TW200902049A - Fusion protein - Google Patents

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200902049 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體上係關於包含衍生自腫瘤排斥抗原NY-ESO-1及L AGE-1中之一者或兩者之抗原的多肽及構築體。 【先前技術】 癌症睾丸（CT)抗原為一類具有通常限制於睾丸、卵巢中 之生殖細胞或滋養層細胞之表現之腫瘤相關抗原。該等抗 原通常不表現於成人體組織中。參見Simpson 等人，Nat· Rev. Cancer, 5(8):615-625 (2005) ; Scanlan等人，1]111111111〇1· Reviews, 188:22-32 (2002) ; Scanlan等人，Cane. Immun·， 4:1-15 (2004)。 癌症患者之CT抗原基因調控受到破壞，導致該等抗原 在多種腫瘤中之異常表現。待鑑別之第一 CT抗原MAGE-1 係在20世紀90年代早期藉由T細胞抗原決定基選殖鑑別 (van der Bruggen等人，19918(^611。6 13;254(5038):1643-7 ; van der Bruggen等人，1999 Science 254:1643-1647 ; Traversari等人，1992 Immunogenetics，35(3):145-152 ;及 美國專利第5,342,774號，該等文獻係以引用的方式併入本 文中）。其後，血清學表現選殖技術（SEREX)(Sahin等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(25):11810-11813(1995)及美 國專利第5,698,396號）、酵母表面上重組抗原表現 (RAYS)(Mischo等人，Cane. Immun.，3:5-16 (2003))及差異 mRNA表現分析（Gure等人，Int· J. Cane., 85(5):726-732 (2000))已使得約90種CT抗原得以鑑別，且預計在將來幾 128049.doc 200902049 年中其數目將增長。一些ct抗原在癌症患者體内之免疫原 性使其成為研製腫瘤疫苗之理想標靶。 NY-ESO-1.目前所關注之適用於癌症免疫療法中之癌症 睾丸抗原為NY-ESO-1。此抗原係在90年代末期在New

York Branch of the Ludwig Institute for Cancer Research藉 由SEREX在食道鱗狀細胞癌中首次得以鑑別（Chen等人， PNAS USA，94(5):1914-1918 (1997);及美國專利第 5,804,381號，該等文獻係以引用的方式併入本文中）。 蛋白質NY-ESO-1之長度為180個胺基酸且可描述為由以 下三個區域組成： N末端區域大致胺基酸1至70 中心區域大致胺基酸7 1至13 4，及 C末端區域大致胺基酸135至180。 膠原蛋白樣區域包含N末端區域之大致或大約胺基酸15至 73(參見圖1)。 已在多種腫瘤中發現蛋白質NY-ESO-1，該等腫瘤包括 (但不限於）印巢癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、食道癌、膀 胱癌及黑素瘤（Nicholaou T，等人，Immunol Cell Biol. 2006 年 6 月；84(3):303-17及 Jungbluth 等人，2001，Int. J. Cane.，92(6):856-860)。已描述具有NY-ESO-1陽性腫瘤之 患者對抗此抗原之自發體液及細胞免疫反應，且已鑑別出 多種HLA(人白血球抗原）1型及II型限制肽（Jager等人， 1998 J. Exp. Med.，187(2):265-270 ; Yamaguchi等人，2004 Clin, Cane. Res.，10(3):890-961 ;及 Davis等人，2004 Proc. 128049.doc 200902049

Natl. Acad. Sci. USA, 101(29):10697-10702)。例示性專利 文獻為美國專利第6，140,〇5〇號；第6,251,603號；第6,242,〇52 號；第 6,274，145 號；第 6,338,947 號；第 6,417,165 號；第 6,525,177 號；第 6,605,711 號；第 6,689,742 號；第 6,723,832 號；第6,756,044號；及第6,800,730號，該等文獻皆係以引用 的方式併入本文中。 在臨床試驗中，具有HLA-A2結合基元之三個部分重疊 NY-ESO-1衍生肽（157-167、157-1 65及 155-163)已用於疫苗 中來治療1 2名患有轉移性NY-ESO-1表現腫瘤之患者。此 研究證實合成NY-ESO-1肽可安全投與且能夠產生潛在有 益之 T 細胞反應（Jager 等人，2000 PNAS USA，97(22):12198-12203)。 已由不同群體鑑別出蛋白質中之多種MHC(主要組織相 容性複合物）1型及II型抗原決定基，例如參見圖1。該等抗 原決定基僅為關於蛋白質所報導之抗原決定基之代表且圖 1中之列舉並不詳盡。此外，圖1中所報導及/或列舉之抗 原決定基中之至少一或多者尚未經實驗證實。N末端中之 膠原蛋白樣區域含有至少一個MHC I型抗原決定基（在本文 中稱作A3 1)。中心區域包含若干MHC 2型抗原決定基（在 本文中稱作DR1、DR2、DR4、DR7及DP4)。此區域亦含 有若干MHC I型抗原決定基（在本文中稱作B35、B51、Cw3 及Cw6)。咸信C末端含有至少兩個Π型抗原決定基（DR4及 DP4)及一個I型抗原決定基（A2)。 LAGE-1.亦已鑑別出另一癌症睾丸抗原LAGE-1。已描 128049.doc 200902049 述兩個 LAGE-1 轉錄物 LAGE-la及 LAGE-lb。LAGE-lb經不 完全剪接且編碼具有約2 1 0個胺基酸殘基之推定蛋白質， 而LAGE-la基因產物含有180個胺基酸殘基（Sun等人， Cancer Immunol Immunother 2006: 55: 644-652) ° LAGE-1及NY-ESO-1蛋白之N末端區域具高度保守性且 認為其具有大於97°/。一致性。然而，LAGE-1與NY-ESO-1 之中心區域不同，其僅具有62% —致性。NY-ESO-1及 LAGE-la之C末端具高度保守性（大於97%—致性）。然而， LAGE-lb之C末端較長且並不保守且認為其與LAGE-la/NY-ESO-Ι中之相同區域具有小於50%—致性。 關於該等蛋白質之一般資訊可獲自LICR網址（參見 www.cancerimmunity.org/CTdatabase)。 【發明内容】 本發明提供一種免疫原性融合蛋白，其包含： (i) NY-ESO-1或其片段，其與以下物質連接， (ii) LAGE-1或其片段， 其中NY-ESO-1及/或LAGE-1中之至少一者經截斷或部分截 斷，或為包括NY-ESO-1或LAGE-1之一或多個抗原決定基 之片段。本發明亦提供一種免疫原性融合蛋白，其包含： (i) LAGE-1或其片段，其與以下物質連接， (ii) NY-ESO-1 或其片段， 其中NY-ESO-1及/或LAGE-1中之至少一者經截斷或部分截 斷，或為包括NY-ESO-1或LAGE-1之一或多個抗原決定基 之片段。因此，本發明亦提供包含截斷或部分截斷NY- 128049.doc 200902049 ESO-i或其包括NY-ESO-丨之一或多個抗原決定基之片段的 多肽及融合蛋白。本發明亦提供包含截斷或部分截斷 LAGE-1或其包括LAGE-1之一或多個抗原決定基之片段的 多肽及融合蛋白。本發明亦提供涉及該等融合蛋白及多肽 之組合物及方法。 【實施方式】 融m本發明之融合蛋白適用於治療癌症，且更 特定言之適用於治療：黑素瘤：乳癌；前列腺癌；膀胱 癌，包括移行細胞癌；肺癌，包括非小細胞肺癌 (NSCLC);頭頸癌，包括食道癌；鱗狀細胞癌；胃腸道 癌，肝癌；腦腫瘤；白血病；及各種肉瘤。 基於LAGE 1及NY-ES0-1之表現概況，本發明之融合蛋 白具有對估§十37%之乳癌有效之潛力。本發明之治療亦可 尤”適用於/α療不適於Her2/neu乾向療法之患者。亦預測 本發明之融合蛋白對約35%前列腺癌患者、35%膀胱癌患 者、40%黑素瘤患者及35% NSCLC(非小細胞肺癌）患者有 效在實施例十，本發明之融合蛋白可使更寬範圍之患 者群體經丈治療’因為可對患有表現NY_escm及/或 LAGE-1(包括LAGE-la及LAGE-lb)之腫瘤之患者提供本發 明之融合蛋白。 本發明之融合蛋白亦可比其個別組份蛋白質具有更大免 疫原性，其係由於以下原因： 移除一或多個膠原蛋白樣域可降低化合物由其與天然 内源性膠；f卷· & έ士 A 1 豕贫白、、'°構之同源性造成的潛在免疫耐受性，或 128049.doc -10- 200902049 視情況添加異種融合搭配物可進一步刺激CD4 T細胞 反應。因此，融合蛋白適用於誘導對諸如NY-ESO-1或 LAGE-1或兩者之癌症抗原之免疫原性反應。 本發明中使用之NY-ESO-1可為能夠引起對NY-ESO-1之 免疫反應之全長、部分截斷或截斷NY-ESO-1或其包括一 或多個抗原決定基之任何片段。本說明書上下文中之全長 NY-ESO-1蛋白意謂具有約1至1 80個胺基酸且與天然存在 蛋白質（SEQ ID ΝΟ:49)具有至少 95%、96%、97%、98%、 99%或100% —致性之蛋白質。如本文中所用，術語 "LAGE-Γ係指如下文中所述之一或多個LAGE-1家族成 員，諸如LAGE-la及LAGE-lb。π全長LAGE-la"蛋白質意 謂與 SEQ ID NO:58 具有 95%、96%、97%、98%、99% 或 100%—致性之蛋白質。類似地，"全長LAGE-lb”蛋白質意 謂與天然存在蛋白質（SEQ ID NO:71)具有95%、96%、 97%、98%、99%或100%—致性之蛋白質。 在一實施例中，一致性為序列全長範圍内之一致性。因 此，本發明亦擴展至具有保守性取代之該等融合蛋白。保 守性取代為吾人所熟知且通常在序列比對電腦程式中設定 為預設計分矩陣。該等程式包括PAM250(Dayhoft M.O.等 人，(1978), "A model of evolutionary changes in proteins", "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft(編），345-352)，National Biomedical Research Foundation，Washington，及 Blosum 62(Steven Henikoft和 Jorja G_ Henikoft (1992)，及 "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), 128049.doc 11 200902049

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919。 一般而言，在下列群内之取代為保守性取代，但認為群 之間的取代為非保守性取代。該等群為： i) 天冬胺酸/天冬醢胺/麩胺酸/麩醯胺酸 ii) 絲胺酸/蘇胺酸 iii) 離胺酸/精胺酸 iv) 苯丙胺酸/酪胺酸/色胺酸 v) 白胺酸/異白胺酸/纈胺酸/甲硫胺酸 vi) 甘胺酸/丙胺酸。 本說明書之上下文中之”部分截斷”意謂大部分膠原蛋白 樣區域已經移除但仍包含此區域中發現之抗原決定基工 或由其組成之NY-ESO-1或LAGE-1蛋白（適當時）。在_實 施例中，部分截斷NY-ESO-1及/或LAGE-1包含大約或確切 胺基酸48至180(或在LAGE-lb之情況下為大約或確切胺基 酸4 8-2 10)或由其組成。 本說明書之上下文中之”截斷”意謂膠原蛋白樣區域已經 移除（包括移除A31抗原決定基）之NY-ESO-1或LAGE-1蛋白 (適當時）。在一實施例中，截斷NY_ES〇_1&/或[AGE」包 含大約或確切胺基酸7卜180(或在LAGE-lb之情況下為大約 或確切胺基酸48-210)或由其組成。 "其他片段”意謂當併入本發明之融合蛋白中時產生具有 本發明融合蛋白之所需性質及優點之最終蛋白質的片段。 NY-ESO-1.根據前述，提供經修飾抗原，其包含衍生 自腫瘤排斥抗原1^¥_“〇_1之抗原’其中膠原蛋白區域經 128049.doc -12· 200902049 部分截斷或完全截斷。在一些實施 中 移除大於勝©I 白區域。在一些實施例中，蛵佟 膠原蛋 一些實施例中’經修飾抗原為重 在 、’几原。在—些實施例中 提供包含如前述句子中所述之抗原之 . _ 夕狀。在一些實施例 中，例示性多肽包含異種蛋白，諸 木目B型流感嗜血桿 菌（Haemophilus infl職zae type B)之蛋白質d或盆片p 在一些實施例中提供包含編碼前述多肽之核苦酸序列：構 築體。 再 在-些實施例中’提供—種包含他咖]或其片段之 免疫原性多肽’其中NY_ES〇]不包括膠原蛋白樣區域。 在其他實施例中，刚S0]經部分截斷或截斷或包含豆 包括一或多個抗原決定基之任何片段。在一些實施例中， 該等多肽具有保守性取代。在一些實施例中，該等多狀及 構築體適用作預防或實質上改善癌症復發之預防藥。 因此在些實施例中，一或多個胺基酸係自膠原蛋白 區域移除。更特定言之，在—些實施例中，卜2、3、4、 6 7、8、9、1 〇、11、12、〗3、14、15、16、17、 ^、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 3〇 、 31 、 32 、 33 、 34 、 35 、 36 、 37 、 38 、 39 、 40 、 41 、 42、43、44、45 ' 46、47、48、49、50、51、52、53、 5 56 57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66 6 7 、 、68、69、70、71、72或73個胺基酸係自包括膠原 蛋白區域之部分（亦即，大約SEQ ID ΝΟ:49之胺基酸1-73) 移除。該等胺基酸可自膠原蛋白區域中之相鄰位置或自不 128049.doc •13- 200902049 相鄰位置移除。換言之，在—些實施例中，胺基酸係自 SEQ ID NO:49之彼部分中之位置1、2、3、4、5、6、7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 ' 55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72或73中之任一者或其任何組合移除。熟習 此項技術者應瞭解.在一些實施例中，胺基酸序列之部分 得以保持以使得其中之特定抗原決定基保留在所得多肽 内。 在一些實施例中，使用NY-ESO-1中心區域或C末端區域 之片段。因此，在一些實施例中，多肽可包含以SEQ ID NO:49列出之胺基酸序列之一或多個片段，亦即含有胺基 酸位置 74-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、 101-105 > 106-110 ' 111-115 ' 116-120 ' 121-125 > 126-130 、 131-135 、 136-140 、 141-145 、 146-150 、 151-155 、 156-160、161-165、166-170、171-175、176-180 中之一或 多者或其任何組合的片段。熟習此項技術者應瞭解：在一 些實施例中，胺基酸序列得以保持以使得特定抗原決定基 保留在所得多狀内。 U G丑-7 ·在—些實施例中，提供一種經修飾抗原，其 包含衍生自腫瘤排斥抗原LAGE-1之抗原，其中膠原蛋白 區域經部分載斷或完全戴斷。在一些實施例中，移除大於 128049.doc -14- 200902049 膠原蛋白區域。在一些實施例中，經修飾抗原係經基因修 飾。在-些實施例中，經修佛抗原為重組抗原。在一些實 施例中’提供包含如前文t所述之抗原之多肽。在一：實 :例中’抗原係衍生自腫瘤排斥抗原LAGE-la。在一些實 施例中，抗原係衍生自腫瘤排斥抗原LAGE-lb。在其他實 施例中’例示性融合蛋白包含異種蛋白，諸如來自：型流 :嗜血：菌之蛋白質〇或其片段。在一些實施例中提供包 §編馬月!j述多肽之核芽酸序列之構築體。 在些實施例中，提供一種包含LAGE-1或其片段之免 疫原性多狀，其中LAGW不包括膠原蛋白樣區域。在其 他““列中’ LAGE-1經部分截斷或截斷或包含其包括一 或多個抗原決定基之任何片段。在—些實施例中，多肽包 含LAGW多肽與Νγ_跡k膠原蛋白樣區域之雜合物。 v 在-實施例中’多肽包含與部分截斷或截斷l AGE· i連 接之NY-ESO-1膠原蛋白區域之部分或全部。在一些實施 例中，該等多肽具有保守性取代。在—些實施例中，該等 多肽及構築體適用作預防或實質上改善癌症復發之預防 藥0 施例中，1、2、3、4、5、6 因此’在一些實施例中， 區域或甚至自N末端胺基酸 —或多個胺基酸係自膠原蛋白 移除。更特定言之，在一些實 9 、 1〇 、 11 、 12 、 20、21、22、23 ' 24、 32 、 33 、 34 、 35 、 36 、 44、45、46、47、48、 13、14、15 ' 16、17、18、19 25、26、27、28、29、30、31 37、38、39、40、41、42、43 128049.doc -15 - 200902049 49、5〇、51、52、53、54、55、56 57、58 59、6〇、 61、62、63、64、 65 66 、 67 、 68 、 69 、 70 、 71 、 72或73 個胺基S夂係自膝原蛋白區域或甚至n末端胺基酸（亦即，大 約 SEQ ID N〇:58(LAGE_la)或 SEQ 山 N〇:7i(LAGE ib)之 fe基酉夂1 73)移除。该等胺基酸可自此區域中之相鄰位置或 自不相鄰位置移除。換言之，在-些實施例中，一或多個 胺基酸係自 SEQ ID NO:58(LAGE-la)或 SEQ ID NO:71(LAGE-lb)中之位置 1 10、11、12、13、14、15 2234465870 2335475971 2、3、4、516 、 17 、 18 24、25、26、27、28、29 36 、 37 、 38 、 39 、 40 、 41 48、49、50、51、52、53 60、61、62、63、64、65 304254 66 6、7、8、9 19 、 20 、 21 31 、 32 、 33 43、44、45 55 ' 56 、 57 67、68 ' 69 72或73中之任一者或其任何組合移除。熟習此項 技術者應瞭解：在一些實施例中，胺基酸序列之部分得以 保持以使得其中之特定抗原決定基保留在所得多肽内。在一些實施例中，使用LAGE_ 1中心區域或C末端區域之 片段。因此，在一些貫施例中，多肽可包含以Seq id NO:58(LAGE-la)或 SEQ ID 购:71(1^八0£-11))列出之胺基酸序列之一或多個片段，亦即含有胺基酸位置74、75、76、 77、78、79、80、81-85、86-90、91-95、96-1〇〇、1〇1· 105、106-110、111-115、116-120、121-125、126-130、131-135 ' 136-140 ' 141-145 ' 146-150 ' 151-155 ' 156-160、161-165、166-170、171-175、176-180 中之一或多者 128049.doc -16- 200902049 或其任何組合之片段。熟習此項技術者應瞭解：在一些實 施例中，胺基酸序列得以保持以使得特定抗原決定基保留 在所得多肽内。 在一態樣中，本發明提供一種包含全長ΝΥ-ESO-l之融 合蛋白。 在一態樣中，本發明提供一種包含部分截斷NY-ESO-1 之融合蛋白。 在一態樣中，本發明提供一種包含截斷ΝΥ-ESO-l之融 合蛋白。 在一態樣中，本發明提供一種包含全長LAGE-1之融合 蛋白。 在一態樣中，本發明提供一種包含部分截斷LAGE-1之 融合蛋白。 在一態樣中，本發明提供一種包含截斷LAGE-1之融合 蛋白。 在一態樣中，本發明中所用之LAGE-1為LAGE-1 a。 在一態樣中，本發明中所用之LAGE-1為LAGE-lb。 在本發明之一態樣中，ΝΥ-ESO-l之N末端係與LAGE-1 之C末端融合。 在本發明之一態樣中，ΝΥ-ESO-l之C末端係與LAGE-1 之N末端融合。 藉由合併來自另一異種抗原（例如蛋白質D，其為革蘭氏 陰性（gram-negative)細菌流感嗜血桿菌B之表面蛋白）之片 段，本發明融合蛋白之免疫原性可進一步增加及/或蛋白 128049.doc -17- 200902049 質之產生性質進—步改良。關於衍生 合搭配物之其他資訊可獲自W0 91/18926。之免疫融 包括於本發明融合搭配物中之蛋白質可 表現為重組融合蛋白形式。在一實施例中，融合 現為重組融合蛋白形式。 貪白係表 其他異種融合搭配物可辅助提供τ辅助細胞抗 其 (免疫融合搭配物），或可辅助以 、土 加強子）。在一眚浐加山 平衣現蛋白質（表現 子）在實把例中，其他異種融合搭配物 融合搭配物與表現增強搭配物。 & 在-實施例中，蛋白fD或其衍生物包含大 蛋白質之前1/3’例如大約或確切蛋白質D之胺其 ⑽。在另-實施例中，蛋白fD或其衍生物 ^ 切蛋白質D之胺基酸2〇至丨27 、力或確 A m 飞由其組成。在-實施例中， =於：發明中之蛋白fD不包括該蛋白質之分泌序列。 =:，在本發明之融合蛋白中’蛋白質〇衍生物未經脂質 在-實施例中，蛋白fD進一步包含（例如）與蛋白質D片 段之N末端融合之胺基酸Met、As^pr〇(亦即構築 含”叫2(M27蛋白質D•，或由其組成）。認為該三種額外胺 基酸可㈣蛋白f之穩定性及/或增加其蛋白表現量。 在-態樣中，本發明提供一種融合蛋白，其中蛋 D(如上文所述）之叫端片段（亦即前三分之―）係與本發明 之融合蛋白或其免疫原性片段之N末端融合。更特定古 之’可實現蛋白質D與本發明融合蛋白之財端之融= 128049.doc 200902049 使得後者置換已經切除之蛋白質D之C末端片段。因此， 蛋白質D之N末i而變成融合蛋白之n末端。 替代蛋白貝D或除蛋白質D之外，其他異種融合搭配物 或其>1段可包括於本發明之融合蛋白中，例如： 來自流感病毒之非結構蛋白NS1(紅血球凝集素”通 常可使用N末端8 1個胺基酸，但可使用不同片段，其限制 條件為其包括T輔助細胞抗原決定基； 何生自肺炎鏈球菌（Strept〇c〇ccus之 LytA，其合成由 LytA 基因（Gene，43 (1986)，第 265_272 頁） 編碼之N-乙醯基丙胺酸醯胺酶LytA，諸如在c末端中發 現之例如起始於殘基178之LytA分子的重複部分（諸如殘基 〇5)在貝把例中，異種融合搭配物為CLytA。在 另一實施例中，異種融合搭配物為如w〇〇3/i〇4272中所述 之cpc(包含CLytA_P2_CLytA之融合蛋白）。在胺基末端處 含有c-LytA片段之雜交蛋白質之純化已描述於 Biotechnology: 10,（1992)，第 795 798 頁中。 八本發明之融合蛋白可進一步包括一種親和標籤，例如包 含1至10個（例如6個或10個）組胺酸殘基之組胺酸尾（亦稱作 ㈣票籤）。該等殘基可位於例如該蛋白質之末端部分，諸 如犯而及/或c端部*。該親和標鐵可併人以進一步改 白質之純化。 蛋 本發明之某些特定融合蛋白可如圖式中所述構築。 圖式中所列屮夕夂與大A仓I主_丄 ’、 人毒 出之各貝她例表不本發明之獨立態樣。本發明 之融δ蛋白之構築體的其他 " Λ J捉供於表1-4中及序列表 128049.doc •19- 200902049 中ο 截焱.本發明亦擴展至編碼本發明融合蛋白之核酸及 聚核酸，諸如DNA。本發明之方法可由諸如Maniat4 人，M〇lecuIar Cloning_A Lab〇rat〇ry ^麵】；c〇id

Harbor, 1982·1989中所述之習知重組技術來實施。詳言 之，方法可包含以下步驟： i)製備一種可複製或整合之表現載體，其能夠在宿主 細胞中表現-種包含編融合蛋白或其免疫原性衍生物 之核苷酸序列之DNA聚合物； 11)用該載體來轉化一種宿主細胞； πι)該轉化之宿主細胞在允許該DNA聚合物表現之條件 下培養以產生該蛋白質；及 iv)回收該蛋白質。

術語”轉化"在本文中用於意謂將外來DNA引入宿主細胞 中。此可例如藉由使用Genetic Engineering; S M 及 A.J· KingSman 編；mackwell Scientific PuMicati〇ns; Oxford, England，1988中所述之習知技術使用適當質體或 病毒载體轉化、轉染或感染來達成。術語"轉化"或"轉化 株將在下文中用於所獲得之含有且表現所關注外來基因 之宿主細胞。包含編碼本發明融合蛋白之核苷酸序列之表 現載體為新穎的且亦形成本發明之一部分。 可根據本發明藉由在連接條件下將可與宿主細胞相容之 載體裂解以得到具有完整複製子之線性DNA區段且將該線 性區段與一或多個DNA分子（其連同該線性區段編碼所需 128049.doc -20- 200902049 產物，諸如編碼本發明蛋白質之DNA聚合物或其衍生物） 組合來製備可複製表現載體。因此，必要時，可在構築載 體期間預先形成或形成DNA聚合物。 載體之選擇將部分由宿主細胞（其可為原核細胞或真核 細胞，但通常為大腸桿菌（E. coli)或CHO細胞）決定。適合 載體包括質體（例如TMCP14或pET21或pET26、pcDNA3)、 噬菌體、黏質體及重組病毒。在於桿狀病毒、酵母或CHO 宿主細胞中表現之一實施例中，可使用以下載體中之一 者：pEE14、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pDMT-DEST48 及pAcSG2。通常可藉由（例如）上文引用之Maniatis等人中 所述之程序由用於限制、聚合及連接DNA之適當酶來進行 可複製表現載體之製備。 根據本發明，藉由在轉化條件下用本發明之可複製表現 載體轉化宿主細胞來製備重組宿主細胞。適合轉化條件為 習知的且描述於（例如）上文引用之Maniatis等人或nDNA Cloning”，第 II卷，D.M. Glover編，IRL Press Ltd, 1985 中。轉化條件之選擇由宿主細胞決定。因此，可用CaCl2 溶液（Cohen等人，Proc. Nat. Acad. Sci., 1973，69，2110)或 包含RbCl、MnCb、乙酸鉀及甘油之混合物之溶液，且隨 後用3-[N-嗎啉基]-丙烷-磺酸、RbCl及甘油處理細菌宿主 (諸如大腸桿菌）。可藉由將載體DNA與鈣共沈澱於細胞上 來轉化培養物中之哺乳動物細胞。本發明亦擴展至經本發 明之可複製表現載體轉化之宿主細胞。 DNA可為由標準技術優化以進一步促進相關宿主之表現 128049.doc -21 - 200902049 的密碼子。 通常如（例如）上文所引用之Maniatis等人及"DNA cloning1 中所述進行在允許DNA聚合物表現之條件下經轉化宿主細 胞的培養。因此，較佳向細胞供應養分且將其在低於50°C 之溫度下培養。本發明之蛋白質可表現於原核細胞或真核 細胞（諸如酵母）中，但通常表現於大腸桿菌中。可使用諸 如以下各者之特定大腸桿菌菌株： .AR58:衍生自N99(其為㈣E::Tn 1〇, △部繼-㈣）， △ -Hl(Cr〇-chIA)，N+)&c1857之隱藏型人溶原菌（參見：巧沉

Natl. Acad. Sci. USA’ 第 82卷，第 88-92 頁，1985 年 1月，

Biochemistry) BLR (DE3) N〇vagen，WI，USA(目錄號：69〇53 4): BLR為BL2l2recA_衍生物。通常併入（例如）卡那黴素 (kanamycine)抗性或安比西林（ampicimn)抗性之選擇標言志 來促進鑑別重組基因/構築體至表現系统中之成功合併。 根據宿主細胞且根據表現產物之定位（細胞内或分泌至 培養基或細胞周質中）藉由羽&十、+ + T )楮田白知方法來回收產物。因此， 若宿主細胞為細菌(諸如大腸桿菌），則其可(例如 理、化學或酶促溶解且自所得溶解產物分離蛋白質產物。 若宿主細胞為哺乳動物’則通f可自營養培養基或不〜 胞之萃取物㈣產物。習知蛋白質分離技術包括選擇 殿、吸附層析及包括單株抗體親和性#柱之親和性/ 提供可以液體形式或以束乾形式溶解之本發明蛋： 本發明亦提供包含本發明之融合蛋白及醫藥學上可接成。 128049.doc *22- 200902049 賦形劑之醫藥組合物，諸如疫苗。 在投藥時，本發明之治療性組合物可以醫藥學上可接為 广:形式投與。該等製劑通常可含有醫藥學上可接受： 又之鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性载劑、補充性免疫辨強 劑(諸如佐劑及細胞因子)及視情況其他治療劑。8 之!=量將視以下因素而^待治療之料病狀、病狀 之嚴重性、個別患者參數（包括年齡、身體狀況、體型及 體重）、治療持續時間、併存療法（若存在）之性質、特定^ 藥途徑及在保健專業人員之知識及專業知識範圍内之類： 因素。该等因素為一般熟習此項技術者所熟知且可僅藉由 常規實驗來處理。通常較佳使用個別組份或其組合之最大 劑量，亦即根據合理醫學判斷之最高安全劑量。然而，一 般熟習此項技術者應瞭解出於醫學原目、心理原因或實際 上任何其他原目’患者可堅持較低劑量或容許劑量。通常 預期各人J劑量將包含i吨至叫蛋白質且較佳為 pg-300 〇

在心樣中，用於投與本發明之融合蛋白之醫藥組合物 將為^苗。該疫苗可視情況含有一或多種其他腫瘤相關抗 原' 多狀及/或肽。舉例而言，屬於MAGE、LAGE及GAGE 豕奴之成員。疫苗製劑大體上描述於Vaccine Oesign(”The

subunit and adjuvant approach"(Powell M.F.及 Newman M. J 、·扁）（1995) pienum press New Y〇rk)中。Fullert〇n，美國 專利4,235,877描述至脂質體内之囊封。 本务明之融合蛋白在本發明之疫苗調配物中可使用佐 128049.doc -23- 200902049 J適《佐劑包括鋁鹽（諸如氫氧化鋁膠（礬）或磷酸鋁）， 但亦可為❹、鐵鹽或鋅鹽，或可祕化赂胺酸或醯化 糖、陽離子或陰離子衍生化多糖或聚鱗腈之不溶性懸浮 液。其他已知佐劑包括含有CpG之募核苷酸。該等寡核苷 酸之特徵在於CpG二核苷酸未經甲基化。該等寡核苷酸為 吾人所熟知且描述於例如w〇96/〇2555中。 在本發明之調配物中，可能需要佐劑組合物誘導優先為 ΤΗ 1類型之免疫反應。適合佐劑系統可包括（例如）單磷醯 基月曰貝A、較佳3-脫-〇-醯化單磷醯基脂質A(3D_MpL)與鋁 鹽之組合。CpG寡核普酸亦可誘導τη 1反應。 增強系統包含單磷醯基脂質A與皂苷衍生物之組合，尤 其如WO 94/00153中所揭示之QS21與3D-MPL之組合，或 如WO 96/33739中所揭示之QS21經膽固醇中止之較小反應 原性組合物。例如呈水包油乳液形式之包含qS2 1、3d_ MPL及生育酚之調配物描述於w〇 95/1 7210中。另一佐劑 調配物為（例如）呈水包油乳液形式或呈脂質體調配物形式 之QS21 ' 3D-MPL及CpG或其等效物。因此，在本發明之 一實施例中’提供一種包含本發明之融合蛋白及（例如）如 上所述之佐劑之疫苗。本發明亦擴展至製備包含如本文中 所述之融合蛋白之疫苗及組合物的方法。 本發明亦涵蓋如本文中所述之核酸、多肽或肽用於疫苗 接種之遞送。可根據此項技術中熟知之標準疫苗接種方案 來貫現多肽及肽之遞送。在另一實施例中，可由離體方 法’亦即藉由自一個體移除細胞，對該細胞進行基因工程 128049.doc -24· 200902049 化以包括癌症相關抗原且將經工程化之細胞再引入該個體 中來實現核酸之遞送。一般而言，此可涉及將基因之功能 複本在活體外引入個體之一或多個細胞中，且將該（等）經 基因工程化之細胞移回至個體。該基因之功能複本調控要 素之可操作控制下’其允許基因在經基因工程化之細胞中 表現。一般熟習此項技術者熟知眾多轉染及轉導技術以及 適當表現載體，其中有》些描述於pCT申請案w〇 95/00654中。根據本發明亦涵蓋使用諸如病毒及靶向脂質 體之載體進行之活體内核酸遞送。 縮寫 CO 膠原蛋白樣區域 W/Ocoll不具有膠原蛋白樣區域（膠原蛋白樣域） PD1/3 蛋白質D前三分之— 融合蛋白及編碼其之核苷酸序列之例示性實施例提供於表 1-3 中。 表1.提供融合蛋白及編碼其之核苷酸序列之例示性實施 例。各核苷酸序列係由標的物描述，由唯一核苷酸序列號 (SEQ ID NO:)鑑別且列於序列表中。各融合蛋白係由標的 物描述，由唯一胺基酸序列號（SEq id NO:)鑑別且列於序 列表中。 SEQ ID NO: 表1 __择築體描述 序列組份 _赛合膠原蛋白NY-ESO-1/不具有膠原蛋白之LAGEla 1 T施例A-核苷酸序列 J^±£2i!NY-ESO-l/LAGEla WO coll 優__ ----- * l-210bp 128049.doc -25- 200902049 SEQ ID NO: 表1 構築體描述 序列組份 NY-ESO-1 ^--- l-537bp 連接子 538-543bp LAGEla — His標籤 - JH-H-OHODp 847-864bp 終止序列 — 865-867bp 2 貫施例B-核苷酸序列 1/3蛋白質D/雜合Co丨丨 NY-ESO-l/LAGEla WO coll (密祺^ -優化） Μυρ起始序列 — l-9bp 1/3蛋白質万· ~~~~~~ 10-333bp 膠原蛋白樣域 ' 334-540bp NY-ESO-1 334-867bp 連接子 --- 868-873bp LAGEla '~~~ 874-1176bp His標籤~ -— 1177-1194bp 終止序列 1195-1197bp 3 贯施例A-胺基酸序列 雜合Coll NY-ESO-l/LAGEla WO coll (具有His標籤） 膠原蛋白樣域 l-70aa NY-ESO-1 l-179aa 連接子~~ 180-181aa LAGEla 182-282aa His標籤 - 283-288aa 4 實施例B-胺基酸序列 '~~ -- 1/3蛋白質D/雜合Coll NY-ESO-l/LAGEla WO coll (具有His標鍤、 MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D 4-11laa 膠原蛋白樣·运 ―― ~ 112-180aa NY-ESO-1 -- 112-289aa 連接子 " 一 290-291aa LAGEla " 一 292-392aa His標籤 —- 393-398aa 雜合膠原蛋白截斷NY-ESO-1/不具有勝原蛋白之LAGEla 5 1貫施例c-雜合膠原蛋白截斷NY-ESO-l/LAGEla WO coll 密碼子優化） 膠原蛋白樣域 l-72bp NY-ESO-1 -- l-399bp 連接子 -- 400-405bp LAGEla 406-708bp His標籤 709-726bp 終止序列 _ 727-729bp 6 貫施例D-核苷酸序列-1/3蛋白質D/雜合膠原蛋白羊 1/LAGEla WO coll (密碼子優化） 良 _NY-ESO- MDP起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D ' 10-333bp 128049.doc -26- 200902049 SEQ ID NO: 表1 構築體描述 序列組份 膠屌贫白樣域 NY-ESO-ϊ —- 334-402bp 連接子 ^.-------- 334-729ορ 730-735bp LACitla ----- 736-1038bp His標籤 1039-1056bp 终止斤夕IJ 1057-1059bp 7 原蛋白截斷NY-ESO-l/LAGEla WO coll (具有His標籤） 膠原资白樣域 l-24aa NY-ES〇rr~ --- l-133aa 連接千 134-135aa LAGEla 136-236aa His標籤 237-242aa 8 實施例D-胺基酸序列 1/3蛋白質D/雜合膠原蛋白截斷NY-ESO-l/LAGEla WO cc (具有His標籤） »11 MDP起始序列 l_3aa 1/3蛋白質---—-- 4-lllaa 膠原蛋白樣域 112-134aa NY-ESO-1 112-243aa 連接子 244-245aa LAGEla ............ 246-346aa His標籤 347-352aa 雜合NY-ESO-1/不具有膠原蛋白樣域及鄰近富含半胱胺酸之區域（8aa)之LAGEla 9 實施例E-核苷酸序列 雜合NY-ESO-l/LAGEla WO coll (密碼子優化） NY-ESO-1 l-306bp 連接子 307-312bp LAGEla 313-615bp His標籤 ' — 616-633bp 終止序列 634-636bp 10 實施例F-核苷酸序列 1/3蛋白質D/雜合NY-ESO-l/LAGEla WO coll (密碼子侵化） MUP起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D ...... ' 10-333bp NY-ESO-1 " 334-636bp 連接子 637-642bp LAGEla 643-945bp His標籤 946-963bp 終止序列 964-966bp 11 實施例E-胺基酸序列 雜合NY-ESO-l/LAGEla WO coll (具有His標箱） NY-ESO-1 l-102aa 連接子 103-104aa 128049.doc -27- 200902049 SEQ ID NO: 表1 — 構築體描述 序列組份 105-205aa LAGEla -- His標籤 -- 206-2llaa 12 實施例F-胺基酸序列 -- 1/3蛋白質D/雜合NY-ESO-l/LAGEla WO c〇li f具右His衝 夜） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D -- 4-11laa NY-ESO-1 -- 112-212aa 連接子 ~ ' 213-214aa LAGEla "~~--- 215-315aa His標籤 ' - 316-32laa 雜合膠原安白LAGEla/不具有谬原昼白之NV_Fsr»_i 13 實施例G-核苷酸序列 雜合Coll LAGEla/NY-ESO-1 WO coll (密碼子優化、 NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 -- l-210bp LAGEla ~ --- 211-540bp 連接子 541-546bp NY-ESO-1 ---- 547-849bp His標籤 --- 850-867bp 終止序列 -- 868-870bp 14 1/3蛋白質D/雜合Coll LAGEla/NY-ESO-1 W〇 coll ί密磁4 -優化） MDP起始序列 ---- l-9bp 1/3蛋白質D ..... 10-333bp NY-ESO-1之膝原蛋白樣域 334-540bp LAGEla---- 541-870bp 連接子 ' 871-876bp NY-ESO-1 ---- 877-1179bp His標籤 1180-1197bp 終止斤列 __ 1198-1200bp 15 實施例G-胺基酸序歹~~~ 雜合Coll LAGEla/NY-ESO-1 WO co丨丨（呈有His標籤） NY-ESO-1之膠原蛋白樣运--- l-70aa LAGEla ........- 71-180aa 連接子 --- 181-182aa lO-ESO-1 183-283aa His標戴 ~-- 284-289aa 16 1/3蛋白質 ϋ/雜合U)丨 1 LAGEla/NY-ESO-ί wo coll (具有Η (由 SEQ ID NO: 14蝙碼） v 巧 is標籤） MUP起始斤刘 --- l-3aa 1/3蛋白質D _ --- 4-lllaa NY-ESO-1之膠原蛋'-- 112-180aa LAGEla ^--- 連接子 -- NY-ESO-1 '---- 181-290aa 291-292aa 293-393aa 128049.doc -28- 200902049 SEQ ID NO: 表1 構箠《描谛 序列組份 His標藏 - 394-399aa -雜口膠原蛋白截g^GEla/π具有膠原蛋白之NY-ESO- 1 —-|_雜°膠原查白截所LAGE1 a/NV_F«rt_i WO eoll ί密礁子傷化） NY-ESO-1之膠原蛋白^ ' l-72bp LAuii I a ........ 73-402bp 連接子 403-408bp NY-ESO-1 --- 409-711bp His標籤--- 712-729bp 終止序列 --- 730-732bp 18 1/3蛋白質ϋ/雜合膠原蛋白截斷LAG；Eia/NY-ESO-l WO C0 (密碼子優化） 11 MDP起始序列---- l-9bp 1/3蛋白質D - 10-333bp M 'i-ESu-1之膠原贪白樣域 334-402bp LAGEla 403-732bp 連接子 -- 733-738bp NY-ESO-1 _ 739-1041bp His標籤 …… 1042-1059bp 終止序列 1060-1062bp 19 雜合膠原蛋白截斷LAGEla/NY-ESO_l WO coll (具有His书 (由 SEQIDNO:17 編瑪） NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 l-24aa LAGEla 25-134aa 連接子 _______ 135-136aa NY-ESO-1 137-237aa His標籤 238-243aa 20 1/3蛋白質D/雜合膠原蛋白截斷LAGEla/NY-ESO-l WO coll (具有His標藏)(由SEQ ID NO: 18編碼） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D ' 4-lllaa NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 112-134aa LAGEla ~ ~~ 135-244aa 連接子 245-246aa NY-ESO-1 -- 247-347aa His標籤 348-353aa 雜合LAGEla/不具有膠原蛋白樣域及鄰近富含半胱胺酸之區域(8aa)之NY-ESO-1 21 貫施例E’-核苷酸序列 雜合LAGEla/NY-ESO-l WO coll (密碼子優化） LACiEla l-309bp 連接子 310-315bp NY-ESO-1 316-618bp His標籤 619-636bp 終止序列 637-639bp 128049.doc -29- 200902049 SEQ ID NO: 表1 構築體描述 序列組份 22 1/3蛋白質D/雜合LAGEla/NY-ES01 WO coU (密碼子 MDP起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D 10-333bp LAGEla 334-639bp 連接子 640-645bp NY-ESO-1 646-948bp His標籤 949-966bp 終止序列 967-969bp 23 實施例E’-胺基酸序列 雜合LAGEla/NY-ESO-1 WO coll (具有His標籤） LAGEla l-103aa 連接子 104-105aa NY-ESO-1 106-206aa His標籤 207-212aa 24 1/3蛋白質D/雜合LAGEla/NY-ESO，l WO coll (具有His標籤） (由 SEQIDNO:22 編碼） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D 4-lllaa LAGEla 112-213aa 連接子 214-215aa NY-ESO-1 216-316aa His標籤 317-322aa His-N末端雜合NY-ESO-1/不具有膠原蛋白及鄰近富含半胱胺g (8aa)之 Lagela t之區域 25 His-腸激酶位點-NY-ESO-1/LAGEla(密碼子優化） His標籤序列 l-36bp 腸激酶位點 37-72bp NY-ESO-1 73-375bp 連接子 376-381bp LAGEla 382-684bp 終止序列 685-687bp 26 His-腸激酶位點-NY-ESO-1/LAGEla(由 SEQ ID NO:25編碼） His標籤(10 His) l-12aa 腸激酶位點 13-24aa NY-ESO-1 25-125aa 連接子 126-127aa LAGEla 128-228aa 27 His-NY-ESO-1/LAGEla(密碼子優化） His標籤序列 l-21bp NY-ESO-1 22-324bp 連接子 325-330bp LAGEla 331-633bp 終止序列 634-636bp 128049.doc -30- 200902049 SEQ ID NO: 表1 構築體描述 序列組份 28 His-JNY-ESO-1/LAGElai由 SEO ID NO:26編瑪） His標籤(6 His) l-7aa NY-ESO-T~--- 8-108aa 連接子 109-110aa LAGEla~~' lll-211aa 禾端雜合膠原蛋白裁斷NY-ESO-1/不具右膜崩杏白之LAGE1 a 29 Hls_勝激酶位點-膠原蛋白截斷-NY-ESO-1/LAGEla(密碼i F·優化） His標籤序列 l-36bp 腸激酶位點 37-72bp 膠原蛋白樣域 73-141bp NY-ESO-1 - 73-468bp 連接子 469-474bp LAGE1 a 475-777bp 終止序列 778-780bp 30 ms-勝激酶位點-勝原蛋白截斷-NY-ESO-1/LAGEla (由 SEQIDN〇:29 编勒 His標毂(1〇 His) l-12aa 腸激酶位點 13-24aa 膠原蛋白樣域 25-47aa NY-ES〇Ti 25-156aa 連接子 -- 157-158aa LAGEla— —-- 159-259aa 31 Hls_膠原蛋白截斷-NY-ESO-1/LAGEla(密碼子優化） his條織序列 l-21bp 膠原蛋白樣域 22-90bp NY-ESO^T 22-417bp 連接十 418-423bp LACiKla 424-726bp 終止序列 727-729bp —-斷-NY-ESO-1/LAGEla(由 SEQ ID NO:31 激 1碼） His 標籤 l-7aa 膠原蛋白樣域 8-30aa NY-ESO^l-- 31-139aa 連接子 ' - 140-141aa LAGEla 142-242aa -His-N末端蛋白NY-ESO-1/不具有膠原蛋白樣域之L4 iGEla 33 | 點-Coll-NY-ESO-1/LAGEla(密碼子優化} rtis孫鐵序列 l-36bp 胸激《位點 --------------- 37-72bp 膠原蛋白樣域 73-279bp NY-ESO-l 73-606bp --- 607-612bp LAGEla —-- 613-915bp 128049.doc -31 - 200902049 SEQ ID NO: 表1 構築體描述 序列組份 終止;' 916-918bp 34 His-腸激酶位點_c〇丨丨·NY_Es〇_1/LAGEla(由SEq ID ν〇:2 3編碍） His 標载(l〇His) l-12aa 腸激酶位點 13-24aa 膠原蛋白樣域 25-93aa NY-ESO-1 ................ 25-202aa 連接子 203-204aa LAGEla 205-305aa 35 ms-Coll-NY-ESO-l/LAGElai 密瑀早俱化） His標籤序列 l-21bp 膠原蛋白樣域 22-228bp NY-ESO-1 22-555bp 連接子 556-561bp LAGEla 562-864bp 終止序列 865-867bp 36 His-Coll-NY-ESO-1/LAGEla(由 SEQ ID NO:35編碼） His 標籤(6 His) l-7aa 膠原蛋白樣域 8-76aa NY-ESO-1 77-185aa 連接子 186-187aa LAGEla -- 188-288aa His-N末端雜合Lagela/不具有膠原蛋白及鄰近富含半胱胺酸之區域(8aa)之 NY-ESO-1 37 His-腸激酶位點-LAGEla/NY-ESO-1(密碼子優化） His標籤序列 l-36bp 腸激酶位點 37-72bp LAGEla - 73-378bp 連接子 -- 379-384bp NY-ESO-1 --- 385-687bp 終止序列 — 688-690bp 38 His-勝激酶位點-LAGEla/NY-ESO-1(由SE〇 ID NO:37編碼） His標籤(10 His) l-12aa 腸激酶位點 13-24aa LAGEla ~ 25-126aa 連接子 127-128aa NY-ESO-1 -- 129-229aa 39 His-LAGEla/NY-ESO-1(密碼子優化） His標贼序列 l-21bp LAGEla 22-327bp 連接子 -- 328-333bp NY-ESO-1 334-636bp 終止序列 637-639bp 40 His-LAGEla/NY-ESO-1(由 SEQ ID NO:39編碼） 128049.doc •32- 200902049 SEQ ID NO: 表1 構第餅你靖 序列組份 Η卜十ϋ ττ:、 ---肢描通 丄丄1紙（0 Ills) — LAGE lT ~~~-- l-7aa 連接子 ---- NY-ESO-1 ----- 8-109aa 110-lllaa —-Hf不具有縣 ^白之 NY- 112-212aa ESO-l ^截斷-LAGEla/NY-ESO-1(密碼 i F優化） His標籤每3-- l-36bp 腸激酶位點 ~ 37-72bp NY-ESO-1之膠原蛋$^------- LAGEla ~~----- 73-141bp 連接子 ~~~~--- NY-ESO-1 ---- 142-471bp 472-477bp 終止序列 —--- 478-780bp 781-783bp 42 酶位點_膠原蛋白截斷-LAGEla/NY-ESO-1 (由 SEQIDNO:41 編职 His棵鐵(1〇 His) ' l-12aa 腸激酶位點 ----- 13-24aa M Ϋ-tISU-1之膠原蛋白構试 25-47aa Τ Λ /^Ι?1 Λ "------ 48-157aa 運接千 NY-ESCM ~~~~~~- 158-159aa —-原蛋白截斷_LAGEla/NY-ESO-li密礁子得化、 160-260aa His私鐵序列 l-21bp NY-ESO-1之膠原蛋白樣试 22-90bp LAGEla ----— 91-420bp 連接子 NY-ESO-1-- 421-426bp 終止序列 - 427-729bp 730-732bp 44 His-膠原责白截斷-LAGEla/NY ES〇 (由 SE〇 ID N〇:4 从 备碼） His標籤(6 His)---- l-7aa NY-ESO-1 之膠原蛋 - 8-30^3. LAGEla 31-140aa 連接子 141-142aa Nlt-ESO-1 143-243aa -g^-N#端雜合膠原安白LAGEla/不具有膠原蛋白樣域之NY- ESO-l 45 丨H1S_勝激酶位點七0丨丨-LAGE! a/NY-ESO-1 (密碼子優化） His標鐵序列 l-36bp 腸激酶位點 37-72bp NY-ESO-1之膠原蛋白樣迠 73-279bp LAGEla 280-609bp 連接子 610-615bp ΝΥ-ESO-l ~~~~---— 616-918bp 終止序列 919-921bp 128049.doc •33 200902049 SEQ ID NO: 表1 -_^築體描述 序列組份 46 His-腸激酶位點由SFQ ID NOW 5編碼） His標籤(10 His) --… l-12aa 腸激酶位點 — 13-24aa NY-ESO-1之膠原蛋白檨试 25-93aa LAGEla 94-203aa 連接子 ------ 204-205aa NY-ESO-1 ......... 206-306aa 47 His-(Joll-LAUEla 削 Y-ESO-H 密碼子番化） His標籤序列 l-21bp NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 22-228bp LAGEla 229-558bp 連接子 ____ 559-564bp NY-ESO-1 _ 565-867bp 終止序列 868-870bp 48 ms_loU-LAGI£la/NY_ESO-li由 SEO ID NO:47编瑀） His標藏((> His) l-7aa NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 8-76aa LAGEla 77-186aa 連接子 187-188aa NY-ESO-1 -- 189-289aa 表2 ·提供融合蛋白及編碼其之核苷酸序列之其他例示性實施 例。各核苷酸序列係由標的物描述，由唯一核苷酸序列號 (SEQ ID NO:)鑑別且列於序列表中。各融合蛋白係由標的物 描述’由唯一胺基酸序列號(SEQ ID NO:)鑑別且列於序列表中。 SEQ 表 2. ID N0: 構築體描述 序列組份 部分截斷膠原蛋白NY-ESO-1 50 1膠原蛋白截斷NY-ESO-1(密碼子優化） 膠原蛋白樣域 l-72bp NY-ESO-1 l-399bp His標籤 400-417bp 終止序列 418-420bp 51 具有His標蕺之膠原蛋白截斷NY-ESO-1 (由SE〇 ID NO: 5( h編碼） 膠原蛋白樣域 l-24aa NY-ESO-1 l-133aa His標籤 - 134-139aa 52 1 1/3蛋白質D/膠原蛋白截斷NY-ESO-1(密碼子嫌化） 128049.doc -34- 200902049 SEQ ID NO: 表2· 構築體描述 序列組份 MDP起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D 10-333bp 谬原蛋白樣域 334-402bp NY-ESO-1 334-729bp His標籤 730-747bp 終止序列 748-750bp 53 1/3蛋白質D/膠原蛋白截斷NY-ESO-1 (具有His標臧） (由 SEQ ID NO: 52編碼） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D 4-lllaa 膠原蛋白樣域 112-134aa NY-ESO-1 112-243aa His標籤 244-249aa NY-ESO-1 WO coll 54 NY-ESO-1 WO coll (密碼子優化） NY-ESO-1 l-306bp His標籤 307-324bp 終止序列 325-327bp 55 具有His標籤之NY-ESO-1 WO coll (由 SEQ ID NO: 54編碼 NY-ESO-1 l-102aa His標籤 103-108aa 56 1/3蛋白質D/NY-ESO-1 WO coll (密碼子優化） MDP起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D 10-333bp NY-ESO-1 334-636bp His標籤 637-654bp 終止序列 655-657bp 57 1/3蛋白質D/NY-ESO-1 WO coll (具有His標籤)(由 SEQ ID VO: 56編碼） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D 4-lllaa NY-ESO-1 112-212aa His標籤 213-218aa 表3.提供融合蛋白及編碼其之核苷酸序列之其他例示性 實施例。各核苷酸序列係由標的物描述，由唯一核苷酸序 列號（SEQ ID NO:)鑑別且列於序列表中。各融合蛋白係由 標的物描述，由唯一胺基酸序列號（SEQ ID NO:)鑑別且列 於序列表中。 128049.doc -35- 200902049 SEQ ID NO: 表3 描述 序列組份 不具有LAGE-la勝原蛋白樣垃夕雜厶成E杏白LAGE_la 59 雜 〇 Coll LAGE-la WO coll ί密穩早格仆 NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 l-210bp LAGE-la 211-540bp His標籤 541-558bp 終止序列 559-561bp 60 丹，ms稞紙义雜甘loiiLAGEda WO⑼丨U*SFX> TO NO: 59煸勒 NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 l-70aa LAGE-la 71-180aa His標籤 —…― 181-186aa 61 仍蛋曰買U/雜合urn LAGE-la WO Ci>ll «有His標德Λί密瑀子偻化、 ML>P起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D ......... 10-333bp NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 334-540bp LAGE-la 541-870bp His標籤 871-888bp 終止序列 889-891bp 62 i/j隹·白頁L»/雜兮(JoU LAGE-la WO coll (具有His標藏） (由 SEQ ID NO: 61 編碼） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D 4-lllaa NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 112-180aa LAGE-la 181-290aa His標籤 291-296aa 不具有膠原蛋白樣域之雜合膠原蛋白截斷LAGE-la 63 不具有膠原蛋白樣域之雜合勝原1白截斯LAGE-la NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 l-72bp L AGE-1 a 73-402bp His標籤 403-420bp 終止序列 421-423bp 64 具有His標戤之雜合膠原蛋白截斷LAGE-la WO coll (由 SEQ ID NO: 63編碼） NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 l-24aa LAGE-la 25-134aa His標藏 135-140aa 65 1/3蛋白質D/雜合膠原蛋白截斷LAGE-la WO coll (具有His標籤)(密碼子優化、 MDP起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D 10-333bp NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 334-402bp 128049.doc -36- 200902049 SEQ ID NO: 表3 描述 序列組份 LAUH-la 403-732bp 733-750bp 終止序列 751-753bp 66 1/3蛋白質D/雜合膠原蛋白截斷LAGE-la WO coll (具有His標藏)(由SEQ ID NO: 65編瑪） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D 4-lllaa NY-ESO-1之膠原蛋白樣域 112-134aa LAGE-la 135-244aa His標籤 ' 245-250aa 不具有膠原蛋白樣域及鄰近富含半胱胺酸之區域(8aa)之LAGE-la 67 LAGE-la WO coll(密碼子優化） LAGE-la l-309bp His標籤 310-327bp 終止序列 328-330bp 68 具有His標籤之LAGE-la WO coll (由SEQ ID NO: 67編碼） LAGE-la 1-1 (Baa His標籤 104-109aa 69 1/3蛋白質D/LAGE-la WO coll (密碼子優化） MDP起始序列 l-9bp 1/3蛋白質D 10-3 3 3bp LAGE-la 334-639bp His標籤 640-657bp 終止序列 6578-660bp 70 1/3蛋白質D/LAGE-la WO coll (具有His標箴)(由SEQ ID NO: 69編碼） MDP起始序列 l-3aa 1/3蛋白質D 4-lllaa LAGE-la 112-213aa His標籤 — 214-219aa 表4.提供在實例中論述之融合蛋白及編碼其之核苷酸序 列。各核苷酸序列係由標的物描述，由唯一核苷酸序列號 (S E Q ID Ν Ο:)鑑別且列於序列表中。各融合蛋白係由標的 物描述，由唯一胺基酸序列號（SEQ ID NO:)鑑別且列於序 列表中。 128049.doc - 37 - 200902049 表4 構築體名稱 核苷酸序列 胺基酸序列 LVL020 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 73 LVL024 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 75 LVL026 SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 77 LVL030 SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 79 LVL068 SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 81 LVL076 SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 83 LVL078 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 85 LVL079 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 87 LVL106 SE〇 ID NO: 88 SEQ ID NO: 89 LVL151 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 91 LVL155 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 93 LVL156 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 95 LVL157 SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 97 由序列表顯而易見，表4之許多構築體具有前述表中所 列出之一或多個實施例相似之設計。舉例而言，LVL068 與表1中SEQ ID NO: 45列出之實施例共用相同之設計。 LVL076與表1中SEQ ID NO: 25列出之實施例共用相同之設 計。LVL078與表1中SEQ ID NO: 33列出之實施例共用相同 之設計。LVL079與表1中SEQ ID NO: 37列出之實施例共用 相同之設計。 另外，表4中所列出之若干融合蛋白構築體（亦即LVL 155、LVL106、LVL156、LVL157、LVL151)係分別由表 4 中所列出之其他融合蛋白序列（亦即LVL068、LVL030、 LVL076、LVL078、LVL024)之常規修飾產生。該等修飾包 括移除蛋白質D與嵌合物之開始部分（亦即衍生自NY-ESO-1及LAGE-1之任一者之部分）之間的胺基酸殘基及移除His 標籤與嵌合物之開始部分之間的胺基酸。因此，表4之某 128049.doc -38 * 200902049 些融合蛋白密切對應於表4中之其他融合蛋白。該等融合 蛋白之間的對應列於表5中且更詳細描述於實例4中。 表 5. LVL068、LVL030、LVL076、LVL078、LVL024與經 修飾 LVL155、LVL106、LVL156、LVL157、LVL151 之間 的對應。 表5 融合蛋白構築體 對應於 融合蛋白構築體 LVL068 LVL155 LVL030 LVL106 LVL076 LVL156 LVL078 LVL157 LVL024 LVL151 實例 實例1. NY-LA1嵌合蛋白設計及產生 若干NY-ESO-1/LAGE-1融合蛋白經設計具有及不具有膠 原蛋白樣域，且具有及不具有蛋白質D之末端，如圖17中 所概述。所設計之構築體針對於大腸桿菌中之表現而經密 碼子優化。合成基因係自寡核苷酸及/或PCR產物裝配。使 用Kpnl及Sacl限制位點將片段選殖至pGA4主鏈（AmpR) 中，其中分別在經優化基因之5'端及3’端添加Ndel及Xhol 位點。 自轉化細菌純化質體DNA且藉由UV光譜來測定濃度。 藉由測序來驗證最終構築體。使用Ndel及Xhol限制位點將 不同NY/LAGE嵌合構築體之優化編碼序列直接次選殖至 pET19(AmpR)多個選殖位點中以得到NY/LAGE嵌合物表現 質體。對於選殖至pET26中而言，設計PCR引子以添加N末 128049.doc -39- 200902049 端組胺酸尾。此擴增使得在具有不同構築體之編碼區域之 相中添加6個組胺酸尾。用Ndel/Xhol限制酶將此擴增片段 酶促消化且隨後將不同NY/LAGE嵌合構築體選殖至 pET26(KanR)多個選殖位點中以得到表現質體。藉由測序 來驗證最終構築體。 震盪燒瓶產生。細菌宿主菌株之生長及誘導 培養 使細菌於2.5 L震盪燒瓶中之800 ml Luria-Bertani(LB)肉 湯（BD)+ 1% (w/v)葡萄糖（Lab〇ratoire MAT，目錄號：GR-〇1〇1)+抗生素（對於pET19而言為卡苯尼西林（carbenicillin)100 Kg/m卜對於PET26而言為卡那黴素（kanamycin)40 pg/ml)中 生長。對於BLR(DE3)細胞而言將培養物在37°C下培育直 至 〇.D.6〇〇nm為約 0.8。 讀箏 在 〇 , D . 6。〇n m 為約0.8時，將培養物BLR(DE3)以1 mM異丙 基卜D-1_硫代哌喃半乳糖苷（IPTG ; EMD Chemicals Inc.， 目錄號：5815)誘導且在16。〇下培育16_18小時。對於構築 體 LVL1 06、151、155及 157 ’ 已獲得每 800 ml 5 mg至 15 mg之特疋蛋白質。各構築體之蛋白質產生概述於圖I?中。 貫例2.初步純化及穩定性之概述 蛋白質之萃取及純化 藉由離心收集細胞，隨後由物理或化學方式使其裂解， 且保留所得粗萃取物以分離所關注多肽。 純化 128049.doc 200902049 將所表現之重組蛋白由鹽酸胍溶液溶解且裝載於固定化 金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography ; IMAC)樹脂上。隨後將蛋白質於管柱上用8 M及4 M尿素溶 液洗滌，接著藉由增加σ米吐濃度來溶離。隨後將蛋白質於 最終4 Μ尿素緩衝液（pH 7.0)中去鹽以供進一步使用。藉由 SDS PAGE及西方墨點法（Western Blot)來評估純化以驗證 蛋白質之純度及身份。 經純化融合蛋白之穩定性測試 在37°C下進行穩定性檢定且由SDS-PAGE來評估蛋白 質。初步穩定性檢定未揭示主要問題。 初步溶解檢定 如以下圖表中所概述來評估蛋白質之溶解性。 構li !體 緩衝液 LVL LVL LVL LVL LVL LVL LVL LVL 076 079 78 68 020 26 024 30 PBS IX ； 1 mM TCEP ； 1 mM EDTA，pH 7.03 P S S P P P NT P 20 mM二經乙甘胺酸；138 mM NaCl ； 1 mM TCEP ； 1 mM EDTA，pH 8.68 P S P P P P NT P 20mM咪n坐；138mMNaCl ; 1 mM TCEP ； 1 mM EDTA > pH 5.99 P S P P P P NT P 10 mM 乙酸納；5 mM NaCl ; 1 mM TCEP ； 1 mM EDTA > pH 4.99 s S S s s s NT s 10 mM檸檬酸；5 mMNaCl ; 1 mM TCEP ； 1 mM EDTA > pH 3.7 NT NT s s NT NT NT s 圖表1.融合蛋白溶解性。註解：P沈澱；S無沈澱；NT 未測試。 128049.doc • 41 - 200902049 實例3 :用融合蛋白進行肌肉内免疫 在涉及如下所述之一系列肌肉内免疫篩檢實驗之小鼠模 型中臨床前評估融合蛋白。所選小鼠模型為CB6F1，由 C57BL6小鼠與Balb/c小鼠雜交產生之第一代。此小鼠係購 自 Charles River Laboratories, Inc., 25 1 Ballardvale Street, Wilmington，MA 01887-1000。所選腫瘤細胞株為B16(小鼠 黑素瘤細胞株），其為可購得以進行癌症療法研究之可移 植鼠科動物黑素瘤。 篩檢#1 實驗設#。在76天試驗中，使用CB6F1小鼠來評估 LVL076 、LVL079 、LVL078 、LVL068 、LVL020 、 LVL026、LVL024、LVL030中之每一者以判定用融合蛋白 加佐劑進行肌肉内免疫是否賦予對移植腫瘤細胞 (B16/NYES01)之皮下攻毒之保護。特定言之，用含有15 pg蛋白質及佐劑之5 0 pL注射液對小鼠進行肌肉内免疫。 所選佐劑為AS15。AS15為包含QS21、3D-MPL及CpG之脂 質體佐劑調配物。 用下文1A及1B中列出之融合蛋白來進行試驗。將小鼠 分為每組15隻小鼠之組。如下在第0天及再次在第14天對 小鼠進行免疫：

試驗J A • LVL079 LVL026 LVL068 128049.doc -42- 200902049

LVL030 試驗IB LVL076 LVL020 LVL078 LVL024 對照物 抗原緩衝液/AS 15緩衝液 全長NY-ESO-1 不具有膠原蛋白樣域（CLD)之LAGE-la MAGE A3 在第28天用皮下移植B16/NY-ESO-1腫瘤對每組6隻小鼠 進行攻毒。在第〇天、第14天、第28天及第76天藉由 ELISA(IgGl及IgG2a)評估對全長NY-ESO-1、不具有膠原 蛋白樣域之LAGE-la及人類膠原蛋白之抗體反應。在第28 天使用所收集之脾細胞（用NY-ESO-1及LAGE-la肽集合再 刺激（3個具有3隻小鼠之集合））藉由FACS來評估細胞介導 反應。篩檢#1之實驗設計概述於圖18中。 ，結肩。在四種對照物中，與緩衝液相比，僅全長NY-ESO-1賦予若干保護。參見圖19。在接受全長NY-ESO-1或 LVL030之小鼠組中，每組有兩隻小鼠在試驗結束時不含 腫瘤。在接受LVL068之小鼠中，有四隻小鼠在研究結束 時不含腫瘤。與接受緩衝液之小鼠相比，LVL068及 LVL078賦予更長存活。參見圖20。藉由ELISA、FACS及 128049.doc -43- 200902049 西方墨點法來評估NY-ESO-1特異性免疫反應。藉由EUSA 及FACS來評估LAGE-1 a(不具有膠原蛋白樣域）特異性免疫 反應。參見圖21。該等結果概述於以下圖表中。 免疫原 B16/NY-ESO-1 保護 NY-ESO-1 特異性免疫 LAGEla 特異性免疫 LVL068 ++ ++ ++ LVL078 + ++ ++ LVL076 + ++ + LVL024 + ++ + LVL030 + ++ + LVL020 + + + LVL079 + + LVL026 - + + 圖表2.特異性免疫性概述。註解：（-)-最低反應；（+)-中等反應；（++)-最高反應。 篩檢#2 實，驗菝。在105天試驗中，使用CB6F1小鼠來評估 LVL076、LVL078、LVL068及LVL024中之每一者以判定用 融合蛋白加佐劑進行肌肉内免疫是否賦予對B16/NYES01 移植腫瘤細胞（在兩次免疫後）或B16/LAGE-la腫瘤細胞（在 四次免疫後）之皮下攻毒之保護。特定言之，用含有15 pg 蛋白質及25 μι AS 15佐劑之50 hL注射液對小鼠進行肌肉 内免疫。 將小鼠分為每組29隻小鼠之組。如下在第0天、第14 天、第28天及第42天對小鼠進行免疫： 試驗 LVL076 128049.doc -44- 200902049 LVL068 LVL078 • LVL024 對照物 抗原緩衝液/AS 1 5緩衝液 全長NY-ESO-1 •不具有膠原蛋白樣域（CLD)之L AGE· la • MAGE A3 在第28天用皮下移植B16/NY-ESO-1腫瘤細胞對每組10 隻小鼠進行攻毒。在第56天用皮下移植B16/LAGE-1A腫瘤 細胞對每組9隻小鼠進行攻毒。在第0天、第14天、第28 天、第42天、第56天、第84天及第105天取血清且藉由 ELISA(IgGl 及 IgG2a)來評估對（i)全長 NY-ESO-1、（ii)不具 有膠原蛋白樣域之LAGE-la及（iii)人類膠原蛋白之抗體反 應。篩檢#2之實驗設計概述於圖22及圖23中。 結果 B16-NYES01腫瘤攻毒。 在接受LVL078之小鼠中，有兩隻小鼠在B16-NY-ESO-1 攻毒後在50餘天内不含腫瘤。在接受全長NY-ESO-1或 LVL024之小鼠中，每組有兩隻小鼠在50餘天内不含腫 瘤，有三隻小鼠存活。在接受LVL068之小鼠中，有三隻 小鼠不含腫瘤且有四隻小鼠存活。在接受LVL076之小鼠 中，有3隻小鼠不含腫瘤且有5隻小鼠存活。參見圖24。 B16-LAGEla腫瘤攻毒。 128049.doc -45- 200902049 接受LVL076或不具有膠原蛋白樣區域之LAGE-la之所有 小鼠在攻毒後第4〇天之前死亡。在僅接受緩衝液之小鼠 中’有一隻小鼠存活’其在研究結束時不含腫瘤。在接受 LVL024之小鼠中，有一隻小鼠在研究結束時不含腫瘤。 在接党全長NY-ESO-1之小鼠中，無小鼠不含腫瘤，但在 研究結束時仍有一隻小鼠存活。在接受LVL078之小鼠 中’有一隻小鼠不含腫瘤。在接受LVL068之小鼠中，有 三隻小鼠不含Μ瘤。在接受LVL076之小鼠中，有三隻小 昧Vi在研究結束日守不含腫瘤。參見圖25。該等結果概述於以 下圖表中。 免疫原 NY-ESO-1 LAGE-la 保護 特異性免疫 保護 特異性免疫 LVL068 ++ ++ -H- ++ LVL078 ++ ++ ++ ++ LVL024 士 ++ LVL076 + + - + 圖表3.對B16-LAGEla腫瘤攻毒之保護。註解：（_)_最 低；（士)-次最低反應；（+)-中等反應；（++)-最高反應。 人類膠原蛋白特異性免疫反應 為研究NY-ESO-1之膠原蛋白樣域是否刺激人類膠原蛋 白特異性免疫反應，在接種後14天時自經以下物質中之一 者免疫之小鼠收集血清且彙集：（1)緩衝液（對照物）；（2)全 長NY-ESCM ; (3)不具有膠原蛋白樣域之LAGE-la ; (4)LVL068 ； (5)LVL078 ； (6)LVL024 ； (7)LVL076。對該等 七個血清集合中之每一者以及含有mAb抗人類膠原蛋白】 之陽性對照物進行ELISA。膠原蛋白樣域不刺激小鼠抗人 128049.doc -46- 200902049 類膠原蛋白I抗體產生。參見圖26。對於膠原蛋白III及膠 原蛋白VI進行類似研究（結果未展示）；未偵測到小鼠抗人 類膠原蛋白III及小鼠抗人類膠原蛋白VI抗體產生。 實例4 :精製構築體 使用常規選殖技術對表4中列出之一些構築體進行修 飾。特定言之，對LVL068、LVL030、LVL076、LVL078、 LVL024 進行修飾以得到 LVL155、LVL106、LVL156、 LVL 1 57、LVL 151。存在兩種類型之修飾，第一種為移除 蛋白質D與嵌合物之開始部分之間的5個胺基酸殘基。舉例 而言，此修飾係由 LVL024(SEQ ID NO: 74 ; SEQ ID NO: 75)進行以得到 LVL151(SEQ ID NO: 90 ; SEQ ID NO:91)。 因此，LVL024對應於LVL 151。第二類修飾為移除His標籤 與嵌合物之開始部分之間的胺基酸。此修飾係由 LVL068(SEQ ID NO: 80 ; SEQ ID NO: 81)進行以得到 LVL155(SEQ ID NO: 92 ; SEQ ID NO: 93)。因此，LVL068 對應於LVL 1 5 1。經修飾之各融合蛋白構築體及與其對應 之融合蛋白構築體列於實施方式之表5中。 應理解，並不預期上述修飾產生融合蛋白與其相應經修 飾融合蛋白之間的功能差異。因此，預期吾人可利用表5 之右側所列出之各經修飾融合蛋白，其可與該圖表左側所 列出之其相應融合蛋白互換。 實例5. 實,驗設縿。在105天試驗中，使用CB6F1小鼠來評估 LVL068、LVL030、LVL076、LVL078、LVL024及經修飾 128049.doc •47- 200902049 LVL155、LVL106、LVL156、LVL157、LVL151 中之每一 者以研究用融合蛋白加佐劑進行肌肉内免疫是否對抗 B16/NYES01移植腫瘤細胞（在兩次免疫後）或B16/LAGE-la 腫瘤細胞（在四次免疫後）之皮下攻毒。特定言之，用含有 15 pg蛋白質及25 pL AS 15佐劑之50 μ：ί注射液對小鼠進行 肌肉内免疫。 將小鼠分為每組29隻小鼠之組。如下在第0天、第14 天、第28天及第42天對小鼠進行免疫： 試驗 LVL068 LVL030 LVL076 LVL078 LVL024 LVL15 5 LVL106 LVL156 LVL157 LVL151 對照物 抗原緩衝液/AS15緩衝液 全長NY-ESO-1 不具有膠原蛋白域之L A G Ε -1 a MAGE A3 128049.doc -48- 200902049 在第28天用皮下移植B M/NY-ESo—i腫瘤細胞對每組1 〇 隻小鼠進行攻毒。在第56天用皮下移植B16/LAGE1A腫瘤 細胞對每組9隻小鼠進行攻毒。為監測特異性免疫反應， 可在第0天、第Μ天、第28天、第42天、第％天、第84天 及第105天取血清且藉由ELIS A(IgGl及IgG2a)來量測對⑴ 全長NY-ESO-1、（11)不具有膠原蛋白樣域iLAGE_la&(出) 人類膠原蛋白之抗體反應。 前述實例係為達成說明目的而提供，而並非作為限制。 在本發明申請案中，冠詞”一"在本文中用於指一個或一 個以上（亦即至少一個）語法賓語之物品。舉例而言，"一要 素"意謂一或多個要素。 單位、字首及符號可以其SI接受形式表示。除非另外說 明’否則核酸係自左至右以5,至3,方向書寫；胺基酸序列 係自左至右以胺基至絲方向書寫（分別）。數值範圍包括 界定該範圍之數字。胺基酸在本文中可由其通常已知之三 字母符號或由IUPAC_IUB生物化學命名委員會 (Biochemical Nomenclature Commission)推薦之單字母符號 提及。㈣酸可由其通f接受之單字母編碼提及。 上文定義之術語總體上藉由參看本說明書而更充分定義。 【圖式簡單說明】 圖1展不已由不同群體鑑別之ny_es〇_i蛋白上之多種 MHC(主要組織相容性複合物型及Π型抗原決定基。該等 抗原決定基僅為關於該蛋白質所報導之抗原決^基之代 表’因此圖i中之列舉並不詳盡。此外，圖i中所報導及/ 128049.doc -49- 200902049 或列舉之抗原決定基中之至少一或多者尚未經實驗證實。 所報導之ΝΥ-ESO-l胺基酸序列在本文中見於SEQ ID NO:49 中。 圖2展示構築體A，其為包含全長ΝΥ-ESO-l及截斷 LAGE-1(諸如LAGE-la)之融合蛋白。在此實施例中，NY-ESO-1之C末端係與截斷LAGE-1之N末端融合，連同組胺 酸親和標籤以提供長度為288個胺基酸之融合蛋白。構築 體A之其他細節提供於表1中（SEQ ID NO:l ; SEQ ID NO:3)。 圖3展示構築體B，其為包含蛋白質D之前三分之一（不具 有其分泌信號）（例如胺基酸20至127)、全長ΝΥ-ESO-l及截 斷LAGE-1 (諸如LAGE-la)之融合蛋白。在此實施例中，蛋 白質D之胺基酸127係與ΝΥ-ESO-l之N末端融合，NY-ESO-1之C末端係與截斷LAGE-1之N末端融合，以得到長度為 3 98個胺基酸之融合蛋白。構築體B之其他細節提供於表1 中 1.6部分中（SEQ ID NO:2 ; SEQ ID NO:4)。 圖4展示構築體C，其為包含部分截斷NY-ESO-1及截斷 LAGE-1 (諸如LAGE-la)之融合蛋白。在此實施例中，部分 截斷NY-ESO-1之C末端係與截斷LAGE-1之N末端融合以提 供長度為242個胺基酸之融合蛋白。構築體C之其他細節提 供於表 1 中（SEQ ID NO:5 ; SEQ ID NO:7)。 圖5展示構築體D，其為包含蛋白質D之前三分之一（不 具有其分泌信號）（例如胺基酸20至大致127)、部分截斷NY-ESO-1及截斷LAGE-1(諸如LAGE-la)之融合蛋白。在此實 128049.doc -50- 200902049 施例中，蛋白質D之胺基酸127係與部分截斷ΝΥ-ESO-l之N 末端融合，部分截斷NY-ESO-1之C末端係與截斷LAGE-1 之N末端融合，以提供長度為352個胺基酸之融合蛋白。此 實施例之其他細節提供於表1中（SEQ ID NO:6 ; SEQ ID NO:8)。 圖6展示構築體E，其為包含截斷NY-ESO-1及截斷 LAGE-1 (諸如LAGE-1 a)之融合蛋白。在此實施例中，截斷 NY-ESO-1之C末端係與截斷LAGE-1之N末端融合以提供長 度為2 11個胺基酸之融合蛋白。構築體E之其他細節提供於 表 1 中（SEQ ID NO:9 ; SEQ ID ΝΟ:11)。 圖7展示構築體F，其為包含蛋白質D之前三分之一（不具 有其分泌信號）（例如胺基酸20至大致127)、截斷NY-ESO-1 及截斷LAGE-1(諸如LAGE-la)之融合蛋白。在此實施例 中，蛋白質D之胺基酸127係與截斷NY-ESO-1之N末端融 合，截斷NY-ESO-1之C末端係與截斷LAGE-1之N末端融 合，以提供長度為321個胺基酸之融合蛋白。構築體F之其 他細節提供於表 1 中（SEQ ID NO:10 ; SEQ ID NO:12)。 圖8展示構築體E之另一實施例（亦即E’），其中截斷 LAGE-1之C末端係與截斷NY-ESO-1之N末端融合以提供長 度為212個胺基酸之融合蛋白。此實施例構築體E’之其他 細節提供於表 1 中（SEQ ID NO:21 ; SEQ ID NO:23)。 圖9展示構築體G，其為包含截斷NY-ESO-1、截斷 LAGE-1 (諸如LAGE-1 a)及膠原蛋白樣區域（諸如來自NY-ESO-1之膠原蛋白域）之融合蛋白。在此實施例中，該膠原 128049.doc -51 - 200902049 蛋白樣區域之C末端係（例如）與截斷LAGE-1之N末端融 合。轉而截斷LAGE-1之C末端係與截斷NY-ESO-1之N末端 融合’以提供長度為289個胺基酸之融合蛋白。構築體g之 其他細節提供於表1中（SEQ ID NO:13 ; SEQ ID NO:15)。 圖10展示包含具有部分截斷膠原蛋白樣域之ny_escm 之例示性重組多肽的示意圖。圖1〇_13中所示之抗原決定 基僅為關於蛋白質所報導之抗原決定基之代表且尚未經實 驗證實。 圖11展示包含蛋白質D之前三分之一（不具有其分泌信 號）（例如胺基酸20至大致127)及具有部分截斷膠原蛋白樣 域之NY-ESO-1之例示性融合蛋白的示意圖。 圖12展示包含具有部分截斷膠原蛋白樣域之 之例示性重組多肽的示意圖。 圖13展示包含蛋白質D之前三分之一（不具有其分泌信 號）（例如胺基酸20至大致127)及具有截斷膠原蛋白樣域之 NY-ESO-1之例示性融合蛋白的示意圖。 圖14為展示在截斷LAGE-la蛋白内鑑別之多種抗原決定 基之不意圖。該等抗原決定基僅為關於該蛋白質所報導之 抗原決定基之代表且因此該列舉並不詳盡。為避免疑問， 除非在本文中另外說明，否則在圖式中所報導及/或列舉 之杬原決定基可能或可能並非未經實驗證實（亦即，其可 經預測等）。完全LAGE-U胺基酸序列列於以SEQ m NOW列出之序列中。完全LAGE_ib胺基酸序列（此圖式中 未描述之LAGE-lb)列於以SEQ ID Ν〇:7〇,】出之序列中。 128049.doc •52· 200902049 圖15展示ΝΥ-ESO-l與LAGE-1以及多種MHC(主要組織相 容性複合物）1型及II型抗原決定基之示意圖。該等抗原決 定基僅為關於蛋白質所報導之抗原決定基之代表，因此該 列舉並不詳盡；所報導及/或所列出之抗原決定基中之一 或多者尚未經實驗證實。 圖16展示NY-ESO-1/LAGE-1融合體設計之示意圖。 圖17以示意性方式概述15種構築體及其產生量。P=蛋白 質D ; C(灰色方框）=NY-ESO-l膠原蛋白樣域；C(白色方 框）=截斷膠原蛋白樣域；L=不具有膠原蛋白樣域之Lage 1 ; N=不具有膠原蛋白樣域之ΝΥ-ESO-l ;黑色箭頭=聚組 胺酸標籤；（-)=低產生；（+)=少許產生；（++)=高產生； (+++)=最佳產生。8種構築體之胺基酸序列及編碼其之核 苷酸序列概述於表4及序列表中。 圖18概述篩檢#1，其為使用CB6F1小鼠來評估LVL076、 LVL079、LVL78、LVL68、LVL020、LVL26、LVL024、 LVL30中之每一者以判定用融合蛋白加佐劑進行肌肉内免 疫是否賦予對經移植腫瘤（B16/NYES01)皮下攻毒之保護 的76天試驗。 圖19概述在76天試驗中所用之對照小鼠之B-16-NY-ESO-1腫瘤生長。 圖 20展示經全長ΝΥ-ESO-l、LVL030、LVL068、LVL079 或LVL026免疫之小鼠的存活。 圖21概述如由ELISA、FACS及西方墨點法所評估之NY-ESO-1特異性免疫反應及如由ELISA及FACS所評估之 128049.doc -53- 200902049 LAGE-l a(不具有膠原蛋白樣域）特異性免疫反應。 圖22概述篩檢#2之實驗設計，其為判定用所選融合蛋白 加佐劑進行肌肉内免疫是否賦予對B16/NY-ESO-1攻毒及 B16/LAGE-la攻毒之保護的105天試驗。展示B16/NY-ESO- 1攻毒。 圖23概述篩檢#2且展示B16/LAGE-la攻毒。 圖 24展示 B16/NY-ESO-1 攻毒後經 LVL078、LVL068、全 長NY-ESO-1、LVL024及LVL076免疫之小鼠的存活。參見 圖24。 圖25展示B16/LAGE-la攻毒後經LVL076、不具有膠原蛋 白樣區域之 LAGE-la、LVL024、全長 NY-ESO-1、LVL078 或LVL068免疫之小鼠的存活。 圖26自左至右之列1-8展示進行以偵測經以下各物中之 一者免疫之小鼠可能之人膠原蛋白特異性免疫反應的 ELISA結果：（1)缓衝液（對照物）；（2)全長NY-ESO-1 ; (3) 不具有膠原蛋白樣域之LAGE-la ; (4)LVL068 ; (5)LVL078 ; (6)LVL024 ; (7)LVL076。陽性對照物（第 8行） 含有抗人膠原蛋白1單株抗體（mAb抗人膠原蛋白I)。 128049.doc 54-

Claims (1)

1. 200902049 十、申請專利範圍： 1. 一種融合蛋白，其包含： (a) ΝΥ-ESO-l或其片段，連接於 (b) LAGE-1或其片段， 其中ΝΥ-ESO-l及/或LAGE-1中之至少一者經截斷或部分 截斷，或為一個包括ΝΥ-ESO-l或LAGE-1之一或多個抗 原決定基（epitopes)之片段。 2. 如請求項1之融合蛋白，其中該ΝΥ-ESO-l係選自：全長 ： ΝΥ-ESO-l、部分截斷之ΝΥ-ESO-l或截斷之ΝΥ-ESO-l或 其包括ΝΥ-ESO-l之一或多個抗原決定基之任何片段。 3. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該LAGE-1係選自：全長 LAGE-1、部分截斷之LAGE-1或截斷之LAGE-1或其包括 LAGE-1之一或多個抗原決定基之任何片段。 4. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該ΝΥ-ESO-l或LAGE-1 與天然存在之ΝΥ-ESO-l或LAGE-1具有至少95%、96%、 97%、98%、99°/。或 100%— 致性。 :: 5.如請求項1或2之融合蛋白，其中該LAGE-1為LAGE-la。 6. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該ΝΥ-ESO-l之N端係與 該LAGE-1之C端融合。 7. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該ΝΥ-ESO-l之C端係與 該L AGE-1之N端融合。 8. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包含 異種融合搭配物。 9. 如請求項8之融合蛋白，其中該異種融合搭配物為蛋白 128049.doc 200902049 質D或其衍生物或片段。 10·如凊求項9之融合蛋白其 質0之約前1/3，例如蛋白質 11.如請求項9之融合蛋白 化0 中該蛋白質D衍生物包含蛋白 D之胺基酸20至127。 其中該蛋白質D衍生物未脂質 12. 如請求項1或2之融合蛋 Asp& ρΓ〇。 白’其進一步包含胺基酸Met、 ’其中s亥荨胺基酸Met、Asp及 中任一項之蛋白質D異種融合搭 13.如請求項12之融合蛋白 Pr0係與如請求項9至11 配物之N端融合。 14.如請求項之融合蛋白 蛋白。 ’其中該融合蛋白為重組融合 15.如請求項丨或2之融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包含 一種親和標籤。 1 6.如請求項1 5之融合蛋白，Α中 户 /、甲5哀親和“籤為包含1至J 〇 個組胺酸殘基之組胺酸尾。 17. —種核酸分子，其編碼如請求項丨至16中任一項之融合 蛋白。 18. —種載體’其包含如請求項17之核酸分子。 19. 一種宿主細胞’其經如請求項18之載體轉化。 20. 一種免疫原性組合物或疫苗，其包含如請求項丨至“中 任一項之融合蛋白、如請求項17之核酸分子或如請求項 18之载體。 21. 如請求項20之免疫原性組合物或疫苗，其另外包含—種 128049.doc 200902049 佐劑及/或免疫刺激性細胞因子（cytokine)或趨化因子 (chemokine) 〇 22. 如請求項20或21之免疫原性組合物或疫苗，其中該融合 蛋白係存在於水包油或油包水乳液媒劑中。 23. 如請求項21之免疫原性組合物或疫苗，其中該佐劑包含 3D-MPL、QS21或CpG寡核苷酸。 24. 如請求項20或21之免疫原性組合物或疫苗，其另外包含 一或多種其他抗原。 25·如請求項20或2 1之免疫原性組合物或疫苗，其係用於藥 物中。 26· —種如請求項i至16中任一項之融合蛋白或如請求項17 之核酸分子或如請求項1 8之載體或如請求項2〇至25中任 一項之組合物或疫苗的用途，其係用於製備供治療癌症 之藥劑，該癌症例如乳房黑素瘤；乳癌；前列腺癌；膀 胱癌，包括移行細胞癌（transiti〇nal cell carcin〇ma);肺 癌，包括非小細胞肺癌（NSCLC);頭頸癌，包括食道 癌；鱗狀細胞癌；胃腸道癌；肝癌；腦腫瘤；白血病； 及各種肉瘤。 士 π I胃26<用^ ’其中該藥劑係用於治療不適於此2/ neu|&向療法之患者。 128049.doc