ES2402767T3 - ADN que codifica p185 neu y usos terapéuticos del mismo - Google Patents

ADN que codifica p185 neu y usos terapéuticos del mismo Download PDF

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Abstract

Un vector de transferencia de ADN que contiene unaUn vector de transferencia de ADN que contiene una secuencia que codifica un fragmento de p185neu, e secuencia que codifica un fragmento de p185neu, en el quedicha secuencia está seleccionada del grupn el quedicha secuencia está seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, 10, 11, 13, 14. o que consiste en SEC ID Nº: 2, 10, 11, 13, 14.

Description

ADN que codifica p185 neu y usos terapéuticos del mismo
La presente invención se refiere a vectores plasmídicos que contienen secuencias que codifican p185neu y el uso de las mismas en vacunación de ADN contra tumores. Las plásmidos de acuerdo con la invención contienen 5 secuencias que codifican diferentes fragmentos de oncoproteína p185neu humana o de rata y son capaces de inducir una respuesta inmune mediada por células o humoral contra tumores que expresan oncogenes de la familia ErbB.
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen dichos plásmidos y su uso para la prevención o terapia de tumores que expresan p185neu.
Antecedentes de la invención
10 La proteína p185neu, uno de los antígenos tumorales más estudiados, ha generado gran interés como diana para terapia inmune contra cáncer, debido a su presencia en la membrana celular de algunos de los carcinomas humanos más habituales.
p185neu es un receptor de membrana codificado en la rata por el proto-oncogén Her-2/neu y que pertenece a la familia de los receptores tirosina quinasa (RTK) de clase I, que también comprende el receptor del factor de 15 crecimiento epidérmico EGF-R (ErbB-1) y otros receptores relacionados con el mismo (ErbB-3 y ErbB-4). Estos receptores están implicados en la proliferación y diferenciación celular (Hynes y Stem, 1994 BBA 1198:165) y por lo tanto atraen un gran interés biológico y clínico. El receptor consiste en tres dominios bien diferenciados: un dominio extracelular, transmembrana e intracitoplasmático. p185neu está implicado en la compleja red de mecanismos de transducción de señal intracelular y comunicación intracelular que regulan los procesos de proliferación y
20 diferenciación (Boyle 1992 Curr. Op. Oncol. 4:156). El oncogén neu se llama así por el neuroglioblastoma de rata inducido de forma química del que se aisló por primera vez. Esta forma neu activada tiene una mutación puntual única que da como resultado el reemplazo de “A” con “T” y la sustitución consecuente del resto de valina en la posición 664 de p185neu con un resto de ácido glutámico (Val664Glu) (Bargmann y col. 1986, Cell 45:649).
Además, el homólogo de neu humana, ErbB-2, se ha aislado y caracterizado y se ha demostrado que tanto el
25 receptor HER2/neu de rata como ErbB2 humano tienen una homología significativa con EGFR (Coussens y col. 1985, Sciente 230:1132; Yamamoto y col. 1986, Nature 319:230). Aunque una mutación genética en la secuencia de rata es la causa de la activación del receptor constitutivo a través de dimerización, en tumores humanos positivos para ErbB-2 se observa una expresión aberrante del oncogén (Di Marco y col. 1990, Mol. Cell. Biol. 10:3247; Klapper y col., 2000, Adv Cancer Res, 77:25), incluso aunque, en pocos casos, se han descubierto mutaciones
30 puntuales activadoras y mecanismos de corte y empalme anómalos (Kwong y col., 1998, Mol Carcinog, 23:62; Xie y col, 2000, J Natl Cancer Inst, 92:412). El efecto global es similar: la amplificación génica y aumento del nivel de transcripción determinan un exceso del receptor de membrana p185neu, con el consecuente aumento de dímeros activos que transducen intracelularmente señales de crecimiento de una manera independiente de ligando. La estructura cristalina de la región extracelular de p185neu humana y de rata recientemente presentada muestra que
35 esta proteína se caracteriza por una conformación rígida que permite interaccionar con otros receptores ErbB, sin unirse directamente a ningún ligando, y desencadena la transducción de la señal de proliferación (Cho HS y col. 2003, Nature 421:756).
En circunstancias normales, p185neu humana está implicada en organogénesis y crecimiento epitelial; se expresa a altos niveles durante la formación de placenta y el desarrollo fetal, mientras que está presente a niveles muy bajos
40 en tejidos adultos (Press y col. 1990, Oncogene 5:953).
Varios estudios han demostrado que la sobreexpresión de p185neu humana está asociada con el proceso neoplásico y hasta el nivel de agresión tumoral. La sobreexpresión de p185neu se ha descrito en adenocarcinomas de pulmón (Kern y col. 1986, Cancer Res. 50:5184), colon (Cohen y col. 1989, Oncogene 4:81), ovario (Slamon y col, 1989, Science 244:707) y en un gran número de carcinomas de mama humanos (Slamon y col, 1989, Science 244:707;
45 Jardines y col. 1993, Pathobiology 61:268).
Las propiedades fundamentales que hacen a p185neu una diana óptima para vacunación con plásmidos son: a) su implicación directa en el crecimiento celular y carcinogénesis, por lo tanto las variantes de clonación que, debido a la inestabilidad genética tumoral, pierden la expresión de este antígeno también pierden su tumorigenicidad; b) su expresión en la membrana plasmática, que la hace reconocible por anticuerpos incluso en células tumorales que
50 pierden la expresión del sistema mayor de histocompatibilidad (Lollini P. y Forni G. 2003, Trends Immunol. 24: 62).
Estudios llevados a cabo en ratones transgénicos para el oncogén de rata activado Her-2/neu (que desarrollan espontáneamente tumores de mama positivos para p185neu) y en modelos murinos que usan líneas tumorales trasplantables positivas para p185neu, han demostrado la posibilidad de prevenir y curar lesiones preneoplásicas. En particular, con respecto a la prevención de tumores mamarios en ratones transgénicos para Her-2/neu activado de 55 rata, los inventores han demostrado que el plásmido que codifica los dominios extracelular y transmembrana de p185neu de rata es capaz de inducir una protección in vivo más eficaz que el plásmido que codifica el p185neu de rata de longitud completa o solamente el dominio extracelular (antígeno secretado) (Amici A. y col. 2000, Gene Ther., 7:
703; Rovero S. y col. 2000, J. of Immunol., 165: 5133). Se han presentado resultados similares por Chen y col. (1998, Cancer Res 58:1965). Otros autores han demostrado que los plásmidos que codifican p185neu, sin variación o mutados para eliminar su actividad tirosina quinasa, son eficaces en la prevención de la aparición de tumores después de inóculo de células positivas para p185neu (Wei WZ y col. 1999, Int J. Cancer 81:748). Además, se demostró que los plásmidos desprovistos de la señal responsable del procesamiento a través de retículo endoplásmico (líder), que determina la localización citoplásmica del antígeno de p185neu, eran igualmente eficaces. La protección inducida por diferentes plásmidos se midió principalmente por una respuesta inmune humoral en el caso de expresión en membrana de p185neu y por una respuesta inmune mediada por linfocitos T en el caso de localización citoplasmática (Pilon SA y col, 2001, J. of Immunol. 167: 3201). Sin embargo, la vacunación combinada con plásmidos que inducían la sobreexpresión de p185neu tanto en el citoplasma como en la membrana fue más eficaz en la protección contra crecimiento tumoral (Piechocki MP y col. 2001, J. Immunol. 167: 3367).
Por lo tanto, el equilibrio entre diferentes mecanismos de respuesta inmune podría ser particularmente importante (Reilly y col., 2001, Cancer Res. 61: 880). Además, se ha observado que la vacunación con plásmidos que codifican los dominios extracelular y transmembrana de p185neu de rata es capaz de erradicar masas tumorales con 2 mm de diámetro, tras el inóculo de células que sobre-expresan p185neu, a través de varios mecanismos efectores diferentes del sistema inmunitario (linfocitos T auxiliares y citolíticos T, anticuerpos, macrófagos, neutrófilos, linfocitos citolíticos naturales, receptores de Fc, interferón gamma y perforinas), que cooperan para el rechazo tumoral (Curcio C. y col., 2003, J. Clin. Invest. 111: 1161).
Descripción de la invención
Se han insertado diversas construcciones que codifican la proteína p185 humana o quimérica humana/de rata en vectores plasmídicos y se han usado en experimentos de inmunización dirigidos a prevenir la progresión tumoral. Para la construcción de plásmidos, se han preparado fragmentos de la proteína p185neu humana que contiene el dominio transmembrana y partes del dominio extracelular de longitud decreciente a partir de la secuencia del oncogén ErbB2, o partes de la misma se han reemplazado con secuencias homólogas del ADNc de Her-2/neu de rata para crear plásmidos quiméricos.
Los plásmidos obtenidos de este modo se han evaluado en experimentos de vacunación en ratones inoculados con células tumorales que sobre-expresan p185neu humana. Los plásmidos que contenían formas truncadas de p185neu indujeron una sensibilidad antitumoral mediada por linfocitos T auxiliares y citolíticos, mientras que los plásmidos quiméricos indujeron una respuesta de anticuerpos contra p185neu tanto humana como de rata.
Basándose en los resultados de los experimentos in vivo, se han seleccionado los plásmidos que contienen secuencias de p185neu capaces de inducir una respuesta inmunitaria fuerte de tipo tanto celular como humoral. Estos plásmidos, objeto de la presente invención, contienen una secuencia que codifica un fragmento de p185neu seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 2, 10-14 (secuencias de referencia de p185neu humana y de rata están disponibles en los números de referencia de Gene Bank M11730 y X03362, respectivamente).
De acuerdo con la invención, las secuencias codificantes de p185neu puede insertarse en cualquier vector plasmídico adecuado para administración humana. Además de las secuencias codificantes, los plásmidos pueden contener elementos funcionales para el control de la transcripción, en particular un promotor situado cadena arriba de la secuencia codificante, preferentemente el promotor de CMV, elementos de transcripción de inicio y parada, marcadores de selección, tales como genes de resistencia a ampicilina o kanamicina, motivos de CpG, un sitio de poliadenilación o activadores de la transcripción. Los elementos de control de la transcripción deberían ser compatibles con el uso del vector en seres humanos. En una realización preferida, los plásmidos de la invención contienen al menos 4 motivos CpG, preferentemente al menos 8, hasta un máximo de 80. Los motivos CpG (ATAATCGACGTTCAA) de origen bacteriano inducen que los macrófagos secreten IL-12, que a su vez induce la secreción de IFN gamma por linfocitos citolíticos naturales, activando de este modo una respuesta mediada por linfocitos T auxiliares (Chu R.S. y col., 1997, J. Exp. Med., 186: 1623). Por lo tanto, la inserción de motivos CpG en secuencias plasmídicas potencia la respuesta inmune.
En una realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene uno o más plásmidos diferentes como se ha definido anteriormente en asociación con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas, en una forma adecuada para la administración parenteral, preferentemente en forma de solución inyectable, se usan convenientemente para vacunación de ADN. Los principios y procedimientos para vacunación de ADN se conocen por los expertos en la materia y se desvelan, por ejemplo, en Liu MA 2003; Int J Med 253: 402.
En otra realización, la invención proporciona una preparación combinada que contiene al menos dos, preferentemente al menos cuatro, más preferentemente al menos ocho plásmidos diferentes para administración simultánea, secuencial o separada a un sujeto o paciente.
Los plásmidos, composiciones y preparaciones de acuerdo con la invención se usan en tratamiento preventivo o terapéutico de sujetos en riesgo de desarrollar tumores positivos para p185neu, o pacientes con tumores primarios, metástasis o recaídas de tumores positivos para p185neu. La prevención puede ser primaria, cuando el tumor no está
manifiesto, secundaria, cuando el tumor está en las fases iniciales como una lesión preneoplásica, o terciaria, en el caso de recaída de tumor o proceso metastásico. Los tumores que pueden beneficiarse del tratamiento con los plásmidos de la invención son los de origen epitelial, en particular adenocarcinomas pulmonares, ováricos y mamarios y, más generalmente, tumores que expresan la proteína p185neu.
Descripción detallada de la invención
Construcción de la cadena principal de plásmido de pCMV3.1
Para construir plásmidos que codifican fragmentos de p185neu humana y plásmidos quiméricos, se usó la cadena principal plasmídica de pCMV3.1. Se han insertado fragmentos que derivan de ADNc del proto-oncogén ErbB-2 humano y de ADNc del proto-oncogén Her-2/neu de rata en pCMV3.1 (Invitrogen, Milán, Italia), retirando con enzimas de restricción DraIII (nt1531) y BsmI (nt3189) un fragmento de 1658 pb que contiene el origen de replicación f1, el origen de replicación y el promotor de SV40 temprano, el gen que codifica resistencia a neomicina y señal de poliadenilación SV40. El plásmido modificado resultante (pCMV3.1) presenta algunas ventajas en comparación con pcDNA3.1 nativo. De hecho, la reducción del tamaño a 3900 pb y la retirada de secuencias irrelevantes contribuyen a aumentar la eficacia de transfección in vivo.
Construcción del plásmido pCMV3.1erbB2
Se ha insertado ADNc de ErbB2 humano, obtenido del plásmido pSVerbB2, en el sitio de clonación múltiple de pCMV3.1 en los sitios de restricción HindIII y XbaI. Este plásmido se usa para la construcción de plásmidos que expresan p185neu truncada y plásmidos quiméricos.
Construcción de plásmidos que contienen la secuencia 4XCpG: pCMY3.1hECD-TM-4CpG y pCMV3.1 hECD-TM 4noCpG
Después de la retirada de la secuencia que codifica el dominio intracitoplasmático del plásmido pCMV3.1-erbB2, se prepararon dos plásmidos que codificaban las regiones para transmembrana y extracelular del proto-oncogén ErbB2. El procedimiento comprendió en primer lugar el análisis de restricción para identificar los sitios únicos presentes en la secuencia de nucleótidos de ADNc de ErbB2. Se identificó un sitio único reconocido por la enzima AccIII (nt 2195) aproximadamente 20 pb cadena abajo del final del dominio transmembrana.
El dominio citoplasmático se retiró usando la enzima AccIII presente como sitio de restricción único y enzima XbaI. Para reinsertar en el extremo 3’ del ADN del ErbB2 ECD-TM, el triplete de nucleótidos TAA, reconocido como señal de parada de la traducción, los inventores usaron dos secuencias sintéticas que consistían en dos oligonucleótidos sentido (oligonucleótido Nº 1, Nº 3) y antisentido (oligonucleótido Nº 2, Nº 4) que tenía los sitios de restricción AccIII y XbaI en sus extremos. En estas secuencias sintéticas también hay cuatro secuencias repetidas CpG y noCpG. Esta última se usa como un control negativo. Estos dos plásmidos nuevos se han nombrado pCMV3.1hECD-TM4CpG y pCMV3.1hECD-TM-4noCpG.
Construcción de los plásmidos que contienen la secuencia 8XCpG: pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG y pCMY3.1H/NhECD-TM-8noCpG
Para añadir estímulos inmunes específicos adicionales los inventores construyeron una nueva cadena principal plasmídica que contenía 4 secuencias CpC inmunoestimuladoras, llamadas pCMV3.1 H/N-4CpG. Para este fin los inventores modificaron pCMV3.1 para retirar uno de los dos sitios de restricción para la enzima PmeI e invertir los sitios de restricción para HindIII y NneI presentes en el sitio de clonación múltiple por medio de una secuencia sintética que consiste en dos oligonucleótidos sentido (oligonucleótido Nº 5) y antisentido (oligonucleótido Nº 6). En este nuevo plásmido, nombrado pCMV3.1 H/N, se han insertado dos secuencias sintéticas, consistentes en dos nucleótidos sentido (oligonucleótido Nº 7, Nº 9) y antisentido (oligonucleótido Nº 8, Nº 10), que contienen cuatro repeticiones para las secuencias CpG y noCpG en los sitios de restricción únicos XbaI y PmeI, obteniendo de este modo pCMV3.1 H/N-4CpG y 4noCpG. A continuación, se han insertado los fragmentos de ADN hECD-TM-4CpG y hECD-TM-4noCpG en pCMV3.1 H/N-4CpG y en pCMV3.1 H/N-4noCpG respectivamente, obteniendo de este modo dos nuevos plásmidos llamados pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG y pCMV3.1 H/N-hECD-TM-8noCpG.
Construcción del plásmido que contiene la secuencia del segundo dominio de cisteína y dominio transmembrana de p185neu humano: pCMY3.1H/NH2° cysECD-TM-8CpG
El dominio extracelular de p185neu humana se caracteriza por dos regiones ricas en cisteínas, conocidas como 1º y 2º subdominio de cisteína (1º cys y 2º Cys). A diferencia de la secuencia de ADNc de rata que contiene solamente un sitio BstEII (nt1250) en el dominio extracelular, localizado en la región de nucleótidos que separa 1º cys de 2º cys, la secuencia de ADNc del dominio extracelular de ErbB2 tiene dos sitios de restricción para BstEII: además del sitio en la misma posición que el de rata (nt1372), está presente un sitio BstEII adicional (nt963) en la parte que codifica el 1º cys del dominio extracelular. Digiriendo el plásmido pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG con HindIII y BstEII, se obtuvo un fragmento de ADN consistente en el 2º cys del dominio extracelular, el dominio transmembrana, la secuencia 8CpG y el plásmido pCMV3.1H/N. Después se insertó la señal para secreción de p185neu de rata a través del retículo endoplásmico por amplificación de ADN enzimática (reacción de PCR) usando un oligonucleótido
sentido consistente en el cebador T7 (oligonucleótido Nº 11) que reconoce la ARN polimerasa T7, presente en el inicio del sitio de clonación múltiple de pCMV3.1H/N, y un oligonucleótido antisentido (oligonucleótido Nº 12) que tiene el sitio BstEII en su extremo. Después de la purificación, la digestión enzimática del fragmento amplificado con enzimas de restricción HindIII y BstEII y posterior clonación, se ha obtenido pCMV3.1H/Nh2 ºCys-TM-8CpG (Figura 1). (Figura 1). Este plásmido se usó en experimentos de vacunación, para compararlo con pCMV3.1 H/NhECD-TM8CpG. A continuación, se ha preparado un ADNc quimérico que codifica la proteína de fusión entre el 2º cys y el dominio transmembrana (nt1372-nt2204) de la secuencia humana y 1º cys (nt-1-nt 1250) de la secuencia de rata. La reconstitución de la secuencia proteica completa por la fusión de partes que derivan de ADNc de rata y humanos, respectivamente, permite aumentar la respuesta inmune.
Construcción del plásmido quimérico que contiene la secuencia del primer dominio de cisteína de p185neu de rata y del segundo dominio de cisteína y dominio transmembrana de ser humano (nt 1-nt 1250): pCMY3.1H/N-r1°cysh2°cysTM-8CpG
A diferencia de la secuencia de ADNc de rata que contiene solamente un sitio BstEII (nt1250) en el dominio extracelular localizado en la región de nucleótidos que separa la primera y la segunda región ricas en cisteínas, la secuencia de ADNc del dominio extracelular de Erb2 tiene dos sitios de restricción para BstEII: uno en la posición 1372 (nt), como en la secuencia de rata, y el otro en la posición 963 (nt), es decir en la parte de secuencia que codifica el 1º cys del dominio extracelular. La presencia del sitio BstEII en la misma posición tanto en el dominio de ADNc de rata (1250nt) como en el ADNc humano (1372nt) permitió la construcción de un plásmido capaz de codificar un producto de fusión entre el 1º cys de rata y 2º cys humana. De hecho, la digestión de pCMV3.1H/N-h2º cys TM-8CpG con las enzimas de restricción HindIII y BstEII permitió reemplazar el fragmento de ADN que codificaba la señal de secreción de p185neu de rata con la secuencia de nucleótidos que codificaba el 1º cys de rata obtenido a través de la digestión de pCMV3.1rECD-TM-4CpG con las mismas enzimas. El producto del plásmido pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG (Figura 2) consiste en una parte de 412 aa de p185neu de rata y una parte de 274 aa de p185neu humana. Este nuevo plásmido, pCMV3.1H/Nr1°cys-h2°cysTM-8CpG se ha usado en experimentos de vacunación usando pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG como término comparativo. Sorprendentemente, el plásmido que codifica la proteína quimérica induce en ratones una protección completa contra tumores que expresan p185neu humana (Tabla). Esta protección es similar a la inducida por pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG. Además, el análisis de los sueros de ratones vacunados con ambos plásmidos ha demostrado un título de anticuerpos similar frente a p185neu humana.
Plásmidos capaces de codificar fragmentos decrecientes del dominio extracelular y transmembrana de p185neu humana
Construcción de siete plásmidos que codifican fragmentos decrecientes del dominio extracelular y transmembrana de p185neu, concretamente: pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG (-70 aa), pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG (-150 aa), pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG (-230 aa), pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG (-310 aa), pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG (-390 aa), pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG (-470 aa) y pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG (-550 aa).
El fragmento codificado por el primero de estos fragmentos es 70 aminoácidos más corto (deleción de 360 pb). Todos los demás son gradualmente 80 aa más cortos (deleciones de 240 pb).
Estos fragmentos se han obtenido por amplificación enzimática de ADN, usando siete oligonucleótidos sentido diferentes con el sitio de restricción NheI (oligonucleótidos Nº 13 – Nº 19) en su extremo y un oligonucleótido antisentido (oligonucleótido Nº 20) capaz de reconocer el sitio llamado “sitio de cebador inverso pcDNA3.1BGH” (830-850 nt) presente en el extremo 3' del poli-ligador de pCMV3.1. Además de la digestión enzimática con enzimas de restricción NheI y PmeI, se han clonado productos de amplificación en pCMV3.1H/N-líder neu, previamente obtenido insertando la señal de secreción en el retículo endoplásmico de p185neu de rata en sitios de restricción. El fragmento de ADN de la señal de secreción de p185neu de rata se ha obtenido por amplificación de ADN enzimática usando el cebador T7 (oligonucleótido Nº 11) como el nucleótido sentido y un nucleótido antisentido (oligonucleótido Nº 21) con sitio NheI en su extremo. El fragmento amplificado después de purificación y digestiones de restricción con HindIII y NheI se ha clonado en el plásmido pCMV3.1H/N, digerido con las mismas enzimas, obteniendo de este modo el pCMV3.1H/N-líder neu. Se espera expresión en membrana de las diferentes formas truncadas de p185neu humana a la vista de la presencia de la señal de secreción en el retículo endoplásmico de p185neu de rata. Los plásmidos que codifican las formas truncadas pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG (Figura 3), pCMV3.1H/NhECD2-TM8CpG (Figura 4), pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG (Figura 5), pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG (Figura 6), así como el plásmido de control pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG, protegen al 100% de los ratones vacunados contra un inóculo letal de células tumorales que expresan p185neu humana (Tabla). El plásmido pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG (Figura 7) protege al 60% de los animales (Tabla), mientras que los plásmidos pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG y pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG (Figuras 8, 9), no tienen efectos protectores contra un inóculo letal de células tumorales que expresan p185neu humana (Tabla). Los productos proteicos expresados por los diferentes plásmidos no se secretan a través del retículo endoplásmico. La ausencia de secuencias consenso necesarias para glicosilación y para su procesamiento a través del retículo endoplásmico, o cambios conformacionales debido a deleción de aminoácidos en el extremo -NH2, podrían explicar la ausencia de productos proteicos en la membrana. Por lo tanto, para verificar adicionalmente si las diversas formas truncadas del dominio extracelular y transmembrana de p185neu humana se expresaban correctamente, se generaron nuevos plásmidos que codifican proteínas de fusión caracterizadas por el epítopo myc en el extremo -NH2. Estas proteínas recombinantes se reconocen por un anticuerpo monoclonal anti-myc, por lo tanto es posible analizar su expresión y localización por microscopía confocal.
En primer lugar se ha creado un nuevo plásmido que codifica la señal de secreción para el retículo endoplásmico de rata (líder neu) y para el epítopo myc. Se ha llevado a cabo clonación usando una secuencia sintética consistente en una con sentido (oligonucleótido Nº 22) y antisentido (oligonucleótido Nº 23) que tienen en ambos extremos el sitio Nhel. El sitio Nhel en la posición 5’ se mutó de modo que, una vez correctamente ligado, no se reconocía por la enzima. Los inventores obtuvieron de este modo el pCMV3.1H/N-líder neu-epítopo myc. Con este plásmido, las secuencias que codifican formas truncadas de p185neu humana se han clonado en los sitios de restricción NheI y PmeI. Después, se han transfectado fibroblastos 3T3 NIH in vitro con plásmidos usando lipofectamine 2000 (Invitrogen, Milán, Italia). Después de 48 horas las células transfectadas se han analizado con microscopía confocal, usando un anticuerpo monoclonal anti-myc conjugado con FITC (Sigma-Aldrich Srl, Milán, Italia). Se ha demostrado de este modo que todas las formas truncadas codificadas por plásmidos se localizan en el citoplasma. Se han transfectado fibroblastos 3T3 NIH en paralelo con el plásmido pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG y se han analizado con microscopía confocal usando el anticuerpo monoclonal c-erbB2/c-neu Ab-3 (Oncogene, Boston, MA) como anticuerpo primario y un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con FITC (PharMigen, San Diego, CA). Se observó de este modo que ECD-TM humano se expresa en la membrana. Los resultados obtenidos usando los primeros cuatro plásmidos descritos anteriormente (pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG, pCMV3.1HNhECD4-TM-8CpG), demuestran que una respuesta celular es suficiente para la prevención antitumoral. Sin embargo, se sabe que la activación contemporánea de la respuesta celular y humoral es necesaria para una terapia más eficaz (Rielly y col., 2001, Cancer Res 61: 880). Como ya se ha descrito previamente en el párrafo anterior, la proteína quimérica codificada por el plásmido pCMV3.1H/N-r1 ºCys-h2 ºCysTM-8CpG es capaz de proteger al 100% de los animales vacunados y es capaz de inducir una respuesta humoral fuerte en los ratones.
Plásmidos quiméricos capaces de codificar cinco p185neu quiméricas de hombre-rata diferentes.
Para la construcción de plásmidos que codifican proteínas quiméricas, los inventores seleccionaron pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG y pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG. Estos cuatro plásmidos protegen al 100% de los ratones vacunados frente a un inóculo letal de células tumorales que expresan p185neu humana. Además se ha seleccionado el plásmido pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG, incluso si protege a solamente el 60% de los ratones vacunados, debido a que la proteína codificada difiere solamente en 17 aa de la codificada por pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG (275 aa), que protege al 20% de los ratones vacunados. Los inventores pueden plantear la hipótesis de que la secuencia peptídica de 17 aa corresponde a un epítopo importante para la inducción de una respuesta inmune eficaz.
Se han obtenido fragmentos de ADN que codifican partes de p185neu de rata mediante amplificación enzimática de ADN. Para amplificar estos fragmentos de ADNc se han usado seis oligonucleótidos que tienen todos la misma orientación, concretamente la del cebador T7 (oligonucleótido Nº 11), mientras que los cinco antisentido se han diseñado para reconocer ADNc de rata en las posiciones apropiadas y tienen el sitio de restricción para Nhel en sus extremos (oligonucleótidos Nº 24-Nº 28). Después de purificación y digestión con las enzimas de restricción Hindlll y Nhel, los fragmentos amplificados se han insertado en los plásmidos correspondientes (pCMV3.1H/NhECD 1-TM8CpG, pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG) y se han digerido con las mismas enzimas de restricción. De este modo los inventores obtuvieron cinco nuevos plásmidos capaces de codificar proteínas quiméricas de 689 aa, de los que 2 (Val-Ser) pertenecen al sitio de restricción Nhel usado para el punto de unión entre ADN de rata y humano. La presencia de estos dos aa hace a las partes tanto humana como de rata heteroclíticas.
Las proteínas quiméricas difieren en partes decrecientes de p185neu humana y partes crecientes de p185neu de rata. El plásmido pCMV3.1H/Nr73-hECD1-TM-8CpG (Figura 10) codifica 73 aa del dominio extracelular de p185neu de rata y 614 aa de p185neu humana. El plásmido pCMV3.1H/Nr153-hECD2-TM-8CpG (Figura 11) codifica 153 aa del dominio extracelular de p185neu de rata y 534 aa de p185neu humana. El plásmido pCMV3.1H/Nr233-hECD3-TM8CpG (Figura 12) codifica 233 aa del dominio extracelular de p185neu de rata y 454 aa de p185neu humana. El plásmido pCMV3.1H/Nr313-hECD4-TM-8CpG (Figura 13) codifica 313 aa del dominio extracelular de p185neu de rata y 374 aa de p185neu humana. El plásmido pCMV3.1H/Nr393-hECD5-TM-8CpG (Figura 14) codifica 393 aa del dominio extracelular de p185neu de rata y 294 aa de p185neu humana. Se han obtenido pruebas indirectas de la expresión en membrana de p185neu quimérica de ser humano/rata codificada por estos plásmidos inmunizando ratones con los cinco nuevos plásmidos y con pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG como control positivo. Los sueros de todos los ratones vacunados contienen anticuerpos específicos contra p185neu humana. Además, los animales vacunados con plásmidos que codifican las cinco proteínas quiméricas diferentes también están protegidos con un inóculo letal de células tumorales que expresan p185neu humana.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Construcción del plásmido pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG
Para construir el plásmido quimérico pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG los inventores partieron del plásmido pCMV-ECD-TM, que expresa el dominio extracelular y transmembrana de p185neu de rata (Amici y col. 2000, Gene 5 Ther., 7: 703). pCMV-ECD-TM se digirió con las enzimas de restricción HindIII y XbaI (BioLabs, Beverly, MA) para separar el inserto de la cadena principal plasmídica.
Digestión de restricción con enzima Hindlll.
ADN plasmídico (1 !g/!l) 10 !l Tampón de restricción 10X (NEB2) 10 !l HindIII (10 U/!l) 5 !l H2O 75 !l
100 !l volumen final
La mezcla se incubó a 37 ºC durante 4 horas y el producto de digestión se controló por electroforesis en gel de agarosa 1% usando un marcador de peso molecular y plásmido no digerido como control.
10 Una vez confirmada la linealización del plásmido, se precipitó el ADN añadiendo 1/10 del volumen de acetato sódico 3 M a pH 5,2 y 2 volúmenes de etanol absoluto frío.
La muestra se mantuvo en hielo durante 20 minutos, después se centrifugó con una minicentrífuga a 14.000 rpm durante 12 minutos. El sedimento se lavó tres veces con 1 ml de etanol frío al 70%, se secó en vacío durante 5 minutos, después se resuspendió en 84 !l de H2O y se digirió enzimáticamente con enzima de restricción Xbal.
15 Digestión de restricción con enzima Xbal:
ADN resuspendido en H2O (10 !g) 84 !l Tampón de restricción 10X (NEB2) 10 !l BSA 100X (100 mg/ml) 1 !l Xbal (10 U/ml) 5!l
100 !l
La mezcla se incubó a 37 ºC durante 4 horas y el producto de digestión se precipitó y se secó como se ha descrito anteriormente. El ADN se resuspendió en 30 !l de H2O.
Los dos fragmentos de ADN correspondientes a la cadena principal plasmídica (pCMV de 4400 pb) y al inserto (ECD-TM de 2100 pb) se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%.
20 La banda correspondiente al inserto se retiró y el ADN se eluyó del gel usando un kit de extracción en gel Qiaquick (Qiagen Italia).
En paralelo, la nueva cadena principal plasmídica (pCMV3.1H/N-4CpG) en la que el fragmento de ADN correspondía a p185 ECD-TM de rata, se digirió con las mismas enzimas de restricción y se eluyó en gel de agarosa.
Los fragmentos de ADN correspondientes a ECD-TM de rata y el plásmido linealizado pCMV3.1H/N-4CpG se usaron 25 para obtener pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG por reacción de ligación.
Reacción de ligación
Inserto de ADN (rECD-TM) (50 ng/!l) 2 !l ADN plasmídico linealizado (pCMV3.1H/N4CpG) (50 ng/!l) 1 !l Tampón de reacción 10X para ADN ligasa T4 1 !l ADN ligasa T4 (2 U/!l) 1 !l H2O 5!l
10 !l
La reacción de ligación se incubó a 16 ºC durante 4 horas.
El producto de ligación se usó después para transformar la cepa bacteriana de E. coli DH5a. Las células bacterianas se han hecho competentes con la técnica de CaCl2.
30 Transformación de la cepa bacteriana DH5a
Células bacterianas competentes 100 !l Producto de ligación 5 !l
Para hacer que el ADN plasmídico penetre en las células competentes, éstas se mantuvieron en hielo durante 40 minutos y se sometieron a choque térmico (1,5 minutos a 42 ºC y después 2 minutos en hielo).
Después de añadir 1 ml de medio de crecimiento LB, las células bacterianas transformadas se incubaron a 37 ºC durante 1 hora para restaurar sus condiciones fisiológicas.
5 La suspensión celular se centrifugó después a 6.000 rpm durante 1 minuto y el sedimento se resuspendió en 100 !l de LB.
Las células se sembraron en placas de Petri que contenían medio sólido selectivo (LB con agar + ampicilina 100 !g/ml) y se cultivaron a 37 ºC durante una noche. La ampicilina permite el crecimiento de células que contienen el plásmido pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG que confiere resistencia a ampicilina.
10 Los clones resultantes se analizaron por lisis alcalina para seleccionar los que contenían el plásmido recombinante pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG.
Para obtener plásmido quimérico pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG, se digirió plásmido pCMV3.1H/N-rECD-TM4CpG con enzimas de restricción BstEII y XbaI para retirar el segundo dominio de cisteína junto con el dominio transmembrana de p185neu de rata. Al mismo tiempo, se digirió el plásmido pCMV3.1hECD-TM-4CpG con las
15 mismas enzimas para aislar el fragmento de ADN correspondiente al segundo subdominio de cisteína y dominio transmembrana del gen humano.
Digestión con BstEll:
ADN plasmídico (1 !g/!l) 10 !l Tampón de restricción 10X (NEB3) 10 !l BstEll (10 U/!l) 5 !l H2O 75 !l
100 !l volumen final
La mezcla se incubó a 60 ºC durante 4 horas.
Se ha descrito previamente la digestión de restricción con Xbal, recuperación de los fragmentos para usar para 20 clonación, reacción de ligación y transformación de células competentes.
El plásmido quimérico resultante pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG se ha secuenciado usando el analizador genético automático ABI PRISM 310 (Applied Biosystem), para verificar la inserción correcta del fragmento correspondiente al 2º subdominio de cisteína y el dominio transmembrana del gen humano.
Ejemplo 2 - Ensayo in vivo
25 Animales
Se han usado ratones hembra de Balb/cAnCr (H-2d) de aproximadamente siete semanas de edad para todos los experimentos.
Los animales, proporcionados por Charles River Laboratories (Calco, MI, Italia), se criaron en condiciones asépticas y de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea.
30 Administración intramuscular seguida de electroporación in vivo
Para evitar contracciones no deseadas del músculo tibial cada ratón se anestesió por inóculo i.p. de 300 !l de avertina, compuesto de 0,58 g de tribromoetanol (Sigma-Aldrich) y 310 !l de alcohol Terc-Amílico (Aldrich) disuelto en 39,5 ml de H2O desionizada. Después se ha afeitado a todos los ratones en correspondencia con el músculo tibial para inóculo.
35 Los animales se han vacunado en correspondencia con ambos músculos antero-tibiales con 40 !l de solución que contenía 50 !g de ADN.
La mezcla que contenía ADN se preparó poco antes de su uso, de acuerdo con las indicaciones de Dr. F. Pericle (Valentis, Inc., The Woodlands, Texas, Estados Unidos). Esta solución contiene ADN plasmídico 1,25 mg/ml, sal sódica de poli-L-glutamato 6 mg/ml (Sigma-Aldrich, S.r.I., Milán, Italia), cloruro sódico 150 mM (Fluka, BioChemika,
40 Buchs, Suiza) y agua destilada sin endotoxinas (Nucleare Free Water, Promega Corporation) a un volumen final de 1 ml.
Después de aproximadamente 5 minutos desde el inóculo, el área tratada se sometió a electroporación, mediante la aplicación de dos impulsos eléctricos que tenían una intensidad de 375 V/cm2, de una duración cada uno de 25 ms, usando el electroporador Electro Square Porator (T820, BTX, San Diego, CA, Estados Unidos). Los impulsos 45 eléctricos transcutáneos se han aplicado mediante el uso de dos electrodos de acero cuadrados situados a 3 mm
entre sí, al lado de cada pata. Se llevó a cabo inmunización génica por electroporación dos veces para cada animal 21 y 7 días antes del inóculo de las células tumorales.
Inóculo de células tumorales
Los ratones se han inoculado con una suspensión que contiene 2 x 105 células D2F2/E2. Estas células derivan de 5 un tumor mamario generado espontáneamente en un ganglio alveolar hiperplásico de un ratón BALB/c y expresan altos niveles de p185 humana.
Evaluación in vivo del crecimiento tumoral
El crecimiento tumoral se evaluó semanalmente mediante palpación y se midieron las dimensiones de los tumores a lo largo de dos diámetros perpendiculares con un calibrador. Las masas neoplásicas que miden más de 3 mm se 10 consideran tumores.
El crecimiento tumoral se siguió durante 100 días desde el inóculo tumoral o hasta que el tumor había crecido hasta un diámetro mayor de 10 mm, y después se sacrificó a los animales.
Tabla
Ratones: hembras BALB/C Tumor: D2F2-E2 que expresa p185neu humana
plásmidos
Número de ratones protección anticuerpos
pCMV3.1H/N-8CpG
5 0% -
pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG
5 100% +++
pCMV3.1H/N-hECD1-TM-8CpG
5 100% -
pCMV3.1H/N- hECD2-TM-8CpG
5 100% -
pCMV3.1H/N- hECD3-TM-8CpG
5 100% +
pCMV3.1H/N- hECD4-TM-8CpG
5 100% ++
pCMV3.1H/N- hECD5-TM-8CpG
5 60% -
pCMV3.1H/N- hECD6-TM-8CpG
5 0% -
pCMV3.1H/N- hECD7-TM-8CpG
5 0% -
pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys.-TM-8CpG
5 100% +++
Lista de oligonucleótidos sintetizados y usados para construcción de plásmidos
15 Nº1. AccIII-TAA-4CpG-erbB2 sentido 71 nt 5’CCGGAAGTAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAT3’ Nº2. XbaI-TAA-4CpG-erbB2 antisentido 71 nt 5’CTAGATTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTACTT3‘ Nº3. AccIII-TAA-4noCpG-erbB2 sentido 71 nt 20 5’CCGGAAGTAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAT3’ Nº4. XbaI-TAA-4noCpG-erbB2 antisentido 71 nt 5’CTAGATTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAACGTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTACTT3’ Nº 5. HindIII-NheI sentido 27nt 5’ CTAGGAAGCTTGTTTAACTTGCTAGCT 3’ 25 Nº 6. HindIII-NheI antisentido 27 nt 5’AGCTAGCTAGCAAGTTAAACAAGCTTC 3’ Nº 7. XbaI-4CpG-neu sentido 68 nt 5’CTAGATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAGTTT3’ Nº 8. PmeI-CpG-neu antisentido 64 nt 30 5’AAACTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTAT3’
Nº 9. XbaI-4noCpG-neu sentido 68 nt
5’CTAGATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAGTTT3’
Nº 10. PmeI-4noCpG-neu antisentido 64 nt
5’AAACTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTAT3’
5 Nº 11. Cebador T7 5‘TAATACGACTCACTATAGGG 3‘ Nº 12. BstEII-líder neu antisentido 32 nt 5’GGCCGGTTACCCGCGATTCCGGGGGGCAGGAG 3’ Nº 13. hECD1-TM-sentido-NheI 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCC 3’ Nº 14. hECD2-TM-sentido-NheI 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGA 3’ Nº 15. hECD3-TM-sentido-NheI 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCCTGCCCACTGACTGCTGCCATG 3’
15 Nº 16. hECD4-TM-sentido-NheI 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGC 3’ Nº 17. hECD5-TM-sentido-NheI 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCC 3’ Nº 18. hECD6-TM-sentido-NheI 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCAACACCCACCTCTGCTTCGTGC 3’ Nº 19. hECD7-TM-sentido-NheI 35 nt CCGGCTAGCTAGCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCA3’ Nº 20. pcDNA3.1/Cebador inverso BGH 20 nt 5’TAGAAGGCACAGTCGAGGCT 3’
25 Nº 21. NheI-líder neu-antisentido 43 nt
5’CCGGCTAGCTAGCCGCGATTCCGGGGGGCAGGAGGGCGAGGAG3’
Nº 22. His-myc-sentido-noNheI 69 nt
5’CTAGGCATCATCATCATCATCATAATGGTCATACCGGTGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGG3’
Nº 23. His-myc-antisentido-NheI 69 nt
5’CTAGCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCACCGGTATGACCATTATGATGATGATGATGATGC3’
Nº 24. NheI-73neu antisentido 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCGCTGGCATTGGCAGGCACGTAG3’ Nº 25. NheI-153neu antisentido 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCCAGGATCTCTGTGAGACTTCGA 3’
35 Nº 26. NheI-233neu antisentido 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCGCCCTTGCACCGGGCACAACCA3’ Nº 27. NheI-313neu antisentido 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCTCCCACTTCCGTAGACAGGTAG 3’ Nº 28. NheI-393neu antisentido 35 nt 5’CCGGCTAGCTAGCAATGCCGGAGGAGGGGTCCCCA3’
Listado de secuencias
<110> INDENA S.p.A.
<120> ADN QUE CODIFICA p185neu Y USOS TERAPÉUTICOS DEL MISMO 45
<130> 7118M
<160> 42
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 922
<212> ADN 55 <213> ser humano/rata
<400> 1
5 <210> 2
<211> 2083
<212> ADN
<213> ser humano/rata
10 <400> 2
<210> 3
<211> 1939
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 3
<210> 4
<211> 1699
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 4
<210> 5
<211> 1459
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 5
<210> 6
<211> 1219
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 6
<210> 7
<211> 979
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 7
<210> 8
<211> 739
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 8
<210> 9
<211> 499
<212> ADN 15 <213> ser humano/rata
<400> 9
<210> 10
<211> 2086
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 10
<210> 11
<211> 2086
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 11
<210> 12
<211> 2086
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 12
<210> 13
<211> 2086
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 13
<210> 14
<211> 2086
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 14
<210> 15
<211> 71
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 15
<210> 16
<211> 71
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 16
<210> 17
<211> 71
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 17
<210> 18
<211> 71
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 18
<210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 19 ctaggaagct tgtttaactt gctagct
27
<210> 20 <211> 27 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 20 agctagctag caagttaaac aagcttc
27
<210> 21 <211> 68
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 21
<210> 22
<211> 64
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 22
<210> 23
<211> 68
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 23
<210> 24
<211> 64
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400>
24
<400>
27 ccggctagct agcctgtcct tcctgcagga tatcc
35
<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 25 taatacgact cactataggg
20
45
<210> 26 <211> 32 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 26 ggccggttac ccgcgattcc ggggggcagg ag
32
<210> 27 <211> 35 <212> ADN <213> ser humano/rata
<210> 28
<211> 35
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 28 ccggctagct agcggagggg tcttgatcca gcgga
<210> 29
<211> 35
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 29 ccggctagct agcctgccca ctgactgctg ccatg
<210> 30
<211> 35
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 30 ccggctagct agctgcaccc tcgtctgccc cctgc
<210> 31
<211> 35
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 31 ccggctagct agcccgctcc agccagagca gctcc
<210> 32
<211> 35
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 32 ccggctagct agcaacaccc acctctgctt cgtgc
<210> 33
<211> 35
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 33 ccggctagct agccccaggg agtatgtgaa tgcca
<210> 34
<211> 20
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 34 tagaaggcac agtcgaggct 20
<210> 35
<211> 43
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 35
ccggctagct agccgcgatt ccggggggca ggagggcgag gag 43
<210> 36
<211> 69
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 36
<210> 37
<211> 69
<212> ADN
<213> ser humano/rata
<400> 37
<210> 38 <211> 35 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 38 ccggctagct agcgctggca ttggcaggca cgtag
35
<210> 39 <211> 35 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 39 ccggctagct agccaggatc tctgtgagac ttcga
35
<210> 40 <211> 35 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 40 ccggctagct agcgcccttg caccgggcac aacca
35
<210> 41 <211> 35 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 41 ccggctagct agctcccact tccgtagaca ggtag
35
<210> 42 <211> 35 <212> ADN <213> ser humano/rata
<400> 42 ccggctagct agcaatgccg gaggaggggt cccca
35

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un vector de transferencia de ADN que contiene una secuencia que codifica un fragmento de p185neu, en el que dicha secuencia está seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, 10, 11, 13, 14.
  2. 2.
    Un vector de transferencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que es un plásmido.
    5 3. El plásmido de la reivindicación 2, que contiene además un promotor de la transcripción.
  3. 4.
    El plásmido de la reivindicación 3, en el que el promotor es CMV.
  4. 5.
    El plásmido de la reivindicación 2, que contiene además 4 motivos CpG.
  5. 6.
    El plásmido de la reivindicación 5, que contiene además 8 motivos CpG.
  6. 7. Composición farmacéutica que contiene un vector de trasferencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las 10 reivindicaciones 1-6 en mezcla por admisión con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.
  7. 8.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 7, que es adecuada para administración parenteral.
  8. 9.
    La composición de la reivindicación 8, que está en forma de solución inyectable.
  9. 10.
    Una combinación de al menos dos plásmidos diferentes de acuerdo con las reivindicaciones 2-6, para su uso terapéutico simultáneo, secuencial o separado.
    15 11. Una combinación de acuerdo con la reivindicación 10, que está en una forma adecuada para vacunación por ADN.
  10. 12. Uso de un vector de acuerdo con la reivindicación 1 o un plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 2-6 para preparar una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de tumores positivos para p185neu o tumores primarios, metástasis o recaídas de tumores que expresan p185neu.
    20 13. El uso de un vector de acuerdo con la reivindicación 1 o un plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 2-6, para la preparación de una vacuna de ADN.
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