CN102597269A - 用于鉴定患者是否将是免疫治疗的反应者的方法 - Google Patents

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CN102597269A CN2010800494497A CN201080049449A CN102597269A CN 102597269 A CN102597269 A CN 102597269A CN 2010800494497 A CN2010800494497 A CN 2010800494497A CN 201080049449 A CN201080049449 A CN 201080049449A CN 102597269 A CN102597269 A CN 102597269A
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F·乌罗亚-蒙托亚
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Abstract

提供了基于一个或多个基因的差别表达而将患者表征为治疗的反应者或非反应者的方法。也提供了基因表达谱、包含代表基因表达谱的核酸序列的微阵列和新的诊断试剂盒和治疗方法。所述试剂盒和方法与(例如，癌症患者中的)特定群体的治疗有关，所述群体通过他们的基因表达谱被表征为遭受表达MAGE的肿瘤。

Description

用于鉴定患者是否将是免疫治疗的反应者的方法
在光盘上呈送的材料
申请人特此提及含有下述命名的文件的光盘材料：2009年10月6日创建的“VR63933P_pe.txt”(文件大小23.330MB)；和2009年10月6日创建的“VR63933P_rq.txt”(文件大小15.767MB)，它们提交在2009年10月6日提交的美国临时申请61/278387中，在本文中要求它们的权益。在本段落中提及酮2张光盘(包括副本)。
为了利用在这些光盘上的pe数据，通过在R session中打入下述命令，将VR63933P_pe.txt ASCII文件输入R session中：
pe<-read.table(“VR63933P_pe.txt“)
pe<-unstack(pe)
为了利用在这些光盘上的rq数据，通过在R session中打入下述命令，将VR63933P_rq.txt ASCII文件输入R session中：
rq<-scan(“VR63933P_rq.txt.”)
在本文别处公开了该数据的公开发表。
技术领域
本发明涉及基因表达谱(gene expression profiles)；用于分类患者的方法；微阵列；和通过使用本文所述的方法和微阵列选出的患者群体的治疗。
背景
黑素瘤是源自表皮中的黑素细胞的肿瘤。患有远处转移的恶性黑素瘤(根据美国癌症联合研究会(AJCC)分类为IV期)的患者的平均存活时间是1年，长期存活率仅仅5％。即使用于IV期黑素瘤的标准化疗仅仅具有8-25％的治疗反应率，但对总体存活没有效果。患有区域性黑素瘤(III期)的患者平均存活2-3年，具有非常低的长期存活几率，即使在对原发和区域性黑素瘤进行足够的手术控制后也是如此(Balch等，1992)。大多数I-III期黑素瘤患者手术切除了肿瘤，但这些患者仍然保留复发的切实危险。因此，仍然需要预防黑素瘤进展，并且需要具有改进的转移性黑素瘤治疗方案，以及用于切除了原发黑素瘤的患者的辅助治疗。
存在两类肺癌：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。该名称仅仅描述了肿瘤中存在的细胞的类型。NSCLC包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌并且占肺癌的大约80％。NSCLC难以治愈，并且可获得的治疗倾向于具有尽可能延长生命并且缓解疾病症状的目的。NSCLC是最常见的肺癌类型，并且与不良结局相关(Gatzmeier等，1994)。在所有NSCLC患者中，仅仅约25％在诊断时具有局部-区域性疾病并且仍然可以进行手术切除(根据AJCC分类是IB、IIA或IIB期)。但是，这些患者中50％以上将在完全手术切除后两年内复发。因此，需要对这些患者提供更好的治疗。
常规化疗是基于给患者施用毒性物质，并且部分依赖于肿瘤/癌细胞对毒性剂的积极摄取。这些毒性物质不利地影响患者的免疫系统，使得个体身体虚弱并且易患感染。
已知并不是所有患者都对当前的癌症治疗有反应。认为仅仅30％或更少的癌症患者对给定治疗有反应。不响应于治疗的癌症被描述为抗性的。在很多情况下，没有可靠的方法用于确定患者是否对治疗有反应。但是，给作为反应者和非反应者的患者都施用治疗(因为他们不能被区分)是对资源的低效利用，并且甚至更差的是，可能对患者是有损害的，因为如已经讨论过的，很多癌症治疗具有显著副作用，如严重的免疫抑制、呕吐和/或脱发。认为许多情况下，患者在不必要或不是有效的情况下接受了治疗。
目前很多研究组正在研究基于抗原、肽、DNA等的新一代癌症治疗。许多所述治疗后的策略(通常称作癌症免疫治疗)是刺激患者的免疫系统对抗癌。这些治疗可能是有利的，因为预期使用这些治疗的副作用与目前进行癌症治疗的患者经受的副作用相比是最小的。用于癌症免疫治疗的抗原可以称作ASCI，它是抗原特异性的免疫治疗。
在二十世纪八十年代早期，Van Pel和Boon公开了针对呈递在肿瘤细胞上的抗原的溶胞性T细胞的发现。这导致表征了第一个肿瘤特异性的共有抗原：黑素瘤AGE-1(MAGE-1，随后重新指定为MAGE-A1)。随后鉴定了许多共有相同表达模式的基因：它们在广泛肿瘤类型(如黑素瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌)中表达。它们不在正常细胞(除睾丸外)中表达。但是，睾丸中的该表达通常不导致抗原表达，因为这些生殖系细胞不表达MHC I类分子。从它们的特定表达谱，给这些基因提出了癌睾丸(CT)基因的名称。
MAGE抗原是由黑素瘤相关抗原基因(MAGE)家族编码的抗原。MAGE基因主要在黑素瘤细胞(包括恶性黑素瘤)上表达，并且一些其它癌症，包括NSCLC(非小细胞肺癌)、头颈鳞状细胞癌、膀胱移行细胞癌和食道癌，但不能在除睾丸和胎盘的正常组织上检测到(Gaugler等，Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on amelanoma by autologous cytolytic T lymphocytes J Exp Med.1994 Mar1；179(3)：921-930)；Weynants等，Expression of mage genes bynon-small-cell lung carcinomas Int.J Cancer.1994 Mar 15；56(6)：826-829，Patard等，Int J.Cancer 64：60，1995)。MAGE-A3在60％的黑素瘤中表达(Gaugler，1994)，并且也可以在44％的NSCLC(Yoshimatsu1988)，48％的头颈鳞状细胞癌，34％的膀胱移行细胞癌，57％的食道癌，32％的结肠癌和24％的乳腺癌中检测到(Van Pel，等，Genes codingfor tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes ImmunologicalReviews 145，229-250，1995，1995.)；Inoue 1995；Fujie 1997；Nishimura1997)。表达MAGE蛋白的癌症也称作Mage相关肿瘤。
最近进行了大量工作，用于辅助癌症患者的诊断和预后，例如，鉴定不需要进一步治疗的患者，因为他们没有疾病转移、复发或进展的危险。
WO 2006/124836鉴定了一些致癌途径上的某些基因表达标记，从而定义患者的预后和对靶定这些途径的治疗剂的敏感性。特定的癌基因是Myc、Ras、E2、S3、Src和β-连环蛋白。
US 2006/0265138公开了建立基因谱的方法，一般地用于鉴定原发肿瘤，从而可以施用合适的治疗。
US 2006/0240441和US 2006/0252057描述了基于某些基因的差别表达诊断肺癌的方法。
US 2006/0234259涉及鉴定和使用与前列腺癌相关的某些基因表达谱。
WO 2006/103442描述了在一个雌激素受体(ER)阳性肿瘤子集中表达的基因谱，其作为对某些激素治疗如他莫昔芬以及某些化疗的反应的预测性标记。
WO 2006/093507描述了用于将结直肠癌症患者表征为具有良好预后或不良预后的基因谱，其中具有良好预后的患者适于化疗。
WO 2006/092610描述了基于某些基因的差别表达和疾病的新标志物，(特别是TSBY1、CYBA和MT2A)而监测黑素瘤进展的方法。
WO 2005/049829描述了一组分离的标记基因，其可以用于预测某些癌症对化疗剂的敏感性，所述化疗剂是erbB受体激酶抑制剂，如吉非替尼(gefitinib)。
已经证实，微阵列基因绘谱(gene profiling)是用于预测癌症患者是否会对治疗做出反应或用于评估疾病的预后(不论任何治疗性干预)的有力技术。许多大规模临床试验目前正在进行中，以验证被认为与乳腺癌和滤泡淋巴瘤的不同预后有关的谱(Dave，2004；Hu，2006；Weigelt，2005)。
细胞(包括肿瘤细胞)表达数百种甚至数千个基因。对治疗做出反应的患者相对于不做出反应的患者的基因差别表达，可能实现针对可能做出反应的患者的治疗的特异性定制(specific tailoring)。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种将患者分类为适当免疫治疗的反应者或非反应者的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)测定患者来源的样品中一个或多个基因的表达水平，其中所述基因选自表1；
(b)基于(a)的表达水平，使用算法(其参数由训练集定义)，将所述患者分类为反应者或非反应者组。
在一个方面，本发明提供了一种将患者表征为治疗的反应者或非反应者的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)分析患者来源的样品中表1的一个或多个基因的基因产物的差别表达，和
(b)基于步骤(a)的结果，将样品的来源患者表征为反应者或非反应者，其中通过参照或对比标准或训练集，或使用算法(其参数从标准或训练集得到)，进行所述表征步骤。
在一个实施方案中，提供了一种治疗患者的方法，其中得到患者来源的样品中表1的一个或多个基因的基因产物的差别表达的分析结果。所述结果将患者表征为免疫治疗的反应者或非反应者，且通过参照或对比标准或训练集，或使用算法(其参数从标准或训练集得到)，进行所述表征步骤。如果所述患者被表征为免疫治疗的反应者，则选择所述患者进行适当免疫治疗的至少一种施用。
在一个实施方案中，提供了一种测定患者是否是免疫治疗的反应者或非反应者的方法，其中得到患者来源的样品，并分析患者来源的样品中表1的一个或多个基因的基因产物的差别表达。所述结果确定所述患者是否被表征为免疫治疗的反应者或非反应者，且通过参照或对比标准或训练集，或使用算法(其参数从标准或训练集得到)，进行所述表征步骤。
在一个实施方案中，步骤(b)是基于数学判别函数或决策树。所述决策树可能包含至少一个二变量分类步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种将患者表征为治疗的反应者或非反应者的方法，所述方法包括：分析患者来源的样品中被表1中列出的一个或多个探针集合(它们的靶序列显示在表3中)识别的基因产物，其中通过参照或对比标准或训练集，或使用算法(其参数从标准或训练集得到)，进行所述表征步骤。
在一个示例性的实施方案中，表1的一个或多个基因或探针集合是在表1中列出的至少63个基因或在表1中列出的至少74个探针集合。
在一个示例性的实施方案中，本发明的方法包括：测定所述基因的表达水平，或测量在表2、5、7或9中指出的探针集合的基因产物。在这些表中的每个基因和探针集合以及基因或探针集合的组，形成本发明的具体方面。在表2、5、7和9中的基因和探针集合代表在表1中的基因和探针集合的具体子集。
也提供了一种预示性基因谱，其可以用于区分MAGE-A3ASCI或任何免疫治疗方案的反应者患者和非反应者患者，其中所述谱包含一个或多个选自下述的基因：在表1中列出的基因。
在一个实施方案中，提供了本文所述的基因谱，其中所述基因是在表1中列出的探针集合所识别的基因。
在另一个方面，谱包含在表1中列出的所有基因或由其组成，或者包含在表1中列出的探针集合所识别或靶向的所有基因或由其组成。
在一个方面，本发明提供了一种包含多核苷酸探针的微阵列，所述多核苷酸探针与至少一个基因的基因产物的序列互补且可杂交，所述基因选自在表1中列出的基因，其中与表1的基因互补且可杂交的多核苷酸探针或探针集合构成在所述微阵列上的至少50％的探针或探针集合。
在一个方面，本发明提供了一种包含多核苷酸探针的微阵列，所述多核苷酸探针与至少一个基因的基因产物的序列互补且可杂交，所述基因选自在表1中列出的基因。
在一个方面，本发明提供了一种固体表面，与其连接了在表1中列出的至少63个基因的多种检测剂，所述检测剂能够检测所述基因的表达或由所述基因编码的多肽。
在一个方面，本发明提供了一种诊断试剂盒，其包含用于检测在表1中列出的一个或多个基因或在表1中列出的基因的基因产物的表达的装置。借助于与mRNA或cDNA基因产物杂交的探针，可以检测所述表达。
在一个方面，本发明提供了一种或多种探针，所述探针用于鉴定下述物质的基因产物(例如mRNA或cDNA)：表1的一个或多个基因，或在表1中列出的基因的基因产物。
在一个方面，本发明提供了PCR(或其它已知的技术)用于鉴定表1的一种或多种基因产物或本文所述的基因谱的基因产物的差别表达(诸如增量调节)的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的方法，所述患者被表征为治疗的反应者，所述方法包括：给所述患者施用本文所述的治疗、疫苗或免疫原性的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的方法，根据本文所述的方法或使用本文所述的诊断试剂盒，所述患者被表征为治疗的非反应者，所述方法包括：施用替代治疗或治疗组合，例如可以使用化疗和/或放疗，以替代或添加给本文所述的疫苗或免疫原性的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含肿瘤相关抗原的组合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗根据本文所述的方法被表征为反应者的患者，本文所述的微阵列的用途，本文所述的基因谱的用途，或本文所述的诊断试剂盒的用途。
附图说明
图1/21显示了留出一个交叉验证(Leave One Out CrossValidation，LOOCV)的方案。
图2/21显示了LOOCV的结果，所述LOOCV选择最好的100个PS用于每个循环的分类。空心圆圈＝非反应者，AS02B组。实心圆圈＝反应者，AS02B组。空心三角形＝非反应者，AS15组。实心三角形＝反应者，AS15组。
图3/21显示了探针集合(PS)在每个LOOCV(PS编号在X轴上)中的100个最高s2n(信噪比)内的次数。
图4/21显示了所有患者在II期黑素瘤试验中通过佐剂得到的总存活数的卡普兰-迈耶曲线(KM)。实线＝AS15组。虚线＝AS02B组。
图5/21显示了通过基于LOOCV分类的基因标记得到的总存活数的KM。实线＝基因标记阳性的(GS+)；虚线＝基因标记阴性的(GS-)。
图6/21显示了通过佐剂和通过基于LOOCV分类的基因标记得到的总存活数卡普兰-迈耶曲线。粗实线＝AS15组，GS+。粗虚线＝AS15组，GS-。细实线＝AS02B组，GS+。细虚线＝AS02B组，GS-。
图7/21显示了使用100个PS对样品的分类(不留出一个)。空心圆圈＝非反应者，AS02B组。实心圆圈＝反应者，AS02B组。空心三角形＝非反应者，AS15组。实心三角形＝反应者，AS15组。
图8/21显示了对应样品的留出一个分类，其中使用通过在表5中指出的PCR测得的22个基因。空心圆圈＝非反应者，AS02B组。实心圆圈＝反应者，AS02B组。空心三角形＝非反应者，AS15组。实心三角形＝反应者，AS15组。
图9/21显示了使用在表5中指出的22个基因对样品的分类(不留出一个)。空心圆圈＝非反应者，AS02B组。实心圆圈＝反应者，AS02B组。空心三角形＝非反应者，AS15组。实心三角形＝反应者，AS15组。
图10/21显示了NSCLC II期试验设计。
图11/21显示了NSCLC试验的无疾病期间的KM曲线。具有圆形的实线＝MAGE-A3；具有正方形的虚线＝安慰剂。
图12/21显示了在本申请的实施例中使用的Cox-SPCA方法学。
图13/21显示了基于LOOCV分类的基因谱的存活曲线，其中使用中位值作为截止，使用通过PCR测得的在表6中列出的23个基因。粗实线＝MAGE免疫治疗，GS+。粗虚线＝MAGE免疫治疗，GS-。细实线＝安慰剂，GS+。细虚线＝安慰剂，GS-。
图14/21显示了在129个NSCLC样品的安慰剂组(左侧图)和疫苗组(右侧图)中的风险评分分布，其中使用通过PCR测得的在表6中列出的23个基因，使用LOOCV分类。实心菱形＝复发；空心菱形＝不复发。
图15/21显示了基于分类的临床结果，其中在分类器中使用通过Q-PCR得到的在表6中列出的23个基因(不留出一个)。粗实线＝MAGE免疫治疗，GS+。粗虚线＝MAGE免疫治疗，GS-。细实线＝安慰剂，GS+。细虚线＝安慰剂，GS-。
图16/21显示了在安慰剂组(左侧图)和疫苗组(右侧图)中的风险评分，这基于在分类器中使用通过Q-PCR得到的在表6中列出的23个基因的分类(不留出一个)。实心菱形＝复发；空心菱形＝不复发。
图17/21显示了129个NSCLC样品基于LOOCV分类的基因谱的存活曲线，其中使用中位值作为截止，使用在表5中列出的22个基因。粗实线＝MAGE免疫治疗，GS+。粗虚线＝MAGE免疫治疗，GS-。细实线＝安慰剂，GS+。细虚线＝安慰剂，GS-。
图18/21显示了在129个NSCLC样品的安慰剂组(左侧图)和疫苗组(右侧图)中的风险评分分布，其中使用通过LOOCV分类测得的在表5中列出的22个基因。实心菱形＝复发；空心菱形＝不复发。
图19/21显示了基于分类的临床结果，其中在分类器中使用通过Q-PCR得到的在表5中列出的22个基因(不留出一个)。粗实线＝MAGE免疫治疗，GS+。粗虚线＝MAGE免疫治疗，GS-。细实线＝安慰剂，GS+。细虚线＝安慰剂，GS-。
图20/21显示了基于分类的风险评分，其中在分类器中使用通过Q-PCR得到的在表5中列出的22个基因(不留出一个)。实心菱形＝复发；空心菱形＝不复发。
图21/21显示了蛋白D 1/3-MAGE3-HIS蛋白。
序列标识符和表：
在序列表中包括下面的序列标识符：
SEQ ID NO：1-100-表3所示的探针集合靶序列
SEQ ID NO：101-蛋白D-MAGE-A3融合蛋白
SEQ ID NO：102-106-CpG寡核苷酸序列
SEQ ID NO：107-113-MAGE肽序列
表1：100个PS和对应的基因列表。
表1A：使用所有样品选出的100个PS，和在LOOCV中选出的次数
表2：来自表1的27个PS和21个基因的子集。
表3：100个PS靶序列。
表4：100个PS分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数。
表5：黑素瘤中的22个基因的合适子集。
表6：黑素瘤中的22个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数。
表7：NSCLC中的23个基因的合适子集。
表8：NSCLC中的23个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数。
表9：NSCLC中的22个基因的合适子集。
表10：NSCLC中的22个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数。
表11：通过Q-PCR在黑素瘤样品中测得的单个基因的分类表现。
表12：通过Q-PCR在NSCLC样品中测得的单个基因的分类表现。
表13：通过微阵列在黑素瘤样品中测得的单个基因的分类表现。
具体实施方式
预示性基因谱
在具有恶性黑素瘤的、进行了外科手术切除的患者的治疗前肿瘤组织上的分析，鉴定出在更可能对治疗有反应的患者(反应者)中与在更少可能有反应的那些患者(非反应者)中差别地表达的某些基因。
发明人已经发现了预示患者对治疗的反应的可能性的基因谱。
“基因谱”是指这样的基因或基因集合：其表达与患者对治疗的反应相关联，因为所述基因或基因集合在具有对治疗的有利反应的患者中和具有对治疗的不利反应的患者中表现出差别表达。在本发明的一个实施方案中，术语“基因谱”表示在表1中列出的基因或在本文中描述的表1的基因的任何选择。
本文使用的对例如抗癌治疗的“有利反应”(或“有利的临床反应”)是指，本领域技术人员认识到的生物反应或身体反应，所述反应指示与用替代治疗或不存在任何治疗的条件下发生的肿瘤生长相比，肿瘤生长速度降低。对治疗的有利临床反应可以包括：受试者经历的症状减轻、预期或实现的存活时间增加、肿瘤生长速度降低、肿瘤生长停止(稳定的疾病)、转移性病灶的数目或团块的消减和/或总体肿瘤团块的消减(每一项都是与不存在治疗或响应于替代治疗时发生的情况相比较)。在辅助癌症治疗的情况下，有利的临床反应可以包括没有复发、或复发率延迟、或无病存活时间或间隔时间增加。
在本发明的上下文中，“差别表达”是指，与它的正常表达相比，基因被增量调节或减量调节。本文别处讨论了用于计算基因的差别表达的统计方法。
在某些方面，本发明提供了用于将患者表征为治疗的反应者或非反应者的基因谱，其中所述谱包含表1的至少一个基因的差别表达，或其中所述谱包含在表1中列出的基因或由其组成。谱可以指示反应者或非反应者。在一个实施方案中，本文所述的基因谱指示反应者。
在表3中，列出了被表1的探针集合识别或靶向的基因序列。
“表1的基因”是指，在表1、2、5、7或9的“基因名称”下列出的基因。“基因产物”是指，基因的转录或翻译的任何产物，无论是通过天然的还是人工的方式生成。
在本发明的一个实施方案中，在本文中提及的基因是在表1、2、5、7或9中列出的那些，如在指示“基因名称”的列中所定义。在另一个实施方案中，在本文中提及的基因是这样的基因：所述基因的产物能够被在表1中列出的探针集合识别。
虽然不希望受到理论的限制，推定在表1中鉴定的基因标记实际上指示指定为反应者的患者中的免疫/炎症，如T细胞浸润/激活反应，例如，该标记可能代表T细胞激活标志物。所述标记也可能代表Th1标志物，包括干扰素途径的成员，所述成员倾向于偏爱细胞介导的免疫应答的诱导。认为该反应的存在会在施用免疫治疗以后辅助患者的身体抵抗疾病，如癌症，使得患者对所述免疫治疗更有反应。
因此，本发明的标记通常不集中在与相关疾病(例如癌症)的诊断和/或预后特异性相关的标志物/基因，如癌基因，而是预示患者是否将对合适的免疫治疗(如癌症免疫治疗)有反应。
认为本文鉴定的基因谱会指示肿瘤的微环境。至少在该方面，肿瘤的正确微环境看起来对于患者是否对合适的癌症免疫治疗有反应是关键的。
所述标记的生物学与ASCI作用模式有关，因为它含有这样的基因：所述基因提示特定肿瘤微环境(趋化因子)的存在，所述微环境有利于免疫效应细胞在反应者患者的肿瘤中的存在，所述患者表现出T-细胞标志物和Th1标志物(包括干扰素途径的成员)的增量调节。最近在转移性黑素瘤中的基因表达绘谱研究揭示，基于T-细胞相关转录物的存在与否，可以分开肿瘤(Harlin，2009)。淋巴细胞在肿瘤中的存在，与6种趋化因子子集(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10)的表达相关联，这6个基因中的3个(CCL5、CXCL9、CXCL10)存在于表1的100个PS中。
在一个实施方案中，本发明采用在表1中列出的一个或多个(诸如基本上所有的)基因。适当地，本发明采用在表1中列出的至少63个基因或74个探针集合。
适当地，表1的一个或多个基因是在表1中列出的至少63个、至少64个、至少65个、至少66个、至少67个、至少68个、至少69个、至少70个、至少71个、至少72个、至少73个、至少74个、至少75个、至少76个、至少77个、至少78个、至少79个、至少80个或基本上所有的基因和/或它们的任意组合。
适当地，表1的一个或多个探针集合是在表1中列出的至少74个、至少75个、至少76个、至少77个、至少78个、至少79个、至少80个、至少81个、至少82个、至少83个、至少84个、至少85个、至少86个、至少87个、至少88个、至少89个、至少90个或基本上所有的探针集合和/或它们的任意组合。
在基因列表的背景下，“基本上所有的”是给出的列表的基因的至少90％、诸如95％、特别是96％、97％、98％或99％。
在一个方面，本发明用于转移场合。
如果基因在认为是反应者(或非反应者)的患者中总是上调或总是下调，则一旦建立阈值并且如果两组的分离程度足够，该单个基因可以用于确定患者是反应者还是非反应者。
在一个方面，本发明提供了用于鉴定反应者的基因谱，其包含一个或多个所述基因，其中50、60、70、75、80、85、90、95、99或100％的基因被上调。与此相比，在非反应者中，所述一个或多个基因没有被上调或下调。
在本发明的上下文中，样品可以是源自可能需要治疗的患者的任何生物组织或液体的样品。样品可以源自痰、血液、尿或来自实体组织，如来自原发肿瘤或转移肿瘤的活检物，或来自以前切除的组织的切片。
样品可以包含例如针活检中心、手术切除样品或淋巴结组织，或由它们组成。这些方法包括获得活检物，所述活检物任选通过低温恒温器切片进行分级分离，从而使肿瘤细胞富集到总细胞群的大约80％。在某些实施方案中，可以用本领域公知的技术扩增从这些样品提取的核酸。可以检测选择的标志物的水平，并且可以与统计学有效组(例如，Mage阳性的非反应者患者组)比较。
对于与癌症有关的分析，将采集生物样品，使得所述样品含有癌细胞或肿瘤细胞的机会最大化，并且可以例如源自癌症或肿瘤，如新鲜样品(包括冷冻样品)或在石蜡中保存的样品。如此，保存在石蜡中的样品可能会降解，观察到的谱可能会改变。本领域技术人员完全能够通过再校准谱的参数而补偿这些改变。
在一个方面，所述生物样品是活组织检查样品，例如来自肿瘤或癌性组织。
在一个方面，所述癌症免疫治疗是用于治疗：黑素瘤、肺癌例如NSCLC、膀胱癌、颈癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌和/或前列腺癌，诸如肺癌和/或黑素瘤，尤其是黑素瘤。
在本发明的上下文中，“反应者”包括其中癌症/肿瘤被根除、减少或改善(完全反应者或部分反应者；混合反应者)或仅仅被稳定化使得疾病不再进展(“稳定的疾病”)的人。关于癌症的“完全临床反应者”是，其中所有靶病灶消失。
关于癌症的“部分临床反应者”或“部分反应者”是，其中所有肿瘤/癌症在某种程度上对治疗有反应，例如其中所述癌症减少了30、40、50、60％或更多。
“渐进性疾病”是指，靶病灶的大小增加了20％，或出现了一个或多个新病灶，或这二者兼有。
可以将具有渐进性疾病(PD)的患者进一步分类为具有非混合反应的PD或渐进性疾病，关于癌症的I或II型“混合的临床反应者”或“混合反应者”被定义为，其中有些肿瘤/癌症对治疗有反应，其它肿瘤/癌症保持不变或进展。
非反应者(NR)被定义为，没有混合反应的渐进性疾病的患者和具有II型混合反应的渐进性疾病的患者，其没有表现出至少一种靶病灶的消失。
在癌症稳定化的反应者中，在稳定阶段中与不接受治疗的患者相比，患者的生活质量和/或预期寿命增加(例如，稳定疾病超过6个月)。
在有些实施方案中，术语“反应者”可能不包括“混合反应者”。
通过参照“标准”或训练集，或通过使用从训练集得到其参数的数学模型/算法(分类器)，可以将新患者预测表征为反应者(基因标记阳性的)或非反应者(基因标记阴性的)。标准可以是已知是反应者或非反应者的人/患者的谱，或者替代地可以是数值。这样的预定的标准可以用任何合适的形式提供，如打印的列表或图、计算机软件程序或其它介质。
所述标准适当地是具有已知反应者或非反应者状态的一位或多位患者中的一种或多种基因产物的表达的值或函数，所以标准信息与关于患者来源的样品中相同基因的表达的信息的对比，允许得出关于患者中的反应者或非反应者状态的结论。使用表1的一个或多个基因，和通过分析已知为反应者或非反应者的一个或多个个体，可以得到标准。
从训练集得到的训练数据或参数的非限制性实例是如下面在实施例1中讨论的用于样品标准化的参照数据集、参照分位数、探针效应或R对象格式数据。这些具体实例在将患者分类为反应者或非反应者中的用途，形成本发明的一个具体方面。
在一个方面，通过参照标准或训练集，进行统计分析。通过在对比中使用训练集中的患者的临床结果(反应者和非反应者)作为组，计算每个探针集合的信噪比，从而产生在表1中的基因列表。然后将源自训练集的分类器参数用于预测新样品的分类。
在本说明书上下文中的训练集意欲表示一组样品，其临床结果可以与基因谱关联，并且可以用于针对新样品训练合适的统计学模型/程序，
虽然不希望受到理论的限制，认为表1的100个基因中的至少68个可耐受训练集中的变化。这些基因形成本发明的一个具体方面。这些基因可以从表1A的第5列中鉴定出。
在一个方面，采用数学模型/算法/统计方法来将患者表征为反应者或非反应者。
所述表征算法使用来自任一个基因和任一个已知反应者或非反应者的基因表达信息，且适当地基于有监督的主成分分析，尽管可以使用任意合适的表征算法，例如实施例1-7的任意算法。
具体地，所述算法可以产生来自具有已知临床结果的个体或训练集的标准，其中使用如实施例1所示的具有判别分析算法的有监督的主成分分析或如实施例3所示的具有cox决策规则的有监督的主成分分析。
因此，在一个方面，本发明也涉及用于将新患者表征为反应者或非反应者的分类器的开发，所述分类器的参数从具有已知临床结果(反应者和非反应者)的训练集得到。使用信噪比、Baldi分析(经典T检验的一种变体)和/或皮尔逊相关系数和/或线性判别分析，可以产生基因列表。参见例如：Golub T，Slonim D，Tamayo P等Molecularclassification of cancer：class discovery and class prediction by geneexpression monitoring.Science 1999；286：531-536.Van′t Veer LJ，DaiH，van de Vijver MJ，He YD，Hart AA，Mao M，Peterse HL，van der KooyK，Marton MJ，Witteveen AT，et al.(2002)Gene expression profilingpredicts clinical outcome of breast cancer.Nature，415(6871)，530-556。
所述分类器可能使用有监督的主成分、判别分析、最接近形心、NN、支持向量机器或适合分类的其它算法；包括使用时间(例如存活时间、无病期间时间)进行分类的算法。或者，使用本领域众所周知的其它数学方法，可以实现分类。
所述分类器可以包含：在实施例1和/或2中例证的具有DA的SPCA决策规则或在实施例3和/或4中例证的SPCA-Cox决策规则。在有些实施方案中，公开的方法正确地预测反应者和非反应者的准确度大于50％、60％或70％，诸如约70％准确度。
在一个实施方案中，通过参照治疗失败时间(TTF)/总存活数(OS)(它是一个连续变量，且可以例如在数月内测量)，定义反应者和非反应者。在治疗失败时间变量较大的情况下，则认为该患者是反应者。在治疗失败时间变量较小的情况下，则认为该患者是非反应者。通常，使用该方案，将混合反应者也归入反应者中。
治疗失败是这样的情况：所述患者没有归入本文定义的反应者、部分反应者、混合反应者或稳定的疾病的定义中。
在一个方面，可以将非反应者定义为具有6个月或更少的TTF的那些。
在一个方面，可以将反应者定义为具有超过6个月(例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多月)的TTF的那些。
在本发明的一个方面，患者对治疗的反应是无病期间(DFI)或无病存活(DFS)，它们是连续变量，且可以例如在数月内测量。DFI和DFS被用于例如辅助治疗中；所述辅助治疗是这样的情况：肿瘤已经被切除，提供所述治疗来避免或延迟复发，或等效地延长无病期间或存活。
DFI和DFS可以与患者临床信息或测量的患者参数(诸如生物标志物或基因表达谱)相关联，且可以用于构建数学模型，以预测新患者的反应。
在一个方面，本发明的方法包括：测定所述基因的表达水平，或测量在表1中列出的探针集合的基因产物。
在一个方面，本发明包括：在表1中列出的一个或多个(诸如基本上所有的)基因或探针集合用于预测或鉴定患者为针对肺癌和黑素瘤的免疫治疗的反应者或非反应者的用途，适当地，所述免疫治疗基于癌睾丸抗原诸如Mage。适当地，本发明采用在表1中列出的至少63个基因或至少74个探针集合。
表1
Figure BPA00001546662600161
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*：来自R2.6的注解，其在R2.9中变成NA。
在一个方面，本发明的方法包括：测定所述基因的表达水平，或测量在表2中列出的探针集合的基因产物。
表2
Figure BPA00001546662600201
*：来自R2.6的注解，其在R2.9中变成NA。
在下面提供了在表1中列出的探针集合的靶序列。
表3
Figure BPA00001546662600211
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在一个方面，本发明提供了如下产生的基因谱：进行预处理步骤，以产生标准化的基因或探针集合强度矩阵，并对该矩阵进行信噪比统计分析，以鉴定差别表达的基因或探针集合，然后以最大差别表达的基因的次序，将基因或探针集合排序。
在一个实施方案中，通过对每个患者的相关基因表达的测量值或源自基因强度向量的“指数”作图，可以建立阈值。通常，反应者和非反应者将在不同的轴/焦点附近簇集。可以通过经典统计学方法在簇之间的缺口中建立阈值，或简单地作出“最佳拟合线”，以确定两组之间的中间点。例如高于预定阈值的值可以指定为反应者，例如低于预定阈值的值可以指定为非反应者。
在一个实施方案中，可以分析任何给定的分类器的性能。如下进行详尽的性能分析：改变阈值的水平，并对于每个阈值的值，计算该模型的预测能力(灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值、准确度)。该分析可以辅助为给定的分类器选择适当的阈值。
另外，对于给定的阈值的值，可以进行分类器的性能分析，以评价该模型的灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值以及准确度。
在本发明的一个或多个方面所提供的谱的合适实施方案中，排除了与性别密切相关的基因的影响。
在一个实施方案中，提供了根据它们的基因谱来分类肿瘤样品的方法，所述基因谱通过Q-PCR来评估，在所述评估中使用在黑素瘤中发现的判别性基因的子集(实施例1)。
在一个实施方案中，提供了根据它们的基因谱来分类NSCLC癌症肿瘤样品的方法，所述基因谱通过Q-PCR来评估，在所述评估中使用在黑素瘤中发现的判别性基因的全部或子集。
分类器可能包括有监督的主成分分析和Cox比例危害模型的用途；除了基因表达谱以外，在该方案中，可能使用总存活数(OS)、训练集中的样品的DFI或DFS以及肿瘤阶段和外科手术状态，以计算模型参数，并随后基于试验集基因表达，计算试验集的风险指数。
一旦已经鉴定出基因谱并已经对样品进行分析，则存在许多呈现结果的方法，例如呈现为热图，所述热图用一种颜色显示反应者，用另一种颜色显示非反应者。尽管如此，可以将更定性的信息表达为指数，所述指数将结果显示为具有阈值的范围(spectrum)，例如在阈值以上的患者被视作反应者，在阈值以下的患者被视作非反应者。将信息呈现为范围的优点是，它允许医师判定是否为被视作非反应者、但是位于阈值附近的那些患者提供治疗。
在本发明的上下文中的“免疫治疗”是指基于刺激免疫应答(通常是对抗原的免疫应答)的治疗，其中所述应答导致与其相关的疾病的治疗、改善和/或进展延迟。在该背景下的治疗通常不包括预防性治疗。
在本说明书上下文中的“癌症免疫治疗”表示用于治疗癌症的免疫治疗。在一个方面，免疫治疗是基于癌睾丸抗原，如Mage(下文更详细讨论)。
有利地，本发明的新颖的方法允许鉴定出可能对适当免疫疗法治疗有反应的患者。这会促进从资源中适当挑选出将从所述治疗受益的患者，更甚者，允许不会从所述治疗受益的患者使用可能对他们更有益的替代治疗。
本发明可以用于鉴定可能对合适的免疫治疗有反应的癌症患者，例如患有黑素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、NSCLC、头颈癌、鳞状细胞癌、结肠癌和食道癌的患者，如用于患有表达MAGE的癌的患者中。在一个实施方案中，本发明可以用于所述癌(特别是肺癌和黑素瘤)的辅助(手术后，例如无病期间)情况。本发明也可以用于治疗转移情况下的癌症治疗。
免疫激活基因意图指促进、增加或刺激适当免疫反应的仅以。免疫反应基因和免疫激活基因在本文可互换使用。
微阵列
用于分析细胞(如癌症/肿瘤细胞)表达的基因的一种重要技术是DNA微阵列(也称作基因芯片技术)，其中将数百个或更多个探针序列(如55,000个探针集合)附着于玻璃表面。探针序列通常都是25聚体或60聚体，并且是来自已知基因的序列。这些探针通常排列为任意特定基因的11个单个探针的集合(探针集合)，并且在玻璃表面固定为预定模式。一旦暴露于合适的生物样品，这些探针与特定基因的相关RNA或DNA杂交。洗涤后，通过合适的方法“读”芯片，并且记录数量，如颜色强度。特定基因的差别表达与记录的测量值/强度成比例。该技术在下文更详细讨论。
微阵列是具有离散区域的阵列，典型是核酸，它们彼此分开，并且典型地以大约100/cm2-1000/cm2的密度排列，但也可以更大的密度排列，如10000/cm2。微阵列实验的原理是，用来自给定细胞系或组织的mRNA产生标记的样品，典型是标记的cDNA，称作“靶物”，其平行杂交于固定在有序阵列中的固体表面上的大量核酸序列，典型是DNA序列。
可以同时检测和定量数万个转录物。尽管已经开发了很多不同的微阵列系统，目前最常用的系统可以根据排列的材料分成两类：互补DNA(cDNA)和寡核苷酸微阵列。排列的材料通常称作探针，这是因为它等同于用于RNA印迹分析中的探针。用于cDNA阵列的探针通常是用载体特异性或基因特异性引物从cDNA文库或克隆集合产生的聚合酶链式反应(PCR)产物，并且作为斑点印刷在载玻片或尼龙膜上的确定位置。斑点的大小通常是10-300μm，并且间隔大致相同的距离。采用该技术，可以将超过30,000个cDNA组成的阵列固定在常规显微镜载玻片的表面。对于寡核苷酸阵列，通过照相平版印刷到硅片上(来自Affymetrix的高密度寡核苷酸阵列)或通过喷墨技术(由Rosetta Inpharmatics开发，许可于Agilent Technologies)原位合成短的20-25聚体。或者，可以将预先合成的寡核苷酸印刷到载玻片上。基于合成寡核苷酸的方法提供了优点，即，由于单独的序列信息就足够产生要排列的DNA，因此不需要耗时的cDNA来源操作。同样，可以设计探针，以代表给定转录物的最独特部分，使得能够检测密切相关的基因或剪接变体。尽管短寡核苷酸可能导致较不特异的杂交并且降低灵敏度，最近已经开发了预先合成的较长寡核苷酸(50-100聚体)的阵列来消除这些缺点。
因此，在进行微阵列以确定患者是否具有本发明的基因标志时，进行了以下步骤：从样品获得mRNA并且制备核酸靶物，在通常由微阵列制造商建议的条件下(合适地是严格杂交条件，如3X SSC，0.1％SDS，50℃)接触阵列，以结合阵列上的相应探针，如果需要，洗涤以除去未结合的核酸靶物，并且分析结果。
可以理解，可以通过本领域已知的方法，如引物特异性cDNA合成，富集mRNA中的感兴趣的序列，如表1中的那些。例如通过采用PCR技术，可以进一步扩增该群体。对靶物或探针进行标记，以允许检测靶物分子与微阵列的杂交。合适的标记包括可以掺入探针中的同位素或荧光标记。
一旦已经鉴定出靶基因/谱，存在微阵列的几种替代分析方法，它们可以用于测量所述基因是否差别表达。
在一个方面，本发明提供了一种包含多核苷酸探针的微阵列，所述多核苷酸探针与至少一个选自下述的基因的基因产物的序列互补且可杂交：在表1中列出的基因。适当地，与表1的基因互补且可杂交的多核苷酸探针或探针集合构成在所述微阵列上的探针或探针集合的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或基本上全部。
适当地，所述微阵列包含与表2中列出的基因的基因产物的序列互补且可杂交的多核苷酸探针。
适当地，具有根据本发明的检测剂或微阵列的固体表面包含这样的检测剂或探针：其能够检测从表1中的例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7980、81、82或83个基因表达的mRNA或cDNA。
在有些情况下，PCR是比微阵列更灵敏的技术，因此可以检测更低水平的差别表达的基因。
在一个替代实施方案中，利用基于PCR技术、特别是定量PCR(综述参见Ginzinger D Experimental haematology 30(2002)第503-512页和Giuliette等，Methods，25第386页(2001)的试剂盒，可以诊断患者，以确定他/她的肿瘤是否表达本发明的基因标记。
分析技术包括实时聚合酶链式反应，也称作定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR或Q-PCR)，其用于同时对样品中存在的给定DNA分子的特定部分进行定量和扩增。
该程序遵循聚合酶链式反应的通常模式，但在每轮扩增后都对DNA进行定量(“实时”方面)。三种常见的定量方法是使用(1)嵌入双链DNA的荧光染料，(2)修饰的DNA寡核苷酸探针，其当与互补DNA杂交时发出荧光，和(3)Taqman探针，其与在延伸过程中被DNA聚合酶水解的扩增序列互补，其释放出荧光染料。
实时聚合酶链式反应的基本概念是样品中的特定cDNA(由此mRNA)越充足，则其在重复的扩增循环过程中将越早被检测到。存在多种系统，其使得能够进行DNA扩增，并且它们通常涉及使用在实时扩增过程中掺入新合成的DNA分子的荧光染料。随后，控制热循环过程的实时聚合酶链式反应机制可以检测荧光DNA的丰度，并且因此检测给定样品的扩增过程。典型地，给定cDNA随时间的扩增符合一条曲线，具有最初的平台阶段，然后是指数阶段。最后，由于实验试剂用尽，DNA合成减慢，指数曲线变平成为平台。
或者，可以通过RNA印迹分析、蛋白印迹和/或免疫组化测量靶基因的mRNA或蛋白产物。
在一个方面，对患者样品进行用于鉴定谱/标记的分析，所述样品中表达癌睾丸抗原。
当分析单个基因时，例如，通过Q-PCR分析时，则通过参照保持恒定的基因，例如具有符号H3F3A、EIF4G2、HNRNPC、GUSB、PGK1、GAPDH或TFRC的基因(它们可能适用于标准化)，可以对基因表达进行标准化。通过从针对考虑中的基因获得的Ct值减去针对恒定基因获得的值，可以进行该标准化。
用于对基因的差别表达进行定量的一个参数是倍数变化，它是用于比较两个不同的实验条件之间的基因的mRNA表达水平的度量标准。其算术定义在研究者之间不同。但是，倍数变化越高，相关基因的差别表达越可能足够分开，使得更容易确定患者属于哪类(反应者或非反应者)。
倍数变化可以例如是至少2、至少10、至少15、至少20或30。
也用来对差别表达进行定量的另一参数是“p”值。认为p值越低，基因越可能差别表达，这使得它是用于本发明的谱中的良好候选物。P值可以例如包括0.1或更小，如0.05或更小，特别是0.01或更小。本文使用的p值包括校正的“P”值和/或也包括未校正的“P”值。
鉴定可以用于样品分类的基因的另一参数是信噪比，该算法测量对比的2个组之间的表达水平的差异，所述对比用组内标准差的总和进行加权。它因而可以用于在具有低组内分散的组之间排序具有最高表达差异的基因。
本发明也延伸到根据本文所述发明的单独实施方案，其包括本文所述的成分/元件、基本由本文所述的成分/元件组成，或由本文所述的成分/元件组成。
本发明延伸到本文列出的基因的功能等同物，例如由基因的等级分类所表征的那些，所述等级分类如Hongwei Wu等，2007(Hierarchical classification of equivalent genes in prokaryotes-NucliecAcid Research Advance Access)所描述。
尽管不希望受到理论的限制，认为作为标记特征的不一定基因本身，而是基础上重要的基因功能。因此，免疫激活基因(如在表1中列出的那些)的功能等同基因可以用于标记中，参见，例如Journal ofthe National Cancer Institute Vol 98，No.7，2006年4月5日。
基因是通过特异性探针鉴定的，因此，技术人员可以理解，上文的基因描述是基于目前关于什么与探针杂交的理解的描述。但是，不论用于基因的命名法如何，通过在规定的条件下重复与相关探针的杂交，可以鉴定必需的基因。
本发明延伸到根据本发明的谱用于预测或鉴定患者为免疫治疗的反应者或非反应者的用途，所述免疫治疗如癌症免疫治疗，例如，癌睾丸免疫治疗、尤其是Mage免疫治疗、特别是针对黑素瘤。
因此，本发明包括，基于根据本发明的谱/基因的表达来分析患者来源的样品的方法，其目的是，根据本发明将样品的来源患者表征为免疫治疗的反应者或非反应者。
在一个方面，本发明提供了用于测量样品中来自本文鉴定出的基因的多核苷酸的表达水平的方法，其目的是，鉴定样品所来源的患者是否可能是免疫治疗(如根据本发明的癌症免疫治疗)的反应者或非反应者，该方法包括以下步骤：
从样品分离RNA，
任选地从样品扩增所述基因的cDNA拷贝，以及
对样品中的cDNA水平进行定量。
在有些实施方案中，本发明提供了诊断试剂盒，其包含至少一种用于对患者来源的样品进行分析的成分，以鉴定根据本发明的谱，其结果可以用于将样品所来源的患者指定为免疫治疗的反应者或非反应者。
该试剂盒可以包含用于PCR(如QPCR)、微阵列分析、免疫组化或其它分析技术的材料/试剂，所述技术可以用于评估一个或多个基因的差别表达。
本发明也提供了诊断试剂盒，其包含一组探针，所述探针能够与一个或多个(例如至少5个)关于本发明在本文中描述的基因的mRNA或cDNA杂交。例如，这样的诊断试剂盒，其包含一组探针，所述探针能够与表1中的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7980、81、82或83个基因的mRNA或它的cDNA杂交。
在另一个实施方案中，本发明涉及诊断试剂盒。例如，含有这种微阵列的试剂盒，所述微阵列包含微阵列基质和探针，所述探针能够与例如由表1中的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7980、81、82或83个基因表达的mRNA或cDNA杂交，所述微阵列能够证明本发明的基因标记。
在一个方面，本发明提供了适于鉴定根据本发明的标记的微阵列。
在有些实施方案中，本发明也延伸到基质和探针，所述探针适于与在本发明中使用的(例如，表1的)一个或多个基因表达的mRNA或cDNA部分杂交。
可商购的微阵列含有比表征基因的差别表达所需多得多的探针，这是出于在任何时间辅助分析的准确性的考虑。因此，一个或多个探针集合可能识别相同的基因。
因此，在一个实施方案中，用多个探针或探针集合来鉴定根据本文所述发明的任意方面的基因的差别表达，诸如增量调节。
诊断试剂盒可以包含例如排列在微阵列上的探针。
具体地，制备的微阵列(例如含有本文描述的一个或多个探针集合的微阵列)可以容易地由诸如Affimetrix等公司制备，从而提供用于鉴定根据本发明的谱的特异性试验以及任选的试剂。
在一个实施方案中，微阵列或诊断试剂盒将额外地能够测试相关的癌睾丸抗原表达基因(如Mage基因)的存在或不存在。
因此，在一个方面，本发明提供了适于所述在合适条件下的杂交的探针和/或探针集合。本发明也延伸到探针(例如本发明描述的探针或其功能等同物)在鉴定根据本发明的基因谱中的用途。
在有些实施方案中，本文描述的发明延伸到本文列出的探针的所有变换(或其功能类似物)用于鉴定所述标记的用途。
在一个方面，本发明提供了探针在鉴定免疫激活基因的至少一种基因产物的差别表达从而确定根据本发明的基因谱在患者来源的样品中是否存在的用途。
在本发明的采用杂交的实施方案中，通常在严谨条件下(诸如3XSSC，0.1％SDS，在50℃)进行杂交。
一旦已经鉴定了靶基因/谱，则本领域技术人员能够设计与相同靶杂交的替代探针。因此，本发明也延伸到探针，其在合适的条件下测量本发明的基因的相同差别表达，以提供描述的标记/谱。
本发明也延伸到相关探针在分析癌症患者将是用合适的免疫治疗进行的治疗的反应者还是非反应者中的用途。
本发明也延伸到已知微阵列用于鉴定根据本发明的标记的用途(以及使用所述微阵列的方法)。
核酸探针的长度可以是至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或更多个核苷酸，并且可以包含全长基因。用于本发明中的探针是能够与由表1列出的基因表达的mRNA(或其cDNA)在严格条件下特异性杂交的探针。
本发明进一步涉及，筛选药物对组织或细胞样品的作用的方法，所述方法包括下述步骤：在药物治疗之前和之后，采用本文所述发明的任一个实施方案，分析表达谱。因此，本发明提供了筛选药物的方法，所述药物将使基因谱改变为在用例如Mage抗原特异性的癌症免疫治疗进行治疗后存活改善的患者的基因谱(即将基因谱改变为反应者的基因谱)，以使患者能够从例如Mage抗原特异性的癌症免疫治疗获益。
本发明进一步提供了患者诊断方法，所述方法包括例如下述步骤：根据本文所述发明的任一个实施方案，分析表达谱，并且将其与标准比较，以诊断患者是否将从Mage特异性的免疫治疗获益的步骤。
本发明包括患者诊断方法，所述方法包括下述步骤：根据本发明的任一个实施方案，分析由患者得到的肿瘤组织样品的表达谱，并且评估例如表1中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7980、81、82或83个所述基因是否表达。
因此，在临床应用中，可以筛选本文所述发明的任一个实施方案的表达在来自人患者的组织样品中的存在和/或缺乏。
在一个替代的方面，本发明提供了一种方法，该方法进一步包括下述步骤：分析源自肿瘤的样品，以确定肿瘤表达哪种(哪些)抗原，并且因此能够施用治疗有效量的合适的抗原特异性的癌症免疫治疗，例如，当发现肿瘤是MAGE(如Mage A3)阳性时，合适的治疗可以例如包括施用Mage A3抗原特异性的免疫治疗。
如果本发明的任意实施方案的一个或多个基因(诸如基本上所有的基因)被差别表达(如上调)，并且可以通过微阵列分析或其它合适的分析(如本文描述的那些分析)检测到，则认为患者的样品(如肿瘤组织)呈现本发明的基因标记。
下面描述了其它具体实施方案。
在有些实施方案中，所述方法包括下述步骤：
1 分析表1的一个或多个基因的基因产物在患者来源的样品中的表达，
2 标准化所述基因产物的表达水平；
3 将标准化的表达水平与标准相对比，其中所述标准是表1的一种或多种基因产物在具有已知反应者或非反应者状态的一位或多位患者中的表达的值或函数，所以标准信息与关于患者来源的样品中相同基因的表达的信息的对比，允许得出关于患者中的反应者或非反应者状态的结论；
4 将样品的来源患者表征为反应者或非反应者；和
5 任选地包括下述步骤：如果所述患者被表征为免疫治疗的反应者，则选择所述患者进行适当免疫治疗的至少一种施用。
在一个方面，使用“内部”参照，诸如持家基因或来自相同样品的基因的表达，进行标准化。在一个方面，使用“外部”参照，诸如源自一个或多个不同个体的参照，进行标准化。
在一个方面，使用微阵列，进行样品的表征。在一个方面，使用核酸扩增技术诸如PCR，进行样品的表征。
在一个方面，使用基于微阵列的技术的新样品表征包括：样品的预处理步骤，和基因标准化，以生成与标准或训练集相当的基因表达值。使用在附录1中例证的GCRMA算法(Wu，2004)，例如使用从合适的训练数据计算出的参照GCRMA参数，可以进行样品标准化。可以从训练数据计算出的参数的实例是参照分位数和探针效应。使用Z-得分计算，可以进行基因标准化，其中从探针集合值减去探针集合特异性的均值，然后通过探针集合特异性的标准差，对以该均值为中心的表达值加权。
在一个方面，使用Q-PCR的新样品的表征包括：使用某些参照或持家基因对患者粗数据标准化的预处理步骤。使用来自标准或训练集的参数，可以进行Z-得分计算。
在一个方面，对比和表征黑素瘤患者的步骤使用在表1中列出的100个探针集合或83个基因，用于将患者表征为反应者(R)或基因标记(GS)+或非反应者(NR、GS-)，其中使用下述算法：
Figure BPA00001546662600461
Figure BPA00001546662600471
Figure BPA00001546662600481
其中
-testset是一个具有100行的矩阵，所述行含有100个PS的标准化的微阵列数据
-M8.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.100个PS的字符列表
2.训练集中的每个PS的100平均值的向量
3.训练集中的每个PS的100sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的100行和56列的矩阵
5.训练集中的反应者组的PC1平均值
6.训练集中的反应者组的PC1 sd值
7.训练集中的非反应者组的PC1平均值
8.训练集中的非反应者组的PC1 sd值
训练集中的每个组的均值和sd(四舍五入至3位有效数字)是：
  均值_PC1R   -4.622
  sd_PC1R   5.727
  均值_PC1NR   2.991
  sd_PC1NR   7.051
100个PS分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  均值   Sd   PC1
  213793_s_at   6.638   1.437   0.0827
  223593_at   4.245   1.721   0.0698
  225996_at   5.369   2.116   0.0625
  204556_s_at   3.515   1.49   0.0594
  223575_at   5.664   1.785   0.0556
  205097_at   7.907   1.526   0.0553
  231229_at   6.464   1.711   0.0504
  1562051_at   3.576   1.847   0.0503
  244393_x_at   4.702   1.444   0.0494
  200615_s_at   6.286   1.232   0.0407
  228316_at   5.362   1.369   0.0402
  201474_s_at   4.506   1.331   0.0376
  222962_s_at   5.177   1.139   0.0372
  236328_at   7.034   1.936   0.0339
  232481_s_at   3.731   2.053   0.0328
  228400_at   3.458   1.437   0.0279
  211149_at   4.061   2.272   0.0266
  228492_at   4.538   2.983   0.0254
  237515_at   5.513   1.86   0.0245
  226084_at   9.153   1.388   0.0234
  205499_at   4.675   1.719   0.0002
  234907_x_at   3.95   1.465   -0.0051
  1553132_a_at   4.068   1.29   -0.0504
  239012_at   6.533   1.694   -0.0656
  238587_at   6.039   1.292   -0.0717
  219551_at   4.637   1.569   -0.0789
  AFFX-HUMISGF3A/M97935_MB_at   7.445   1.504   -0.0819
  1562031_at   6.386   1.521   -0.0871
  238524_at   4.961   1.623   -0.0883
  217436_x_at   8.377   1.127   -0.0891
  1552612_at   7.216   1.841   -0.0929
  244061_at   6.081   1.918   -0.0935
  209774_x_at   6.653   1.952   -0.0953
  221081_s_at   6.805   2.062   -0.0956
  206082_at   6.505   2.038   -0.0988
  209770_at   10.821   1.153   -0.1002
  232375_at   8.732   1.379   -0.1007
  211911_x_at   10.865   1.461   -0.1042
  1552613_s_at   7.491   1.275   -0.1043
  221875_x_at   10.907   1.258   -0.1044
  214470_at   6.927   1.801   -0.1049
  232311_at   7.001   1.484   -0.105
  208729_x_at   10.389   1.419   -0.106
  207536_s_at   4.073   1.75   -0.1061
  均值   Sd   PC1
  204806_x_at   10.065   1.283   -0.1062
  1554240_a_at   4.02   1.761   -0.1068
  207795_s_at   3.698   1.803   -0.1073
  202659_at   6.944   1.284   -0.1077
  210606_x_at   3.915   1.892   -0.1083
  235276_at   7.632   1.905   -0.1084
  208885_at   10.544   1.865   -0.1084
  202643_s_at   5.855   1.381   -0.1087
  204533_at   8.875   3.111   -0.1088
  229152_at   6.925   3.232   -0.1092
  1563473_at   7.07   2.31   -0.1112
  204529_s_at   7.139   2.08   -0.1115
  235175_at   8.682   2.268   -0.1118
  204897_at   9.206   1.692   -0.1123
  204070_at   8.233   2.205   -0.1125
  210439_at   4.539   1.825   -0.1131
  1555759_a_at   4.213   1.638   -0.1133
  204224_s_at   9.809   1.798   -0.1137
  202644_s_at   8.64   1.472   -0.114
  231577_s_at   8.659   1.996   -0.114
  210982_s_at   11.946   1.662   -0.1145
  1555852_at   6.989   1.89   -0.1149
  209813_x_at   4.135   1.808   -0.1152
  205685_at   6.927   1.728   -0.1153
  238581_at   4.289   1.801   -0.1158
  229543_at   8.937   2.328   -0.1159
  229390_at   9.644   2.315   -0.1159
  208894_at   11.493   1.628   -0.1161
  222838_at   7.302   2.672   -0.1164
  228532_at   8.693   1.684   -0.1165
  209606_at   5.957   2.038   -0.1168
  217478_s_at   9.575   1.559   -0.1173
  229391_s_at   9.135   2.228   -0.1175
  211144_x_at   4.32   1.949   -0.1179
  228362_s_at   8.288   2.398   -0.1179
  212671_s_at   8.72   2.387   -0.1182
  203915_at   9.242   3.331   -0.1191
  229625_at   7.32   2.116   -0.1197
  211902_x_at   7.387   1.956   -0.1197
  209671_x_at   5.905   2.044   -0.1197
  1552497_a_at   4.827   2.195   -0.1205
  215806_x_at   4.544   1.973   -0.1215
  216920_s_at   5.641   1.862   -0.1221
  210972_x_at   7.322   2.354   -0.1224
  205890_s_at   8.864   2.983   -0.1225
  232234_at   6.877   2.249   -0.1228
  207651_at   7.222   2.531   -0.1229
  均值   Sd   PC1
  202531_at   7.451   1.809   -0.1234
  206666_at   6.816   2.698   -0.1242
  213193_x_at   6.825   2.768   -0.1257
  204116_at   6.106   2.683   -0.126
  213539_at   7.398   2.851   -0.1263
  211339_s_at   5.602   2.061   -0.1266
  210915_x_at   6.533   2.733   -0.1267
  211796_s_at   6.946   2.921   -0.1271
  205758_at   7.338   3.285   -0.1275
在一个方面，对比和表征黑素瘤患者的步骤单个地使用在表13中提及的100个探针集合或83个基因中的任一个来表征患者，其中使用上面指出的算法，其中使用单个基因表达值替代第一主要成分(PC 1)。
在一个方面，对比和表征黑素瘤患者的步骤使用在表5中列出的22个基因，用于将患者表征为反应者(R)或基因标记(GS)+或非反应者(NR、GS-)，其中使用下述算法：
Figure BPA00001546662600511
Figure BPA00001546662600531
其中
-Testset.RData是一个具有22行的矩阵，所述行含有22个基因的标准化的对数表化的PCR数据
-M8.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.22个基因名称的字符列表
2.训练集中的每个基因的22平均值的向量
3.训练集中的每个基因的22sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的22行和22列的矩阵
5.训练集中的反应者组的PC1平均值
6.训练集中的反应者组的PC1 sd值
7.训练集中的非反应者组的PC1平均值
8.训练集中的非反应者组的PC1 sd值
22个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  基因   均值   Sd   PC1系数
  C4orf7   -1.397   1.244   -0.1834
  CCL5   -0.545   0.691   -0.2441
  JAK2   -1.105   0.354   -0.1636
  IRF1   -0.430   0.500   -0.2345
  CXCL9   -0.276   0.923   -0.2349
  IL2RG   -0.657   0.721   -0.2444
  CXCL10   -0.830   0.896   -0.2181
  SLC26A2   -0.745   0.307   0.0660
  CD86   -1.504   0.461   -0.2272
  CD8A   -1.342   0.879   -0.1881
  UBD   -0.570   0.945   -0.2385
  GZMK   -1.470   0.734   -0.2414
  GPR171   -1.683   0.698   -0.2180
  PSCDBP   -1.335   0.647   -0.2212
  CXCL2   -2.163   0.633   -0.1437
  ICOS   -1.714   0.697   -0.2029
  TRBC1   -2.714   1.313   -0.2026
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   -0.762   0.666   -0.2464
  TARP；TRGC2   -2.405   0.877   -0.1904
  ITK   -1.862   0.896   -0.2178
  CD3D   -1.478   0.806   -0.2452
  HLA-DMA   -0.380   0.470   -0.2284
训练集中的每个组的均值和sd(四舍五入至3位有效数字)是：
均值_PC1R   -2.055
sd_PC1R   2.920
均值_PC1NR   1.210
sd_PC1NR   3.951
在一个方面，对比和表征黑素瘤患者的步骤单个地使用在表11中提及的22个基因中的任一个来表征患者，其中使用上面指出的算法，其中使用单个基因表达值替代第一主要成分(PC1)。
在一个方面，对比和表征NSCLC患者的步骤使用在表7中列出的23个基因，用于将患者表征为反应者(不复发或基因标记+(GS+)、1)或a非反应者(复发、GS-、0)，其中使用下述算法：
Figure BPA00001546662600541
Figure BPA00001546662600561
其中
-Testset.RData是一个具有22行的矩阵，所述行含有23个基因的标准化的对数表化的PCR数据
-M4.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.23个基因名称的字符列表
2.训练集中的每个基因的23平均值的向量
3.训练集中的每个基因的23sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的23行和23列的矩阵
5.风险评分计算中的B治疗
6.风险评分计算中的BPC1相互作用
7.训练集中的中间风险评分
23个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  基因   均值   sd   PC1系数
  C4orf7   -2.35768   1.455544   -0.12114
  CCL5   -0.9599   0.350039   -0.23097
  JAK2   -1.36811   0.260374   -0.19931
  IRF1   -0.52347   0.276644   -0.2256
  CXCL9   -0.87804   0.563437   -0.21386
  IL2RG   -0.83528   0.358042   -0.24997
  CXCL10   -1.36857   0.615177   -0.17136
  SLC26A2   -1.44043   0.255169   -0.05637
  CD86   -1.7699   0.499237   -0.13267
  CD8A   -1.33733   0.375334   -0.25173
  UBD   -0.71367   0.546652   -0.21295
  GZMK   -1.77411   0.529496   -0.24628
  GPR171   -1.81327   0.32409   -0.19376
  PSCDBP   -1.17746   0.387117   -0.24162
  CXCL2   -1.16947   0.696255   -0.09696
  ICOS   -2.15436   0.403522   -0.23497
  TRBC1   -2.62512   1.013281   -0.12679
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   -1.19671   0.3944   -0.25817
  TARP；TRGC2   -2.22752   0.481252   -0.19299
  ITK   -1.85777   0.394118   -0.26077
  CD3D   -1.64584   0.397626   -0.25514
  HLA-DMA   -0.81144   0.380465   -0.22948
  SLAMF7   -1.33744   0.464338   -0.21762
其中从训练集得到B治疗＝-0.2429033且BPC1相互作用＝0.1720062。
将新样品的风险评分与训练集的中间风险评分＝-0.323947288相对比，如果风险评分低于该值，则将所述样品分类为GS+(反应者、不复发、1)。
在一个方面，对比和表征NSCLC患者的步骤单个地使用在表12中提及的23个基因中的任一个来表征患者，其中使用上面指出的算法，其中使用单个基因表达值替代第一主要成分(PC1)。
在一个方面，对比和表征NSCLC患者的步骤使用在表9中提及的22个基因，用于将患者表征为反应者(不复发或基因标记+(GS+)、1)或非反应者(复发、GS-、0)，其中使用下述算法：
Figure BPA00001546662600591
其中
-Testset.RData是一个具有22行的矩阵，所述行含有22个基因的标准化的对数表化的PCR数据
-M4.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.22个基因名称的字符列表
2.训练集中的每个基因的22平均值的向量
3.训练集中的每个基因的22sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的22行和22列的矩阵
5.风险评分计算中的B治疗
6.风险评分计算中的BPC1相互作用
7.训练集中的中间风险评分
22个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  基因   均值   Sd   PC1系数
  C4orf7   -2.37682   1.432191   -0.12613
  CCL5   -0.97196   0.363545   -0.23868
  JAK2   -1.38351   0.272662   -0.20067
  IRF1   -0.5328   0.284196   -0.23035
  CXCL9   -0.88518   0.561561   -0.21758
  IL2RG   -0.84755   0.369696   -0.25893
  CXCL10   -1.38526   0.608373   -0.17545
  SLC26A2   -1.45138   0.259368   -0.06122
  CD86   -1.78136   0.493304   -0.1445
  CD8A   -1.35019   0.38214   -0.26018
  UBD   -0.72426   0.545598   -0.21573
  GZMK   -1.7857   0.526042   -0.25378
  GPR171   -1.81382   0.353983   -0.1875
  PSCDBP   -1.19407   0.398912   -0.24969
  CXCL2   -1.17377   0.679063   -0.10145
  ICOS   -2.16745   0.40877   -0.24479
  TRBC1   -2.63145   0.999466   -0.12889
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   -1.20289   0.392963   -0.26276
  TARP；TRGC2   -2.27109   0.528402   -0.19113
  ITK   -1.87391   0.405727   -0.26852
  CD3D   -1.66653   0.409356   -0.26013
  HLA-DMA   -0.81888   0.400541   -0.23598
其中从训练集得到B治疗＝-0.193146993且BPC1相互作用＝-0.163704817。
将新样品的风险评分与训练集的中间风险评分＝-0.25737421相对比，如果风险评分低于该值，则将所述样品分类为GS+(反应者、不复发、1)。
免疫治疗
在另一个方面，本发明提供了在将患者鉴定为适当免疫治疗的反应者后，用适当免疫治疗(例如癌症免疫治疗，如癌睾丸免疫治疗)对反应者患者进行治疗的方法。
因此，在有些实施方案中，本发明提供了治疗患者的方法，所述方法包括下述步骤：在首先基于至少一种免疫激活基因的差别表达(例如通过患者来源的样品的合适分析显示)将患者表征为反应者后，施用治疗有效量的适当免疫治疗(例如癌症免疫治疗，诸如Mage癌症免疫治疗)。特别地，其中基于本文描述的一个或多个实施方案，将患者表征为反应者。
在一个方面，免疫治疗包含合适的佐剂(免疫刺激剂)，参见下文说明。
在本发明的另一个实施方案中，提供了治疗患有例如表达Mage的肿瘤的患者的方法，该方法包括确定患者是否表达本发明的基因标记，然后施用，例如，Mage特异性的免疫治疗剂。在另一个实施方案中，用例如Mage特异性的免疫治疗来治疗患者，从而在首先接受治疗(如通过手术切除任何肿瘤或其它化疗或放疗)后预防或改善疾病复发。
本发明的另一方面是，治疗患有表达Mage的肿瘤的患者的方法，所述方法包括：从得自患者的生物样品，测定患者的肿瘤是否表达根据本发明的任一个实施方案的谱，然后给所述患者施用Mage特异性的免疫治疗剂。
也提供了治疗容易复发表达Mage的肿瘤的患者的方法，所述患者已经进行过治疗以除去/治疗表达Mage的肿瘤，所述方法包括：从得自患者的生物样品，测定患者的肿瘤是否表达一个或多个选自本发明的任意实施方案的基因，然后施用Mage特异性的免疫治疗剂。
本发明也提供了治疗方法或用途，其中采用：
●包含MAGE抗原或其肽的MAGE特异性的免疫治疗剂，
●包含MAGE-A3蛋白或肽的MAGE抗原，
●包含肽EVDPIGHLY的MAGE抗原，
●与载体蛋白融合或缀合的MAGE抗原或肽，例如，其中载体蛋白选自蛋白D、NS1或CLytA或其片段，和/或
●进一步包含佐剂的MAGE特异性的免疫治疗剂，例如，其中佐剂包括以下一种或多种，或其组合：3D-MPL；铝盐；含CpG的寡核苷酸；含皂苷的佐剂，如QS21或ISCOMs；水包油乳状液；和脂质体。
本发明也延伸到免疫治疗(如癌症免疫治疗，特别是Mage免疫治疗)在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗患者(如指定为治疗的反应者的癌症患者)。
观察到一个最初表征为非反应者的患者在放射治疗后随后表征为反应者。有趣的是，本发明人也认为例如通过使患者接受放射治疗，或施用炎症刺激剂，如干扰素或TLR3(例如WO 2006/054177中的描述)、4、7、8或TLR 9激动剂(例如含有CpG基序，特别施用其高剂量，如每Kg施用0.1-75mg，例如每周施用)，可以在至少一些非反应者中诱导反应者谱。参见例如Krieg，A.M.，Efler，S.M.，Wittpoth，M.，Al Adhami，M.J.& Davis，H.L.Induction of systemicTH1-like innate immunity in normal volunteers following subcutaneousbut not intravenous administration of CPG 7909，a synthetic B-class CpGoligodeoxynucleotide TLR9 agonist.J.Immunother.27，460-471(2004)。
高剂量的CpG可以例如吸入或皮下施用。
本发明进一步提供了Mage特异性的免疫治疗在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗患有表达Mage的肿瘤的患者或已经接受治疗(如手术、化疗或放疗)以除去/治疗表达Mage的肿瘤的患者，所述患者表达本发明的基因标记。
然后可以将免疫治疗施用给例如反应者，或在已经诱导了反应者谱以后。
在一个方面，本发明提供了Mage特异性的免疫治疗在制备用于治疗患有表达Mage的肿瘤的患者的药剂中的用途，所述患者的特征在于，他们的肿瘤表达一个或多个选自本发明的任意实施方案的基因。
本发明也提供了Mage特异性的免疫治疗在制备用于治疗易复发表达Mage的肿瘤的患者的药剂中的用途，所述患者的特征在于，他们的肿瘤表达一个或多个选自本发明的任意实施方案的基因。
有利地，本发明可以允许治疗提供者靶定将从接受合适的免疫治疗获得临床益处的患者群体。预期在筛选后，至少60％(如70、75、80、85％或更多)的被视作/表征为反应者的患者将从免疫治疗获得临床益处，这比目前通常用诸如癌症治疗等治疗观察到的水平显著增加。
有利地，如果癌症免疫治疗是与化疗同时施用，或在化疗后施用，它可能有助于增加患者的免疫应答(其可能已经被化疗消耗)。
在另一个实施方案中，免疫治疗可以在外科手术、化疗和/或放疗之前施用。
适用于本发明的抗原特异性的癌症免疫治疗剂(ASCI)可以例如包括：能够增强Mage特异性的免疫应答的那些。这类免疫治疗剂可能能够增强对Mage基因产物(例如Mage-A抗原，如Mage-A3)的免疫应答。免疫治疗剂通常包含来自Mage基因产物的至少一个表位。这样的表位可能作为肽抗原存在，其任选共价连接于载体，并且任选有佐剂存在。或者，可以使用更大的蛋白片段。例如，用于本发明的免疫治疗剂可以包含与MAGE-A1的氨基酸195-279相对应或包含所述氨基酸的抗原。但是，当合适地提供时，使用的片段和肽必须能够增强Mage特异性的免疫应答。可以用于本发明的肽的实例包括MAGE-3.A1九肽EVDPIGHLY[Seq.ID No](参见Marchand等，International Journal of Cancer 80(2)，219-230)，以及以下MAGE-A3肽：
替代的ASCI包括癌睾丸抗原，诸如NY-ESO1、LAGE 1、LAGE2，其详细内容可以从www.cancerimmunity.org/CTdatabase获得。ASCI也包括可能不是癌睾丸特异性的其它抗原，诸如PRAME和WT1
癌症免疫治疗可以基于，例如下文讨论的一种或多种抗原。
在本发明的一个实施方案中，要使用的抗原可以由MAGE肿瘤抗原组成，或包含MAGE肿瘤抗原，所述MAGE肿瘤抗原例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、MAGE 5、MAGE 6、MAGE 7、MAGE8、MAGE 9、MAGE 10、MAGE 11或MAGE 12。编码这些MAGE抗原的基因位于X染色体上，并且它们的编码序列彼此有64-85％的同源性(De Plaen，1994)。这些抗原有时称作MAGE A1、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A10、MAGE A11和/或MAGE A12(MAGE A家族)。在一个实施方案中，抗原是MAGE A3。
在一个实施方案中，也可以使用来自两个另外的MAGE家族，即MAGE B组和MAGE C组之一的抗原。MAGE B家族包括MAGE B1(也称作MAGE Xp1和DAM 10)、MAGE B2(也称作MAGE Xp2和DAM 6)、MAGE B3和MAGE B4-Mage C家族目前包括MAGEC1和MAGE C2。
概括地，MAGE蛋白可以定义为含有朝向蛋白的C末端定位的核心序列标记(例如，关于MAGE A1，即一种309个氨基酸的蛋白，核心标记相应于氨基酸195-279)。
因此，核心标记的共有模式描述如下，其中x代表任何氨基酸，小写残基是保守的(允许保守变体)，大写残基是完全保守的。
核心序列标记
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
保守置换是公知的，并且通常作为序列比对计算机程序中的默认评分矩阵。这些程序包括PAM250(Dayhoft M.O.等，(1978)，“A modelof evolutionary changes in proteins”，In“Atlas of Protein sequence andstructure”5(3)M.O.Dayhoft(编)，345-352)，国家生物医学研究基金会，华盛顿，和Blosum 62(Steven Henikoft and Jorja G.Henikoft(1992)，“Amino acid substitution matricies from protein blocks”)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(Biochemistry)：10915-10919。
概括地，以下组内的置换是保守置换，而组之间的置换认为是非保守的。所述组是：
i)天冬氨酸/天冬酰胺/谷氨酸/谷氨酰胺
ii)丝氨酸/苏氨酸
iii)赖氨酸/精氨酸
iv)苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸
v)亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸/甲硫氨酸
vi)甘氨酸/丙氨酸
通常，并且在本发明的上下文中，MAGE蛋白的同一性将是大约50％或更高，诸如70、80、90、95 96、97、98或99％同一性，在该核心区中具有MAGE A1的氨基酸195-279。
MAGE蛋白衍生物也是本领域已知的，参见WO 99/40188。所述衍生物适用于治疗性疫苗制剂(免疫治疗剂)，其适用于治疗一些肿瘤类型。
已经基于MAGE-3蛋白鉴定了一些CTL表位。一种这样的表位，即MAGE-3.A1，是位于MAGE-3蛋白的氨基酸168-176之间的九肽序列，当与MHC I类分子HLA.A1联合呈递时，其构成CTLs的特异性表位。最近，通过在黑素瘤细胞和自体淋巴细胞的混合培养物中设置CTL应答的能力，鉴定了MAGE-3蛋白的肽序列上的两个额外的CTL表位。这两个表位分别具有HLA.A2(Van der Bruggen，1994)和HLA.B44(Herman，1996)等位基因的特异性结合基序。
在本发明的另外的实施方案中，肿瘤抗原可以包含以下抗原之一或其免疫原性部分或由以下抗原之一或其免疫原性部分组成，所述免疫原性部分能够指导对抗原的免疫应答：SSX-2；SSX-4；SSX-5；NA17；MELAN-A；酪氨酸酶；LAGE-1；NY-ESO-1；PRAME；P790；P510；P835；B305D；B854；CASB618(描述于WO00/53748)；CASB7439(描述于WO01/62778)；C1491；C1584；和C1585。
在一个实施方案中，抗原可以包含P501S(也称作prostein)，或由P501S组成。P501S抗原可以是重组蛋白，其将P501S蛋白的大部分与细菌融合蛋白组合在一起，所述融合蛋白包含肺炎链球菌的蛋白LytA的C末端部分，其中插入了破伤风类毒素的P2通用T辅助肽，所述融合蛋白即WO03/104272中描述的包含CLytA-P2-CLyta(“CPC”融合配偶体)的融合体。
在一个实施方案中，抗原可以包含以下成分或由以下成分组成：肾母细胞瘤基因表达的WT-1、或包含大约或近似氨基酸1-249的其N末端片段WT-1F；由Her-2/neu基因表达的抗原或其片段。在一个实施方案中，Her-2/neu抗原可以是WO00/44899中描述的以下融合蛋白之一。
在另一个实施方案中，抗原可以包含以下成分或由以下成分组成：“HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白”，也称作“ECD-ICD”或“ECD-ICD融合蛋白”，其是指包含HER-2/neu蛋白的胞外域(或其片段)和胞内域(或其片段)的融合蛋白(或其片段)。在一个实施方案中，该ECD-ICD融合蛋白不包括HER-2/neu跨膜域的主要部分，或不包括任何HER-2/neu跨膜域。
在另一个实施方案中，抗原可以包含以下成分或由以下成分组成：“HER-2/neu ECD-PD融合蛋白”，也称作“ECD-PD”或“ECD-PD融合蛋白”，或“HER-2/neu ECD-ΔPD融合蛋白”，也称作“ECD-ΔPD”或“ECD-ΔPD融合蛋白”，其是指包含HER-2/neu蛋白的胞外域(或其片段)和磷酸化域(或其片段，如ΔPD)的融合蛋白(或其片段)。在一个实施方案中，ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白不包括HER-2/neu跨膜域的主要部分，或不包括任何HER-2/neu跨膜域。
在一个实施方案中，抗原可以包含与免疫融合体或表达增强子配偶体链接的Mage或其它合适的蛋白。融合蛋白可以包括杂合蛋白，其包含两种或更多种与给定疾病相关的抗原，或融合蛋白可以是抗原和表达增强子配偶体的杂合体。
在一个实施方案中，所述MAGE抗原可以包含全长MAGE蛋白。在一个替代实施方案中，所述Mage抗原可以包含MAGE抗原的氨基酸3-312。
在替代实施方案中，所述MAGE抗原可以包含100、150、200、250或300个来自MAGE蛋白的氨基酸，条件是，当用于免疫治疗性处理中时，所述抗原能够产生针对MAGE的免疫应答。
抗原和配偶体可以是化学缀合的，或可以表达为重组融合蛋白。在一个实施方案中(其中抗原和配偶体表达为重组融合蛋白)，这可能使得能够与非融合蛋白相比，在表达系统中产生更高的水平。因此，融合配偶体可以辅助提供T辅助表位(免疫融合配偶体)，优选由人识别的T辅助表位，和/或辅助以比天然重组蛋白更高的产率表达蛋白(表达增强子)。在一个实施方案中，融合配偶体既可以是免疫融合配偶体，也可以是表达增强配偶体。
在本发明的一个实施方案中，可以使用的免疫融合配偶体源自蛋白D，即革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌B的一种表面蛋白(WO91/18926)，或其衍生物。蛋白D衍生物可以包含蛋白的前1/3，或近似或大约蛋白的前1/3，具体地，它可以包含N末端的前100-110个氨基酸，或近似N末端的前100-110个氨基酸。
在一个实施方案中，融合蛋白包含蛋白D的前109个残基(或来自其的108个残基)或氨基酸20-127。
可以使用的其它融合配偶体包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。典型地，可以利用NS1的N末端的81个氨基酸，但也可以使用不同的片段，前提是它们包括T辅助表位。
在另一个实施方案中，免疫融合配偶体是称作LytA的蛋白。LytA源自肺炎链球菌，其合成N-乙酰-L丙氨酸酰胺酶，即酰胺酶LytA(由LytA基因(Gene，43(1986)265-272页)编码)，它是一种特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LytA蛋白的C末端结构域负责与胆碱或与一些胆碱类似物如DEAE的亲和力。已经利用了该特性来开发表达大肠杆菌C-LytA的质粒，该质粒用于表达融合蛋白。已经描述了在氨基末端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化(Biotechnology：10，(1992)795-798页)。在一个实施方案中，可以使用分子的C末端部分。该实施方案可以利用存在于C末端中，从残基178开始的LytA分子的重复部分。在一个实施方案中，LytA部分可以掺入残基188-305。
在一个实施方案中，Mage蛋白可以包含衍生的游离硫醇。所述抗原描述于WO 99/40188中。具体地，可以使用羧酰胺化或羧甲基化的衍生物。
在本发明的一个实施方案中，肿瘤相关抗原包含Mage-A3-蛋白D分子。该抗原和下文概括的抗原更详细描述于WO 99/40188中。
在本发明的另一个实施方案中，肿瘤相关抗原可以包含任意以下融合蛋白：脂蛋白D片段、MAGE1片段和组氨酸尾的融合蛋白；NS1-MAGE3和组氨酸尾的融合蛋白；CLYTA-MAGE1-组氨酸的融合蛋白；CLYTA-MAGE3-组氨酸的融合蛋白。
本发明的另一个实施方案包括利用核酸免疫治疗剂，其包含编码本文描述的Mage特异性肿瘤相关抗原的核酸分子。所述序列可以插入合适的表达载体，并且用于DNA/RNA接种。表达核酸的微生物载体也可以用作载体送递的免疫治疗剂。所述载体包括例如痘病毒、腺病毒、甲病毒和利斯特氏菌。
用于获得核酸序列和生产表达载体的常规重组技术描述于Maniatis等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor，1982-1989。
对于基于蛋白的免疫治疗剂，本发明的蛋白以液体形式或冻干形式提供。
通常预期，每个人类剂量将包含1-1000μg蛋白，例如30-300μg，诸如25、30、40、50、60、70、80或90μg。
本文描述的方法可以包含组合物，进一步包含疫苗佐剂和/或免疫刺激性细胞因子或趋化因子。
用于本发明的合适的疫苗佐剂是可以商购的，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；铝盐，如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子，如GM-CSF或白介素-2、-7或-12和趋化因子，也可以用作佐剂。
在制剂中，可能理想的是佐剂组合物诱导主要是Th1型的免疫应答。高水平的Th1-型细胞因子(如IFN-γ、TNF α、IL-2和IL-12)倾向于有利于诱导对施用的抗原的细胞介导的免疫应答。根据一个实施方案(其中应答主要是Th1型)，Th1型细胞因子的水平将增加到高于Th2型细胞因子水平的程度。采用标准测定可以容易地评估这些细胞因子的水平。关于细胞因子家族的综述，参见Mosmann and Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。
因此，可以用合适的佐剂诱导主要是Th1型的应答，包括，例如，单磷酰脂质A(如3-脱氧-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL))与铝盐的组合。在WO 98/50399、WO 01/34617和WO 03/065806中公开的3D-MPL或其它toll样受体4(TLR4)配体(如氨基团烷基氨基葡糖苷磷酸酯)也可以单独用于产生主要是Th1型的应答。
其它可以优先诱导TH1型免疫应答的已知佐剂包括：TLR9激动剂，如含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。该寡核苷酸的特征在于，CpG二核苷酸是未甲基化的。这类寡核苷酸是公知的，并且描述于例如WO 96/02555。
合适的寡核苷酸包括：
  SEQ ID NO：102   TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
  SEQ ID NO：103   TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
  SEQ ID NO：104 ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
  SEQ ID NO：105   TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006，CpG 7909)
  SEQ ID NO：106   TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
含CpG的寡核苷酸也可以单独使用，或与其它佐剂组合。例如，增强的系统涉及含CpG的寡核苷酸与皂苷衍生物的组合，特别是WO00/09159和WO 00/62800中公开的CpG和QS21的组合。
该制剂可以另外包含水包油乳状液和/或生育酚。
另一种合适的佐剂是皂苷，例如QS21(Aquila BiopharmaceuticalsInc.，Framingham，MA)，它可以单独使用或与其它佐剂组合。例如，增强的系统涉及单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，例如WO 94/0015中公开的QS21和3D-MPL的组合，或反应原性较低的组合物，其中QS21被胆固醇猝灭，如WO 96/33739中的描述。其它合适的制剂包含水包油乳状液和生育酚。WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，它涉及在例如水包油乳状液中的QS21、3D-MPL和生育酚。
在另一个实施方案中，佐剂可以配制在脂质体组合物中。
使用的3D-MPL的量通常是小的，但是取决于免疫治疗制剂，可以在每剂1-1000μg的范围内，例如每剂1-500μg，诸如每剂1-100μg，特别是每剂25、30、40、50、60、70、80或90μg。
在一个实施方案中，佐剂系统包含三种免疫刺激剂：CpG寡核苷酸、3D-MPL和QS21，它们存在于脂质体制剂中或水包油乳状液中，如在WO 95/17210中所述。
本发明的佐剂或免疫治疗剂中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量通常是小的，但是取决于免疫治疗制剂，可以在每剂1-1000μg的范围内，例如每剂1-500μg。
用于本发明的佐剂中的皂苷的量可以在每剂1-1000μg的范围内，例如每剂1-500μg，诸如每剂1-100μg，特别是每剂25、30、40、50、60、70、80或90μg。
通常，预期每个人类剂量将包含0.1-1000μg抗原，例如0.1-500μg，诸如0.1-100μg，特别是0.1-50μg，尤其是25或50μg。通过包括观察接种的受试者中的合适免疫应答的标准研究，可以确定特定免疫治疗剂的最优量。在最初疫苗接种后，受试者可以接受足够隔开的一次或几次加强免疫。
其它合适的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，France)、SAF(Chiron，California，United States)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、Ribi Detox、RC-529(GSK，Hamilton，MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGPs)。
因此，提供了用于本发明的方法中的免疫原性组合物，其包含本文公开的抗原和佐剂，其中佐剂包含3D-MPL、QS21、CpG寡核苷酸中的一种或多种，或这些佐剂的两种或多种的组合。免疫原性组合物内的抗原可以水包油或油包水乳状液载体或脂质体制剂存在。
在一个实施方案中，佐剂可以包含3D-MPL、QS21和免疫刺激性CpG寡核苷酸中的一种或多种。在一个实施方案中，存在所有三种免疫刺激剂。在另一个实施方案中，3D-MPL和QS21存在于水包油乳状液中，并且不存在CpG寡核苷酸。
用于本发明的方法中的组合物可以包含药物组合物，所述药物组合物包含本文描述的肿瘤相关抗原或其融合蛋白以及药学上可接受的赋形剂。
在本说明书上下文中，词语“包含”的使用表示非限制性的，即是指“包括”。
具体地预见到这样的实施方案：其中本发明的包含特定要素的方面被限制为由相关要素组成或基本上由相关要素组成的所述方面，作为单独的实施方案。
显示了下面的实施例来例证可以用于制备本发明的颗粒的方法。
在本说明书中对文件的讨论，意图给出本发明的背景，并辅助本发明的理解。绝不意图承认，所述文件或评论是已知的，或是相关领域的普通一般知识。
在一个或多个方面，本发明提供了在下面的段落1-101中的任一段中所述的实施方案。
1)因而，本发明可以采用来自表1的一个或多个基因。
2)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号STAT1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.2至1.100的一个或多个基因。
3)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号PSMB9，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1和1.3至1.100的基因。
4)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号JAK2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.2和1.4至1.100的基因。
5)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号ITGA3，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.3和1.5至1.100的基因。
6)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号PSMB 10，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.4和1.6至1.100的基因。
7)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CXCL9，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.5和1.7至1.100的基因。
8)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号RARRES3，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.6和1.8至1.100的基因。
9)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号IL2RG，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.7和1.9至1.100的基因。
10)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CXCL10，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.8和1.10至1.100的基因。
11)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CD8A，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.9和1.11至1.100的基因。
12)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号UBD，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.10和1.12至1.100的基因。
13)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GPR171，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.11和1.13至1.100的基因。
14)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号KLRD1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.12和1.14至1.100的基因。
15)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-B，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.13和1.15至1.100的基因。
16)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号LCP1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.14和1.16至1.100的基因。
17)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-DRA，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.15和1.17至1.100的基因。
18)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CYTIP，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.16和1.18至1.100的基因。
19)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号IL23A，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.17和1.19至1.100的基因。
20)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TRA，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.18和1.20至1.100的基因。
21)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-DRA，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.19和1.21至1.100的基因。
22)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TARP，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.20和1.22至1.100的基因。
23)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号ITK，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.21和1.23至1.100的基因。
24)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号，所述基因是被探针集合211796_s_at鉴定出的基因，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.22和1.24至1.100的基因。
25)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-B，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.23和1.25至1.100的基因。
26)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-DQA1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.24和1.26至1.100的基因。
27)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HOMER1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.25和1.27至1.100的基因。
28)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TRGC2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.26和1.28至1.100的基因。
29)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因是被探针集合216920_s_at鉴定出的基因，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.27和1.29至1.100的基因。
30)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-A，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.28和1.30至1.100的基因。
31)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-DMA，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.29和1.31至1.100的基因。
32)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-F，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.30和1.32至1.100的基因。
33)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号SLAMF7，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.31和1.33至1.100的基因。
34)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号KIAA1549，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.32和1.34至1.100的基因。
35)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号LONRF2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.35至1.100的基因。
36)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.34和1.36至1.100的基因。
37)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号C1orf162，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.35和1.37至1.100的基因。
38)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.36和1.38至1.100的基因。
39)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GBP5，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.37和1.39至1.100的基因。
40)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因是被探针集合232375_at鉴定出的基因，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.38和1.40至1.100的基因。
41)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号SLITRK6，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.39和1.41至1.100的基因。
42)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GBP4，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.40和1.42至1.100的基因。
43)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号EPSTI1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.41和1.43至1.100的基因。
44)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号AKR1C2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.42和1.44至1.100的基因。
45)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号ITGAL，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.43和1.45至1.100的基因。
46)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CDC42SE2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.44和1.46至1.100的基因。
47)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号DZIP1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.45和1.47至1.100的基因。
48)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号PTGER4，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.46和1.48至1.100的基因。
49)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HCP5，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.47和1.49至1.100的基因。
50)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号UTY，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.48和1.50至1.100的基因。
51)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号KLRB1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.49和1.51至1.100的基因。
52)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.50和1.52至1.100的基因。
53)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HILS1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.51和1.53至1.100的基因。
54)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号C20orf24，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.52和1.54至1.100的基因。
55)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号B2M，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.53和1.55至1.100的基因。
56)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号ZNF285A，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.54和1.56至1.100的基因。
57)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TMEM56，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.55和1.57至1.100的基因。
58)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号IRF1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.56和1.58至1.100的基因。
59)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TRGV9，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.57和1.59至1.100的基因。
60)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有被探针集合238524_at鉴定出的符号NA，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.58和1.60至1.100的基因。
61)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号SLC26A2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.59和1.61至1.100的基因。
62)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CXCL2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.60和1.62至1.100的基因。
63)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号ICOS，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.61和1.63至1.100的基因。
64)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因是被探针集合213193_x_at鉴定出的基因，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.62和1.64至1.100的基因。
65)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CCL5，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.63和1.65至1.100的基因。
66)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号LOC284757，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.64和1.66至1.100的基因。
67)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CD86，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.65和1.67至1.100的基因。
68)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号KLRD1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.66和1.68至4.488的基因。
69)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因是被探针集合211902_x_at鉴定出的基因，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.67和1.69至1.100的基因。
70)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号SLAMF6，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.68和1.70至1.100的基因。
71)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TOX，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.69和1.71至1.100的基因。
72)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GZMK，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.70和1.72至1.100的基因。
73)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CDC42SE2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.71和1.73至1.100的基因。
74)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号PPP1R16B，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.72和1.74至1.100的基因。
75)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号EAF2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.73和1.75至1.100的基因。
76)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号USP9Y，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.74和1.76至1.100的基因。
77)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.75和1.77至1.100的基因。
78)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号FLJ31438，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.76和1.78至1.100的基因。
79)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号SHROOM3，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.77和1.79至1.100的基因。
80)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TNFAIP3，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.78和1.80至1.100的基因。
81)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号HLA-F，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.79和1.81至1.100的基因。
82)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号CD3D，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.80和1.82至1.100的基因。
83)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号MAP1B，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.81和1.83至1.100的基因。
84)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号SRPX2，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.82和1.84至1.100的基因。
85)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号AADAT，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.83和1.85至1.100的基因。
86)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号ARHGAP15，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.84和1.86至1.100的基因。
87)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号MCM10，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.85和1.87至1.100的基因。
88)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TC2N，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.86和1.88至1.100的基因。
89)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号AP2B1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.87和1.89至1.100的基因。
90)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GOLGA7，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.88和1.90至1.100的基因。
91)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TNFRSF9，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.89和1.91至1.100的基因。
92)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号RNF144B，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.90和1.92至1.100的基因。
93)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因是被探针集合209671_x_at鉴定出的基因，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.91和1.93至1.100的基因。
94)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号UBASH3B，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.92和1.94至1.100的基因。
95)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号BTN3A1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.93和1.95至1.100的基因。
96)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GCH1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.94和1.96至1.100的基因。
97)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号DENND2D，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.95和1.97至1.100的基因。
98)在另一个方面，本发明采用一个或多个基因根据段落1，其中所述基因具有符号C4orf7，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.96和1.98至1.100的基因。
99)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号TNFAIP3，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.97和1.99至1.100的基因。
100)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GBP5，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.100的基因。
101)在另一个方面，本发明采用一个或多个根据段落1的基因，其中所述基因具有符号GBP1，其任选地与一个或多个选自下述的基因相组合：在表1中鉴定出的被标记为1.1至1.99的基因。
在一个或多个方面，本发明提供了在下面的段落1-101中的任一段中所述的实施方案。当提及段落2-100中的任一段时，在段落3-101中的表述“所述基因”无意替换在段落2-100中提及的具体基因，而是向其添加。
1)因而，本发明可以采用来自表1的一个或多个基因。
2)在另一个方面，本发明采用根据段落1的一个或多个基因，其中所述基因具有符号STAT1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.2至1.100的一个或多个基因相组合。
3)在另一个方面，本发明采用根据段落1或2的一个或多个基因，其中所述基因具有符号PSMB9，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.3至1.100的一个或多个基因相组合。
4)在另一个方面，本发明采用根据段落1-3中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号JAK2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为的一个或多个基因相组合1.4至1.100。
5)在另一个方面，本发明采用根据段落1-4中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号ITGA3，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.5至1.100的一个或多个基因相组合。
6)在另一个方面，本发明采用根据段落1-5中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号PSMB10，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.6至1.100的一个或多个基因相组合。
7)在另一个方面，本发明采用根据段落1-6中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CXCL9，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.7至1.100的一个或多个基因相组合。
8)在另一个方面，本发明采用根据段落1-7中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号RARRES3，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.8至1.100的一个或多个基因相组合。
9)在另一个方面，本发明采用根据段落1-8中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号IL2RG，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.9至1.100的一个或多个基因相组合。
10)在另一个方面，本发明采用根据段落1-9中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CXCL10，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.10至1.100的一个或多个基因相组合。
11)在另一个方面，本发明采用根据段落1-10中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CD8A，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.11至1.100的一个或多个基因相组合。
12)在另一个方面，本发明采用根据段落1-11中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号UBD，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.12至1.100的一个或多个基因相组合。
13)在另一个方面，本发明采用根据段落1-12中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GPR171，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.13至1.100的一个或多个基因相组合。
14)在另一个方面，本发明采用根据段落1-13中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号KLRD1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.14至1.100的一个或多个基因相组合。
15)在另一个方面，本发明采用根据段落1-14中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-B，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.15至1.100的一个或多个基因相组合。
16)在另一个方面，本发明采用根据段落中任一段的一个或多个基因1-15，其中所述基因具有符号LCP1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为的一个或多个基因相组合1.16至1.100。
17)在另一个方面，本发明采用根据段落1-16中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-DRA，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.17至1.100的一个或多个基因相组合。
18)在另一个方面，本发明采用根据段落1-17中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CYTIP，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.18至1.100的一个或多个基因相组合。
19)在另一个方面，本发明采用根据段落1-18中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号IL23A，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.19至1.100的一个或多个基因相组合。
20)在另一个方面，本发明采用根据段落1-19中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TRA，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.20至1.100的一个或多个基因相组合。
21)在另一个方面，本发明采用根据段落1-20中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-DRA，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.21至1.100的一个或多个基因相组合。
22)在另一个方面，本发明采用根据段落1-21中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TARP，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.22至1.100的一个或多个基因相组合。
23)在另一个方面，本发明采用根据段落1-22中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号ITK，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.23至1.100的一个或多个基因相组合。
24)在另一个方面，本发明采用根据段落1-23中任一段的一个或多个基因，其中所述基因是被鉴定出的基因探针集合211796_s_at，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.24至1.100的一个或多个基因相组合。
25)在另一个方面，本发明采用根据段落1-24中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-B，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.25至1.100的一个或多个基因相组合。
26)在另一个方面，本发明采用根据段落1-25中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-DQA1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.26至1.100的一个或多个基因相组合。
27)在另一个方面，本发明采用根据段落1-26中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HOMER1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.27至1.100的一个或多个基因相组合。
28)在另一个方面，本发明采用根据段落1-27中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TRGC2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.28至1.100的一个或多个基因相组合。
29)在另一个方面，本发明采用根据段落1-28中任一段的一个或多个基因，其中所述基因是被鉴定出的基因探针集合216920_s_at，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.29至1.100的一个或多个基因相组合。
30)在另一个方面，本发明采用根据段落1-29中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-A，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.30至1.100的一个或多个基因相组合。
31)在另一个方面，本发明采用根据段落1-30中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-DMA，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.31至1.100的一个或多个基因相组合。
32)在另一个方面，本发明采用根据段落1-31中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-F，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.32至1.100的一个或多个基因相组合。
33)在另一个方面，本发明采用根据段落1-32中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号SLAMF7，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.33至1.100的一个或多个基因相组合。
34)在另一个方面，本发明采用根据段落1-33中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号KIAA1549，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.34至1.100的一个或多个基因相组合。
35)在另一个方面，本发明采用根据段落1-34中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号LONRF2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.35至1.100的一个或多个基因相组合。
36)在另一个方面，本发明采用根据段落1-35中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.36至1.100的一个或多个基因相组合。
37)在另一个方面，本发明采用根据段落1-36中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号C1orf162，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.37至1.100的一个或多个基因相组合。
38)在另一个方面，本发明采用根据段落1-37中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.38至1.100的一个或多个基因相组合。
39)在另一个方面，本发明采用根据段落1-38中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GBP5，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.39至1.100的一个或多个基因相组合。
40)在另一个方面，本发明采用根据段落1-39中任一段的一个或多个基因，其中所述基因是被探针集合232375_at鉴定出的基因，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.40至1.100的一个或多个基因相组合。
41)在另一个方面，本发明采用根据段落1-40中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号SLITRK6，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.41至1.100的一个或多个基因相组合。
42)在另一个方面，本发明采用根据段落1-41中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GBP4，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.42至1.100的一个或多个基因相组合。
43)在另一个方面，本发明采用根据段落1-42中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号EPSTI1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.43至1.100的一个或多个基因相组合。
44)在另一个方面，本发明采用根据段落1-43中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号AKR1C2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.44至1.100的一个或多个基因相组合。
45)在另一个方面，本发明采用根据段落1-44中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号ITGAL，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.45至1.100的一个或多个基因相组合。
46)在另一个方面，本发明采用根据段落1-45中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CDC42SE2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.46至1.100的一个或多个基因相组合。
47)在另一个方面，本发明采用根据段落1-46中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号DZIP1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.47至1.100的一个或多个基因相组合。
48)在另一个方面，本发明采用根据段落1-47中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号PTGER4，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.48至1.100的一个或多个基因相组合。
49)在另一个方面，本发明采用根据段落1-48中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HCP5，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.49至1.100的一个或多个基因相组合。
50)在另一个方面，本发明采用根据段落1-49中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号UTY，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.50至1.100的一个或多个基因相组合。
51)在另一个方面，本发明采用根据段落1-50中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号KLRB1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.51至1.100的一个或多个基因相组合。
52)在另一个方面，本发明采用根据段落1-51中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.52至1.100的一个或多个基因相组合。
53)在另一个方面，本发明采用根据段落1-52中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HILS1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.53至1.100的一个或多个基因相组合。
54)在另一个方面，本发明采用根据段落1-53中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号C20orf24，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.54至1.100的一个或多个基因相组合。
55)在另一个方面，本发明采用根据段落1-54中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号B2M，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.55至1.100的一个或多个基因相组合。
56)在另一个方面，本发明采用根据段落1-55中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号ZNF285A，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.56至1.100的一个或多个基因相组合。
57)在另一个方面，本发明采用根据段落1-56中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TMEM56，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.57至1.100的一个或多个基因相组合。
58)在另一个方面，本发明采用根据段落1-57中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号IRF1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.58至1.100的一个或多个基因相组合。
59)在另一个方面，本发明采用根据段落1-58中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TRGV9，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.59至1.100的一个或多个基因相组合。
60)在另一个方面，本发明采用根据段落1-59中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有被探针集合238524_at鉴定出的符号NA，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.60至1.100的一个或多个基因相组合。
61)在另一个方面，本发明采用根据段落1-60中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号SLC26A2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.61至1.100的一个或多个基因相组合。
62)在另一个方面，本发明采用根据段落1-61中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CXCL2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.62至1.100的一个或多个基因相组合。
63)在另一个方面，本发明采用根据段落1-62中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号ICOS，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.63至1.100的一个或多个基因相组合。
64)在另一个方面，本发明采用根据段落1-63中任一段的一个或多个基因，其中所述基因是被探针集合213193_x_at鉴定出的基因，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.64至1.100的一个或多个基因相组合。
65)在另一个方面，本发明采用根据段落1-64中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CCL5，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.65至1.100的一个或多个基因相组合。
66)在另一个方面，本发明采用根据段落1-65中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号LOC284757，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.66至1.100的一个或多个基因相组合。
67)在另一个方面，本发明采用根据段落1-66中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CD86，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.67至1.100的一个或多个基因相组合。
68)在另一个方面，本发明采用根据段落1-67中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号KLRD1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.68至4.488的一个或多个基因相组合。
69)在另一个方面，本发明采用根据段落1-68中任一段的一个或多个基因，其中所述基因是被探针集合211902_x_at鉴定出的基因，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.69至1.100的一个或多个基因相组合。
70)在另一个方面，本发明采用根据段落1-69中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号SLAMF6，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.70至1.100的一个或多个基因相组合。
71)在另一个方面，本发明采用根据段落1-70中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TOX，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.71至1.100的一个或多个基因相组合。
72)在另一个方面，本发明采用根据段落1-71中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GZMK，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.72至1.100的一个或多个基因相组合。
73)在另一个方面，本发明采用根据段落1-72中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CDC42SE2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.73至1.100的一个或多个基因相组合。
74)在另一个方面，本发明采用根据段落1-73中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号PPP1R16B，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.74至1.100的一个或多个基因相组合。
75)在另一个方面，本发明采用根据段落1-74中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号EAF2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.75至1.100的一个或多个基因相组合。
76)在另一个方面，本发明采用根据段落1-75中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号USP9Y，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.76至1.100的一个或多个基因相组合。
77)在另一个方面，本发明采用根据段落1-76中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号FAM26F，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.77至1.100的一个或多个基因相组合。
78)在另一个方面，本发明采用根据段落1-77中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号FLJ31438，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.78至1.100的一个或多个基因相组合。
79)在另一个方面，本发明采用根据段落1-78中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号SHROOM3，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.79至1.100的一个或多个基因相组合。
80)在另一个方面，本发明采用根据段落1-79中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TNFAIP3，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.80至1.100的一个或多个基因相组合。
81)在另一个方面，本发明采用根据段落1-80中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号HLA-F，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.81至1.100的一个或多个基因相组合。
82)在另一个方面，本发明采用根据段落1-81中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号CD3D，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.82至1.100的一个或多个基因相组合。
83)在另一个方面，本发明采用根据段落1-82中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号MAP1B，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.83至1.100的一个或多个基因相组合。
84)在另一个方面，本发明采用根据段落1-83中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号SRPX2，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.84至1.100的一个或多个基因相组合。
85)在另一个方面，本发明采用根据段落1-84中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号AADAT，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.85至1.100的一个或多个基因相组合。
86)在另一个方面，本发明采用根据段落1-85中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号ARHGAP15，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.86至1.100的一个或多个基因相组合。
87)在另一个方面，本发明采用根据段落1-86中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号MCM10，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.87至1.100的一个或多个基因相组合。
88)在另一个方面，本发明采用根据段落1-87中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TC2N，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.88至1.100的一个或多个基因相组合。
89)在另一个方面，本发明采用根据段落1-88中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号AP2B1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.89至1.100的一个或多个基因相组合。
90)在另一个方面，本发明采用根据段落1-89中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GOLGA7，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.90至1.100的一个或多个基因相组合。
91)在另一个方面，本发明采用根据段落1-90中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TNFRSF9，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.91至1.100的一个或多个基因相组合。
92)在另一个方面，本发明采用根据段落1-91中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号RNF144B，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.92至1.100的一个或多个基因相组合。
93)在另一个方面，本发明采用根据段落1-92中任一段的一个或多个基因，其中所述基因是被探针集合209671_x_at鉴定出的基因，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.93至1.100的一个或多个基因相组合。
94)在另一个方面，本发明采用根据段落1-93中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号UBASH3B，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.94至1.100的一个或多个基因相组合。
95)在另一个方面，本发明采用根据段落1-94中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号BTN3A1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.95至1.100的一个或多个基因相组合。
96)在另一个方面，本发明采用根据段落1-95中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GCH1，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.96至1.100的一个或多个基因相组合。
97)在另一个方面，本发明采用根据段落1-96中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号DENND2D，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.97至1.100的一个或多个基因相组合。
98)在另一个方面，本发明采用根据段落1-97中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号C4orf7，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.98至1.100的一个或多个基因相组合。
99)在另一个方面，本发明采用根据段落1-98中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号TNFAIP3，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.99至1.100的一个或多个基因相组合。
100)在另一个方面，本发明采用根据段落1-99中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GBP5，其任选地与在表1中鉴定出的被标记为1.100的一个或多个基因相组合。
101)在另一个方面，本发明采用根据段落1-100中任一段的一个或多个基因，其中所述基因具有符号GBP1。
实验实施例
实施例1
MAGE008 Mage黑素瘤临床试验：
在这个正在进行的试验中，将recMAGE-A3蛋白(重组mage融合蛋白)与两种不同的免疫佐剂即AS02B(QS21，MPL)或AS15(QS21，MPL和CpG7909)组合。目的是在安全性谱、临床反应和免疫应答方面区分这些佐剂。
在该实验中，两种佐剂组合物由两种免疫刺激剂的混合物组成：
1.QS21(来自南美树木-南美皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的纯化的天然存在的皂苷分子)，和
2.MPL(3脱氧-乙酰化单磷酰脂质A-脂质A的去毒衍生物，衍生自明尼苏达沙门氏菌LPS)。
AS02B是QS21和MPL的水包油乳状液。
在动物模型中，已经成功显示这些佐剂诱导体液免疫应答和TH1型细胞介导的免疫应答，包括产生IFNα的CD4和CD8T细胞(Moore等，1999；Gérard等，2001)。此外，注射配制在这种类型的佐剂中的重组蛋白，导致诱导系统抗肿瘤应答：实际上，显示接种的动物受到保护，免受基因工程化而表达肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞的攻击，并且显示消退中的肿瘤受到CD8、CD4和NK细胞以及巨噬细胞的高度浸润。
第二种佐剂系统是AS15：除了MPL和QS21，它在脂质体制剂中含有第三种免疫刺激剂，即CpG7909(原本称作上文的CpG 2006)。在动物模型(主要是小鼠)中，已经显示加入CpG7909进一步改进诱导的免疫应答和抗肿瘤反应(Krieg and Davis，2001；Ren等，2004)。CpG寡脱氧核苷酸(ODNs)直接通过TLR9触发而刺激树突细胞激活。此外，在小鼠中，CpG7909的系统应用显著增加转移的T细胞浸润到肿瘤中(Meidenbauer等，2004)。
研究概述
1.设计
MAGE008试验是
●开放的
●两组(two-arm)(AS02B相对于AS15)
●总共68个患者
如上文所述，将recMAGE-A3蛋白与AS02B或AS15佐剂系统组合。
2.患者群体
给具有区域性或远处皮肤和/或淋巴结病变的进行性转移黑素瘤患者(不能切除的III期和IV期M1a)施用recMAGE-A3蛋白。通过定量PCR评估肿瘤的MAGE-A3基因表达。选择的患者以前没有接受过黑素瘤治疗(recMAGE-A3作为一线治疗施用)并且没有内脏疾病。
3.免疫接种方案
治疗方案的方法
在MAGE008临床试验中进行的免疫接种方案如下：
周期1：以2周的间隔接种6次(第1、3、5、7、9、11周)
周期2：以3周的间隔接种6次(第15、18、21、24、27、30周)
周期3：以6周的间隔接种4次(第34、40、46、52周)
长期治疗：以3个月的间隔接种4次，例如，随后以6个月的间隔接种4次
对于上述两种治疗方案，都可以根据需要在治疗后施用额外的接种。
为了筛选上述临床试验的可能参与者，我们在任何免疫接种之前接受了肿瘤活组织检查。从活检物提取RNA，用于MAGE-A3定量PCR，并将该RNA也用于通过微阵列进行的基因表达绘谱。目的是，在疫苗接种前的活检物中鉴定一组与临床反应相关的基因，并开发出会预测患者临床结果的数学模型，从而可以合适地鉴定和选择可能从这种抗原特异性的癌症免疫治疗剂获益的患者。仅仅对来自签署了微阵列分析的知情同意书的患者的活检物进行基因绘谱分析。
1.材料和方法
1.1 肿瘤样本和RNA纯化
将在疫苗接种之前从65位患者采集的65个肿瘤活检物用于Mage008Mage-3黑素瘤临床试验。这些是在RNA稳定溶液RNAlater中新鲜冷冻保存的。
使用Tripure方法(Roche目录号1 667 165)，纯化总RNA。随后通过使用RNeasy Mini试剂盒进行提供的方案——具有DNA酶处理的清扫方案(Qiagen目录号74106)。使用CsCl离心，进一步处理来自其黑色素含量较高(通过目检测定)的样品的RNA。
最初用在260nm的光密度和Quant-IT RiboGreen RNA测定试剂盒(Invitrogen-Molecular probes R11490)，完成RNA定量。
1.2 用于微阵列分析的RNA标记和扩增
由于在临床研究中接受的小的活检物大小，结合RNA的标记使用扩增方法，用于微阵列分析：Nugen 3’ovation生物素试剂盒(50ngRNA的标记-Ovation生物素系统目录；2300-12，2300-60)。采用50ng总RNA的起始输入。
1.3 微阵列芯片、杂交和扫描
根据标准的Affymetrix方案，杂交、洗涤和扫描AffymetrixHG-U133.Plus 2.0基因芯片。
1.1.1 用于基因标记分析的患者的定义
采用二元分类方案，将患者分配给基因标记(GS)阳性的(GS+)或GS阴性的(GS-)组。训练集由56位可评价的患者组成，所述患者给出基因标记分析的知情同意，他们具有好质量微阵列数据，并进行至少6次疫苗接种。
对于该基因标记分析，将反应者(R)定义为呈现出临床活性的客观征象的患者，这些包括：客观反应(完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定的疾病(SD)、混合的反应(MR)。将非反应者(NR)定义为渐进性疾病(PD)。仅具有至少6次疫苗接种的可评价的患者用于基因谱分析，因为这是检测到免疫应答的大致时间。
用于基因谱分析的反应者(R)是呈现出生物活性的征象的患者，这些包括：完全和部分反应者(CR、PR)、稳定的疾病(SD)、具有混合的反应1(MxR1)的渐进性疾病(PD)和消失了至少一个靶病灶的PD MxR2。
非反应者(NR)：没有MxR的PD、没有表现出至少一个靶病灶的消失的PD MxR2和不具有MxR的渐进性疾病。
在该临床研究的2组(对比2种免疫佐剂)中的训练集分布由22位R(14位在AS15组中，8位在AS02B组中)和34位NR(13位AS15，21位AS02B)组成。
样品标准化
在RNA的扩增和标记以后，进行与HG-U133 plus2 AffymetrixGeneChip的杂交。在来自Bioconductor的gcrma包中，使用GCRMA算法(Wu，2004)的改进版本，使用具有好质量微阵列数据的所有患者(基于定标因子和gcrma标准化)，标准化在扫描以后得到的CEL文件。该算法适合存储使用该阵列集合得到的预处理参数。所述参数分成2类：分位数标准化所必需的平均经验分布，和用于进行探针集合(PS)总结的探针-特异性的效应。这些参数从65个样品得到，并应用于训练集中的56个样品中，以得到每个探针集合的总结值。
1.4 缺失/存在和非特异性过滤
使用PANP程序(1.8.0软件版)的R实现，去除在用于标准化的所有65个样品中调用缺失(Absent)的Affymetrix探针集合(PS)。这使数据集从54,613个减少至约28,100个PS。
独立于与每个样品有关的结果，过滤标准化的杂交样品的四分位距(IQR)过滤的探针集合(PS)。该非特异性过滤的目的是，去除在样品之间表现出大致恒定的表达的基因，因为它们倾向于提供微不足道的鉴别力(Heidebreck等，2004)。
执行四分位过滤器，其仅保留在训练集(56个样品)的表达矩阵中具有等于或高于1.7的四分位距的PS。该步骤使PS大小从28,100减少至约5045。
特征标准化
随后，使用Z-得分计算，标准化所述总结的和过滤的PS。如下计算每个单个患者表达PS值的Z-得分：从PS值减去PS-特异性的均值，然后用PS-特异性的标准差加权该以均值为中心的表达值。在Z-得分计算中涉及的PS-特异性的均值和标准差是从训练集计算出的那些。
特征选择
要用作临床结果患者数据的分类的特征的有关PS的选择由信噪比得分组成，其使用训练集中的56个样品的标准化的和z-评分的表达矩阵得到：
s 2 n = x &OverBar; R - x &OverBar; NR sd R + sd NR
＝反应者的均值
＝非反应者的均值
sdR＝标准偏差反应者
sdNR＝标准偏差非反应者
选择100个具有最高绝对信噪比得分的PS作为分类器特征(表1)。估测该数字是适当的，因为它是用另一种技术(即Q-RT-PCR)测量的可行基因数目。
通过在下一部分中描述的交叉验证，测试上述基因选择方法。
分类方法的留出一个交叉验证(LOOCV)
为了估测所述方法的性能和选择分类器的适当截止值，使用留出一个的交叉验证开发和测试了分类方案，并在每个交叉验证环中重新计算报告列表。
首先，应用非特异性的过滤器，其抛弃具有小于1.7的四分位距(IQR)的探针集合(PS)(在每个交叉验证中保留约5000个PS)。随后，在每个训练集内进行Z-得分标准化，并应用于实验样品。如Golub等(Golub，1999)所述，使用信噪比(s2n)对基因排序，并选择最好的100个PS(绝对s2n得分)为分类器特征。
使用选择的PS，构建基于有监督的主成分-判别分析(SPCA)的分类算法(Bair和Tibshirani，PLOS Biol 2004和Tibshirani等，PNAS2002)。该分类器是基于仅具有被选为分类器特征的PS的训练集的表达矩阵的奇异值分解。计算在第一主要成分(PC1)中训练集的每个组(R和NR)的均值和标准差。为了分类实验样品，它的z-评分的表达值在由训练集定义的PC1中突出，并使用PC1至每个组的均值的距离来计算样品属于反应者或非反应者组的可能性。所述分类器结果因而是这样的指数：所述指数是样品为反应者(GS+)的可能性，范围为0-1。
图1/21显示了LOOCV的方案。
图2/21显示了LOOCV的结果，所述LOOCV在每个循环中选择最好的100个PS用于分类。
使用灵敏度(Se)和特异性(Sp)作为性能指标。Se被定义为真阳性(TP)在被预测为反应者的样品中的比例，Sp被定义为真阴性(TN)在被预测为非反应者的患者中的比例。
从图2/21可以看出，在0.41至0.47之间的任意值具有相同的灵敏度和特异性。决定采用0.43的截止值。该截止值会将32/56个样品分类为反应者(R)，灵敏度是17/22(0.77)，特异性是19/34(0.56)。值得注意的是，仅在AS 15组中的灵敏度和特异性较高；分别是0.79和0.69。重要的是，所有客观反应者(CR和PR)都被正确地分类。
将通过LOOCV构建出的56个分类器中的每一个的选择的特征的稳定性与使用所有样品选择的特征相对比。
表1A.使用所有样品选择的100个PS和在LOOCV中选择的次数
Figure BPA00001546662600981
Figure BPA00001546662601001
*：来自R2.6的注解，其在R2.9中变成NA
图3/21显示了PS在每个LOOCV中在前100个s2n内的次数。用黑色指示也使用所有样品选择的PS。使用所有样品选择的100个PS中的68个，也在至少50个LOOCV中被选出，使用所有样品选择的100个PS的列表，是将用于预测独立患者的反应的分类器特征(表1)。
基因标记对总存活数(OS)的影响
在Cox回归中，危险代表在一段时间内发生事件(死亡、疾病进展)的可能性。假定基线危险为所有样品所共有，向该模型中添加协变量，它们是对危险具有影响的说明变量。危险比会量化协变量对危险的影响。它会反映变量的相对危险度。
例如，危险比为0.4(如在下面的表2中所示)的治疗是指，基因标记阳性的患者与基因标记阴性的患者相比，在每个时间段内具有降低了60％的死亡风险。应当指出，0.4是预期的HR的均值，在该模型中也估测95％的置信区间。
图4/21显示了所有患者在II期黑素瘤试验中通过佐剂得到的OS的卡普兰-迈耶曲线(KM)；危险比(HR)：0.55(95％CI[0.28；1.06])。
当仅使用训练集中的56位患者时，估测的危险比是0.41(95％CI[0.191；0.88])。为了估测GS对总存活数(OS)影响，使用通过LOOCV得到的分类，其具有0.43的截止值(1.4部分)；图5/21中的图显示了通过GS得到的OS的KM。
拟合多变量Cox-模型(使用佐剂和GS作为协变量)，产生GS的下述HR：
Figure BPA00001546662601011
通过GS估测的生存中值时间是：
Figure BPA00001546662601012
在图6/21中显示了基于LOOCV分类通过佐剂和基因标记得到的总存活数卡普兰-迈耶曲线，HR如下。
Figure BPA00001546662601013
如以上所讨论的，已经开发了基于给定的基因表达谱来预测对MAGE-A3 ASCI的临床反应的分类器，并在II期黑素瘤试验(GSK249553/008)中交叉验证。使用LOOCV估测了分类器性能，得到0.77的灵敏度和0.56的特异性。在AS15组中的特异性仅为0.79，灵敏度为0.69。该分类导致GS+群体中的总存活数的危险比显著降低，在AS15组中具有更重要的作用。
也评价了分类器特征选择的稳定性，发现可以稳健地去除训练集中的一个样品。与MAGE-A3-ASCI(使用训练集中的所有56位患者通过s2n鉴定的前100个PS；表1)的临床效力相关联的标记的生物学与ASCI作用模式有关，因为它含有这样的基因：所述基因提示特定肿瘤微环境(趋化因子)的存在，所述肿瘤微环境有利于免疫效应细胞在反应者患者的肿瘤中的存在，所述患者表现出T-细胞标志物的增量调节。最近在转移性黑素瘤中的基因表达绘谱研究揭示，基于T-细胞相关转录物的存在与否，可以分开肿瘤(Harlin，2009)。淋巴细胞在肿瘤中的存在，与6种趋化因子子集(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10)的表达相关联，这6个基因中的3个(CCL5、CXCL9、CXCL10)存在于100个PS中。令人感兴趣地，也发现HLA分子在反应者患者中被增量调节。已经假定，HLA分子在肿瘤细胞中的减量调节可能是避免免疫监督的机制(Aptsiauri，2008)。
来自Ingenuity途径分析的最高生物学功能证实了免疫相关基因在100个PS标记中的富集(p-值是为子函数得到的范围)：
4.新样品的临床结果预测
这里描述的进行临床结果预测的步骤已经书写为R脚本。在进行给定的患者的临床结果预测之前，进行患者Affymetrix基因芯片数据的2个连续标准化：样品和基因标准化。这些标准化的目的是，通过正确地定标至用于开发出预测方案的训练集数据，产生可比较的患者基因表达值。训练集由来自II期黑素瘤试验的56个样品组成。关于训练集和样品标准化的细节，已经在前述部分中描述，并在下述段落中进一步详细描述。
4.1 样品标准化
从每个样品的CEL文件开始，进行样品标准化(也称作预处理)，并注意下述方面：
1.校正背景粗的Affymetrix寡核苷酸探针强度；
2.使用分位数标准化规程，标准化背景校正的探针强度。
3.按照在芯片定义文件(Chip Definition File，CDF)中定义的探针-至-PS映射，将探针强度转化成单个探针集合强度。CDF文件是对Affymetrix所使用和提供的基因芯片阵列(hgu133plus2)特异性的。该最后一个步骤称作总结。
该步骤的目标是，将未知患者数据的探针集合(PS)强度的分布拟合至训练集的PS强度分布。这使用GCRMA算法(Wu，2004)来完成。该算法适用于补偿在参照微阵列数据集上定义的预处理参数。所述参数分成2类：分位数标准化所必需的平均经验分布，和用于进行PS总结的探针-特异性的效应。
用来自II期黑素瘤试验研究的65个样品构建参照GCRMA参数，并使用基于refplus R包的代码，将它们应用于新患者样品。
附录1代码知识块是可在Bioconductor中得到的RefPlus R包(Harbron等，2007)中包含的代码的改进。该RefPlus代码被改进，以执行给定的样品杂交的GCRMA标准化，并考虑从参照数据集计算出的标准化参数。参照数据集是在以前的部分(65位患者)中描述的数据集。RefPlus最初为参照数据集标准化而设计，但是使用RMA算法而不是GCRMA。RMA和GCRMA之间的唯一差别在于背景校正步骤。RefPlus能够执行GCRMA背景校正，这通过将嵌入rmaplus R函数中的bg.correct.rma R函数替换为bg.adjust.gcrma R函数来实现。RefPlus代码修改是在2007年10月进行，并且可从GlaxoSmithKline得到。为了用附录1的GCRMA-能实现的、改进的RefPlus代码标准化样品，必须调用GCRMA背景校正能实现的-rmaplus函数，该函数除了使用用于标准化的数据(属于AffyBatch类别)作为参数以外，还使用在参照数据集上计算出的参照分位数(r.q选项)和探针效应(p.e选项)作为参数。参照分位数和探针效应被包含在rq.txt和pe.txt文件中，它们可从GSK得到，并在如上提及的光盘上呈送至美国专利和商标局(USPTO)。
为了用附录1的GCRMA-能实现的、改进的RefPlus代码(图5)标准化样品，必须调用GCRMA背景校正能实现的-rmaplus函数，该函数除了使用用于标准化的数据(属于AffyBatch类别)作为参数以外，还使用在参照数据集上计算出的参照分位数(r.q选项)和探针效应(p.e选项)作为参数。参照分位数和探针效应被包含在rq.txt和pe.txt文件中，它们可从GSK的公司知识产权办公室(Head of CorporateIntellectual Property at GSK)得到，分别被命名为VR63933P_rq.txt和VR63933P_pe.txt。这些文件还已经在光盘上呈送至美国专利和商标局，具有2009年10月6日提交的美国优先权申请系列号61/278387，且可以通过在可利用的时间从美国专利和商标局订购美国系列号61/278387的文件历史来得到。
同时，这些文件也可作为zip文件在https://sites.google.com/site/vr63933/vr63933r_files得到(注意，在https地址的字母“r”和单词“files”之间存在“_”)。在网站上的文件分别被命名为VR63933P_rq.zip和VR63933P_pe.zip。为了得到这2个文件的拷贝，浏览至在该段落中提供的地址，并选择每个文件的超文本“Download”。在提示框中选择“Save”选项，并保存至希望的位置。象通常打开zip文件一样，打开所述文件，并在希望的位置将它们保存为ASCII(.txt)文件。然后，遵循在本申请的前2段中的指令。
随后使用Z-得分计算，标准化总结的探针集合(PS)；这适用于被选择为分类器特征的PS。该第二标准化步骤的目的是，使在数据中具有类似表达模式但是具有不同绝对表达值范围的基因相同。
如下计算每个单个患者表达PS值的Z-得分：从PS值减去PS-特异性的均值，然后用PS-特异性的标准差加权该以均值为中心的表达值。在Z-得分计算中涉及的PS-特异性的均值和标准差是从训练集计算出的那些(表4)。
已经用训练集参数标准化患者粗数据以后，可以对它们进行决策规则(分类器或分类方案)，用于预测患者的临床结果。
4.2 新样品的分类算法
为了基于标准化的患者PS来预测患者临床结果，应用有监督的主成分(SPCA)-判别分析(DA)决策规则(改进自Bair，2004；Tibshirani，2002)。包含SPCA-DA工作的预测过程如下：
●用于分类的探针集合仅是分类器特征(100个PS)，并在基于训练集的模型开发中鉴定出(表1)
●用于分类的患者的标准化的表达谱(分类器特征)在由训练集定义的第一主要成分(PC1)空间中突出，其中使用分类器特征的线性组合(通过训练集的奇异值分解，得到线性组合中的每个特征的系数，它们提供在表4中)
●使用下述方程式，得到PC1中的实验样品距离反应者和非反应者组的均值的标准化距离：
d iK = | PC 1 i - mean _ PC 1 K | sd _ PC 1 K
i＝实验样品
K＝反应者(R)或非反应者(NR)
mean_PC1K＝训练集中的R或NR组的PC1均值
sd_PC1K＝训练集中的R或NR组的PC1标准差
●训练集中的每个组的均值和sd(四舍五入至3位有效数字)是：
  mean_PC1R   -4.622
  sd_PC1R   5.727
  mean_PC1NR   2.991
  sd_PC1NR   7.051
●用下式得到每个样品的指数(样品是反应者的概率)：
P R = e - d iR 2 e - d iR 2 + e - d iNR 2
●如果它的PR大于0.43，则样品分类为基因标记阳性的(反应者，R)。
为了例证该方法的目的，将该分类器应用于训练集，产生图7/21。
用于预测新样品的算法
Figure BPA00001546662601062
Figure BPA00001546662601071
Figure BPA00001546662601081
其中
-testset是一个具有100行的矩阵，所述行含有100个PS的标准化的微阵列数据
-M8.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.100个PS的字符列表
2.训练集中的每个PS的100平均值的向量
3.训练集中的每个PS的100sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的100行和56列的矩阵
5.训练集中的反应者组的PC1平均值
6.训练集中的反应者组的PC1sd值
7.训练集中的非反应者组的PC1平均值
8.训练集中的非反应者组的PC1sd值
表4：100个PS分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  均值   Sd   PC1
  213793_s_at   6.638   1.437   0.0827
  223593_at   4.245   1.721   0.0698
  225996_at   5.369   2.116   0.0625
  204556_s_at   3.515   1.49   0.0594
  223575_at   5.664   1.785   0.0556
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  201474_s_at   4.506   1.331   0.0376
  222962_s_at   5.177   1.139   0.0372
  236328_at   7.034   1.936   0.0339
  均值   Sd   PC1
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  228400_at   3.458   1.437   0.0279
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  226084_at   9.153   1.388   0.0234
  205499_at   4.675   1.719   0.0002
  234907_x_at   3.95   1.465   -0.0051
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  219551_at   4.637   1.569   -0.0789
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  208729_x_at   10.389   1.419   -0.106
  207536_s_at   4.073   1.75   -0.1061
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  1554240_a_at   4.02   1.761   -0.1068
  207795_s_at   3.698   1.803   -0.1073
  202659_at   6.944   1.284   -0.1077
  210606_x_at   3.915   1.892   -0.1083
  235276_at   7.632   1.905   -0.1084
  208885_at   10.544   1.865   -0.1084
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  1555759_a_at   4.213   1.638   -0.1133
  均值   Sd   PC1
  204224_s_at   9.809   1.798   -0.1137
  202644_s_at   8.64   1.472   -0.114
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  229625_at   7.32   2.116   -0.1197
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  210915_x_at   6.533   2.733   -0.1267
  211796_s_at   6.946   2.921   -0.1271
  205758_at   7.338   3.285   -0.1275
实施例2。
使用Q-RT-PCR数据的黑素瘤分类器
在含有来自100个PS(83个基因)的22个基因和用于标准化的5个参照基因(GUSB、PGK1、H3F3A、EIF4G2、HNRNPC)(表3)的定制Taqman低密度阵列(ABI，PN 4342259)中，测试了用于通过微阵列进行基因表达绘谱的RNA。
为了该分析，包括共54个黑素瘤样品(52个也用于微阵列分析，另外2个的微阵列杂交不具有良好质量)。
表5.用于构建黑素瘤样品的基于PCR的分类器的22个基因+参照基因的ABI Taqman试验数目
Figure BPA00001546662601111
在20μl含有1x第一链缓冲液、0.5mM每种dNTP、10mM二硫苏糖醇、20U rRNA酶抑制剂(Promega目录号N2511)、250ng随机六聚体和200U M-MLV逆转录酶(Life Technologies目录号28025-013)的混合物中，在42℃进行来自500ng(OD260测量结果)总RNA的cDNA合成1小时30分钟。将与200ng总RNA相对应的cDNA混合在含有TaqMan缓冲液、5mM MgCl2、0.4mM dUTP、0.625U Ampli Taq Gold DNA聚合酶、0.05 U UNG的200μl总体积中，并根据生产商的推荐，装载进TaqMan低密度阵列中。在Applied Biosystem7900HT上运行Taqman低密度阵列。扩增谱是：1个在50℃2min的循环，1个在94.5℃10min的循环，和40个在97℃30s并在59.7℃1min的循环。使用SDS 2.2软件(ABI)，分析粗数据。使用自动基线得到Ct值，并使用0.15作为阈值。
使用22个基因Q-PCR数据的SPCA-DA分类的留出一个交叉验证：
开发了分类方案，并使用通过Q-PCR测得的所有22个基因(即没有分类器特征重新计算)，使用留出一个交叉验证进行了测试。
首先，在每个训练集内进行Z-得分标准化，并应用于实验样品。接着，构建应用于基于有监督的主成分-判别分析(SPCA-DA)的微阵列数据的相同分类算法，并应用于在该循环中剩下的每个样品(Bair和Tibshirai，PLOS Biol 2004和Tibshirani等，PNAS 2002)。
使用来自微阵列的0.43截止值，将33/54样品分类为GS+，灵敏度为85％(17/20)，特异性为53％(18/34)。象在微阵列中一样，AS15组具有更好的性能，92％灵敏度和57％特异性。
使用在PCR数据上计算出的0.47截止值，将31/54样品分类为GS+，灵敏度为85％(17/20)，特异性为59％(20/34)。
在PCR上测试的52个样品是在微阵列模型中。我们对比了在具有100个PS的LOO SPCA-DA微阵列(具有特征选择)上和在具有22个基因的LOO SPCA-DA PCR(没有特征选择)上的对应样品的分类，它们二者都具有0.43的概率截止值。在留出一个模型之间的样品分类的一致性是，52个样品中的49个在两种分类中具有相同的标签(错误分类的是边界样品)。
图8/21显示了用具有22个基因的LOO SPCA-DA PCR(没有特征选择)得到的分类器指数。
使用源自训练集的参数的新样品分类
为了基于分类器中的22个基因的Q-PCR表达水平来预测新患者临床结果，应用有监督的主成分(SPCA)-判别分析(DA)决策规则(改编自Bair，2004；Tibshirani，2002)，如以前关于基于实施例1的分类器的微阵列所示。
在已经使用参照基因标准化患者粗数据并进行对数转化(这将被称作表达矩阵)以后，可以对它们进行决策规则(分类器或分类方案)，用于预测患者的临床结果。
●使用来自训练集的均值和标准差(Sd)(表6)，对表达矩阵进行z-评分
●用于分类的患者的z-评分的标准化的表达谱(分类器特征)在由训练集定义的第一主要成分(PC1)空间中突出，其中使用分类器特征的线性组合(通过训练集的奇异值分解，得到线性组合中的22个特征中的每一个的系数，它们提供在表6中)。
表6：对于22个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  基因   均值   Sd   PC1系数
  C4orf7   -1.397   1.244   -0.1834
  CCL5   -0.545   0.691   -0.2441
  JAK2   -1.105   0.354   -0.1636
  IRF1   -0.430   0.500   -0.2345
  CXCL9   -0.276   0.923   -0.2349
  IL2RG   -0.657   0.721   -0.2444
  CXCL10   -0.830   0.896   -0.2181
  SLC26A2   -0.745   0.307   0.0660
  CD86   -1.504   0.461   -0.2272
  CD8A   -1.342   0.879   -0.1881
  UBD   -0.570   0.945   -0.2385
  GZMK   -1.470   0.734   -0.2414
  GPR171   -1.683   0.698   -0.2180
  PSCDBP   -1.335   0.647   -0.2212
  CXCL2   -2.163   0.633   -0.1437
  ICOS   -1.714   0.697   -0.2029
  TRBC1   -2.714   1.313   -0.2026
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   -0.762   0.666   -0.2464
  TARP；TRGC2   -2.405   0.877   -0.1904
  ITK   -1.862   0.896   -0.2178
  CD3D   -1.478   0.806   -0.2452
  HLA-DMA   -0.380   0.470   -0.2284
●使用下述方程式，得到PC1中的实验样品距离反应者和非反应者组的均值的标准化距离：
d iK = | PC 1 i - mean _ PC 1 K | sd _ PC 1 K
i＝实验样品
K＝反应者(R)或非反应者(NR)
mean_PC1K＝训练集中的R或NR组的PC1均值
sd_PC1K＝训练集中的R或NR组的PC1标准差
●训练集中的每个组的均值和sd(四舍五入至3位有效数字)是：
  mean_PC1R   -2.055
  sd_PC1R   2.920
  mean_PC1NR   1.210
  sd_PC1NR   3.951
●用下式得到每个样品的指数(样品是反应者的概率)：
P R = e - d iR 2 e - d iR 2 + e - d iNR 2
●如果它的PR大于0.47，则样品分类为基因标记阳性的(反应者，R)。
将该分类器应用于训练集，产生图9/21，该图表明，22个基因可以分类训练集，具有0.85(17/20)的灵敏度和0.59(20/34)的特异性、69％一致性。
Figure BPA00001546662601152
Figure BPA00001546662601161
Figure BPA00001546662601171
其中
-Testset.RData是一个具有22行的矩阵，所述行含有22个基因的标准化的对数表化的PCR数据
-M8.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.22个基因名称的字符列表
2.训练集中的每个基因的22平均值的向量
3.训练集中的每个基因的22sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的22行和22列的矩阵
5.训练集中的反应者组的PC1平均值
6.训练集中的反应者组的PC1 sd值
7.训练集中的非反应者组的PC1平均值
8.训练集中的非反应者组的PC1 sd值
实施例3
使用通过PCR评估的23个基因子集分类NSCLC样品
背景：NSCLC II期临床试验。
这是在完全外科手术切除肿瘤以后的MAGE-A3阳性的、IB和II期NSCLC患者中进行的双盲安慰剂对照的概念验证试验(CPMS249553/004)。ASCI剂(抗原-特异性的癌症免疫治疗剂)是与蛋白-D和Hist-尾巴融合的重组MAGE-A3融合蛋白。它与AS02B免疫学佐剂相组合。AS02B是QS21和MPL的水包油乳剂。QS21是一种来自南美洲树Quillaja Saponaria Molina的纯化的、天然存在的皂苷分子，MPL 3脱-O-乙酰化的单磷酰基脂质A-脂质A的去毒化的衍生物，源自S.minnesota LPS。该双盲的、随机化的、安慰剂对照的试验用于评价复发时间(图11/21)。
图10/21显示了NSCLC II期试验设计。在2年中登记了共182位具有MAGE-A3-阳性的、完全切除的、IB或II期NSCLC的患者，并随机分配，以接受ASCI靶向的MAGE-A3或安慰剂(2∶1比例)。在27个月的时段内，施用最大13剂。在从切除日期28个月的中间随访期以后，进行主要分析，并在2006年11月发表。
该试验提供了癌症免疫治疗在该患者群体中的活性的第一证据。在主要分析时，67位患者已经表现出疾病复发：41位recMAGE-A3+AS02B ASCI组中(33.6％)，26位在安慰剂组中(43.3％)。使用Cox回归分析来计算无疾病期间(DFI)的相对改善，同时考虑每位患者的各个事件发生时间。结果证实了与安慰剂相比在接受ASCI的组中在28个月中间随访以后癌症复发风险的27％相对降低(危险比＝0.73；CI＝0.44-1.2；p＝0.108，单侧时序试验)(图11/21)。
无病存活(DFS)和总存活数(OS)的危险比分别是0.73(CI：0.45-1.16)和0.66(CI＝0.36-1.20)。
在最后分析时(2007年12月至44个月的中间随访)，进一步证实了这些结果：DFI的HR0.75(CI＝0.46-1.23)，DFS的0.76(CI＝0.48-1.21)和OS的0.81(CI＝0.47-1.40)。
图11/21显示了NSCLC试验的无疾病期间的卡普兰-迈耶曲线。使用来自该研究的样品，测定黑素瘤标记作为在该患者群体中预测ASCI-治疗临床反应的潜在生物标志物的用途。
使用PCR数据分类NSCLC样品：
使用来自100个PS的23个基因子集(表-1)，构建LOO分类器，其使用来自MAGE-A3NSCLC临床试验(MAGE004；GlaxoSmithKline)的样品。
表7.用于构建NSCLC样品的基于PCR的分类器的23个基因的ABI Taqman试验数目(参照基因与实施例2中的黑素瘤分类器相同)
Figure BPA00001546662601191
方法
使用来自MAGE-A3NSCLC临床试验(MAGE004；GlaxoSmithKline)的129个肿瘤样本(疫苗接种前)。这些是在RNAlater(一种RNA稳定化溶液)中保存的新鲜冷冻样品。使用Tripure方法(Roche目录号1 667 165)，纯化总RNA。遵循推荐的方案，随后使用RNeasy Mini试剂盒——具有DNA酶处理的清扫方案(Qiagen目录号74106)。使用在260nm的光密度，初步完成RNA的定量。
在20μl含有1x第一链缓冲液、0.5mM每种dNTP、10mM二硫苏糖醇、20U rRNA酶抑制剂(Promega目录号N2511)、250ng随机六聚体和200U M-MLV逆转录酶(Life Technologies目录号28025-013)的混合物中，在42℃进行来自500ng总RNA的cDNA合成1小时30分钟。将与200ng总RNA相对应的cDNA混合在含有TaqMan缓冲液、5mM MgCl2、0.4mM dUTP、0.625U Ampli Taq GoldDNA聚合酶、0.05U UNG的200μl总体积中，并根据生产商的推荐，装载进TaqMan低密度阵列中。
在Applied Biosystem 7900HT上运行Taqman低密度阵列。扩增谱是：1个在50℃2min的循环，1个在94.5℃10min的循环，和40个在97℃30s并在59.7℃1min的循环。使用SDS 2.2软件(ABI)，分析粗数据。使用自动基线得到Ct值，并使用0.15作为阈值。
使用23个基因Q-PCR数据的SPCA-Cox分类的留出一个交叉验证：
该临床试验含有安慰剂和治疗组，开发了一种分类器，其使用无病期间(DFI)来估测风险评分，这是基于治疗和基因谱之间的相互作用(总结为主要成分1)的Cox比例危害模型，并以治疗、基因谱、阶段、外科手术和组织学类型作为协变量。
使用5个参照基因的几何平均数，标准化每个基因的Ct值，并进行对数转化。随后，通过每个训练集中的Z-得分，标准化所述基因，并将这些参数应用于试验集。
在z-得分标准化以后，在训练集中进行奇异值分解(SVD)，以得到第一主要成分(PC1)。该第一成分用于具有与治疗的相互作用的Cox回归中，以估测训练集中的协变量系数；针对组织学、阶段和外科手术效应的类型，调节所述Cox回归。将来自该回归的系数用于计算训练集和实验样品(留出的样品)中的风险评分。将训练集的中间风险评分用作截止值，以调用患者基因标记(GS)+或基因标记(GS)-。该方法称作Cox-SPCA，并图解在图12/21中。
图13/21和14/21分别显示了基于LOOCV分类的基因谱的存活曲线，其中使用中位值作为在安慰剂和疫苗组中的截止值和风险评分分布。风险评分分布如下：
Figure BPA00001546662601211
使用Cox-SPCA算法的新样品分类
为了基于分类器中的23个基因的Q-PCR表达水平来预测新患者临床结果，应用有监督的主成分(SPCA)-Cox决策规则：
在已经使用参照基因标准化患者粗数据并进行对数转化以后，可以对它们进行决策规则(分类器或分类方案)，用于预测患者的临床结果。
●使用来自训练集的参数(表8)，对表达矩阵进行z-评分
表8.23个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  基因   均值   sd   PC1系数
  C4orf7   -2.35768   1.455544   -0.12114
  CCL5   -0.9599   0.350039   -0.23097
  JAK2   -1.36811   0.260374   -0.19931
  IRF1   -0.52347   0.276644   -0.2256
  CXCL9   -0.87804   0.563437   -0.21386
  IL2RG   -0.83528   0.358042   -0.24997
  CXCL10   -1.36857   0.615177   -0.17136
  SLC26A2   -1.44043   0.255169   -0.05637
  CD86   -1.7699   0.499237   -0.13267
  CD8A   -1.33733   0.375334   -0.25173
  UBD   -0.71367   0.546652   -0.21295
  GZMK   -1.77411   0.529496   -0.24628
  GPR171   -1.81327   0.32409   -0.19376
  PSCDBP   -1.17746   0.387117   -0.24162
  CXCL2   -1.16947   0.696255   -0.09696
  ICOS   -2.15436   0.403522   -0.23497
  TRBC1   -2.62512   1.013281   -0.12679
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   -1.19671   0.3944   -0.25817
  TARP；TRGC2   -2.22752   0.481252   -0.19299
  ITK   -1.85777   0.394118   -0.26077
  CD3D   -1.64584   0.397626   -0.25514
  HLA-DMA   -0.81144   0.380465   -0.22948
  SLAMF7   -1.33744   0.464338   -0.21762
●用于分类的患者的z-评分的标准化的表达谱(分类器特征)在由训练集定义的第一主要成分(PC1)空间中突出，其中使用分类器特征的线性组合(通过训练集的奇异值分解，得到线性组合中的23个特征中的每一个的系数，它们提供在表8中)。
●使用下述方程式，计算新样品的风险评分：
其中从训练集得到B治疗＝-0.232051457
且BPC1相互作用＝0.176736586
将新样品的风险评分与训练集的中间风险评分＝-0.315324195相对比，如果风险评分低于该值，则将所述样品分类为GS+(反应者、不复发、1)。
图15/21和16/21显示了基于分类器中的23个基因的Q-PCR表达水平的临床结果。GS对HR的影响如下：
Figure BPA00001546662601222
Figure BPA00001546662601223
其中
-Testset.RData是一个具有23行的矩阵，所述行含有23个基因的标准化的对数表化的PCR数据
-M4.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.23个基因名称的字符列表
2.训练集中的每个基因的23平均值的向量
3.训练集中的每个基因的23sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的23行和23列的矩阵
5.风险评分计算中的B治疗
6.风险评分计算中的BPC1相互作用
7.训练集中的中间风险评分
实施例4
使用通过PCR评估出的22个基因子集分类NSCLC样品：
使用来自100个PS的22个基因子集(表-1)，构建LOO分类器，其使用来自MAGE-A3 NSCLC临床试验(MAGE004；GlaxoSmithKline)的样品。
表9.用于构建NSCLC样品的基于PCR的分类器的22个基因的ABI Taqman试验数目(参照基因与实施例2中的黑素瘤分类器相同)
Figure BPA00001546662601251
方法
使用来自MAGE-A3 NSCLC临床试验(MAGE004；GlaxoSmithKline)的137个肿瘤样本(疫苗接种前)。这些是在RNAlater(一种RNA稳定化溶液)中保存的新鲜冷冻样品。
使用Tripure方法(Roche目录号1 667 165)，纯化总RNA。遵循推荐的方案，随后使用RNeasy Mini试剂盒——具有DNA酶处理的清扫方案(Qiagen目录号74106)。使用在260nm的光密度，初步完成RNA的定量。
在20μl含有1x第一链缓冲液、0.5mM每种dNTP、10mM二硫苏糖醇、20U rRNA酶抑制剂(Promega目录号N2511)、250ng随机六聚体和200 U M-MLV逆转录酶(Life Technologies目录号28025-013)的混合物中，在42℃进行来自500ng总RNA的cDNA合成1小时30分钟。
将与200ng总RNA相对应的cDNA混合在含有TaqMan缓冲液、5mM MgCl2、0.4mM dUTP、0.625U Ampli Taq Gold DNA聚合酶、0.05U UNG的200μl总体积中，并根据生产商的推荐，装载进TaqMan低密度阵列中。
在Applied Biosystem 7900HT上运行Taqman低密度阵列。扩增谱是：1个在50℃2min的循环，1个在94.5℃10min的循环，和40个在97℃30s并在59.7℃1min的循环。使用SDS 2.2软件(ABI)，分析粗数据。使用自动基线得到Ct值，并使用0.15作为阈值。
使用22个基因Q-PCR数据的SPCA-Cox分类的留出一个交叉验证：
该临床试验含有安慰剂和治疗组，开发了一种分类器，其使用无病期间(DFI)来估测风险评分，这是基于治疗和基因谱之间的相互作用(总结为主要成分1)的Cox比例危害模型，并以治疗、基因谱、阶段、外科手术和组织学类型作为协变量。
使用5个参照基因的几何平均数，标准化每个基因的Ct值，并进行对数转化。随后，通过每个训练集中的Z-得分，标准化所述基因，并将这些参数应用于试验集。
在z-得分标准化以后，在训练集中进行奇异值分解(SVD)，以得到第一主要成分(PC1)。该第一成分用于具有与治疗的相互作用的Cox回归中，以估测训练集中的协变量系数；针对组织学、阶段和外科手术效应的类型，调节所述Cox回归。将来自该回归的系数用于计算训练集和实验样品(留出的样品)中的风险评分。将训练集的中间风险评分用作截止值，以调用患者GS+或GS-。该方法在其它文件中称作Cox-SPCA。该方法图解在图12/21中。
图17/21和18/21分别显示了基于LOOCV分类的基因谱的存活曲线，其中使用中位值作为在安慰剂和疫苗组中的截止值和风险评分分布。风险评分分布如下：
Figure BPA00001546662601271
使用Cox-SPCA算法的新样品分类
为了基于分类器中的22个基因的Q-PCR表达水平来预测新患者临床结果，应用有监督的主成分(SPCA)-Cox决策规则：
在已经使用参照基因标准化患者粗数据并进行对数转化以后，可以对它们进行决策规则(分类器或分类方案)，用于预测患者的临床结果。
●使用来自训练集的参数(表10)，对表达矩阵进行z-评分
表10.22个基因分类器特征的均值、标准差(Sd)和PC1系数
  基因   均值   Sd   PC1系数
  C4orf7   -2.37682   1.432191   -0.12613
  CCL5   -0.97196   0.363545   -0.23868
  JAK2   -1.38351   0.272662   -0.20067
  IRF1   -0.5328   0.284196   -0.23035
  CXCL9   -0.88518   0.561561   -0.21758
  IL2RG   -0.84755   0.369696   -0.25893
  CXCL10   -1.38526   0.608373   -0.17545
  SLC26A2   -1.45138   0.259368   -0.06122
  CD86   -1.78136   0.493304   -0.1445
  CD8A   -1.35019   0.38214   -0.26018
  UBD   -0.72426   0.545598   -0.21573
  GZMK   -1.7857   0.526042   -0.25378
  GPR171   -1.81382   0.353983   -0.1875
  PSCDBP   -1.19407   0.398912   -0.24969
  CXCL2   -1.17377   0.679063   -0.10145
  ICOS   -2.16745   0.40877   -0.24479
  TRBC1   -2.63145   0.999466   -0.12889
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   -1.20289   0.392963   -0.26276
  TARP；TRGC2   -2.27109   0.528402   -0.19113
  ITK   -1.87391   0.405727   -0.26852
  CD3D   -1.66653   0.409356   -0.26013
  HLA-DMA   -0.81888   0.400541   -0.23598
●用于分类的患者的z-评分的标准化的表达谱(分类器特征)在由训练集定义的第一主要成分(PC1)空间中突出，其中使用分类器特征的线性组合(通过训练集的奇异值分解，得到线性组合中的22个特征中的每一个的系数，它们提供在表10中)。
●使用下述方程式，计算新样品的风险评分：
Figure BPA00001546662601281
其中从训练集得到B治疗＝-0.193146993且BPC1相互作用＝0.163704817
将新样品的风险评分与训练集的中间风险评分＝-0.25737421相对比，如果风险评分低于该值，则将所述样品分类为GS+(反应者、不复发、1)。
图19/21和20/21显示了基于分类器中的22个基因的Q-PCR表达水平的临床结果。
Figure BPA00001546662601292
Figure BPA00001546662601301
其中
-Testset.RData是一个具有22行的矩阵，所述行含有22个基因的标准化的对数表化的PCR数据
-M4.train.parameters是含有下述项目的类列表的对象：
1.22个基因名称的字符列表
2.训练集中的每个基因的22平均值的向量
3.训练集中的每个基因的22sd值的向量
4.含有训练矩阵的svd分解的U矩阵的22行和22列的矩阵
5.风险评分计算中的B治疗
6.风险评分计算中的BPC1相互作用
7.训练集中的中间风险评分
实施例5
通过Q-PCR测得的黑素瘤样品中的单个基因的分类性能
使用应用于黑素瘤样品的多变量分类的算法，评价了来自实施例2的22个基因中的每一个的单变量分类性能，其中使用单个基因表达值替代第一主要成分。
在使用参照基因标准化表达值并进行z-得分以后，使用每个单个基因的表达水平来构建分类器，其中使用训练集中的所有样品。计算训练集中的每个基因的差别表达的t-检验p-值以及反应者相对于非反应者的倍数变化。得到训练集中的每个样品是反应者的概率，通过使临床标记的一致性最大化，测定每个基因的最佳截止值，结果显示在下表中：
表11
  基因   一致性(％)   t-检验p-值   倍数变化
  CCL5   72   0.003   3.7
  JAK2   67   0.010   1.8
  IRF1   72   0.004   2.5
  CXCL9   76   0.010   4.6
  IL2RG   69   0.006   3.5
  CXCL10   69   0.004   5.2
  SLC26A2   63   0.030   0.7
  CD86   67   0.049   1.8
  CD8A   74   0.095   2.6
  UBD   70   0.001   7.0
  GZMK   67   0.023   2.9
  GPR171   65   0.084   2.2
  PSCDBP   65   0.005   3.1
  CXCL2   83   0.003   3.3
  ICOS   67   0.004   3.5
  C4orf7   74   0.008   8.2
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   72   0.001   4.1
  TARP；TRGC2   70   0.003   5.1
  ITK   76   0.062   3.0
  TRBC1   74   0.076   4.5
  CD3D   69   0.011   3.7
  HLA-DMA   70   0.012   2.1
单个基因所得到的结果与在实施例2中使用所有基因在多变量分类中得到的69％的一致性百分比相当。
实施例6
通过Q-PCR测得的NSCLC样品中的单个基因的分类性能
使用应用于NSCLC样品的多变量分类的算法(Cox-SPCA)，评价了来自实施例3的23个基因中的每一个的分类性能，其中使用单个基因表达值替代第一主要成分。
在使用参照基因标准化表达值并进行z-得分以后，使用每个单个基因的表达水平来构建分类器，如在实施例3中所述。得到训练集中的每个样品的风险评分，并基于不同的截止值，将样品指定为GS+或GS-。通过计算与每个GS+和GS-组中的该截止值有关的治疗HR，评估每个截止值的性能。通过使分类的相互作用系数最大化(也就是说，使GS+和GS-的治疗HR之间的差异最大化)，单独地测定每个基因的最佳截止值。下表显示了使用该优化过程得到的GS+和GS-的治疗HR以及与那些HR有关的p-值。
表12
  基因   GS+HR   GS+p-值   GS-HR   GS-p-值
  C4orf7   0.182   0.03   1.133   0.71
  CCL5   0.169   0.04   1.061   0.86
  JAK2   0.427   0.091   0.992   0.98
  IRF1   0.521   0.088   1.567   0.46
  CXCL9   0.166   0.027   1.040   0.91
  IL2RG   0.244   0.056   1.162   0.66
  CXCL10   0.648   0.2   1.607   0.57
  SLC26A2   0.680   0.25   1.910   0.35
  CD86   0.479   0.13   1.159   0.7
  CD8A   0.209   0.024   1.204   0.6
  UBD   0.230   0.016   1.413   0.37
  GZMK   0.086   0.0082   1.364   0.37
  GPR171   0.402   0.045   1.715   0.23
  PSCDBP   0.340   0.025   1.514   0.28
  CXCL2   0.635   0.16   2.476   0.26
  ICOS   0.585   0.13   2.122   0.2
  TRBC1   0.387   0.12   1.101   0.78
  TRA；TRAJ17；TRDV2；TRAC；TRAV20   0.288   0.026   1.413   0.36
  TARP；TRGC2   0.747   0.51   1.003   1
  ITK   0.152   0.039   1.167   0.65
  CD3D   0.217   0.033   1.202   0.59
  HLA-DMA   0.394   0.17   1.094   0.79
  SLAMF7   0.354   0.029   1.222   0.63
实施例7
通过微阵列测得的黑素瘤样品中的单个基因的分类性能
使用应用于黑素瘤样品的多变量分类的算法，评价了来自实施例1的100个PS中的每一个的单变量分类性能，其中使用单个基因表达值替代第一主要成分。
在标准化表达值(gcrma)并进行z-得分以后，使用每个单个PS的表达水平来构建分类器，其中使用训练集中的所有样品。计算训练集中的每个PS的差别表达的t-检验p-值以及反应者相对于非反应者的倍数变化。得到训练集中的每个样品是反应者的概率，通过使临床标记的一致性最大化，测定每个基因的最佳截止值，结果显示在下表中：
表13
  探针集合   一致性(％)   p-值t-检验   FC
  225996_at   71   0.0002   0.2
  205890_s_at   75   0.0002   7.4
  223575_at   75   0.0002   0.3
  232481_s_at   73   0.0011   0.3
  213793_s_at   77   0.0004   0.4
  217436_x_at   77   0.0004   2.1
  228400_at   70   0.0025   0.4
  204116_at   73   0.0005   5.4
  232375_at   75   0.0005   2.4
  244393_x_at   70   0.0007   0.4
  215806_x_at   75   0.0004   3.6
  221875_x_at   75   0.0005   2.2
  1555852_at   79   0.0010   3.1
  208729_x_at   75   0.0007   2.4
  204806_x_at   75   0.0006   2.2
  211144_x_at   75   0.0006   3.4
  222838_at   73   0.0018   4.6
  211911_x_at   79   0.0008   2.4
  208894_at   71   0.0018   2.6
  203915_at   71   0.0023   6.5
  226084_at   79   0.0007   0.4
  216920_s_at   75   0.0010   3.1
  236328_at   75   0.0008   0.3
  1562031_at   77   0.0012   2.5
  212671_s_at   71   0.0018   3.9
  204533_at   68   0.0018   6.0
  207795_s_at   75   0.0009   3.0
  217478_s_at   73   0.0020   2.4
  209606_at   73   0.0014   3.3
  201474_s_at   71   0.0037   0.5
  211796_s_at   73   0.0019   5.3
  204070_at   71   0.0017   3.6
  204556_s_at   68   0.0031   0.4
  1554240_a_at   75   0.0012   2.9
  235276_at   71   0.0022   2.9
  202659_at   73   0.0018   2.1
  210982_s_at   71   0.0028   2.5
  205758_at   70   0.0020   6.5
  211149_at   66   0.0042   0.3
  237515_at   68   0.0024   0.4
  探针集合   一致性(％)   p-值t-检验   FC
  210972_x_at   68   0.0019   3.8
  231229_at   71   0.0018   0.4
  208885_at   68   0.0031   2.8
  211339_s_at   71   0.0022   3.2
  235175_at   73   0.0026   3.5
  229391_s_at   73   0.0037   3.3
  214470_at   64   0.0030   2.7
  210915_x_at   73   0.0031   4.5
  AFFX-HUMISGF3A/M97935_MB_at   71   0.0033   2.3
  206082_at   75   0.0027   3.1
  228362_s_at   73   0.0040   3.6
  1562051_at   63   0.0076   0.4
  205097_at   68   0.0028   0.4
  229625_at   70   0.0032   3.2
  228532_at   70   0.0044   2.4
  222962_s_at   71   0.0036   0.5
  209774_x_at   73   0.0032   2.9
  238524_at   73   0.0030   2.4
  202643_s_at   66   0.0034   2.1
  232234_at   73   0.0030   3.4
  204897_at   68   0.0044   2.4
  232311_at   70   0.0037   2.2
  229543_at   73   0.0051   3.3
  202531_at   71   0.0031   2.7
  210606_x_at   71   0.0028   2.8
  207651_at   75   0.0036   3.9
  209813_x_at   73   0.0028   2.7
  228492_at   64   0.0059   0.2
  219551_at   71   0.0031   2.4
  1555759_a_at   75   0.0031   2.4
  205499_at   66   0.0063   0.4
  1552613_s_at   66   0.0048   1.9
  228316_at   70   0.0041   0.5
  210439_at   70   0.0042   2.6
  234907_x_at   77   0.0029   2.2
  211902_x_at   70   0.0035   2.9
  205685_at   71   0.0049   2.5
  213193_x_at   73   0.0044   4.3
  1552612_at   70   0.0054   2.6
  1552497_a_at   70   0.0034   3.3
  223593_at   75   0.0068   0.4
  200615_s_at   71   0.0041   0.5
  206666_at   66   0.0050   4.1
  204529_s_at   70   0.0037   3.1
  1563473_at   66   0.0050   3.3
  1553132_a_at   73   0.0033   2.0
  229390_at   71   0.0064   3.2
  探针集合   一致性(％)   p-值t-检验   FC
  213539_at   68   0.0058   4.3
  244061_at   66   0.0043   2.8
  209770_at   68   0.0047   1.8
  238587_at   66   0.0088   1.9
  207536_s_at   71   0.0037   2.6
  221081_s_at   64   0.0070   2.8
  209671_x_at   71   0.0041   3.0
  239012_at   68   0.0069   2.3
  229152_at   68   0.0052   5.3
  202644_s_at   66   0.0065   2.1
  238581_at   71   0.0048   2.6
  231577_s_at   75   0.0065   2.7
  204224_s_at   64   0.0091   2.4
单个PS所得到的结果与在实施例1中使用所有基因在多变量分类中得到的68％的一致性百分比相当。
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Claims (32)

1.一种将患者表征为治疗的反应者或非反应者的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)分析患者来源的样品中表1的一个或多个基因的基因产物的差别表达，和
(b)基于步骤(a)的结果，将样品的来源患者表征为反应者或非反应者，
其中通过参照或对比标准或训练集，或使用从标准或训练集得到其参数的算法，进行表征步骤。
2.一种治疗患者的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)得到患者来源的样品中表1的一个或多个基因的基因产物的差别表达的分析结果，其中所述结果将患者表征为免疫治疗的反应者或非反应者，且其中通过参照或对比标准或训练集，或使用从标准或训练集得到其参数的算法，进行表征步骤；和
(b)如果所述患者被表征为免疫治疗的反应者，则选择所述患者进行适当免疫治疗的至少一种施用。
3.一种测定患者是否是免疫治疗的反应者或非反应者的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)得到患者来源的样品；和
(b)分析患者来源的样品中表1的一个或多个基因的基因产物的差别表达，其中所得结果确定所述患者是否被表征为免疫治疗的反应者或非反应者，且通过参照或对比标准或训练集，或使用从标准或训练集得到其参数的算法，进行表征步骤。
4.在根据权利要求1-3中的任一项中要求保护的方法，其中表1的一个或多个基因是在表1中列出的至少63个基因或在表2、5或7中指出的基本上所有的基因。
5.一种将患者表征为治疗的反应者或非反应者的方法，所述方法包括：分析患者来源的样品中被表1中列出的一个或多个探针集合识别的基因产物，所述探针集合的靶序列显示在表3中，
其中通过参照或对比标准或训练集，或使用从标准或训练集得到其参数的算法，进行表征步骤。
6.在权利要求5中要求保护的方法，其中表1的一个或多个探针集合是在表1中列出的探针集合中的至少74个，或表2、5或7中的基因的所有探针集合。
7.在权利要求1或3-6中任一项所定义的方法，所述方法包括下述额外步骤：鉴定患者为反应者，并选择所述患者进行治疗。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述标准是来自一位或多位患者的患者来源的一份或多份样品，其各自具有已知的临床结果。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述疗法或治疗是癌症免疫治疗，优选针对黑素瘤和/或肺癌的癌症免疫治疗。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症免疫治疗是MAGE。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述MAGE免疫治疗是MAGE A3免疫治疗。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中表1的一个或多个基因是在表1中列出的至少63个、至少68个、至少70个、至少75个、至少80个或基本上所有的基因和/或它们的任意组合。
13.根据权利要求5-11中任一项所述的方法，其中表1的一个或多个探针集合是在表1中列出的至少74个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个或所有的探针集合和/或它们的任意组合。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述一个或多个基因与它们的正常表达相比被增量调节。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中至少80％的所述基因与它们的正常表达相比被增量调节。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，所述方法另外包括下述步骤：测定所述基因产物是否被增量调节和/或减量调节。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述基因产物被增量调节和/或减量调节的测定指示反应者。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述基因是免疫相关基因。
19.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法包括：探针用于鉴定一种或多种基因产物的用途。
20.根据任一项前述权利要求所述的方法，所述方法包括：微阵列试剂盒或PCR用于分析基因表达的用途。
21.表1中的至少63个基因的基因列表或由其产生的数据或表1中的至少74个探针集合或由其产生的数据用于分析患者是否可能是诸如癌症免疫治疗等治疗的反应者或非反应者的用途。
22.根据在权利要求20中要求保护的用途，其中所述基因列表包含表1中的基本上所有的基因或探针集合或由其组成。
23.一种包含多核苷酸探针的微阵列，所述多核苷酸探针与至少一个基因的基因产物的序列互补且可杂交，所述基因选自在表1中列出的基因，其中与表1的基因互补且可杂交的多核苷酸探针或探针集合构成在所述微阵列上的至少50％的探针或探针集合。
24.一种包含多核苷酸探针的微阵列，所述多核苷酸探针与至少一个基因的基因产物的序列互补且可杂交，所述基因选自在表1中列出的基因。
25.根据在权利要求23或权利要求24中要求保护的微阵列，所述微阵列包含多核苷酸探针，所述多核苷酸探针与在表2中列出的基因的基因产物的序列互补且可杂交。
26.一种诊断试剂盒，其包含用于测量在表1中列出的一个或多个基因或在表1中列出的基因的基因产物的表达的装置，例如与mRNA或cDNA基因产物杂交的探针，用于执行根据权利要求1-20中任一项所述的方法。
27.一种治疗根据权利要求1-20所述的方法或根据权利要求23-25所述的微阵列或根据权利要求26所述的诊断试剂盒的用途表征为反应者的患者的方法，其包括：给所述患者施用包含肿瘤相关抗原的组合物。
28.一种用于治疗根据权利要求1-20所述的方法或根据权利要求23-25所述的微阵列或根据权利要求26所述的诊断试剂盒的用途确定为或表征为反应者的患者的包含肿瘤相关抗原的组合物。
29.包含肿瘤相关抗原的组合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗根据权利要求1-20所述的方法或根据权利要求23-25所述的微阵列或根据权利要求26所述的诊断试剂盒的用途确定为或表征为反应者的患者。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述肿瘤相关抗原是MAGE抗原。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法、组合物或用途，其中所述组合物另外包含佐剂。
32.一种固体表面，与其连接了在表1中列出的至少63个基因的多种检测剂，所述检测剂能够检测所述基因的表达或由所述基因编码的多肽。
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