CN1863547A - 编码p185neu的DNA及其治疗用途 - Google Patents
编码p185neu的DNA及其治疗用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1863547A CN1863547A CNA2004800293153A CN200480029315A CN1863547A CN 1863547 A CN1863547 A CN 1863547A CN A2004800293153 A CNA2004800293153 A CN A2004800293153A CN 200480029315 A CN200480029315 A CN 200480029315A CN 1863547 A CN1863547 A CN 1863547A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- neu
- people
- rat
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 121
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 claims description 4
- 235000018259 Solanum vestissimum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000002825 Solanum vestissimum Species 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 abstract description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 abstract 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 87
- 101000856426 Mus musculus Cullin-7 Proteins 0.000 description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 65
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 4
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 4
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108700017469 rat Cdkn2c Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 2
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005869 Activating Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010005254 Activating Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000000078 claw Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000051957 human ERBB2 Human genes 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- -1 tert-pentyl alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及含有编码p185neu癌蛋白质的不同片段的序列的质粒，其能够诱导抗表达ErbB家族癌基因的肿瘤的免疫应答，及其药物组合物。
Description
本发明涉及含有p15neu-编码序列的质粒载体及其在抗肿瘤的DNA疫苗接种中的用途。根据本发明的质粒含有编码人类或大鼠癌蛋白质p185neu不同片段的序列，并且能够诱导抗表达ErbB家族癌基因的肿瘤的体液或细胞介导的免疫应答。
本发明还涉及含有所述质粒的药物组合物以及它们用于预防或治疗表达p185neu的肿瘤的用途。
发明背景
蛋白质p185neu是研究最多的肿瘤抗原之一，由于它存在于一些最常见的人类癌细胞膜上，所以它作为抗癌免疫治疗的靶标引起了人们极大的兴趣。
p185neu是在大鼠体内由原癌基因Her2/neu编码的膜受体，并且属于I类酪氨酸激酶受体(RTKs)家族，此家族还包括表皮生长因子受体EGF-R(ErbB-1)和其它相关受体(ErbB-3、ErbB-4)。这些受体与细胞增殖和分化有关(Hynes和Stern，1994BBA 1198：165)，因此引起极大的生物学及临床兴趣。此受体由三个明确区分的结构域：胞外结构域、跨膜结构域和胞浆内结构域组成。p185neu与细胞内信号转导和细胞内通讯的机制的复杂网络有关，此所述机制调节增殖与分化过程(Boyle 1992Curr.Op.Oncol.4：156)。癌基因neu是按化学诱导的大鼠神经胶质胚细胞瘤(neuroglioblastoma)命名，从神经胶质胚细胞瘤首次分离癌基因neu。此活化的neu形式有一个点突变，导致“T”代替“A”，结果谷氨酸残基取代p185neu 644位的缬氨酸残基(Val644Glu)(Bargmann等人，Cell 45：649)。
人类neu同源基因ErbB-2也已经被分离鉴定，并证明大鼠HER2/neu受体和人类ErbB2都与EGFR有显著同源性(Coussens等人，1985，Science230：1132；Yamamoto等人，1986，Nature 319：230)。虽然大鼠序列中遗传突变导致组成型受体通过二聚化激活，但是在ErbB-2阳性人肿瘤中，观测到癌基因的异常表达(Di Marco等人，1990，Mol.Cell.Biol.10：3247；Klapper等人，2000，Adv Cancer Res，77：25)，即使在极少数情况中，已经发现了激活点突变和异常剪接机制(Kwong等人，1998，Mol Carcinog 23：62；Xie等人，2000，J Natl Cancer Inst，92：412)。总体效应是相似的：基因扩增和转录水平的增加决定了过量的p185neu膜受体，结果活性二聚体增加，其在细胞内以配体独立的方式转导生长信号。最近报导的关于人类和大鼠p185neu细胞外区域的晶体结构显示此蛋白的特征在于具有刚性构象，其允许与其它的ErbB受体相互作用，不直接结合任何配体，并引发增殖信号转导(Cho HS等人，2003，Nature 421：756)。
正常情况下，人p185neu与器官发生和上皮生长有关；在胎盘形成和胎儿发育期间以高水平表达，而它在成人组织中则以非常低的水平存在(Press等人，1990，Oncogene 5：953)。
一些研究证明，人类p185neu过量表达与肿瘤性转化过程和肿瘤侵占的水平有关。已经描述了p185neu在肺(Kern等人，1986，CancerRes.50：5184)、结肠(Cohen等人，1989，Oncogene 4：81)、卵巢(Slamon等人，1989，Science 244：707)、腺癌以及在多种人乳腺癌(Slamon等人，1989，Science 244：707；Jardines等人，1993，Pathobiology 61：268)中的过量表达。
使得p185neu成为质粒疫苗接种的最佳靶标的基本特性是：a)它直接与细胞生长和癌发生有关，因此克隆变体由于肿瘤遗传不稳定性而失去了此抗原的表达，也失去了它们的致瘤力；b)它表达在细胞质膜上，这使它即使是在失去了主要组织相容性体系的表达的肿瘤细胞中也可以被抗体识别(Lollini P.和Forni G.2003，Trends Immunol，24：62)。
对活化的大鼠癌基因Her-2/neu转基因的小鼠(其自发产生p185neu阳性乳腺肿瘤)以及使用p185neu阳性可移植肿瘤系对鼠类模型进行的研究证明了预防和治疗癌变前损伤的可能性。具体关于大鼠活化的Her-2/neu基因转基因小鼠中乳腺肿瘤的预防，我们证明了与编码全长大鼠p185neu的质粒或者只编码胞外结构域的质粒(分泌抗原)相比，编码p185neu胞外结构域和跨膜结构域的质粒可以更有效地诱导体内保护(Amici A.等人，2000，Gene Ther.，7：703；Rovero S.等，2000，J.of Immunol.，165：5133)。Chen等人报道了相似的结果(1998，Cancer Res 58：1965)。其他作者证明不管是编码未改变的p185neu的质粒还是编码突变p185neu以除去它的酪氨酸激酶活性的质粒，在预防p185neu阳性细胞接种物引起的肿瘤发生中都是有效的(Wei WZ等人，1999，Int J.Cancer 81：748)。而且，缺乏负责通过内质网加工的信号(前导区，其决定p185neu抗原在细胞质中的定位)的质粒经证明同样有效。由不同质粒诱导的保护作用主要对于p185neu的膜表达的情况由体液免疫应答介导，对于细胞质定位的情况由T淋巴细胞介导的免疫应答介导(Pilon SA等人2001，J.of Immunol.167：3367)。然而，用诱导在细胞质和细胞膜中p185neu都过表达的质粒联合疫苗接种在对抗肿瘤生长的保护中更加有效(Piechocki MP等人，2001，J.Immunol.167：3367)。
因此，不同免疫应答机制之间的平衡可能尤其重要(Reilly等人，2001，Cancer Res.61：880)。而且，观察到用编码大鼠p185neu的胞外结构域和跨膜结构域的质粒接种，当细胞接种物过表达p185neu时，能够消灭直径为2mm的肿瘤块，这是免疫系统的许多不同的效应机制(T辅助细胞和T杀伤细胞、抗体、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞、Fc受体、γ干扰素和穿孔蛋白)实现的，所述效应机制协力排斥肿瘤(Curcio C.等人，2003，J.Clin.Invest.111：1161)。
发明描述
已经将编码人或人/大鼠嵌合p185蛋白质的多种构建体插入质粒载体并用于旨在防止肿瘤发展的免疫实验中。为了质粒构建，由ErbB2癌基因序列制备出人p185neu蛋白质的片段，其含有跨膜结构域和长度减少的胞外结构域的部分，或者其部分用大鼠Her-2/neu cDNA同源序列代替以构建嵌合质粒。
在接种过表达人p185neu的肿瘤细胞的小鼠中通过疫苗接种实验评估所得质粒。含有p185neu的截短形式的质粒诱导杀伤性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞介导的抗肿瘤反应性，而嵌合质粒诱导针对人和大鼠p185neu的抗体应答。
以体内实验结果为基础，挑选能够诱导细胞型和体液型强免疫反应的含p185neu序列的质粒。这些本发明的目的质粒含有编码p185neu片段的序列，此序列选自SEQ ID NO.1-14(人和大鼠p185neu参考序列可以分别以Gene Bank检索号M11730和X03362得到)。
根据本发明，p185neu编码序列可以插入适合人施用的任意质粒。除了编码序列，质粒还可以含有用于转录控制的功能元件，特别是置于编码序列上游的启动子，优选CMV启动子、起始和终止转录元件、选择标记，如氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因；CpG基序、聚腺苷酸化位点或转录激活因子。转录控制元件应与载体在人体中的使用相容。在优选实施方案中，本发明的质粒含有至少4个CpG基序，优选地，至少8个CpG基序，最多80个CpG基序。细菌来源的CpG基序(ATAATCGACGTTCAA)诱导巨噬细胞分泌IL-2，其又诱导自然杀伤细胞分泌IFN-γ，从而激活T辅助淋巴细胞介导的应答(Chu R.S.等人，1997，J.Exp.Med.，186：1623)。因此，质粒序列中CpG基序的插入增强免疫应答。
在另一实施方案中，本发明提供了药物组合物，它含有一种或多种不同的如上定义的质粒及与之联合使用的可药用载体(vehicle)和赋形剂。此药物组合物为适合肠胃外施用的形式，优选地，为可注射溶液剂的形式，方便地用于DNA疫苗接种。DNA疫苗接种的原理和方法是技术人员已知的并且公开在例如，Liu MA 2003，J Int Med 253：402。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合制剂，其含有至少两种，优选地，至少四种，更优选地，至少八种不同的质粒，用于同时、顺序或者单独施用于个体或患者。
根据本发明的质粒、组合物和制剂用于预防性或治疗性治疗处于患p15neu-阳性肿瘤危险中的个体，或者患有p15neu-阳性肿瘤的原发肿瘤、转移瘤或复发的患者。预防可以是主要的，此时肿瘤还没有表现出来，预防可以是次要的，此时肿瘤处在初始阶段作为癌前病变，预防可以是第三位的，此时肿瘤处于复发或转移过程。能从用本发明的质粒治疗中受益的肿瘤是那些上皮来源肿瘤的，特别是肺、卵巢和乳腺腺癌，更一般地，表达p18neu蛋白质的肿瘤。
发明详述
pCMV3.1质粒骨架的构建
为了构建编码人p185neu片段的质粒和嵌合质粒，使用pCMV3.1质粒骨架。将得自人类原癌基因ErbB2 cDNA的片段和得自大鼠原癌基因Her-2/neu cDNA的片段插入由限制酶DraIII(nt1531)和BsmI(nt189)除去1658bp片段的pCMV3.1(Invitrogen，米兰，意大利)中，所述1658bp片段含有复制起点f1、复制起点和早期SV40启动子、编码新霉素抗性的基因和SV40多腺苷酸化信号。与天然pCMV3.1相比，所得改造后的质粒(pCMV3.1)呈现出某些优势。实际上，质粒大小减小到3900bp和无关序列的除去有助于提高体内转染功效。
质粒pCMV3.1erbB2的构建
从质粒pSVerB2获得的人ErbB2 cDNA已经插入pCMV3.1的多克隆位点中限制位点HindIII和XbaI中。此质粒用于构建表达截短的p185neu的质粒和嵌合质粒。
含有序列4XCpG的质粒：pCMV3.1hECD-TM-4CpG和pCMV3.1hECD-TM-4noCpG的构建
从质粒pCMV3.1-erbB除去编码细胞质内结构域的序列后，制备编码原癌基因ErbB2胞外区和跨膜区的两种质粒。此过程包括首先进行限制性分析，用以鉴定存在于ErbB2 cDNA核苷酸序列中的独特位点。鉴定了酶AccIII(nt2195)所识别的一个独特位点，其位于跨膜结构域末端下游大约20bp处。
用以独特限制性酶切位点存在的酶AccIII和酶XbaI除去细胞质结构域。为了将识别为翻译终止信号的核苷酸三联体TAA重新插入ErbB2ECD-TM DNA的3’末端，我们使用两条合成序列，这两条序列由两条有义寡核苷酸(寡核苷酸#1、#3)和两条反义寡核苷酸(寡核苷酸#2、#4)组成，所述寡核苷酸它们的末端有限制性位点AccIII和XbaI。在这些合成的序列中，还存在着四个重复序列CpG和noCpG，后者用做阴性对照。将这两种新质粒命名为pCMV3.1hECD-TM-4CpG和pCMV3.1hECD-TM-4noCpG。
含在序列8XCpG的质粒：pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD-TM-8noCpG的构建
为了增加其他的无特异性免疫刺激，我们构建了含有4个免疫刺激性CpG序列的新的质粒骨架，命名为pCMV3.1H/N-4CpG。为达到这个目的，我们改进了pCMV3.1以便除去酶PmeI的两个限制性位点中的一个，并通过由两条有义(寡核苷酸#5)和反义(寡核苷酸#6)寡核苷酸组成的合成序列颠倒多克隆位点上存在的HindIII和NneI限制性位点。在此命名为pCMV3.1H/N的新质粒中，插入了两条合成的序列，此两序列由两条有义(寡核苷酸#7，#9)和反义核苷酸(寡核苷酸#8，#10)组成，并在唯一限制性位点XbaI和PmeI中含有CpG和noCpG序列的四个重复，从而获得了pCMV3.1H/N-4CpG和4noCpG质粒。此后，将DNA片段hECD-TM-4CpG和hECD-TM-4noCpG分别插入pCMV3.1H/N-4CpG和pCMV3.1H/N-4noCpG中，由此得到两种新的质粒，命名为pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD-TM-8noCpG。
含有人p185neu的第二个半胱氨酸结构域和跨膜结构域的质粒：pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG的构建
人p185neu胞外结构域的特征是两个富含半胱氨酸的区域，称作第一和第二个半胱氨酸亚结构域(1st cys和2nd cys)。不像大鼠cDNA序列，其只含有胞外结构域中的一个位点BstEII(nt1250)，该胞外结构域位于分隔1stcys和2nd cys的核苷酸区域中，ErbB2的胞外结构域的cDNA序列有两个BstEII限制性位点：除了与大鼠相同位置的位点(nt1372)外，另一个BstEII位点(nt963)存在于编码胞外结构域的1st cys部分中。用HindIII和BstEII消化质粒pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG，得到由来自胞外结构域的2ndcys、跨膜结构域、序列8CpG和质粒pCMV3.1H/N组成的DNA片段。然后使用有义寡核苷酸和反义寡核苷酸，通过酶促DNA扩增(PCR反应)将大鼠p185neu经内质网分泌的信号插入，所述有义寡核苷酸由识别T7RNA聚合酶的引物T7(寡核苷酸#11)(存在于pCMV3.1H/N多克隆位点的开始处)组成，所述反义寡核苷酸(寡核苷酸#12)在其末端具有BstEII位点。经纯化后，扩增的片段用限制酶HindIII和BstEII酶促消化，随后克隆，得到pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG(图.1)。此质粒用于疫苗接种实验，将它与pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG比较。此后，制备了编码融合蛋白质的嵌合cDNA，此融合蛋白质是人序列的2nd cys和跨膜结构域(nt1372-nt2204)与大鼠序列的1st cys(nt1-nt1250)之间的融合蛋白质。通过分别来自大鼠和人cDNA的部分的融合重构完整蛋白质允许增强免疫应答。
含有大鼠p185neu的第一半胱氨酸结构域和人第二个半胱氨酸结构域及跨膜结构域(nt1-nt1250)的序列的嵌合质粒：
pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG的构建
不像大鼠cDNA序列，其只含有胞外结构域中的一个BstEII位点(nt1250)，该胞外结构域位于分隔富含半胱氨酸的第一个和第二个区的核苷酸区域中，Erb2的胞外结构域的cDNA序列有两个BstEII限制性位点：一个在1372(nt)位，和大鼠序列中位置相同；另一个在963(nt)位上，即位于编码胞外结构域的1st cys的序列部分中。BstEII位点存在于大鼠cDNA结构域(1250nt)和人类cDNA(1372nt)中同一个位置上使得可以构建能够编码大鼠1st cys与人2nd cys之间的融合产物。事实上，用限制酶HindIII和BstEII消化pCMV3.1H/N-h2°cysTM-8CpG使得可以将编码大鼠p185neu分泌信号的DNA片段用编码大鼠1st cys的核苷酸序列替换，所述编码大鼠1st cys的核苷酸序列用同样的酶消化pCMV3.1rECD-TM-4CpG获得的。质粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG(图2)的产物由大鼠p18neu的422个氨基酸的部分和人p185neu的274个氨基酸的部分组成。此新质粒pCMV.1H/N-r1°cys-h2°cysTM-8CpG已用于免疫接种实验，实验中用pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG做为比较项。令人惊奇地，编码嵌合蛋白的质粒在小鼠体内诱导针对表达人p185neu的肿瘤的完全保护作用(表)。此保护作用与pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG诱导的保护作用相似。而且，对用两种质粒接种的小鼠血清的分析证明对人p185neu具有相似的抗体效价。
能够编码人p185neu胞外结构域和跨膜结构域的减短片段的质粒
构建编码人p185neu胞外结构域和跨膜结构域的减短片段的7种质粒，即：pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG(-70个氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG(-150个氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG(-230个氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG(-310个氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG(-390个氨基酸)；pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG(-470个氨基酸)和pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG(-550个氨基酸)。
这些片段中第一个片段编码的片段缩短70个氨基酸(缺失360bp)。所有其它的则逐个缩短80个氨基酸(缺失240bp)。
这些片段已经经DNA酶促扩增得到，该扩增使用末端具有NheI限制性位点的七条不同的有义寡核苷酸(寡核苷酸#13-#19)，和能够识别存在于pCMV3.1的3’末端的多接头处名为“pCMV3.1/BGH反向引发位点”(830-850nt)的反义寡核苷酸(寡核苷酸#20)。用限制性酶NheI和PmeI酶促消化后，扩增产物克隆入先前获得的pCMV3.1H/N-neu前导区，将大鼠p185neu的内质网分泌信号插入限制性位点中。大鼠p185neu分泌信号的DNA片段是用引物T7(寡核苷酸#11)作为有义核苷酸，和在末端具有NheI位点的反义核苷酸(寡核苷酸#21)经酶促DNA扩增得到的。扩增得到的片段经过纯化和用HindIII和NheI限制性消化后，被克隆到用同样的酶消化的质粒pCMV3.1H/N中，得到pCMV3.1H/N-neu前导区。由于存在大鼠p185neu的内质网分泌信号，所以预计人p185neu不同截短形式的膜表达。编码截短形式的质粒pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG(图3)、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG(图4)、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG(图5)、pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG(图6)和对照质粒pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG都保护100％接种的小鼠对抗表达人p185neu的肿瘤细胞的致死性接种物(表)。质粒pCMV3.1H/N-hECD5-TM-8CpG(图7)保护60％动物，而质粒pCMV3.1H/NhECD6-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD7-TM-8CpG(图8、9)对于表达人类P185neu的肿瘤细胞的致死性接种物没有保护作用(表)。不同的质粒表达的蛋白质产物没有通过内质网分泌。糖基化和内质网加工所必需的共有序列的缺乏，或-NH2末端氨基酸的缺失导致的构象改变可以解释膜中蛋白质产物的缺乏。因此，为了进一步验证不同截短形式的人p185neu胞外和跨膜结构域是否被正确表达，产生了编码以-NH2末端表位myc为特征的融合蛋白的新质粒。这些重组蛋白质被抗myc单克隆抗体所识别，因此，就可能用共焦显微术分析它们的表达和定位。
首先，已经产生了编码大鼠内质网分泌信号(neu前导区)和myc表位的新质粒。使用合成序列实施克隆，此序列由两端都具有NheI位点的有义(寡核苷酸#22)和反义(寡核苷酸#23)寡核苷酸组成。突变5’位中的NheI位点，从而一旦正确连接，此位点不被所述酶识别。我们因此得到了pCMV3.1H/Nneuleader-myc表位。用此质粒，在限制性位点NheI和PmeI中克隆了编码人p185neu截短形式的序列。随后用lipofectamine2000(Invitrogen，米兰，意大利)将质粒体外转染3T3 NIH成纤维细胞。48小时后，使用FITC缀合的抗myc单克隆抗体(Sigma-Aldrich Srl，米兰，意大利)，用共焦显微术分析经转染的细胞。由此，证明了所有质粒编码的截短形式均定位在细胞质中。3T3 NIH成纤维细胞用质粒pCMV3.1H/NhECD-TM-8CpG平行转染，使用c-erbB2/c-neu Ab-3单克隆抗体(Oncogene，波士顿，美国)作为一级抗体，和FITC缀合的抗小鼠二级抗体(PharMigen，San Diego，CA)，用共焦显微术进行分析。观察到人ECD-TM表达在膜上。用前述质粒的前四种质粒(pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG)所得到的结果证明细胞应答足够用于抗肿瘤防御。然而，已知细胞和体液应答的同时活化对于更有效的治疗是必要的(Rielly等人，2001，Cancer Res61：880)。正如前面段落已经陈述的那样，质粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG编码的嵌合蛋白质可以100％的保护接种过的动物，并能在小鼠体内诱导强的体液应答。
嵌合质粒能够编码五种不同的人-大鼠嵌合p185neu
为构建编码嵌合蛋白质的质粒，我们选用了质粒pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG。这四种质粒可以100％保护被接种的小鼠对抗表达人p185neu的肿瘤细胞的致死接种物。质粒pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG也被选用，即使它仅保护60％的经接种小鼠，因为所编码的蛋白质与质粒pCMV3.1H/Nh2°cysECD-TM-8CpG编码的蛋白质相比只有17个氨基酸不同，后者保护60％的经接种小鼠。我们可以假设，这17个氨基酸的肽序列对应于诱导有效免疫应答的重要表位。
DNA酶促扩增获得了编码大鼠p185neu部分的DNA片段。为扩增这些cDNA片段，使用都具有相同定位，即T7引物(寡核苷酸#11)的定位的6种寡核苷酸，而设计了识别适当位置的大鼠cDNA并且在它们的末端具有NheI限制性位点的5种反义寡核苷酸(寡核苷酸#24-#28)。扩增得到的片段经纯化和限制酶HindIII和NheI消化后，插入到经同样限制酶消化的相应质粒(pCMV3.1H/NhECD1-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD2-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD3-TM-8CpG、pCMV3.1H/NhECD4-TM-8CpG和pCMV3.1H/NhECD5-TM-8CpG)中。通过这种方法，我们得到了五种新质粒，其可以编码689个氨基酸的嵌合蛋白质，其中2个(Val-Ser)属于用来连接大鼠和人DNA的限制性位点NheI。这两个氨基酸的存在使得人和大鼠部分都是异种溶解的。
嵌合蛋白质不同于人p185neu缩短部分和大鼠p18neu增加部分。质粒pCMV3.1H/Nr73-hECD1-TM-8CpG(图10)编码大鼠p185neu胞外结构域的73个氨基酸和人p185neu的614个氨基酸。质粒pCMV3.1H/Nr73-hECD2-TM-8CpG(图11)编码大鼠p185neu胞外结构域的153个氨基酸和人p185neu的534个氨基酸。质粒pCMV3.1H/Nr233-hECD3-TM-8CpG(图12)编码大鼠p185neu胞外结构域的233个氨基酸和人p185neu的454个氨基酸。质粒pCMV3.1H/Nr313-hECD4-TM-8CpG(图13)编码大鼠p18neu胞外结构域的313个氨基酸和人p185neu的374个氨基酸。质粒pCMV3.1H/Nr393-hECD5-TM-8CpG(图14)编码大鼠p185neu胞外结构域的393个氨基酸和人类p185neu的294个氨基酸。用这五种新的质粒和作为阳性对照的质粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG免疫小鼠得到了这些质粒编码的人/大鼠嵌合p185neu的膜表达的间接证据。所有接种的小鼠血清都含有抗人p185neu的特异抗体。而且，用编码五种不同嵌合蛋白质的质粒接种的动物也受到保护免于表达人p185neu的肿瘤细胞致死性接种物的影响。
实施例
实施例1-质粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG的构建
为构建嵌合质粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG，我们从质粒pCMV-ECD-TM开始，该质粒表达大鼠p185neu胞外结构域和跨膜结构域(Amici等人，2000，Gen Ther.，7：703)。质粒pCMV-ECD-TM用限制酶HindIII和XbaI(BioLabs，Beverly，MA)消化以从质粒骨架分离插入片段。
用酶HindIII的限制性消化
质粒DNA(1μg/μl) 10μl
限制性缓冲液10X(NEB2) 10μl
HindIII(10U/μl) 5μl
H2O 75μl
100μl终体积
混合物在37℃孵育4个小时，消化产物由1％琼脂糖凝胶电泳控制，用分子量标准参照物和未消化的质粒作为对照。
一旦证实了质粒线性化，即加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和两倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA。
将样品置于冰上20分钟，用小型离心机以14,000转/分钟离心12分钟。沉淀物用1mL 70％冷乙醇洗涤三次，真空干燥5分钟后重悬浮于84μl水中，用限制酶XbaI酶促消化。
酶XbaI的限制性消化
重悬浮于水中的DNA(10μg) 84μl
限制性缓冲液10X(NEB2) 10μl
BSA 100X(100mg/ml) 1μl
XbaI(10U/ml) 5μl
100μl
混合物在37℃孵育4小时，消化产物如上述沉淀和干燥。将DNA重悬浮于30μl水中。
相应于质粒骨架(4400bp的pCMV)和插入片段(2100bp的ECD-TM)相应的两种DNA片段在1％琼脂糖凝胶上电泳分离。
将与插入片段相应的带除去，用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen，意大利)从凝胶洗脱DNA。
平行的，将其中DNA片段对应于大鼠p185ECD-TM的新质粒骨架(pCMV3.1H/N-4CpG)用相同的限制性酶消化并在琼脂糖凝胶上洗脱。
与大鼠ECD-TM相应的DNA片段和线性化质粒pCMV3.1H/N-4CpG用于通过连接反应获得pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG。
连接反应
DNA插入片段(rECD-TM)(50ng/μl) 2μl
线性化质粒DNA(pCMV3.1H/N4CpG)(50ng/μl) 1μl
T4DNA连接酶的反应缓冲液10X 1μl
T4DNA连接酶 1μl
H2O 5μl
10μl
连接反应物在16℃孵育4小时。
连接产物然后用于转化大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α。细菌细胞用CaCl2技术制备成感受态。
菌株DH5α的转化：
感受态细菌细胞 100μl
连接产物 5μl
为了使质粒DNA穿透感受态细胞，将转化体系放置冰上40分钟，然后将其进行热休克(42℃1.5分钟，之后放置冰上2分钟)。
加入1ml LB生长培养基后，转化后的细菌细胞在37℃孵育1小时以恢复其生理状态。
细胞悬浮液以6000转/分钟离心1分钟，沉淀物重悬浮于100μlLB中。
细胞接种在含有选择性固体培养基(含有琼脂的LB+100μg/ml氨苄青霉素)的培养皿上，并在37℃生长一夜。氨苄青霉素允许含有质粒pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG的细胞生长，所述质粒赋予了氨苄青霉素抗性。
所得克隆用碱裂解分析以挑选出含有重组质粒pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG的那些克隆。
为了获得嵌合质粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG，质粒pCMV3.1H/N-rECD-TM-4CpG用限制酶BstEII和XbaI消化以除去大鼠p185neu的第二个半胱氨酸结构域和跨膜结构域。同时，质粒pCMV3.1hECD-TM-4CpG用相同的酶消化以分离相应于人基因的第二个半胱氨酸亚结构域和跨膜结构域的DNA片段。
用BstEII消化
质粒DNA(1μg/μl) 10μl
限制性缓冲液10X(NEB3) 10μl
BstEII(10U/μl) 5μl
H2O 75μl
100μl终体积
混合物在60℃孵育4小时。
用XbaI限制性消化，以前已经描述了用于用于克隆的片段的回、连接反应和感受态细胞的转化。
所得嵌合质粒pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys-TM-8CpG已经用自动ABIPRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosysterm)测序，以验证相应于人基因的第二个半胱氨酸亚结构域和跨膜结构域的片段的正确插入。
实施例2-体内试验
动物
约7周龄的Balb/cAnCr(H-2d)雌性小鼠用于所有实验中。
这些动物由Charles River Laboratories(Calco，MI，意大利)提供，生长在无菌条件中并按照欧洲共同体(European Community)的准则。
肌内施用后体内电穿孔
为避免胫骨肌肉不必要的收缩，每只小鼠都用腹膜内接种300μl的阿佛丁(avertine)麻醉，阿佛丁由将0.58g三溴乙醇(Sigma-Aldrich)和310μl叔戊醇(Aldrich)溶于39.5ml去离子水中制备。随后，所有小鼠在胫骨肌相应处剃毛以便接种。
用含有50μg DNA的40μl溶液在相应于两个胫前肌处接种动物。
在临用前制备含有DNA的混合液，按照F.Pericle博士(Valentis，Inc.The woodlands，德克萨斯，美国)的指示配制。此溶液含有1.25mg/ml质粒DNA，6mg/ml聚-L-谷氨酸钠盐(Sigma-Aldrich，S.r.l.，Milano，意大利)，150mM氯化钠(Fluka，BioChemika，Buchs，瑞典)和不含内毒素的蒸馏水(Nucleare Free Water，Promega公司)，最终体积为1mL。
在接种后约5分钟，所处理的区域用电穿孔仪Electro SquarePorator(T820，BTX，San Diego，CA，USA)进行电穿孔，应用两次电脉冲，强度为375V/cm2，每次持续25ms。通过使用彼此相隔3mm放置于每个爪子边上的两个方形钢电极应用经皮电脉冲。在接种肿瘤细胞前21天和7天，对每只动物用电穿孔进行2次基因免疫。
肿瘤细胞的接种
用含有2×105个D2F2/E2细胞的悬浮液接种小鼠。这些细胞来源于在BALB/C小鼠的增生泡状结中自发产生的乳腺肿瘤，并表达高水平的人p185。
肿瘤生长的体内评估
每周通过触诊评估肿瘤生长，用卡尺沿着两个垂直的直径测量肿瘤的尺寸。测定大于3毫米的瘤块即认为是肿瘤。
肿瘤生长从肿瘤接种后到100天，或者直到肿瘤生长到直径大于10mm，然后处死动物。
表
小鼠：雌性BALB/c
肿瘤：表达人p185neu的D2F2-E2
| 质粒 | 小鼠数目 | 保护 | 抗体 |
| pCMV3.1H/N-8CpG | 5 | 0％ | - |
| pCMV3.1H/N-hECD-TM-8CpG | 5 | 100％ | +++ |
| pCMV3.1H/N-hECD1-TM-8CpG | 5 | 100％ | - |
| pCMV3.1H/N-hECD2-TM-8CpG | 5 | 100％ | - |
| pCMV3.1H/N-hECD3-TM-8CpG | 5 | 100％ | + |
| pCMV3.1H/N-hECD4-TM-8CpG | 5 | 100％ | ++ |
| pCMV3.1H/N-hECD5-TM-8CpG | 5 | 60％ | - |
| pCMV3.1H/N-hECD6-TM-8CpG | 5 | 0％ | - |
| pCMV3.1H/N-hECD7-TM-8CpG | 5 | 0％ | - |
| pCMV3.1H/N-r1°cys-h2°cys.-TM-8CpG | 5 | 100％ | +++ |
合成并用于质粒构建的寡核苷酸列表
#1.AccIII-TAA-4CpG-erbB2有义71nt
5’CCGGAAGTAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAT3’
#2.XbaI-TAA-4CpG-erbB2反义71nt
5’CTAGATTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTACTT3’
#3.AccIII-TAA-4noCpG-erbB2有义71nt
5’CCGGAAGTAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAT3’
#4.XbaI-TAA-4noCpG-erbB2反义71nt
5’CTAGATTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTACTT3’
#5.HindIII-NheI有义27nt
5’CTAGGAAGCTTGTTTAACTTGCTAGCT3’
#6.HindIII-NheI反义27nt
5’AGCTAGCTAGCAAGTTAAACAAGCTTC3’
#7.XbaI-4CpG-neu有义68nt
5’CTAGATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAATAATCGACGTTCAAGTTT3’
#8.PmeI-CpG-neu反义64nt
5’AAACTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTATTTGAACGTCGATTAT3’
#9.XbaI-4noCpG-neu有义68nt
5’CTAGATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAATAATAGAGCTTCAAGTTT3’
#10.PmeI-4noCpG-neu反义64nt
5’AAACTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTATTTGAAGCTCTATTAT3’
#11.T7引物
5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’
#12.BstEII-neuleader反义32nt
5’GGCCGGTTACCCGCGATTCCGGGGGGCAGGAG3’
#13.hECD1-TM-有义-NheI 35nt
5’CCGGCTAGCTAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCC3’
#14.hECD2-TM-有义-NheI 35nt
5’CCGGCTAGCTAGCGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGA3’
#15.hECD3-TM-有义-NheI 35nt
5’CCGGCTAGCTAGCCTGCCCACTGACTGCTGCCATG3’
#16.hECD4-TM-有义-NheI 35nt
5’CCGGCTAGCTAGCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGC3’
#17.hECD5-TM-有义-NheI 35nt
5’CCGGCTAGCTAGCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCC3’
#18.hECD6-TM-有义-NheI 35nt
5’CCGGCTAGCTAGCAACACCCACCTCTGCTTCGTGC3’
#19.hECD7-TM-有义-NheI 35nt
CCGGCTAGCTAGCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCA3’
#20.pcDNA3.1/BGH反向引物20nt
5’TAGAAGGCACAGTCGAGGCT3’
#21.NheI-neuleader-反义43nt
5’CCGGCTAGCTAGCCGCGATTCCGGGGGGCAGGAGGGCGAGGAG3’
#22.His-myc-有义-noNheI 69nt
5’CTAGGCATCATCATCATCATCATAATGGTCATACCGGTGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGG3’
#23.His-myc-反义-NheI 69nt
5’CTAGCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCACCGGTATGACCATTATGATGATGATGATGATGC3’
#24.NheI-73neu反义35nt
5’CCGGCTAGCTAGCGCTGGCATTGGCAGGCACGTAG3’
#25.NheI-153neu反义35nt
5’CCGGCTAGCTAGCCAGGATCTCTGTGAGACTTCGA3’
#26.NheI-233neu反义35nt
5’CCGGCTAGCTAGCGCCCTTGCACCGGGCACAACCA3’
#27.NheI-313neu反义35nt
5’CCGGCTAGCTAGCTCCCACTTCCGTAGACAGGTAG3’
#28.NheI-393neu反义35nt
5’CCGGCTAGCTAGCAATGCCGGAGGAGGGGTCCCCA3’
序列表
<110>因德纳有限公司
<120>编码p185neu的DNA及其治疗用途
<130>7118M
<160>42
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>922
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>1
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg ttacctatac atctcagcat ggccggacag 120
cctgcctgac ctcagcgtct tccagaacct gcaagtaatc cggggacgaa ttctgcacaa 180
tggcgcctac tcgctgaccc tgcaagggct gggcatcagc tggctggggc tgcgctcact 240
gagggaactg ggcagtggac tggccctcat ccaccataac acccacctct gcttcgtgca 300
cacggtgccc tgggaccagc tctttcggaa cccgcaccaa gctctgctcc acactgccaa 360
ccggccagag gacgagtgtg tgggcgaggg cctggcctgc caccagctgt gcgcccgagg 420
gcactgctgg ggtccagggc ccacccagtg tgtcaactgc agccagttcc ttcggggcca 480
ggagtgcgtg gaggaatgcc gagtactgca ggggctcccc agggagtatg tgaatgccag 540
gcactgtttg ccgtgccacc ctgagtgtca gccccagaat ggctcagtga cctgttttgg 600
accggaggct gaccagtgtg tggcctgtgc ccactataag gaccctccct tctgcgtggc 660
ccgctgcccc agcggtgtga aacctgacct ctcctacatg cccatctgga agtttccaga 720
tgaggagggc gcatgccagc cttgccccat caactgcacc cactcctgtg tggacctgga 780
tgacaagggc tgccccgccg agcagagagc cagccctctg acgtccatcg tctctgcggt 840
ggttggcatt ctgctggtcg tggtcttggg ggtggtcttt gggatcctca tcaagcgacg 900
gcagcagaag atccggaagt aa 922
<210>2
<211>2083
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>2
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg cacccaagtg tgtaccggca cagacatgaa 120
gttgcggctc cctgccagtc ctgagaccca cctggacatg ctccgccacc tgtaccaggg 180
ctgtcaggta gtgcagggca acttggagct tacctacgtg cctgccaatg ccagcctctc 240
attcctgcag gacatccagg aagttcaggg ttacatgctc atcgctcaca accaggtgaa 300
gcgcgtccca ctgcaaaggc tgcgcatcgt gagagggacc cagctctttg aggacaagta 360
tgccctggct gtgctagaca accgagatcc tcaggacaat gtcgccgcct ccaccccagg 420
cagaacccca gaggggctgc gggagctgca gcttcgaagt ctcacagaga tcctgaaggg 480
aggagttttg atccgtggga accctcagct ctgctaccag gacatggttt tgtggaagga 540
cgtcttccgc aagaataacc aactggctcc tgtcgatata gacaccaatc gttcccgggc 600
ctgtccacct tgtgcccccg cctgcaaaga caatcactgt tggggtgaga gtccggaaga 660
ctgtcagatc ttgactggca ccatctgtac cagtggttgt gcccggtgca agggccggct 720
gcccactgac tgctgccatg agcagtgtgc cgcaggctgc acgggcccca agcattctga 780
ctgcctggcc tgcctccact tcaatcatag tggtatctgt gagctgcact gcccagccct 840
cgtcacctac aacacagaca cctttgagtc catgcacaac cctgagggtc gctacacctt 900
tggtgccagc tgcgtgacca cctgccccta caactacctg tctacggaag tgggatcctg 960
cactctggtg tgtcccccga ataaccaaga ggtcacagct gaggacggaa cacagcgttg 1020
tgagaaatgc agcaagccct gtgctcgagt gtgctatggt ctgggcatgg agcaccttcg 1080
aggggcgagg gccatcacca gtgacaatgt ccaggagttt gatggctgca agaagatctt 1140
tgggagcctg gcatttttgc cggagagctt tgatggggac ccctcctccg gcattgctcc 1200
gctgaggcct gagcagctcc aagtgttcga aaccctggag gagatcacag gttacctata 1260
catctcagca tggccggaca gcctgcctga cctcagcgtc ttccagaacc tgcaagtaat 1320
ccggggacga attctgcaca atggcgccta ctcgctgacc ctgcaagggc tgggcatcag 1380
ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact gggcagtgga ctggccctca tccaccataa 1440
cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc ctgggaccag ctctttcgga acccgcacca 1500
agctctgctc cacactgcca accggccaga ggacgagtgt gtgggcgagg gcctggcctg 1560
ccaccagctg tgcgcccgag ggcactgctg gggtccaggg cccacccagt gtgtcaactg 1620
cagccagttc cttcggggcc aggagtgcgt ggaggaatgc cgagtactgc aggggctccc 1680
cagggagtat gtgaatgcca ggcactgttt gccgtgccac cctgagtgtc agccccagaa 1740
tggctcagtg acctgttttg gaccggaggc tgaccagtgt gtggcctgtg cccactataa 1800
ggaccctccc ttctgcgtgg cccgctgccc cagcggtgtg aaacctgacc tctcctacat 1860
gcccatctgg aagtttccag atgaggaggg cgcatgccag ccttgcccca tcaactgcac 1920
ccactcctgt gtggacctgg atgacaaggg ctgccccgcc gagcagagag ccagccctct 1980
gacgtccatc gtctctgcgg tggttggcat tctgctggtc gtggtcttgg gggtggtctt 2040
tgggatcctc atcaagcgac ggcagcagaa gatccggaag taa 2083
<210>3
<211>1939
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>3
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggc tagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga 120
ggtgcagggc tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct 180
gcggattgtg cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa 240
tggagacccg ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga 300
gctgcagctt cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc 360
ccagctctgc taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct 420
ggctctcaca ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg 480
taagggctcc cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt 540
ctgtgccggt ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca 600
gtgtgctgcc ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa 660
ccacagtggc atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt 720
tgagtccatg cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg 780
tccctacaac tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa 840
ccaagaggtg acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc 900
ccgagtgtgc tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc 960
caatatccag gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga 1020
gagctttgat ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt 1080
gtttgagact ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct 1140
gcctgacctc agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg 1200
cgcctactcg ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag 1260
ggaactgggc agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac 1320
ggtgccctgg gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg 1380
gccagaggac gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca 1440
ctgctggggt ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga 1500
gtgcgtggag gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca 1560
ctgtttgccg tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc 1620
ggaggctgac cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg 1680
ctgccccagc ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga 1740
ggagggcgca tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga 1800
caagggctgc cccgccgagc agagagccag ccctctgacg tccatcgtct ctgcggtggt 1860
tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttggg atcctcatca agcgacggca 1920
gcagaagatc cggaagtaa 1939
<210>4
<211>1699
<2t2>DNA
<213>人/大鼠
<400>4
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggc tagcggaggg gtcttgatcc agcggaaccc 120
ccagctctgc taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct 180
ggctctcaca ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg 240
taagggctcc cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt 300
ctgtgccggt ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca 360
gtgtgctgcc ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa 420
ccacagtggc atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt 480
tgagtccatg cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg 540
tccctacaac tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa 600
ccaagaggtg acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc 660
ccgagtgtgc tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc 720
caatatccag gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga 780
gagctttgat ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt 840
gtttgagact ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct 900
gcctgacctc agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg 960
cgcctactcg ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag 1020
ggaactgggc agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac 1080
ggtgccctgg gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg 1140
gccagaggac gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca 1200
ctgctggggt ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga 1260
gtgcgtggag gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca 1320
ctgtttgccg tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc 1380
ggaggctgac cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg 1440
ctgccccagc ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga 1500
ggagggcgca tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga 1560
caagggctgc cccgccgagc agagagccag ccctctgacg tccatcgtct ctgcggtggt 1620
tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttggg atcctcatca agcgacggca 1680
gcagaagatc cggaagtaa 1699
<210>5
<211>1459
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>5
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggc tagcctgccc actgactgct gccatgagca 120
gtgtgctgcc ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa 180
ccacagtggc atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt 240
tgagtccatg cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg 300
tccctacaac tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa 360
ccaagaggtg acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc 420
ccgagtgtgc tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc 480
caatatccag gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga 540
gagctttgat ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt 600
gtttgagact ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct 660
gcctgacctc agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg 720
cgcctactcg ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag 780
ggaactgggc agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac 840
ggtgccctgg gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg 900
gccagaggac gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca 960
ctgctggggt ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga 1020
gtgcgtggag gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca 1080
ctgtttgccg tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc 1140
ggaggctgac cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg 1200
ctgccccagc ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga 1260
ggagggcgca tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga 1320
caagggctgc cccgccgagc agagagccag ccctctgacg tccatcgtct ctgcggtggt 1380
tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttggg atcctcatca agcgacggca 1440
gcagaagatc cggaagtaa 1459
<210>6
<211>1219
<2t2>DNA
<213>人/大鼠
<400>6
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggc tagctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa 120
ccaagaggtg acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc 180
ccgagtgtgc tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc 240
caatatccag gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga 300
gagctttgat ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt 360
gtttgagact ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct 420
gcctgacctc agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg 480
cgcctactcg ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag 540
ggaactgggc agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac 600
ggtgccctgg gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg 660
gccagaggac gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca 720
ctgctggggt ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga 780
gtgcgtggag gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca 840
ctgtttgccg tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc 900
ggaggctgac cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg 960
ctgccccagc ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga 1020
ggagggcgca tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga 1080
caagggctgc cccgccgagc agagagccag ccctctgacg tccatcgtct ctgcggtggt 1140
tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttggg atcctcatca agcgacggca 1200
gcagaagatc cggaagtaa 1219
<210>7
<211>979
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>7
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggc tagcccgctc cagccagagc agctccaagt 120
gtttgagact ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct 180
gcctgacctc agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg 240
cgcctactcg ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag 300
ggaactgggc agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac 360
ggtgccctgg gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg 420
gccagaggac gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca 480
ctgctggggt ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga 540
gtgcgtggag gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca 600
ctgtttgccg tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc 660
ggaggctgac cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg 720
ctgccccagc ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga 780
ggagggcgca tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga 840
caagggctgc cccgccgagc agagagccag ccctctgacg tccatcgtct ctgcggtggt 900
tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttggg atcctcatca agcgacggca 960
gcagaagatc cggaagtaa 979
<210>8
<211>739
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>8
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggc tagcaacacc cacctctgct tcgtgcacac 120
ggtgccctgg gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg 180
gccagaggac gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca 240
ctgctggggt ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga 300
gtgcgtggag gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca 360
ctgtttgccg tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc 420
ggaggctgac cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg 480
ctgccccagc ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga 540
ggagggcgca tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga 600
caagggctgc cccgccgagc agagagccag ccctctgacg tccatcgtct ctgcggtggt 660
tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttggg atcctcatca agcgacggca 720
gcagaagatc cggaagtaa 739
<210>9
<211>499
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>9
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggc tagccccagg gagtatgtga atgccaggca 120
ctgtttgccg tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc 180
ggaggctgac cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg 240
ctgccccagc ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga 300
ggagggcgca tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga 360
caagggctgc cccgccgagc agagagccag ccctctgacg tccatcgtct ctgcggtggt 420
tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttgggatcctcatca agcgacggca 480
gcagaagatc cggaagtaa 499
<210>10
<211>2086
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>10
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg cacccaagtg tgtaccggca cagacatgaa 120
gttgcggctc cctgccagtc ctgagaccca cctggacatg ctccgccacc tgtaccaggg 180
ctgtcaggta gtgcagggca acttggagct tacctacgtg cctgccaatg ccagcgctag 240
cctgtccttc ctgcaggata tccaggaggt gcagggctac gtgctcatcg ctcacaacca 300
agtgaggcag gtcccactgc agaggctgcg gattgtgcga ggcacccagc tctttgagga 360
caactatgcc ctggccgtgc tagacaatgg agacccgctg aacaatacca cccctgtcac 420
aggggcctcc ccaggaggcc tgcgggagct gcagcttcga agcctcacag agatcttgaa 480
aggaggggtc ttgatccagc ggaaccccca gctctgctac caggacacga ttttgtggaa 540
ggacatcttc cacaagaaca accagctggc tctcacactg atagacacca accgctctcg 600
ggcctgccac ccctgttctc cgatgtgtaa gggctcccgc tgctggggag agagttctga 660
ggattgtcag agcctgacgc gcactgtctg tgccggtggc tgtgcccgct gcaaggggcc 720
actgcccact gactgctgcc atgagcagtg tgctgccggc tgcacgggcc ccaagcactc 780
tgactgcctg gcctgcctcc acttcaacca cagtggcatc tgtgagctgc actgcccagc 840
cctggtcacc tacaacacag acacgtttga gtccatgccc aatcccgagg gccggtatac 900
attcggcgcc agctgtgtga ctgcctgtcc ctacaactac ctttctacgg acgtgggatc 960
ctgcaccctc gtctgccccc tgcacaacca agaggtgaca gcagaggatg gaacacagcg 1020
gtgtgagaag tgcagcaagc cctgtgcccg agtgtgctat ggtctgggca tggagcactt 1080
gcgagaggtg agggcagtta ccagtgccaa tatccaggag tttgctggct gcaagaagat 1140
ctttgggagc ctggcatttc tgccggagag ctttgatggg gacccagcct ccaacactgc 1200
cccgctccag ccagagcagc tccaagtgtt tgagactctg gaagagatca caggttacct 1260
atacatctca gcatggccgg acagcctgcc tgacctcagc gtcttccaga acctgcaagt 1320
aatccgggga cgaattctgc acaatggcgc ctactcgctg accctgcaag ggctgggcat 1380
cagctggctg gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc tcatccacca 1440
taacacccac ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctttc ggaacccgca 1500
ccaagctctg ctccacactg ccaaccggcc agaggacgag tgtgtgggcg agggcctggc 1560
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcactg ctggggtcca gggcccaccc agtgtgtcaa 1620
ctgcagccag ttccttcggg gccaggagtg cgtggaggaa tgccgagtac tgcaggggct 1680
ccccagggag tatgtgaatg ccaggcactg tttgccgtgc caccctgagt gtcagcccca 1740
gaatggctca gtgacctgtt ttggaccgga ggctgaccag tgtgtggcct gtgcccacta 1800
taaggaccct cccttctgcg tggcccgctg ccccagcggt gtgaaacctg acctctccta 1860
catgcccatc tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc cagccttgcc ccatcaactg 1920
cacccactcc tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc gccgagcaga gagccagccc 1980
tctgacgtcc atcgtctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt 2040
ctttgggatc ctcatcaagc gacggcagca gaagatccgg aagtaa 2086
<210>11
<211>2086
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>11
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg cacccaagtg tgtaccggca cagacatgaa 120
gttgcggctc cctgccagtc ctgagaccca cctggacatg ctccgccacc tgtaccaggg 180
ctgtcaggta gtgcagggca acttggagct tacctacgtg cctgccaatg ccagcctctc 240
attcctgcag gacatccagg aagttcaggg ttacatgctc atcgctcaca accaggtgaa 300
gcgcgtccca ctgcaaaggc tgcgcatcgt gagagggacc cagctctttg aggacaagta 360
tgccctggct gtgctagaca accgagatcc tcaggacaat gtcgccgcct ccaccccagg 420
cagaacccca gaggggctgc gggagctgca gcttcgaagt ctcacagaga tcctggctag 480
cggaggggtc ttgatccagc ggaaccccca gctctgctac caggacacga ttttgtggaa 540
ggacatcttc cacaagaaca accagctggc tctcacactg atagacacca accgctctcg 600
ggcctgccac ccctgttctc cgatgtgtaa gggctcccgc tgctggggag agagttctga 660
ggattgtcag agcctgacgc gcactgtctg tgccggtggc tgtgcccgct gcaaggggcc 720
actgcccact gactgctgcc atgagcagtg tgctgccggc tgcacgggcc ccaagcactc 780
tgactgcctg gcctgcctcc acttcaacca cagtggcatc tgtgagctgc actgcccagc 840
cctggtcacc tacaacacag acacgtttga gtccatgccc aatcccgagg gccggtatac 900
attcggcgcc agctgtgtga ctgcctgtcc ctacaactac ctttctacgg acgtgggatc 960
ctgcaccctc gtctgccccc tgcacaacca agaggtgaca gcagaggatg gaacacagcg 1020
gtgtgagaag tgcagcaagc cctgtgcccg agtgtgctat ggtctgggca tggagcactt 1080
gcgagaggtg agggcagtta ccagtgccaa tatccaggag tttgctggct gcaagaagat 1140
ctttgggagc ctggcatttc tgccggagag ctttgatggg gacccagcct ccaacactgc 1200
cccgctccag ccagagcagc tccaagtgtt tgagactctg gaagagatca caggttacct 1260
atacatctca gcatggccgg acagcctgcc tgacctcagc gtcttccaga acctgcaagt 1320
aatccgggga cgaattctgc acaatggcgc ctactcgctg accctgcaag ggctgggcat 1380
cagctggctg gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc tcatccacca 1440
taacacccac ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctttc ggaacccgca 1500
ccaagctctg ctccacactg ccaaccggcc agaggacgag tgtgtgggcg agggcctggc 1560
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcactg ctggggtcca gggcccaccc agtgtgtcaa 1620
ctgcagccag ttccttcggg gccaggagtg cgtggaggaa tgccgagtac tgcaggggct 1680
ccccagggag tatgtgaatg ccaggcactg tttgccgtgc caccctgagt gtcagcccca 1740
gaatggctca gtgacctgtt ttggaccgga ggctgaccag tgtgtggcct gtgcccacta 1800
taaggaccct cccttctgcg tggcccgctg ccccagcggt gtgaaacctg acctctccta 1860
catgcccatc tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc cagccttgcc ccatcaactg 1920
cacccactcc tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc gccgagcaga gagccagccc 1980
tctgacgtcc atcgtctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt 2040
ctttgggatc ctcatcaagc gacggcagca gaagatccgg aagtaa 2086
<210>12
<211>2086
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>12
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg cacccaagtg tgtaccggca cagacatgaa 120
gttgcggctc cctgccagtc ctgagaccca cctggacatg ctccgccacc tgtaccaggg 180
ctgtcaggta gtgcagggca acttggagct tacctacgtg cctgccaatg ccagcctctc 240
attcctgcag gacatccagg aagttcaggg ttacatgctc atcgctcaca accaggtgaa 300
gcgcgtccca ctgcaaaggc tgcgcatcgt gagagggacc cagctctttg aggacaagta 360
tgccctggct gtgctagaca accgagatcc tcaggacaat gtcgccgcct ccaccccagg 420
cagaacccca gaggggctgc gggagctgca gcttcgaagt ctcacagaga tcctgaaggg 480
aggagttttg atccgtggga accctcagct ctgctaccag gacatggttt tgtggaagga 540
cgtcttccgc aagaataacc aactggctcc tgtcgatata gacaccaatc gttcccgggc 600
ctgtccacct tgtgcccccg cctgcaaaga caatcactgt tggggtgaga gtccggaaga 660
ctgtcagatc ttgactggca ccatctgtac cagtggttgt gcccggtgca agggcgctag 720
cctgcccact gactgctgcc atgagcagtg tgctgccggc tgcacgggcc ccaagcactc 780
tgactgcctg gcctgcctcc acttcaacca cagtggcatc tgtgagctgc actgcccagc 840
cctggtcacc tacaacacag acacgtttga gtccatgccc aatcccgagg gccggtatac 900
attcggcgcc agctgtgtga ctgcctgtcc ctacaactac ctttctacgg acgtgggatc 960
ctgcaccctc gtctgccccc tgcacaacca agaggtgaca gcagaggatg gaacacagcg 1020
gtgtgagaag tgcagcaagc cctgtgcccg agtgtgctat ggtctgggca tggagcactt 1080
gcgagaggtg agggcagtta ccagtgccaa tatccaggag tttgctggct gcaagaagat 1140
ctttgggagc ctggcatttc tgccggagag ctttgatggg gacccagcct ccaacactgc 1200
cccgctccag ccagagcagc tccaagtgtt tgagactctg gaagagatca caggttacct 1260
atacatctca gcatggccgg acagcctgcc tgacctcagc gtcttccaga acctgcaagt 1320
aatccgggga cgaattctgc acaatggcgc ctactcgctg accctgcaag ggctgggcat 1380
cagctggctg gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc tcatccacca 1440
taacacccac ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctttc ggaacccgca 1500
ccaagctctg ctccacactg ccaaccggcc agaggacgag tgtgtgggcg agggcctggc 1560
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcactg ctggggtcca gggcccaccc agtgtgtcaa 1620
ctgcagccag ttccttcggg gccaggagtg cgtggaggaa tgccgagtac tgcaggggct 1680
ccccagggag tatgtgaatg ccaggcactg tttgccgtgc caccctgagt gtcagcccca 1740
gaatggctca gtgacctgtt ttggaccgga ggctgaccag tgtgtggcct gtgcccacta 1800
taaggaccct cccttctgcg tggcccgctg ccccagcggt gtgaaacctg acctctccta 1860
catgcccatc tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc cagccttgcc ccatcaactg 1920
cacccactcc tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc gccgagcaga gagccagccc 1980
tctgacgtcc atcgtctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt 2040
ctttgggatc ctcatcaagc gacggcagca gaagatccgg aagtaa 2086
<210>13
<211>2086
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>13
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg cacccaagtg tgtaccggca cagacatgaa 120
gttgcggctc cctgccagtc ctgagaccca cctggacatg ctccgccacc tgtaccaggg 180
ctgtcaggta gtgcagggca acttggagct tacctacgtg cctgccaatg ccagcctctc 240
attcctgcag gacatccagg aagttcaggg ttacatgctc atcgctcaca accaggtgaa 300
gcgcgtccca ctgcaaaggc tgcgcatcgt gagagggacc cagctctttg aggacaagta 360
tgccctggct gtgctagaca accgagatcc tcaggacaat gtcgccgcct ccaccccagg 420
cagaacccca gaggggctgc gggagctgca gcttcgaagt ctcacagaga tcctgaaggg 480
aggagttttg atccgtggga accctcagct ctgctaccag gacatggttt tgtggaagga 540
cgtcttccgc aagaataacc aactggctcc tgtcgatata gacaccaatc gttcccgggc 600
ctgtccacct tgtgcccccg cctgcaaaga caatcactgt tggggtgaga gtccggaaga 660
ctgtcagatc ttgactggca ccatctgtac cagtggttgt gcccggtgca agggccggct 720
gcccactgac tgctgccatg agcagtgtgc cgcaggctgc acgggcccca agcattctga 780
ctgcctggcc tgcctccact tcaatcatag tggtatctgt gagctgcact gcccagccct 840
cgtcacctac aacacagaca cctttgagtc catgcacaac cctgagggtc gctacacctt 900
tggtgccagc tgcgtgacca cctgccccta caactacctg tctacggaag tgggagctag 960
ctgcaccctc gtctgccccc tgcacaacca agaggtgaca gcagaggatg gaacacagcg 1020
gtgtgagaag tgcagcaagc cctgtgcccg agtgtgctat ggtctgggca tggagcactt 1080
gcgagaggtg agggcagtta ccagtgccaa tatccaggag tttgctggct gcaagaagat 1140
ctttgggagc ctggcatttc tgccggagag ctttgatggg gacccagcct ccaacactgc 1200
cccgctccag ccagagcagc tccaagtgtt tgagactctg gaagagatca caggttacct 1260
atacatctca gcatggccgg acagcctgcc tgacctcagc gtcttccaga acctgcaagt 1320
aatccgggga cgaattctgc acaatggcgc ctactcgctg accctgcaag ggctgggcat 1380
cagctggctg gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc tcatccacca 1440
taacacccac ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctttc ggaacccgca 1500
ccaagctctg ctccacactg ccaaccggcc agaggacgag tgtgtgggcg agggcctggc 1560
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcactg ctggggtcca gggcccaccc agtgtgtcaa 1620
ctgcagccag ttccttcggg gccaggagtg cgtggaggaa tgccgagtac tgcaggggct 1680
ccccagggag tatgtgaatg ccaggcactg tttgccgtgc caccctgagt gtcagcccca 1740
gaatggctca gtgacctgtt ttggaccgga ggctgaccag tgtgtggcct gtgcccacta 1800
taaggaccct cccttctgcg tggcccgctg ccccagcggt gtgaaacctg acctctccta 1860
catgcccatc tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc cagccttgcc ccatcaactg 1920
cacccactcc tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc gccgagcaga gagccagccc 1980
tctgacgtcc atcgtctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt 2040
ctttgggatc ctcatcaagc gacggcagca gaagatccgg aagtaa 2086
<210>14
<211>2086
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>14
ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60
cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcggg cacccaagtg tgtaccggca cagacatgaa 120
gttgcggctc cctgccagtc ctgagaccca cctggacatg ctccgccacc tgtaccaggg 180
ctgtcaggta gtgcagggca acttggagct tacctacgtg cctgccaatg ccagcctctc 240
attcctgcag gacatccagg aagttcaggg ttacatgctc atcgctcaca accaggtgaa 300
gcgcgtccca ctgcaaaggc tgcgcatcgt gagagggacc cagctctttg aggacaagta 360
tgccctggct gtgctagaca accgagatcc tcaggacaat gtcgccgcct ccaccccagg 420
cagaacccca gaggggctgc gggagctgca gcttcgaagt ctcacagaga tcctgaaggg 480
aggagttttg atccgtggga accctcagct ctgctaccag gacatggttt tgtggaagga 540
cgtcttccgc aagaataacc aactggctcc tgtcgatata gacaccaatc gttcccgggc 600
ctgtccacct tgtgcccccg cctgcaaaga caatcactgt tggggtgaga gtccggaaga 660
ctgtcagatc ttgactggca ccatctgtac cagtggttgt gcccggtgca agggccggct 720
gcccactgac tgctgccatg agcagtgtgc cgcaggctgc acgggcccca agcattctga 780
ctgcctggcc tgcctccact tcaatcatag tggtatctgt gagctgcact gcccagccct 840
cgtcacctac aacacagaca cctttgagtc catgcacaac cctgagggtc gctacacctt 900
tggtgccagc tgcgtgacca cctgccccta caactacctg tctacggaag tgggatcctg 960
cactctggtg tgtcccccga ataaccaaga ggtcacagct gaggacggaa cacagcgttg 1020
tgagaaatgc agcaagccct gtgctcgagt gtgctatggt ctgggcatgg agcaccttcg 1080
aggggcgagg gccatcacca gtgacaatgt ccaggagttt gatggctgca agaagatctt 1140
tgggagcctg gcatttttgc cggagagctt tgatggggac ccctcctccg gcattgctag 1200
cccgctccag ccagagcagc tccaagtgtt tgagactctg gaagagatca caggttacct 1260
atacatctca gcatggccgg acagcctgcc tgacctcagc gtcttccaga acctgcaagt 1320
aatccgggga cgaattctgc acaatggcgc ctactcgctg accctgcaag ggctgggcat 1380
cagctggctg gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc tcatccacca 1440
taacacccac ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctttc ggaacccgca 1500
ccaagctctg ctccacactg ccaaccggcc agaggacgag tgtgtgggcg agggcctggc 1560
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcactg ctggggtcca gggcccaccc agtgtgtcaa 1620
ctgcagccag ttccttcggg gccaggagtg cgtggaggaa tgccgagtac tgcaggggct 1680
ccccagggag tatgtgaatg ccaggcactg tttgccgtgc caccctgagt gtcagcccca 1740
gaatggctca gtgacctgtt ttggaccgga ggctgaccag tgtgtggcct gtgcccacta 1800
taaggaccct cccttctgcg tggcccgctg ccccagcggt gtgaaacctg acctctccta 1860
catgcccatc tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc cagccttgcc ccatcaactg 1920
cacccactcc tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc gccgagcaga gagccagccc 1980
tctgacgtcc atcgtctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt 2040
ctttgggatc ctcatcaagc gacggcagca gaagatccgg aagtaa 2086
<210>15
<211>71
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>15
ccggaagtaa ataatcgacg ttcaaataat cgacgttcaa ataatcgacg ttcaaataat 60
cgacgttcaa t 71
<210>16
<211>71
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>16
ctagattgaa cgtcgattat ttgaacgtcg attatttgaa cgtcgattat ttgaacgtcg 60
attatttact t 71
<210>17
<211>71
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>17
ccggaagtaa ataatagagc ttcaaataat agagcttcaa ataatagagc ttcaaataat 60
agagcttcaa t 71
<210>18
<211>71
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>18
ctagattgaa gctctattat ttgaagctct attatttgaa gctctattat ttgaagctct 60
attatttact t 71
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>19
ctaggaagct tgtttaactt gctagct 27
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>20
agctagctag caagttaaac aagcttc 27
<210>21
<211>68
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>21
ctagataatc gacgttcaaa taatcgacgt tcaaataatc gacgttcaaa taatcgacgt 60
tcaagttt 68
<210>22
<211>64
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>22
aaacttgaac gtcgattatt tgaacgtcga ttatttgaac gtcgattatt tgaacgtcga 60
ttat 64
<210>23
<211>68
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>23
ctagataata gagcttcaaa taatagagct tcaaataata gagcttcaaa taatagagct 60
tcaagttt 68
<210>24
<211>64
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>24
aaacttgaag ctctattatt tgaagctcta ttatttgaag ctctattatt tgaagctcta 60
ttat 64
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>25
taatacgact cactataggg 20
<210>26
<211>32
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>26
ggccggttac ccgcgattcc ggggggcagg ag 32
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>27
ccggctagct agcctgtcct tcctgcagga tatcc 35
<210>28
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>28
ccggctagct agcggagggg tcttgatcca gcgga 35
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>29
ccggctagct agcctgccca ctgactgctg ccatg 35
<210>30
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>30
ccggctagct agctgcaccc tcgtctgccc cctgc 35
<210>31
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>31
ccggctagct agcccgctcc agccagagca gctcc 35
<210>32
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>32
ccggctagct agcaacaccc acctctgctt cgtgc 35
<210>33
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>33
ccggctagct agccccaggg agtatgtgaa tgcca 35
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>34
tagaaggcac agtcgaggct 20
<210>35
<211>43
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>35
ccggctagct agccgcgatt ccggggggca ggagggcgag gag 43
<210>36
<211>69
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>36
ctaggcatca tcatcatcat cataatggtc ataccggtga acaaaaactc atctcagaag 60
aggatctgg 69
<210>37
<211>69
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>37
ctagccagat cctcttctga gatgagtttt tgttcaccgg tatgaccatt atgatgatga 60
tgatgatgc 69
<210>38
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>38
ccggctagct agcgctggca ttggcaggca cgtag 35
<210>39
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>39
ccggctagct agccaggatc tctgtgagac ttcga 35
<210>40
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>40
ccggctagct agcgcccttg caccgggcac aacca 35
<210>41
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>41
ccggctagct agctcccgct tccgtagaca ggtag 35
<210>42
<211>35
<212>DNA
<213>人/大鼠
<400>42
ccggctagct agcaatgccg gaggaggggt cccca 35
Claims (13)
1.含有编码p185neu片段的序列的DNA转移载体，其中所述序列选自SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14。
2.根据权利要求1的DNA转移载体，其是质粒。
3.权利要求2的质粒，其还含有转录启动子。
4.权利要求3的质粒，其中所述启动子是CMV。
5.权利要求2的质粒，其还含有4个CpG基序。
6.权利要求5的质粒，其还含有8个CpG基序。
7.药物组合物，其含有根据权利要求1-6任一项的DNA转移载体与可药用载体和赋形剂的混合物。
8.根据权利要求7的组合物，其适于肠胃外施用。
9.权利要求8的组合物，其是可注射溶液剂的形式。
10.含有根据权利要求1-6的至少两种不同质粒的组合药物制剂，其用于同时、顺序或者单独的治疗用途。
11.根据权利要求10的组合制剂，其是适于DNA接种的形式。
12.根据权利要求1-6的质粒用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防性或治疗性治疗处于患p185neu阳性肿瘤危险中的个体，或者患有表达p185neu的肿瘤的原发肿瘤、转移或复发的患者。
13.根据权利要求12的用途，用于制备DNA疫苗。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI2003A001942 | 2003-10-09 | ||
| IT001942A ITMI20031942A1 (it) | 2003-10-09 | 2003-10-09 | Dna codificante p185^neu e suoi usi terapeutici |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1863547A true CN1863547A (zh) | 2006-11-15 |
| CN100546647C CN100546647C (zh) | 2009-10-07 |
Family
ID=34509441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004800293153A Expired - Fee Related CN100546647C (zh) | 2003-10-09 | 2004-10-06 | 编码p185neu的DNA及其治疗用途 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7795016B2 (zh) |
| EP (1) | EP1670498B9 (zh) |
| JP (1) | JP4829114B2 (zh) |
| KR (2) | KR101215768B1 (zh) |
| CN (1) | CN100546647C (zh) |
| AU (1) | AU2004283430B2 (zh) |
| CA (1) | CA2541840C (zh) |
| DK (1) | DK1670498T3 (zh) |
| ES (1) | ES2402767T3 (zh) |
| HK (1) | HK1094531A1 (zh) |
| IL (1) | IL174821A (zh) |
| IT (1) | ITMI20031942A1 (zh) |
| NO (1) | NO340097B1 (zh) |
| NZ (1) | NZ546411A (zh) |
| PL (1) | PL1670498T3 (zh) |
| PT (1) | PT1670498E (zh) |
| RU (1) | RU2350652C2 (zh) |
| SG (1) | SG146693A1 (zh) |
| SI (1) | SI1670498T1 (zh) |
| WO (1) | WO2005039618A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116042649A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-05-02 | 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所） | 一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI20031942A1 (it) * | 2003-10-09 | 2005-04-10 | Indena Spa | Dna codificante p185^neu e suoi usi terapeutici |
| ITMI20041965A1 (it) * | 2004-10-15 | 2005-01-15 | Augusto Amici | "dna codificante forme tronche e chimeriche della proteina p185neu e suoi usi terapeutici" |
| US20160038577A1 (en) * | 2014-08-06 | 2016-02-11 | Indena S.p.A. Con Socio Unico | Use of anti-erbb2 vaccines in association with an electric field |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6239116B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| KR100555211B1 (ko) | 2002-07-16 | 2006-03-03 | 주식회사 팬제노믹스 | 항암효과를 갖는 Ｈｅｒ-２/ｎｅｕ ＤＮＡ 백신 |
| ITMI20031942A1 (it) * | 2003-10-09 | 2005-04-10 | Indena Spa | Dna codificante p185^neu e suoi usi terapeutici |
-
2003
- 2003-10-09 IT IT001942A patent/ITMI20031942A1/it unknown
-
2004
- 2004-10-06 SG SG200807355-3A patent/SG146693A1/en unknown
- 2004-10-06 WO PCT/EP2004/011161 patent/WO2005039618A1/en active Search and Examination
- 2004-10-06 KR KR1020117026603A patent/KR101215768B1/ko active IP Right Grant
- 2004-10-06 AU AU2004283430A patent/AU2004283430B2/en not_active Expired
- 2004-10-06 CN CNB2004800293153A patent/CN100546647C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-06 CA CA2541840A patent/CA2541840C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-06 EP EP04765853.9A patent/EP1670498B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-06 SI SI200432023T patent/SI1670498T1/sl unknown
- 2004-10-06 ES ES04765853T patent/ES2402767T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-06 JP JP2006530102A patent/JP4829114B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-06 KR KR1020067006581A patent/KR101226873B1/ko active IP Right Grant
- 2004-10-06 NZ NZ546411A patent/NZ546411A/en unknown
- 2004-10-06 PT PT47658539T patent/PT1670498E/pt unknown
- 2004-10-06 US US10/574,897 patent/US7795016B2/en active Active
- 2004-10-06 DK DK04765853.9T patent/DK1670498T3/da active
- 2004-10-06 PL PL04765853T patent/PL1670498T3/pl unknown
- 2004-10-06 RU RU2006111336/13A patent/RU2350652C2/ru active
-
2006
- 2006-04-05 NO NO20061542A patent/NO340097B1/no unknown
- 2006-04-06 IL IL174821A patent/IL174821A/en active IP Right Grant
-
2007
- 2007-02-08 HK HK07101473.7A patent/HK1094531A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-09-02 US US12/874,619 patent/US8298821B2/en active Active
-
2011
- 2011-05-17 US US13/109,359 patent/US8389494B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116042649A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-05-02 | 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所） | 一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用 |
| CN116042649B (zh) * | 2022-11-11 | 2023-07-21 | 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所） | 一种编码富含半胱氨酸的非分泌型小分子肽及其编码基因与应用 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1671423A (zh) | 新型嵌合cd154 | |
| CN1993463A (zh) | 促滤泡素抑制素突变多肽 | |
| CN1109260A (zh) | 转导醛脱氢酶-1基因的反转录病毒载体及其应用 | |
| CN1784424A (zh) | 编码人癌胚抗原的合成基因及其用途 | |
| CN1170931C (zh) | 血管发生相关分子 | |
| CN1863547A (zh) | 编码p185neu的DNA及其治疗用途 | |
| CN1778930A (zh) | 激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN1283793C (zh) | 具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族 | |
| CN1673368A (zh) | Hcv调节的蛋白表达 | |
| CN1286973C (zh) | 一种组蛋白甲基转移酶及其制备方法 | |
| CN1170850C (zh) | 人血管生成素样蛋白和编码序列及其用途 | |
| CN1827640A (zh) | 血管生成抑制多肽及其制备方法和应用 | |
| CN101065399A (zh) | 编码p185neu蛋白质序列变体的质粒及其治疗用途 | |
| CN1257187C (zh) | 钙网蛋白－肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途 | |
| CN1239713C (zh) | S140g突变型kcnq1蛋白及其在筛选离子通道抑制剂和促进剂中的应用 | |
| CN1966684A (zh) | 一种新的HER2/neu mRNA体外转录载体的构建及其用途 | |
| CN1303102C (zh) | 利用人和鼠Rhor基因及其编码产物诊断和治疗秃发的方法 | |
| CN1954882A (zh) | 长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治肝衰竭药物中的用途 | |
| CN1932016A (zh) | 影响sre活性的多核苷酸及其编码多肽和用途 | |
| CN1268738C (zh) | 细胞毒性t淋巴细胞 | |
| CN1304425C (zh) | 含可溶性肿瘤坏死因子II型受体和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN1281962C (zh) | 作为肝癌标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途 | |
| CN1274828C (zh) | 鼠源epor胞外区与人源nok胞内区嵌合受体及编码基因与应用 | |
| CN1920015A (zh) | 在毕赤酵母细胞器中表达的重组酪氨酸激酶及其基因、衍生融合蛋白和制备方法 | |
| CN1789424A (zh) | 双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1094531 Country of ref document: HK |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1094531 Country of ref document: HK |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20091007 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |