するために使用される。この技法は、多くの場合、特にがんが他の治療によって治癒されない場合に、出血又は閉塞等のがんの症状を緩和するために使用される。この技法は、腫瘍を縮小又は破壊することによってがんを治療するためにも使用される。「レーザー」という用語は、励起誘導放射による光増幅を表す。電球からの光等の常光は、多くの波長を有し、全ての方向に広がる。その一方で、レーザー光は、特定波長を有し、狭ビームに集中する。このタイプの高強度光は、多くのエネルギーを含んでいる。レーザーは、非常に強力であり、鋼鉄の切断又はダイヤモンドの成形に使用され得る。レーザーは、眼内の損傷網膜の修復又は組織の切断（外科用メスの代わりに）等の非常に精密な外科的作業にも使用され得る。いくつかの異なる種類のレーザーが存在するが、医学分野で３種類のみが広く使用されている。二酸化炭素（ＣＯ２）レーザー：このタイプのレーザーは、深層を貫通することなく皮膚表面から薄層を取り除くことができる。この技法は、皮膚の深部に広がっていない腫瘍及びある特定の前がん性状態を治療する際に特に有用である。伝統的な外科用メス手術の代替案として、ＣＯ２レーザーも皮膚を切断することができる。レーザーをこの方法で使用して、皮膚がんを取り除く。ネオジム：イットリウム－アルミニウム－ガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）レーザー：このレーザーからの光は、他のタイプのレーザーよりも深く組織に透過することができ、血液を素早く凝固させることができる。これは、光ファイバーを通じて身体の到達しにくい部分に運ばれる。このタイプのレーザーは、咽喉がんの治療に使用されることもある。アルゴンレーザー：このレーザーは、組織の表層のみを通過することができ、したがって、皮膚科学及び眼の手術に有用である。これは、光線力学的療法（ＰＤＴ）として既知の手技において腫瘍を治療するために感光性色素とともに使用される。レーザーは、以下を含む標準の手術道具に優るいくつかの利点を有する。レーザーは、外科用メスよりも精密である。周辺皮膚又は他の組織とほとんど接触しないため、切開付近の組織が保護される。レーザーによって生成された熱が手術部位を滅菌するため、感染の危険性を低下させる。レーザーの精度がより小さい切開を可能にするため、より短い手術時間しか要しない場合がある。多くの場合、治癒時間が短縮され、レーザー熱が血管を閉鎖するため、出血、腫脹、又は瘢痕が軽減される。レーザー手術はあまり複雑ではない場合がある。例えば、光ファイバーを用いて、レーザー光は、大きく切開することなく、身体部分に方向付けられ得る。より多くの手技が外来で行われ得る。レーザーを２つの方法で使用して、すなわち、熱で腫瘍を縮小若しくは破壊することによって、又はがん細胞を破壊する感光剤として既知の化学物質を活性化することによって、がんを治療することができる。ＰＤＴでは、感光剤はがん細胞で保持され、がん細胞を死滅させる反応を引き起こす光によって刺激され得る。ＣＯ２及びＮｄ：ＹＡＧレーザーは、腫瘍を縮小又は破壊するために使用される。これらは、医師が膀胱等の身体のある特定の領域を覗き込むことを可能にする管である内視鏡とともに使用され得る。いくつかのレーザーからの光は、光ファイバーを装着したフレキシブル内視鏡を通して伝達される。これにより、医師が手術を除いては別様に到達することのできない身体部分を見て作業することが可能になり、それ故に、レーザービームの非常に精密な照準が可能になる。レーザーは、低出力顕微鏡とともに使用される場合もあり、医師は治療をされている部位をはっきりと見ることができる。他の器具とともに使用して、レーザーシステムは、極細糸の幅未満である直径最小２００ミクロンの切断領域を生成することができる。レーザーは、多くのがんタイプを治療するために使用される。レーザー手術は、声門（声帯）がん、子宮頸がん、皮膚がん、肺がん、膣がん、外陰がん、及び陰茎がんのある特定の病期に対する標準の治療である。がんを破壊するための使用に加えて、レーザー手術は、がんによって引き起こされる症状の緩和（緩和ケア）を助けるためにも使用される。例えば、レーザーを使用して、患者の気管（ｔｒａｃｈｅａ）（気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ））を封鎖している腫瘍を縮小又は破壊し、呼吸を容易にすることができる。これは、結腸直腸がん及び肛門がんの緩和に使用されることもある。レーザー誘起間質温熱療法（ＬＩＴＴ）は、レーザー療法における最新の開発のうちの１つである。ＬＩＴＴは、熱が、細胞を損傷するか、又はそれらが生きるのに必要な物質をそれらから取り除くことによって腫瘍を縮小させる助けとなり得る、温熱療法と呼ばれるがん治療と同じ発想を使用する。この治療では、レーザーは、体内の間質領域（臓器間の領域）に方向付けられる。その後、レーザー光が腫瘍の温度を上昇させ、これにより、がん細胞が損傷又は破壊される。
療法を用いた治療の持続期間及び／又は用量は、特定の治療薬又はそれらの組み合わせによって異なり得る。当業者であれば、特定のがん治療薬の適切な治療時間を理解するであろう。本発明は、各がん治療薬の最適治療スケジュールの継続的な評価を企図し、ここで、本発明の方法によって決定される対象のがんの表現型が、最適治療用量及びスケジュールを決定する要因である。
ポリヌクレオチドを哺乳動物、ヒト、若しくは非ヒト、又はそれらの細胞に導入するための任意の手段は、本発明の様々な構築物を対象とするレシピエントに送達するための本発明の実施に適応され得る。本発明の一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、トランスフェクションによって、すなわち、「ネイキッド」ＤＮＡの送達によって、又はでコロイド分散系との複合体で細胞に送達される。コロイド系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系、例えば、水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合体化ＤＮＡ又はリポソーム製剤化ＤＮＡである。前者のアプローチでは、例えば、脂質でのＤＮＡの製剤化の前に、所望のＤＮＡ構築物を有するトランス遺伝子を含むプラスミドが発現（例えば、イントロンの５’非翻訳領域への包含及び不要な配列の排除（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １２６－１３９，１９９５）について最初に実験的に最適化され得る。その後、例えば、様々な脂質又はリポソーム材料でのＤＮＡの製剤化が、既知の方法及び材料を使用して達成され得、レシピエント哺乳動物に送達され得る。例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １０：２４－２９，１９９４、Ｔｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６８、Ａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．５：１３５－１４２，１９９３、及びＣａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６７９，６４７号を参照のこと。
リポソームの標的は、解剖学的要因及び機構的要因に基づいて分類され得る。解剖学的分類は、選択性レベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的、及び細胞小器官特異的に基づいている。機構的標的は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別され得る。受動的標的は、洞様毛細血管を含む臓器内の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの生来の傾向を利用する。その一方で、能動的標的は、天然に存在する局在化部位以外の臓器及び細胞型への標的を達成するために、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質、若しくはタンパク質等の特異的リガンドに結合することによる、又はリポソームの組成又はサイズを変化させることによるリポソームの改変を伴う。
標的とされた送達系の表面は、様々な方法で修飾され得る。リポソーム標的送達系の場合、脂質基は、標的リガンドをリポソーム二重層と安定した会合で維持するために、リポソームの脂質二重層に組み込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドに連結するために様々な連結基が使用され得る。送達ビヒクル、例えば、リポソームと会合したネイキッドＤＮＡ又はＤＮＡは、対象におけるいくつかの部位に投与され得る（以下を参照のこと）。
核酸は、任意の所望のベクターで送達され得る。これらには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びプラスミドベクターを含むウイルス又は非ウイルスベクターが含まれる。例示のウイルスタイプには、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、及びＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が挙げられる。核酸は、十分に効率的な送達レベルを提供する任意の所望の形式で、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子で投与され、ポリマーに複合体化され得る。
目的とするタンパク質又は核酸をコードする核酸は、プラスミド若しくはウイルスベクター、又は当該技術分野で既知の他のベクターに存在し得る。かかるベクターは周知であり、任意のベクターが特定の用途のために選択され得る。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーター及びデメチラーゼコーディング配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーター及び細胞増殖によって活性化されるプロモーター、例えば、チミジンキナーゼ及びチミジル酸シンターゼプロモーターである。他の好ましいプロモーターには、ウイルス感染によって活性化可能なプロモーター、例えば、α－及びβ－インターフェロンプロモーター、並びにエストロゲン等のホルモンによって活性化可能なプロモーターが含まれる。使用され得る他のプロモーターには、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、及びマウスアルブミンプロモーターが含まれる。プロモーターは、構成的又は誘導性であり得る。
別の実施形態では、ネイキッドポリヌクレオチド分子が、ＷＯ９０／１１０９２及び米国特許第５，５８０，８５９号に記載されるように遺伝子送達ビヒクルとして使用される。かかる遺伝子送達ビヒクルは、成長因子ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかであり得、ある特定の実施形態では、死滅アデノウイルスに連結される。Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７－１５４，１９９２。任意に使用され得る他のビヒクルには、ＤＮＡ－リガンド（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５－１６９８７，１９８９）、脂質－ＤＮＡの組み合わせ（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３ ７４１７，１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７８５１－７８５５，１９８７）、及びマイクロプロジェクタイル（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６－２７３０，１９９１）が含まれる。
遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス複製起源又はパッケージングシグナル等のウイルス配列を任意に含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、又はアデノウイルス等のウイルスから選択され得る。好ましい実施形態では、成長因子遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルス及びその様々な使用は、例えば、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：１５３，１９８３、Ｃａｎｅ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６３４９，１９８４、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５－１４，１９９０、米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、及び同第４，９８０，２８９号、並びにＰＣＴ出願第８９／０２，４６８号、同第８９／０５，３４９号、及び同第９０／０２，８０６号を含む、多数の参考文献に記載されている。例えば、ＥＰ０，４１５，７３１、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、米国特許第５，２１９，７４０号、ＷＯ９３１１２３０、ＷＯ９３１０２１８、Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０－３８６４，１９９３、Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２－９６７，１９９３、Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８，１９９３、Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３－５０３，１９９２、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９－７３５，１９９３（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１，ＥＰ０，３４５，２４２、及びＷＯ９１／０２８０５）に記載のものを含む、多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが、本発明で利用され得る。本発明のポリヌクレオチドを送達するために使用され得る他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（１９９７年５月２０日に発行されたＷｏｏ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６３１，２３６号、及びＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８）Ｒｉｄｇｅｗａｙ，“Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｉｎ：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ Ｌ，Ｄｅｎｈａｒｄｔ Ｄ Ｔ，ｅｄ．Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ（１９８６）“Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎｅｓ，”Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ，ｅｄ．Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ，６８：１－１０）、及びいくつかのＲＮＡウイルスに由来している。好ましいウイルスには、アルファウイルス、ポキシウイルス、アレナウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。それらは、様々な哺乳類細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５－１２８１、Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８（上記参照）、Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６（上記参照）、Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．１９８８、Ｈｏｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：６４２－６５０）。
他の実施形態では、ゲノム中の標的ＤＮＡは、当該技術分野で周知の方法を使用して操作され得る。例えば、ゲノム中の標的ＤＮＡは、欠失、挿入、及び／又は変異によって操作され得、これらは、レトロウイルス挿入、人工染色体技法、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターによるランダム挿入、遺伝子標的、転移性因子、及び／又は外来ＤＮＡを導入するための若しくは修飾ＤＮＡ／修飾核ＤＮＡを産生するための任意の他の方法である。他の修飾技法は、ＤＮＡ配列をゲノムから欠失させること及び／又は核ＤＮＡ配列を改変することを含む。例えば、核ＤＮＡ配列は、部位特異的変異誘発によって改変され得る。
他の実施形態では、組換えバイオマーカーポリペプチド及びそれらの断片が対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、増強された生物学的特性を有する融合タンパク質が構築及び投与され得る。加えて、バイオマーカーポリペプチド及びその断片は、増加したバイオアベイラビリティ及び減少したタンパク質分解等の望ましい生物学的活性を更に増強するために、当該技術分野で周知の薬理学的方法（例えば、ペグ化、グリコシル化、オリゴマー化等）に従って修飾され得る。
ＶＩＩ．臨床的有効性
臨床的有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって測定され得る。例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療などの療法に対する応答は、がん、例えば、腫瘍のその療法に対する任意の応答、好ましくは、ネオアジュバント又はアジュバント化学療法の開始後の腫瘍質量及び／又は体積の変化に関連する。腫瘍応答は、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、又は触診によって測定される全身介入後の腫瘍サイズが初期サイズ及び寸法と比較され得るネオアジュバント又はアジュバント状況下で評価され得、腫瘍の細胞充実度が組織学的に推定され得、治療開始前に採取された腫瘍生検の細胞充実度と比較され得る。応答は、生検又は外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定又は病理学的試験によっても評価され得る。応答は、腫瘍体積若しくは細胞充実度のパーセンテージ変化等の定量様式で記録され得るか、又は残留がん組織量等の半定量スコア化システム（Ｓｙｍｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００７）２５：４４１４－４４２２）若しくはミラー・ペインスコア（Ｏｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｒｅａｓｔ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）１２：３２０－３２７）を使用して、「病理学的完全応答」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、又は他の質的基準等の質的様式で記録され得る。腫瘍応答の評価は、ネオアジュバント又はアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、又は好ましくは数ヶ月後に行われ得る。応答評価の典型的なエンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終了時又は残留腫瘍細胞及び／若しくは腫瘍床の外科的除去時である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的治療の臨床的有効性は、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することによって決定され得る。臨床的有用率は、療法終了の少なくとも６ヶ月後の時点での完全寛解（ＣＲ）にある患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）にある患者の数、及び安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の合計を決定することによって測定される。この公式の省略表現は、６ヶ月にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。いくつかの実施形態では、特定の抗免疫チェックポイント治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又はそれ以上である。
抗免疫チェックポイント療法などの免疫療法に対する応答を評価するための追加の基準は、「生存期間」に関連し、これには、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、又は腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（病という用語は、がん及びそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時又は治療開始時）及び終了点（例えば、死、再発、又は転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、及び腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。
例えば、適切な閾値を決定するために、特定の抗がん治療レジメンが対象集団に投与され得、転帰が、抗免疫チェックポイント療法などの任意の免疫療法の投与前に決定されたバイオマーカー測定値と相関され得る。転帰測定値は、ネオアジュバント状況で施される療法に対する病理学的応答であり得る。あるいは、バイオマーカー測定値が既知である免疫療法後の対象について、全生存期間及び無病生存期間などの転帰測定値がある期間にわたって監視され得る。特定の実施形態では、同じ用量の免疫療法剤が、もしあれば、各対象に投与される。関連実施形態では、投与される用量は、免疫療法で使用される薬剤の当該技術分野で既知の標準用量である。対象が監視される期間は異なり得る。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０ヶ月間監視され得る。免疫療法の転帰と相関するバイオマーカー測定閾値は、実施例の節に記載の方法などの方法を使用して決定され得る。
ＶＩＩＩ．本発明の更なる使用及び方法
本明細書に記載の組成物は、様々な診断用途、予後用途、及び治療用途で使用することができる。診断方法、予後予測方法、治療方法、又はそれらの組み合わせなどの本明細書に記載の任意の方法では、方法の全てのステップは、単一の作用素によって、又は代替的に、複数の作用素によって行われ得る。例えば、診断は、治療的治療を提供する作用素によって直接行われ得る。あるいは、治療剤を提供する人は、診断アッセイが行われることを要求することができる。診断士及び／又は治療介入者は、診断アッセイ結果を解釈して治療戦略を決定することができる。同様に、かかる代替プロセスは、予後アッセイなどの他のアッセイに適用することができる。
ａ．スクリーニング方法 本発明の一態様は、非細胞ベースのアッセイ及び異種移植片動物モデルアッセイを含む、スクリーニングアッセイに関する。一実施形態では、これらのアッセイは、異種移植片動物モデルアッセイを使用することによってヒトなどにおける表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療にがんが応答する可能性があるかを特定し、かつ／又は薬剤が表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療に応答する可能性の低いがん細胞の成長を阻害するか、又はそれを死滅させることができるかを特定するための方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、本明細書（例えば、表、図、実施例、又は本明細書の他の箇所）に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに結合するか、又はその生物学的活性を調節する試験薬剤をスクリーニングするためのアッセイに関する。一実施形態では、かかる薬剤を特定するための方法は、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを調節する、例えば、阻害する薬剤の能力の決定を伴う。
一実施形態では、アッセイは、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを試験薬剤と接触させることと、以下に記載されるように基質の直接結合を測定すること又は間接的パラメータを測定すること等によって、バイオマーカーの酵素活性を調節する（例えば、阻害する）試験薬剤の能力を決定することとを含む、無細胞アッセイ又は細胞ベースのアッセイである。
例えば、直接結合アッセイでは、結合が複合体中の標識タンパク質又は分子を検出することによって決定され得るように、バイオマーカータンパク質（又はそれらのそれぞれの標的ポリペプチド又は分子）が放射性同位体又は酵素標識にカップリングされ得る。例えば、標的は、直接的又は間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで標識され得、放射性同位体が放射線放出の直接計数又はシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは、標的は、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識され得、酵素標識が適切な基質の産物への変換の決定によって検出され得る。バイオマーカーと基質との間の相互作用の決定が標準の結合又は酵素分析アッセイを使用して達成される場合もある。上述のアッセイ方法の１つ以上の実施形態では、ポリペプチド又は分子を固定化して、タンパク質又は分子の一方又は両方の複合体形成されていない形態からの複合体形成された形態の分離を促進し、かつアッセイの自動化を適応させることが望ましくあり得る。
試験薬剤の標的への結合は、反応物を収容するのに好適な任意の容器内で達成され得る。かかる容器の非限定的な例には、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管が挙げられる。本明細書に記載の抗体の固定化された形態は、多孔性、微孔性（約１ミクロン未満の平均細孔径を有する）又はマクロ多孔性（約１０ミクロン超の平均細孔径を有する）材料、例えば、膜、セルロース、ニトロセルロース、又はガラス繊維；ビーズ、例えば、アガロース若しくはポリアクリルアミド若しくはラテックス製のもの；又は皿、プレート、若しくはウェルの表面、例えば、ポリスチレン製のもの等の固相に結合した抗体も含み得る。
代替の実施形態では、バイオマーカーと基質又はバイオマーカーとその天然結合パートナーとの間の相互作用を調節する薬剤の能力決定は、シグナル伝達経路（例えば、フィードバックループ）内のその位置の下流又は上流で機能するポリペプチド又は他の産物の活性を調節する試験薬剤の能力を決定することによって達成され得る。かかるフィードバックループは当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ（２００９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｒｅｓ．２：１－１９を参照のこと）。
本発明は更に、上述のスクリーニングアッセイによって特定された新規の薬剤に関する。したがって、本明細書に記載されるように特定された薬剤を適切な動物モデル等に更に使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように特定された薬剤が動物モデルに使用されて、かかる薬剤での治療の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載されるように特定された抗体が動物モデルに使用されて、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。
ｂ．予測医学
本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、及び臨床試験の監視が予後（予測）目的で使用され、それによって個体を予防的に治療する、予測医学の分野にも関する。したがって、本発明の一態様は、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、又は組織）の観点で本明細書に記載のバイオマーカーの量及び／又は活性を決定し、それによって、がんに罹患した個体が、がんなどにおいて、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療に応答する可能性が高いかどうかを決定するための診断アッセイに関する。かかるアッセイは、予後目的若しくは予測目的のみに使用されてもよく、又は治療介入と組み合わせて、それによって、バイオマーカーポリペプチド、核酸発現若しくは活性によって特徴付けられるか、又はこれらに関連する障害の発症前又は再発後の個体を予防的に治療してもよい。当業者であれば、任意の方法が、表、図、実施例、及び本明細書に記載されるその他のものなどの本明細書に記載されるバイオマーカーのうちの１つ以上（例えば、組み合わせ）を使用することができることを理解するであろう。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のバイオマーカーの発現又は活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物、及び小核酸系分子）の影響を監視することに関する。これら及び他の薬剤については、以下の章に更に詳細に記載されている。
当業者は、特定の実施形態では、本発明の方法が、コンピュータプログラム及びコンピュータシステムを実装することも理解するであろう。例えば、コンピュータプログラムを使用して、本明細書に記載のアルゴリズムを実行することができる。コンピュータシステムはまた、本発明の方法を実装する際にコンピュータシステムによって使用することができる複数のバイオマーカーシグナルの変化／プロファイルを含む、本発明の方法によって生成されるデータを記憶し、操作することができる。特定の実施形態では、コンピュータシステムは、バイオマーカー発現データを受信し、（ｉｉ）データを記憶し、（ｉｉｉ）本明細書に記載の任意の数の様式でデータを比較し（例えば、適切な対照と比較した分析）、がん性又は前がん性組織からの有益なバイオマーカーの状態を決定する。他の実施形態では、コンピュータシステムは、（ｉ）決定された発現バイオマーカーレベルを閾値と比較し、（ｉｉ）上述のバイオマーカーレベルが閾値を有意に調節されるか（例えば、閾値を上回るか、又は下回るか）、又は上述の適応症に基づく表現型の指標を出力する。
特定の実施形態では、かかるコンピュータシステムもまた、本発明の部分とみなされる。多数の種類のコンピュータシステムを使用して、バイオインフォマティクス及び／又はコンピュータ技術分野の当業者によって所持される知識に従って、本発明の分析方法を実装することができる。そのようなコンピュータシステムの動作中に、いくつかのソフトウェアコンポーネントをメモリにロードすることができる。ソフトウェアコンポーネントは、当該技術分野で標準であるソフトウェアコンポーネントと、本発明に特有のコンポーネント（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０，１２３３－１２４０に記載されるｄＣＨＩＰソフトウェア、当該技術分野で既知の放射基底関数に基づく機械学習アルゴリズム（ＲＢＭ））の両方を含んでいてもよい。
本発明の方法はまた、使用される特定のアルゴリズムを含め、方程式の記号入力及び処理の高レベル仕様を可能にする数学的ソフトウェアパッケージでプログラム化又はモデル化されてもよく、それによって、個々の方程式及びアルゴリズムを手順的にプログラミングする必要性からユーザを解放する。かかるパッケージには、例えば、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（ネイティック、マサチューセッツ）製のＭａｔｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（シャンペーン、イリノイ）製のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、又はＭａｔｈＳｏｆｔ（シアトル、ワシントン）製のＳ－Ｐｌｕｓが挙げられる。
特定の実施形態では、コンピュータは、バイオマーカーデータを保存するためのデータベースを含む。そのような記憶されたプロファイルにアクセスし、後の時間点で目的の比較を実行するために使用することができる。例えば、対象の非がん性組織に由来する試料のバイオマーカー発現プロファイル、及び／又は同じ種の関連する集団における目的の情報遺伝子座の集団に基づく分布から生成されるプロファイルが保存され、その後、その対象のがん性組織又はその対象のがん性であると疑われる組織に由来する試料のプロファイルと比較することができる。
本明細書に記載される例示的なプログラム構造及びコンピュータシステムに加えて、当業者には、他の代替的なプログラム構造及びコンピュータシステムが容易に明らかになるであろう。したがって、上述のコンピュータシステム及びプログラム構造から精神的又は範囲的のいずれかに逸脱しないそのような代替システムは、添付の特許請求の範囲内であると理解されることが意図されている。
ｃ．診断アッセイ
本発明は、生体試料が、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療に応答する可能性が高いがんに関連しているかを正確に分類するための方法、システム、及びコードを部分的に提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、統計的アルゴリズム及び／又は経験的データ（例えば、表、図、実施例、及び他の方法で本明細書に記載されるものなどの本明細書に記載されるバイオマーカーの量又は活性）を使用して、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療に関連するか、又は応答するか、若しくは応答しない危険性があるものとして試料（例えば、対象由来）を分類するのに有用である。
本明細書に記載されるバイオマーカーの量又は活性を検出し、したがって、ある試料が、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療に応答する可能性が高いか、又は応答する可能性が低いかを分類するのに有用な例示的方法は、試験対象から生体試料を得ることと、生体試料と薬剤、例えば、生体試料中のバイオマーカーの量又は活性を検出することができる、抗体若しくはその抗原結合断片のようなタンパク質結合剤、又はオリゴヌクレオチドのような核酸結合剤とを接触させることと、を伴う。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片が使用され、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のかかる抗体又は抗体断片が組み合わせで（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡで）又は順次に使用され得る。ある特定の例では、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計的分類子システムである。例えば、単一の学習統計的分類システムを使用して、予測値又は確率値、及びバイオマーカーの存在又はレベルに基づくものとして試料を分類することができる。単一の学習統計的分類システムの使用により、典型的には、試料を、例えば、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の感受性、特異性、陽性予測値、陰性予測値、及び／又は全体的な精度を有する免疫療法レスポンダー又はプログレッサー試料である可能性が高いと分類する。
他の好適な統計的アルゴリズムが当業者に周知である。例えば、学習統計的分類子システムは、複雑なデータセット（例えば、目的とするマーカーのパネル）に適合し、かかるデータセットに基づいて決定することができる機械学習アルゴリズム技法を含む。いくつかの実施形態では、分類ツリー（例えば、ランダムフォレスト）等の単一の学習統計的分類子システムが使用される。他の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の学習統計的分類子システムの組み合わせが、好ましくは直列で使用される。学習統計的分類子システムの例には、帰納的学習（例えば、ランダムフォレスト、分類及び回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）、ブーストツリー等の決定／分類ツリー）、確率的に近似的に正しい（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、多層パーセプトロン等のパーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの適用、信念ネットワークにおけるベイズ学習等）、強化学習（例えば、ナイーブ学習、適応動的学習、及び時間差学習等の既知の環境における受動的学習、未知の環境における受動的学習、未知の環境における能動的学習、学習行動値関数、強化学習の適用等）、並びに遺伝的アルゴリズム及び進化的プログラミングを使用したものが挙げられるが、これらに限定されない。他の学習統計的分類子システムは、サポートベクトルマシン（例えば、カーネル法）、多変量適応型回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、レーベンバーグ・マーカートアルゴリズム、ガウス・ニュートンアルゴリズム、ガウスの混合（ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎｓ）、勾配降下アルゴリズム、及び学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）を含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、試料分類結果を臨床医、例えば、腫瘍学者に送信することを更に含む。
別の実施形態では、対象の診断に続いて、個体に、診断に基づいて、治療有効量の定義された治療の投与が行われる。
一実施形態では、本方法は、対照生体試料（例えば、がんを有しないか、若しくはがんが、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療に感受性である対象由来の生体試料）、寛解中の対象由来の生体試料、又は表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法併用治療にもかかわらず進行するがんを発達させるための治療中の対象由来の生体試料を得ることを更に伴う。
ｄ．予後アッセイ
更に、本明細書に記載される診断法は、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤及び免疫療法併用治療に応答する可能性が高いか、若しくは応答する可能性が低いがんを有するか、又はそれを発症する危険性がある対象を特定するために利用され得る。前述の診断アッセイ又は以下のアッセイ等の本明細書に記載のアッセイを利用して、本明細書に記載される少なくとも１つのバイオマーカーの量又は活性の誤制御に関連する障害を（例えば、がんにおいて）有するか、又はその状態が発生する危険性がある対象を特定することができる。あるいは、予後アッセイを利用して、本明細書に記載される少なくとも１つのバイオマーカーの誤制御に関連する障害を（例えば、がんにおいて）有するか、又はその状態が発生する危険性がある対象を特定することができる。更に、本明細書に記載の予後アッセイを使用して、対象に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬物候補）を投与して、異常なバイオマーカー発現又は活性に関連する疾患又は障害を治療することができるかどうかを決定することができる。
ｅ．治療方法
表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法の組み合わせなどの、本明細書に記載の治療組成物を、本明細書に記載の製剤及び／又は組み合わせを使用して、種々のインビトロ及びインビボでの治療用途で使用することができる。一実施形態では、治療薬を使用して、それに応答すると決定されたがんを治療することができる。例えば、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの阻害剤、及び免疫療法の両方を阻害又は遮断する単一又は複数の薬剤を使用して、それに応答する可能性が高いと特定された対象におけるがんを治療することができる。
本発明の調節方法は、免疫細胞などの細胞と、かかる１つ以上のバイオマーカー及び／又は免疫療法、例えば、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１）の発現及び／又は活性を阻害又は遮断する薬剤とを接触させることを伴う。かかる方法に有用な例示的な薬剤は、上で説明されている。かかる薬剤は、インビトロ若しくはエクスビボで（例えば、細胞を薬剤と接触させることによって）、又はあるいはインビボで（例えば、薬剤を対象に投与することによって）で投与され得る。したがって、本発明は、免疫応答の増加から利益を受け得る状態、例えば、感染症又は結腸直腸がんのようながんに罹患している個体を治療するために有用な方法を提供する。
免疫応答を上方制御する薬剤は、既存の免疫応答を増強する形態又は初期免疫応答を誘発する形態であり得る。したがって、本主題の組成物及び方法を使用して免疫応答を増強させることは、がんを治療するのに有用であるだけではなく、感染症（例えば、細菌、ウイルス、又は寄生虫）、寄生虫感染症、及び免疫抑制性疾患を治療するのにも有用であり得る。
例示的な感染性障害としては、ヘルペス又は帯状疱疹などのウイルス性皮膚疾患が挙げられ、その場合、かかる薬剤は皮膚に局所的に送達され得る。加えて、全身性ウイルス疾患、例えば、インフルエンザ、一般的な風邪、及び脳炎は、かかる薬剤の全身投与によって軽減され得る。好ましい一実施形態では、本明細書に記載の免疫応答を上方制御する薬剤は、寄生虫に対する保護性免疫応答を促進するために、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ感染症の間のアルギナーゼ／ｉＮＯＳバランスを調節するのに有用である。
免疫応答はまた、エクスビボでのアプローチによって、例えば、患者から免疫細胞を除去し、免疫細胞を本明細書に記載の薬剤とインビトロで接触させ、インビトロで刺激された免疫細胞を患者に再導入することによって、感染した患者において増強され得る。
ある特定の例では、免疫応答を更に増強するために、免疫応答を上方制御する他の薬剤、例えば、共刺激受容体を介してシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーメンバーの形態を更に投与することが望ましくあり得る。かかる追加の薬剤及び療法については、以下に更に記載される。また、免疫応答を上方制御する薬剤が様々なポリペプチド（例えば、病原体に由来するポリペプチド）に対するワクチンにおいて予防的に使用され得る。病原体（例えば、ウイルス）に対する免疫は、適切なアジュバントにおいて免疫応答を上方制御する薬剤とともにウイルスタンパク質をワクチン接種することによって誘導され得る。
別の実施形態では、本明細書に記載の免疫応答機能の上方制御又は増強は、腫瘍免疫の誘導に有用である。
別の実施形態では、免疫応答は、既存の耐性、クローン欠失、及び／又は疲弊（例えば、Ｔ細胞疲弊）が克服されるように、本明細書に記載の方法によって刺激され得る。例えば、対象が有意な免疫応答を開始することができない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原等の自己抗原に対する免疫応答は、免疫応答を上方制御する本明細書に記載の適切な薬剤を投与することによって誘導され得る。一実施形態では、腫瘍特異的抗原等の自己抗原が同時投与され得る。別の実施形態では、主題の薬剤は、能動免疫化の過程で外来抗原に対する応答を高めるためのアジュバントとして使用され得る。
一実施形態では、免疫細胞は、対象から得られ、本明細書に記載の薬剤の存在下、エクスビボで培養され、免疫細胞の集団を肥大させ、かつ／又は免疫細胞活性化を増強する。更なる実施形態では、免疫細胞は、次いで、対象に投与される。免疫細胞は、当該技術分野で知られているように、例えば、免疫細胞に一次活性化シグナル及び共刺激シグナルを提供することによって、インビトロで刺激され得る。様々な薬剤を使用して、免疫細胞の増殖を共刺激することもできる。一実施形態では、免疫細胞は、ＰＣＴ出願第９４／２９４３６号に記載の方法に従って、エクスビボで培養される。共刺激ポリペプチドは、可溶性であってもよく、細胞膜に付着していてもよく、又はビーズ等の固体表面に付着していてもよい。
ＩＸ．薬剤の投与
本発明によって包含される免疫調節剤は、免疫細胞媒介性免疫応答を増強するために、インビボでの医薬品投与に好適な生物学的に適合性の形態で対象に投与される。「インビボでの投与に好適な生物学的に適合性の形態」とは、いずれの毒性作用もタンパク質の治療効果を上回る、投与されるタンパク質の形態を意味する。「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る生きている生物、例えば、哺乳動物を含むよう意図されている。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。本明細書に記載の薬剤の投与は、薬剤の治療的に活性な量を単独で又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含む任意の薬理学的形態であり得る。
本発明の治療的組成物の治療的に活性な量の投与は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の結果を達成するのに有効な量として定義される。例えば、薬剤の治療的に活性な量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重等の因子、並びに個体に所望の応答を誘発するペプチドの能力により異なり得る。投薬量レジメンは、最適治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの分割用量が１日１回投与され得るか、又は用量は、治療状況の緊急事態によって示されるように比例的に減少し得る。
単独で、又は免疫療法と組み合わせて、表１～５に列挙される１つ以上のバイオマーカーの発現及び／又は活性を阻害又は遮断することは、本明細書に記載の調節剤との併用療法によって達成することができる。併用療法は、１つ以上のバイオマーカーが免疫療法と同時に阻害又は遮断される療法を記載する。これは、本明細書に記載の調節剤を免疫療法と同時に（例えば、併用剤形で、又は単一の薬剤を同時に投与することによって）投与することによって、又は患者に同時に存在する各調節剤の有効量をもたらすスケジュールに従って、かかる１つ以上のバイオマーカー及び免疫療法のための単一の阻害剤を投与することによって達成され得る。
本明細書に記載の治療剤は、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮適用、又は直腸投与などの簡便な様式で投与され得る。投与経路に応じて、活性化合物は、化合物を不活性化し得る酵素、酸、及び他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。例えば、薬剤の投与について、非経口投与以外の方法により、薬剤をその不活性化を阻止するための材料でコーティングするか、又は薬剤をその材料と同時投与することが望ましくあり得る。
薬剤は、個体に、適切な担体、希釈剤、若しくはアジュバント中で投与されるか、酵素阻害剤と同時投与されるか、又はリポソーム等の適切な担体中で投与される。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝溶液が含まれる。アジュバントは、その最も広い意味で使用され、インターフェロン等の任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書で企図されるアジュバントには、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＥＰ）、及びトラジロールが含まれる。リポソームには、水中油中水乳剤、並びに従来のリポソーム（Ｓｔｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）が含まれる。
以下で詳細に説明されるように、本発明の薬学的組成物は、以下のために適合されたものを含め、固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化されてもよい。（１）経口投与、例えば、ドレンチ（水性若しくは非水性の溶液若しくは懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト、（２）非経口投与、例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液としての皮下、筋肉内、又は静脈内注射によるもの、（３）局所投与、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、若しくはスプレーとしてのもの、（４）膣内若しくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム、又はフォームとしてのもの、あるいは（５）エアロゾル、例えば、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物、又は固体粒子。
本明細書において、「薬学的に許容される」という語句は、理にかなった医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症がなく、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適したそれらの薬剤、材料、組成物、及び／又は投薬形態を指すために用いられる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、ある臓器又は身体の一部から別の臓器又は身体の一部へと、対象の化学物質を運ぶか、又は輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクル、例えば、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又はカプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、対象に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能できる材料の例には、（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及びスクロース、（２）デンプン類、例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン、（３）セルロース、及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース、（４）トラガカント末（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばカカオバター及び坐剤ワックス、（９）油類、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油、（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール、（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール、（１２）エステル類、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び（２１）薬学的製剤に使用される他の非毒性適合物質、が含まれる。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明によって包含されるバイオマーカーの発現及び／又は活性、又は複合体の発現及び／又は活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤の比較的非毒性の無機及び有機の酸付加塩を指す。これらの塩は、治療薬の最終的な単離及び精製中に、又はその遊離塩基形態での精製された治療薬と好適な有機若しくは無機の酸とを別個に反応させ、そのようにして生成した塩を単離することによって、系中で調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩等が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９も参照のこと）。
他の場合では、本発明の方法で有用な薬剤は、１つ以上の酸性官能基を含んでいてもよいため、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの場合における「薬学的に許容される塩」という用語は、バイオマーカーの発現及び／又は活性、又は複合体の発現及び／又は活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤の比較的非毒性の無機及び有機の塩基付加塩を指す。これらの塩は、同様に、治療薬の最終的な単離及び精製中に、又はその遊離酸形態での精製された治療薬と好適な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩と、アンモニアと、又は薬学的に許容される有機の一級、二級若しくは三級アミンとを別個に反応させることによって、系中で調製することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミ塩等が挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照）。湿潤剤、乳化剤及びラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、香味料及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等、（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロール等、及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が含まれる。
本発明の方法に有用な製剤には、経口、鼻、局所（頬及び舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾル及び／又は非経口投与に好適な製剤が含まれる。製剤は、単位投与形態で簡便に提供されてもよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単回投与形態を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主、特定の投与方法に応じて変化する。単回投与形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、有効成分の約１パーセント～約９９パーセント、好ましくは約５パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント～約３０パーセントの範囲である。
これらの製剤又は組成物を調製する方法は、バイオマーカーの発現及び／又は活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤と、担体及び任意に１つ以上の付随成分とを会合させるステップを含む。一般に、製剤は、治療薬と、液体担体、又は精密に分割した固体担体、又はその両方とを均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって調製される。
経口投与に適した製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（フレーバーベース、通常、スクロース及びアカシア若しくはトラガカントを使用する）、粉末、顆粒の形態で、又は水性若しくは非水性液体の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型若しくは油中水型液体乳剤として、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤として、又はトローチ剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）（不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン、若しくはスクロース及びアカシアを使用する）として、及び／又は口腔洗浄剤等としてのものであってもよく、各々が有効成分として所定量の治療薬を含有する。化合物は、ボーラス、舐剤又はペーストとして投与することもできる。
経口投与用の固体投与形態（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒等）において、有効成分を、１つ以上の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は以下のいずれか、（１）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸、（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシア、（３）保湿剤、例えばグリセロール、（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（６）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、（８）吸着剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレイ、（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物、並びに（１０）着色剤と混合する。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合、薬学的組成物は、緩衝剤も含み得る。類似のタイプの固体組成物はまた、ラクトース又は乳糖のような賦形剤、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟及び硬充填ゼラチンカプセルの充填剤としても使用できる。
錠剤は、任意に１つ以上の副成分とともに、圧縮又は成形することにより作成できる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤又は分散剤を使用して調製できる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状ペプチド又はペプチド模倣薬の混合物を適切な機械で成形することにより作製することができる。
錠剤、及び他の固体投与形態、例えば、糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒は、任意に、刻み目が付けられているか、又は腸溶性コーティング及び薬学的製剤の分野で知られている他のコーティング等のコーティング及びシェルを伴って調製することができる。それらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを使用して、その中の有効成分の徐放又は制御放出を提供するように製剤化することもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、又は使用直前に滅菌水若しくはいくつかの他の滅菌注射媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌されてもよい。これらの組成物はまた、任意に不透明剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含有していてもよく、任意選択的に遅延様式で、胃腸管の特定の部分でのみ、又は優先的に有効成分を放出する組成物であってもよい。使用可能な包埋組成物の例には、ポリマー物質及びワックスが含まれる。有効成分は、適切な場合、上記の賦形剤の１つ以上を含むマイクロカプセル化形態であってもよい。
経口投与のための液体投薬形態は、薬学的に許容される乳剤、微乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルを含む。有効成分に加えて、液体投薬形態は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油類（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含有し得る。
不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、香味料、着色料、芳香剤及び保存剤などのアジュバントも含むことができる。
懸濁液は、活性薬剤に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、及びそれらの混合物等の懸濁化剤を含有し得る。
直腸又は膣投与のための製剤は、坐剤として提示されてもよく、坐剤は、１つ以上の治療薬と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックス若しくはサリチル酸塩を含む１つ以上の好適な非刺激性賦形剤若しくは担体とを混合することによって調製されてもよく、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸又は膣腔で融解して活性薬剤を放出する。
膣投与に適した製剤には、適切であることが当該技術分野で知られているような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤も含まれる。バイオマーカーの発現及び／又は活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤の局所又は経皮投与のための投与形態としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性要素は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、及び必要とされる可能性のある保存料、緩衝剤、又は噴射剤と混合することができる。
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、治療薬に加えて、賦形剤、例えば、動物性及び植物性脂肪、油類、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物を含有し得る。
粉末及びスプレーは、バイオマーカーの発現及び／又は活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素などの通常の噴射剤、及びブタン及びプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を追加で含有することができる。
あるいは、バイオマーカーの発現及び／又は活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤は、エアロゾルによって投与することができる。これは、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物、又は固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液を使用することができる。超音波式ネブライザは、薬剤が、化合物の分解を引き起こし得る剪断にさらされることを最小限に抑えるため、好ましい。
通常、水性エアロゾルは、薬剤の水溶液又は懸濁液を、従来の薬学的に許容される担体及び安定剤とともに製剤化することによって作製される。担体及び安定剤は、特定の化合物の要求によって異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、又はポリエチレングリコール）、血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン等の無害なタンパク質、グリシン等のアミノ酸、緩衝液、塩、糖又は糖アルコールを含む。エアロゾルは、一般に、等張性溶液から調製される。
経皮パッチは、身体への治療薬の制御された送達を提供するという追加の利点を有する。そのような投与形態は、治療薬を適切な媒体に溶解又は分配することによって作製することができる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通るペプチド模倣薬の流れを増大させることもできる。そのような流れの速度は、速度を制御する膜を提供するか、又はペプチド模倣薬をポリマーマトリックス若しくはゲルに分散させることのいずれかによって制御することができる。眼科製剤、眼軟膏、粉末、溶液なども、本発明の範囲内にあると考えられる。
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、１つ以上の治療薬を、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張性水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液若しくは乳剤、又は使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再構成可能な滅菌粉末と組み合わせて含み、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を対象レシピエントの血液と等張性にする溶質、又は懸濁化剤又は増ちょう剤を含有していてもよい。
本発明の薬学的組成物において用いることができる好適な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルなどが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散液の場合は必要な粒子径の維持、及び界面活性剤の使用により維持できる。
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の活動の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって確実にできる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましいと言える。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤を含めることにより、注射可能な薬剤形態の長期吸収がもたらされ得る。
場合によっては、薬物の効果を延長するために、皮下注射又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、難水溶性である結晶性又は非晶質の液体懸濁液を使用することにより達成できる。その場合、薬物の吸収速度は溶解速度に依存し、次に溶解速度は結晶サイズと結晶形に依存する可能性がある。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解又は懸濁することにより達成される。
注射可能なデポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中でバイオマーカーの発現及び／又は活性を調節する（例えば、阻害する）薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。薬物とポリマーの比率、及び使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御できる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。デポー注射用製剤は、生体組織に適合するリポソーム又はマイクロ乳剤中に薬物を取り込むことによっても調製される。
本発明の治療剤を医薬としてヒト及び動物に投与する場合、治療剤は、そのままで、又は例えば０．１～９９．５％（より好ましくは０．５～９０％）の有効成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する薬学的組成物として与えられ得る。
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬量レベルは、対象に対して毒性であることなく、特定の対象、組成物、及び投与態様にとって所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るように、本発明の方法によって決定され得る。
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子療法ベクターとして使用され得る。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、又は定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：３０５４－３０５７を参照）によって対象に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得るか、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、例えば、レトロウイルスベクターの場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
一実施形態では、本発明によって包含される薬剤は、抗体である。本明細書で定義されるように、抗体の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、約０．００１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１～２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、更により好ましくは約１～１０ｍｇ／ｋｇ、２～９ｍｇ／ｋｇ、３～８ｍｇ／ｋｇ、４～７ｍｇ／ｋｇ、又は５～６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者であれば、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されないある特定の因子が、対象を有効に治療するのに必要な投薬量に影響を及ぼし得ることを理解する。更に、抗体の治療有効量での対象の治療は、単回治療を含み得るか、又は好ましくは一連の治療を含み得る。好ましい例では、対象は、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体で、約１～１０週間、好ましくは２～８週間、より好ましくは約３～７週間、更により好ましくは約４、５、又は６週間にわたって週１回治療される。治療に使用される抗体の有効投薬量が特定の治療の過程にわたって増加又は減少し得ることも理解されるであろう。投薬量の変化により、診断アッセイの結果がもたらされ得る。
Ｘ．単離された修飾ポリペプチド及び複合体
本発明は、部分的に、単離されたポリペプチド及び／又はそれを含む複合体、例えば、表１～５に列挙されるポリペプチドからなる群から選択されるものに関する。いくつかの実施形態では、複合体は、ポリコームリプレッサー複合体（例えば、ＰＲＣ１．１複合体）である。
本発明による使用のための複合体は、別の部分と会合する単一のポリペプチド（例えば、ＵＳＰ７ポリペプチド若しくはその断片）、又は互いに会合し、かつ／若しくは別の部分と会合するポリペプチドの組み合わせ（例えば、ＵＳＰ７サブユニットを含むタンパク質複合体）であり得る。
本発明の一態様では、少なくとも１つのバリアントポリペプチドを含むポリペプチドの複合体を含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも１つのバリアントアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する変異体ペプチドである。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、複合体中の他のポリペプチドが由来する種とは異なる種における野生型ポリペプチドである。特定の実施形態では、単離されたポリペプチドは、野生型又は野生型配列に対して修飾されるドメインを含む断片のものである。いくつかの実施形態では、単離された修飾ポリペプチド断片は、野生型断片と比較して、活性が低減している。いくつかの実施形態では、単離された修飾断片は、野生型断片と比較して、以下のうちの１つ以上を有する：ａ．任意に、塩基性アミノ酸がアルファらせんの外向き残基である場合、少なくとも１つの塩基性アミノ酸の中性又は酸性アミノ酸への置き換え；ｂ．塩基性アミノ酸がアルファらせんの外向き残基である場合、少なくとも１つの塩基性アミノ酸の欠失；又はｃ．等電点の低減、電荷電位の低減、及び／若しくは正味正電荷の低減。いくつかの実施形態では、単離された断片は、親和性タグ又は標識などの異種アミノ酸配列を更に含む。タグには、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、タンパク質Ｃタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈａｌｏタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ビオチンタグ、及びＶ５タグが含まれ得る。標識は、蛍光タンパク質を含むことができる。
いくつかの実施形態では、上述の断片であり得る修飾サブユニット、又はかかる断片の機能的特性を有するように修飾された全長ポリペプチドを含む、タンパク質複合体が提供される。特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体の少なくとも１つのサブユニットは、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの相同体、誘導体（例えば、機能的に活性な誘導体）、断片（例えば、機能的に活性な断片）である。本発明によって包含される特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの相同体／オルソログ、誘導体、又は断片は、他のサブユニットと複合体を形成することが依然として可能である。複合体形成は、当業者に知られている任意の方法によって試験することができる。かかる方法には、非変性ＰＡＧＥ、ＦＲＥＴ、及び蛍光偏光アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
天然細胞タンパク質複合体のメンバーである相同体（例えば、他の種由来のサブユニットタンパク質をコードする核酸）又は他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングのための当該技術分野で周知の方法を使用して、プローブとしての特定の核酸配列の全て又は一部との低、中、又は高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによって同定及び取得することができる。
例示的な中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである：６Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サーモン精子ＤＮＡで構成される緩衝液中で、ＤＮＡを含有するフィルターの予備ハイブリダイゼーションを６５℃で８時間～一晩実行する。１００μｇ／ｍｌの変性サーモン精子ＤＮＡ及び５～２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有する予備ハイブリダイゼーション混合物中で、フィルターを６５℃で４８時間ハイブリダイズする。２Ｘ ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のＦｉｃｏｌｌ、及び０．０１％のＢＳＡを含有する溶液中で、フィルターの洗浄を３７℃で１時間行う。続いて、オートラジオグラフィーの前に、０．１×ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄する。あるいは、高ストリンジェンシーの例示的な条件は、以下のとおりである：例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中、６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ａｔ ｐ．２．１０．３）。使用され得る高ストリンジェンシーの他の条件は、当該技術分野で周知である。例示的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌの変性サーモン精子ＤＮＡ、及び１０％（重量／体積）デキストラン硫酸塩を含む緩衝液中、４０℃で１８～２０時間のハイブリダイゼーション、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＩ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１．５時間の洗浄、並びに２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＩ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間の洗浄を含む。
特定の実施形態では、サブユニットの相同体は、サブユニットが結合する同じタンパク質に結合する。特定のより具体的な実施形態では、サブユニットの相同体は、サブユニットが結合する同じタンパク質に結合し、相同体とサブユニットの結合パートナーとの間の結合親和性は、サブユニットと結合パートナーとの間の結合親和性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である。タンパク質間の結合親和性は、当業者に知られている任意の方法によって決定することができる。
特定の実施形態では、複合体のタンパク質サブユニットの断片は、天然に存在するタンパク質複合体のタンパク質サブユニットの少なくとも６個の（連続的な）アミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、又は少なくとも５００個のアミノ酸からなる。特定の実施形態では。かかる断片は、４０個以下のアミノ酸、５０個以下のアミノ酸、７５個以下のアミノ酸、１００個以下のアミノ酸、１５０個以下のアミノ酸、２００個以下のアミノ酸、２５０個以下のアミノ酸、３００個以下のアミノ酸、４００個以下のアミノ酸、又は５００個以下のアミノ酸である。より具体的な実施形態では、機能的断片は、本発明によって包含される複合体を形成することができ、すなわち、断片は、依然として少なくとも１つの他のタンパク質サブユニットに結合して、本発明によって包含される複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、若しくは４４以上、又はそれらの間の任意の範囲の同一の領域を共有する断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、このドメインは、野生型ドメインと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれ以上、又はその間の任意の範囲のアミノ酸残基欠失及び／又は変異を含むことができる。
サブユニットタンパク質の誘導体又は類似体としては、様々な実施形態において、同一のサイズのアミノ酸配列にわたって、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％の同一性でサブユニットタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、あるいはアラインメントが当該技術分野で知られているコンピュータホモロジープログラムによって行われるか、又はそのコード核酸が、ストリンジェント、中程度にストリンジェント、若しくは非ストリンジェントな条件下でサブユニットタンパク質をコードする配列にハイブリダイズすることが可能である整列配列と比較した場合の分子が挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質サブユニットの誘導体としては、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの、異種アミノ酸配列への融合タンパク質、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの変異形、及び本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの化学修飾形が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの機能的誘導体は、本発明によって包含される複合体を形成することができ、すなわち、誘導体は、依然として少なくとも１つの他のタンパク質サブユニットに結合して、本発明によって包含される複合体を形成することができる。
本発明によって包含される特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体の少なくとも２つのサブユニットは、少なくとも１つの共有結合を介して互いに連結される。本発明によって包含される複合体のサブユニット間の共有結合は、サブユニットの解離を防止するため、本発明によって包含される複合体の安定性を増加させる。当業者に既知の任意の方法を使用して、本発明によって包含される少なくとも２つのサブユニット間の共有結合を達成することができる。
特定の実施形態では、共有結合架橋は、隣接したサブユニット間に導入される。かかる架橋は、二量体界面の反対側のアミノ酸の側鎖間であり得る。好適な架橋剤と組み合わせた二量体界面におけるアミノ酸残基の任意の官能基を使用して、二量体界面におけるタンパク質サブユニット間の共有結合を作製することができる。二量体界面における既存のアミノ酸を使用することができるか、あるいは、部位特異的変異誘発によって好適なアミノ酸を導入することができる。
例示的な実施形態では、二量体界面の対向する側のシステイン残基が酸化されて、ジスルフィド結合を形成する。例えば、Ｒｅｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ １４：１００７－１０１１の１００８頁を参照のこと。１，３－ジブロモアセトンを使用して、二量体界面における２つのスルフヒドリル基間の不可逆的共有結合を作製することもできる。特定の他の実施形態では、二量体界面でのリジン残基を使用して、複合体のタンパク質サブユニット間の共有結合を作成する。リジン残基のイプシロンアミノ基間の共有結合を作成するために使用され得る架橋剤は、例えば、限定されないが、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ジメチルアジピミデート－２ＨＤ１、グルタル酸ジスクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル２，３－ジブロモプロピオンネートである。
他の特定の実施形態では、２つ以上の相互作用サブユニット、又はその相同体、誘導体、若しくは断片は、ペプチドリンカーを介して直接融合されるか、又は共有結合され、単一の非分岐ポリペプチド鎖を有するハイブリッドタンパク質を形成する。したがって、タンパク質複合体は、ハイブリッドタンパク質の２つの部分間の「分子内相互作用」によって形成され得る。なお別の実施形態では、このタンパク質複合体における融合又は連結した相互作用サブユニットのうちの少なくとも１つは、天然タンパク質の相同体、誘導体、又は断片である。
特定の実施形態では、少なくとも１つのサブユニット、又はその相同体、誘導体、若しくは断片は、異種アミノ酸配列にペプチド結合を介して接合されたサブユニット、相同体、誘導体、又は断片を含む融合又はキメラタンパク質として発現され得る。
本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、サブユニット、又はその断片、相同体、若しくは誘導体に対応するポリペプチド以外のポリペプチド）に作動可能に連結されたサブユニット、又はその断片、相同体、若しくは誘導体に対応するポリペプチドの全て又は一部（好ましくは、生物学的に活性な部分）を含む。融合タンパク質において、「作動可能に連結される」という用語は、本発明によって包含されるポリペプチドと異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すよう意図されている。異種ポリペプチドは、本発明によって包含されるポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に融合し得る。
一実施形態では、異種アミノ酸配列は、親和性精製に使用することができる親和性タグを含む。別の実施形態では、異種アミノ酸配列は、蛍光標識を含む。なお別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列、免疫グロブリン融合タンパク質、毒素、又は他の有用なタンパク質配列を含む。
当該技術分野で既知の様々なペプチドタグを使用して、例えば限定されないが、免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Ｐｅｔｔｙ，（１９９６）Ｍｅｔａｌ－ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：Ｓｍｉｔｈ，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：２２０－２２９）、Ｅ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎｅｔａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ６７：２１－３０）、及び様々なセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４号、同第５，２０２．２４７号、同第５，１３７，８１９号；Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：１１７－１２３）等の本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの融合タンパク質を生成することができる。
本明細書で企図されるペプチドタグは、限定されないが、以下の周知の例、ＦＬＡＧエピトープ、アミノ酸４０８～４３９のｍｙｃエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープなどの、モノクローナル抗体が利用可能である短いアミノ酸配列を含む。他のペプチドタグは、特定の結合パートナーによって認識され、したがって、結合パートナーへの親和性結合による単離を容易にし、結合パートナーは、好ましくは、固定化され、かつ／又は固体支持体上にある。当業者であれば理解するであろうが、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、及び合成方法を含むが、これらに限定されない、上述のペプチドタグのコーディング領域を得るために、多くの方法を使用することができる。それらの検出及び単離のためのペプチドタグ及び試薬のうちのいくつかは、市販されている。
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットの精製のために、又は複合体の精製のために、異なるペプチドタグの組み合わせが使用される。特定の実施形態では、少なくとも１つのサブユニットは、少なくとも２つのペプチドタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ及びＨｉｓタグを有する。異なるタグは、一緒に融合され得るか、又はタンパク質サブユニットに対して異なる位置で融合され得る。精製手順において、異なるペプチドタグは、その後に、又は同時に、精製のために使用される。特定の実施形態では、少なくとも２つの異なるサブユニットは、ペプチドタグに融合され、２つのサブユニットのペプチドタグは、同一であっても異なっていてもよい。複合体の精製のために異なるタグ付きサブユニットを使用することで、複合体のみが精製されることを確実にし、モノマー又はホモ二量体などの非複合体化タンパク質サブユニットの量を最小限に抑える。
当該技術分野で知られている様々なリーダー配列は、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットを細菌及び哺乳類細胞から効率的に分泌するために使用することができる（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９－１０５）。リーダーペプチドは、意図される宿主細胞に基づいて選択され、細菌、酵母、ウイルス、動物、及び哺乳動物配列を含み得る。例えば、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄリーダーペプチドは、多様な哺乳類細胞での使用に好適である。哺乳類細胞で使用するための好ましいリーダーペプチドは、マウス免疫グロブリンカッパ鎖のＶ－Ｊ２－Ｃ領域から得ることができる（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：５８１２－５８１６）。
既知であるか、又はライブラリ若しくは商業的サプライヤーから容易に入手可能である、所望のペプチドタグ又はリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列は、本発明の実施において好適である。
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットは、同じ種に由来する。より具体的な実施形態では、タンパク質サブユニットは全て、ヒトに由来する。別の特定の実施形態では、タンパク質サブユニットは全て、哺乳動物に由来する。
特定の他の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質サブユニットは、非ヒト種、例えば、限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、霊長類（例えば、チンパンジー、カニクイザルなどのサル）に由来する。特定の実施形態では、１つ以上のサブユニットはヒトに由来し、他のサブユニットはヒト以外の哺乳動物に由来してキメラ複合体を生じさせる。
本発明に包含される範囲には、サブユニット、又はその相同体、誘導体、若しくは断片が、翻訳中又は翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子又は他の細胞リガンドへの結合等によって、差異的に修飾される、単離された修飾タンパク質複合体が含まれる。多数の化学修飾のうちのいずれかは、チュニカマイシンの存在下での、シアノゲンブロミド、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、代謝合成などによる特定の化学切断を含むが、これらに限定されない、既知の技法によって実行され得る。なお別の実施形態では、タンパク質配列は、ヘテロ官能性試薬を有するように修飾され、かかるヘテロ官能性試薬は、複合体のメンバーを架橋するために使用され得る。
本発明によって包含されるタンパク質複合体も、修飾形態であり得る。例えば、タンパク質複合体と選択的に免疫反応する抗体は、タンパク質複合体に結合することができる。別の例では、タンパク質複合体における相互作用パートナー間の相互作用を増強することができる非抗体調節因子を含んでもよい。
上述のタンパク質複合体は、任意の追加の構成要素、例えば、他のタンパク質、核酸、脂質分子、単糖類又は多糖類、イオン等を更に含み得る。
ＸＩ．ポリペプチド及びタンパク質複合体を調製する方法
本発明によって包含されるポリペプチド及びタンパク質複合体は、タンパク質精製及び組換えタンパク質発現のための当該技術分野で周知の方法、並びに実施例で詳細に記載される方法によって得ることができる。例えば、本発明によって包含されるポリペプチド及びタンパク質複合体は、第５節（下記参照）、及び参照によりそれぞれその全体が組み込まれる、ＷＯ００／０９７１６及びＲｉｇａｕｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：１０３０－１０３２に記載されるＴＡＰ方法を使用して単離され得る。加えて、ポリペプチド及びタンパク質複合体は、サブユニットタンパク質の免疫沈降及び免疫沈降タンパク質の組み合わせによって単離され得る。タンパク質複合体はまた、サブユニットタンパク質を組み換えて発現させ、発現させたタンパク質を組み合わせることによって産生することができる。
特定の実施形態では、複合体は、複合体のサブユニットを細胞内で共発現させ、続いて複合体を精製することによって生成され得る。特定のより具体的な実施形態では、細胞は、組換えＤＮＡ技術によって複合体の少なくとも１つのサブユニットを発現する。他の実施形態では、細胞は、通常、複合体のサブユニットを発現する。特定の他の実施形態では、複合体のサブユニットは別々に発現され、サブユニットは、組換えＤＮＡ技術を使用して発現され得るか、又は少なくとも１つのサブユニットは、通常、サブユニットを発現する細胞から精製される。複合体の個々のサブユニットを、本発明によって包含される複合体のサブユニットの互いへの結合に有利な条件下でインビトロでインキュベートし、本発明によって包含される複合体を生成する。
サブユニットのうちの１つ以上が組換えＤＮＡ技術によって発現される場合、当業者に知られている任意の方法を使用して、組換えタンパク質を産生することができる。本発明によって包含されるタンパク質複合体のサブユニットタンパク質の核酸及びアミノ酸配列は、表１などで本明細書に提供され、当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、各配列の３’及び５’末端にハイブリダイゼーション可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、及び／又は各ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドを使用したｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリからのクローニングによって得ることができる。
１つ以上のタンパク質の組換え発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全て又は一部を含有する核酸は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入され得る。必要な転写及び翻訳シグナルはまた、サブユニットタンパク質遺伝子の天然プロモーター及び／又は隣接領域によって供給され得る。
タンパク質コーディング配列を発現するために、様々な宿主ベクター系を利用してもよい。これらには、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳類細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母などの微生物、又はバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が含まれるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素は、それらの強度及び特異性が変化する。利用される宿主ベクター系に応じて、いくつかの好適な転写及び翻訳要素のうちの任意の１つが使用され得る。
好ましい実施形態では、本発明によって包含される複合体は、同じプロモーター又は別個のプロモーターのいずれかの制御下で、同じ細胞内でサブユニットタンパク質のコーディング配列全体を発現させることによって得られる。更に別の実施形態では、サブユニットタンパク質の誘導体、断片、又は相同体は、組換えで発現される。好ましくは、タンパク質の誘導体、断片、又は相同体は、複合体の他のサブユニットと複合体を形成し、より好ましくは、抗複合体抗体に結合する複合体を形成する。
当該技術分野で利用可能な任意の方法は、適切な転写／翻訳制御シグナル及びタンパク質コーディング配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために、ＤＮＡ断片をベクターに挿入するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ及び合成技法、並びにインビボ組換え技法（遺伝子組換え）を含み得る。サブユニットタンパク質、又はそれらの誘導体、断片、若しくは相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子又はその断片が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように、第２の核酸配列によって制御され得る。例えば、タンパク質の発現は、当該技術分野で知られている任意のプロモーター／エンハンサーによって制御され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、サブユニットタンパク質の遺伝子に対して天然ではない。使用され得るプロモーターは、当該技術分野で知られている多くのプロモーターの中から選択することができ、選択された宿主細胞で機能するように選択される。
特定の実施形態では、サブユニットタンパク質、又はその断片、誘導体、若しくは相同体をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、１つ以上の複製起点、及び任意に１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターを使用する。
別の特定の実施形態では、サブユニットタンパク質のコーディング配列又はその一部を一緒に又は別々に含有する発現ベクターは、遺伝子配列を３つのｐＧＥＸベクター（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ発現ベクター、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ７：３１－４０）の各々のＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングすることによって作製される。これにより、正しいリーディングフレームにおける生成物の発現が可能になる。
目的とする配列を含有する発現ベクターは、以下の３つの一般的アプローチによって同定され得る：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在若しくは不在、及び（ｃ）挿入された配列の発現。第１のアプローチでは、コーディング配列は、挿入された配列に相同かつ相補的な配列を含むプローブへの核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第２のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、ベクター内の目的とする配列の挿入によって引き起こされる特定の「マーカー」機能（例えば、抗生物質への耐性、バキュロウイルスにおける閉塞体の形成等）の存在又は不在に基づいて同定及び選択され得る。例えば、サブユニットタンパク質遺伝子又はその一部が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、コードされたタンパク質又は一部を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の不在（例えば、β－ガラクトシダーゼ活性の喪失）によって特定される。第３のアプローチでは、組換え発現ベクターは、組換えベクターによって発現されるサブユニットタンパク質についてアッセイすることによって特定され得る。かかるアッセイは、例えば、インビトロアッセイシステムにおける相互作用種の物理的又は機能的特性、例えば、タンパク質を含む複合体の形成又は抗複合体抗体への結合に基づくことができる。
組換えサブユニットタンパク質分子が同定され、複合体又は個々のタンパク質が単離されると、当該技術分野で既知のいくつかの方法を使用してそれらを増殖させることができる。好適な宿主系及び増殖条件を使用して、組換え発現ベクターを増殖させ、量で増幅させることができる。前述のように、使用され得る発現ベクター又は誘導体には、ワクシニアウイルス又はアデノウイルスなどのヒト又は動物ウイルス；バキュロウイルス、酵母ベクターなどの昆虫ウイルス；ラムダファージなどのバクテリオファージベクター；並びにプラスミド及びコスミドベクターが含まれるが、これらに限定されない。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、又は発現したタンパク質を所望の特定の様式で修飾若しくは処理する宿主細胞株を選択してもよい。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導体の存在下で上昇させることができ、したがって、遺伝子操作されたサブユニットタンパク質の発現を制御することができる。更に、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後プロセシング及び修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化等）のための特徴的かつ特異的な機構を有する。外来タンパク質の所望の修飾及び処理が確実に達成されるように、適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。例えば、細菌系における発現を使用して、グリコシル化されていないコアタンパク質を産生することができ、一方、哺乳類細胞における発現は、異種タンパク質の「天然」グリコシル化を確実にする。更に、異なるベクター／ホスト発現系は、異なる範囲への処理反応に影響を及ぼし得る。
他の特定の実施形態では、サブユニットタンパク質、又はその断片、相同体、若しくは誘導体は、異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して接合されたタンパク質、断片、相同体、若しくは誘導体を含む融合タンパク質又はキメラタンパク質生成物として発現してもよい。かかるキメラ生成物は、当該技術分野で知られている方法によって、適切なコードフレーム内で所望のアミノ酸をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートし、当該技術分野で一般的に知られている方法によって、好適な宿主においてキメラ生成物を発現することによって作製することができる。あるいは、かかるキメラ生成物は、タンパク質合成技法によって、例えば、ペプチド合成装置の使用によって作製することができる。任意の異種タンパク質コード配列に融合されたサブユニットタンパク質の一部を含むキメラ遺伝子を構築してもよい。
特に、タンパク質サブユニット誘導体は、機能的に等価な分子を提供する置換、付加、又は欠失によってそれらの配列を改変させることによって作製することができる。ヌクレオチドコーディング配列の変性により、サブユニット遺伝子又はｃＤＮＡと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明によって包含される実施において使用することができる。これらには、サブユニットタンパク質遺伝子の全て又は一部を含むヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されず、これらは、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、したがって、サイレント変化をもたらす。同様に、本発明によって包含される誘導体には、サブユニットタンパク質のアミノ酸配列の全て又は一部を一次アミノ酸配列として含有するものが含まれるが、これらに限定されず、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基に置換され、サイレント変化をもたらす改変配列が含まれる。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する同様の極性の別のアミノ酸によって置換され、サイレント改変をもたらすことができる。配列内のアミノ酸の置換基は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
特定の実施形態では、野生型タンパク質中のアミノ酸の総数の最大１％、２％、５％、１０％、１５％、若しくは２０％が置換若しくは欠失されるか、あるいは野生型タンパク質に対して１、２、３、４、５、若しくは６、又は最大１０、又は最大２０個のアミノ酸が挿入、置換、又は欠失される。
本発明によって包含されるタンパク質サブユニット誘導体及び類似体は、当該技術分野で既知の様々な方法によって産生され得る。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子又はタンパク質レベルで生じ得る。例えば、クローニングされた遺伝子配列は、当該技術分野で既知の多数の戦略のうちのいずれかによって修飾され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な部位で切断し、その後、必要に応じて更なる酵素修飾を行い、単離し、インビトロでライゲートすることができる。サブユニットタンパク質の誘導体、相同体、又は類似体をコードする遺伝子の産生において、修飾遺伝子が、所望の活性がコードされる遺伝子領域において、翻訳停止シグナルによって中断されない元の翻訳リーディングフレームを確実に保持するように注意を払わなければならない。
加えて、コード核酸配列をインビトロ又はインビボで変異させて、翻訳配列、開始配列、及び／若しくは終結配列を作成及び／若しくは破壊するか、又はコーディング領域の変異を作成して、新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、又は既存の部位を破壊して、更なるインビトロ修飾を促進することができる。化学的変異誘発及びインビトロ部位特異的変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｒｎ．２５３：６５５１－６５５８）、変異を含有するＰＣＲプライマーによる増幅等を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の変異誘発のための任意の技法を使用することができる。
サブユニットタンパク質、又はその断片若しくは誘導体を発現する組換え細胞が同定されると、個々の遺伝子産物又は複合体を単離して分析することができる。これは、製品の放射性標識、続いてゲル電気泳動、イムノアッセイ、マーカー標識生成物への架橋等による分析を含むがこれらに限定されない、タンパク質又は複合体の物理的及び／又は機能的特性に基づくアッセイによって達成される。
サブユニットタンパク質及び複合体は、当該技術分野で既知の標準的な方法（天然源、又は複合体若しくはタンパク質を発現する組換え宿主細胞のいずれかから）、あるいは本明細書の実施例に記載される方法（カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、ゲル排除、逆相高圧、高速タンパク質液体等）、分画遠心分離、示差溶解度、又はタンパク質の精製に使用される任意の他の標準的な技法を含むが、これらに制限されない）によって単離及び精製され得る。いくつかの実施形態では、単離方法は、密度沈降に基づくアプローチを含む。機能的特性は、当該技術分野で知られている任意の好適なアッセイを使用して評価され得る。
あるいは、サブユニットタンパク質又はその誘導体が同定されると、タンパク質のアミノ酸配列は、それをコードしたキメラ遺伝子の核酸配列から推定することができる。結果として、タンパク質又はその誘導体は、当該技術分野で既知の標準的な化学的方法（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５－１１１）によって合成することができる。
加えて、類似体の複合体及びサブユニットタンパク質の誘導体を化学的に合成することができる。例えば、所望のドメインを含むか、又はインビトロで所望の活性（例えば、複合体形成）を媒介する、サブユニットタンパク質の一部に対応するペプチドは、ペプチド合成装置の使用によって合成することができる。
更に、必要に応じて、非古典的アミノ酸又は化学アミノ酸類似体を、タンパク質配列に置換又は付加として導入することができる。非古典的なアミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ－異性体、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸（４－Ａｂｕ）、２－アミノ酪酸（２－Ａｂｕ）、６－アミノヘキサン酸（Ａｈｋ）、２－アミノイソ酪酸（２－Ａｉｂ）、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、β－メチルアミノ酸）、Ｃａ－メチルアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。Ｎａ－メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体全般。更に、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）又はＬ（左旋性）であり得る。
天然物が変異体であることが疑われる場合、又は新たな種から精製される場合、天然源から精製されるサブユニットタンパク質のアミノ酸配列、及びインビトロで発現されるもの、又はインビボ若しくはインビトロで合成される発現ベクターから発現されるものは、ＤＮＡ配列の分析から、又は代替的に、精製されたタンパク質の直接配列決定によって決定され得る。かかる分析は、手動配列決定によって、又は自動アミノ酸配列決定装置の使用によって行うことができる。
複合体は、親水性分析によって分析することもできる（Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４－３８２８）。親水性プロファイルを使用して、タンパク質の疎水性及び親水性領域を特定し、結合実験、抗体合成等の実験操作のための基質の設計におけるそれらの配向を予測するのに役立てることができる。二次構造解析を行って、特定の構造を想定したサブユニットタンパク質、又はそれらの誘導体の領域を特定することもできる（Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２－２３）。操作、翻訳、二次構造予測、親水性及び疎水性プロファイル予測、オープンリーディングフレーム予測及びプロッティング、並びに配列相同性の決定等は、当該技術分野で利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成され得る。
Ｘ線結晶学を含むが、これらに限定されない他の構造解析方法（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７－１３）、質量分析及びガスクロマトグラフィー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７）、並びにコンピュータモデリング（Ｆｉｅｔｔｅｒｉｃｋ ａｎｄ Ｚｏｌｌｅｒ ｅｄｓ．（１９８６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いることもできる。
特定の実施形態では、複合体の少なくとも１つのサブユニットは、組換えＤＮＡ技術によって生成され、天然に存在するタンパク質の誘導体である。特定の実施形態では、誘導体は、融合タンパク質であり、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に融合される。第２のアミノ酸配列は、タンパク質の精製、免疫学的検出、及び同定、並びに可視化を促進するペプチドタグであり得る。異なる機能及び親和性を有する多様なペプチドタグを本発明において使用して、親和性クロマトグラフィーによるサブユニット又はサブユニットを含む複合体の精製を容易にすることができる。特異的ペプチドタグは、免疫グロブリンの定常領域を含む。他の実施形態では、サブユニットは、リーダー配列に融合され、タンパク質サブユニットを発現する細胞からのタンパク質サブユニットの分泌を促進する。本発明とともに使用することができる他のペプチドタグには、ＦＬＡＧエピトープ又はＨＡタグが含まれるが、これらに限定されない。
複合体のサブユニットが共発現される場合、複合体は、免疫沈降、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む、当業者に既知の任意の方法によって精製することができる。
本明細書に記載の方法を使用して、本発明によって包含される複合体の個々のサブユニットを精製することができる。複合体全体を精製するために、本方法を使用することもできる。一般に、複合体の精製条件及び解離定数は、精製手順中に複合体が無傷のままであるかどうかを決定する。かかる条件には、塩濃度、洗剤濃度、ｐＨ、及び酸化還元電位が含まれるが、これらに限定されない。
複合体の少なくとも１つのポリペプチド又はサブユニットがペプチドタグを含む場合、本発明は、ペプチドタグの特性に基づく本発明によって包含される複合体の精製のための方法も企図する。１つのアプローチは、タグとその結合パートナーとの間の特定の分子相互作用に基づいている。他のアプローチは、タグ上に存在するエピトープへの抗体の免疫特異的結合に依存する。当該技術分野で周知の親和性クロマトグラフィーの原理は、概して、これらのアプローチの両方に適用可能である。別の実施形態では、複合体は、免疫沈降を使用して精製される。
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体の個々のサブユニットは、別々に発現される。その後、複合体のサブユニットの互いへの結合に有利な条件下でサブユニットをインキュベートして、複合体を生成する。特定のより具体的な実施形態では、サブユニットは、複合体形成の前に精製される。他の実施形態では、サブユニットを発現する細胞の上清（サブユニットが分泌される場合）又はサブユニットを発現する細胞の細胞溶解物（サブユニットが分泌されない場合）を最初に組み合わせて複合体を生じさせ、その後、複合体を精製する。本発明によって包含されるサブユニットが互いに結合する能力に影響を与えるパラメータには、塩濃度、洗剤濃度、ｐＨ、及び酸化還元電位が含まれるが、これらに限定されない。複合体が形成されると、当業者に知られている任意の方法によって複合体を精製又は濃縮することができる。特定の実施形態では、複合体は、濾過によって残りの個々のサブユニットから分離される。フィルターの細孔径は、個々のサブユニットが依然としてフィルターを通過することができるが、複合体がフィルターを通過しないようにしなければならない。複合体を濃縮するための他の方法には、スクロース勾配遠心分離及びクロマトグラフィーが含まれる。
ＸＩＩ．スクリーニング方法
ａ．複合体形成の調節因子
本発明によって包含される複合体、複合体の成分タンパク質及び成分タンパク質をコードする核酸、並びにアミノ酸及び核酸の誘導体及び断片を使用して、当該複合体に結合するか、又は当該複合体の活性の量、形成、若しくは安定性を調節する化合物についてスクリーニングすることができ、したがって、複合体の活性、複合体の安定性、及び／又は複合体の形成（すなわち、形成される複合体の量）、及び／又は複合体のタンパク質成分組成物の調節因子（すなわち、アゴニスト又はアンタゴニスト）としての潜在的な使用を有する。
上述のように、本発明による使用のための複合体は、別の部分と会合した単一のポリペプチド、又は互いに会合し、かつ／又は別の部分と会合したポリペプチドの組み合わせ（例えば、タンパク質複合体）であり得る。
したがって、本発明は、本発明によって包含される複合体のタンパク質成分組成物に結合するか、又はその活性の量を調節する分子についてスクリーニングするための方法も対象とする。本発明によって包含される一実施形態では、本発明によって包含される複合体の機能、活性又は形成を直接的又は間接的に調節する分子についてスクリーニングするための方法は、調節に有利な条件下で、当該複合体、又は複合体の機構を含む細胞若しくは生物を１つ以上の試験薬剤に曝露することと、当該複合体のタンパク質成分の活性の量又は同一性を決定することとを含み、試験薬剤の不在下での当該量、活性、又は同一性に対する当該量、活性、又は同一性の変化は、試験薬剤が当該複合体の機能、活性、又は形成を調節することを示す。かかるスクリーニングアッセイは、当該技術分野で一般に知られている無細胞及び細胞ベースの方法を使用して実行され得る。
一実施形態では、本発明によって包含される複合体に結合するか、又は複合体の量、活性、形成、若しくは安定性を調節する分子についてスクリーニングするための方法は、上述の接触のステップの前に、修飾タンパク質複合体を形成するために有利な条件下、試験薬剤の存在下で単離された修飾タンパク質複合体のサブユニットをインキュベートすることを更に含む。別の実施形態では、方法は、単離された修飾タンパク質複合体における個々のサブユニットの存在及び／又は量を決定するステップを更に含む。
本発明は、本発明によって包含される複合体のサブユニットの発現を調節する分子についてスクリーニングするための方法を更に対象とする。本発明によって包含される一実施形態では、本発明によって包含される複合体のサブユニットの発現を調節する分子についてスクリーニングするための方法は、調節に有利な条件下で、成分をコードする核酸を含む細胞又は生物を１つ以上の化合物に曝露することと、当該複合体のタンパク質成分の活性の量又は同一性を決定することとを含み、当該化合物の不在下での当該量、活性、又は同一性に対する当該量、活性、又は同一性の変化は、化合物が当該複合体の発現を調節することを示す。かかるスクリーニングアッセイは、当該技術分野で一般に知られている無細胞及び細胞ベースの方法を使用して実行され得る。複合体又は構成要素の活性がアッセイの読み出しとして使用される場合、ウエスタンブロット分析又はノーザンブロット分析などの後続のアッセイを行って、構成要素の調節された発現レベルが調節された活性の原因であることを検証することができる。
更なる特定の実施形態では、複合体の形成又は安定性の調節を決定することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、単離された修飾タンパク質複合体の形成又は安定性を調節する（阻害又は促進する）。特定の実施形態では、薬剤は、単離された修飾タンパク質複合体の形成又は安定性を、複合体中のポリペプチドと表１～５に列挙される別のサブユニットとの間の少なくとも１つの相互作用の間の相互作用を阻害又は促進することによって阻害する。薬剤は、例えば、小分子阻害剤、小分子分解剤、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド若しくはペプチド模倣薬阻害剤、アプタマー、抗体、又はイントラボディであってもよい。特定の実施形態では、薬剤は、単離された修飾タンパク質複合体の少なくとも１つのサブユニットに特異的に結合する、抗体及び／若しくはイントラボディ、又はその抗原結合断片を含む。いくつかの他の実施形態では、薬剤は、単離された修飾タンパク質複合体の形成又は安定性を増強する。特定の実施形態では、薬剤は、複合体のポリペプチドと、表１～５に列挙される別のサブユニットとの間の少なくとも１つの相互作用の間の相互作用を安定化することによって、タンパク質複合体の形成又は安定性を強化する。薬剤は、小分子化合物、例えば、小分子安定剤であり得る。
かかる調節は、その形成の典型的な時間経過の変化又は完全な複合体の形成につながる典型的なステップの変化のいずれかであり得る。かかる変化は、例えば、特定の状況において特定の条件及び／若しくは特定の薬剤で処理された特定の疾患表現型及び／若しくは細胞を示すか、又はそれを発生させる素因を有する特定のタイプ及び／若しくは細胞の未処理の野生型細胞における複合体形成のプロセスを分析及び比較することによって検出することができる。時間経過におけるかかる変化を研究する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、その形成の異なるステップで単離された複合体中のタンパク質のウエスタンブロット分析が挙げられる。
特定の実施形態では、複合体のタンパク質成分、特にペプチド模倣物の断片及び／又は類似体は、複合体形成の競合的又は非競合的阻害剤としての活性についてスクリーニングされ、それによって複合体の活性又は形成を阻害する。
別の実施形態では、本発明は、本発明によって包含されるタンパク質複合体に結合する分子についてスクリーニングするための方法であって、当該複合体、又は複合体機構を含有する細胞若しくは生物を１つ以上の候補分子に曝露することと、当該複合体が当該候補分子のうちのいずれかによって結合されるかどうかを決定することと、を含む、方法を対象とする。
ライブラリのスクリーニングは、多様な一般的に知られている方法のうちのいずれかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照のこと：Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５－２１８：Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－３９０、Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２－４２７、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３９３－５３９７：Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：９３３－９４５、Ｓｔａｕｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７－５８０、Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４－５６６：Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６９８８－６９９２：Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０－８５２、米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、及び米国特許第５，１９８．３４６号、全てＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｂａｒ ａｎｄ Ｐａｂｏ，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１－６７３）、並びに国際特許公開第９４／１８３１８号。
特定の実施形態では、スクリーニングは、ライブラリメンバーを、固相上で固定化された複合体と接触させ、タンパク質に結合する（又は核酸若しくは誘導体をコードする）ライブラリメンバーを回収することによって実行することができる。「パニング」技法と呼ばれるかかるスクリーニング方法の例は、例えば、Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３：３０５－３１８、Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２－４２７、国際特許公開第９４／１８３１８号、及び上記の本明細書で引用される参考文献に記載されている。
特定の実施形態では、複合体、特にペプチド模倣物のタンパク質成分の断片及び／又は類似体は、細胞内の複合体形成（複合体の量若しくは複合体の組成）又は活性の競合的又は非競合的阻害剤としての活性についてスクリーニングされ、それによって、細胞内の複合体活性又は形成を阻害する。
一実施形態では、複合体活性又は形成を調節する（すなわち、アンタゴナイズ又はアゴナイズする）薬剤は、結合阻害アッセイを使用してスクリーニングすることができ、ここで、薬剤は、複合体形成が試験される薬剤の不在下で生じる、水性又は生理学的結合条件下で複合体の形成を調節するそれらの能力についてスクリーニングされ得る。本発明によって包含される複合体の形成を妨げる薬剤は、複合体形成のアンタゴニストとして特定される。複合体の形成を促進する薬剤は、複合体形成のアゴニストとして特定される。複合体の形成を完全に遮断する薬剤は、複合体形成の阻害剤として特定される。
スクリーニングのための方法は、複合体の成分タンパク質を、放射性リガンド（例えば、１２５１若しくは３Ｈ）、磁性リガンド（例えば、酢酸フォトビオチンに共有結合された常磁性ビーズ）、蛍光リガンド（例えば、フルオレセイン若しくはローダミン）、又は酵素リガンド（例えば、ルシフェラーゼ若しくはβ－ガラクトシダーゼ）で標識することを伴い得る。次いで、溶液中で結合する反応物は、非標識結合パートナーに対する抗血清を使用した標識複合体部分の共免疫沈降（又は第２の標識複合体部分で使用されるものと区別可能なマーカーを有する標識結合パートナー）、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び勾配密度遠心分離を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている多くの技法のうちの１つによって単離され得る。好ましい実施形態では、標識された結合パートナーは、市販のフィルターによって保持されない小さな断片又はペプチド模倣物である。結合すると、標識された種は次いで、フィルターを通過することができず、複合体形成の単純なアッセイを提供する。
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質成分は、成分の互いへの結合がＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）をもたらすように、異なるフルオロフォアで標識される。化合物の添加が、化合物の不在下でのＦＲＥＴと比較してＦＲＥＴの差異をもたらす場合、化合物は、複合体形成の調節因子として特定される。化合物の存在下におけるＦＲＥＴが、化合物の不在下におけるＦＲＥＴと比較して減少する場合、化合物は、複合体形成の阻害剤として特定される。化合物の存在下でのＦＲＥＴが、化合物の不在下でのＦＲＥＴと比較して増加する場合、化合物は、複合体形成の活性化剤として特定される。
特定の他の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質成分は、成分が別のタンパク質成分に結合して、本発明によって包含される複合体を形成することによって、ＦＰ（蛍光偏光）がもたらされるように、フルオロフォアで標識される。化合物の添加が、化合物の不在下でのＦＰと比較してＦＰの差異をもたらす場合、化合物は、複合体形成の調節因子として特定される。
当該技術分野で一般的に知られている方法は、複合体の構成要素のうちの少なくとも１つを標識するために使用される。好適な標識方法には、放射性標識アミノ酸、例えば、３Ｈ－ロイシン若しくは３５８－メチオニンの組み込みによる放射標識、クロラミンＴ法を使用した１２５Ｉ若しくは１３１Ｉによる翻訳後ヨウ素化による放射標識、ボルトン－ハンター試薬等、又はホスホリラーゼ及び無機放射標識リンを使用した３２Ｐによる標識、フォトビオチン－酢酸塩及び太陽灯曝露によるビオチン標識等が含まれるが、これらに限定されない。複合体のメンバーのうちの１つが固定化される場合、例えば、以下に記載されるように、遊離種が標識される。相互作用種のいずれも固定化されていない場合、各々が区別可能なマーカーで標識され得、その結果、両方の部分の単離を追跡して、より正確な定量化を提供し、ヘテロマー複合体からのホモマー複合体の形成を区別することができる。修飾された相互作用物質のうちの１つに結合するアクセサリータンパク質を利用して、検出の感度を改善し、複合体の安定性を高める方法等が提供される。
複合体形成の物理的パラメータは、使用される標識に特異的なアッセイ方法、例えば、放射活性検出のための液体シンチレーション計数、酵素標識部分のための酵素活性等を使用する複合体形成の定量化によって分析することができる。次いで、反応結果を、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ｈｉｌｌ分析、及び当該技術分野で一般的に知られている他の方法を利用して分析する（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９３）Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
スクリーニングされる薬剤／分子（候補分子）は、限られた数の特定の化合物の混合物として、又は化合物ライブラリ、ペプチドライブラリ等として提供され得る。スクリーニングされる薬剤／分子には、複合体活性又は形成を調節することができる、あらゆる形態の抗血清、アンチセンス核酸等も含まれ得る。スクリーニングのための例示的な候補分子及びライブラリを以下に記載する。
特定の実施形態では、化合物は、プールでスクリーニングされる。ポジティブプールが特定されると、そのプールの個々の分子を別々に試験する。特定の実施形態では、プールサイズは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、又は少なくとも５００個の化合物である。
本発明によって包含される特定の実施形態では、スクリーニング方法は、候補分子の構造を決定することを更に含む。候補分子の構造は、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。
ｉ．試験薬剤
当該技術分野で知られている任意の分子は、当該複合体の量、活性、又はタンパク質成分組成物の変化によって検出されるように、本発明によって包含される複合体の量、活性、又はタンパク質成分組成物を調節する（増加又は減少させる）その能力について試験することができる。一例として、複合体の量の変化は、複合体機構を発現する細胞から単離することができる複合体の量の変化を検出することによって検出することができる。他の実施形態では、化合物の不在と比較した化合物の存在下でのシグナル強度の変化（例えば、ＦＲＥＴ又はＦＰを使用する場合）は、化合物が複合体形成の調節因子であることを示す。複合体活性を調節する分子を特定するために、複合体を発現する細胞に候補分子を直接提供することができるか、又は候補タンパク質の場合、複合体機構を発現する細胞内で候補タンパク質を産生するために核酸が組換え的に発現される条件下で、それらのコード核酸を提供することによって提供することができ、次いで、複合体を細胞から精製し、精製された複合体を、上述のものに限定されないが、当該技術分野で周知の方法を使用して活性についてアッセイする。
特定の実施形態では、本発明は、複合体の量、活性、又はタンパク質成分組成物を調節する、例えば、阻害する、アンタゴナイズする、又はアゴナイズする分子についての化学ライブラリを使用したスクリーニングアッセイを提供する。化学ライブラリは、ペプチドライブラリ、ペプチド模倣ライブラリ、化学合成ライブラリ、組換え、例えば、ファージディスプレイライブラリ、及びインビトロ翻訳ベースライブラリ、他の非ペプチド合成有機ライブラリ等であり得る。
例示的なライブラリは、いくつかの供給源（ＡｒＯｕｌｅ、Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ、ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ、及びＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から市販されている。場合によっては、これらの化学ライブラリは、メンバー化合物が付着している基板上のライブラリの各メンバーの同一性をコードする組み合わせ戦略を使用して生成され、したがって、効果的な調節因子である分子の直接的かつ即時的な特定を可能にする。したがって、多くの組み合わせアプローチでは、化合物のプレート上の位置は、その化合物の組成を指定する。また、一実施例では、単一のプレート位置は、目的とする相互作用を含むウェルへの投与によってスクリーニングされ得る１～２０個の化学物質を有し得る。したがって、調節が検出される場合、相互作用する対のより小さなプールを調節活性についてアッセイすることができる。かかる方法によって、多くの候補分子をスクリーニングすることができる。
使用に好適な多くの多様なライブラリが当該技術分野で既知であり、本発明に従って試験される化合物を提供するために使用され得る。あるいは、ライブラリは、標準的な方法を使用して構築することができる。化学的（合成）ライブラリ、組換え発現ライブラリ、又はポリソームベースのライブラリは、使用され得るライブラリの例示的なタイプである。
ライブラリは、拘束性又は半剛性（ある程度の構造的剛性を有する）、又は直鎖状若しくは非拘束性であり得る。ライブラリは、ｃＤＮＡ若しくはゲノム発現ライブラリ、ランダムペプチド発現ライブラリ、又は化学的に合成されたランダムペプチドライブラリ、又は非ペプチドライブラリであり得る。発現ライブラリを、アッセイが行われる細胞に導入し、ライブラリの核酸を発現させて、それらのコードされたタンパク質を産生する。
一実施形態では、本発明で使用することができるペプチドライブラリは、インビトロで化学的に合成されるライブラリであり得る。かかるライブラリの例は、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４－８６（各ペプチドの第１の残基及び第２の残基が個々にかつ具体的に定義された遊離ヘキサペプチドの混合物を記載する）、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－８４（固相分割合成スキームが、コレクション中の各ビーズがアミノ酸残基の単一のランダム配列をその上に固定化したペプチドのライブラリを作製した「１つのビーズ、１つのペプチド」アプローチを記載する）、Ｍｅｄｙｎｓｋｉ（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９－７１０（分割合成及びＴ－ｂａｇ合成方法を記載する）、並びにＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３－１２５１に示される。単なる他の例として、コンビナトリアルライブラリは、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２－１０９２６、Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２－１１４２６、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１６１４－１６１８、又はＳａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１７０８－１１７１２の方法に従い、使用のために調製され得る。ＰＣＴ公開第９３／２０２４２号及びＢｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３８１－５３８３は、各化学ポリマーライブラリメンバーについてのオリゴヌクレオチド識別子を含有する「コードされたコンビナトリアル化学ライブラリ」を記載している。
好ましい実施形態では、スクリーニングされるライブラリは、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリである生物学的発現ライブラリであり、ランダムペプチドは（例えば、ジスルフィド結合を有することによって）拘束される。
更に、より一般的な、構造的に拘束された有機多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリも使用され得る。
使用され得る立体構造的に制限されたライブラリとしては、限定されないが、酸化環境において、ジスルフィド結合によって架橋されてシスチン、修飾ペプチド（例えば、フッ素、金属、同位体標識を組み込む、リン酸化される等）、１つ以上の非天然に存在するアミノ酸を含有するペプチド、非ペプチド構造、及びＹ－カルボキシグルタミン酸の相当部分を含有するペプチドを形成する、不変のシステイン残基を含有するライブラリが挙げられる。
非ペプチド、例えば、ペプチド誘導体（例えば、１つ以上の非天然に存在するアミノ酸を含有する）のライブラリも使用され得る。これらの一例は、ペプチドライブラリである（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７－９３７１）。ペプトイドは、天然に存在する側鎖がアルファ炭素に結合していないが、骨格アミノ窒素に結合している非天然アミノ酸のポリマーである。
ペプトイドは、ヒト消化酵素によって容易に分解されないため、ペプトイドは、有利には薬物使用により容易に適応する。ペプチド中のアミド官能基がパルメチル化されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリを生成する、使用可能なライブラリの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１１３８－１１１４２）によって記載されている。
本発明によるスクリーニングが可能なペプチドライブラリのメンバーは、２０個の天然に存在するアミノ酸を含有することに限定されない。特に、化学的に合成されたライブラリ及びポリソームベースのライブラリは、２０個の天然に存在するアミノ酸に加えてアミノ酸の使用を可能にする（ライブラリ産生で使用されるアミノ酸の前駆体プールにそれらを含めることによって）。特定の実施形態では、ライブラリメンバーは、１つ以上の非天然又は非古典的アミノ酸又は環状ペプチドを含有する。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ－異性体、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸；γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｋ、６－アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸：３－アミノプロピオン酸：オルニチン；ノルロイシン：ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、デザイナーアミノ酸、例えば、β－メチルアミノ酸、Ｃａ－メチルアミノ酸、Ｎａ－メチルアミノ酸、フルオロ－アミノ酸、及びアミノ酸類似体全般が挙げられるが、これらに限定されない。更に、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）又はＬ（左旋性）であり得る。
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質成分の断片及び／又は類似体、特にペプチド模倣体は、複合体活性又は形成の競合的又は非競合的阻害剤としての活性についてスクリーニングされる。
本発明によって包含される別の実施形態では、コンビナトリアル化学を使用して、複合体の調節因子を特定することができる。コンビナトリアル化学は、数十万個の化合物を含有するライブラリを作成することができ、その多くは、構造的に類似し得る。高スループットスクリーニングプログラムは、既知の標的に対する親和性のためにこれらの広大なライブラリをスクリーニングすることができるが、より低次元のライブラリを達成するが、最大の化学的多様性を提供する新たなアプローチが開発されている。（例えば、Ｍａｔｔｅｒ（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２１９－１２２９を参照のこと）。
コンビナトリアル化学の１つの方法、親和性フィンガープリンティングは、以前に、定義されたタンパク質パネルに対する結合親和性についての小分子の離散ライブラリを試験するために使用されてきた。スクリーニングによって得られたフィンガープリントは、個々のライブラリメンバーの目的とする他のタンパク質又は受容体に対する親和性を予測するために使用される（本発明では、本発明によって包含されるタンパク質複合体及びそのタンパク質成分）。フィンガープリントは、ライブラリ化合物が同様に反応し得るかどうかを予測するために、目的とするタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られたフィンガープリントと比較される。例えば、複合体又はタンパク質成分との相互作用について大規模なライブラリ内の全てのリガンドを試験するのではなく、その活性を有することが知られている他の化合物と同様のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することができる。（例えば、Ｋａｕｖａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１０７－１１８、Ｋａｕｖａｒ（１９９５）Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．８：２５－２８、及びＫａｕｖａｒ，Ｔｏｘｉｃ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．Ｌ．Ｓｔａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｈ．Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．Ｅｄｉｔｏｒｓ，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５－３１２を参照のこと）。
Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８：５９－６５（Ｋａｙ）は、従来の任意のライブラリよりも長い、全くランダムな配列のペプチドをコードするペプチドライブラリを構築する方法を開示している。Ｋａｙに開示されるライブラリは、約２０アミノ酸長を超える全合成ランダムペプチドをコードする。かかるライブラリは、複雑な調節因子を特定するために有利にスクリーニングされ得る。（１９９６年３月１２日付の米国特許第５，４９８，５３８号、及び１９９４年８月１８日付のＰＣＴ国際公開第９４／１８３１８号も参照されたい）。
様々なタイプのペプチドライブラリの包括的なレビューは、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３－１２５１に見出すことができる。
本発明によって包含される方法を使用してスクリーニングされるライブラリは、様々なタイプの化合物を含み得る。本発明に包含される方法に従ってスクリーニングされ得るライブラリの例としては、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチドなどの多様体；ビニロガスポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣薬；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；及び小分子ライブラリ（好ましくは、小有機分子ライブラリ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スクリーニングされたライブラリ内の化合物は、核酸又はペプチド分子である。非限定的な例では、ペプチド分子は、ファージディスプレイライブラリに存在し得る。他の実施形態では、化合物のタイプには、非天然に存在するアミノ酸、例えば、Ｄ－アミノ酸、アミノ酸のリン類似体（α－アミノリン酸及びα－アミノリン酸など）、又は非ペプチド結合を有するアミノ酸、核酸類似体（ホスホロチオエート及びＰＮＡなど）、ホルモン、抗原、合成又は天然に存在する薬物、オピエート、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトース、及びガラクトースを含むペプチド類似体が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチド又はタンパク質のライブラリもまた、本発明によって包含されるアッセイで使用され得る。
好ましい実施形態では、コンビナトリアルライブラリは、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、及びベンゾジアゼピンを含むが、これらに限定されない小有機分子ライブラリである。別の実施形態では、コンビナトリアルライブラリは、ペプチド；ランダムなバイオオリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチドなどの多量体；ビニロガスポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣物；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；又は炭水化物ライブラリを含む。コンビナトリアルライブラリ自体は、市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．、ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．等を参照のこと）。
好ましい実施形態では、ライブラリの化合物が細胞取り込みにより適しているように、ライブラリが事前に選択される。例えば、化合物は、限定されないが、サイズ、親油性、親水性、及び水素結合などの特定のパラメータに基づいて選択され、これらは、化合物が細胞内に入る可能性を増加させる。別の実施形態では、化合物は、三次元又は四次元コンピュータ計算プログラムによって分析される。
本発明によって包含される方法に従って使用するためのコンビナトリアル化合物ライブラリを合成してもよい。薬理学的、生物学的、又は他の活性についてスクリーニングされ得る、小有機化合物、又はライブラリの大規模なコレクションの作成に向けられた合成方法に大きな関心がある。広大なコンビナトリアルライブラリを作成するために適用される合成方法は、溶液中又は固相中、すなわち、固体支持体上で行われる。固相合成は、過剰な試薬を容易に添加し、各反応ステップ後に洗い流すことができるため、多段階反応を実施し、高収率で反応を完了させることを容易にする。固相コンビナトリアル合成はまた、単離、精製、及びスクリーニングを改善する傾向がある。しかしながら、より伝統的な溶液相化学は、固相化学よりも幅広い種類の有機反応を支持する。
本発明によって包含されるコンビナトリアル化合物ライブラリは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｉｌｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，１９０，６１９号に記載される装置を使用して合成され得る。米国特許第６，１９０，６１９号は、複数の別個の化合物の並列合成のため、又は化合物のコンビナトリアルライブラリのために、複数の反応容器を保持することができる合成装置を開示している。
一実施形態では、コンビナトリアル化合物ライブラリは、溶液中で合成することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，１９４，６１２号に開示される方法は、コンビナトリアルライブラリの溶液相合成のためのテンプレートとして有用な化合物を特徴とする。
テンプレートは、液体／液体又は固体／液体抽出を使用して、反応生成物を未反応の反応物から容易に精製できるように設計されている。テンプレートを使用したコンビナトリアル合成によってされる化合物は、好ましくは小有機分子である。ライブラリ内のいくつかの化合物は、非ペプチド又はペプチドの効果を模倣し得る。
コンビナトリアル化合物ライブラリの固相合成とは対照的に、液相合成は、多段階固相合成の個々のステップを監視するための専門的なプロトコルの使用を必要としない（Ｅｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：２６５２、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：２６５０、Ｆｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：７９５５、Ｌｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９：７５８８、Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：８９４、Ｙｏｕｎｇｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ．８：７７、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．１１７：５４１９、Ｂｒｕｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：３９９、及びＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔ．３：４３１）。
本発明によって包含される方法に有用なコンビナトリアル化合物ライブラリは、固体支持体上で合成され得る。一実施形態では、固体支持体上の化合物のライブラリを合成するために、合成中に固体支持体を分離及び混合するプロトコルである分割合成方法を使用する（例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：４１－４４８、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２－１０９２６、及びそれらで引用される参考文献を参照のこと）。最終ライブラリの各固体支持体は、その表面に実質的に１つのタイプの化合物が付着している。１つの生成物が各支持体に付着される、固体支持体上でコンビナトリアルライブラリを合成するための他の方法は、当業者に知られているであろう（例えば、Ｎｅｆｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：４４９－４７２を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、特定のタイプの固体支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、当業者に知られている。固体支持体としては、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、アルミナゲル、及び多糖類が挙げられる。好適な固体支持体は、所望の末端使用及び様々な合成プロトコルに対する好適性に基づいて選択され得る。例えば、ペプチド合成の場合、固体支持体は、ｐ－メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｙ．）、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるＰＡＭ－樹脂等）（クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレン、及びアミノメチルポリスチレンを含む）、ポリ（ジメチルアクリルアミド）を移植したスチレンコジビニルベンゼン（例えば、Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ，Ｃａｎａｄａから得られるＰＯＬＹＨＩＰＥ樹脂）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールを移植されたポリスチレン樹脂（例えば、ＴＥＮＴＡＧＥＬ若しくはＡＲＧＯＧＥＬ，Ｂａｙｅｒ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる）、又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの樹脂であり得る。
本発明によって包含されるいくつかの実施形態では、化合物は、リンカーを介して固体支持体に付着され得る。リンカーは、固体支持体と一体であり、その一部であり得るか、又は一体でなくてもよく、固体支持体上で合成されるか、若しくは合成後にそれに付着されるかのいずれかである。リンカーは、固体支持体への化合物結合点を提供するだけでなく、リンカーの性質に応じて、異なる条件下で固体支持体から異なる分子基を切断することを可能にするためにも有用である。例えば、リンカーは、とりわけ、求電子的に切断され得るか、求核的に切断され得るか、光切断可能であり得るか、酵素的に切断され得るか、金属によって切断され得るか、還元的条件下で切断され得るか、又は酸化的条件下で切断され得る。好ましい実施形態では、化合物は、化合物の高スループットスクリーニングの前に固体支持体から切断される。
本発明によって包含される特定の実施形態では、薬剤は、小分子である。
ｉｉ．無細胞アッセイ
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体の形成又は安定性の調節因子を特定するための方法は、インビトロで、特に無細胞系において実行され得る。特定のより具体的な実施形態では、複合体は、精製される。特定の実施形態では、候補分子は、精製される。
特定の実施形態では、スクリーニングは、ライブラリメンバーを、固相上で固定化された複合体と接触させ、タンパク質に結合する（又は核酸若しくは誘導体をコードする）ライブラリメンバーを回収することによって実行することができる。「パニング技法」と呼ばれるかかるスクリーニング方法の例は、例として、Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：３０５－３１８：Ｆｏｗｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２－４２７：国際特許公開第９４／１８３１８号、及び上で本明細書において引用される参考文献に記載されている。
一実施形態では、複合体活性又は形成を調節する（すなわち、アンタゴナイズ若しくはアゴナイズする）薬剤は、結合阻害アッセイを使用してスクリーニングすることができ、ここで、薬剤は、複合体形成が試験される薬剤の不在下で生じる、水性又は生理学的結合条件下で複合体の形成を調節するそれらの能力についてスクリーニングされる。本発明によって包含される複合体の形成を妨げる薬剤は、複合体形成のアンタゴニストとして特定される。複合体の形成を促進する薬剤は、複合体形成のアゴニストとして特定される。複合体の形成を完全に遮断する薬剤は、複合体形成の阻害剤として特定される。例示的な実施形態では、結合条件は、例えば、限定ではないが、相互作用の特異性を向上させる１０～２５０ｍＭのＮａＣｌ、５～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ５～８、及び０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、又は他の洗剤の塩水溶液中にある。結合を改善し、かつ／又はタンパク質分解を低減するために、金属キレート剤及び／又は二価カチオンを添加することができる。反応温度は、４、１０、１５、２２、２５、３５、又は４２℃を含み得、インキュベーション時間は、典型的に少なくとも１５秒であるが、結合平衡を生じさせるために、より長い時間が好ましい。特定の複合体を、日常的なタンパク質結合アッセイを使用してアッセイして、再現可能な結合のための最適な結合条件を決定することができる。
２つの分子間の相互作用の決定が、標準の結合又は酵素分析アッセイを使用して達成される場合がある。これらのアッセイは、熱シフトアッセイ（タンパク質単独かつ分子の存在下での融解温度の変化の測定値）（Ｒ．Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｍｏｎｓｍａ，（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，１３：３８９－４０２）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）（Ｔ．Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７：１６３０－１６４２）、ＦＲＥＴ／ＢＲＥＴ（蛍光又は生物発光共鳴励起移動）（Ａ．Ｌ．Ｍａｔｔｈｅｙｓｅｓ，Ａ．Ｉ．Ｍａｒｃｕｓ，（２０１５），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２７８：３２９－３３９、Ｊ．Ｂａｃａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．，３：３１１－３２４），Ｅｌｉｓａ（（酵素結合免疫吸着アッセイ）（Ｚ．Ｗｅｎｇ，Ｑ．Ｚｈａｏ，（２０１５），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２７８：３４１－３５２）、蛍光偏光（Ｙ．Ｄｕ，（２０１５），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２７８：５２９－５４４）、及びファーウェスタン（Ｕ．Ｍａｈｌｋｎｅｃｈｔ，Ｏ．Ｇ．Ｏｔｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｈｏｅｌｚｅｒ Ｊ．（２００１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８８：８９－９４）、又は他の技法を含み得る。（等温熱量測定（ＩＴＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、及びＸ線結晶学を使用して）分子結合モードの構造又は熱力学的詳細を提供する、より高度な（かつより低いスループットの）生物物理学的方法もまた、潜在的なヒットの更なる検証及び特性評価のために必要とされ得る。
例えば、直接結合アッセイでは、結合が複合体中の標識サブユニットを検出することによって決定され得るように、１つのサブユニット（又はそれらのそれぞれの結合パートナー）が放射性同位体又は酵素標識にカップリングされ得る。例えば、サブユニットは、直接的又は間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで標識され得、放射性同位体が放射線放出の直接計数又はシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは、サブユニットは、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識され得、酵素標識が適切な基質の生成物への変換の決定によって検出され得る。
特定の実施形態では、インビトロ結合アッセイに対する別の一般的なアプローチが使用される。このアッセイでは、結合種のうちの１つは、フィルター上、マイクロタイタープレートウェル内、試験管内で、共有結合又は非共有結合のいずれかで、クロマトグラフィーマトリックス等に固定化される。タンパク質は、当該技術分野で周知の任意の方法、例えば、限定されないが、Ｋａｄｏｎａｇａ ａｎｄ Ｔｊｉａｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５８８９－５８９３の方法、すなわち、ＣＮＢｒ－セファロース４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などのシアノゲン－臭化誘導体化基質への連結を使用して共有結合的に固定化することができる。必要な場合、スペーサーの使用は、基質による立体障害を低減することができる。タンパク質の基質への非共有結合には、タンパク質の荷電表面への付着、特定の抗体との結合、第３の無関係な相互作用タンパク質への結合等が含まれるが、これらに限定されない。
複合体の１つのメンバー（又はその誘導体）と、任意の手段（例えば、上記の手段）によって標識された複合体の別のメンバーとの結合についての競合のための薬剤（細胞抽出物又はライブラリプールを含む）のアッセイは、複合体形成の競合体又はエンハンサーについてスクリーニングするために提供される。特定の実施形態では、他のタンパク質成分への試薬の非特異的結合を阻害するための遮断剤、又はプラスチック、固定化マトリックス等への試薬の吸収損失が、アッセイ混合物に含まれる。遮断剤には、ウシ血清アルブミン、１３－カゼイン、非脂肪乾燥乳、デンハート試薬、フィコール、ポリビニルピロリジン、非イオン性洗剤（ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０等）、イオン性洗剤（例えば、ＳＤＳ、ＬＯＳ等）、ポリエチレングリコール等が含まれるが、これらに限定されない。適切な遮断剤濃度は、複合体形成を可能にする。
結合が行われた後、結合されていない標識タンパク質を上清中で除去し、任意の結合された標識タンパク質を保持する固定化タンパク質を広範囲に洗浄する。次いで、結合標識の量を、当該技術分野における標準的な方法を使用して定量化して、標識を検出する。
好ましい実施形態では、優れた安定性を有するが、複合体を形成する能力を保持するポリペプチド誘導体（例えば、結合アッセイ緩衝液中のタンパク質分解に耐性であるように、又は酸化的分解に耐性であるように修飾された１つ以上の構成タンパク質）を使用して、複合体の活性又は形成の調節因子についてスクリーニングする。そのような耐性分子は、例えば、タンパク質分解切断部位におけるアミノ酸の置換、タンパク質分解感受性部位における化学的に誘導体化されたアミノ酸の使用、並びに酸化を受けるアミノ酸残基、すなわち、メチオニン及びシステインの置換によって生成することができる。
ｉｉｉ．細胞ベースのアッセイ
特定の実施形態では、アッセイを実行して、複合体のタンパク質成分を発現する組換え細胞を使用して、複合体に結合するか、又は複合体の活性若しくは形成を干渉するか、又は複合体の活性若しくは形成を促進する分子についてスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、融合タンパク質としての組換え細胞で発現されるタンパク質成分のうちの少なくとも１つ、タンパク質成分は、精製及びその後の定量化及び／又は免疫学的視覚化及び定量化を容易にするためにペプチドタグに融合される。
本発明によって包含される特定の態様は、例えば、複合体を単離するために記載された方法を使用して、本発明によって包含される複合体の形成又は分解を阻害又は促進する分子を特定することと、第４節（下記参照）、並びにＷＯ００／０９７１６及びＲｉｇａｕｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１０３０－１０３２（各々、参照によりそれら全体が組み込まれる）に記載されているＴＡＰアッセイを使用して、複合体のメンバーを特定することに関する。
本発明によって包含される別の実施形態では、調節因子は、本発明によって包含される複合体の組換え構成タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物に試験薬剤を投与することによって特定される。特定の実施形態では、複合体成分は、相同性内因性タンパク質成分から区別可能である。特定の実施形態では、組換え構成タンパク質は、融合タンパク質であり、タンパク質成分は、ペプチドタグに融合される。特定の実施形態では、組換えタンパク質成分のアミノ酸配列は、組換えタンパク質成分に特異的な抗体を使用して、タンパク質成分又は当該成分とともに形成される複合体のレベルを決定することができるように、内因性タンパク質成分のアミノ酸配列とは異なる。特定の実施形態では、組換えタンパク質成分は、それぞれのタンパク質の天然プロモーターではないプロモーターから発現される。特定の実施形態では、組換えタンパク質成分は、通常、それが発現されない組織で発現される。特定の実施形態では、化合物は、トランスジェニック非ヒト動物においても組換え的に発現される。
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体のタンパク質成分の変異体形態は、細胞において発現され、タンパク質成分の変異体形態は、本発明によって包含される複合体の他のタンパク質成分に対する天然に存在するタンパク質の結合親和性よりも低い結合親和性を有する。特定の実施形態では、タンパク質成分の優性阻害性変異体形態は、細胞において発現される。優性阻害性形態は、他のタンパク質成分、すなわち結合ドメインに結合するタンパク質成分のドメインであり得る。理論に縛られることなく、結合ドメインは、複合体の他のタンパク質成分に結合するために天然に存在するタンパク質成分と競合し、それによって、完全長タンパク質成分を含有する複合体の形成を防止する。代わりに、細胞内の優性阻害性形態のレベルが増加するにつれて、漸増量の複合体は、通常、優性阻害性として表されるタンパク質成分によって複合体に提供されるドメインを欠く。
タンパク質成分の結合ドメインは、当業者に知られている任意の標準技法によって特定され得る。非限定的な例では、アラニン走査変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５）を実施して、別のタンパク質成分との二量体化に必要なタンパク質の領域を特定する。他の実施形態では、タンパク質成分の異なる欠失変異体が生成され、それにより、組み合わされた欠失領域がタンパク質全体に及ぶことになる。特定の実施形態では、異なる欠失は互いに重複する。タンパク質成分の変異体形態が生成されると、それらは、別のタンパク質成分と二量体を形成するそれらの能力について試験される。特定の変異体が別のタンパク質成分と二量体を形成することに失敗した場合、又は天然に存在する形態と比較して低減した親和性で他のタンパク質成分に結合した場合、この変異体形態の変異は、二量体形成に関与するタンパク質の領域内にあるものとして識別される。変異が単にタンパク質の適切なフォールディングを干渉したことを除外するために、当業者に既知の任意の構造解析を行って、タンパク質の三次元立体構造を決定することができる。かかる技法には、環状二色性（ＣＤ）、ＮＭＲ、及びＸ線結晶学が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体の成分の変異形態は、誘導性プロモーター下で細胞において発現され得る。当業者に知られている任意の方法を使用して、成分をコードするヌクレオチド配列を変異させることができる。当業者に知られている任意の誘導性プロモーターを使用することができる。特に、本発明によって包含される複合体の成分の変異形態は、活性の低減、例えば、複合体の他の成分に対するＲＮＡ核酸分解活性の低減及び／又は親和性の低減を有する。
特定の実施形態では、本発明によって包含されるアッセイは、高スループット形式で行われる。例えば、逆ツーハイブリッド又はＢＲＥＴを使用して相互作用の喪失を測定する高スループット細胞スクリーニングを使用してもよく、細胞透過性分子のみを選択する利点を提供する（Ａ．Ｒ．Ｈｏｒｓｗｉｌｌ，Ｓ．Ｎ．Ｓａｖｉｎｏｖ，Ｓ．Ｊ．Ｂｅｎｋｏｖｉｃ（２００４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：１５５９１－１５５９６、Ａ．Ｈａｍｄｉ，Ｐ．Ｃｏｌａｓ（２０１２），Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，３３：１０９－１１８）。後者のアプローチは、「標的上の」効果を評価するために更なる検証が必要である。上述のアッセイ方法の１つ以上の実施形態では、ポリペプチド又は分子を固定化して、タンパク質又は分子の一方又は両方の複合体形成されていない形態からの複合体形成された形態の分離を促進し、かつアッセイの自動化を適応させることが望ましくあり得る。
ｂ．新たな結合パートナーを特定するための複合体の使用
本発明によって包含される特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体を使用して、複合体の新たな成分を特定する。特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体の新たな結合パートナーが特定され、それによってクロマチンリモデリングプロセシングに関与する。当業者に知られている任意の技法を使用して、かかる新たな結合パートナーを特定することができる。特定の実施形態では、本発明によって包含される複合体の結合パートナーは、本発明によって包含される複合体に結合するが、本発明によって包含される複合体の個々のタンパク質成分には結合しない。特定の実施形態では、免疫沈降を使用して、本発明によって包含される複合体の結合パートナーを特定する。
特定の実施形態では、本発明によって包含されるアッセイは、高スループット形式で行われる。
本発明によって包含されるスクリーニング方法はまた、当該技術分野で知られている他の無細胞又は細胞ベースのアッセイ、例えば、ＷＯ２００４／００９６２２、ＵＳ２００２／０１７７６９２Ａ１、ＵＳ２０１０／０１３６７１０Ａ１（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものを使用することもできる。
本発明は更に、上述のスクリーニングアッセイによって特定された新規の薬剤に関する。したがって、本明細書に記載されるように特定された薬剤を適切な動物モデルにおいて更に使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように特定された薬剤が動物モデルに使用されて、かかる薬剤での治療の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載されるように特定された抗体が動物モデルに使用されて、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。
ＸＩＩＩ．キット
本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーを検出及び／又は調節するためのキットも包含する。本発明のキットは、本明細書に提供される開示される本発明の方法における、開示される本発明のキット又は抗体の使用を開示又は記載する教材も含み得る。キットは、キットが設計される特定の用途を容易にするための追加の成分を含み得る。例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、ヒツジ抗マウス－ＨＲＰなどの適切な二次標識など）及び対照に必要な試薬（例えば、対照生体試料又は標準）を更に含んでいてもよい。キットは、開示される本発明の方法での使用が認められている緩衝液及び他の試薬を更に含み得る。非限定的な例には、担体タンパク質又は洗剤等の非特異的結合を減少させる薬剤が挙げられる。
ＸＩＩＩＩ．表１～４スクリーニングヒット
以下の表１～４は、本明細書とともに提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルにも見出される遺伝子記号を列挙する（ＰＣＴ出願の１頁の「Ｌａｒｇｅｓ Ｆｉｌｅｓ」段落を参照のこと）。スクリーニングヒットに関する配列及び追加情報は、本明細書とともに提出された大きなＡＳＣＩＩファイルにおいて見出すことができる。以下に列挙される遺伝子記号は、周知かつ広く使用されている遺伝子記号を表す。当業者は、かかる記号を認識することができ、遺伝子カード（Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ）又はアンサンブル（Ｅｎｓｅｍｂｌ）を含むがこれらに限定されない任意の周知の遺伝子データベース内でその対応する配列を見つけることができるであろう。
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実施例１：実施例２～９の材料及び方法
ａ．腫瘍細胞株の生成
腫瘍試料は、患者生検又は患者由来異種移植片のいずれかから得た。組織を手動で粉砕し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２５ｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）の溶液中に懸濁し、１５ｍＬ円錐管に移し、オービタルシェーカー上で低速で３０分間インキュベートした。消化後、単細胞懸濁液を１００ｍストレーナーで濾過し、洗浄し、０．０２％のヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、及び２０ｎｇ／ｍｌのｈＦＧＦ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳ－Ａヒト増殖キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の培地を含有する組織培養フラスコ中で培養した。確立された細胞株をマイコプラズマ不含（Ｖｅｎｏｒ（商標）ＧｅＭマイコプラズマ検出キット、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で試験し、ＣＫ２０及びＳＯＸ２に対する抗体を使用した免疫組織化学染色を通じてＭＣＣとして検証した。
ｂ．細胞培養の最適化
細胞株を、以下のようにＣＫ２０及びＳＯＸ２に対する抗体を使用した免疫組織化学染色を通じて、ＭＣＣとして認証した：
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細胞株を、以下のように１１株のうち７株についてＨＬＡタイピングすることによって、元の腫瘍試料の誘導体として認証した。
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全てのＭＣＣ細胞株は、０．０２％のヘパリン、２０ｎｇ／ｍＬのｈＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのｈＦＧＦ２を補充したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳ－Ａ増殖キットからの培地で維持された。細胞培養最適化に使用される他の培地には、本明細書に詳述されるようなサプリメントとともにＳｔｅｍｆｌｅｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、及びＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）が含まれた。Ｋ５６２細胞を、１０％のウシ胎仔血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ、３－メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム（全てＧｉｂｃｏから）を補充したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ中で保持した。細胞培養最適化に使用した培地は、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳ－Ａ増殖キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ、０．０２％のヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍＬのｈＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、２０ｎｇ／ｍＬのｈＦＧＦ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び５５ｎＭの３－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）であった。
ｃ．組織学
最大１０００万個のＭＣＣ細胞を、１０％ホルムアルデヒド中に固定した。細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、パラフィンブロックに載置した。５μｍの切片を切断し、染色した。
ｄ．フローサイトメトリー
細胞をＶｅｒｓｅｎｅと解離し、１００ｍＬ中の１００万細胞当たり５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｆｃ受容体遮断溶液、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）と室温で１０分間インキュベートした。蛍光色素コンジュゲート抗体又はそれぞれのアイソタイプ対照を直ちに添加し、４℃で更に３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ細胞計上で分析した。追加のステップを、以下のように個々の実験について記載した。ＨＬＡクラスＩ実験の上方制御のために、５×１０５個のＭＣＣ細胞を、漸増用量のＩＦＮα２ｂ、ＩＦＮ３、ＩＦＮγで２４時間、又はＭＥＫ阻害剤及びＤＭＳＯで７２時間処理した後、上記のようにＷ６／３２及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄで染色した。
ｅ．免疫沈降及び質量分析
最大４０００万個のＭＣＣ細胞を免疫沈降させた。簡潔に述べると、ＭＣＣ細胞を採取し、４０ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．０６Ｍのオクチル３－ｄ－グルコピラノシド、１００Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ Ｉ、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（全てＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する氷冷溶解緩衝液中で溶解した。細胞溶解物を４℃で２２分間、１２，７００ｒｐｍで遠心分離した。溶解物上清をＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とカップリングし、１０ｇのＨＬＡクラスＩ（Ｃｌｏｎｅ Ｗ６／３２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＨＬＡ－Ｅ（Ｃｌｏｎｅ ３Ｄ１２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と４℃で３時間、回転撹拌下でインキュベートした。インキュベーション後、溶解物－ビーズ－抗体混合物を短時間遠心分離し、上清を廃棄した。ビーズを、プロテアーゼ阻害剤なしの溶解緩衝液、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．０６Ｍのオクチル３－ｄ－グルコピラノシド、及び２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含有する洗浄緩衝液で洗浄した。ゲル装填チップ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ，ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）を使用して、ビーズから可能な限り多くの流体を除去した。前述のように、最大３つのＩＰのペプチドを組み合わせ、酸溶出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して分析した（Ａｂｅｌｉｎ，Ｋｅｓｋｉｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）。簡潔に述べると、ペプチドを３％ ＡＣＮ、５％ ＦＡに再懸濁し、分析カラム（２０～３０ｃｍ、１．９μｍのＣ１８ Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ、社内で充填）に充填した。ペプチドを６～３０％の勾配で溶出し（ＥａｓｙＬＣ １０００又は１２００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ又はＦｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分析した。Ｌｕｍｏｓ測定の場合、ペプチドはまた、単独で荷電された場合に断片化された。
大型Ｔ抗原ペプチドの検出の場合、ＩＦＮｙで処理した３６７細胞株の３つのＩｐをプールし、酸溶出させ、ステージ先端の基本的な逆相分離を使用して分画し、画分をＦＡＩＭＳｐｒｏインターフェースを備えたＦｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ上で分析した（Ｋｌａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，調製物中）。
質量スペクトルは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌソフトウェアパッケージｖ７．１プレリリース（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して解釈した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、６００～４０００の範囲における前駆体ＭＨ＋を有しないか、前駆体電荷が５超であるか、又は最小５未満の検出されたピークを有する場合、検索から除外された。同じクロマトグラフィーのピークで取得された同じ前駆体ｍ／ｚとの類似のスペクトルの融合を無効にした。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ゲノム及びそのタンパク質コード転写物のｈｇ１９注釈を有する全てのＵＣＳＣゲノムブラウザ遺伝子（６３，６９１エントリ）、一般的なヒトウイルス配列（３０，１８１エントリ）、２６個の組織からの腫瘍で観察される反復変異タンパク質（４，１６７エントリ）、２６４個の一般的な実験室汚染物質、及びＭＣＣ細胞株で検出される体細胞変異を含有するタンパク質配列を含む、９８，２９８エントリを含有するタンパク質配列データベースに対して検索した。ＭＳ／ＭＳ検索パラメータは、無酵素特異性；固定修飾：システインのカルバミドメチル化；可変修飾：ペプチドＮ末端グルタミンにおけるメチオニン、及びピログルタミン酸の酸化；±１０ｐｐｍの前駆体質量公差；±１０ｐｐｍの生成物質量公差、並びに３０％の最小一致ピーク強度を含む。個々のスペクトルのペプチドスペクトル一致（ＰＳＭ）を、ＰＳＭレベル＜１％ ＦＤＲで標的デコイに基づくＦＤＲ推定を適用するために、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ自動検証モジュールを使用して確実に割り当てられたものとして自動的に指定した。ペプチドの自動検証は、スコアを最適化するための自動閾値戦略を用いて各試料について別々に行い、デルタランク１－ランク２スコア閾値は、試料当たりの全てのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実行にわたる各前駆体電荷状態（１～４）について別々に行った。スコア閾値の決定はまた、ペプチドが７の最小配列長を有し、ＰＳＭが５の最小骨格切断スコア（ＢＣＳ）を有することを必要とした。ペプチド及びＰＳＭのエクスポートを、空のビーズ試料中で同定された潜在的なキャリーオーバーペプチド及びペプチドを含む汚染物質についてフィルタリングした。ＩＦＮγ＋／－試料のより公平な比較のために、ＰＳＭを、両方の条件について同様の細胞数及びのＩＰ入力に類似する生のファイルによって濾過した。
ｆ．全プロテオーム解析及び解釈
ＭＣＣ細胞株のタンパク質発現を、前述のように評価した（Ｍｅｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １３（７）：１６３２－６１。簡潔に述べると、ＩＦＮγ処理の有無にかかわらず、ＭＣＣ細胞株の細胞ペレットを８Ｍの尿素中で溶解し、ＬｙｓＣ及びトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してペプチドに消化した。４００μｇのペプチドを、ＴＭＴ１０試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１２６－ＭＣＣ２９０、１２７Ｎ－ＭＣＣ３５０＿ＩＦＮ、１２７Ｃ ＭＣＣ２７５＿ＩＦＮ、１２８Ｎ ＭＣＣ２７５、１２８Ｃ ＭＣＣ３５０、１２９Ｎ＿ＭＣＣ３０１＿ＩＦＮ、１２９Ｃ－ＭＣＣ２７７、１３０Ｎ－ＭＣＣ２９０＿ＩＦＮｙ、１３０Ｃ ＭＣＣ２７７ ＩＦＮ、１３１ ＭＣＣ３０１）で標識し、次いで、その後の分画及び分析のためにプールした。プールしたペプチドを、オフライン高ｐＨ逆相分画を使用して２４個の画分に分離した。１画分当たり１μｇを、分析カラム（２０～３０ｃｍ、１．９μｍのＣ１８ Ｒｅｐｒｏｓｉｌビーズ（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＨＰＬＣ ＧｍｂＨ）、社内充填ＰｉｃｏＦｒｉｔ ７５μＭ内径、１０μＭ発光体（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ））に装填した。ペプチドを、６～３０％の緩衝液Ｂ（０．１％のＦＡ又は０．５％のＡｃＯＨ、及び８０％又は９０％のＡＣＮのいずれか）の範囲の直線勾配（ＥａｓｙＮａｎｏＬＣ １０００又は１２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で８４分間、３０～９０％のＢで９分間溶出し、９０％の緩衝液Ｂで５分間、２００ｎｌ／分で保持した。データ依存的取得の間、ペプチドをＦｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。フルスキャンＭＳは、３００～１，８００ｍ／ｚの６０，０００で取得した。ＡＧＣ目標を４ｅ５及び５０ｍｓに設定した。サイクル当たりの上位２０個の前駆体を、６０，０００分解能で、０．７ｍ／ｚ、３４ ＮＣＥ、３ｅ４ ＡＧＣ標的、及び５０ｍｓの最大注入時間の単離幅でＨＣＤ断片化に供した。動的排除を有効にし、持続時間を４５秒とした。
ＭＣＣバリアントを除外した上記のデータベースに対してＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌを使用してスペクトルを検索して、トリプシンを指定し／消化酵素としてのＰを許容（Ｋ－Ｐ及びＲ－Ｐ切断を許容）し、４つの未切断を許容した。システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定した。ＴＭＴ標識は、リジンで必要とされたが、ペプチドＮ末端は、標識又は非標識のいずれかとすることができた。検索した可変修飾には、タンパク質Ｎ末端のアセチル化、酸化メチオニン、ピログルタミン酸、脱アミドアスパラギン、及びピロカルバミドメチルシステインが含まれる。マッチ許容値を、ＭＳ１及びＭＳ２レベルで２０ｐｐｍに設定した。ＰＳＭスコア閾値化は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ自動検証モジュールを使用して、ペプチドスペクトラムマッチ（ＰＳＭ）レベル及びタンパク質レベルでの２つのステップで標的－デコイベースのＦＤＲを適用した。ステップ１では、ＰＳＭレベルの自動検証は、最初に、最小配列長８の自動閾値戦略、自動可変範囲前駆体質量フィルタリング、並びに最適化したスコア及びデルタランク１－ランク２スコア閾値を使用して行い、各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実行での各前駆体電荷状態について、前駆体電荷２～４のＰＳＭレベルのＦＤＲ推定値＜１．０％を得た。前駆体電荷５～６について合理的な統計を得るために、閾値を最適化して、より高い電荷状態に対して生成されるスペクトルがより少ないため、実験当たり（各実行当たりではなく）全てのＬＣ実行にわたって、０．５％未満のＰＳＭレベルのＦＤＲ推定値を得た。ステップ２では、標的タンパク質レベルのＦＤＲ閾値０を使用して、ＰＳＭを更にフィルタリングするために、タンパク質研磨自動検証を各実験に適用し、タンパク質グループ化方法は、サブグループを拡大し、上位は絶対最小タンパク質スコア９有する共有（ＳＧＴ）を使用する。
ｇ．ＯＲＦスクリーニング
１３，８３３個の遺伝子にマッピングする１６，１７２個の固有のＯＲＦを含む、ヒトＯＲＦｅｏｍｅバージョン８．１レンチウイルスライブラリは、Ｂｒｏａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍからの贈り物として提供された。７５００万個のＭＣＣ３０１ＶＰ細胞を、ＯＲＦｅｏｍｅレンチウイルスで形質導入して、３０％～４０％の感染率を達成した。２日後、形質導入細胞を、３日間の０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン処理で選択した。形質導入の７～１０日後、細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ抗体（Ｗ６／３２クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１１４０５）で染色し、ＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ染色の上位及び下位１０％についてゲーティングしたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで選別した。その後、安定して組み込まれたＯＲＦ配列を含むゲノムＤＮＡを、選別された細胞から単離した。スクリーニングを３回行った。次いで、単離されたゲノムＤＮＡを、構築物バーコード領域のインデックスＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。プールされたＰＣＲ生成物を精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ上で実行した。
ｈ．ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ－ＫＯレンチウイルスライブラリの生成
ＢｒｕｎｅｌｌｏヒトＣＲＩＳＰＲノックアウトプールプラスミドライブラリ（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ３４（２）：１８４－９１）（１ベクター系）は、Ｄａｖｉｄ Ｒｏｏｔ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｄｏｅｎｃｈ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７３１７９）からの贈り物であった。５０ｎｇのＢｒｕｎｅｌｌｏヒトＣＲＩＳＰＲノックアウトプールプラスミドライブラリ（１ベクター系）を、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ Ｓｔｂｌ４コンピテント細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号＃１１６３５０１８）にエレクトロポレーションし、２４．５×２４．５ｃｍの寒天バイオアッセイプレート上で３０℃で一晩インキュベートした。２０時間後、コロニーを採取してプールし、増幅したプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を抽出して精製した。増幅後にライブラリ多様性が維持されたことを確認するために、ｓｇＲＮＡバーコード構築領域を増幅前及び増幅後のライブラリアリコートにおいてＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ生成物を精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で配列決定した。増幅前及び増幅後のアリコートからの配列決定データを比較して、同様の多様性を確保した（図３Ａ）。レンチウイルスを産生するために、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、カタログ番号＃ＭＩＲ２３００）を使用して、ｐＤＮＡ、ＶＳＶ．Ｇ、及びｐｓＰＡＸ２プラスミドでトランスフェクトした。レンチウイルスを、トランスフェクションの４８時間後に採取し、急速凍結した。レンチウイルスを力価化するために、１５０万個の細胞のＭＣＣ－３０１細胞を、１００、２００、３００、５００、及び７００μＬのウイルスで形質導入した。各条件から、細胞の半分を０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンで選択した。感染率は、選択された条件及び選択されていない条件での生細胞カウントを比較することによって計算した。
ｉ．ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯスクリーニング
１９，１１４遺伝子を標的とする７６，４４１のｓｇＲＮＡを含有するヒトＢｒｕｎｅｌｌｏ ＣＲＩＳＰＲノックアウトプールプラスミドライブラリは、Ｄａｖｉｄ Ｒｏｏｔ及びＪｏｈｎ Ｄｏｅｎｃｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号＃７３１７８）からの贈り物であった。次いで、Ｂｒｕｎｅｌｌｏプラスミドライブラリを形質転換し、エレクトロコンピテントＳｔｂｌ４細胞内で増殖させ、レンチウイルスをＨＥＫ－２９３Ｔ細胞内で産生した。その後の形質導入及びＦＡＣＳスクリーニングは、以下の例外を除いて、ＯＲＦスクリーニングに類似して３回行った：１億５０００万個のＭＣＣ３０１ＶＰ細胞は、複製ごとに形質導入され、形質導入の数日後に細胞を選別した。更に、形質導入後、フローサイトメトリー選択の前に、代表的なペレット（４０００万個の細胞）を採取し、３つの複製全てから配列決定して、ｓｇＲＮＡの表現を評価した（図４Ｆ）。
ｊ．スクリーニングデータ分析
未処理のＦＡＳＴＱ読み取りを、ＰｏｏｌＱソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、各構築物についてｌｏｇ正規化スコアに変換した。３つの複製の各々について、上位と下位の１０％スコア間のｌｏｇ倍率変化（ＬＦＣ）を、各構築物について計算した。ＯＲＦスクリーニングの場合、次いで、ＯＲＦ構築物を、それらの中央値ＬＦＣに基づいてランク付けし、対応するｐ値を、超幾何分布モデル（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して計算した。ＣＲＩＳＰＲスクリーニングの場合、平均ｓｇＲＮＡ表現（図４Ｃ）によって測定して、不良な試料品質のために複製２を廃棄し、各ｓｇＲＮＡのＬＦＣ値を複製１と３との間で平均化し、次いでＳＴＡＲＳソフトウェア（ｖ１．３、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）上記参照）に入力し、それらに対応する個々のｓｇＲＮＡのランクに基づいて遺伝子をランク付けするために二項分布モデルを用いた。
ｋ．ＣＲＩＳＰＲ ＫＯ株の生成
配列５’ＣＡＣＣＧ－－－－ｓｇＲＮＡ配列－－－３’及び５’ＡＡＡＣ－－－ｓｇＲＮＡの逆相補鎖－－－Ｃ３’を有する順方向及び逆方向オリゴは、Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって合成された。順方向及び逆方向のオリゴをアニーリングしてリン酸化し、ＢｓｍＢＩ適合性オーバーハングを産生した。ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号＃５２９６１）をＢｓｍＢＩで消化し、エビアルカリホスファターゼで脱リン酸化し、ゲル精製した。ベクター及びインサートを、室温でＴ７ ＤＮＡリガーゼと１：８の比率でライゲーションし、Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換した。以下のプライマー：５’－ＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴ－３’を使用したＳａｎｇｅｒ配列決定により、正しいｓｇＲＮＡクローニングを確認した。レンチウイルスを産生し、ＭＣＣ－３０１細胞を、ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯライブラリと同様の方法で単一の構築物レンチウイルスで形質導入した。
ｌ．全エクソーム配列決定及び変異呼び出し
ゲノムＤＮＡ試料を、約１８０ｂｐのサイズ分布のために最適化されたＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ開発のプロトコルを使用して剪断した。Ｋａｐａ Ｈｙｐｅｒｐｒｅｐキットを使用して、末端修復、独自の分子インデックスを含有する二又アダプターによるアダプターライゲーション、及びＰＣＲを介したＰ５及びＰ７試料バーコードの添加を含む、体細胞試料に最適化されたプロセスでライブラリを構築した。ＳＰＲＩ精製を行い、得られたライブラリをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎで定量化した。ライブラリを正規化し、等モルプーリングを行い、ハイブリダイゼーションのための多重化セットを調製した。自動捕捉を行い、続いて濃縮されたＤＮＡのＰＣＲを行った。ＳＰＲＩ精製をクリーンアップに使用した。次いで、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎで多重プールを定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＤＮＡ断片サイズを推定した。最終ライブラリをｑＰＣＲによって定量化し、標的領域の１３０～１６０倍の平均カバレッジの範囲で、５０倍以上の深度で標的塩基の８５％以上がカバーされるように、適切な数のレーンにわたってＩｌｌｕｍｉｎａフローセルに装填した。
エクソーム配列決定ｂａｍファイルは、Ｇｏｏｇｌｅ Ｃｌｏｕｄ Ｓｔｏｒａｇｅコマンドツールｇｓｕｔｉｌバージョン４．５（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＧｏｏｇｌｅＣｌｏｕｄＰｌａｔｆｏｒｍ／ｇｓｕｔｉｌ／）を使用して、Ｂｒｏａｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆｉｒｅｃｌｏｕｄ／Ｔｅｒｒａプラットフォームからダウンロードした。ｇａｔｋバージョン４．１．２．０（ｄｏ Ｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７（１２）：２７－３５）を使用して、（１）最大ＭＮＰ距離０を使用して、Ｍｕｔｅｃｔ２コマンドで正常なｂａｍ上の参照から変異を呼び出し（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ｂｉｏＲｘｉｖ， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／８６１０５４）、（２）ＣｒｅａｔｅＳｏｍａｔｉｃＰａｎｅｌＯｆＮｏｒｍａｌｓコマンドを使用して、呼び出された正常変異のｖｃｆファイルから正常のパネルを構築し、（３）Ｍｕｔｅｃｔ２コマンドを使用して、それらそれぞれの正常な対応物と比較して、腫瘍及び細胞株の両方の対間で変異を呼び出した。これらのステップでは、以下の注釈を使用した：ｆｔｐ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｂｕｎｄｌｅ／ｂ３７／ｈｕｍａｎ＿ｇ１ｋ＿ｖ３７．ｆａｓｔａからダウンロードしたｂ３７参照配列、ｆｔｐ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｂｕｎｄｌｅ／ｂｅｔａ／Ｍｕｔｅｃｔ２／ａｆ－ｏｎｌｙ－ｇｎｏｍａｄ．ｒａｗ．ｓｉｔｅｓ．ｂ３７．ｖｃｆ．ｇｚからダウンロードした生殖系列リソースｖｃｆ、及びｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ｇａｔｋ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｓｒｃ／ｔｅｓｔ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｌａｒｇｅ／ｗｈｏｌｅ＿ｅｘｏｍｅ＿ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ｃｏｄｉ ｎｇ＿ｖ１．Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ１９．ｔａｒｇｅｔｓ．ｉｎｔｅｒｖａｌ＿ｌｉｓｔからダウンロードしたインターバルリスト。呼び出されたバリアントを、ｇａｔｋ ＦｉｌｔｅｒＭｕｔｅｃｔＣａｌｌｓコマンドでフィルタリングし、ＰＡＳＳとラベル付けされたバリアントを抽出し、下流分析に含めた。
次に、通過したバリアントのｖｃｆファイルを、ｖｃｆ２ｍａｆバージョン１．１６．１７（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｍｓｋｃｃ／ｖｃｆ２ｍａｆ／ｔｒｅｅ／５４５３ｆ８０２ｄ２ｆ１ｆ２６１７０８ｆｅ２１ｃ９ｄ４７ｂ６６ｄ１３ｅ１９７３７からダウンロードした）及びｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｅｎｓｅｍｂｌ／ｅｎｓｅｍｂｌ－ｖｅｐ／ａｒｃｈｉｖｅ／ｒｅｌｅａｓｅ／９５．３．ｔａｒ．ｇｚ（ＭｃＬａｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７（１）：１－１４）からインストールしたバリアント効果予測因子（ＶＥＰ）バージョン９５を使用して、ｍａｆファイルとして注釈を付けた。Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｍａｆｔｏｏｌｓ（Ｍａｙａｋｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（１１）：１７４７－５６）を使用して、遺伝子及び試料による変異の腫瘍プロットを生成した。
ｍ．全ゲノム配列決定及びコピー数分析
全ゲノム配列決定は、Ａｄｍｅｒａ Ｈｅａｌｔｈによって行った。読み取りは、ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅをデフォルト設定で使用して、品質及びアダプターでトリミングした。トリミングした読み取りを、ｈｇ３８及びＭＣＰｙＶ（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＣ＿０１０２７７）を含有する融合参照に対して、ｂｏｗｔｉｅ２－ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅを使用して整列させた。コピー数のバリアント分析は、ＧＡＴＫ４ ＣＮＶ推奨業務を用いて行った。腫瘍由来のＣＮＶを呼び出すために、１７個の正常な血液全ゲノムから正常のパネルを生成した。
ｎ．ＲＮＡ配列決定分析
ＲＮＡ試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＶ２００メトリック）を使用して、最初に品質について評価した。１００ｎｇのＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆トランスクリプターゼ及びＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡアクセス試料調製キットを使用した第１の鎖ｃＤＮＡ合成の入力として使用した。ｃＤＮＡの第２の鎖の合成に続いて、ＵＭＩ（独自の分子インデックス）アダプターを用いたインデックス化アダプターライゲーションを行った。その後のＰＣＲ増幅により、適合断片が濃縮された。増幅されたライブラリを定量化し、正規化し、プールし、エクソーム標的化オリゴとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ビーズクリーニング、溶出、及びＰＣＲを行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルレーン上で配列決定するためのライブラリプールを調製した。トランスクリプトームを、対で少なくとも５０００万回の読み取りのカバレッジまで配列決定した。
線維芽細胞及び角質細胞対照株の生のｆａｓｔｑファイルを、受入コードＳＲＰ１２６４２２（対照試料「ＮＮ」から４回の複製）及びＳＲＰ１３１３４７（条件：対照及び遺伝子型：対照で６回の複製）を使用するＲ ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＳＲＡｄｂ（Ｍａｙａｋｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）上記、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４（１）：１－４）を使用して、ＳＲＡからダウンロードした。これらのｆａｓｔｑファイルを、ｍｋｌ１及びｗａｇａ細胞株のファイルとともに、ＳＴＡＲバージョン２．７．３ａ（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９（１）：１５－２１）を使用し、ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｇｅｎｃｏｄｅ／Ｇｅｎｃｏｄｅ＿ｈｕｍａｎ／ｒｅｌｅａｓｅ＿１９／ＧＲＣｈ３７．ｐ１３．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａ．ｇｚからダウンロードしたインデックスゲノム参照ファイル、ｄａｔａ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｎｏｗｍａｎ／ｈｇ１９／ｓｔａｒ／ｇｅｎｃｏｄｅ．ｖ１９．ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｇｔｆからダウンロードした転写物注釈ファイル、及び以下のオプションを使用して整列させた：－－ｔｗｏｐａｓｓＭｏｄｅ Ｂａｓｉｃ、－－ｏｕｔＳＡＭｓｔｒａｎｄＦｉｅｌｄ ｉｎｔｒｏｎＭｏｔｉｆ、－－ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ １００００００、－－ａｌｉｇｎＭａｔｅｓＧａｐＭａｘ １００００００、－－ｓｊｄｂＳｃｏｒｅ ２、－－ｏｕｔＳＡＭｔｙｐｅ ＢＡＭ Ｕｎｓｏｒｔｅｄ、－－ｏｕｔＳＡＭａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ＮＨ ＨＩ ＮＭ ＭＤ ＡＳ ＸＳ、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＴｙｐｅ ＢｙＳＪｏｕｔ、－－ｏｕｔＳＡＭｕｎｍａｐｐｅｄ Ｗｉｔｈｉｎ、－－ｇｅｎｏｍｅＬｏａｄ ＮｏＳｈａｒｅｄＭｅｍｏｒｙ、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＳｃｏｒｅＭｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ ０、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ ０、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ ９９９、及びｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ ２０。重複は、ｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓバージョン２．２２．０－ＳＮＡＰＳＨＯＴでマークした。
ＭＣＣ腫瘍及び細胞株試料のＲＮＡ配列決定ｂａｍファイルを、Ｇｏｏｇｌｅ Ｃｌｏｕｄ Ｓｔｏｒａｇｅコマンドラインツールｇｓｕｔｉｌバージョン４．５（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＧｏｏｇｌｅＣｌｏｕｄＰｌａｔｆｏｒｍ／ｇｓｕｔｉｌ／）を使用して、Ｂｒｏａｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆｉｒｅｃｌｏｕｄ／Ｔｅｒｒａプラットフォームからダウンロードした。
遺伝子カウントは、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓバージョン２．０．０（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｔ６５６）を使用して、ｂａｍファイルから得た。試料全体の平均カウントが１未満の非常に低い発現遺伝子は、分析から除外された。ＤＥＳｅｑ２ Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）上記、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５（１２）：５５０）のｖｓｔ関数から得られた分散安定化カウントのベクター上のユークリッド距離を使用して、試料間距離メトリックを計算した。
（１）ウイルス陽性及びウイルス陰性試料（共変量として細胞株又は腫瘍について調整する）、（２）細胞株及び腫瘍試料（共変量としてウイルス状態について調整する）、並びに（３）ＤＥＳｅｑ２の陰性二項ＧＬＭ Ｗａｌｄ試験を使用してＩＦＮγプラス及びマイナス試料（共変量としてウイルス状態について調整する）の間で差次的発現分析を行い、ここで、デフォルト設定下で複数の比較について調整したｐ値を使用して、有意性を評価した。試料群間の潜在的な全般的遺伝子発現差異を説明するために、ＲＵＶｇ（Ｒｉｓｓｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ３２（９）：８９６－９０２）を使用して、ｗｗｗ．ｔａｕ．ａｃ．ｉｌ／～ｅｌｉｅｉｓ／ＨＫＧ／ＨＫ＿ｇｅｎｅｓ．ｔｘｔからダウンロードされたハウスキーピング遺伝子のリストから、望ましくない変異の潜在的因子を推定した。次いで、不必要な変動の最大の因子を、ＤＥＳｅｑ２モデルで共変量として使用して、ライブラリサイズとは無関係の潜在的変動を調整した。ｆｇｓｅａ Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して、上述の差次的発現結果に対して遺伝子セット濃縮分析を行った（Ｋｏｒｏｔｋｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ）。
ｏ．ＡＴＡＣ－ｓｅｑ
ＡＴＡＣ配列決定は、Ａｄｍｅｒａ Ｈｅａｌｔｈによって行った。ＡＴＡＣ配列決定は、ｈｇ３８を参照としてペアエンド読み取りについて、Ｋｕｎｄａｊｅ ｌａｂ ＡＴＡＣ ｓｅｑパイプライン（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｕｎｄａｊｅｌａｂ／ａｔａｃ＿ｄｎａｓｅ＿ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ）を使用して分析した。下流分析には、擬似複製物の重複からのピークを使用した。ＡＴＡＣ－Ｓｅｑデータの品質を確認するために、各試料をＣｉｓｔｒｏｍｅ ＤＢ（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７（Ｄ１）：Ｄ７２９－３５）上の一般に公開されているＡＴＡＣ－Ｓｅｑデータセットに対して、ピーク保存性を評価することによってベンチマークした。
ｐ．示差ピーク分析
（１）ウイルス陽性及び陰性試料、並びに（２）ＩＦＮγ応答性及び非応答性（上位４つ及び下位４つに分割＜詳細説明はＰａｔｒｉｃｋ＞）の間の示差ＡＴＡＣ－ｓｅｑピークを、ＤｉｆｆＢｉｎｄ Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して呼び出した（Ｒｏｓｓ－Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８１（７３８１）：３８９－９３）。ＤｉｆｆＢｉｎｄによって呼び出される、ＤＥＳｅｑ２の陰性二項ＧＬＭ Ｗａｌｄ試験からの調整ｐ値を使用して有意性を評価した。ＣｈＩＰｐｅａｋＡｎｎｏ（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １１（Ｍａｙ）：２３７）及びＴｘＤｂ．Ｈｓａｐｉｅｎｓ．ＵＣＳＣ．ｈｇ３８．ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ（ＴｘＤｂ．Ｈｓａｐｉｅｎｓ．ＵＣＳＣ．ｈｇ１９．ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ）Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して、ピークを最も近いＴＳＳを有する遺伝子によって注釈を付けた。視覚化のための比較ＡＴＡＣ－Ｓｅｑデータセットを、ＧＥＯ（ＧＳＭ２７０２７１２－初代Ｂ細胞、ＧＳＭ２４７６３４０－５０１ＭＥＬ細胞株）及びＥＮＣＯＤＥ（ＥＮＣＦＦ６５４ＺＮＩ－初代胎児包皮角質細胞）から抽出した。ＡＴＡＣ－Ｓｅｑトラックを視覚化するために、全てのＢＡＭファイルを、１０ヌクレオチドｂｉｎサイズ、及び１００万読み取り当たりの転写物のキロベース当たりの読み取りの正規化方法（ＲＰＫＭ）を用いて、ｄｅｅｐＴｏｏｌｓからのｂａｍＣｏｖｅｒａｇｅ（ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｎａｒ／ａｒｔｉｃｌｅ／４４／Ｗ１／Ｗ１６０／２４９９３０８）を使用して同一に正規化した。得られたｂｉｇｗｉｇファイルを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３３４６１８２／）において視覚化した。
ｑ．全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定
全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（ＷＧＢＳ）を、Ａｄｍｅｒａ Ｈｅａｌｔｈによって行った。ｈｇ３８参照ゲノムを、Ｂｉｓｍａｒｋを使用して調製した。読み取りを調製したｈｇ３８ゲノムに整列させ、重複排除し、Ｂｉｓｍａｒｋをデフォルト設定で使用してメチル化状態を抽出した。
Ｂｉｓｍａｒｋメチル化カウント出力ファイル（．ｃｏｖ）を、ｂｓｓｅｑ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して鎖崩壊させた（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３（１０）：Ｒ８３）。４未満の試料中で少なくとも１つの読み取りによって覆われたＣｐＧ部位は、更なる分析から除外された。ＴｘＤｂ．Ｈｓａｐｉｅｎｓ．ＵＣＳＣ．ｈｇ３８．ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ（ＴｘＤｂ．Ｈｓａｐｉｅｎｓ．ＵＣＳＣ．ｈｇ１９．ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ）Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージによって注釈を付けた全ての転写物のプロモーター領域（２０００塩基対上流、２００塩基対下流）。次いで、各遺伝子記号に一致する全ての転写物の各プロモーター領域内の全ての部位の生メチル化レベル（メチル化カウントをカバレッジで割ったもの）を平均化した。
ｒ．ＭＣＰｙＶウイルス転写物検出（核酸単離、ライブラリ調製及び配列決定）
ＯｎｃｏＰａｎｅｌ（ｖ３）ｂａｉｔセットによる補充の有無にかかわらずＶｉｒｏＰａｎｅｌを行うために、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、精製したＤＮＡを定量化した。（Ｓｔａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １２：３０）。２００ｎｇのＤＮＡを使用してライブラリ構築を行い、最初に、Ｃｏｖａｒｉｓ ＬＥ２２０フォーカス超音波計（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用して約２５０ｂｐに断片化し、続いてＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して１：１のビーズ対試料比でサイズ選択されたクリーンアップを行った。断片化したＤＮＡを、製造業者の推奨（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリキットを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリに変換した。アダプターライゲーションは、ｘＧｅｎデュアルインデックスＵＭＩアダプター（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を使用して行った。
試料を等体積でプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑナノフローセル上で実行して、バーコード当たりの読み取り数に基づいてライブラリの量を定量化した。全ての試料は、十分なライブラリ（＞２５０ｎｇ）を得て、ハイブリッド捕捉に持ち込んだ。ライブラリを等質量（３×１７－ｐｌｅｘ及び１×１８－ｐｌｅｘ）でプールして、合計７５０ｎｇとした。捕捉は、ＯｎｃｏＰａｎｅｌ（ｖ３）ｂａｉｔセットを用いた補充の有無にかかわらず、ＶｉｒｏＰａｎｅｌを用いたＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ Ｆａｓｔ標的濃縮アッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して行った。捕捉を、急速実行モードのＩｌｌｕｍｉｎａ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上で配列決定した。
ウイルス読み取りを抽出、組み立て、注釈、及び視覚化し、ウイルスインテグレーション部位を決定するために、カスタムｐｅｒｌスクリプトを記述した。ウイル読み取り及びそれらのメイトは、最初に、ウイルスゲノムに少なくとも１つのメイトマップを有するものによって特定され、抽出された。ウイルス配列を含有する追加の読み取りを、ＭＣＰｙＶゲノムの３１ｂｐ ｋ－ｍｅｒで重複する独自の構築したｂｌｏｏｍフィルターによって特定した。ウイルスゲノムへのメイトマッピングを有する任意の読み取りのヒトゲノム位置をＢＥＤファイルに出力し、ウイルス対及びヒト対の配向を記憶して、重複したインテグレーション部位を正確に分断した。このＢＥＤファイルは、その範囲に重複する読み取り数をカウントする配向に基づいて、重複する範囲にマージされた。インテグレーション接合部のカバレッジの歪みは、前述の範囲の前半及び後半で重複するウイルス－ホスト読み取りペアの分画の差によって計算された。この歪み値を使用して、ウイルス－宿主接合部の配向を決定し（すなわち、正の値、接合部は範囲の３’末端にあり、負の値、接合部は範囲の５’末端にある）、これをデノボアセンブリの結果から検証した。デフォルトパラメータを有するＳＰＡｄｅを使用して、抽出した読み取りからインテグレートされたウイルスゲノムを組み立てた。ＳＰＡｄｅｓからのアセンブリグラフを、ｈｇ１９及びＭＣＰｙＶ参照ゲノムに対するｂｌａｓｔｎを使用して、ｅ値カットオフ１×１０－１０で注釈を付けた。注釈付きアセンブリグラフを、ｇｇｒａｐｈ Ｒパッケージを使用して視覚化した。
参照誘導アラインメント及びアセンブリデータによって確認されたインテグレーション部位を、ウイルスゲノム及びヒトゲノム上のインテグレーション接合部の上流及び下流の１０ｂｐを選択することによって、ヒトゲノムとウイルスゲノムとの間のマイクロホモロジーの伸長について分析した。これらの配列内で、２つの塩基対よりも長い同じ位置での同一の配列の伸長をカウントした。配列間の全体的な相同性は、Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ距離によって計算した。ウイルスＤＮＡとヒトＤＮＡとの間に１～２５ｂｐの範囲の不定ＤＮＡ配列を挿入した３つのインテグレーション接合部を分析から除外した。予想されるマイクロホモロジーは、ヒト及びＭＣＰｙＶゲノムから非Ｎ含有配列の１０００個の２０ｂｐ対をランダムに選択することによって計算した。
反復要素へのインテグレーション部位の近接性は、最も近いｂｅｄｔｏｏｌｓ及びＵＣＳＣゲノムブラウザから取得したｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ注釈を使用して決定した。ヒトゲノム中の１０００個の部位をランダムに選択することによって、反復要素の近くでのインテグレーションの予想される頻度を決定した。反復要素の２ｋｂ以内の部位を近接としてカウントした。
体細胞変異及びウイルスインテグレーション事象の機能的注釈を、ＰＡＮＴＨＥＲ（ｗｗｗ．ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ）を使用して行った。
ｓ．ＲＮＡ－ｓｅｑのウイルス転写物定量化
メルケル細胞ポリオーマウイルス参照配列を、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＥＵ３７５８０４＆ｄｉｓｐｌａｙ＝ｆａｓｔａからダウンロードした。マッピングされていない読み取りを、ＳＡＭｔｏｏｌｓビューバージョン１．１０（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５（１６）：２０７８－７９）を使用して、腫瘍及び細胞株のＲＮＡ－ｓｅｑ ｂａｍファイルから抽出し、ｂｗａバージョン０．７．１７－ｒ１１８８（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ ２０１０）を使用して、ＭＣＣポリオーマウイルス参照配列に再整列した。最後に、ＭＣＣポリオマウイルス参照に良好にマッピングされた各試料の読み取り数を、ＳＡＭｔｏｏｌｓビューでカウントした。
ｔ．依存性マップの相関関係
ＤｅｐＭａｐ ２０Ｑ２ ＣＲＩＳＰＲ依存性データは、ｗｗｗ．ｄｅｐｍａｐ．ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／からダウンロードした。少なくとも１つのコード変異の基準に基づいて、ＤｅｐＭａｐポータル上のＣｅｌｌ－Ｌｉｎｅ Ｓｅｌｅｃｔｏｒツールを使用して、ＴＰ５３変異状態を割り当てた。ピアソン係数を、Ｒ中のｔｅｓｔ．ｃｏｒを使用して計算し、この関数によって出力された両側ｐ値を、ｐ．ａｄｊｕｓｔを使用してＦＤＲに変換した。ｇｇｐｌｏｔ２、ｔｉｄｙｖｅｒｓｅ、ｇｒｉｄＥｘｔｒａ、ｃｏｗｐｌｏｔ、及びスケールを使用して、プロットを生成した。ＧＳＥＡは、ピアソン相関が負の場合、－ｌｏｇ（ｐ－ｖａｌ）に（－１）を乗じてランク付けされた遺伝子リストを使用して行った。
ｕ．定量化及び統計分析
全ての統計分析の詳細とともに、バージョン番号を含む特定のソフトウェアパッケージは、上記のそれぞれの方法の節に列挙されている。研究の一部として、ランダム化手順又は試料サイズの計算は実行されなかった。全エクソーム配列分析、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ示差ピーク解析、ＭＣＰｙＶウイルス転写物検出、及びＷＧＢＳプロモーターシグナル抽出のための特定のパラメータ設定を含む全ての分析コードは、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｄｋｏｒｔｈａｕｅｒ／ＭＣＣのＭＩＴライセンスの下でＧｉｔｈｕｂリポジトリで利用可能になる。Ｒにおける全ての解析は、バージョン３．６．２を使用して実行した。
ｖ．オリゴ、プライマー、及び主要なリソース
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実施例２：ＭＣＣ細胞株は、一次患者試料から確実に生成される。
典型的にはＲＰＭＩ－１６４０ベースの培地製剤で培養される多くの確立されたＭＣＣ株は、インビトロで多重継代されており、関連するアーカイブ原発腫瘍材料及び臨床データが一般的に欠如している。患者標本から直接一連の株を確立するために、条件を最適化して、ＭＣＣ細胞株をインビトロで増殖させるための信頼できるアプローチを生成した。ＭＣＣ腫瘍は神経内分泌組織学を示し、ＭＣＣ株の別のパネルが修飾された神経堤幹細胞培地で良好に確立されていたため、以前に膠芽腫多形腫瘍細胞株を確立するために使用された神経幹細胞培地でこれらの細胞株を培養することが細胞株の確立を促進すると仮定した。ＭＣＣ－３３６腫瘍標本上で５つの培地製剤を試験し、増殖因子補充を伴うＮｅｕｒｏｃｕｌｔ ＮＳ－Ａ増殖培地は、一貫して最高のインビトロ増殖率を提供し、培養７日後に細胞数を３倍にした（図１Ａ）。
この方法を使用して、生検（ｎ＝４）又は患者由来異種移植片（ＰＤＸ）材料（ｎ＝７）から合計１１の安定した細胞株を確立した（表６）。以前に確立されたＭＣＣ株と一致して、これらの細胞株は、懸濁液中の緊密なクラスターでほとんど成長することが観察され、ＭＣＣの古典的な免疫組織化学マーカーであるＣＫ２０及びＳＯＸ２では陽性に染色された（図１Ｂ、１Ｃ）。ハイブリッドキャプチャベースの配列決定プラットフォームであるＶｉｒｏ－Ｐａｎｅｌを使用して、４４７個のがん関連遺伝子及び１９個の腫瘍ウイルスを検出したところ、１１株のうち７株がＭＣＰｙＶに陽性であり、４株がＭＣＰｙＶ－であった（図１Ｄ）。
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１１人の患者のうち７人について、マッチした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が利用可能であり、そこから生殖系列ＤＮＡを抽出した。マッチした原発腫瘍、細胞株、及び生殖系列供給源からのＤＮＡの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）、並びにＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）をこれらの株について行った。これらの研究は、ＭＣＣの特徴的な遺伝的改変を示す細胞株、並びに対応する腫瘍と細胞株との間のゲノム及び転写の類似性を明らかにした（表６）。ＭＣＰｙＶ－及びＭＣＰｙＶ＋試料は、それぞれ、予想される対照的な高い（細胞株当たりの非サイレントコーディング変異の中央値６４７、範囲３５４～９４０）及び低い（中央値４０、範囲１８～７３）変異負荷を示した（図１Ｅ及びデータ未掲載）。更に、２つの分析されたＭＣＰｙＶ－株は、いずれも、以前の研究と一致して、ＲＢ１及びＴＰ５３（データ未掲載）における変異を含んでいた（Ｇｏｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（３）：３４０３－１５）、Ｋｎｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９ａ）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１９）：５９６１－７１）。各細胞株において見出された変異のうち、９４．４％の中央値は、対応する腫瘍又はＰＤＸ試料においても検出され（範囲５１～１００％）、変異プロファイルに基づいて、腫瘍－細胞株対が互いに最も密接に関連していた（図１Ｆ）。注目すべきことに、いくつかのＰＤＸ由来の腫瘍試料（表６）は、マウス細胞汚染に起因する可能性が高い、それらの対応する細胞株（図１Ｅ）よりも高い変異負荷を示した。
ＲＮＡｓｅｑデータ内で、ＭＣＰｙＶ ＳＴ及びＬＴ抗原にマッピングする転写物を、ＶｉｒｏＰａｎｅｌ（図１Ｄ、１Ｇ）によってＭＣＰｙＶ＋であることが決定された全ての試料においてデータ検出した。ＲＮＡ－ｓｅｑに基づくＭＣＣ腫瘍及び細胞株の無監督階層クラスタリング分析によって、各細胞株は、試料のタイプによるクラスタリングではなく、対応する親腫瘍と最も密接に関連することが観察され（平均ペアワイズスピアマン相関０．９２）（図１Ｈ）、これらの細胞株が、それらが由来する腫瘍を忠実に再現することを確認した。加えて、リボ－ｓｅｑを使用して、翻訳された注釈なしのＯＲＦを予測することができる（図１Ｉ）。
親腫瘍に関して生成された細胞株の遺伝子プロファイル及び転写プロファイルにおける一貫性に加えて、これらの株はまた、それらの親腫瘍のような表面ＨＬＡ Ｉ表面発現における一貫した欠陥を示した。汎クラスＩ抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体を使用したフローサイトメトリーによって、１１株全てが、顕著に低く、ほとんど存在しないＨＬＡ Ｉを示した（図１Ｊ）。ＭＣＣ細胞上のかかるインサイツＨＬＡクラスＩ発現の不在は、４株の親腫瘍の免疫組織化学染色によって確認された（図１Ｋ）。更に、フローサイトメトリーによる低いクラスＩ表面発現は、十分に研究されたＭＣＰｙＶ＋株ＭＫＬ－１及びＷａＧａと同等であった（図１Ｌ）。３つの株は、ＩＦＮ－ｙ曝露に応答しなかったが（ＭＣＣ－３３６、－３５０、－３５８）、８つの株は、ＩＦＮ－ｙ曝露によって誘導され得るＨＬＡ Ｉ表面発現を示した（ＭＦＩによる中央値５．７倍の増加、範囲２．５～１２．４）。２つの株について、ＨＬＡ Ｉは、ＩＦＮ－ａ－２ｂ及びＩＦＮ－１３（図１Ｍ）によって上方制御され得、別の株（ＭＣＣ－３０１）は、ＩＦＮ－ｙを伴う誘導性ＨＬＡ－ＤＲ発現を同様に有していた（図１Ｎ）。これらのデータは、ＭＣＣ試料の大部分が、ゲノムレベルではなく、転写レベルで可逆的なＨＬＡクラスＩ経路の欠陥を有することを示唆する。
実施例３：ＭＣＣ株は、基礎となるＮＬＲＣ５改変を伴う複数のクラスＩ遺伝子の転写下方制御を示す。
ＭＣＣ株における障害されたＨＬＡ Ｉ表面発現の機構を解明するために、材料が利用可能であるウイルス陽性及び陰性の両方の株のサブセットについて、詳細なゲノム及びエピゲノム特性評価を行った（表７）。ＩＦＮ－ｙ曝露後のＭＣＣにおける遺伝子発現の改変を定義するために、ベースライン時及びＩＦＮ－ｙ刺激後の１１個のＭＣＣ株全てにおいて、転写物発現を評価した。表皮角質細胞及び皮膚線維芽細胞は、それぞれＭＣＰｙＶ－及びＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣの細胞起源の有力な候補であり（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３７（１１）：１４０９－１６）、両方とも皮膚内に常在するため、ＭＣＣ株の発現を、それらの細胞と比較した（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １２（１２）：ｅ０１８９６６４）、Ｓｗｉｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（１）：１８０４５）。ベースライン時に、ＭＣＣ株は、いくつかのクラスＩ経路遺伝子、最も顕著にはＨＬＡ－Ｂ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＰＳＭＢ８、及びＰＳＭＢ９の低いｍＲＮＡ発現を示し、２つのよく研究されたＭＣＣ細胞株であるＭＫＬ－１及びＷａＧａにおいて、発現プロファイルは概して類似していた（図２Ａ）。ＩＦＮ－ｙ処理は、１１個のＭＣＣ株のうちの１０個においてクラスＩ遺伝子を顕著に上方制御し（図２Ｂ、表８）、この傾向は、４つのＭＣＣ株のマッチしたプロテオームにおいて確認された（図２Ｃ）。フローサイトメトリー（図１Ｉ）によって非ＩＦＮ応答性であったＭＣＣ株は、ＩＦＮ誘導ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ ｍＲＮＡ上方制御（ＭＣＣ－３３６）の欠如、並びにＩＦＮ誘導ＳＴＡＴ１／ｐ－ＳＴＡＴ１タンパク質発現の欠如（図２Ａ、２Ｄ、２Ｅ）などの可変欠陥を示した。
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ＭＣＣ細胞のバルクトランスクリプトーム配列決定で観察されたＨＬＡ Ｉ下方制御における不均一性の程度を調べるために、ＨＬＡ発現を、高スループット液滴ベースの単一細胞トランスクリプトーム分析によって２つの新鮮なＭＣＣ生検（ＭＣＣ３５０［ＭＣＰｙＶ－］及びＭＣＣ３３６［ＭＣＰｙＶ＋］）について評価した。Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒを使用して両方の試料からの読み取りをｈｇ１９に整列させ、Ｓｅｕｒａｔパイプラインを使用して転写物量を分析した（実施例１を参照のこと）。試料ＱＣに続いて、細胞をＬｏｕｖａｉｎクラスタリングを使用してグループ化した。２つの試料にわたって同定された合計ｘｘ １５，８０８個の細胞（平均４２３１．９遺伝子／細胞）から、７つの異なる転写的に定義されたクラスターが検出された。ＣＤ４５発現によって同定された免疫細胞は、クラスター６を含み、クラスター０～５は、ＳＯＸ２、ＳＹＰ、及びＡＴＯＨ１の発現によって同定されたＭＣＣ細胞であった（図２Ｆ、２Ｇ）。全てのＭＣＣクラスターは、ＭＣＣ細胞株における表面ＨＬＡ Ｉ発現の前述のバルク特性評価と一致して、ほぼ不在のＨＬＡ－Ｂ、ＴＡＰ１／２、ＰＳＭＢ８／９、及びＮＬＲＣ５発現、並びに低ＨＬＡ－Ａ及び－Ｃ発現を示した（図２Ｆ、２Ｈ）。対照的に、クラスター６（免疫細胞）は、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ転写物の平均８．２２倍高い発現を示した。
複数のクラスＩ遺伝子の顕著なＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの下方制御を考慮して、最初に、これらの観察のための可能な遺伝的基盤を特定しようとした。ＷＥＳによって、ＭＣＣ－３２０におけるＨＬＡ－Ｆ及び－Ｈ変異を除いて、ＭＣＣ株は、２７の正準ＨＬＡ Ｉ経路遺伝子において顕著な体細胞変異を有していなかった（表９）。インターフェロン遺伝子（ＲＥＡＣＴＯＭＥ＿ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ＿ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ遺伝子セット内に含まれるもの）で合計３２個の変異が検出されたが、Ｐｏｌｙｐｈｅｎによっておそらく損傷していると予測されたのは２個のみであり、正準インターフェロン遺伝子ＩＦＮＧＲ１／２、ＪＡＫ１／２、ＳＴＡＴ１、及びＩＲＦ１／２では変異は検出されなかった（表９）。しかしながら、ＮＬＲＣ５のコピー数損失は、コピー数変動分析を行った８つの株中５つで検出された（図２１及びデータ未掲載）。ＮＬＲＣ５は、これらの遺伝子のプロモーターにおける保存されたＳ／Ｘ／Ｙ領域に局在するいくつかのＨＬＡ Ｉ経路成分（すなわち、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｅ、－Ｆ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及びＰＳＭＢ９（ＬＭＰ２））の転写活性化因子であり、ＭＣＣ株におけるＮＬＲＣ５とこれらの他のクラスＩ遺伝子との間に正の相関が観察された（図２Ｊ）。マッチした全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定の分析により、他のクラスＩ抗原提示遺伝子と比較したＮＬＲＣ５プロモーターの過メチル化も検出され（図２Ｋ、表１０）、ＭＣＣにおいてＮＬＲＣ５が抑制され得る更なる機構が示唆された。これらの観察と一致して、ＮＬＲＣ５コピー数の損失及びプロモーターメチル化は、多様ながんにわたる一般的な変化として最近認識されている。エピジェネティックな風景を更に調べるために、クラスＩ経路遺伝子におけるクロマチンアクセシビリティもまた、ＡＴＡＣ－Ｓｅｑデータを使用して調査した（図２Ｌ－２Ｎ）。ＮＬＲＣ５の分析は結論が出ないことがわかったが、角質細胞、Ｂ細胞、及びＮＬＲＣ５などの対照と比較して、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの転写開始部位に明確なピークが見られないことから、黒色腫株５０１－Ｍｅｌ（図２Ｌ、２Ｏ）－Ｃ及びＮＬＲＣ５（図２Ｌ）が観察され、クラス１遺伝子のエピジェネティックサイレンシングの更なる証拠が示された。
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Figure 2023529026000144
Figure 2023529026000145
実施例４：ＩＦＮ－γ誘導ＨＬＡ Ｉ上方制御は、ＨＬＡペプチドームのシフトに関連している。
ＨＬＡ Ｉの発現の低下は、ＭＣＣにおけるＨＬＡ提示ペプチドの数及び多様性の低下をもたらし、腫瘍の免疫原性に影響を与えることが予想される。実際、汎ＨＬＡクラスＩ抗体を用いた腫瘍細胞溶解物の免疫沈降に続いて（図３Ａ、方法を参照のこと）、質量分析によるクラスＩ結合ペプチドの直接検出のための標準的なワークフローを使用して、ベースラインでの同様に低い総ペプチドカウントが、親腫瘍及び細胞株で検出された。ＩＦＮ－γ刺激に続いて、クラスＩ結合ペプチドの存在量の中央値２５倍の増加が、４つの細胞株にわたって検出された（図３Ｂ）。ベースライン時に、腫瘍と細胞株との間で免疫ペプチドームアミノ酸シグネチャの高いレベルの相関が観察されたが、ＩＦＮ－ｙ処理の前後では、細胞株間で低い相関が観察された（図３Ｃ）。細胞株ペプチドームは、それらのペプチドの５０％超を対応する腫瘍ペプチドームと共有し（図３Ｄ）、同様の結合モチーフを示したが、ＩＦＮ－γ処理は、全体的なモチーフを改変するように見えた（図３Ｅ）。これらの観察を更に調べるために、同定されたペプチドが結合した最も可能性の高いＨＬＡ対立遺伝子を推測した。各クラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子上に提示されるペプチドの推定頻度は、対応する腫瘍と細胞株との間で類似していた（図３Ｆ、３Ｇ）。ＩＦＮ－γに曝露されたか、又は曝露されていない細胞株を比較した場合、各ＨＬＡ対立遺伝子にマッピングするペプチドの頻度に劇的な変化が観察され、最も顕著には、ＨＬＡ－Ｂ提示ペプチドの増加である（図３Ｅ、３Ｈ）。これは、プロモーターに２つのインターフェロン応答性要素を有するＨＬＡ－Ｂに起因するＨＬＡ－Ａよりも、インターフェロンがＨＬＡ－Ｂを強く上方制御するという以前の観察と一致する。
ＭＣＰｙＶ＋株について、ＩＦＮ－ｙ刺激に続くＨＬＡ Ｉのこの上方制御が、ＭＣＰｙＶ特異的エピトープを提示する能力の増加をもたらすと仮定した。実際に、ＭＣＰｙＶ＋株であるＭＣＣ－３６７に関して、ＬＴのＯＢＤドメイン（ＴＳＤＫＡＩＥＬＹ）に由来するペプチド配列が検出され、これは、その細胞株のＨＬＡ ＊Ａ０１０１に対する強力な結合剤として予測された（ランク＝０．０１８、ＨＬＡｔｈｅｎａ）（Ｓａｒｋｉｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ ３８（２）：１９９－２０９）。
実施例５：相補的ゲノムスケールの機能喪失及び獲得スクリーニングは、ＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉ発現の既知かつ新規の潜在的制御因子を特定する。
ＮＬＲＣ５コピー数の損失及びプロモーターメチル化は、ＨＬＡ Ｉ経路のサイレンシングを実施する際の寄与因子として特定されたが、少なくとも３つの株（ＭＣＣ－２９０、－３０１、－３２０）は、正常なＮＬＲＣ５コピー数を示し、低レベルのＨＬＡ Ｉ発現を有していた。したがって、高レベルのＨＬＡ Ｉ表面損失及び複数のクラスＩ成分の下方制御の基礎となる代替経路及び機構の同定が試みられた。
この目的のために、対合したゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲ－ＫＯ機能喪失及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）機能獲得スクリーニングは、ＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉ表面発現の新規の制御因子を体系的に特定するように設計された。これらのスクリーニングは、ウイルス陽性ＭＣＣ－３０１株で実施されたが、これはその堅牢な成長速度のためであり、またその低い変異背景のためでもあり、制御解除された遺伝子の役割に焦点を当てることを可能にした。また、このＭＣＰｙＶ＋コンテキストで特定された新規の影響を受けた経路が、ＭＣＰｙＶ－ＭＣＣでミラーリングされると仮定し、ここで、ＨＬＡ Ｉ抑制は、これらの同じ経路に影響を与える体細胞変異を通じて達成され得る。ＭＣＣ－３０１細胞を、ＯＲＦ又はＣａｓ９＋ｓｇＲＮＡ構築物のいずれかを含有するゲノムワイドレンチウイルスライブラリを用いて低い感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体で細胞を染色した後、ＨＬＡ Ｉ－高集団及びＨＬＡ Ｉ－低集団は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく細胞選別単離を行い、各スクリーニングは、生物学的に３回行った（図４Ａ）。注目すべきことに、ＣＲＩＳＰＲライブラリではなくＯＲＦライブラリでの形質導入は、おそらくインターフェロン関連遺伝子ＯＲＦ発現細胞からのインターフェロン分泌に起因して、ＨＬＡ Ｉ表面発現の全集団的な増加をもたらした。これは、ＯＲＦライブラリ特異的効果であり、ＧＦＰ形質導入細胞が表面ＨＬＡ Ｉの増加を示さなかったため、レンチウイルス形質導入プロセスによるものではなかった（図４Ｂ）。ＯＲＦスクリーニングについては、３回の複製から中央値の構築物ｌｏｇ２倍率変化があったが、ＣＲＩＳＰＲスクリーンについては、試料の質が不良であった１回の複製を破棄し、残りの２回の高品質の複製を平均化した（図４Ｃ）。
ＯＲＦスクリーニングは、ｌｏｇ２倍率変化の中央値の２倍超の増加（ＨＬＡ Ｉ－高対ＨＬＡ Ｉ－低における濃縮）を伴って７５回のヒットを生じさせた。予想どおり、これらのヒットは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって、インターフェロン及びＨＬＡ Ｉ経路遺伝子について高度に濃縮された（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０２（４３）：１５５４５－５０）（図４Ｄ、表１及び２）。いくつかの実施形態では、２倍の変化（例えば、増加又は減少）を使用して、表１、２、３、４、又は５内からバイオマーカーを選択する。上位のヒットはＩＦＮＧであり、インターフェロンシグナル伝達経路遺伝子は上位１２のうちの４つを含む。加えて、ＨＬＡ－Ｂ及び－Ｃは、それぞれ、ヒット＃１０及び＃３８であった。顕著には、ＭＹＣＬは、上位のネガティブヒットであることがわかった（図４Ｄ）。ＭＹＣＬは、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣにおける中心的な転写因子であり、ＳＴは、ＥＰ４００クロマチン修飾因子複合体にＭＹＣＬを結合及び動員して、がん形成に必要な広範なエピジェネティック変化を引き起こす。
ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯスクリーニングはまた、ＨＬＡクラスＩ経路のいくつかの既知の構成要素を特定した。ＦＡＣＳの前のＣＲＩＳＰＲライブラリ形質導入細胞の配列決定により、適切なｓｇＲＮＡ表現が存在することが確認された（図４Ｃ）。次いで、ポジティブヒット及びネガティブヒットを、ＳＴＡＲＳアルゴリズムに従ってランク付けした（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）、上記。上位のネガティブヒット（そのノックアウトがＨＬＡ Ｉ－低集団において最高の濃縮をもたらした遺伝子）は、ＴＡＰＢＰ（図４Ｅ、表１及び２）であり、部分的に折り畳まれたＨＬＡ Ｉ重鎖のシャペロンとして作用し、非結合ＨＬＡ ＩとＴＡＰとの間の結合を促進する主要なクラスＩ経路構成要素であった。ＩＦＮ経路遺伝子ＩＲＦ１（＃２１）及びクラスＩ遺伝子ＣＡＬＲ（＃８４）及びＢ２Ｍ（＃１４１）を含む他の顕著なネガティブヒットも特定されたが、ＧＳＥＡは、タンパク質翻訳に関連する遺伝子セットの濃縮を示した。（図４Ｅ、表１及び２）。
ＣＲＩＳＰＲ正ヒットの中で、ポリコーム抑制性複合体ＰＲＣ１．１のいくつかの構成要素が繰り返し特定され、これには、スクリーンの上位２つのヒットが含まれる：ＢＣＯＲＬ１（＃１）、ＵＳＰ７（＃２）、及びＰＣＧＦ１（＃４６）。各々の場合、これらの遺伝子の少なくとも２つのｓｇＲＮＡについて、＞４．５倍の濃縮が観察された（図４Ｇ）。ＰＲＣ１．１は、ＣｐＧ島におけるＨ２ＡＫ１１９のユビキチン化を通じて遺伝子発現をサイレンシングする非正準ポリコーム抑制複合体である。スクリーニングヒットに加えて、ＰＲＣ１．１複合体の他の構成要素としては、ＫＤＭ２Ｂ、ＳＫＰ１、ＲＩＮＧ１Ａ／Ｂ、ＲＹＢＰ／ＹＡＦ２、及びＢＣＯＲ（ＢＣＯＲＬ１と交換可能）が挙げられる。
両方のスクリーニングにおける顕著なポジティブヒット及びネガティブヒットは、少なくとも２回の複製間で高い一致性を示した（図４Ｉ）。ＯＲＦスクリーニングポジティブヒットを検証するために、インターフェロン又はＨＬＡ Ｉ経路に関連しない上位７１ヒットに焦点を当てて、ＭＣＣ－３０１に単一のＯＲＦ過剰発現株を生成した。フローサイトメトリーを使用して、７１個の候補ヒットのうち８個（１１．３％）が、ＴＦＥＢ、ＣＸｏｒｆ６７、及びＹＹ１を含む形質導入後の生存率も維持しながら、ＭＦＩ（ＨＬＡ－ＡＢＣ）をＧＦＰ形質導入対照と比較して２倍超上方制御することが確認された（図４Ｈ）。
ＣＲＩＳＰＲスクリーニングについては、ＰＲＣ１．１成分ＢＣＯＲＬ１、ＰＣＧＦ１、及びＵＳＰ７に対する２つの最高スコアのｓｇＲＮＡを使用して、一連のＭＣＣ－３０１ ＫＯ株を生成することによって、上位ヒットの標的化検証を行った。Ｃａｓ９によるゲノム編集を、ＴＩＤＥを使用したＳａｎｇｅｒ配列決定によって確認し（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２）：ｅ１６８）図４Ｉ、機能的ノックダウンを、ウエスタンブロット又はｑＲＴ－ＰＣＲによって確認した。各遺伝子のノックアウトは、対照非標的化ｓｇＲＮＡで形質導入されたＭＣＣ－３０１と比較して、フローサイトメトリーによる表面ＨＬＡ Ｉ発現を増加させた（図４Ｊ）。全体として、並列スクリーニングにわたる上位ヒットのレビューは、ポリコーム抑制複合体［ＰＲＣ１．１成分ＵＳＰ７、ＰＣＧＦ１、及びＢＣＯＲＬ１；ＯＲＦヒットＣＸｏｒｆ６７及びＹＹ１；ＰＲＣ２成分ＥＥＤ及びＳＵＺ１２（ＣＲＩＳＰＲポジティブヒット＃１６２及び＃４０９）］並びにＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体［ＭＹＣＬ及びＣＲＩＳＰＲポジティブヒットＢＲＤ８（＃５１）、ＤＭＡＰ１（＃９３）、ＫＡＴ５（＃６１９）、及びＥＰ４００（＃８８６）］に関連するいくつかのヒットを明らかにした。ＭＹＣＬ及びＰＲＣ１．１成分ＵＳＰ７の両方が、ＭＣＰｙＶと直接相互作用することが報告されているタンパク質をコードするため（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １３（１０）：ｅ１００６６６８）（Ｃｚｅｃｈ－Ｓｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９４（５）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＶＩ．０１６３８－１９）（図４Ｋ）、したがって、これらをより詳細な特性評価のために選択した。更に、ＰＲＣ１．１ ＫＯ株のＴＩＤＥ分析を行い、各ノックアウト株におけるインデルを有する細胞のパーセンテージの決定を可能にした（図４Ｌ）。重複ヒットを特定したＭＣＣ－３０１ ＣＲＩＳＰＲ ＨＬＡ－ＡＢＣスクリーニング及び独立Ｋ５６２スクリーニング（Ｂｕｒｒ ｅｔ ａｌ．２０１９）の分析。
実施例６：ＭＹＣＬはＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉ抑制を媒介する
ＭＹＣＬ過剰発現は、ＨＬＡ Ｉ－高ＩＭＲ９０線維芽細胞株におけるＨＬＡ Ｉを低減したため、ＭＹＣＬ不活性化が、ＨＬＡ Ｉ－低ＭＣＣ株におけるクラスＩを復元するのに十分であるかどうかを調査した。ＭＹＣＬ ｓｈＲＮＡをＭＣＰｙＶ＋ＭＫＬ－１細胞株に導入し、ＭＹＣＬノックダウンをスクランブルｓｈＲＮＡ対照と比較した。これらのノックダウン株のＲＮＡ－ｓｅｑ分析により、ＨＬＡ－Ｂ、－Ｃ、及びＴＡＰ１を含むいくつかのクラスＩ遺伝子の発現が２倍超増加し、ＧＳＥＡによる抗原プロセシング／提示のシグネチャの濃縮が明らかになった（ｑ＝０．０４、図５Ａ、５Ｂ及びデータ未掲載）。ＳＴは、ＳＴ－ＥＰ４００－ＭＹＣＬ複合体を介してＭＹＣＬ機能に結合し、強化するため（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １３（１０）：ｅ１００６６６８）、ウイルス抗原不活性化もクラスＩを上方制御する可能性があることが疑われた。実際、ＳＴ及びＬＴの共有エクソンを標的とするｓｈＲＮＡを用いてＷａＧａ細胞株（ＭＣＰｙＶ＋）を形質導入し、両方のＭＣＰｙＶウイルス抗原を不活性化をもたらした後、ＨＬＡ－Ｂ、－Ｃ、及びＮＬＲＣ５における１．５倍超の増加を含む、類似しているがより控えめなクラスＩ遺伝子の上方制御が観察された（図５Ｃ及びデータ未掲載）。更に、２つの異なるｓｈＲＮＡを有するＭＫＬ－１におけるＥＰ４００のノックダウンは、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの４倍超の増加をもたらした（図５Ｄ）。これらの所見は、ＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉ制御とＳＴ－ＥＰ４００－ＭＹＣＬ複合体成分の発現を直接的に関連付けている。
実施例７：ＭＹＣＬはＭＣＰｙＶ－ＭＣＣ及び他のがんに関連している
ＭＹＣＬのＨＬＡ Ｉ抑制効果がウイルス陰性ＭＣＣにも同様に一般化したかどうかを判定するために、ＭＹＣＬのコピー数ステータスをＭＣＰｙＶ－ＭＣＣで評価した。ＭＹＣＬを包含する染色体１ｐのコピー数獲得は、ＭＣＣにおけるより一般的なコピー数改変のうちの１つとして以前に報告された。実際、ＭＹＣＬコピー数（ｌｏｇ２コピー数比０．２２～０．６４）において、４つのウイルス陰性ＭＣＣ株のうちの３つが増加し（図５Ｅ）、ＭＣＰｙＶ－ＭＣＣがウイルス抗原の不在下でＭＹＣＬシグナル伝達を増強し得る機構を示唆する。この機構が他のがんによって用いられ得るかどうかを判定するために、一般に公開されているＲＮＡ－ｓｅｑデータをＣａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（Ｇｈａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ ５６９（７７５７）：５０３－８）から照会した。ＳＣＬＣ及び神経芽細胞腫などのＨＬＡ Ｉ経路成分の発現が低いがん細胞株は、ＭＹＣファミリーメンバーＭＹＣＬ及びＭＹＣＮのそれぞれの過剰発現も頻繁に特性評価た（図５Ｆ）。
実施例８：ＰＲＣ１．１成分はＭＹＣＬによって制御される
ＨＬＡクラスＩ遺伝子の発現の間の関連性を調べるために、ＭＣＰｙＶ＋及びＭＣＰｙＶ－の両方を含む５２個のＭＣＣ腫瘍のＲＮＡ－ｓｅｑコホートにおけるスクリーニングヒットを調べた。バルククラスＩ発現データを混乱させる免疫細胞浸潤の可能性を説明するために、ＥＳＴＩＭＡＴＥ（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４：２６１２）を使用して、腫瘍純度を計算した。ＭＹＣＬは、このコホートにおけるクラスＩ発現とは関連していなかったが、いくつかのクラスＩ遺伝子と、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣにおけるＰＲＣ１．１成分ＫＤＭ２Ｂ及びＵＳＰ７、並びにＭＣＰｙＶ－ＭＣＣにおけるＢＣＯＲ及びＵＳＰ７との間に負の相関が観察された（ｐ＜０．０５、図５Ｇ）。これらの所見は、ＰＲＣ１．１とＭＹＣＬ及びＨＬＡクラスＩ遺伝子との関係の更なる調査を動機付けた。以前に生成されたＣｈＩＰ－ｓｅｑデータ（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）上記）の再分析では、ＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体の成分が、ＰＲＣ１．１遺伝子ＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１のプロモーターに結合するが、ＢＣＯＲ又はＢＣＯＲＬ１には結合しないことが観察された（図６Ａ、６Ｂ）。その後、ＭＡＸ及びＥＰ４００のＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１への結合を、ＭＫＬ－１細胞においてＣｈＩＰ ｑＰＣＲによって確認した（図６Ｃ）。これらの結果は、ＰＲＣ１．１がＨＬＡ Ｉを制御する際にＭＹＣＬの下流で作用する可能性を示唆した。
実施例９：ＵＳＰ７の薬理学的阻害は、ＭＣＰｙＶ±及びＭＣＰｙＶ－ＭＣＣにおけるＨＬＡ ＩをＰＲＣ１．１依存的に復元する。
ＭＣＣにおけるＨＬＡクラスＩ制御におけるＰＲＣ１．１の役割を調べるために、選択的低分子阻害剤が開発されているＵＳＰ７に焦点を当てた。強力かつ不可逆的なＵＳＰ７阻害剤であるＸＬ１７７Ａの活性を、対照として機能する５００倍より少ない効力を示すエナンチオマー化合物である、ＸＬ１７７Ｂと比較した（Ｓｃｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０（１）：５３２４）。２つのＭＣＰｙＶ＋株（ＭＣＣ－３０１、ＭＣＣ－２７７）及び２つのＭＣＰｙＶ－株（ＭＣＣ－２９０、ＭＣＣ－３２０）を、様々な阻害剤濃度で３日間処理した。１００ｎＭで、対照化合物ＸＬ１７７Ｂとは有意に異なる、ＸＬ１７７Ａに応答して、３つの株（ＭＣＣ－２７７、－２９０、－３０１）でのＤＭＳＯと比較したフローサイトメトリーによる表面ＨＬＡクラスＩの発現において、平均１．８９倍（範囲１．６０～２．２７）の増加が観察された（ｐ値０．００２～０．０２、倍率変化はＤＭＳＯと比較してＸＬ１７７Ａを指し、ｐ値はＸＬ１７７Ａ対ＸＬ１７７Ｂの比較である）（図６Ｄ）。ＭＣＣ－３２０は、ＨＬＡ Ｉの発現において統計的に有意な増加を示さなかった。
ＵＳＰ７は、無数の機能を有することが知られており（例えば、ＭＤＭ２脱ユビキチン化によるｐ５３の制御）、ＰＲＣ１．１でのその役割が最近発見されたばかりであるため（Ｍａａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ｂｉｏＲｘｉｖ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２２１０９３）、ＨＬＡ Ｉに対するＵＳＰ７の効果が、実際にＰＲＣ１．１によって媒介されたかどうかを調査した。がん依存性マップ内のデータ（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ｂｉｏＲｘｉｖ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／７２０２４３）、Ｍｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１２）：１７７９－８４）を利用して、生存共依存性が、かかる遺伝子が同じ複合体又は経路内で機能し得ることを暗示するという根拠を用いて、がん細胞株にわたるＵＳＰ７の生存依存性と相関する遺伝子を同定した。ＴＰ５３－ＷＴ株は、ＵＳＰ７遺伝子とポリコーム遺伝子との間に共依存性を示さなかったが、ＴＰ５３変異株は、ＵＳＰ７遺伝子とＰＲＣ１．１遺伝子ＰＣＧＦ１及びＲＩＮＧ１との間に高い相関性を示した（それぞれ６及び１３の相関ランク、並びにｐ＜０．０００３及び０．００３）（図６Ｅ及びデータ未掲載）。更に、ＧＳＥＡ分析により、ＴＰ５３変異体細胞株におけるＵＳＰ７共依存性遺伝子内で最も濃縮された遺伝子セットとしてのヒストンユビキチン化のプロセスが明らかになった（図６Ｆ及びデータ未掲載）。これらの結果は、その主な役割がｐ５３制御であるが、ＵＳＰ７がＰＲＣ１．１においても重要な役割を果たすことを示す。
ＵＳＰ７がＰＲＣ１．１を介して作用している場合、ＵＳＰ７の阻害が、有能なＰＲＣ１．１複合体の発現を欠く株に適用される場合、ＨＬＡ Ｉ発現に影響を及ぼさない。ＭＣＣ－３０１ ＰＣＧＦ１－ＫＯ株においてＵＳＰ７を阻害し、表面クラスＩについて、フローサイトメトリーによって結果を確認した（図６Ｅ）。ＥＰ４００－ＳＴ－ＭＹＣＬ複合体がＵＳＰ７プロモーターに結合するというＣｈＩＰ－ｓｅｑの証拠に基づいて、ＭＹＣＬはまた、ＨＬＡ抑制のために少なくとも部分的にＵＳＰ７に依存することが疑われた。
ＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉの制御因子を理解することは、ウイルス感染症及びがんの両方の設定におけるクラスＩ抗原提示抑制の広範な洞察機構を提供する可能性がある。１１個の堅牢なＭＣＣ細胞株の生成及びゲノム特性評価を通じて、表面ＨＬＡ Ｉの喪失が、複数のクラスＩ経路遺伝子の転写下方制御及びＮＬＲＣ５への改変によって支持されることが示された。ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣ株におけるゲノムワイドスクリーニングを通じて、ＰＲＣ１．１及びＭＹＣＬを含むＨＬＡ Ｉの新規の上流制御因子が同定され、これはウイルス抗原駆動ＨＬＡ Ｉ抑制を媒介すると考えられている。
ＭＣＣにおける低表面ＨＬＡ Ｉ、並びにＴＡＰ１／２及びＰＳＭＢ８／９（ＬＭＰ７／２）の転写損失が実証されている。本明細書に提示されるように、これらのクラスＩ遺伝子の下方制御が確認され、ＨＬＡクラスＩ転写活性化因子ＮＬＲＣ５も改変の標的であることが示され、新たなＭＣＣ細胞株の多くにおいてコピー数（ＣＮ）の減少及びプロモーターのメチル化の両方を示す。ＮＬＲＣ５発現は、多くのがんにわたるいくつかのクラスＩ遺伝子の発現と相関することが知られており、７，７３０人のがん患者のＴＣＧＡコホートの２８．６％において、ＮＬＲＣ５のＣＮ損失が観察された。しかしながら、ＮＬＲＣ５が依然としてこれらのＭＣＣ株において発現されることを考慮すると、正常な組織対照と比較して低レベルであるが、おそらくウイルス抗原シグナル伝達に起因して、ＭＣＣにおけるクラスＩの下方制御を調整する他のエピジェネティック制御因子が存在する可能性があると仮定した。かかるＨＬＡ制御因子の薬理学的阻害は、本明細書で実証されるＩＦＮ－γ処理後のＨＬＡ提示ウイルスエピトープを検出する能力によって証明されるように、ＭＣＣ腫瘍の免疫原性を増加させることができる。
したがって、ＰＲＣ１．１及びＭＹＣＬがＭＣＣにおけるＨＬＡ Ｉ表面発現の負の制御因子であることを見出したゲノムスケール機能獲得及び喪失スクリーニングを行った。ＭＹＣＬは、ＳＴ抗原によってウイルス陽性ＭＣＣにおいて活性化され、ウイルス陰性ＭＣＣにおいて頻繁に増幅される、ＨＬＡ Ｉの興味深い候補制御因子である。加えて、ＭＹＣ及びＭＹＣＮは、それぞれ、黒色腫及び神経芽細胞腫におけるＨＬＡ Ｉ表面発現を抑制することが知られている。ＭＹＣＬとＳＴとの間の既知の相互作用、及びいずれか１つのノックダウンがクラスＩ遺伝子を上方制御することを実証する本明細書に提示される実験に基づいて、ＭＣＰｙＶは、ＭＹＣＬとのＳＴ相互作用を通じてクラスＩを抑制することができる。ＳＴが多数の下流標的遺伝子をトランス活性化するＭＹＣＬ及びＥＰ４００複合体を動員する能力を考慮すると、これらの標的遺伝子のうちの１つ以上がＭＨＣ Ｉの抑制に寄与すると仮定された。２つの顕著なＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００下流標的遺伝子は、ＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１であり、両方ともＣＲＩＳＰＲスクリーニングヒット及びＰＲＣ１．１複合体の構成要素成分である。
ＰＲＣ１．１は、タンデムに作用する抑制性クロマチン修飾因子である、ポリコーム複合体のファミリーに属する。従来のモデルでは、ＰＲＣ２は、非メチル化ＣｐＧ島に抑制性Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークを沈着させ、これらのマークは、その後、Ｈ２ＡＫ１１９をユビキチン化する正準ＰＲＣ１を動員する。いくつかの非正準ＰＲＣ１バリアント複合体も同定されており、これらのうちの１つは、ＰＲＣ２とは独立して、非メチル化ＣｐＧ島を標的とすることができるＰＲＣ１．１である。ポリコーム複合体は、がんにおいて重要であり、がん遺伝子及び腫瘍抑制剤の両方として関与しており、ＰＲＣ２阻害剤は、リンパ腫及び肉腫における初期臨床試験において有望であることが示されている。ポリコーム複合体とＨＬＡクラスＩ制御との間のつながりは、新しく有望な発展である。ＰＲＣ２は、最近、白血病細胞株Ｋ５６２（Ｂｕｒｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３６（４）：３８５－４０１．ｅ８）内の独立したＣＲＩＳＰＲスクリーニングを通じてＨＬＡ Ｉのリプレッサーとして同定され、この研究は、ＰＲＣ１．１複合体との新規のつながりも確立している。ＭＣＣの文脈内では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤などのエピジェネティック修飾因子がクラスＩを上方制御することができることが示されているが、この研究は、クラスＩ遺伝子の周りのエピジェネティックランドスケープの作成に関与する特定のプレイヤーのうちのいくつかを特定する。Ｂｕｒｒらは、１つのＭＣＣ株においても同様にＰＲＣ２ ＫＯ媒介性ＨＬＡ Ｉ上方制御を検証し、ＭＣＣにおけるポリコーム複合体の意義に更なる信憑性をもたらした。本明細書に提示されるスクリーニング及びＢｕｒｒらのスクリーニングは、ＰＣＧＦ１を含むいくつかの重複したヒットを特定し、クラスＩを抑制するためにＰＲＣ１．１とＰＲＣ２との間の協調を示唆する可能性がある。本明細書に提示される研究は、小分子ＵＳＰ７阻害剤によるクラスＩの上方制御を示し、ＰＲＣ１．１の薬理学的標的化のための経路を提供する。
しかしながら、ＨＬＡ Ｉ制御におけるＰＲＣ１．１及びＭＹＣＬの役割は、文脈及び細胞型に依存し得ることを考慮することが重要である。ＰＲＣ１．１は、非メチル化ＣｐＧ島を標的とするが、その特異性を洗練する追加の因子が存在するかどうかは不明である。ゲノムワイドスクリーニングは、単一のＭＣＰｙＶ＋ ＭＣＣ株（ＭＣＣ－３０１）で行われたが、５２ ＭＣＣ腫瘍の大きなコホート内のＨＬＡクラスＩといくつかのＰＲＣ１．１成分との間に逆相関が観察された。更に、Ｂｕｒｒ ｅｔ ａｌ ２０１９のＫ５６２ ＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおける別のポリコーム複合体の同定は、収束生物学を更に示す。
ＨＬＡ Ｉ喪失は、ウイルス感染症及びがんにおける免疫回避の重要な機構であり、これらの機構をよりよく理解することは、ＨＬＡ Ｉの回復のための標的を同定するのに役立ち得る。ＭＣＣにおけるゲノムスケールスクリーニングを通じて、とりわけＰＲＣ１．１及びＭＹＣＬが、ＨＬＡ Ｉ表面発現の新規の抑制因子として同定された。これらの結果は、治療標的を特定し、ＭＣＰｙＶウイルス抗原がＨＬＡクラスＩ遺伝子を調節することができる２つの方法を強調する。
実施例１０：実施例１１～１９の材料及び方法
ａ．データ及びコードの利用可能性
ＷＥＳ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ、及びＷＧＢＳのＤｂＧａＰ提出（受入番号ｐｈｓ００２２６０）は、現在保留中であり、一般公開される。全エクソーム配列決定分析、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析、ＭＣＰｙＶウイルス転写物検出、及びＷＧＢＳプロモーターシグナル抽出のための全ての分析コードは、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｄｋｏｒｔｈａｕｅｒ／ＭＣＣのＭＩＴライセンス下でＧｉｔｈｕｂリポジトリで利用可能になる。全てのプロテオミクス及び免疫ペプトミクス実験の元の質量スペクトル、免疫ペプトーム実験のペプチドスペクトラムマッチのテーブル、及び検索に使用されるタンパク質配列データベースは、公開プロテオミクスリポジトリＭａｓｓＩＶＥ（ｍａｓｓｉｖｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ）に保管されており、ｆｔｐ：／／ＭＳＶ００００８７２５１＠ｍａｓｓｉｖｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕにおいてユーザ名：ＭＳＶ００００８７２５１、パスワード：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎでアクセス可能である。
ｂ．実験モデル及び対象の詳細
ヒト対象：
ＭＣＣ腫瘍試料については、患者は、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでＩＲＢプロトコル＃０９－１５６に基づいて同意した。患者の臨床注釈を表６に列挙する。
細胞株：
新たに誘導されたＭＣＣ細胞株を、０．０２％のヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及び２０ｎｇ／ｍｌのｈＦＧＦ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳ－Ａヒト増殖培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中３７℃で培養した。細胞株の性別を表６に記載する。ＣＫ２０及びＳＯＸ２に対する抗体を使用した免疫組織化学染色によって、細胞株をＭＣＣとして認証した（図１Ｂ、図１Ｐ）。細胞株を、ＨＬＡタイピングによって元の腫瘍試料の誘導体として認証し、これは１１株のうち７株について利用可能であった（以下を参照のこと）。ＭＫＬ－１及びＷａＧａ株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で増殖させた。
ＨＬＡタイピング。
全エクソーム配列決定データを有する１１個のＭＣＣ株のうちの７個についてのＨＬＡタイピング。
Figure 2023529026000146
ｃ．腫瘍細胞株の生成
腫瘍試料は、患者生検又は患者由来異種移植片のいずれかから得た。組織を手動で粉砕し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２５ｕｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の溶液中に懸濁し、１５ｍＬ円錐管に移し、オービタルシェーカー上で低速で３０分間インキュベートした。消化後、単一細胞懸濁液を１００ミクロンストレーナーに通し、洗浄し、０．０２％のヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍｌのｈＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及び２０ｎｇ／ｍｌのｈＦＧＦ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳ－Ａヒト増殖キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の培地を含有する組織培養フラスコ中で培養した。利用可能な場合、過剰の腫瘍単一細胞懸濁液を９０％ ＦＢＳ及び１０％ ＤＭＳＯ中で凍結し、液体窒素中で保存した。確立された細胞株をマイコプラズマ不含（Ｖｅｎｏｒ（商標）ＧｅＭマイコプラズマ検出キット、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）として試験し、ＣＫ２０及びＳＯＸ２に対する抗体を使用した免疫組織化学染色を通じてＭＣＣとして検証した。全てのＭＣＣ細胞株は、０．０２％のヘパリン、２０ｎｇ／ｍＬのｈＥＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのｈＦＧＦ２を補充したＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳ－Ａ増殖キットからの培地で維持された。細胞培養最適化に使用される他の培地としては、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（Ｇｉｂｃｏ）；０．０２％のヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍＬのｈＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及び２０ｎｇ／ｍＬのｈＦＧＦ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）；１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び５５ｎＭのβ－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）；並びに２０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
ｄ．組織学及び免疫組織化学
全てのＩＨＣは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＩＩＩ自動染色プラットフォームで行った。細胞株から、最大１０００万個のＭＣＣ細胞をペレット化し、ホルムアルデヒド中に固定し、ＰＢＳで洗浄し、パラフィンブロック上に載置した。単一の染色については、５ミクロンの切片を切断し、ＳＯＸ２又はＣＫ２０について染色した。Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｆｉｎｅ検出キットを、ＳＯＸ２についてのクエン酸塩抗原回収（Ａｂｃａｍ ＃９７９５９、ポリクローナル、１：１００希釈）、及びサイトケラチン２０についてのＥＤＴＡ抗原回収（ＣＫ２０；Ｄａｋｏ ＃Ｍ７０１９、クローンＫｓ２０．８、１：５０希釈）とともに使用した。アーカイブ腫瘍標本の二重免疫組織化学染色には、ＭＣＣマーカーＳＯＸ２（ＣＳＴ、Ｄ６Ｄ９、１：５０希釈；赤色発色素）を使用し、ＨＬＡクラスＩ（Ａｂｃａｍ、ＥＭＲ８－５、１：６，０００希釈；褐色発色素）又はＨＬＡクラスＩＩ（Ｄａｋｏ Ｍ０７７５、ＣＲ３／４３、１：７５０希釈；褐色発色素）のいずれかを、自動染色システム（Ｂｏｎｄ ＩＩＩ、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコルに従って使用した。ＨＬＡ Ｉ又はＨＬＡ ＩＩ膜染色を示したＳＯＸ２＋ＭＣＣ細胞の割合を、２名の理事会認定病理学者のコンセンサスによって評価した。
ｅ．免疫蛍光
染色は、ＢＯＮＤ ＲＸ完全自動染色器（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で一晩行った。厚さ５μｍのホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織切片を、６０℃で３時間焼成した後、ＢＯＮＤ ＲＸに装填した。スライドを脱パラフィン化し（ＢＯＮＤ ＤｅＷａｘ溶液、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ＡＲ９５９０）、一連の勾配エタノールを介して脱イオン水に再水和した。抗原回収を、ＢＯＮＤエピトープ回収溶液１（ＥＲ１；ｐＨ６）又は２（ＥＲ２；ｐＨ９）（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ＡＲ９９６１、 ＡＲ９６４０）中で９５℃で行った。脱パラフィン化、再水和、及び抗原回収は全て、ＢＯＮＤ ＲＸによって事前にプログラムされ、実行された。次に、スライドを、以下の一次抗体で連続的に染色した：ＳＯＸ２（クローンＢ６Ｄ９、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、希釈１：２００；Ｏｐａｌ ６９０ １：１００）、ＣＤ８（クローン４Ｂ１１、Ｌｅｉｃａ、希釈１：２００；Ｏｐａｌ ４８０ １：１５０）、ＰＤ－Ｌ１（クローンＥ１Ｌ３Ｎ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、希釈１：３００；Ｏｐａｌ ５２０ １：１５０）、及びＰＤ－１（クローンＥＰＲ４８７７［２］、Ａｂｃａｍ、希釈１：３００；Ｏｐａｌ ６２０ １：３００）（ＥＲ１で２０分間）、並びにＦＯＸＰ３（クローンＤ６０８Ｒ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、希釈１：１００；Ｏｐａｌ ５７０ １：３００）（ＥＲ２溶液で４０分間）。各一次抗体を３０分間インキュベートした。その後、抗マウス＋抗ウサギＯｐａｌポリマーホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．ＡＲＨ１００１ＥＡ）を、１０分間のインキュベーション時間を有する二次標識として適用した。抗体複合体のシグナルを標識し、スライドを１０分間インキュベートすることによって、それらの対応するＯｐａｌフルオロフォア試薬（Ａｋｏｙａ）によって視覚化した。スライドをＳｐｅｃｔｒａｌ ＤＡＰＩ溶液（Ａｋｏｙａ）中で１０分間インキュベートし、空気乾燥させ、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ褪色防止用封入剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログＰ３６９６５）とともに載置し、Ｖｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓマルチスペクトルイメージングプラットフォーム（Ｖｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓ、Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化した。目的の代表的な腫瘍領域を病理学者によって同定し、試料当たり２～６の視野を取得した。画像をスペクトル的に混合せず、Ｉｎｆｏｒｍ ２．４（Ａｋｏｙａ）内の監視対象機械学習アルゴリズムを使用して、病理学者の監督下で細胞同定を行った。
ｆ．フローサイトメトリー
細胞をＶｅｒｓｅｎｅと解離し、１００μＬ中の１００万細胞当たり５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｆｃ受容体遮断溶液；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２２３０２）と室温で１０分間インキュベートした。フルオロフォアコンジュゲート抗体又はそれぞれのアイソタイプ対照を添加し、４℃で更に３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ又は４％パラホルムアルデヒド中に再懸濁し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ細胞計上で分析した。ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの検出には、以下の抗体を使用した：ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３１１４０６）、ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３１１４１０）、又はＡＦ６４７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ｓｃ３２２３５ ＡＦ６４７）、及びＨＬＡ－ＤＲ－ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３０７６０４）にコンジュゲートしたＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｗ６／３２クローン）。
ｇ．全エクソーム配列決定及び変異呼び出し
ゲノムＤＮＡ試料を、約１８０ｂｐのサイズ分布のために最適化されたＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ開発のプロトコルを使用して剪断した。Ｋａｐａ Ｈｙｐｅｒｐｒｅｐキットを使用して、末端修復、独自の分子インデックスを含有する二又アダプターによるアダプターライゲーション、及びＰＣＲを介したＰ５及びＰ７試料バーコードの添加を含む、体細胞試料に最適化されたプロセスでライブラリを構築した。ＳＰＲＩ精製を行い、得られたライブラリをＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎで定量化した。ライブラリを正規化し、等モルプーリングを行い、ハイブリダイゼーションのための多重化セットを調製した。自動捕捉を行い、続いて濃縮されたＤＮＡのＰＣＲを行った。ＳＰＲＩ精製をクリーンアップに使用した。次いで、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎで多重プールを定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＤＮＡ断片サイズを推定した。最終ライブラリをｑＰＣＲによって定量化し、標的領域の１３０～１６０倍の平均カバレッジの範囲で、５０倍以上の深度で標的塩基の８５％以上がカバーされるように、適切な数のレーンにわたってＩｌｌｕｍｉｎａフローセルに装填した。
エクソーム配列決定ＢＡＭファイルを、Ｇｏｏｇｌｅ Ｃｌｏｕｄ Ｓｔｏｒａｇｅコマンドラインツールｇｓｕｔｉｌバージョン４．５（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＧｏｏｇｌｅＣｌｏｕｄＰｌａｔｆｏｒｍ／ｇｓｕｔｉｌ／）を使用して、Ｂｒｏａｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆｉｒｅｃｌｏｕｄ／Ｔｅｒｒａプラットフォームからダウンロードした。ＧＡＴＫバージョン４．１．２．０を使用して、（１）最大ＭＮＰ距離０を使用して、Ｍｕｔｅｃｔ２コマンドで正常なＢＡＭ上の参照から変異を呼び出し、（２）ＣｒｅａｔｅＳｏｍａｔｉｃＰａｎｅｌＯｆＮｏｒｍａｌｓコマンドを使用して、呼び出された正常変異のＶＣＦファイルから正常のパネルを構築し、（３）Ｍｕｔｅｃｔ２コマンドを使用して、それらそれぞれの正常な対応物と比較して、腫瘍及び細胞株の両方の対間で変異を呼び出した。これらのステップでは、以下の注釈を使用した：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｂｕｎｄｌｅ／ｂ３７／ｈｕｍａｎ＿ｇ１ｋ＿ｖ３７．ｆａｓｔａからダウンロードしたｂ３７参照配列、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｂｕｎｄｌｅ／ｂｅｔａ／Ｍｕｔｅｃｔ２／ａｆ－ｏｎｌｙ－ｇｎｏｍａｄ．ｒａｗ．ｓｉｔｅｓ．ｂ３７．ｖｃｆ．ｇｚからダウンロードした生殖系列リソースＶＣＦ、及びｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ｇａｔｋ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｓｒｃ／ｔｅｓｔ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｌａｒｇｅ／ｗｈｏｌｅ＿ｅｘｏｍｅ＿ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ｖ１．Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ１９．ｔａｒｇｅｔｓ．ｉｎｔｅｒｖａｌ＿ｌｉｓｔからダウンロードしたインターバルリスト。呼び出されたバリアントを、ＧＡＴＫ ＦｉｌｔｅｒＭｕｔｅｃｔＣａｌｌｓコマンドでフィルタリングし、ＰＡＳＳとラベル付けされたバリアントを抽出し、下流分析に含めた。
次に、通過したバリアントのＶＣＦファイルを、ｖｃｆ２ｍａｆバージョン１．１６．１７（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｍｓｋｃｃ／ｖｃｆ２ｍａｆ／ｔｒｅｅ／５４５３ｆ８０２ｄ２ｆ１ｆ２６１７０８ｆｅ２１ｃ９ｄ４７ｂ６６ｄ１３ｅ１９７３７からダウンロードした）及びｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｅｎｓｅｍｂｌ／ｅｎｓｅｍｂｌ－ｖｅｐ／ａｒｃｈｉｖｅ／ｒｅｌｅａｓｅ／９５．３．ｔａｒ．ｇｚからインストールしたバリアント効果予測因子バージョン９５を使用して、ＭＡＦファイルとして注釈を付けた。Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｍａｆｔｏｏｌｓ７１を使用して、遺伝子及び試料による変異の腫瘍プロットを生成した。標準的なクラスＩ及びクラスＩＩ ＰＣＲベースのタイピング（Ｂｒｉｇｈａｍ及びＷｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して、患者ＨＬＡアロタイプを評価した。
ｈ．全ゲノム配列決定及びコピー数分析
全ゲノム配列決定は、Ａｄｍｅｒａ Ｈｅａｌｔｈによって行った。読み取りは、ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅをデフォルト設定で使用して、品質及びアダプターでトリミングした。トリミングした読み取りを、ｈｇ３８及びＭＣＰｙＶ（ＮＣＢＩ受入番号：ＮＣ＿０１０２７７）を含有する融合参照に対して、ｂｏｗｔｉｅ２－ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅを使用して整列させた。コピー数のバリアント分析は、ＧＡＴＫ４ ＣＮＶ推奨業務を用いて行った。腫瘍由来のＣＮＶを呼び出すために、１７個の正常な血液全ゲノムから正常のパネルを生成した。ｈｇ３８にマッピングされた全てのＣＮＶ呼び出しは、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉｇｖ／）からのＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓビューアを使用して視覚化された。
ｉ．ＲＮＡ配列決定及び分析
ＭＣＣ腫瘍及び新たに生成された細胞株からの試料について、ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＶ２００メトリック）を使用して、最初に質について評価した。１００ｎｇのＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆トランスクリプターゼ及びＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡアクセス試料調製キットを使用した第１の鎖ｃＤＮＡ合成の入力として使用した。ｃＤＮＡの第２の鎖の合成に続いて、ＵＭＩ（独自の分子インデックス）アダプターを用いたインデックス化アダプターライゲーションを行った。その後のＰＣＲ増幅により、適合断片が濃縮された。増幅されたライブラリを定量化し、正規化し、プールし、エクソーム標的化オリゴとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ビーズクリーニング、溶出、及びＰＣＲを行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルレーン上で配列決定するためのライブラリプールを調製した。トランスクリプトームを、対で少なくとも５０００万回の読み取りのカバレッジまで配列決定した。
線維芽細胞及び角質細胞対照株については、受入コードＳＲＰ１２６４２２（対照試料「ＮＮ」から４回の複製）及びＳＲＰ１３１３４７（条件：対照及び遺伝子型：対照で６回の複製）でＲ ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＳＲＡｄｂを使用して、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅから生のＦＡＳＴＱファイルをダウンロードした。以下に記載される対照ｓｈＳｃｒ ＭＫＬ－１及びＷａＧａ細胞株から、ＭＫＬ－１及びＷａＧａに関する生のＦＡＳＴＱファイルを入手した（方法：ＭＫＬ－１ ｓｈＭＹＣＬ及びＷａＧａ ｓｈＳＴ／ＬＴ株生成及び配列決定）。次いで、線維芽細胞、角質細胞、ＭＫＬ－１、及びＷａＧａからのＦＡＳＴＱファイルを、ＳＴＡＲバージョン２．７．３ａを使用し、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｇｅｎｃｏｄｅ／Ｇｅｎｃｏｄｅ＿ｈｕｍａｎ／ｒｅｌｅａｓｅ＿１９／ＧＲＣｈ３７．ｐ１３．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａ．ｇｚからダウンロードしたインデックスゲノム参照ファイル、ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｔａ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｎｏｗｍａｎ／ｈｇ１９／ｓｔａｒ／ｇｅｎｃｏｄｅ．ｖ１９．ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｇｔｆからダウンロードした転写物注釈ファイルを使用し、以下のオプションを用いて整列させた：－－ｔｗｏｐａｓｓＭｏｄｅ Ｂａｓｉｃ、－－ｏｕｔＳＡＭｓｔｒａｎｄＦｉｅｌｄ ｉｎｔｒｏｎＭｏｔｉｆ、－－ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ １００００００、－－ａｌｉｇｎＭａｔｅｓＧａｐＭａｘ １００００００、－－ｓｊｄｂＳｃｏｒｅ ２、－－ｏｕｔＳＡＭｔｙｐｅ ＢＡＭ Ｕｎｓｏｒｔｅｄ、－－ｏｕｔＳＡＭａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ＮＨ ＨＩ ＮＭ ＭＤ ＡＳ ＸＳ、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＴｙｐｅ ＢｙＳＪｏｕｔ、－－ｏｕｔＳＡＭｕｎｍａｐｐｅｄ Ｗｉｔｈｉｎ、－－ｇｅｎｏｍｅＬｏａｄ ＮｏＳｈａｒｅｄＭｅｍｏｒｙ、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＳｃｏｒｅＭｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ ０、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ ０、－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ ９９９、及びｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ ２０。重複は、ｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓバージョン２．２２．０－ＳＮＡＰＳＨＯＴでマークした。
ＭＣＣ腫瘍及び細胞株試料のＲＮＡ配列決定ＢＡＭファイルを、Ｇｏｏｇｌｅ Ｃｌｏｕｄ Ｓｔｏｒａｇｅコマンドラインツールｇｓｕｔｉｌバージョン４．５（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＧｏｏｇｌｅＣｌｏｕｄＰｌａｔｆｏｒｍ／ｇｓｕｔｉｌ／）を使用して、Ｂｒｏａｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆｉｒｅｃｌｏｕｄ／Ｔｅｒｒａプラットフォームからダウンロードした。
遺伝子カウントは、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓバージョン２．０．０を使用して、ＢＡＭファイルから得た。試料全体の平均カウントが１未満の非常に低い発現遺伝子は、分析から除外された。ＤＥＳｅｑ２ Ｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージのｖｓｔ関数から得られた分散安定化カウントのベクター上のユークリッド距離を使用して、試料間距離メトリック（図１Ｇ）を計算した。
ＤＥＳｅｑ２の陰性二項ＧＬＭ Ｗａｌｄ検定を使用して、ＩＦＮ－γ＋試料と－試料との間で示差発現分析を実行し（共変量としてウイルス状態を調整する）、ここで、有意性は、デフォルト設定下での複数の比較に対して調整したｐ値を使用して評価した。試料群間の潜在的な全般的な遺伝子発現差異を説明するために、ＲＵＶｇを使用して、ｗｗｗ．ｔａｕ．ａｃ．ｉｌ／～ｅｌｉｅｉｓ／ＨＫＧ／ＨＫ＿ｇｅｎｅｓ．ｔｘｔからダウンロードされたハウスキーピング遺伝子のリストから、望ましくない変異の潜在的因子を推定した。次いで、不必要な変動の最大の因子を、ＤＥＳｅｑ２モデルで共変量として使用して、ライブラリサイズとは無関係の潜在的変動を調整した。ＲＵＶｇによって戻される変動の潜在的な因子について調整された正規化されたカウントを、図２Ａにおいて視覚化した。
ｊ．ＭＣＰｙＶウイルスＤＮＡ及びＲＮＡ検出
ＭＣＣ腫瘍試料中のＭＣＰｙＶのＤＮＡ検出をＶｉｒｏＰａｎｅｌで行った。ＲＮＡ－ｓｅｑのウイルス転写物の定量化の場合、メルケル細胞ポリオーマウイルス参照配列を、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＥＵ３７５８０４＆ｄｉｓｐｌａｙ＝ｆａｓｔａからダウンロードした。ヒト参照配列にマッピングされなかった読み取りを、ＳＡＭｔｏｏｌｓビューバージョン１．１０を使用して腫瘍及び細胞株のＲＮＡ－ｓｅｑ及びＶｉｒｏＰａｎｅｌ ＢＡＭファイルから抽出し、ＢＷＡバージョン０．７．１７－ｒ１１８８を使用して修飾されたメルケル細胞ポリオーマウイルス参照配列（ＨＭ３５５８２５．１、ＶＰ２コード配列が終了したときに参照配列が終了するように再循環させた）に再整列させた。各位置のカバレッジは、‘ｓａｍｔｏｏｌｓ ｄｅｐｔｈ－ａａ－ｄ０’コマンドを使用してｓａｍｔｏｏｌｓで評価し、カバレッジ深度は、ｇｇｐｌｏｔ２及びｇｇｇｅｎｅｓパッケージを使用してＲバージョン３．５．１でプロットした。
ｋ．単一細胞ＲＮＡ配列決定
ＭＣＣ－３３６（ＭＣＰｙＶ＋）及びＭＣＣ－３５０（ＭＣＰｙＶ－）からの腫瘍試料を、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）について処理した。細胞を解凍し、ＲＰＭＩ及び１０％のＦＢＳ中で２回洗浄した後、死細胞枯渇を受けた（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０９０－１０１）。生存ＭＣＣ腫瘍細胞を、１，０００細胞／μＬの細胞濃度で０．０４％のＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁した。１７，０００個の細胞を、製造業者の指示に従って、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標）装置（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）上に装填した。ｓｃＲＮＡｓｅｑライブラリを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標）単一細胞５’ライブラリ及びゲルビーズキット（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して処理した。増幅されたｃＤＮＡライブラリ及び最終シーケンシングライブラリの品質制御は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った。ＳｃＲＮＡｓｅｑライブラリを４ｎＭ濃度に正規化し、プールし、次いで、プールしたライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ Ｓ４プラットフォーム上で配列決定した。配列決定パラメータは、１５０ｂｐの読み取り１、１５０ｂｐの読み取り２、及び８ｂｐのインデックス１であった。両方の試料からの読み取りを脱多重化し、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ（ｖ．３．０．２）を使用してｈｇ１９に整列させ、転写物量をＳｅｕｒａｔ（ｖ．３．１．５）Ｒパッケージを使用して共分析した。＞１，５００及び＜７，５００遺伝子、及び＜１０％ミトコンドリア遺伝子を発現する細胞のみを更なる分析のために保持し、合計１５，８０８個の細胞を平均深度４，２３１．９遺伝子／細胞に配列決定した。データを正規化し、上位２，０００の変数特徴を特定した。その後、遺伝子カウント、ミトコンドリアパーセンテージ、及び細胞周期段階からの変動を回帰させながら、データをスケーリングした。この後、主成分分析、Ｈａｒｍｏｎｙ（ｖ．１．０）８１を使用したバッチ補正、ＵＭＡＰ分析、最後に、解像度＝０．３でのＬｏｕｖａｉｎクラスタリングが続いた。免疫細胞クラスターは、ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）の発現によって同定し、ＭＣＣクラスターは、ＡＴＯＨ１、ＳＹＰ、及びＳＯＸ２の発現によって同定した。
ｌ．免疫沈降、質量分析、及びペプチド同定
最大４０００万又は０．２ｇのＭＣＣ細胞を免疫沈降させた。簡潔に述べると、ＭＣＣ細胞を採取し、４０ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．０６Ｍのオクチルβ－ｄ－グルコピラノシド、１００Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ Ｉ、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（全てＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する氷冷溶解緩衝液中で溶解した。細胞溶解物を４℃で２２分間、１２，７００ｒｐｍで遠心分離した。溶解物上清をＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とカップリングし、１０μｇのＨＬＡ－Ｉ抗体（クローンＷ６／３２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と回転撹拌下、４℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、溶解物－ビーズ－抗体混合物を短時間遠心分離し、上清を廃棄した。プロテアーゼ阻害剤を含まない、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．０６Ｍのオクチルβ－ｄ－グルコピラノシド、及び２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含有する洗浄緩衝液からなる溶解緩衝液でビーズを洗浄した。ゲル装填チップ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）を使用して、ビーズから可能な限り多くの流体を除去した。最大３回の免疫沈降のペプチドを組み合わせ、酸溶出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。簡潔に述べると、ペプチドを５％ギ酸を含む３％アセトニトリルに再懸濁し、分析カラム（１．９μｍのＣ１８ Ｒｅｐｒｏｓｉｌビーズを含む２０～３０ｃｍ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＨＰＬＣ ＧｍｂＨ）、社内充填）に装填した。ペプチドを６～３０％の勾配（ＥａｓｙＬＣ １０００又は１２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶出させ、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ、又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ ４８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。Ｌｕｍｏｓ測定の場合、ペプチドはまた、単独で荷電された場合に断片化された。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓの測定（２回の免疫沈降プール、＋／－ ＩＦＮ－γ、図３）及び大型Ｔ抗原ペプチドの検出（ＩＦＮ－γで処理したＭＣＣ－３６７細胞株の３回の免疫沈降）の場合、ペプチドを、２パンチのＳＤＢ－ＸＣ材料（Ｅｍｐｏｒｅ ３Ｍ）及び漸増濃度のアセトニトリル（０．１％ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ１０中５％、１０％、及び３０％）を用いて、ステージ先端の基本的な逆相分離を使用して更に分画した。画分を、ＦＡＩＭＳｐｒｏインターフェースを備えたＦｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ ４８０で分析した。
上記のように、ＵＳＰ７阻害剤で処理した細胞株の免疫ペプチドームを溶出し、続いて、ＴＭＴ６試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；１２６－ＵＳＰ７ｉＡ、１２７－ＷＴ、１２８ ＵＳＰ７ｉＡ、１２９ＷＴ、１３０－ＵＳＰ７ｉＢ、１３１ ＵＳＰ７ｉＢ）で標識し、次いで、５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ１０）中の漸増濃度のアセトニトリル（１０％、１５％、及び５０％）を用いた基本的な逆相分画、並びにＦＡＩＭＳｐｒｏを用いたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ ４８０上での分析を使用して、その後の分画のためにプールした。データ取得パラメータは上記のとおりであり、ＮＣＥは３４秒及び２秒の動的除外に設定した。
質量スペクトルは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌソフトウェアパッケージｖ７．１プレリリース（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して解釈した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、６００～４０００の範囲における前駆体ＭＨ＋を有しないか、前駆体電荷が５超であるか、又は最小５未満の検出されたピークを有する場合、検索から除外された。同じクロマトグラフィーのピークで取得された同じ前駆体ｍ／ｚとの類似のスペクトルの融合を無効にした。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ゲノム及びそのタンパク質コード転写物のｈｇ１９注釈を有する全てのＵＣＳＣゲノムブラウザ遺伝子（５２，７８８エントリ）、一般的なヒトウイルス配列（３０，１８１エントリ）、２６個の組織からの腫瘍で観察される反復変異タンパク質（４，５９５エントリ）、２６４個の一般的な実験室汚染物質、及びＭＣＣ細胞株で検出される体細胞変異を含有するタンパク質配列（３，０７６エントリ）を含む、９０，９０４エントリを含有するタンパク質配列データベースに対して検索した。ＭＳ／ＭＳ検索パラメータは、無酵素特異性；ＥＳＩ－ＱＥＸＡＣＴＩＶＥ－ＨＣＤ－ＨＬＡ－ｖ３器具スコアリング；固定修飾：システインのシステイン化；可変修飾：ペプチドＮ末端グルタミンにおけるメチオニンの酸化、システインのカルバミドメチル化、及びピログルタミン酸；前駆体質量公差± １０ｐｐｍ；生成物質量公差±１０ｐｐｍ、並びに最小一致ピーク強度３０％を含む。個々のスペクトルのペプチドスペクトル一致（ＰＳＭ）を、ＰＳＭレベル＜１％ ＦＤＲで標的デコイに基づくＦＤＲ推定を適用するために、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ自動検証モジュールを使用して確実に割り当てられたものとして自動的に指定した。ペプチドの自動検証は、スコアを最適化するための自動閾値戦略を用いて各試料について別々に行い、デルタランク１－ランク２スコア閾値は、試料当たりの全てのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実行にわたる各前駆体電荷状態（１～４）について別々に行った。スコア閾値の決定はまた、ペプチドが７の最小配列長を有し、ＰＳＭが５の最小骨格切断スコアを有することを必要とした。ペプチド及びＰＳＭのエクスポートを、空のビーズ試料中で同定された潜在的なキャリーオーバーペプチド及びペプチドを含む汚染物質についてフィルタリングした。ＴＭＴ標識試料については、ケラチンタンパク質に由来するペプチドを除去し、ＴＭＴ強度値を全般的な中央値に対して正規化した。Ｐ値は、ＲにおけるＬＩＭＭＡパッケージに基づいて、社内ソフトウェアを使用して計算した。
ｍ．全プロテオーム解析及び解釈
ＭＣＣ細胞株のタンパク質発現を評価した。簡潔に述べると、ＩＦＮ－γ処理の有無にかかわらず、ＭＣＣ細胞株の細胞ペレットを８Ｍの尿素中で溶解し、ＬｙｓＣ及びトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してペプチドに消化した。４００μｇのペプチドを、ＴＭＴ１０試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１２６－ＭＣＣ－２９０、１２７Ｎ－ＭＣＣ－３５０＿ＩＦＮ、１２７Ｃ ＭＣＣ－２７５＿ＩＦＮ、１２８Ｎ ＭＣＣ－２７５、１２８Ｃ ＭＣＣ－３５０、１２９Ｎ＿ＭＣＣ－３０１＿ＩＦＮ、１２９Ｃ－ＭＣＣ－２７７＿ＩＦＮ、１３０Ｎ－ＭＣＣ－２９０＿ＩＦＮｙ、１３０Ｃ ＭＣＣ－２７７、１３１ ＭＣＣ－３０１）で標識し、次いで、その後の分画及び分析のためにプールした。プールしたペプチドを、オフライン高ｐＨ逆相分画を使用して２４個の画分に分離した。１画分当たり１μｇを、分析カラム（２０～３０ｃｍ、１．９μｍのＣ１８ Ｒｅｐｒｏｓｉｌビーズ［Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＨＰＬＣ ＧｍｂＨ］、社内充填、ＰｉｃｏＦｒｉｔ ７５μＭ内径、１０μＭ発光体［Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］）に装填した。ペプチドを、６～３０％の緩衝液Ｂ（０．１％のギ酸又は０．５％のＡｃＯＨ、及び８０％又は９０％のアセトニトリルのいずれか）の範囲の直線勾配（ＥａｓｙＮａｎｏＬＣ １０００又は１２００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で８４分間、３０～９０％のＢで９分間溶出し、９０％の緩衝液Ｂで５分間、２００ｎｌ／分で保持した。データ依存的取得の間、ペプチドをＦｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。フルスキャンＭＳは、３００～１，８００ｍ／ｚの６０，０００で取得した。ＡＧＣ目標を４ｅ５及び５０ｍｓに設定した。サイクル当たりの上位２０個の前駆体を、６０，０００分解能で、０．７ｍ／ｚの単離幅、３４ ＮＣＥ、３ｅ４ ＡＧＣ標的、及び５０ｍｓの最大注入時間でＨＣＤ断片化に供した。動的排除を有効にし、持続時間を４５秒とした。
ＭＣＣバリアントを除外した上記のデータベースに対してＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌを使用してスペクトルを検索して、トリプシンを指定し／消化酵素としてのＰを許容（Ｋ－Ｐ及びＲ－Ｐ切断を許容）し、４つの未切断及びＥＳＩ－ＱＥＸＡＣＴＩＶＥ－ＨＣＤ－ｖ３を許容した。システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定した。ＴＭＴ標識は、リジンで必要とされたが、ペプチドＮ末端は、標識又は非標識のいずれかとすることができた。検索した可変修飾には、タンパク質Ｎ末端のアセチル化、酸化メチオニン、ピログルタミン酸、脱アミドアスパラギン、及びピロカルバミドメチルシステインが含まれる。マッチ許容値を、ＭＳ１及びＭＳ２レベルで２０ｐｐｍに設定した。ＰＳＭスコア閾値化は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ自動検証モジュールを使用して、ペプチドスペクトラムマッチ（ＰＳＭ）レベル及びタンパク質レベルでの２つのステップで標的－デコイベースのＦＤＲを適用した。ステップ１では、ＰＳＭレベルの自動検証は、最初に、最小配列長８の自動閾値戦略、自動可変範囲前駆体質量フィルタリング、並びに最適化したスコア及びデルタランク１－ランク２スコア閾値を使用して行い、各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実行での各前駆体電荷状態について、前駆体電荷２～４のＰＳＭレベルのＦＤＲ推定値＜１．０％を得た。前駆体電荷５～６について合理的な統計を得るために、閾値を最適化して、より高い電荷状態に対して生成されるスペクトルがより少ないため、実験当たり（各実行当たりではなく）全てのＬＣ実行にわたって、０．５％未満のＰＳＭレベルのＦＤＲ推定値を得た。ステップ２では、標的タンパク質レベルのＦＤＲ閾値０を使用して、ＰＳＭを更にフィルタリングするために、タンパク質研磨自動検証を各実験に適用し、タンパク質グループ化方法は、サブグループを拡大し、上位使用は絶対最小タンパク質スコア９で（ＳＧＴ）を共有した。ＴＭＴ１０レポーターイオン強度を、ロット番号ＴＢ２６６２９３について試薬製造業者の分析証明書（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／９０４０６）から得られたＣｒａｍｅｒ’ｓ Ｒｕｌｅ及び補正因子に従って決定因子計算を実施するａｆＲＩＣＡ補正法を使用して、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌタンパク質／ペプチド概要モジュール内の同位体不純物について補正した。
ｎ．ＥＬＩＳｐｏｔ
患者ＭＣＣ－３６７からのマッチする患者末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、ウェル当たり１０７個の細胞を２４ウェルプレートに一晩播種した。細胞を、１０％ヒト血清及び２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充した完全ＤＭＥＭ中の１０ｕｇ／ｍｌのＬＴ抗原ペプチドＴＳＤＫＡＩＥＬＹ（ＭＣＣ－３６７ ＨＬＡペプチドーム中で同定、図３Ｆ）で刺激した。３日間の刺激後、細胞に２０単位／ｍＬのＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充した。１０日間の刺激後、細胞を一晩サイトカイン除去した。１０ｕｇ／ｍｌのＴＳＤＫＡＩＥＬＹペプチドを用いたＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、ウェル当たり５０，０００個の細胞を刺激した。ＤＭＳＯ及びＨＩＶ－ＧＡＧペプチドを陰性対照として使用した。ＣＥＦ（Ｍａｂｔｅｃｈ）及びＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を陽性対照として使用した（図示せず）。ＥＬＩＳｐｏｔ及びＴ細胞培養方法は、以前に詳細に記載された。
ｏ．ＯＲＦスクリーニング
１３，８３３個の遺伝子にマッピングする１６，１７２個の固有のＯＲＦを含む、ヒトＯＲＦｅｏｍｅバージョン８．１レンチウイルスライブラリは、Ｂｒｏａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍからの贈り物として提供された。７５００万個のＭＣＣ－３０１細胞を、ＯＲＦｅｏｍｅレンチウイルスで形質導入して、およそ３０～４０％の感染率を達成した。２日後、形質導入細胞を、３日間の０．５ｕｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ＳＣ－１０８７１）処理で選択した。形質導入の７～１０日後、細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ抗体（Ｗ６／３２クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１１４０５）で染色し、ＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ染色の上部及び下部１０％についてゲーティングしたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで選別した。選別した細胞をＰＢＳで洗浄し、急速凍結し、－８０℃で保存した。その後、安定して組み込まれたＯＲＦ配列を含むゲノムＤＮＡを、選別した細胞ペレットから単離した。スクリーニングを３回行った。次いで、単離されたゲノムＤＮＡを、構築物バーコード領域のインデックスＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。プールされたＰＣＲ生成物を精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ上で実行した。
ｐ．ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯスクリーニング
ＢｒｕｎｅｌｌｏヒトＣＲＩＳＰＲノックアウトプールプラスミドライブラリ（１ベクター系）は、Ｄａｖｉｄ Ｒｏｏｔ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｄｏｅｎｃｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃７３１７９）からの贈り物であった。５０ｎｇのＢｒｕｎｅｌｌｏプラスミドライブラリを、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ Ｓｔｂｌ４コンピテント細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１１６３５０１８）にエレクトロポレーションし、３０℃、２４．５×２４．５ｃｍの寒天バイオアッセイプレート上で一晩インキュベートした。２０時間後、コロニーを採取してプールし、増幅したプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を抽出して精製した。増幅後にライブラリ多様性が維持されたことを確認するために、ｓｇＲＮＡバーコード構築領域を増幅前及び増幅後のライブラリアリコートにおいてＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ生成物を精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で配列決定した。増幅前及び増幅後のアリコートからの配列決定データを比較して、同様の多様性を確保した。レンチウイルスを産生するために、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ ＃ＭＩＲ２３００）を使用して、ｐＤＮＡ、ＶＳＶ－Ｇ、及びｐｓＰＡＸ２プラスミドでトランスフェクトした。レンチウイルスを、トランスフェクションの４８時間後に採取し、急速凍結した。レンチウイルスを滴定するために、１５０万個の細胞のＭＣＣ－３０１細胞を、１００、２００、３００、５００、及び７００μＬのウイルスで形質導入した。各条件から、細胞の半分を０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ＳＣ－１０８７１）で選択し、残りの半分を未処理のままにした。感染率は、選択された条件及び選択されていない条件での生細胞数を比較することによって計算した。
レンチウイルス形質導入及びＦＡＣＳスクリーニングは、以下の例外を除いて、ＯＲＦスクリーニングに類似して３回行った：１億５０００万個のＭＣＣ－３０１細胞は、複製ごとに形質導入され、形質導入の１０～１４日後に細胞を選別した。更に、形質導入後、フローサイトメトリー選択の前に、代表的なペレット（４０００万個の細胞）を採取し、３つの複製全てから配列決定して、ｓｇＲＮＡの表現を評価した（図４Ｆ）。
ｑ．スクリーニングデータ分析
未処理のＦＡＳＴＱ読み取りを、ＰｏｏｌＱ ｖ２．２．０（ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｏｏｌｑ）を使用して、各構築物のｌｏｇ２正規化スコアに変換した。３つの複製の各々について、ＨＬＡ－Ｉ－高及びＨＬＡ－Ｉ－低の集団の正規化されたカウントスコア間のｌｏｇ２倍率変化（ＬＦＣ）を、各構築物について計算した。
ＯＲＦスクリーニングの場合、次いで、ＯＲＦ構築物を、それらの中央値ＬＦＣ値に基づいてランク付けし、対応するｐ値を、超幾何分布モデル（ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｃｒｉｓｐｒ－ｇｅｎｅ－ｓｃｏｒｉｎｇ）を使用して計算した。１つの遺伝子にマッピングする複数のＯＲＦが存在する場合、ＬＦＣ値を全ての構築物にわたって平均化して、遺伝子レベルの値を生成した。各選別された集団の試料の質を、ｌｏｇ正規化されたＯＲＦ構築物スコア（ｌｏｇ２（ＯＲＦ構築物読み取り／総読み取り×１０６＋１））を計算し、全ての構築物が等しく表されている場合、平均構築物頻度が予想される頻度の１０％以上であることを確認することによって評価した（平均ｌｏｇ正規化されたスコアカットオフ２．８４に対応する）（図４Ｆ（左））。
ＣＲＩＳＰＲスクリーニングの場合、対応するｌｏｇ正規化スコアカットオフ３．８０）と同等のカットオフ基準を使用して、複製２ ＨＬＡ－Ｉ－高の選別された集団の平均ｌｏｇ正規化スコアがわずか０．４１３であったため、複製２を破棄した（図４Ｆ（右））。その後、各ｓｇＲＮＡのＬＦＣ値を、複製物１と３との間でのみ平均化し、次いで、対応する個々のｓｇＲＮＡのランクに基づいて遺伝子をランク付けするために二項分布モデルを用いる、ＳＴＡＲＳソフトウェア（ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｃｒｉｓｐｒ－ｇｅｎｅ－ｓｃｏｒｉｎｇ）に入力した。
ＧＳＥＡ分析の場合、ランク付けされたＯＲＦ及びＣＲＩＳＰＲリストは、特定の遺伝子にマッピング又は標的化する全ての構築物のＬＦＣ値を平均化し、この平均ＬＦＣに基づいて遺伝子をランク付けすることによって生成された。次いで、これらのランク付けされたリストを、ＧＳＥＡＰｒｅｒａｎｋｅｄ（濃縮統計－重み付け、最大遺伝子セットサイズ－５００、最小遺伝子セットサイズ－１５）の入力として使用した。
ｒ．ＯＲＦ株の生成
ｐＬＸ＿ＴＲＣ３１７プラスミドにクローニングされた単一のＯＲＦ構築物は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）からの贈り物であった。ＯＲＦプラスミド、ｐｓＰＡＸ２、及びＶＳＶ－Ｇを、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして、レンチウイルスを産生した。ＭＣＣ－３０１及びＭＣＣ－２７７細胞を、２μｇ／ｍＬのポリブレン中の個々のＯＲＦレンチウイルスで形質導入し、スピンフェクションを２，０００ｒｐｍで３０℃で２時間行った。形質導入の２日後、形質導入細胞を、３日間の０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン処理で選択した。上述のように（方法：フローサイトメトリーを参照のこと）、ＭＣＣ－３０１株についてはＰＥコンジュゲートＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｗ６／３２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３１１４０６）、又はＭＣＣ－２７７株についてはＡＦ６４７コンジュゲートＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｗ６／３２）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ｓｃ２４６３７）のいずれかを使用して、フローサイトメトリーを行った。
ｓ．ＣＲＩＳＰＲ ＫＯ株の生成
配列５’ＣＡＣＣＧ－－－－ｓｇＲＮＡ配列－－－３’及び５’ＡＡＡＣ－－－ｓｇＲＮＡの逆相補鎖－－－Ｃ３’を有する順方向及び逆方向オリゴは、Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成された。順方向及び逆方向のオリゴをアニーリングしてリン酸化し、ＢｓｍＢＩ適合性オーバーハングを産生した。ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃５２９６１）をＢｓｍＢＩで消化し、エビアルカリホスファターゼで脱リン酸化し、ゲル精製した。ベクター及びインサートを、室温でＴ７ ＤＮＡリガーゼと１：８の比率でライゲーションし、Ｓｔｂｌ３化学的コンピテント細胞に形質転換した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｃ７３７３０３）。以下のプライマー：５’－ＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴ－３’を使用したＳａｎｇｅｒ配列決定により、正しいｓｇＲＮＡクローニングを確認した。レンチウイルスは、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（ｐｓＰＡＸ２、ＶＳＶ－Ｇ、及びクローニングされたＣＲＩＳＰＲプラスミド）において産生され、ＭＣＣ－３０１細胞は、単一のノックアウト株についての単一の構築物レンチウイルスで、又は２つの異なるｓｇＲＮＡを含有する２つのレンチウイルスプールで、二重ノックアウト株についての同じ遺伝子に対して形質導入された。形質導入は、ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯライブラリと同様に行った。単一ノックアウト株の遺伝子編集を検証するために、単一ノックアウト株及びＷＴ ＭＣＣ－３０１の両方からゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして使用し、プライマーを推定ｓｇＲＮＡ結合部位に隣接させるように設計した。ＰＣＲ生成物を精製し、ＳａｎｇｅｒをＥｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで配列決定した。次いで、ＷＴ ＭＣＣ－３０１を参照として、編集した細胞のパーセントを、ＴＩＤＥ４９によって決定した。上述のように（方法：フローサイトメトリーを参照のこと）、単一ノックアウト株についてはＰＥコンジュゲートＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｗ６／３２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３１１４０６）、又は二重ノックアウト株についてはＡＦ６４７コンジュゲートＨＬＡ－ＡＢＣ（Ｗ６／３２）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ｓｃ２４６３７）のいずれかを使用して、フローサイトメトリーを行った。
ｔ．ウエスタンブロット分析
簡潔に述べると、非標的化対照であるＰＣＧＦ１、ＢＣＯＲＬ１、又はＵＳＰ７に対して、１００万個のＭＣＣ－３０１細胞を単一のレンチウイルス構築物で形質導入した。形質導入の２日後、細胞を０．５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン処理で３日間選択に供した。ＩＦＮ－γ処理の場合、ＭＣＣ－３０１細胞株を、ウエスタンブロット分析のために採取する前に、示された用量のＩＦＮ－γで２４時間処理した。細胞を遠心分離によって収集し、ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、並びに２－メルカプトエタノール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を補充したＥＢＣ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）で溶解して、全細胞抽出物を得た。細胞抽出物を、遠心分離によって明らかにした。各試料のタンパク質含有量を、ＢｉｏＲａｄ ＢｒａｄＦｏｒｄアッセイを使用して、６×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加し、試料を９５℃で５分間沸騰させた後に決定した。分析のために４～２０％勾配ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を実行し、タンパク質を０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％乳を使用して、室温で１時間遮断し、続いて製造業者の使用に従ってＴＢＳＴ中の５％乳中、４℃で一晩希釈した適切な一次抗体［ＵＳＰ７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＰＡ５３４９１１）、ＰＣＧＦ１（Ｅ８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ＳＣ－５１５３７１）、ＴＡＰ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃１２３４１Ｓ）、ＴＡＰ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃１２２５９Ｓ）、ｐ５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ＳＣ－１２６）、汎ＭＹＣ（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ１９５２０７）、Ｖｉｎｃｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｖ９１３１）、ＴＢＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃８５１５Ｓ）］でインキュベートした。翌日、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、ＴＢＳＴ中の１％乳中、室温１時間希釈した適切な二次抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、ヤギ抗マウス ＃Ａ９０－１１６Ｐ又はヤギ抗ウサギ ＃Ａ１２０－１０１Ｐ）とインキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ＨＲＰ基質と短時間インキュベートした後、Ｇ－ｂｏｘイメージングシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ）上のシグナルを視覚化した。生のウエスタンブロット画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して視覚化のために処理した。
ｕ．ＭＫＬ－１ ｓｈＭＹＣＬ及びＷａＧａ ｓｈＳＴ／ＬＴ ＲＮＡ－ｓｅｑ、並びにフローサイトメトリー
レンチウイルスＰＬＫＯベクター（ｓｈＳｃｒ）から構成的に発現されるスクランブルｓｈＲＮＡは、以前に報告されている（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１８６４）。ＭＹＣＬ及びＥＰ４００ ｓｈＲＮＡ標的配列は、Ｂｌｏｃｋ－ｉＴ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。ＭＹＣＬ標的－ＧＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＴＣＡＣＡＡ、ｓｈＥＰ４００－２標的－ＧＣＴＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＧＴＴＡＧＡ、ｓｈＥＰ４００－３標的－ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＴＡＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡ。ｓｈＳｃｒ、ｓｈＭＹＣＬ、ｓｈＥＰ４００－２、及びｓｈＥＰ４００－３（）のアニーリングされた順方向及び逆方向オリゴを、ドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡベクターＴｅｔ－ｐＬＫＯ－ｐｕｒｏ（Ｄｍｉｔｒｉ Ｗｉｅｄｅｒｓｃｈａｉｎ，Ａｄｄｇｅｎｅ ＃２１９１５からの贈り物）のＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位間でクローニングした。２９３Ｔ細胞は、Ｔｅｔ－ＰＬＫＯ－ｐｕｒｏプラスミド＋ｐｓＰＡＸ２パッケージ及びＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０及び＃１２２５９）でトランスフェクトされ、ＭＫＬ－１細胞形質導入のためのレンチウイルス粒子を生成した。形質導入されたＭＫＬ－１細胞を、１μｇのピューロマイシンで４日間選択して、Ｄｏｘ誘導性ＭＫＬ－１ ｓｈＳｃｒ、ｓｈＭＹＣＬ、ｓｈＥＰ４００－２、及びｓｈＥＰ４００－３株を生成した。Ｄｏｘ誘導性ＷａＧａ ｓｈＳＴ／ＬＴ株は、Ｒｏｌａｎｄ Ｈｏｕｂｅｎからの贈り物であった。
ＲＮＡ－ｓｅｑについて、細胞を以下のようにＤＯＸで処理した。ＭＫＬ－１ ｓｈＭＹＣＬ及びｓｈＳｃｒ－２日間のＤｏｘ、ＭＫＬ－１ ｓｈＥＰ４００－２、－３及びｓｈＳｃｒ－６日間のＤｏｘ、Ｄｏｘの有無にかかわらずＷａＧａ ｓｈＳＴ／ＬＴ細胞－６日間。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ｍＲＮＡを、ＮＥＢ－Ｎｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で単離した。配列決定ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）のためのＮＥＢＮｅｘｔ ｍＲＮＡライブラリプレップマスターミックスセットで調製し、Ｑｕｂｉｔ、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、及びｑＰＣＲ ＱＣ分析を通過させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００システムで、５０サイクルのシングルエンド配列決定を行った。読み取りをＴＯＰＨＡＴによってｈｇ１９ゲノムにマッピングした。ＨＴＳｅｑを使用して、遺伝子名を含むカウントファイルを作成した。ＲパッケージＤＥＳｅｑ２を使用して、カウントを正規化し、１００万当たりの総読み取り数（ＴＰＭ）を計算し、遺伝子発現の差を決定した。示差的に発現した遺伝子のＭＡプロットを検査することによって、品質管理を行った。ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、受入番号ＧＳＥ６９８７８を有するＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓから入手可能である。ＧＳＥＡ分析の場合、ＤＥＳｅｑ２からのＬＦＣ値に基づいて遺伝子をランク付けした。次いで、これらのランク付けされたリストを、ＧＳＥＡＰｒｅｒａｎｋｅｄ（濃縮統計－重み付け、最大遺伝子セットサイズ－５００、最小遺伝子セットサイズ－１５）の入力として使用した。
フローサイトメトリーの場合、ｓｈＭＹＣＬ及びｓｈＳｃｒ ＭＫＬ－１細胞を０．２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで７日間処理し、ドキシサイクリン含有培地で３日ごとに更新した。加えて、構成的に発現した（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１７４８６）ｓｈＲＮＡ耐性ＭＹＣＬ（ｓｈＭＹＣＬ＋ＭＹＣＬ）構築物を含有するｓｈＭＹＣＬ細胞を同一に処理した。単一細胞懸濁液を、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ １５０４００６６）での処理を介して非酵素的に調製した。細胞をヒトＴｒｕｅ－Ｓｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃４２２３０２）とインキュベートし、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートした抗ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃ抗体（ＳＣＢＴ、＃３２２３５）又はアイソタイプマッチＩｇＧ対照（ＳＣＢＴ、＃２４６３７）で染色した。染色した細胞を１００μｍフィルターに通し、フローサイトメトリー（ＢＤ、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を介して蛍光を測定した。ＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａの判別を利用して単一細胞を選択し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７蛍光の幾何平均を単一細胞集団から計算した。
Figure 2023529026000147
Figure 2023529026000148
Figure 2023529026000149
ｖ．ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ及びＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ
ＭＡＸ、ＥＰ４００、ＳＴ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、及びＨ３Ｋ２７ａｃのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを生成した。ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲについては、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（）に示されるＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに基づいてＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ（ＩｄｔＤＮＡ）を使用して、以下のプライマーを設計した。以下の指示マニュアルに従って、ＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）上でＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ超高速ＳＹＢＲ緑色ｑＰＣＲマスターミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ｑＰＣＲを行った。
ｗ．ＭＣＣ腫瘍ＲＮＡ－ｓｅｑコホート
ＤＦＣＩで５２人の患者から腫瘍生検を収集し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加を介したＲＮＡ単離のために保存した。保存された組織をＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を介して均質化し、ＲＮＡをＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を介して採取した。ＲＮＡは、ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット（ＮＥＢ）を利用したライブラリ構築に提出した。ＮｏｖａＳｅｑ ６０００システム上で各方向に１５０サイクル（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）、ペアエンド配列決定を行った。生のペアエンド配列決定データを、ＦａｓｔＱＣ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を介して品質について広く評価した。品質管理を通過した試料は、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３ゲノムアセンブリのためにＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子注釈を利用して、Ｓａｌｍｏｎを介して転写物レベルに定量した。正規化された遺伝子レベルのカウントを、ＴｘＩｍｐｏｒｔ及びＤＥＳｅｑ２で調製した。ウイルス陽性又はウイルス陰性試料を特定するために、ペアエンド読み取りをＢＷＡを介してＭＣＰｙＶゲノム（Ｒ１７ｂ単離物）にマッピングし、ＭＣＰｙＶ特異的読み取り（＞１００）を含有するそれらの試料をウイルス陽性とみなした。ＲＮＡ－ｓｅｑヒートマップについて、ｌｏｇ２の正規化された遺伝子レベルのカウントのｚスコアを計算した。１つの腫瘍試料は、この試料で分析した１８個の遺伝子のうち７個において、ｚスコアが＞３．５又は＜－３．５であったため、その後、外れ値として廃棄された（比較のために、他の全ての試料における１８個の遺伝子全てのｚスコアの範囲は、－３．４５～２．４７であった）。その後、残りの５１個の腫瘍試料をユークリッド距離によってクラスタリングして、ＲＮＡ－ｓｅｑヒートマップを生成した。腫瘍純度は、ＥＳＴＩＭＡＴＥ Ｒパッケージを使用して決定した。腫瘍純度パーセンテージは、公開されているように、等式：ｃｏｓ（０．６０４９８７２０１８＋０．０００１４６７８８４×ＥＳＴＩＭＡＴＥスコア）を使用して、ＥＳＴＩＭＡＴＥスコアから計算した。
ｘ．ＰＣＧＦ１－ＫＯ ＲＮＡ－ｓｅｑ及びウエスタンブロット
ＲＮＡを、ＭＣＣ－３０１ ＰＣＧＦ１－ＫＯ ＃２株（２番目に高いスコアリングガイドＲＮＡ）及び非標的化ｓｇＲＮＡ対照及びＣａｓ９で形質導入したＭＣＣ－３０１株の３つの技術的複製から抽出した。「ＲＮＡ配列決定及び分析」で上述したように、試料の調製及び配列決定を行った。その後、生のＦＡＳＴＱファイルを、ＦａｓｔＱＣ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を介して配列決定の質について広く評価し、通過した質のものを更なる分析に使用した。サーモンを使用して、生の読み取りを、以下の規定を伴うＧＲＣｈ３８ｐ．１３ ｖ９９（Ｅｎｓｅｍｂｌ）のデコイ感知トランスクリプトームにマッピングした：－－ｗｒｉｔｅＵｎｍａｐｐｅｄＮａｍｅｓ、－－ｓｅｑＢｉａｓ、－－ｇｃＢｉａｓ、－－ｖａｌｉｄａｔｅＭａｐｐｉｎｇｓ。生の転写物レベルのカウントを、ＴｘＩｍｐｏｒｔを介して遺伝子レベルのカウントに変換し、ＤＥＳｅｑ２を使用して示差遺伝子発現分析を行った。
ＴＡＰ１ウエスタンブロットについては、ＭＫＬ－１細胞においてＩＦＮ－γ滴定を最初に行い（図４Ｑ）、ＴＡＰ１発現が検出可能となったＩＦＮ－γ範囲を決定した。その後、ＭＣＣ－３０１ ＰＣＧＦ１－ＫＯ及び対照ｓｇＲＮＡ株におけるＴＡＰ１ウエスタンブロットに、０、１００、及び１，０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ－γ濃度を使用した。
ｙ．細胞周期分析
１００万個のＭＫＬ－１対照又はｐ５３ ＫＯ細胞を播種し、ＤＭＳＯ、ＸＬ１７７Ａ（１００ｎＭ）又はＸＬ１７７Ｂ（１００ｎＭ）で３日間処理した。３日間の処理の最後の１時間の間に、細胞を１０μＭのＥｄＵヌクレオチドでパルスした。細胞を遠心分離によって収集し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して塊を分解し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド溶液を使用して室温で１５分間固定した。細胞をＰＢＳ中の１％ ＢＳＡで洗浄し、７０％氷冷エタノール中に再懸濁し、追加の固定及び透過化のために－２０℃で一晩インキュベートした。細胞を、データを取得する日まで－２０℃で７０％エタノールに保存した。データ取得日に、遠心分離によって細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞中に組み込まれたＥｄＵを、３０分間ロッキングしながら、室温でＣＬＩＣＫ反応カクテル（ＰＢＳ中１ｍＭのＣｕＳＯ４、１００μＭのＴＨＰＴＡ、１００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、及び２．２μＭのＡｌｅｘａ ６４７アジド）で標識した。次いで、試料をＰＢＳ中の１％ ＢＳＡで１回洗浄し、続いてＰＢＳで２回洗浄し、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ、１００ｎｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ溶液により室温で１時間インキュベートして、ＤＮＡを染色した。次いで、試料をストレーナチューブに通し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ分析器を使用して分析した。フローサイトメトリーデータＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。各細胞サイクル相における細胞のパーセンテージを、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して表した。
ｚ．ＵＳＰ７阻害剤実験
ＭＣＣ－３０１ ＵＳＰ７阻害剤実験のために、２５０万個のＭＣＣ細胞をＴ２５フラスコに播種し、ＵＳＰ７阻害剤ＸＬ１７７Ａ及び対照鏡像異性体ＸＬ１７７Ｂとともに１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、及び１０ｎＭでインキュベートした。細胞を３～４日間インキュベートした。インキュベーション後、１００万個の細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）で処理して、細胞クラスターを解離した。表面Ｆｃ受容体を、５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２２３０２）で遮断した。表面ＨＬＡ－Ｉを５μＬのＰａｎ ＨＬＡクラス Ｉ抗体（クローンＷ６／３２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０分間、４℃の暗所で染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で固定した。細胞を、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ上で分析した。ＭＣＣ－３０１データは、４つの独立した実験の代表である。統計分析を行うために、各細胞株について、最初に、ＤＭＳＯ群及び全ての実験群のＭＦＩに対して一元配置分散分析を行った。次いで、各濃度について個々のウェルチｔ検定を行い、ＸＬ１７７ＡとＸＬ１７７Ｂとの間のＭＦＩ（阻害剤）／平均ＭＦＩ（ＤＭＳＯ対照）の倍率変化を比較した。
ＭＫＬ－１ ＵＳＰ７阻害剤の実験の場合、ｐ５３－ＷＴ対照株（ＷＴ、スクランブル、ＡＡＶＳ１）及び３つのｐ５３－ＫＯ株をＵＳＰ７阻害剤で処理し、ＭＣＣ－３０１について上述したように、表面ＨＬＡ Ｉについてフローサイトメトリーによって評価した。対照株とｐ５３－ＫＯ株との間では、二乗平均平方根誤差がかなり異なっていたため（１２．２８９４及び６．６９８４４）、２つの群を二元配置分散分析によって別々に分析し、薬物治療は、両方の症例においてＭＦＩの変動の統計的に有意なソースであることがわかった（対照ではＰ＝０．０００３及びｐ５３－ＫＯ株ではＰ＜０．０００１）。分散分析は、ＸＬ１７７Ａ、ＸＬ１７７Ｂ、及びＤＭＳＯ処理間の事後Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を行い、図６Ｈに示されるｐ値を生成した。
ａａ．依存性マップの相関関係
ＤｅｐＭａｐ ２０Ｑ２ ＣＲＩＳＰＲ依存性データは、ｗｗｗ．ｄｅｐｍａｐ．ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／ｄｏｗｎｌｏａｄからダウンロードした。少なくとも１つのコード変異の基準に基づいて、ＤｅｐＭａｐポータル上のＣｅｌｌ－Ｌｉｎｅ Ｓｅｌｅｃｔｏｒツールを使用して、ＴＰ５３変異状態を割り当てた。ピアソン係数を、Ｒ中のｔｅｓｔ．ｃｏｒを使用して計算し、この関数によって出力された両側ｐ値を、ｐ．ａｄｊｕｓｔを使用してＦＤＲに変換した。ｇｇｐｌｏｔ２、ｔｉｄｙｖｅｒｓｅ、ｇｒｉｄＥｘｔｒａ、ｃｏｗｐｌｏｔ、及びスケールを使用して、プロットを生成した。ＧＳＥＡは、ピアソン相関が負の場合、－ｌｏｇ（ｐ－ｖａｌ）に（－１）を乗じてランク付けされた遺伝子リストを使用して行った。
定量化及び統計分析
全てのフローサイトメトリー棒グラフは、１つの試料を示す図１Ｊ及び図１Ｎを除いて、３つの技術的又は生物学的複製の平均蛍光強度を示す。特に断りのない限り、エラーバーは、標準偏差を示す。全ての実験において、０．０５のＰ値を有意性閾値として使用した。各図で使用される特定の統計検定は、図の凡例及び／又は方法の節で言及されている。
全ての統計分析の詳細とともに、バージョン番号を含む特定のソフトウェアは、上記のそれぞれの方法の節に列挙されている。研究の一部として、ランダム化手順又は試料サイズの計算は実行されなかった。全エクソーム配列決定分析、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析、ＭＣＰｙＶウイルス転写物検出、及びＷＧＢＳプロモーターシグナル抽出のための特定のパラメータ設定を含む全ての分析コードは、ｗｗｗ．ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｄｋｏｒｔｈａｕｅｒ／ＭＣＣのＭＩＴライセンス下でＧｉｔＨｕｂリポジトリで利用可能になる。Ｒにおける全ての解析は、バージョン３．６．２を使用して実行した。
実施例１１：一次患者試料からのＭＣＣ細胞株の確実な生成
多くの確立されたＭＣＣ株は、インビトロで多重継代され、関連するアーカイブ原発腫瘍材料が欠如しているため、ＭＣＣ株を生成するための信頼できるアプローチが確立された。ＭＣＣは、典型的にはＲＰＭＩ－１６４０培地で培養されるが、ＭＣＣの神経内分泌組織学及び神経堤幹細胞培地によるＭＣＣ株の生成に成功した以前の報告に基づいて、以前に膠芽腫細胞株を確立するために使用された神経幹細胞培地が細胞株の確立を促進すると仮定した。試験した５つの培地製剤のうち、成長因子補充を有するＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＮＳ－Ａ増殖培地は、インビトロでの成長率が一貫して最も高く、培養７日後に細胞数が３倍になり（図１Ａ）、複数のＭＣＣ腫瘍細胞株の確実な成長を促進した（図１Ｐ）。この方法を使用して、生検（ｎ＝４）又は患者由来異種移植片（ＰＤＸ）材料（ｎ＝７）から１１の安定した細胞株を確立した（表６）。確立された古典的ＭＣＣ株と一致して、これらの株は、ＭＣＣ－３２０におけるＣＫ２０陰性度を除いて、ほとんどが懸濁液中の密なクラスター中で増殖し、ＭＣＣマーカーＳＯＸ２及びＣＫ２０について染色陽性となった（図１Ｂ、図１Ｃ）。１１個の株のうち７個の株（６３．６％）が、ＶｉｒｏＰａｎｅｌを使用してＭＣＰｙＶ＋であることが決定された（図１Ｄ）。
一致した細胞株及び生殖系列ＤＮＡが利用可能であった１１人の患者のうち７人からの腫瘍ＤＮＡに対して、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を行った（表１１）。ＭＣＰｙＶ－（ｎ＝２）及びＭＣＰｙＶ＋（ｎ＝５）試料は、それぞれ、予想されるように、コントラストの高い（細胞株当たりの非サイレントコード変異の中央値６４７、範囲３５４～９４０）及び低い（中央値４０、範囲１８～７３）ＴＭＢ（図１Ｅ、表１１）を示した。分析した２つのＭＣＰｙＶ－株は、以前の研究と一致するＲＢ１及びＴＰ５３（表１１）における変異を含有した。対応する腫瘍又はＰＤＸ試料において、９４．４％の細胞株変異の中央値が検出され（５１～１００％の範囲）、腫瘍細胞株対は、変異プロファイルに基づいて互いに最も密接に関連付けられた（図１Ｆ）。注目すべきことに、いくつかのＰＤＸ由来の腫瘍試料（表６）は、マウス細胞汚染に関連するバリアントに起因する可能性が高い、それらの対応する細胞株（図１Ｅ）よりも高い変異負荷を示した。利用可能なマッチした腫瘍及び細胞株対の対応するＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）（表１）は、全てのＭＣＰｙＶ＋試料中でＭＣＰｙＶ ＳＴ及びＬＴ抗原転写物を検出した（図１Ｇ、図１Ｄ）。これらのトランスクリプトームの無監督階層クラスタリングによって、各細胞株は、試料の種類によるクラスタリングではなく、対応する親腫瘍と最も密接に関連付けられ（平均ペアワイズスピアマン相関０．９２）（図１Ｇ、図１Ｈ）、これらの細胞株がそれらの親腫瘍を忠実に再現することを確認する。
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１１個のＭＣＣ株のうち１０個は、フローサイトメトリーによって表面ＨＬＡ－Ｉが顕著に低く、ほとんど存在しないことを示した（図１Ｄ）。この低表面ＨＬＡ－Ｉは、十分に研究されたＭＣＰｙＶ＋株ＭＫＬ－１及びＷａＧａと同様であった（図１Ｌ）。３つの株（ＭＣＣ－３３６、－３５０、－３５８）は、ＩＦＮ－γ曝露後にＨＬＡ－Ｉを有意に上方制御しなかったが（ＭＦＩの１．１５倍以下の増加）、８つの株は、２．５倍以上の増加を示した（中央値５．７、範囲２．５～１２．４）。更に、ＩＦＮ－α－２ｂ及びＩＦＮ－βがＨＬＡ－Ｉを上方制御することが２つの株で確認されたが（図１Ｍ）、ＩＦＮ－γはまた、ＭＣＣ－３０１細胞株におけるＨＬＡ－ＤＲ発現も上方制御した（図１Ｎ）。
これらの細胞株の結果は、９つの対応する親腫瘍上のＨＬＡ－Ｉ発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）特性評価と一致し、大部分（９つのうちの６つ）は、１５％未満の腫瘍細胞においてＨＬＡ－Ｉ陽性染色を示し（図１Ｊ；図２Ｉ）、並びに最小限のＨＬＡクラスＩＩ（図１Ｒ）を示した。腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞密度（中央値５６．６細胞／ｍｍ２、範囲０～１０３１．８）は、ＭＣＣについての以前の報告と同等であった（図１Ｓ）。更に、連続ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍試料の入手可能性により、次いで、我々は、経時的なＨＬＡ－Ｉ発現の変化を評価することができた。ＭＣＣ－２９０を除く全ての細胞株は、治療後の腫瘍に由来し、最も一般的には放射線±シスプラチン／エトポシド（表６）であり、治療前の試料は、６人の患者に対して利用可能であった。６例のうちの５例では、処理後標本は、対の処理前標本（図１Ｏ）よりも少ないＨＬＡ－Ｉ陽性細胞を示し、治療抵抗性の機構としてのＨＬＡ－Ｉ損失を更に示唆した。
実施例１２：ＭＣＣ株は、複数のクラスＩ遺伝子の転写下方制御及びＮＬＲＣ５改変を示す。
ＭＣＣ株におけるＨＬＡ－Ｉ表面発現障害の機構を明らかにするために、材料が利用可能であったＭＣＰｙＶ＋及びＭＣＰｙＶ－株のサブセットの詳細なゲノム及び転写特性評価を行った（表１１）。クラスＩ ＡＰＭの転写改変を定義するために、ＩＦＮ－γ刺激の前後の１１個のＭＣＣ株全てのトランスクリプトームを評価した。ベースライン時に、ＭＣＣ株は、それぞれＭＣＰｙＶ－及びＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣの起源細胞の候補である、対照表皮角質細胞及び真皮線維芽細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｂ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＰＳＭＢ８、及びＰＳＭＢ９の低い発現を示した（図２Ａ）。ＩＦＮ－γ処理は、クラスＩ遺伝子を顕著に上方制御し（図２Ｂ、表１１）、この傾向は、４つのＭＣＣ株のマッチングしたプロテオームにおいて確認された（図２Ｃ）。非ＩＦＮ－γ応答性株（図１Ｊ）は、ＭＣＣ－３３６におけるＩＦＮ誘導ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ ｍＲＮＡの上方制御の欠如（図２Ａ）、並びにＳＴＡＴ１リン酸化の欠如を含む、ＭＣＣ－３５０におけるタンパク質レベルでのＩＦＮ誘導ＨＬＡ－Ｉ及びＩＦＮ経路の上方制御の全体的欠如（図２Ｃ、図２Ｄ～Ｅ）などの可変欠陥を示した。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑデータで観察されたＨＬＡ－Ｉ下方制御の不均一性を調べるために、２つの新鮮なＭＣＣ生検（ＭＣＣ－３５０［ＭＣＰｙＶ－］及びＭＣＣ－３３６［ＭＣＰｙＶ＋］）の高スループット、液滴ベースの単一細胞トランスクリプトーム配列決定を行った。２つの試料にわたって同定された合計１５，８０８個の細胞（平均４２３１．９遺伝子／細胞）から、７つの異なる転写的に定義されたクラスターが検出された。ＣＤ４５＋免疫細胞は、クラスター６を含んでいたが、クラスター０～５は、ＳＯＸ２、ＳＹＰ、及びＡＴＯＨ１の発現によって特定されるＭＣＣ細胞であった（図２Ｆ、図２Ｇ）。全てのＭＣＣクラスターは、ほぼ不在のＨＬＡ－Ｂ、ＴＡＰ１／２、ＰＳＭＢ８／９、及びＮＬＲＣ５発現並びに低ＨＬＡ－Ａ及び－Ｃ発現を示し（図２Ｆ、図２Ｈ）、バルクＲＮＡ－ｓｅｑデータと一致した。対照的に、クラスター６（免疫細胞）は、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、及び－Ｃ転写物の平均２１倍高いレベルを示した。
ベースライン時のクラスＩ遺伝子の顕著なＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの下方制御を考慮して、これらの観察の可能性のある遺伝的基盤を調べた。ＷＥＳにより、ＭＣＣ－３２０におけるＨＬＡ－Ｆ及び－Ｈ変異を除いて、クラスＩ ＡＰＭ遺伝子に顕著な変異を有するＭＣＣ株はなかった（表１１）。全ての分析株にわたるＩＦＮ経路遺伝子で合計３２個の変異が検出されたが、Ｐｏｌｙｐｈｅｎによっておそらく損傷すると予測されたのは２個のみであり、ＩＦＮＧＲ１／２、ＪＡＫ１／２、ＳＴＡＴ１、又はＩＲＦ１／２では変異は検出されなかった（表１１）。しかしながら、ＮＬＲＣ５のコピー数損失は、分析した８つの株中５つ（６２．５％）で検出された（図２Ｉ、表１１）。ＮＬＲＣ５は、プロモーター内の保存されたＳ／Ｘ／Ｙ領域に局在するいくつかのクラスＩ経路遺伝子の転写活性化因子である。ＮＬＲＣ５コピー数の損失は、最近、多くのがんにわたる一般的な改変として認識されている。
実施例１３：ＩＦＮ－γ誘導ＨＬＡ Ｉ上方制御は、ＨＬＡペプチドームのシフトに関連している。
ＨＬＡ－Ｉの発現の低下は、ＭＣＣにおけるＨＬＡ提示ペプチドの数及び多様性の低下をもたらし、腫瘍の免疫原性に影響を与えることが予想される。実際に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（方法）によるクラスＩ結合ペプチドの直接検出のためのワークフローを使用して、汎ＨＬＡ－Ｉ抗体を用いた腫瘍細胞溶解物の免疫沈降後（図３Ｍ）、親腫瘍及び細胞株におけるベースライン時の同様に低い総ペプチドカウントが検出された（図３Ａ～Ｂ）。ＩＦＮ－γ刺激後、免疫沈降のための同等の入力材料を使用して、７つの細胞株にわたってクラスＩ結合ペプチドの存在量の中央値１２倍の増加を検出した（図３Ｋ、図３Ａ～Ｂ、方法）。細胞株と親腫瘍との間のベースライン免疫ペプチドームアミノ酸シグネチャは、高度に相関しており（図３Ｃ）、細胞株ペプチドームは、対応する腫瘍ペプチドームとそれらのペプチドの５０％超を共有していた（図３Ｄ）。対照的に、ＩＦＮ－γ処理の前後の相関が低く、ＩＦＮ－γ曝露による全体的な結合モチーフの改変が観察された（図３Ｋ及び３Ｅ、図３Ｎ）。これらの観察を更に調べるために、同定されたペプチドによって結合した最も可能性の高いＨＬＡ対立遺伝子を推測した。ＩＦＮ－γ処理の有無にかかわらず細胞株を比較すると、各ＨＬＡ対立遺伝子にマッピングするペプチドの頻度に劇的な変化が観察され、最も顕著なのは、ＨＬＡ－Ｂ提示ペプチドの増加であった（図３Ｆ～Ｇ）。
ＭＣＰｙＶ＋株について、ＩＦＮ－γ刺激に続くＨＬＡ－Ｉのこの上方制御が、ＭＣＰｙＶ－特異的エピトープを提示する能力の増加をもたらすと仮定した。実際、ＭＣＰｙＶ＋株ＭＣＣ－３６７について、ＬＴ抗原（ＴＳＤＫＡＩＥＬＹ）の起点結合ドメイン（ＯＢＤ）に由来するペプチド配列が検出され、これは、その細胞株のＨＬＡ＊Ａ０１：０１対立遺伝子（ランク＝０．０１８、ＨＬＡｔｈｅｎａ）の強力な結合剤として予測された（図３Ｊ、方法）。このＭＣＣ－３６７由来エピトープに対する反応性は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって自己Ｔ細胞によって確認され、このエピトープの免疫原性が実証された（図３Ｌ）。
実施例１４：ＭＣＣにおけるＨＬＡ－Ｉの新規制御因子を同定するための相補的ゲノムスケール機能獲得及び喪失スクリーニング
複数のクラスＩ ＡＰＭ遺伝子の同時転写下方制御は、この抑制が上流制御因子によって調整されたことを示唆した。ＮＬＲＣ５コピー数減少は顕著な事象であったが、８つの株中５つ（６２．５％）でしか観察されなかったため、他の制御因子の存在が疑われた。この目的のために、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣ－３０１株における対ゲノムスケールオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）機能獲得及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウト（ＫＯ）機能喪失スクリーニングを生成して、ＭＣＣにおけるＨＬＡ－Ｉ表面発現の新規の制御因子を系統的に特定した。ＭＣＣ－３０１株は、３つの理由で選択された。第一に、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣの低ＴＭＢは、ウイルス抗原シグナル伝達又は細胞型特異的因子に関連し得るＨＬＡ－Ｉ抑制の均質な機構の可能性を増加させる。第二に、ＨＬＡ－ＩのＩＦＮ－γ媒介性誘導性は、ＨＬＡ－Ｉの上方制御を禁止するであろうハードワイヤされたゲノム改変の可能性をほぼ排除する。最後に、かかるスクリーニングは、ＭＣＣ－３０１（図１Ｐ）などの堅牢な成長を有する細胞株を必要とする。
ＭＣＣ－３０１細胞を、ゲノムスケールＯＲＦ又はＣａｓ９＋ｓｇＲＮＡレンチウイルスライブラリ（Ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いて低い多重度の感染で形質導入した。抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体で細胞を染色した後、ＨＬＡ－Ｉ－高集団及びＨＬＡ－Ｉ－低集団は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づく細胞選別単離を受け、各スクリーニングは、３回行った（図４Ａ）。ＨＬＡ－Ｉ－高集団とＨＬＡ－Ｉ－低集団の中央値ｌｏｇ２倍率変化（ＬＦＣ）濃縮に従って構築物をランク付けし、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングについては、ｓｇＲＮＡランキングを、ＳＴＡＲＳアルゴリズム（方法）を使用して遺伝子レベルのランキングに集計した。
実施例１５：ＯＲＦスクリーンを介してＭＣＣにおけるＨＬＡ－Ｉ抑制の媒介因子として同定されたＭＹＣＬ
ＯＲＦスクリーニングは、ＨＬＡ－Ｉ－高集団とＨＬＡ－Ｉ－低集団では、４倍超の濃縮で７５ヒットを生じた。予想されるように、これらのヒットは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって、ＩＦＮ及びＨＬＡ－Ｉ経路遺伝子について高度に濃縮された（図４Ｄ）。上位ヒットは、ＩＦＮＧであり、ＩＦＮ経路遺伝子は、上位１２ヒットのうちの４つを占めた（３３％）。ＨＬＡ－Ｂ及び－Ｃは、＃１０及び＃３８にランク付けされた。注目すべきことに、ＯＲＦライブラリによる形質導入は、おそらくＩＦＮ遺伝子ＯＲＦで形質導入された細胞からのＩＦＮ分泌に起因して、ＨＬＡ－Ｉの集団全体の増加をもたらした。ＧＦＰ形質導入細胞は、表面ＨＬＡ－Ｉの増加を示さなかったため、レンチウイルス形質導入によるものではなく、ＯＲＦライブラリ特異的効果が確認された（図４Ｃ）。更に、これらの顕著なヒットは、少なくとも２つの複製物の間で高い一致性を示したことが確認された（図４Ｆ－Ｉ）。
多くの高度に濃縮されたポジティブヒットは、ＩＦＮ又はＨＬＡ－Ｉ経路に直接関係しない上位のポジティブヒットに焦点を当てて、ＭＣＣ－３０１において７１個の単一ＯＲＦ過剰発現株を生成することによって検証された。フローサイトメトリーによって、７１個の候補ヒットのうち８個（１１．３％）は、ＧＦＰ対照と比較して２倍超の表面ＨＬＡ－Ｉを上方制御したが、同時に、ポリコーム関連遺伝子ＥＺＨＩＰ（ＣＸｏｒｆ６７）及びＹＹ１（図４Ｈ）を含む形質導入後も生存率を維持した。更なる検証として、ＯＲＦをＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣ－２７７株に形質導入し、ＨＬＡ－Ｉのレベルの上昇を確認した（図４Ｈ）。ＨＬＡ－Ｉのレベルを上昇させた遺伝子とは対照的に、ＭＹＣＬは、上位のネガティブヒットであった（図４Ｄ）。ＭＹＣＬは、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣにおける重要な転写因子であり、ＳＴは、ＥＰ４００クロマチン修飾因子複合体にＭＹＣＬを結合及び動員して、がん形成に必要な広範なエピジェネティック変化を引き起こす。検証として、ＭＫＬ－１細胞におけるＭＹＣＬノックダウンは、スクランブルｓｈＲＮＡ対照と比較して、フローサイトメトリーによる表面ＨＬＡ－Ｉの増加をもたらしたことが観察され（Ｐ＝０．００３）、この効果は、外因性ＭＣＹＬのレスキュー発現によって否定された（図４Ｍ）。
ＭＹＣＬがＨＬＡ－Ｉ表面発現にどのように影響するかを更に調べるために、ＭＫＬ－１ ＭＹＣＬ ｓｈＲＮＡ株のＲＮＡ－ｓｅｑを行った。スクランブルｓｈＲＮＡ対照株と比較して、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ１、及びＰＳＭＢ９を含むクラスＩ遺伝子の発現において、ＧＳＥＡによる抗原プロセシング／提示のシグネチャのための濃縮で、２倍超の増加を観察した（ｑ＝０．０４、図４Ｎ、図５Ｂ）。ＳＴは、ＳＴ－ＥＰ４００－ＭＹＣＬ複合体を介してＭＹＣＬ機能に結合し、強化するため、ウイルス抗原不活性化もクラスＩを上方制御する可能性があることが疑われた。これらの所見の範囲を更に拡大するために、別の確立されたＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣ株であるＷａＧａを選択して、ＳＴ及びＬＴの共有エクソンを標的とするｓｈＲＮＡで形質導入し、両方のＭＣＰｙＶウイルス抗原の不活性化をもたらした。ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＮＬＲＣ５における１．５倍超の増加を含む、類似しているが、より控えめなクラスＩ遺伝子の上方制御が観察された（図４Ｏ）。更に、２つの異なるｓｈＲＮＡを有するＭＫＬ－１におけるＥＰ４００のノックダウンは、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの３倍超の増加をもたらした（図５Ｊ）。したがって、これらの所見は、ＭＣＣにおけるＨＬＡ－Ｉの下方制御におけるＳＴ－ＥＰ４００－ＭＹＣＬ複合体成分の継続的な発現を暗示する。
ＭＹＣＬのＨＬＡ－Ｉ抑制効果がＭＣＰｙＶ－ＭＣＣ及び他のがんに一般化したかどうかを判定するために、ＭＣＰｙＶ－ＭＣＣにおけるＭＹＣＬのコピー数ステータスを評価した。ＭＹＣＬを包含する染色体１ｐのコピー数獲得は、ＭＣＣにおけるより一般的なコピー数改変のうちの１つとして以前に報告された。４つのＭＣＰｙＶ－ＭＣＣ株のうちの３つ（７５％）は、ＭＹＣＬコピー数の獲得（コピー数比１．１６～１．５６、図５Ｅ）を示し、ＭＣＰｙＶ－ＭＣＣがウイルス抗原の不在下でＭＹＣＬシグナル伝達を増強し得る機構を示唆している。ＭＹＣＬが他のがんにおけるＨＬＡ－Ｉ発現に関連しているかどうかを判定するために、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａからのＲＮＡ－ｓｅｑデータを検索した。特に、ＨＬＡ－Ｉ経路成分の発現が低い小細胞肺がん及び神経芽細胞腫などの他の神経内分泌がんもまた、それぞれＭＹＣファミリーメンバーのＭＹＣＬ及びＭＹＣＮの過剰発現を頻繁に特徴とした（図５Ｆ）。全体として、ＭＹＣＬは、平均ＨＬＡ－Ｉ遺伝子発現と負の相関を示した（ピアソン相関ｒ＝－０．３３、Ｐ＝０．０４）。
実施例１６：ＣＲＩＳＰＲ機能喪失スクリーニングによってＭＣＣにおけるＨＬＡ－Ｉの新規の負の制御因子として同定されたＰＲＣ１．１複合体
ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯスクリーニングは、いくつかのクラスＩ ＡＰＭ遺伝子も同定した。上位ネガティブヒットは、非結合ＨＬＡ－ＩとＴＡＰとの間の結合を容易にする部分的に折り畳まれたＨＬＡ－Ｉ重鎖のためのシャペロンであるＴＡＰＢＰ（図４Ｅ）であった。他の顕著なネガティブヒットとしては、ＩＦＮ経路遺伝子ＩＲＦ１（＃２１）及びクラスＩ遺伝子ＣＡＬＲ（＃８４）及びＢ２Ｍ（＃１４１）が挙げられた。ＯＲＦスクリーニングで以前にＭＹＣＬを同定したところ、ＣＲＩＳＰＲポジティブヒット内の他のＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体メンバーには、ＢＲＤ８（＃５１）、ＤＭＡＰ１（＃９３）、ＫＡＴ５（＃６１９）、及びＥＰ４００（＃８８６）が含まれることが観察された。加えて、ＣＲＩＳＰＲポジティブヒット内のポリコーム抑制複合体１．１（ＰＲＣ１．１）のいくつかの構成要素が同定され、スクリーニングの上位２つのヒットが含まれた。ＵＳＰ７（＃１）、ＢＣＯＲＬ１（＃２）、及びＰＣＧＦ１（＃５０）。これらの遺伝子について、２つのＣＲＩＳＰＲ複製物間の高い一致性が観察され（図４Ｆ及びＩ、方法）、４つのｓｇＲＮＡのうちの少なくとも２つについては、４．５倍超の濃縮が観察された（図４Ｇ）。ＰＲＣ１．１は、ＣｐＧ島におけるＨ２ＡＫ１１９のモノユビキチン化を通じて遺伝子発現をサイレンシングする非正準ポリコーム抑制複合体である。ＰＲＣ１．１の他の構成要素としては、ＫＤＭ２Ｂ、ＳＫＰ１、ＲＩＮＧ１Ａ／Ｂ、ＲＹＢＰ／ＹＡＦ２、及びＢＣＯＲ（ＢＣＯＲＬ１の代わりになり得る）が挙げられる。全体として、並列スクリーニングにわたる上位ヒットのレビューは、ポリコーム抑制複合体に関連するいくつかのヒットを明らかにした：ＰＲＣ１．１成分ＵＳＰ７、ＢＣＯＲＬ１、及びＰＣＧＦ１；ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）及びＹＹ１の阻害剤であるＯＲＦヒットＥＺＨＩＰ；並びにＰＲＣ２成分ＥＥＤ及びＳＵＺ１２（ＣＲＩＳＰＲポジティブヒット＃１６２及び＃４０９）。
ＰＲＣ１．１遺伝子ＵＳＰ７、ＢＣＯＲＬ１、及びＰＣＧＦ１に対する一連のＭＣＣ－３０１ ＫＯ株を生成した。非標的化ｓｇＲＮＡ対照株と比較して、各遺伝子のノックアウトは、フローサイトメトリーによって評価されるように、ベースライン表面ＨＬＡ－Ｉ発現レベルを増加させた（図５Ｈ）。ＰＣＧＦ１ノックアウトは、ＩＦＮ－γ誘導ＨＬＡ－Ｉ上方制御も同様に増加させた（図４Ｐ）。遺伝子編集及びタンパク質ノックアウトを、抗体が利用可能である遺伝子において、ＴＩＤＥ（図４Ｌ）を使用したＳａｎｇｅｒ配列決定によって、及びウエスタンブロット（図５Ｈ）によって確認した。
ＰＲＣ１．１機能の喪失に関連する特定のクラスＩ ＡＰＭ遺伝子発現変化を定義するために、ＰＣＧＦ１がＰＲＣ１．１機能に不可欠であることを以前の研究が実証したため、ＭＣＣ－３０１におけるＰＣＧＦ１－ＫＯ株及び非標的化ｓｇＲＮＡ対照株からのＲＮＡ－ｓｅｑデータを生成した。ＰＣＧＦ１－ＫＯ株において上方制御された遺伝子は、標的遺伝子を抑制するためにＰＲＣ２と協調するＰＲＣ１．１の既知の役割と一致する、「ＰＲＣ２標的遺伝子」シグネチャ（図５Ｉ）のために著しく濃縮された。顕著なことに、クラスＩ ＡＰＭ遺伝子ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びＰＳＭＢ８の発現の５倍超の増加、並びにクラスＩトランスアクチベーターＮＬＲＣ５のよりわずかな増加が認められた（図５Ｉ）。更なる確認のために、ベースライン時及びＰＣＧＦ１－ＫＯ株におけるＩＦＮ－γ処理後の両方でウエスタンブロットによるＴＡＰ１のタンパク質発現の増加が観察された（図５Ｊ）。５１個のＭＣＣ腫瘍生検のＲＮＡ－ｓｅｑコホートを評価して、ＨＬＡ－Ｉ遺伝子の発現とＰＲＣ１．１との間の関連性を検討した。バルククラスＩ発現の測定を混乱させ得る免疫細胞浸潤の可能性を説明するために、ＥＳＴＩＭＡＴＥ５１を適用して、腫瘍純度（純度中央値８７％、範囲４１～９９％）を計算した。いくつかのクラスＩ遺伝子とＰＲＣ１．１成分ＢＣＯＲ及びＫＤＭ２Ｂとの間に負の相関が観察された（Ｐ＜０．０５、図５Ｇ）。
ＭＹＣＬとＰＲＣ１．１との間に関係があるかどうかを探索するために、ＭＫＬ－１細胞内で以前に生成されたＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを分析した。ＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体の構成要素がＰＲＣ１．１遺伝子ＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１のプロモーターに結合しているが、ＢＣＯＲ又はＢＣＯＲＬ１に結合していないことが観察された（図６Ａ、図６Ｂ）。ＭＡＸ及びＥＰ４００のＵＳＰ７及びＰＣＧＦ１への結合を、ＣｈＩＰ ｑＰＣＲによって更に確認した（図６Ｇ）。これらの結果は、ＰＲＣ１．１がＭＹＣＬの下流で作用し得ることを示す。更に、ＭＹＣＬ及びＰＲＣ１．１成分ＵＳＰ７の両方は、それぞれ、ＭＣＰｙＶ ＳＴ及びＬＴウイルス抗原と直接相互作用することが報告されているタンパク質をコードし、ウイルス抗原がＭＹＣＬ及びＰＲＣ１．１を介して配位して、ＨＬＡ－Ｉ表面発現を抑制し得るモデルを示唆している（図４Ｋ）。
実施例１７：ＵＳＰ７の薬理学的阻害は、ＭＣＣにおけるＨＬＡ－Ｉを復元する
ＰＲＣ１．１成分ＵＳＰ７の選択的低分子阻害剤が、以前に開発されている。しかしながら、ＵＳＰ７は、ＭＤＭ２脱ユビキチン化によるｐ５３の制御など多くの機能を有し、ＰＲＣ１．１との関連が最近発見されたため、ＰＲＣ１．１におけるＵＳＰ７の役割の程度が調査された。がん依存性マップを調べることにより、がん細胞株にわたるＵＳＰ７の生存依存性と相関する遺伝子が同定され、生存共依存性は、かかる遺伝子が同じ複合体又は経路内で機能し得ることを意味するという根拠が得られた。ＴＰ５３野生型（ＷＴ）株は、ＵＳＰ７遺伝子とポリコーム遺伝子との間に共依存性を示さなかったが、ＴＰ５３変異体株は、ＵＳＰ７遺伝子とＰＲＣ１．１遺伝子ＰＣＧＦ１及びＲＩＮＧ１との間に高い相関性を示した（それぞれ、６番目及び１３番目に高い相関係数、ＦＤＲ＝２．４６×１０－４及び２．９７×１０－３）（図６Ｅ）。更に、ＧＳＥＡ分析は、ＴＰ５３変異体細胞株におけるＵＳＰ７共依存性遺伝子内で最も濃縮された遺伝子セットとして、ヒストンユビキチン化を明らかにした（図６Ｆ）。これらの結果は、ＵＳＰ７がＰＲＣ１．１機能において重要な役割を果たすという概念を更に支持する。
強力で不可逆的なＵＳＰ７阻害剤であるＸＬ１７７Ａの活性を、５００倍強力ではないが、より高い用量で標的上の活性を示すＸＬ１７７Ａのエナンチオマーである、ＸＬ１７７Ｂと比較した。２つのＭＣＰｙＶ＋株（ＭＣＣ－３０１及び－２７７）並びに２つのＭＣＰｙＶ－株（ＭＣＣ－２９０及び－３２０）を、様々な阻害剤濃度で３日間処理した。１００ｎＭでは、２つのＭＣＰｙＶ＋株において、ＤＭＳＯと比較して、フローサイトメトリーによる表面ＨＬＡ－Ｉの発現において、平均２．０倍（範囲１．７８～２．２７）の増加が観察された。ＭＣＰｙＶ－株内では、ＭＣＣ－２９０におけるＨＬＡ－Ｉレベルのより穏やかな増加が観察されたが、ＭＣＣ－３２０では観察されなかった（図６Ｄ）。ｐ５３制御におけるＵＳＰ７の顕著な役割を考慮して、ＨＬＡに対するＵＳＰ７の効果がｐ５３依存性であるかどうかを評価した。特に、ＭＫＬ－１におけるＴＰ５３－ＫＯ及びＴＰ５３－ＷＴの両方の株のＸＬ１７７Ａ処理は、ＸＬ１７７Ｂ及びＤＭＳＯと比較して表面ＨＬＡ－Ｉを増加させた（図６Ｈ、図６Ｋ）。更に、ＵＳＰ７阻害は、ＳからＧ１相へのわずかな細胞周期シフトを誘導したが、この効果は、ＴＰ５３－ＷＴ及びＴＰ５３－ＫＯの両方の文脈で類似していた（図６Ｌ）。ＨＬＡ－Ｉ提示に対するＵＳＰ７阻害の機能的結果を評価するために、ＸＬ１７７Ａ及びＸＬ１７７Ｂで処理したＭＣＣ－３０１細胞のＨＬＡ－Ｉ結合ペプチドームを分析した。ＸＬ１７７Ａ処理細胞は、ＸＬ１７７Ｂ及び未処理細胞と比較して、より高い存在量の表示されたペプチドを示した（図６Ｉ）。３つの条件のうちの２つの間で存在量が有意に異なる（Ｐ＜０．０５）２８２個のペプチドのうち、２７０個（９５．７％）は、未処理細胞と比較して、ＸＬ１７７Ａにおいてより存在量が多かった。特に、ＸＬ１７７Ａ処理は、それぞれのＨＬＡ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ）上に表示されるペプチドの頻度に影響を与えなかった（図６Ｊ）。
実施例１８：考察
表面ＨＬＡ－Ｉ損失は、がんにおける免疫回避の広範な機構であり、免疫療法への耐性を促進する。ウイルス駆動がんとして、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣは、ウイルス抗原が正常な生理学を破壊する機構を研究するための非常に有益な基質を提供する。出願人は、ＭＣＰｙＶウイルス抗原が、ＭＣＰｙＶ－ＭＣＣ腫瘍を含む他のがんにおいて表現型模写され得る制御機構の異常を通じて、クラスＩ抗原提示も抑制することを疑った。ＨＬＡ－Ｉの制御因子に対する偏りのないゲノムスケールスクリーニングを通じて、ＭＣＰｙＶ＋ＭＣＣにおけるＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体の一部として作用し、ＭＣＰｙＶ－ＭＣＣにおいて頻繁に増幅されるＭＹＣＬが同定された。ＳＴ抗原は、ＭＹＣＬをＥＰ４００複合体に動員して、ＭＣＣ発がんに必要な広範なエピジェネティック変化を引き起こし、本明細書の結果は、ＭＹＣＬ活性によるＨＬＡ－Ｉの抑制におけるＳＴの新規の機能を特定する。ＨＬＡに対するＭＹＣファミリータンパク質の効果は、他のがんにも同様に一般化し、ＭＹＣ及びＭＹＣＮは、それぞれ、黒色腫及び神経芽細胞腫におけるＨＬＡ－Ｉを抑制することができる。
ＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおけるＰＲＣ１．１の同定は、ＨＬＡ－Ｉを抑制するエピジェネティック制御機構の重要性を明確に確認する。ＰＲＣ１．１は、ＣｐＧ島内でＨ２ＡＫ１１９をモノユビキチン化する非正準ポリコーム複合体であり、抑制性Ｈ３Ｋ２７トリメチル化マークを沈着させるＰＲＣ２の動員を促進する。ＰＲＣ２は、最近、白血病及びリンパ腫細胞株における独立したＣＲＩＳＰＲスクリーニングを通じて、ＨＬＡ－Ｉリプレッサーとして同定され、この研究は、ＰＲＣ１．１との新規接続を確立する。これらのスクリーニングはまた、ＰＣＧＦ１（）を同定し、ＰＲＣ２サブユニットは、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングで、ＰＲＣ２阻害剤ＥＺＨＩＰは、ＯＲＦスクリーニングで同定した。
ＨＬＡ－Ｉ喪失の拮抗は、有効な抗腫瘍細胞毒性Ｔ細胞応答にとって重要であり、臨床的に高い関心を持つ場合、ＨＬＡ－Ｉ上方制御薬は、チェックポイント遮断などの免疫療法に対する応答を増強し得る。本明細書における小分子ＵＳＰ７阻害剤研究は、ＰＲＣ１．１阻害を介したＭＣＣにおけるＨＬＡ－Ｉの薬理学的上方制御のための手段を提供する。ＩＦＮ－γがＨＬＡ－Ｉを上方制御する非特異的な炎症機構とは対照的に、ＵＳＰ７阻害は、ＰＲＣ１．１の破壊を介して、クラスＩ抗原提示における根本的な腫瘍固有のエピジェネティック欠陥を逆転させる。したがって、ＵＳＰ７阻害は、炎症性微小環境を必要とせずに、ベースライン腫瘍ＨＬＡ－Ｉ発現を上昇させる。
ＳＴ－ＭＹＣＬ－ＥＰ４００複合体によるＵＳＰ７及びＰＣＣＧＦ１プロモーターの占有は、ＭＣＰｙＶ ＳＴ抗原がＰＲＣ１．１の発現を増加させるためにＭＹＣＬをともに最適化し、その後、クラスＩ ＡＰＭ遺伝子発現を抑制する可能性のある統一機構を示唆している。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が各々参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書のいずれの定義も含む本出願が支配する。
Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）のワールドワイドウェブｔｉｇｒ．ｏｒｇ及び／又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖによって管理されているものなどの公開データベースのエントリと相関する受入番号を参照する任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列もまた、参照によりそれら全体が組み込まれる。
等価物
当業者であれば、通例の実験のみを使用して、本明細書に記載の本開示によって包含される特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は確定することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図されている。

Claims (85)

  1. がんに罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を修飾する治療有効量の薬剤、並びに免疫療法を投与することを含む、方法。
  2. 前記薬剤が、表１若しくは４に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片の前記コピー数、前記発現レベル、及び／又は前記活性を減少させる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記薬剤が、ＭＹＣＬポリペプチド及び／若しくはポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの前記コピー数、前記発現レベル、及び／又は前記活性を減少させる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチドが、ＵＳＰ７、ＢＣＯＲＬ１、ＰＣＧＦ１、ＫＤＭ２Ｂ、ＳＫＰ１、ＲＩＮＧ１Ａ、ＲＩＮＧ１Ｂ、ＲＹＢＰ、ＹＡＦ２、及び／又はＢＣＯＲである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記薬剤が、低分子阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド若しくはペプチド模倣薬阻害剤、アプタマー、抗体、又はイントラボディである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＲＮＡ干渉剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ｓｇＲＮＡが、表１～４に列挙される核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記薬剤が、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される前記１つ以上のバイオマーカー及び／又は前記１つ以上のバイオマーカーの基質に特異的に結合する、イントラボディ又はその抗原結合断片を含む、請求項５に記載の方法。
  9. 前記イントラボディ又はその抗原結合断片が、マウス、キメラ、ヒト化、複合体、若しくはヒトイントラボディ、又はその抗原結合断片である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記イントラボディ又はその抗原結合断片が、検出可能に標識されており、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／又はＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディ断片からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 前記薬剤が、表２又は３に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片の前記コピー数、前記発現レベル、及び／又は前記活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
  12. 前記薬剤が、免疫療法に対するがん細胞の感受性を増加させる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記免疫療法が、前記薬剤の前、後、又はそれと同時に投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記免疫療法が、抗がんワクチン及び／又はウイルスを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 前記免疫療法が、細胞ベースの免疫療法であり、任意に、前記細胞ベースの免疫療法が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）療法である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記免疫療法が、免疫チェックポイントを阻害する、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＡ２ａＲからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記免疫チェックポイントが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２からなる群から選択され、任意に、前記免疫チェックポイントが、ＰＤ－１である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記１つ以上のバイオマーカーが、表５に列挙される核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、かつ／又は表５に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記対象が、哺乳動物である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、又は家畜化哺乳動物である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記薬剤が、前記免疫療法に対する前記がんの感受性を増加させ、任意に、（ｉ）前記免疫療法が、Ｔ細胞媒介であり、かつ／又は（ｉｉ）前記薬剤が、前記がん細胞を含む腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の量を増加させる、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記薬剤が、前記がん細胞の表面上のＭＨＣ－Ｉのレベルを増加させる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記対象に、少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンを投与することを更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンが、前記薬剤及び／又は前記免疫療法より前、後、又はそれと同時に投与される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記薬剤が、薬学的に許容される製剤で投与される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記がんが、神経内分泌がんである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記神経内分泌がんが、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がんである、請求項２７に記載の方法。
  29. がん細胞における主要組織適合性複合体の発現を増加させる方法であって、前記がん細胞を、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片のコピー数、発現レベル、及び／又は活性を調節する薬剤と接触させることを含み、任意に、前記がん細胞、又は前記がん細胞及び免疫細胞を含む細胞の集団を、免疫療法と接触させることを更に含む、方法。
  30. 前記薬剤が、表１又は４に列挙される１つ以上のバイオマーカーの前記コピー数、前記発現レベル、及び／又は前記活性を減少させる、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記薬剤が、ＭＹＣＬポリペプチド及び／若しくはポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの前記コピー数、前記発現レベル、及び／又は前記活性を減少させる、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記ポリコームリプレッサー複合体１．１（ＰＲＣ１．１）ポリペプチドが、ＵＳＰ７、ＢＣＯＲＬ１、ＰＣＧＦ１、ＫＤＭ２Ｂ、ＳＫＰ１、ＲＩＮＧ１Ａ、ＲＩＮＧ１Ｂ、ＲＹＢＰ、ＹＡＦ２、及び／又はＢＣＯＲである、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記薬剤が、低分子阻害剤、ＣＲＩＳＰＲ一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド若しくはペプチド模倣薬阻害剤、アプタマー、抗体、又はイントラボディである、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＲＮＡ干渉剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記ｓｇＲＮＡが、表１～４に列挙される核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記薬剤が、表１、２、３、４、若しくは５に列挙される前記１つ以上のバイオマーカー及び／又は前記１つ以上のバイオマーカーの基質に特異的に結合する、イントラボディ又はその抗原結合断片を含む、請求項３４に記載の方法。
  37. イントラボディ又はその抗原結合断片が、マウス、キメラ、ヒト化、複合体、又はヒトイントラボディである、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記イントラボディ又はその抗原結合断片が、検出可能に標識されており、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／又はＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディ断片からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記薬剤が、表２又は３に列挙される１つ以上のバイオマーカーの前記コピー数、前記発現レベル、及び／又は前記活性を増加させる、請求項２９に記載の方法。
  40. 前記薬剤が、前記免疫療法に対する前記がん細胞の感受性を増加させる、請求項２９～３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記がん細胞が、前記薬剤の前、後、又はそれと同時に前記免疫療法と接触する、請求項２９～３９のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記免疫療法が、抗がんワクチン及び／又はウイルスを含む、請求項３９又は４０に記載の方法。
  43. 前記免疫療法が、細胞ベースの免疫療法であり、任意に、前記細胞ベースの免疫療法が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）療法である、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記免疫療法が、免疫チェックポイントを阻害する、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＩＤＯ、ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＡ２ａＲからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記免疫チェックポイントが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記免疫チェックポイントが、ＰＤ－１である、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記バイオマーカーが、表５に列挙される核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、かつ／又は表５に列挙されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記１つ以上のバイオマーカーが、ヒト、マウス、キメラ、又は融合バイオマーカーである、請求項２９～４７のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記免疫療法が、（ｉ）Ｔ細胞媒介であり、かつ／又は（ｉｉ）前記薬剤が、前記がん細胞を含む腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の量を増加させる、請求項２９～４８のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記薬剤が、前記がん細胞における前記ＭＨＣクラスＩ表面発現のレベルを増加させる、請求項２９～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記対象に、少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンを投与することを更に含む、請求項２９～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記少なくとも１つの追加のがん療法又はレジメンが、前記薬剤及び／又は前記免疫療法より前、後、又はそれと同時に投与される、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記薬剤が、薬学的に許容される製剤で投与される、請求項２９～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記がん細胞が、神経内分泌がん細胞である、請求項２９～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記神経内分泌がん細胞が、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がん細胞である、請求項５５に記載の方法。
  57. 表１、２、３、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を調節することによって治療することができるがんに罹患しているか、又はそれを発症するリスクのある対象を特定する方法であって、対照と比較した前記対象からの細胞における主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ発現の増加又は減少レベルを検出することと、それによって、表１、２、３、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性を調節することによって治療することができるがんに罹患しているか、又はそれを発症するリスクのある前記対象を特定することと、を含み、任意に、前記対象由来の前記細胞を含む生体試料が、前記対象から得られる、方法。
  58. 前記薬剤が、表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性を減少させる、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記特定された対象に、表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーを阻害する薬剤を推奨すること、処方すること、又は投与することを更に含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
  60. 前記薬剤が、表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性を増加させる、請求項５７に記載の方法。
  61. 前記特定された対象に、免疫療法を推奨すること、処方すること、又は投与することを更に含む、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記免疫療法が、抗がんワクチン、抗がんウイルス、及び／又はチェックポイント阻害剤を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記対象に、標的療法、化学療法、放射線療法、及び／又はホルモン療法からなる群から選択されるがん療法を推奨すること、処方すること、又は投与することを更に含む、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記対照が、前記患者又は前記患者が属する同じ種のメンバーのいずれかに由来する、がん性又は非がん性試料に由来する試料を含む、請求項５７～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記対照が、既知の参照値である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記がんが、神経内分泌がんである、請求項５７～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記神経内分泌がんが、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がんである、請求項６６に記載の方法。
  68. 表１、２、３、４、若しくは５に列挙される１つ以上のバイオマーカー又はその断片を発現するがんに罹患している対象の、免疫療法による治療に対する臨床転帰を予測するための方法であって、
    ａ）対象試料における表１、２、３、４、又は５に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を決定することと、
    ｂ）良好な臨床転帰を有する対照における少なくとも前記１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性を決定することと、
    ｃ）前記対象試料中及び前記対照中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性を比較することと、を含み、
    前記対照中の前記コピー数、量、及び／又は活性を比較した、前記対象試料中の表１、２、３、４、又は５に列挙される前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性の存在又はわずかな変化が、前記対象が不良な臨床転帰を有することを示す、方法。
  69. 表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数及び／若しくは量を減少させ、かつ／又は前記活性を阻害する薬剤と、免疫療法とで、がんを有するか、又はがんを有する疑いのある対象の治療を監視するための方法であって、第１の時間点での前記対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現のレベル、及びその後の時間点での前記対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現の前記レベルの変化又は変化がないことを検出し、それによって、前記対象の前記治療を監視することを含む、方法。
  70. 表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数及び／若しくは量を増加させ、かつ／又は前記活性を阻害する薬剤と、免疫療法とで、がんを有するか、又はがんを有する疑いのある対象の治療を監視するための方法であって、第１の時間点での前記対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現のレベル、及びその後の時間点での前記対象に由来する試料におけるＭＨＣクラスＩ発現の前記レベルの変化又は変化がないことを検出し、それによって、前記対象の前記治療を監視することを含む、方法。
  71. 対象における表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を減少させる薬剤の有効性を評価する方法であって、対象試料において、第１の時間点で、その後の時間点と比較した表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性の変化又は変化がないことを検出することを含み、表１又は４に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び又は活性の減少が、前記薬剤が有効であることを示す、方法。
  72. 対象における表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーのコピー数、量、及び／又は活性を増加させる薬剤の有効性を評価する方法であって、対象試料において、第１の時間点で、その後の時間点と比較した表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び／又は活性の変化又は変化がないことを検出することを含み、表２又は３に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーの前記コピー数、量、及び又は活性の減少が、前記薬剤が有効であることを示す、方法。
  73. 前記第１の時間点と、前記その後の時間点との間で、前記対象が、前記がんの治療を受けた、治療を終了した、かつ／又は寛解中である、請求項７１又は７２に記載の方法。
  74. 治療が、前記対象に前記薬剤を投与することを含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記第１及び／又は前記その後の試料が、エクスビボ又はインビボ試料を含む、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記第１及び／又は少なくとも１つのその後の試料が、前記対象から得られる単一試料又はプールされた試料の一部である、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記試料が、前記対象から得られた細胞、血清、腫瘍周辺組織、及び／又は腫瘍内組織を含む、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記１つ以上のバイオマーカーが、表１、２、３、４、又は５に列挙される、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記がん又はがん細胞が、神経内分泌がんである、請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記神経内分泌がんが、メルケル細胞がん、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、又は神経内分泌がんである、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記がん又はがん細胞が、前記がんの動物モデルにある、請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記動物モデルが、マウスモデルである、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記がんが、哺乳類対象にある、請求項１～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記哺乳類対象が、マウス又はヒトである、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記哺乳動物がヒトである、請求項８４に記載の方法。
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