KR101215768B1

KR101215768B1 - ｐ185ｎｅｕ - 암호화 ＤＮＡ와 그의 치료 용도

Info

Publication number: KR101215768B1
Application number: KR1020117026603A
Authority: KR
Inventors: 아우구스토 아미치; 페데리카 카발로; 구이도 포르니; 크리스티나 마치니
Original assignee: 인데나 에스피아
Priority date: 2003-10-09
Filing date: 2004-10-06
Publication date: 2012-12-26
Also published as: CA2541840C; IL174821A0; US8298821B2; AU2004283430B2; JP2007508004A; JP4829114B2; ITMI20031942A1; KR20070004526A; HK1094531A1; WO2005039618A1; US7795016B2; CN100546647C; ES2402767T3; CA2541840A1; US20110245330A1; PL1670498T3; NO340097B1; EP1670498B1; EP1670498A1; EP1670498B9

Abstract

p185neu 종양단백질(oncoprotein)의 다른 단편을 암호화하는 서열을 포함하며, ErbB 과(family)의 종양유전자(oncogene)를 발현하는 종양에 저항하는 면역 반응을 유발할 수 있는 플라스미드(plasmid), 및 그의 약제학적 조성물.

Description

ｐ185ｎｅｕ - 암호화 ＤＮＡ와 그의 치료 용도{p185neu - Encoding DNA and therapeutical uses thereof}

본 발명은 항종양 DNA 백신주사에서 p185^neu - 암호 서열을 함유한 플라스미드 벡터(plasmid vectors)와 그것의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 플라스미드(plasmid)는 사람 또는 랫트(rat)의 종양단백질(oncoprotein) p185^neu의 다른 단편(fragments)을 암호화한 암호서열을 포함하고, 종양을 발현시키는 ErbB 과(family)의 종양유전자(oncogene)에 대항하는 체액 또는 세포 중개 면역 반응을 유발할 수 있다.

본 발명은 또한 p185^neu - 발현 종양의 예방 또는 치료를 위한 언급된 플라스미드(plasmids)와 그것의 용도를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

가장 많이 연구된 종양 항원의 하나인, 단백질 p185^neu은 가장 흔한 인간 악성종양(carcinomas)의 세포막 상에 존재하기 때문에, 암에 대항하는 면역 요법을 위한 대상으로 큰 흥미를 일으켰다.

p185^neu은 원종양유전자(proto-oncogene) Her-2/neu에 의해 암호화된 랫트(rat)의 세포막 수용체이고, Class Ⅰ의 티로신 키나제 수용체(Tyrosine Kinase Receptors(RTKs))의 과(family)에 속하며, 표피성장인자 수용체 EGF-R(Epidermal Growth Factor Receptor EGF-R(ErbB-1))과 거기에 연관된 다른 수용체(ErbB-3, ErbB-4)로 역시 구성된다. 이들 수용체는 세포 증식과 분화(Hynes and Stern, 1994 BBA 1198 : 165)에 영향을 받으며, 그런 까닭에 큰 생물학적 임상적 흥미를 끈다. 수용체는 세개의 잘 구별된 도메인(domains) : 세포외의, 막횡단의(transmembrane) 그리고 세포질내의 도메인(domain)으로 구성된다. p185^neu은 세포내 암호 변환(signal transduction)과 세포내 메카니즘(mechanism)의 복합 네트웍(complex network)에 영향을 미치며, 증식과 분화 과정을 조절한다(Boyle 1992 Curr. Op. Oncol. 4 : 156). 종양유전자 neu는 화학적으로 야기된 랫트(rat) 신경교세포종(neuroglioblastoma)으로부터 처음 분리된 후 이름지어졌다. 이 활성화된 neu 형태는 "A"와 "T"의 치환과 p185^neu의 664 위치에서 글루탐산(glutamic acid) 잔존물(Va1664Glu)로 발린(Valine) 잔존물의 연속 치환의 결과로 단일 점돌연변이(singly point mutaion)를 갖는다(Bargmann et al. 1986, Cell 45 : 649).

사람 역시 neu 상동(homologous)의 ErbB-2이 분리되고, 특성화되고, 랫트(rat) HER2/neu 수용체와 사람 ErbB-2 둘 다 EGFR에 중요한 상동관계를 갖는 것으로 드러났다(Coussens et al. 1985, Sciente 230 : 1132 ; Yamamoto et al. 1986, Nature 319 : 230). 랫트(rat) 서열에서 발생 돌연변이는 이량체화(dimerization) 통하여 구성 수용체 활성화의 원인인데 반해, ErbB-2 양성 사람 종양에서 종양유전자(oncogene)의 이상형 유전자발현(aberrant expression)이 발견되었다(Di Marco et al. 1990, Mol. Cell. Ciol. 10 : 3247 ; Klapper et al., 2000, adv Cancer Res, 77 : 25).

드문 경우기는 하지만, 활성 점돌연변이(point mutaions)과 비정상의 스플라이싱(splicing) 메카니즘(mechanisms)이 발견되었다(Kwong et al., 1998, Mol Carcinog, 23 : 62 ; Xie et al., 2000, J Natl Cancer Inst, 92 : 412). 전체적인 효과는 유사하다 : 전사 단계에서 유전자 증폭(amplification)과 증가는 리간드-독립성 방법으로 성장 신호를 세포내로 형질도입하는 활성 이량체(dimers)의 연속적 증가로, p185^neu 세포막 수용체의 과다를 결정한다. 사람과 랫트(rat) p185^neu 세포외부 영역의 결정 구조는 최근 보고되었으며, 이 단백질은 고정된 형태(rigid conformaion)의 특성이 있는데 어떠한 리간드의 직접적인 결합과 신호 형질도입 증식 트리거(trigger) 없이, 다른 EebB 수용체와 상호작용을 한다고 알려져 있다(Cho HS et al. 2003, Nature 421 : 756).

보통의 상황 하에선, 인간 p185^neu은 기관발생(organogenesis)과 상피 성장에 영향을 미친다 : 태반 형성과 태아 발달 동안 높은 수준으로 나타나는데 반해, 성인 조직에서는 매우 낮은 수준으로 존재한다(Press et al. 1990, Oncogene 5 : 953).

여러 연구에서 인간 p185^neu의 과다발현(overexpression)은 종양의 진행과 종양 침범의 단계에 관련이 있다는 것이 증명되었다. p185^neu의 과다발현(overexpression)은 폐(Kern et al. 1986, Cancer Res. 50 : 5184), 결장(Cohen et al. 1989, Oncogene 4 : 81), 난소(Slamon et al. 1989, Science 244 : 707) 선암종(adenocarcinomas)와 인간 유방암(Slamon et al. 1989, Science 244 : 707)의 높은 수치로 나타났다.

플라스미드 백신화를 위한 최선의 목표물인 p185^neu을 만드는 근본적인 성질은 : a) 세포 성장과 발암성의 직접적인 연관을 관리하고, 그런 까닭에 종양 발생 불안성, 항원의 발현을 감소, 또한 그들의 발암성(tomorigenicity)을 감소시키는데 기인한 클론 변이체(clone variants)이고 ; b) 혈장 세포막(plasmatic membrane) 상의 발현은 종양 세포에서조차 항체들에 의해 그것을 인식할 수 있게 되며, 주요한 조직적합성 시스템(histocompatibility system)의 발현을 감소시키는 것이다(Lollini P. and Forni G. 2003, trends Immunol. 24 : 62).

연구는 p185^neu 양성 이식가능한 종양 라인(lines)을 사용하는 머린모델(murine model)실험과 활성화된 랫트(rat) 종양유전자(oncogene) Her-2/neu(자생적으로 발달한 p185^neu 양성 유방 종양)을 위한 쥐(mice) 이식유전자에 대하여 실험을 수행하였는바, 종양전 외상(preneoplastic lesions)을 예방하고 치료하는데 가능성 있다는 것이 증명되었다. 활성화된 Her-2/neu 랫트(rat)를 위한 쥐 이식유전자(mice transgenic)에서 특히 유방 종양의 예방의 관점에서, 우리는 랫트(rat) p185^neu의 세포외와 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 암호화하는 플라스미드(plasmid)는 전체길이(full-length) 랫트(rat) p185^neu 또는 단지 세포외 도메인(domain)(숨겨진 항원)에 대하여 암호화하는 플라스미드(plasmid) 보다 생체 내 보호에 더 효과적으로 유발될 수 있다는 것을 보여주었다(Amici A. et al. 2000, Gene Ther., 7 : 703 ; Rovero S. et al. 2000, J. of Immunol., 165 : 5133). 유사한 결과는 첸 등(Chen et al.)에 의해 보고되었다(1998, Cancer Res 58 : 1965). 다른 저자는 p185^neu을 암호화하는 플라스미드(plasmid) - 그들의 티로신-키나제(tyrosine-kinase) 활성을 제거하기 위해 비변이(unvaried) 이거나 혹은 돌연변이된 - 는 p185^neu-양성 세포 이식편(inoculum) 다음에 오는 종양의 개시를 예방하는데 효과적이다는 것을 증명했다(Wei WZ et al. 1999, Int. J. Cancer 81 : 748). 또한, 소포체(endoplasmic reticulum)(리더(leader))를 통한 진행의 원인이 되는 신호가 결여된 플라스미드(plasmid)는 p185^neu 항원의 세포질 국소화(localization)를 결정하는데 동등하게 효과적인 것을 입증했다. 다른 플라스미드(plasmids)에 의해 유발된 보호는 p185^neu의 세포막 합성의 경우에서 체액성 면역 반응과 세포질 국소화(localization)의 경우에서 면역-반응에 조절된 T-림프구(T-lyphocyte)에 의해 주로 조절됐다(Pilon SA et al. 2001, J. of Immunol. 167 : 3201). 그러나, 세포질과 세포막 둘 다에 유발된 p185^neu 과발현 플라스미드의 결합된 백신화는 종양 성장에 대한 보호에 보다 효과적이었다(Piechocki MP et al. 2001, J. Immunol. 167 : 3367).

따라서, 다른 면역 반응 메카니즘(mechanisma) 사이의 균형이 중요할지도 모른다(Reilly et al., 2001, Cancer Res. 61 : 880). 또한, 랫트(rat) p185^neu의 세포내와 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인(domain)을 암호화하는 플라스미드의 백신주사는 종양 거부에 협력하는, 면역 시스템(T 헬퍼(helper)와 T 킬러(killer) 세포, 항체, 대식세포(macrophages), 중성백혈구(neutrophiles), 자연 킬러(killer) 세포, Fc 수용체, 감마 인터페론(gamma interferon)과 퍼포린(perforins))의 다수의 다른 작동체(effector)를 통해, p185^neu 을 과발현하는 세포 이식편인, 2 mm 이량체의 종양 덩어리를 박멸할 수 있는 것으로 관찰되었다(Curcio C. et al. 2003, J. Clin. Invest. 111 : 1161).

p185^neu 종양단백질의 다른 단편을 암호화하는 서열을 포함하며, ErbB 패밀리의 종양유전자를 발현하는 종양에 저항하는 면역반응을 유발할 수 있는 플라스미드(plasmid) 및 그의 약제학적 조성물, 용도 등을 제공하려 한다.

[발명의 상세한 설명]

사람 또는 사람/랫트(rat) 키메랄성(chineric) p185^neu 을 암호화하는 다양한 구조물이 플라스미드(plasmid) 벡터(vector)에 끼워 넣어지고, 종양 진행을 막는 것을 목표 삼는 면역성부여 실험에 사용했다. 플라스미드(plasmid) 구조물에서,

트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인(domain)과 감소하는 길이의 세포내 도메인(domain)의 일부를 포함하는 사람 p185^neu 단백질의 조각은 키메랄성(chimeric) 플라스미드(plasmids)처럼 랫트(rat) Her-2/neu cDNA에서 상동 서열에 대체되어 준비된 그것의, ErbB2 종양유전자(oncogene) 서열 또는 일부로 제조된다.

그렇게하여 획득된 플라스미드(plasmids)는 인간 p185^neu를 과발현하는 종양세포로 접종된 마우스 중 백신화 실험에서 평가된다. p185^neu의 끝이 잘린 형태를 포함하는 플라스미드(plasmids)는 킬러(killer)와 헬퍼(helper) T 림파구(lymphocytes)에 의해 조정된 항종양 반응성을 유발하는데 반해, 키메랄성(chimeric) 플라스미드(plasmids)는 사람과 랫트(rat) p185^neu 둘 다에 대항해 항체 반응을 유발했다.

생체 내 실험에서의 결과상에, 세포질과 체액성 타입(type) 둘 다에서 강한 면역 반응을 유발할 능력이 있는 p185^neu 서열을 포함하는 플라스미드(plasmid)가 선택된다. 본 발명의 목적물인 이들 플라스미드(plasmids)는 SEQ ID N. 1-14(사람과 랫트(rat) p185^neu 참고서열은 유전자 은행(Gene Bank) 수납 번호 M11730 과 X03362로 각각 입수가능하다)으로 구성된 그룹에서 선택된 p185^neu 조각을 암호화하는 서열을 포함한다.

발명에 따르면, 서열이 암호화된 p185^neu은 사람 적용에 적합한 어떠한 플라스미드(plasmid) 벡터(vector)에 끼어들 수 있다. 암호화하는 서열을 제외하고는, 플라스미드(plasmid)는 전사 조절에 기능적인 요소, 보다 상세하게는 암호화하는 서열의 상류(upstream)에 위치한 프로모터, 되도록이면 CMV 프로모터(promoter), 시작과 종결 전사 요소, 선택 표시자(selection markers), 예를 들어, 암피실린(ampicillin) 또는 카나마이신(kanamicin) 저항 유전자, CpG 특색(motifs), 폴리아데닐레이션(polyadenilation) 위치 또는 전사 활성제를 포함할 수 있다. 전사 조절 요소는 사람의 벡터(vector)에 용도에 호환이 가능해야한다. 바람직한 태양에서, 본 발명의 플라스미드(plasmids)는 최소한 4 CpG 특색(motifs), 되도록이면 최소한 8에서 최대 80을 포함한다. 세균성 기원의 CpG 특색(motifs) (ATAATCGACGTTCAA)은 차례대로 자연 킬러(killer) 세포에 의해 IFN 감마 분비물을 유발하는, 신비의 IL-12에 대식세포(macrophages)를 유발하고, 따라서 T 헬퍼(helper) 림프구-조정 반응을 활성화한다(Chu R.S. et al. 1997, J. Exp. Med., 186 : 1623). 그런 까닭에, 플라스미드(plasmid) 서열에서 CpG 특색(motifs)의 삽입은 면역 반응을 향상시킨다.

그 이상의 태양에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 매개물(vehicles)과 부형제(excipients)와 연합하여 위의 규정처럼, 하나 또는 그 이상의 다른 플라스미드(plasmids)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은, 비경구 투여에 적합한 형태로, 되도록이면 주사용액의 형태로, DNA 백신주사에 관용적으로 편리하게 사용된다. DNA 백신주사의 원리와 방법은 예를 들어, Liu MA 2003 ; J Int Med 253 : 402에 그 분야의 기술이 알려져 있고, 발표되어있다.

다른 태양에서, 본 발명은 실험자와 환자에 동시, 연속 또는 분리된 투여를 위한 최하 두 가지, 되도록이면 최소한 네 가지, 보다 되도록이면 최소한 여덟 가지 다른 플라스미드(plasmids)를 포함하는 조합된 제제를 제공한다.

발명에 따른 플라스미드(plasmids), 조성물과 제제는 p185^neu-양성 종양의 발현 위험이 있는 실험자 또는 1차적인 종양, 전이 또는 재발된 p185^neu-양성 종양의 환자의 예방 또는 치료의 처리에 사용된다. 예방은 종양이 명백하지 않고, 2차가 아닐 때, 퇴보 또는 진행이 정지한 종양의 경우에는, 종양이 원종양의 외상(preneoplastic lesion), o 3차 처럼 처음 상태일 때는 근본적으로 가능하다. 본 발명의 플라스미드(plasmids)로 치료상 이득이 될 수 있는 종양은 상피 기원의 종양들, 자세하게는 폐, 난소 그리고 유방 선암종 그리고, 보다 일반적으로 p185^neu 단백질을 발현하는 종양이다.

pCMV3 .1의 플라스미드( plasmid ) 백본(backbone)의 구조

사람 p185^neu 단편과 키메랄성 플라스미드(chimeric plasmids)를 암호화한 플라스미드(plasmids) 구조에 pCMV3.1 플라스미드(plasmid) 백본(backbone)이 사용됐다. 사람 원종양유전자(proto-oncogene) ErbB-2 cDNA와 랫트(rat) 원종양유전자(proto-oncogene) Her-2/neu cDNA에서 유도된 단편을 pCMV3.1(Invitrogen, Milano, Italia)에 복제 기원 f1, 복제기원과 초기 SV40 프로모터(prometor), 네오마이신(neomicine) 저항과 SV40 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호를 암호화하는 유전자를 포함하는 1658 bP의 단편, 제한 효소 DraⅢ(nt1531) e BsmⅠ(nt3189)로 제거하기 위하여 끼워 넣어진다. 얻은 수정된 플라스미드(plasmid)(pCMV3.1)는 천연 pcDNA3.1 하며 몇몇 유익한 점이 있다. 사실, 3900 bp로 크기축소와 부적절한 서열의 제거는 생체내에 트랜스펙션(transfection) 효력을 증가시키는데 기여한다.

플라스미드( plasmid ) pCMV3 .1 erbB2 의 구조

플라스미드(plasmid) pSVerbB2에서 획득된 사람 ErbB2 cDNA는, 제한 위치(restriction sites) HindⅢ과 XbaⅠ에 pCMV3.1의 복합 클로닝 위치(multiple cloning site)에 끼워넣어 진다. 이 플라스미드(plasmid)는 끝을 자른 p185^neu와 키메랄성(chimeric) 플라스미드(plasmid)를 합성하는 플라스미드(plasmid)의 구조에 사용된다.

4 XCpG 서열을 포함하는 플라스미드의 구조 : pCMV3 .1 hECD - TM -4 CpG 와 pCMV3.1hECD-TM-4noCpG

플라스미드 pCMV3.1-erbB2 유래 내부세포질 도메인(domain)을 암호화한 서열의 제거 후, 원종양유전자(proto-oncogene) ErbB2 세포외와 트랜스멤브레인(transmembrane)을 암호화한 두 플라스미드(plasmid)를 제조하였다.

순서는 ErbB2 cDNA의 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열에 존재하는 독특한 위치를 확인하는데 제한 분석을 첫 번째로 포함했다. 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인(domain)의 끝에 대략 20 bp 하류(downstream)의 효소 Acc Ⅲ에 의해 인식된 독특한 위치가 확인됐다.

세포질 도메인(domain)은 독특한 제한 부위와 효소 XbaⅠ처럼 존재하는 효소 AccⅢ의 사용으로 제거됐다. ErbB2 ECD-TM의 3' 끝의 DNA에 뉴클레오타이드(nucleotide) 세 개가 한 벌인 TAA에 다시 끼워 넣어지는데, 번역 정지 신호(translation stop signal)처럼 인식되어, 우리는 두 감각(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #1, #3)과 그들의 끝에 제한 부위 AccⅢ과 XbaⅠ를 갖는 반감각(antisense)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #2, #4) 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로 구성된 두 합성 서열을 사용했다. 합성 서열에서, 서열 CpG와 noCpG가 역시 4번 반복된다. 이들 두 새로운 플라스미드(plasmid)는 pCMV3.1hECD-TM-4CpG와 pCMV3.1hECD-TM-4noCpG로 명명됐다.

8 XCpG 서열을 포함하는 플라스미드의 구조 : pCMV3 .1H/ NhECD - TM -8 CpG 와 pCMV3.1H/NhECD-TM-8noCpG

더욱이 비특이성 면역 자극에 더하여 pCMV3.1H/N-4CpG로 불리우는 4 면역-자극 CpC 서열을 포함하는 새로운 플라스미드(plasmid) 백본(backbone)을 구성했다. 이 목적을 위해 우리는 효소 PmeⅠ의 두 제한 부위에 하나를 제거하고, 두 감각(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #5)과 반감각(antisense)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #6)으로 구성된 합성 서열에 의하여 복합 클로닝 부위(multiple cloning site) 상에 HindⅢ 과 NneⅠ 존재에 제한부위 반전으로 pCM3.1 을 수정했다. pCMV3.1 이라고 명명된, 이 새로운 플라스미드(plasmid)에서, 두 합성 서열은 끼워 넣어지고, 이렇게하여 pCMV3.1 H/N-4CpG 와 4noCpG 를 획득하는데, 고유한 제한 부위 XbaⅠ 과 PmeⅠ 에 CpG와 noCpG의 4번 반복을 포함하는 두 감각(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #7, #9)과 반감각(antisense) 뉴크레오타이드(nucleotides)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #8, #10)로 이루어진다. 그 후, DNA 단편 hECD-TM-4CpG 와 hECD-TM-4noCpG를 pCMV3.1 H/N-4CpG 그리고 pCMV3.1 H/N-4noCpG 각각에 끼워넣고, 이렇게하여 얻어진 두 개의 플라스미드(plasmid)를 pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG 와 pCMV3.1H/N-hECD-TM-8noCpG 로 불렀다.

두번째 시스테인 도메인( second cystein domain )과 사람 p185 ^neu 의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 서열을 포함하는 플라스미드의 구조 : pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG

사람 p185^neu 세포질외부 도메인(extracellular domain)은 1^st 와 2^nd 시스테인 서브-도메인(cystein sub-domain)(1^stcys 와 2^ndcys)으로 알려진 시스테인(cysteins)이 풍부한 두 지역(regions)으로 특징 지워진다. 뉴클레오다이트 지역(nucleotide region)에 위치한 세포질외부 도메인(extracellular domain)에서 오직 한 부위인 BstEⅡ 만을 포함하는 다른 랫트(rat) cDNA 서열과는 달리, 2^ndcys 에서 1^stcys을 분리하는 뉴클레오타이드(nucleotide) 부위에 위치하며, ErbB2의 세포질외부 도메인(extracellular domain)에 cDNA 서열은 BstEⅡ의 두 개의 제한 부위(restriction sites)를 갖는다 : 그 위에 또, 랫트(rat)(nt1372) 처럼 같은 위치의 부위(site), 더욱이 BstEⅡ 부위(site)(nt963)가 세포질외부 도메인(extracellular domain)의 1^stcys 을 암호화하는 부분에 존재한다. HindⅢ 과 BstEⅡ에 의한 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG를 소화하면서, 세포질외부 도메인(extracellular domain), 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain), 서열 8CpG 와 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N로 구성된 DNA 단편을 얻었다. 다음 소포체(endoplasmic reticulum)를 통한 랫트(rat) p185neu 분비 신호는 프라이머(primer) T7(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #11)로 구성된 감각 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 사용하는 효소 DNA 증폭(PCR 반응)에 의해 끼워넣어지고, pCMV3.1H/N 복합 클로닝 부위(multiple cloning site)의 시작에 존재하는 T7 RNA 폴리머라제(polymerase)와, 그의 말단에 BstEⅡ 를 갖는 비감각(antisense) 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide #12)를 인식한다. 세정 후, 제한 효소 HindⅢ 과 BstEⅡ로 증폭된 단편의 효소 소화시킨 다음 pCMV3.1H/Nh2°cys-TM-8CpG (도 1)을 클로닝(cloning)하여 얻었다(도 1). 이 플라스미드(plasmid)는 pCMV3.1 H/NhECD-TM-8CpG 에 비교되는 백신주사에 사용됐다. 그 후, 사람 서열의 2^nd cys 와 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)(nt1372 - nt2204) 사이 융합단백질(fusion protein)을 암호화하는 키메랄성(chimeric) cDNA와 랫트(rat) 서열의 1^st cys(nt1 - nt1250)이 제조되었다. 랫트(rat)와 사람 각각의 cDNA에서 유도된 조각의 융합에 의한 전체 단백질 서열의 재구성은 면역 반응을 증가하게 한다.

랫트 ( rat ) p185neu 의 첫번째 시스테인 도메인( cystein domain )과 사람( nt1 - nt1250)의 두번째 시스테인 도메인(cystein domain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 키메랄성 플라스미드(chimeric plasmid)의 구조 : pCMV3.1H/N-rl°cys-h2°cysTM-8CpG

시스테인(cystein)이 풍부한 첫 번째와 두 번째 영역을 나누는, 뉴클레오타이드(nucleotide)에 위치하는 세포 외부 도메인(extracellular domain)에서의 BstEII(nt1250)만을 포함하는 랫트(rat)의 cDNA 서열과는 달리, Erb2의 세포외부 도메인(extracellular domain)의 cDNA 서열은 BstEII를 위한 2개의 제한 부위(restiction site)를 갖는다. 하나는 랫트(rat) 서열과 같이 1372(nt) 위치이며 다른 하나는 963(nt) 위치 즉, 세포외부 도메인(extracellular domain)의 1st cys을 암호화하는 서열부분이다. 랫트(rat) cDNA 도메인(domain) (1250nt)와 사람 cDNA (1372nt) 모두에서 동일한 위치에 존재하는 BstEII 부위는 플라스미드(plasmid)의 구성이 랫트(rat) 1^st cys과 사람 2^nd cys 사이에서의 융합 산물을 암호화하는 것을 가능하게 한다. 사실, pCMV3.1H/N-h2°cysTM-8CpG를 제한효소(restriction enzyme) HindIII와 BstEII로 소화하여 랫트(rat) p185^neu 분비 신호를 암호화하는 DNA 단편을, 동일한 효소로 pCVM3.1rECD-TM-4CpG의 소화를 통하여 얻어지는 랫트(rat) 1^st cys를 암호화하는 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열로 대체하는 것을 가능하게 한다. 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG의 산물(도 2)은 랫트(rat) p185^neu의 412 aa 부분과 사람 p185^neu의 274 aa 부분으로 이루어져 있다. 이 새로운 플라스미드(plasmid), pCMV3.1H/Nr1°cyc-h2°cysTM-8CpG는 pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG를 비교 용어(comparative term)로 사용하는 백신주사 실험에 사용되어 왔었다. 놀랍게도, 키메랄성(chimeric) 단백질을 암호화하는 플라스미드(plasmid)는 랫트(rat)들에 있어서 사람 p185^neu를 발현시키는 종양들에 대한 완벽한 보호(protection)를 유발한다(표). 이러한 보호는 pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG에 의해 유발되는 보호와 유사하다. 더욱이, 두 플라스미드(plasmid) 모두로 접종된 쥐(mice)들의 혈청분석은 사람 p185^neu에 대해 유사한 항체 역가(antibody titer)를 보였다.

사람 p185neu 의 세포외부 ( extracellular ) 그리고 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인에서의 감소하는 단편들을 암호화하도록 하는 플라스미드(plasmid)

사람 p185^neu의 세포외부(extracellular) 그리고 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인에서의 감소하는 단편들을 암호화하도록 하는 7개의 플라스미드(plasmid)는 pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG (-70 aa), pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG (-150 aa), pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG (-230 aa), pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG (-310 aa), pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG (-390 aa), pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG (-470 aa), 그리고 pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG (-550 aa)의 구성을 보인다.

이들 단편들 가운데 첫 번째에 의해 암호화된 단편은 70 aa (360 bp가 제거된) 쇼터(shorter)이다. 다른 모든 것들은 차차 80 aa 쇼터(shorter)(240 bp가 제거된)이다.

이들 단편들은 끝단에 NheI 제한 부위를 갖는 7개의 서로 다른 센스(sense) 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)들(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #13-#19)과 pCMV3.1 폴리링커(polylinker)의 3' 끝에 존재하는 "pcDNA3.1/BGH 역시작부위(reverse priming site)" (830-850 nt)라고 불리우는 부위를 인지할 수 있는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide #20)를 이용하는 DNA 효소적 증폭(enzymatic amplification)에 의해 얻어진다. 제한 효소 NheI와 PmeI를 사용하는 효소적 소화(enzymatic digestion)에 덧붙여, 증폭 산물(amplification product)들은 pCMV3.1H/N-neu 리더(leader)로 복제되는데, 이는 이제까지 제한 부위(restriction site)에서의 랫트(rat) p185^neu 소포체에 분비 신호를 삽입함으로써 얻어졌다. 랫트(rat) p185^neu 분비 신호의 DNA 단편은 프라이머(primer) T7 (올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #11)을 센스(sense) 뉴클레오타이드로, 그리고 끝단에 NheI을 갖는 안티센스(antisense) 뉴클레오타이드 (올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #21)를 사용하는 효소적 DNA 증폭에 의해 얻어진다. 정제와 HindIII와 NheI을 사용하는 제한 소화 이후의 증폭된 단편은 플라스미드 pCMV3.1H/N으로 복제되고, 같은 효소들로 소화되고, 따라서 pCMV3.1H/N-nue 리더(leader)를 얻는다. 랫트(rat) p185^neu 소포체에 분비 신호가 존재한다는 관점으로부터 사람 p185^neu의 서로 다르게 절단된 형태들의 세포막 합성(membrane expression)이 기대된다. 조절 플라스미드(control plasmid) 인 pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG는 물론 절단된 형태들인 pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG (도 3), pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG (도 4), pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG (도 5), pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG (도 6)를 암호화하는 플라스미드(plasmid)는 접종된 랫트(rat)들을 사람 p185^neu를 발현하는 치사 접종원(lethal inoculum) 종양세포로부터 100 % 보호한다(표). 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG (도 7)은 접종 동물들의 60 %를 보호한 반면, 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG와 pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG (도 8, 9)가 사람 p185^neu를 발현하는 치사 접종원(lethal inoculum) 종양세포에 대한 어떠한 보호 효과도 가지고 있지 않았다(표). 서로 다른 플라스미드(plasmid)에 의해 발현된 단백질 산물들은 소포체로부터 분비되지 않는다. 글리코실화(glicosilation)와 소포체를 통한 진행 또는 NH₂ 말단에서의 아미노산 제거에 의한 조직상의 변화에 필요한, 일치되는 서열의 부재는 세포막에서의 단백질 산물의 부재로 설명할 수 있다. 따라서 사람 p185^neu의 세포외부(extracellular) 그리고 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인의 다양하게 절단된 형태들이 올바르게 발현하는지를 보다 더 검증하기 위해, -NH₂ 말단에 에피토프(epitope) myc에 의해 특성화되는 융합 단백질(fusion protein)을 암호화하는 새로운 플라스미드(plasmid)를 만들었다. 이들 재조합 단백질들은 항-myc 단일클론 항체에 의해 인지되며, 따라서 그들의 발현과 그 위치를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분석할 수 있다.

먼저 랫트(rat) 소포체(neu leader)에 대한 분비 신호와 myc 에피토프(epitope)를 암호화하는 새로운 플라스미드(plasmid)를 생성하였다. 센스 (올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #22)와 양 끝단에 NheI 부위를 갖는 안티센스 (올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) #23)로 구성된 합성서열을 이용하여 복제가 진행되었다. 5' 위치에서의 NheI 부위는 일단 올바르게 결찰되면 효소에 의해 인지되지 않도록 변화되었다. 우리는 이렇게하여 pCMV3.1H/Nneuleader-myc 에피토프(epitope)를 얻었다. 이 플라스미드(plasmid)로 사람 p185^neu 절단 형태들을 암호화하는 서열들은 NheI과 PmeI 제한 부위(restriction site)에서 복제되었다. 그리고나서 3T3 NIH 섬유아세포들이 리포펙타민(lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Milan, Italy)을 사용하는 플라스미드(plasmid)들과 함께 생체 밖에서 프랜스펙트(transfect)되었다. 48시간 후 트랜스펙트된 세포들은 FITC-conjugated 항-myc 단일클론 항체 (Sigma-Aldrich Srl, Milan, Italy)을 이용한 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분석하였다. 이렇게 해서 모든 플라스미드(plasmid)-암호화된 절단 형태들이 세포질에 존재함을 입증하였다. 3T3 NIH 섬유아세포들은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG와 유사하게 트랜스펙트 되었으며 1차 항체로써 c-erbB2/c-neu Ab-3 단일클론 항체 (Oncogene, Boston, MA)를, 그리고 FITC-conjugated anti-mouse 2차 항체 (PharMigen, San Diego, CA)를 사용하는 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분석되었다. 이에 의해 사람 ECD-TM이 세포막에서 발현됨이 관찰되었다. 전술된 첫 4개의 플라스미드(plasmid)들(pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG)을 사용하여 얻어진 결과들은 세포의 반응이 항종양 예방에 충분함을 입증하였다. 그러나, 보다 효과적인 치료를 위해서는 세포와 세포액 반응의 동시 활성화가 필요하다는 것이 알려져있다(Rielly et al., 2001, Cancer Res 61 : 880). 이전 단락에서 이미 기술된 바와 같이, 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG에 의해 암호화된 키메랄성(chimeric) 단백질은 접종된 동물들을 100 % 보호할 수 있으며 랫트(mice)들에서 강한 세포액 반응을 유발할 수 있다.

5개의 서로 다른 사람- 랫트 ( rat ) 키메랄성 ( chimeric ) p185neu 를 암호화할 수 있는 키메랄성(chimeric) 플라스미드(plasmid)들

키메랄성(chimeric) 단백질들을 암호화할 수 있는 플라스미드(plasmid)의 구성을 위해, 우리는 pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG, 그리고 pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG를 선택하였다. 이들 4가지 플라스미드(plasmid)들은 사람 p185^neu를 발현하는 치사 접종원(lethal inoculum) 종양세포에 대해 접종된 랫트(rat)들의 100 %를 보호한다. 또한 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG는 이에 의해 암호화된 단백질이 접종된 랫트(rat)들의 20 %만을 보호하는 pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG (275 aa)에 의해 암호화된 것과 단지 17 aa만이 다르기 때문에 접종된 랫트(rat)들의 60 %만을 보호함에도 불구하고 선택되었다. 우리는 17 aa의 펩티드 서열이 효과적인 면역 반응의 유발에 있어 중요한 에피토프(epitope)에 해당한다고 가정할 수 있다.

랫트(rat) p185^neu 일부를 암호화하는 DNA 단편은 DNA 효소 증폭에 의해 얻어졌다.

모든 같은 방위를 갖는 이들 cDNA 단편 여섯 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)를 증폭시키기 위해서는, 즉 다시 말해, T7 프라이머(primer)(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #11)를 사용되는데 반하여, 다섯 안티센스(antisense)는 적당한 위치에서 랫트(rat) cDNA를 인식하게 소화됐고, 그들의 끝(올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) #24-#28)에 NheⅠ은 제한 부위를 갖는다.

HindⅢ 과 NheⅠ 제한 효소에 세정과 소화 후에, 증폭된 단편들은 대응하는 플라스미드(plasmid) (pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG, pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG)에 끼워 넣어지고, 같은 제한효소로 소화시켰다. 같은 방법으로 획득된 다섯개의 새로운 플라스미드(plasmid)는 랫트(rat)와 사람 DNA 사이에 결합에 사용되는 제한 부위 NheⅠ를 따라 2(Val-Ser)의 689 aa 키메랄성 단백질(chimeric proteins)을 부호화할 수 있다. 이들 두개의 aa의 존재는 인간이나 랫트(rat) 모두의 부위불규칙을 제공한다.

키메랄성 단백질(chimeric proteins)은 사람 p185^neu 감소 부분과 랫트(rat) p185^neu감소 부분이 다르다. 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/Nr73-hECD1-TM-8CpG(도 10)은 랫트(rat) p185^neu 세포내 도메인(domain)의 73 aa와 사람 p185^neu의 614 aa를 암호화한다. 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/Nr153-hECD2-TM-8CpG(도 11)은 랫트(rat) p185^neu 세포내 도메인(domain)의 153 aa와 사람 p185^neu의 534 aa를 암호화한다. 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/Nr233-hECD3-TM-8CpG(도 12)은 랫트(rat) p185^neu세포내 도메인(domain)의 233 aa와 사람 p185^neu의 454 aa를 암호화한다. 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/Nr313-hECD4-TM-8CpG(도 13)은 랫트(rat) p185^neu 세포내 도메인(domain)의 313 aa와 사람 p185^neu의 374 aa를 암호화한다. 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/Nr393-hECD5-TM-8CpG(도 14)은 랫트(rat) p185^neu 세포내 도메인(domain)의 393 aa와 사람 p185^neu의 294 aa를 암호화한다. 이들 플라스미드(plasmid)에 의해 암호화된 사람/랫트(rat) 키메랄성(chimeric) p185^neu의 세포막 합성의 직접적 증거는 다섯 개의 새로운 플라스미드(plasmid)와 양성 대조로 pCMV3.1H/N-rl°cys-h2°cysTM-8CpG의 면역성부여된 쥐(mice)들을 획득했다. 모든 백신주사된 쥐들의 혈청은 사람 p185^neu에 대한 특수한 항체를 포함한다. 또한 다섯 개의 다른 키메랄성 단백질(chimeric protein)을 암호화하는 플라스미드(plasmid)를 백신주사한 동물은 사람 p185^neu 표현하는 종양 세포의 치명적 접종원으로 역시 보호되어 졌다.

본 발명에 따르면, p185^neu 종양단백질의 다른 단편을 암호화하는 서열을 포함하며, ErbB 패밀리의 종양유전자를 발현하는 종양에 저항하는 면역반응을 유발할 수 있는 플라스미드(plasmid) 및 그의 약제학적 조성물, 용도 등을 제공할 수 있다는 특장점이 있다.

도 1은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-h2°cys-TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 3은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-neuL-hECD1-TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 4는 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-neuL-hECD2-TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 5는 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-neuL-hECD3TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 6은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-neuL-hECD4TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 7은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-neuL-hECD5TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 8은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-neuL-hECD6TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 9는 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-neuL-hECD7TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 10은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r73-hECD1-TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 11은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r153-hECD2TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 12는 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r233-hECD3TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 13은 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r313-hECD4TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.
도 14는 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-r393-hECD5TM 8XCpG를 그림으로 나타낸 것이다.

[실시예]

실시예 1 - 플라스미스 pCMV3 .1H/N- rl ° cys - h2 ° cysTM -8 CpG 의 구조

플라스미스(plasmid) pCMV3.1H/N-rl°cys-h2°cysTM-8CpG의 구조는 랫트(rat) p185^neu 의 세포외부(extracellular)와 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인(domain)을 합성하는, 플라스미드 pCMV-ECD-TM에서 출발했다(Amici et al 2000, Gene Ther., 7 : 703). pCMV-ECD-TM은 플라스미드(plasmid) 백본(backbone) 유래 삽입물을 분리하기 위해 제한효소 HindⅢ과 XbaⅠ(BioLabs, Beverly, MA)로 소화시켰다.

효소 Hind Ⅲ의 제한 소화 :

플라스미드 DNA(plasmid DNA)(1μg/μl) 10 μl

제한 버퍼(restriction buffer) 10X(NEB2) 10 μl

HindⅢ(10U/μl) 5 μl

H₂O 75 μl

총량 100 μl

혼합물을 37 ℃ 에서 4 시간 동안 배양시키고, 소화 생성물을 대조군으로 분자 중량 마커(marker)와 미소화 플라스미드(undigested plasmid)를 사용하여 1 % 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동(electrophoresis) 시켜 통제되었다.

플라스미드 선상화(plasmid linearization)가 확인된 이래, DNA는 1/10 분량의 pH 5.2의 3 M 소디움 아세테이트(sodium acetate)와 2 분량의 pH 5.2의 차가운 순수 에탄올(ethanol)을 첨가하여 침전시켰다.

샘플은 얼음에 20분 동안 두고, 그때 14000 rpm 에서 12분 동안 미니원심분리기(minicentrifuge)에서 원심분리했다. 펠릿(pellet)은 70 % 차가운 에탄올로 3 차례 세척하고, 진공하에서 5분 동안 건조하고, H₂O 84 μl 로 재현탁시키고, 제한 효소 XbaⅠ로 효소 소화시켰다.

효소 Xba Ⅰ의 제한 소화 :

H₂O 에 재현탁시킨 DNA(10 μg) 84 μl

제한 버퍼(restriction buffer) 10X(NEB2) 10 μl

BSA 100X(100 mg/ml) 1 μl

XbaⅠ(10U/ml) 5 μl

총량 100 μl

혼합물을 37 ℃ 에서 4 시간 동안 배양시키고, 소화 생산물을 침전시킨 다음, 위에 설명처럼 건조시켰다. DNA는 H₂O 30 μl 로 재현탁시켰다.

플라스미드(plasmid) 백본(backbone)(4400 bp의 pCMV)와 삽입물(2100 bp의 ECD-TM)에 부합하는 DNA 단편을 1 % 아가로스 겔(agarose gel) 상에 전기영동(electophoresis)에 의해 분리했다.

삽입물에 부합하는 밴드(band)는 제거하고, DNA는 키아킥(Qiaquick) 겔 추출 키트(Qiagen Italy)를 사용하는 겔로 추출했다.

동시에, 새로운 플라스미드(plasmid) 백본(backbone)(pCMV3.1H/N-4CpG)으로, 랫트(rat) p185 ECD-TM에 부합하는 DNA 단편을 같은 제한 효소로 소화시키고, 아가로스 겔(agarose gel) 상에 용리했다.

랫트(rat) p185 ECD-TM에 부합하는 DNA 단편과 선상화(linearized)된 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-4CpG는 결찰 반응(ligation reaction)시켜 pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG를 얻었다.

결찰 반응( ligation reaction )

DNA 삽입물(rECD-TM)(50 ng/μl) 2 μl

선상화된 플라스미드 DNA(Linearized plasmid DNA)

(pCMV3.1H/N4CpG)(50 ng/μl) 1 μl

T4 DNA 리가제(ligase)

반응 버퍼(reaction buffer) 10X(NEB2) 1 μl

T4 DNA 리가제(ligase)(2U/μl) 1 μl

H₂O 5 μl

총량 10 μl

결찰 반응(ligation reaction)을 16 ℃ 에서 4 시간 동안 배양시켰다.

결찰 생성물(ligation product)은 E. coli 세균성 스트레인(strain) DH5 α 를 형질변환시키기 위해 사용된다.

세균성 스트레인( strain ) DH5 α 의 형질전환 :

적당한 세균성 세포 100 μl

결찰 생성물(ligation product) 5 μl

적당한 세포를 침입하는 플라스미드(plasmid) DNA를 만들기 위해서, 얼음에서 40 분 동안 두고, 열 충격(thermal shock)을 주었다(42 ℃ 에서 1.5 분과 얼음에서 2 분).

1 ml LB 성장 배지 첨가 후, 형질전환된 세균성 세포는 그들의 생리학적인 조건을 회복시키기 위해 37 ℃ 에서 1시간 동안 배양시켰다.

세포 현탁물은 6000 rpm 에서 1 분 동안 원심분리시키고, 펠렛(pellet)은 100 μl LB 에서 재현탁 시켰다.

세포는 선택된 고체 배지(아가(agar) 함유 LB + 암피실린(ampicillin) 100 μg/ml)를 포함하는 유리접시(Petri dishes)에 뿌리고, 37 ℃ 에서 하룻밤 동안 배양한다. 암피실린(ampicillin)은 암피실린 저항성을 보이는, 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG를 포함하는 세포를 성장하게 한다.

얻어진 클론(clones)은 재조합 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG를 포함하는 것을 분리하기 위해, 알칼리 용해에 의해 분해시켰다.

키메랄성 플라스미드(chimeric plasmid) pCMV3.1H/N-rl°cys-h2°cysTM-8CpG을 얻기 위해, 플라스미드(plasmid) pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG를 두번째 시스테인 도메인(cystein domain)과 함께 랫트(rat) p185^neu의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 제거하기 위해 제한효소 BstEⅢ 과 XbaⅠ 로 소화시켰다. 동시에, 플라스미드(plasmid) pCMV3.1hECD-TM-4CpG를 두번째 시스테인 도메인(cystein domain)과 함께 사람 유전자의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)에 부합하는 DNA 단편을 분리하기 위해 같은 효소로 소화시켰다.

BstE Ⅱ 소화 :

플라스미드 DNA(plasmid DNA)(1 μg/μl) 10 μl

제한 버퍼(restriction buffer) 10X(NEB3) 10 μl

BstEⅡ(10U/μl) 5 μl

H₂O 75 μl

총량 100 μl

혼합물을 60 ℃ 에서 4시간 동안 배양시켰다.

XbaⅠ로 제한 소화, 클로닝에 사용되는 단편의 회수, 결찰 반응(ligation reaction)과 적당한 세포의 형질전환은 전술한 바와 같다.

얻어진 키메랄성 플라스미드(chimeric plasmid) pCMV3.1H/N-rl°cys-h2°cysTM-8CpG는 사람 유전자의 2^nd 시스테인 서브도메인(cystein subdomain)과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)에 부합하는 단편의 정확한 삽입을 검증하기 위해, 자동 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Biosystem이 적용된)을 사용하여 배열을 완성했다.

실시예 2 - 생체내 실험

동물( Animals )

약 7주쯤 된 Balb/cAnCr(H-2d) 암컷 쥐를 모든 실험에 사용하였다.

찰스리버라보라토리즈(Charles River Laboratories)(Calco, MI, Italy)에서 공급한 동물을 무균 상태에서 European Community 지침에 따라 키운다.

생체내 전기영동법( electroporation )에 따른 근육내 투여

트리브로모에탄올(tribromoethanol)(Sigma-Aldrich) 0.58 g 과 3급-아밀 알코올(Tert-Amyl alcohol)(Aldrich) 310 μl 를 탈이온수 39.5 ml 중에 용해시켜 만들어진 알버틴(avertine) 300 μl를 i.p. 접종(inoculum)하여, 각각의 쥐 정강이뼈(tibial) 근육의 원치않는 수축을 피하기 위해 마취시켰다. 모든 쥐들은 접종(inoculum)을 위해 정강이뼈(tibial) 근육의 대응해 제모했다.

동물을 50 μg DNA를 포함하는 용액 40 μg으로, 두 앞-정강이뼈(antero-tibial) 근육들의 대응하는 백신주사를 했다.

DNA-함유 혼합물은 Dr. F. Pericle(Valentis, Inc., THe Woodlands, Texas, USA)의 지시에 적합하게 사용하기 전에 빨리 제조되었다. 이 용액은 1.25 mg/ml 플라스미드(plasmid) DNA, 6 mg/ml 폴리-L-글루타메이트 소디움 솔트(poly-L-glutamate sodium salt)(Sigma-Aldrich, S.r.l., Milano, Italia), 150 mM 소디움 클로라이드(sodium chloride)(Fluka, BioChemika, Buchs, Switzerland) 그리고 최종 부피가 1 ml가 될 때까지 균체내 독소가 없는 증류수(Nucleare Free Water, Promega Corporation)를 포함한다.

접종(inuculum) 5 분 후, 처리된 지역을 23 ms를 유지하는, 전기영동기 Eletro Square Prator(T820, BTX, san Diego, CA, USA)로, 375 V/cm²의 강도를 갖는 두 전기 충격파의 적용에 의해 전기영동 됐다. 경피 전기 충격파(transcutaneous electric impulses)는 각각의 발과 비교해, 각각 다른 데서 3 mm에 두 사각 스틸(steel) 전극을 사용하여 적용시켰다. 전기영동에 의한 유전자 면역성부여는 각각 21 마리의 동물과 종양 세포의 접종(inuculum) 전 7일 동안, 두 번 수행하였다.

종양 세포의 접종

쥐(mice)는 2 × 10⁵ D2F2/E2 세포를 포함하는 현탁액으로 접종시켰다. 이들 세포는 BALB/c 쥐의 형성적인 치조돌기 마디(hyperplastic alveolar node)와 사람 p185의 높은 수준의 발현에서 자발적으로 야기된 유방 종양에서 유도된다.

생체내 종양 성장에 대한 평가

종양 성장은 촉진(palpation)에 의해 매주 평가되고, 종양의 크기는 직경에 두 직각을 이루는 직경을 따라 측정했다. 측정시 3 mm보다 더 크게 형성된 덩어리를 종양으로 간주하였다.

종양 성장은 종양 접종 후 100일 또는 10 mm보다 더 큰 직경으로 종양이 성장될 때까지 성장시킨 다음 동물을 희생시켰다.

표

쥐 : 암컷 BALB/c

종양 : 사람 p185^neu을 발현하는 D2F2-E2

플라스미드( plasmid ) 구조에 합성되고 사용되는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)의 목록

서열목록 전자파일 첨부

Claims

유효성분으로 서열번호 2, 10, 11, 12, 13, 14로 구성된 그룹에서 선택된 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나 이상의 서열을 포함하는 DNA 트랜스퍼 벡터(vector)를 함유하는 p185^neu - 발현성 원발종양이나 재발전이를 가진 환자의 예방이나 치료용 항암제.
청구항 1에 있어서, 전술한 제제가 DNA 백신 제형인 항암제.
청구항 1에 있어서, 전술한 벡터가 플라스미드(plasmid)인 DNA 트랜스퍼 벡터(vector)를 포함하는 항암제.
청구항 3에 있어서, 전술한 벡터가 추가로 전사 프로모터(transcription promotor)를 포함하는 항암제.
청구항 4에 있어서, 전술한 전사 프로모터(transcription promotor)가 CMV인 항암제.
청구항 3에 있어서, 전술한 벡터가 추가로 4 CpG 모티프(motifs)를 포함하는 항암제.
청구항 6에 있어서, 전술한 벡터가 추가로 8 CpG 모티프(motifs)를 포함하는 항암제.