EA035625B1

EA035625B1 - Новые соединения и конъюгаты криптофицина, их получение и их терапевтическое применение

Info

Publication number: EA035625B1
Application number: EA201890898A
Authority: EA
Inventors: Антони Биго; Эрве Бушар; Мари-Присцилл Брэн; Франсуа Клер; Цзидун Чжан
Original assignee: Санофи
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2020-07-17
Also published as: PH12018500852A1; EP3371179B1; JP2018535255A; CN108349960B; CN108349960A; MX2018005379A; PH12018500852B1; IL259067A; HK1256754B; TWI714661B; SG11201803181SA; AU2016347724B2; WO2017076998A1; KR20180073678A; LT3371179T; CY1122441T1; AU2016347724A1; CA3003085A1; UY36979A; JP6929292B2

Abstract

Изобретение относится к соединениям криптофицина формулы (I)Изобретение также относится к полезным нагрузкам криптофицина, к конъюгатам криптофицина, к композициям, содержащим их, и к их терапевтическому применению, в частности, в качестве противоопухолевых средств. Изобретение также относится к способу получения данных конъюгатов.

Description

Изобретение относится к новым соединениям криптофицина, новым полезным нагрузкам криптофицина, новым конъюгатам криптофицина, композициям, содержащим их, и их терапевтическому применению, в частности, в качестве противоопухолевых средств. Изобретение также относится к способу получения данных конъюгатов.

Криптофицины представляют собой вторичные метаболиты, принадлежащие к классу депсипептидных макроциклов, продуцируемых цианобактериями рода Nostoc. Первый представитель данного класса молекул, криптофицин-1 (С-1), был выделен в 1990 г. из цианобактерии Nostoc sp (ATCC 53789; см. Εΐβ^Γ S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789). В начале 1990-х гг. было обнаружено, что криптофицины С-1 и С-52, которые характеризуются эпоксидной функцией, обладают противоопухолевой активностью in vitro и in vivo. Хлоргидрины данных C-8 и C-55 были значительно более активными, но не могли быть получены в виде стабильных растворов (Bionpally R.R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33). Их более высокая активность коррелировалась с их предполагаемой способностью генерировать соответствующие эпоксиды в клетках. При отсутствии в то время метода адекватной стабилизации хлоргидрина криптофицин C-52 (LY355703) вошел в клинические испытания, продуцировал минимально эффективную противоопухолевую активность в двух фазах II исследований рака легкого с 30-40% устойчивым заболеванием, и, таким образом, исследования были прекращены (Edelman M.J., et al., Lung Cancer 2003, 39, 197-99 и Sessa C., et al., Eur. J. Cancer 2002, 38, 2388-96).

R = H,C-1 C-55

R = Me, C-52

Учитывая их высокую эффективность и общий механизм действия с майтанзиноидами и ауристатинами, две цитотоксические молекулы, утвержденные в клинике для конъюгатов антителолекарственное средство (ADC), данную серию рассматривали как потенциальное тубулиновое связующее вещество для ADC. Поэтому конъюгаты в серии криптофицинов были разработаны, исходя из получения производных в пара-бензильном положении макроцикла (Al-Awar R.S., et al., J. Med. Chem 2003, 46, 2985-3007).

В WO 2011/001052 описаны конъюгаты криптофицина антитело-лекарственное средство, в которых цитотоксический фрагмент связан с антителом через пара-бензильное положение с использованием различных видов линкеров. Они могут быть расщепляемыми, дисульфидными, или протеазачувствительными, или нерасщепляемыми.

Дальнейшая оптимизация конъюгатов криптофицина антитело-лекарственное средство, описанных в WO 2011/001052, приводила к эффективным конъюгатам криптофицина, которые проявляли перспективную противоопухолевую активность, но являлись неустойчивыми в плазме мышей, в то время как были стабильными в плазме негрызунов. Следовательно, существовала потребность в конъюгатах криптофицина, обладающих улучшенными свойствами стабильности.

Целью данного изобретения является предложение новых макроциклов криптофицина, которые после конъюгирования с антителом являются стабильными в плазме мышей, и новых конъюгатов криптофицина, состоящих из данных стабильных макроциклов.

Сущность изобретения

В этом отношении изобретение относится к соединениям криптофицина формулы (I)

в которой

R1 представляет собой (^-^алкильную группу;

R2 представляет собой атом водорода или (^-^алкильную группу;

R₃ представляет собой атом водорода;

или, альтернативно, R2 и R₃ образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, (C₃-C₆)циклоалкильную группу;

R4 представляет собой (^-^алкильную группу или группу (С1-С₆)алкил-ОН;

R₅ представляют собой (^-^алкильную группу;

R6 представляет собой атом водорода;

R₇ представляет собой (^-^алкильную группу;

- 1 035625

R₈ представляет собой атом водорода;

R₉ представляет собой один или два заместителя фенильного ядра, выбранных независимо друг от друга из атома водорода, (С1-С4)алкокси или атома галогена;

R10 представляет собой четыре заместителя фенильного ядра, выбранных из атома водорода;

W представляет собой (СгС^алкил-КИ^п), более конкретно (CH2)nNHR₁₁;

(C₁-C₆)алкил-OH, более конкретно (CH₂)nOH; или (С1-С₆)алкил-И₃;

W располагается в орто- (о), мета- (м) или пара- (п) положении фенильного ядра;

R1 1 представляет собой атом водорода;

n представляет собой целое число от 1 до 6.

Изобретение дополнительно относится к полезным нагрузкам криптофицина формулы (II)

в которой

R1, R2, R₃, R4, R5, R6, R7, R₈, R₉ и R10 представляют собой, как определено в формуле (I);

Y представляет собой (С1-С₆)алкил-ИК11 или (^-С^лкил-О; или альтернативно Y представляет собой C(=O)O или C(=O)NH; или альтернативно Y представляет собой (С1-С₆)алкилтриазольную группу

N-N (С^С^алкигГ^⁴^!^ .

Y располагается в орто- (о), мета- (м) или пара- (п) положении фенильного ядра;

R11 представляет собой атом водорода;

L представляет собой линкер;

RCG1 представляет собой реакционноспособную химическую группу, присутствующую на конце линкера, причем RCG1 является реакционноспособной по отношению к реакционноспособной химической группе, присутствующей на антителе.

Изобретение также относится к конъюгатам формулы (III)

в которой

Y и L представляют собой, как определено в формуле (II);

G представляет собой продукт взаимодействия между RCG1, реакционноспособной химической группой, присутствующей на конце линкера, и RCG2, ортогональной реакционноспособной химической группой, присутствующей на антителе (Ab);

Ab представляет собой антитело.

Каждый заместитель от R1 до R11 может также принимать одну из пространственных конфигураций (например, R или S или, альтернативно, Z или E), как описано в примерах.

Соединения формулы (I), (II) и (III) могут содержать один или более асимметрических атомов углерода. Поэтому они могут существовать в форме энантиомеров или диастереомеров. Данные энантиомеры и диастереомеры, а также их смеси, включая рацемические смеси, являются частью изобретения.

Соединения формулы (I), включая проиллюстрированные соединения, могут существовать в форме основно- или кислотно-аддитивных солей, в частности фармацевтически приемлемых кислот.

Определения.

В контексте настоящего изобретения определенные термины имеют следующие определения.

Алкенильная группа - углеводородная группа, полученная удалением одного атома водорода из алкена. Алкенильная группа может быть линейной или разветвленной. Примеры, которые могут быть упомянуты, включают этенил (-CH=CH₂, также называемый винил) и пропенил (-CH₂-CH=CH₂, также называемый аллил).

Алкоксигруппа - -O-алкильная группа, в которой алкильная группа представляет собой, как определено ниже.

Алкильная группа - линейная или разветвленная насыщенная алифатическая углеводородная груп- 2 035625 па, полученная удалением атома водорода из алкана. Примеры, которые могут быть упомянуты, включают метильную, этильную, пропильную, изопропильную, бутильную, изобутильную, трет-бутильную, пентильную, неопентильную, 2,2-диметилпропильную и гексильную группы.

Алкиленовая группа - насыщенная двухвалентная группа эмпирической формулы -C_nH_2n-, полученная удалением двух атомов водорода из алкана. Алкиленовая группа может быть линейной или разветвленной. Примеры, которые могут быть упомянуты, включают метилен (CH2-), этилен (-CH2CH2-), пропилен (-CH₂CH₂CH₂-), бутилен (-CH₂CH₂CH₂CH₂-) и гексилен (-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) или следующие разветвленные группы

предпочтительно алкиленовая группа имеет формулу -(CH₂)_n-, n представляет собой целое число; в диапазоны значений включены предельные значения (например, диапазон типа n в диапазоне от 1 до 6 или от 1 до 6 включает предельные значения 1 и 6).

Антитело - антитело с аффинностью к биологической мишени, более определенно моноклональное антитело. Функция антитела состоит в том, чтобы направлять биологически активное соединение в виде цитотоксического соединения в направлении биологической мишени. Антитело может быть моноклональным, поликлональным или мультиспецифическим; оно также может быть фрагментом антитела; оно может также представлять собой мышиное, химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Антитело может быть природным или стандартным антителом, в котором две тяжелые цепи связаны друг с другом дисульфидными связями и каждая тяжелая цепь связана с легкой цепью дисульфидной связью (также называемое полноразмерным антителом). Термины стандартное (или полноразмерное) антитело относятся как к антителу, содержащему сигнальный пептид (или пропептид, если он есть), так и к зрелой форме, полученной при секреции и протеолитическом процессинге цепи(ей). Существует два типа легкой цепи: λ и к. Существует пять основных классов тяжелой цепи (или изотипов), которые определяют функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Каждая цепь содержит различные последовательности доменов. Легкая цепь включает два домена или области, вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). Тяжелая цепь включает четыре домена, вариабельный домен (VH) и три константных домена (CH1, CH2 и CH3, вместе называемые CH). Вариабельные области как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепи определяют распознавание связывания и специфичность к антигену. Константные домены легкой (CL) и тяжелой (VH) цепи придают важные биологические свойства, такие как ассоциация цепей антител, секреция, трансплацентарная подвижность, связывание с комплементом и связывание с Fc-рецепторами (FcR). Fv-фрагмент представляет собой N-концевую часть Fabфрагмента иммуноглобулина и состоит из вариабельных частей одной легкой цепи и одной тяжелой цепи. Специфичность антитела заключается в структурной комплементарности между сайтом объединения антител и антигенной детерминантой. Сайты связывания антител составлены из остатков, происходящих в основном из гипервариабельных или определяющих комплементарность областей (CDR). Иногда остатки из негипервариабельных или каркасных областей (FR) влияют на общую структуру домена и, следовательно, сайта связывания. Определяющие комплементарность области или CDRs относятся к аминокислотным последовательностям, которые вместе определяют аффинность связывания и специфичность природной Fv-области сайта связывания нативного иммуноглобулина. Легкая и тяжелая цепи иммуноглобулина, каждая, имеет три CDRs, обозначенные CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L и CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H соответственно. Таким образом, стандартный антигенсвязывающий участок антитела включает шесть CDRs, содержащих набор CDR из каждой из V-области тяжелой и легкой цепи.

Используемый в настоящем описании термин антитело обозначает как стандартные (полноразмерные) антитела, так и их фрагменты, также как однодоменные антитела и их фрагменты, в частности вариабельные тяжелые цепи однодоменных антител. Фрагменты (стандартных) антител обычно содержат часть интактного антитела, в частности антигенсвязывающую область или вариабельную область интактного антитела, и сохраняют биологическую функцию стандартного антитела. Примеры таких фрагментов включают Fv, Fab, F(ab')₂, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)₂ и диатела.

Функция антитела состоит в том, чтобы направлять биологически активное соединение в виде цитотоксического соединения в направлении биологической мишени.

Арильная группа - циклическая ароматическая группа, содержащая от 5 до 10 атомов углерода. Примеры арильных групп включают фенил, толил, ксилил, нафтил.

Биологическая мишень - антиген (или группа антигенов), предпочтительно расположенный на поверхности раковых клеток или стромальных клеток, связанных с данной опухолью; данные антигены могут быть, например, рецептором фактора роста, онкогенным продуктом или продуктом мутантного гена подавителя опухоли, связанной с ангиогенезом молекулой или молекулой адгезии.

Конъюгат - конъюгат антитело-лекарственное средство или ADC, т.е. антитело, к которому ковалентно присоединена через линкер,по меньшей мере одна молекула цитотоксического соединения.

Циклоалкильная группа - циклическая алкильная группа, содержащая от 3 до 6 атомов углерода,

- 3 035625 участвующих в циклической структуре. Примеры, которые могут быть упомянуты, включают циклопропильную, циклобутильную, циклопентильную и циклогексильную группы.

DAR (соотношение лекарственного средства и антитела) - среднее количество цитотоксических молекул, присоединенных через линкер к антителу.

Галоген - любой из четырех элементов: фтор, хлор, бром и йод.

Гетероарильная группа - арильная группа, содержащая от 2 до 10 атомов углерода и от 1 до 5 гетероатомов, таких как азот, кислород или сера, включенных в кольцо и связанных с атомами углерода, образующими кольцо. Примеры гетероарильных групп включают пиридил, пиримидил, тиенил, имидазолил, триазолил, индолил, имидазопиридил, пиразолил.

Г етероциклоалкильная группа - циклоалкильная группа, содержащая от 2 до 8 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, таких как азот, кислород или сера, включенных в кольцо и связанных с атомами углерода, образующими кольцо. Примеры включают азиридинил, пирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, тетрагидрофуранил, тетрагидротиофуранил, тетрагидропиранил, азетидинил, оксетанил и пиранил.

Линкер - группа атомов или одинарная связь, которая может ковалентно присоединить цитотоксическое соединение к антителу для образования конъюгата.

Фрагмент - более простые молекулы, которые обеспечивают полный синтез соединений криптофицина.

Полезная нагрузка - цитотоксическое соединение, к которому ковалентно присоединен линкер.

Реакционноспособная химическая группа - группа атомов, способная содействовать или подвергаться химической реакции.

Сокращения.

ADC - конъюгат антитело-лекарственное средство;

AcOH - уксусная кислота;

AIBN - азобисизобутиронитрил;

ALK - (^-^^алкиленовая группа, более конкретно (^-^алкилен, более конкретно формы -(CH₂)_n-, причем n представляет собой целое число от 1 до 12 и предпочтительно от 1 до 6;

водн. - водный;

Ar - аргон;

AUC - площадь под кривой;

BEMP - 2-трет-бутилимино-2-диэтиламино-1,3-диметилпергидро-1,3,2-диазафосфорин;

BF₃ - трифторид бора;

Boc₂O - ди-трет-бутилдикарбонат;

BuLi - бутиллитий;

ЦАН - церий аммоний нитрат;

Cbz - карбоксибензил;

CHCl₃ - хлороформ;

CH3CN - ацетонитрил;

CH3I - метилиодид;

CO2 - диоксид углерода;

CL - клиренс;

м-CPBA - м-хлорпербензойная кислота;

CR - полный ответ;

крипто обозначает единицу формулы

крипто, в частности, обозначает одно из соединений криптофицина D1-D₁₉, описанных ниже, или соединение криптофицина примера; D1 относится к ADC с DAR 1, D2 к ADC с DAR 2 и т.д.;

д - день;

DAR - соотношение лекарственного средства и антитела;

DBU - 8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен;

ДЦК - ^№-дициклогексилкарбодиимид;

ДХЭ - дихлорэтан;

ДХМ - дихлорметан;

DDQ - 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон;

ДИК - ^№-диизопропилкарбодиимид;

DIAD - диизопропилазодикарбоксилат;

- 4 035625

DIEA - Ν,Ν-диизопропилэтиламин;

ДМА - диметилацетамид;

ДМАП - 4-(диметиламино)пиридин;

ДМЭ - диметоксиэтан;

DMEM - модифицированная по способу Дульбекко среда Игла;

DMEM/F12 - модифицированная по способу Дульбекко среда Игла с питательной смесью F-12;

ДМФ - диметилформамид;

ДМСО - диметилсульфоксид;

DPBS - фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко;

ДФФА - дифенилфосфоразид (P1iO)₂P(=O)N₃;

ДСК - Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат;

ЭДА - этилендиамин;

ЭДК - 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

EEDQ - №этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин;

ELSD - испарительный детектор светорассеяния;

экв. - эквивалент;

ES - электрораспыление;

EtOAc - этилацетат;

Et₂O - диэтиловый эфир;

EtOH - этанол;

Пр. - пример;

ФБС - фетальная бычья сыворотка;

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;

FmocOSu - №(9-флуоренилметоксикарбонилокси)сукцинимид;

GI - электроиндуктивная группа;

катализатор Граббса I - бензилиден-бис(трициклогексилфосфин)дихлорутений;

катализатор Граббса II - (1,3-бис(2,4,6-триметилфенил)-2-имидазолидинилиден)дихлор(фенилметилен)(трициклогексилфосфин)рутений;

ч - час;

H₂O - вода;

Гал - галоген;

HATU - 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида гексафторфосфат;

HCl - хлористоводородная кислота;

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;

HIC - хроматография гидрофобного взаимодействия;

HOAt - 1-гидрокси-7-азабензотриазол;

HOBt - 1-гидроксибензотриазол;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

MCBP - масс-спектрометрия высокого разрешения;

IC₅₀ - средняя ингибирующая концентрация;

т.е. - означает, что есть;

IEC - ионообменная хроматография;

iPrOH - 2-пропанол;

iPr2O - диизопропиловый эфир;

в/в - внутривенный;

K2CO3 - карбонат калия;

LDA - диизопропиламид лития;

LiOH: гидроксид лития;

незнач. - незначительно;

MeOH - метанол;

МеТГФ - 2-метилтетрагидрофуран;

MgSO₄ - сульфат магния;

Мин - минута;

MNBA - 2-метил-6-нитробензойный ангидрид;

МТБЭ - метил-трет-бутиловый эфир;

МПД - максимальная переносимая доза;

NaH - гидрид натрия;

NaHSO₄ - бисульфат натрия;

Na₂S₂O₃ - тиосульфат натрия;

NaCl - хлорид натрия;

- 5 035625

NaHCO₃ - гидрокарбонат натрия;

NaHSO₃ - бисульфит натрия;

NaHSO₄ - гидросульфат натрия;

NaOH - гидроксид натрия;

NH₄Cl - хлорид аммония;

NHS - N-гидроксисукцинимид;

NMP - 1-метил-2-пирролидон;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

P₂-Et - 1-этил-2,2,4,4,4-пентакис (диметиламино)-2/_5,4/.5-катенади (фосфазен);

ФСБ - фосфатно-солевой буфер;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

ФК - фармакокинетика;

ПМБ - параметоксибензил;

PNGase F - пептид-Ы-гликозидаза F;

PPh₃ - трифенилфосфин;

м.д. - миллионная доля;

PR - частичный ответ;

QS - достаточное количество, означает количество, которое необходимо;

Q-Tof - квадрупольный времяпролетный;

колич. - количественный выход;

RCG - реакционноспособная химическая группа;

КТ - комнатная температура;

насыщ. - насыщенный;

п.к. - подкожно;

SCID - тяжелый комбинированный иммунодефицит;

SEC - эксклюзионная хроматография;

TBAF - тетрабутиламмония фторид;

tBuOK - трет-бутоксид калия;

TCEP - трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид;

ТЭА - триэтиламин;

TEMPO - (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксил;

ТФУК - трифторуксусная кислота;

TFS - выживший без опухоли;

ТГФ - тетрагидрофуран;

ТГП - тетрагидропиран;

ТСХ - тонкослойная хроматография;

t_1/2 - период полувыведения;

t_R - время удерживания;

п-TsOH - паратолуолсульфокислота;

СВЭЖХ - сверхэффективная жидкостная хроматография;

УФ - ультрафиолетовый;

V_ss - кажущийся объем распределения в стабильном состоянии.

Описание фигур

Фиг. 1 - масс-спектр высокого разрешения пр. 3;

фиг. 2 - масс-спектр высокого разрешения пр. 7;

фиг. 3 - масс-спектр высокого разрешения пр. 10;

фиг. 4 - масс-спектр высокого разрешения пр. 14;

фиг. 5 - масс-спектр высокого разрешения пр. 20;

фиг. 6 - масс-спектр высокого разрешения пр. 23;

фиг. 7 - эффективность in vivo пр. 3 в отношении ксенотрансплантата MDA-MB-231 у мышей SCID;

фиг. 8 - эффективность in vivo пр. 7 в отношении ксенотрансплантата MDA-MB-231 у мышей SCID;

фиг. 9 - эффективность in vivo пр. 10 в отношении ксенотрансплантата MDA-MB-231 у мышей SCID;

фиг. 10 - эффективность in vivo пр. 14 в отношении ксенотрансплантата MDA-MB-231 у мышей SCID;

фиг. 11 - эффективность in vivo пр. 20 в отношении ксенотрансплантата MDA-MB-231 у мышей SCID;

фиг. 12 - эффективность in vivo пр. 23 в отношении ксенотрансплантата MDA-MB-231 у мышей SCID;

фиг. 13 - ФК-профиль in vivo ADC1 после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 14 - ФК-профиль in vivo ADC1 после однократного в/в введения у негрызунов;

фиг. 15 - ФК-профиль in vivo пр. 3 после однократного в/в введения у мышей SCID;

- 6 035625 фиг. 16 - ФК-профиль in vivo пр. 7 после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 17 - спектр MCBP дегликозилированного ADC1 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 18 - спектр MCBP легкой цепи ADC2 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей

SCID;

фиг. 19 - спектр MCBP дегликозилированного ADC1 через 6 д. после однократного в/в введения у негрызунов;

фиг. 20 - спектр MCBP пр. 3 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 21 - спектр MCBP пр. 7 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 22 - спектр МСВР пр. 10 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 23 - спектр MCBP пр. 14 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 24 - спектр MCBP пр. 20 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей SCID;

фиг. 25 - спектр MCBP пр. 23 через 96 ч после однократного в/в введения у мышей SCID.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к соединениям криптофицина формулы (I)

в которой

R₁ представляет собой (С1-С₆)алкильную группу;

R₂ представляет собой атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу;

R₃ представляет собой атом водорода;

или, альтернативно, R₂ и R₃ образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, (C₃-C₆)циkлоалkильную группу;

R представляет собой или (С1-С₆)алкильную группу, или группу (C₁-C₆)алкил-OH;

R₅ представляет собой (С1-С₆)алкильную группу;

R6 представляет собой атом водорода;

R₇ представляет собой (С1-С₆)алкильную группу;

R8 представляет собой атом водорода;

R9 представляет собой один или два заместителя фенильного ядра, выбранных независимо друг от друга из атома водорода, (С1-С₄)алкокси или атома галогена;

R₁₀ представляет собой четыре заместителя фенильного ядра, выбранных из атома водорода;

W представляет собой (С1-С₆)алкил-№^п), более конкретно (CH₂)_nNHR11;

(C₁-C₆)алkил-OH, более конкретно (CHH₂)_nOH или (С1-С₆)алкил^з;

R11 представляет собой атом водорода;

n представляет собой целое число от 1 до 6.

Соединение криптофицина может представлять собой одно из следующих D1-D19:

- 7 035625

в котором

W и R₁₂ представляют собой, как определено в формуле (I);

или соединение криптофицина может являться эквивалентной единицей, описанной в одном из примеров.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, первая группа соединений состоит из соединений, для которых R1 представляет собой (С^С^лкил, в частности метильную

- 8 035625 группу.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, вторая группа соединений состоит из соединений, для которых каждый из R2 и R3 представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, третья группа соединений состоит из соединений, для которых один из R2 и R3 представляет собой (^^^алкил, в частности метильную группу, и другой представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, четвертая группа соединений состоит из соединений, для которых R₂ и R₃ образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, (C₃-C₆)циклоαлкuльную группу, в частности циклопропильную группу.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, пятая группа соединений состоит из соединений, для которых каждый из R4 и R5 представляет собой (^-^алкил, в частности метильную группу.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, восьмая группа соединений состоит из соединений, для которых R₉ представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора. Более конкретно, фенильное ядро содержит два заместителя в положениях 3 и 4 на фенильном ядре. Предпочтительными являются 3-Cl и 4-метокси.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, десятая группа соединений состоит из соединений, для которых W располагается в пара-положении фенильного ядра.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, одиннадцатая группа соединений состоит из соединений, для которых W выбран из (C₁-C₆)aлкuл-NHR₁₁, в частности (C1C₃^ku4-NHRh, в частности группы CH2-NH2, (C₁-C₆)aлкuл-ОН, в частности (C₁-C₃)aлкuл-OH, в частности группы CH₂-OH.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, двенадцатая группа соединений состоит из соединений, для которых R1 представляет собой (C₁-C₆)aлкuл, в частности метильную группу, каждый из R₂ и R₃ представляет собой атом водорода, R₆ представляет собой атом водорода, R9 представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора, более конкретно фенильное ядро содержит два заместителя в положениях 3 и 4 на фенильном ядре, предпочтительными являются 3-C1 и 4-метокси, и R₁₀ представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, тринадцатая группа соединений состоит из соединений, для которых R1 представляет собой (C₁-C₆)aлкuл, в частности метильную группу, R2 и R3 представляет собой (^-^алкил, в частности метильную группу, и другой представляет собой атом водорода, R₆ представляет собой атом водорода, R₉ представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора, более конкретно фенильное ядро содержит два заместителя в положениях 3 и 4 на фенильном ядре, предпочтительными являются 3-C1 и 4-метокси, и R₁₀представляет собой атом водорода.

Альтернативно, W выбран из (CH2)_nNHR11 и (CH₂)_nOH, в которой n представляет собой целое число от 1 до 6.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, четырнадцатая группа соединений состоит из соединений следующей структуры (β-эпоксидная конфигурация):

Все данные подгруппы, взятые отдельно или в комбинации, являются частью изобретения.

Среди соединений формулы (I), которые являются объектом изобретения, можно упомянуть, в ча стности, следующие соединения:

- 9 035625

в которой

R1, R2, R₃, R4, R5, Кб, R7, R8, R9 и R10 представляют собой, как определено в формуле (I);

- 10 035625

Y представляет собой (С1-С₆)алкил-№п или (С1-С₆)алкил-О;

или, альтернативно, Y представляет собой C(=O)O или C(=O)NH; или, альтернативно, Y представляет собой (C₁-C₆)алкилтриазольную группу

IN=N (С^С^алкигГ_#

R11 представляет собой атом водорода;

L представляет собой линкер;

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, первая группа соединений состоит из соединений, для которых R1 представляет собой (С^С^алкил, в частности метильную группу.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, вторая группа соединений состоит из соединений, для которых каждый из R2 и R3 представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, третья группа соединений состоит из соединений, для которых один из R2 и R3 представляет собой (С^С^алкильную группу, в частности метильную группу, и другой представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, четвертая группа соединений состоит из соединений, для которых R2 и R3 образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, (С₃-С₆)циклоалкильную группу, в частности циклопропильную группу.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, пятая группа соединений состоит из соединений, для которых каждый из R4 и R₅ представляет собой (С1-С₆)алкильную группу, в частности метильную группу.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, восьмая группа соединений состоит из соединений, для которых R₉ представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора. Более конкретно, фенильное ядро содержит два заместителя в положениях 3 и 4 на фенильном ядре. Предпочтительными являются 3-Cl и 4-метокси.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, десятая группа соединений состоит из соединений, для которых Y располагается в пара-положении фенильного ядра.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, одиннадцатая группа соединений состоит из соединений, для которых Y представляет собой (С^С^алкил-КЕп, в частности (C1С₃)алкил-Ж_п, более конкретно CH2-NH.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, двенадцатая группа соединений состоит из соединений, для которых R1 представляет собой (С1-С₆)алкил, в частности метильную группу, каждый из R2 и R3 представляет собой атом водорода, R6 представляет собой атом водорода, R9 представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора, более конкретно фенильное ядро содержит два заместителя в положениях 3 и 4 на фенильном ядре, предпочтительными являются 3-Cl и 4-метокси, и R₁₀ представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, тринадцатая группа соединений состоит из соединений, для которых R1 представляет собой (С1-С₆)алкил, в частности метильную группу, R2 и R3 представляет собой (С1-С₆)алкил, в частности метильную группу, и другой представляет собой атом водорода, R6 представляет собой атом водорода, R9 представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора, более конкретно фенильное ядро содержит два заместителя в положениях 3 и 4 на фенильном ядре, предпочтительными являются 3-Cl и 4-метокси, и R₁₀представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, четырнадцатая группа соединений состоит из соединений следующей структуры (β-эпоксидная конфигурация):

Среди соединений формулы (II), которые являются объектом изобретения, можно упомянуть, в частности, следующие соединения:

- 11 035625

Изобретение также относится к конъюгатам формулы (III) в которой

R1, R₂, R₃, R4, R5, R₆, R7, R8, R9 и R10 представляют собой, как определено в формуле (I);

- 12 035625

Ab представляет собой антитело.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, первая группа соединений состоит из соединений, для которых R1 представляет собой (С1-С₆)алкил, в частности метильную группу.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, вторая группа соединений состоит из соединений, для которых каждый из R₂ и R3 представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, третья группа соединений состоит из соединений, для которых один из R2 и R3 представляет собой (С1-С₆)алкильную группу, в частности метильную группу, и другой представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, четвертая группа соединений состоит из соединений, для которых R₂ и R₃ образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, (С₃-С₆)циклоалкильную группу, в частности циклопропильную группу.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, пятая группа соединений состоит из соединений, для которых каждый из R4 и R5 представляет собой (С1-С₆)алкильную группу, в частности метильную группу.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, шестая группа соединений состоит из соединений, для которых R₆ представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, седьмая группа соединений состоит из соединений, для которых R7 и R8 независимо друг от друга представляют собой атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, восьмая группа соединений состоит из соединений, для которых R₉ представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора. Более конкретно, фенильное ядро содержит два заместителя в положениях 3 и 4 на фенильном ядре. Предпочтительными являются 3-Cl и 4-метокси.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, девятая группа соединений состоит из соединений, для которых R₁₀ представляет собой атом водорода.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, десятая группа соединений состоит из соединений, для которых Y располагается в пара-положении фенильного ядра.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, одиннадцатая группа соединений состоит из соединений, для которых Y представляет собой (C₁-C₆)αлкил-NR₁₁, в частности (C₁-C₃)aлкил-NR₁₁, более конкретно CH2-NH.

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, двенадцатая группа соединений состоит из соединений следующей структуры (β-эпоксидная конфигурация):

Среди соединений формулы (III), которые являются объектом изобретения, можно упомянуть, в частности, следующие соединения:

- 13 035625

Связывание между полезной нагрузкой криптофицина формулы (II) и антителом для получения конъюгата формулы (III) получают с помощью реакционноспособной химической группы RCG1, присутствующей на полезной нагрузке, которая является реакционноспособной по отношению к реакционноспособной группе RCG2, присутствующей на антителе. Взаимодействие между RCG1 и RCG2 обеспечивает присоединение соединения формулы (II) к антителу путем образования ковалентной связи. В конъюгате формулы (III) части RCG1 и RCG2 могут оставаться образующими связывание между линке ром и антителом.

Примеры RCG1, которые могут быть упомянуты, включают:

(i) -G(=O)-Z_aR_a реакционноспособную группу, для которой Z_a представляет собой одинарную связь, O или NH, более конкретно O, и R_a представляет собой атом водорода или (^-^алкильную, (C₃^циклоалкильную, алкенильную, арильную, гетероарильную или (^-^гетероциклоалкильную группу. Арильная группа может быть замещена 1-5 группами, выбранными из галогена, в частности F, алкильной, алкокси, нитро и цианогрупп;

о n J (ii) одну из следующих реакционноспособных групп: малеимидо о группа; галогенацетамидо ft

I 13

Г ВГ или I ⁰ группа с R₁₃, представляющим атом водорода или (^-^алкильную группу, более конкретно Me; -Cl; -N₃; -OH; -SH; -NH₂; -C^CH или активированную C^C, такую как фрагмент циклооктина, такой

- 14 035625

как ; о-алкилгидроксиламин или реакционный субстрат Пикте-Шпенглера, такой как описанный в Agarwal P., et al., Bioconjugate Chem 2013, 24, 846-851.

Более конкретно, -Z_aRa может представлять собой -OH, -OCH₃, -OCH₂CH=CH₂, о % SO,M on J ,7 М=Нилигатлсн ⁰ , где катион представляет собой, например, натрий, калий или цезий, или (O-NHS) или \

O-N j ό <=% или

группу, в которой GI представляет собой по меньшей мере одну электроиндуктивную группу, такую как -NO₂ или -Hal, в частности -F. Они могут представлять собой, например, следующие группы:

—о

NO, или

Другим типом -C(=O)Z_aRa группы является следующая:

Более конкретно, RCG1 может быть выбран из одной из групп, описанных в примерах.

Примеры RCG2, которые могут быть упомянуты, включают (Garnett M.C., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216):

(i) ε-аминогруппы лизинов, находящихся на боковых цепях остатков лизина, которые присутствуют на поверхности антитела;

(ii) α-аминогруппы N-концевых аминокислот тяжелых и легких цепей антитела;

(iii) группы сахаридов шарнирной области;

(iv) тиолы цистеинов, образованные путем восстановления внутрицепочечных дисульфидных связей, или тиолы сконструированных цистеинов;

(v) амидные группы, находящиеся на боковых цепях некоторых остатков глутамина, которые присутствуют на поверхности антитела;

(vi) альдегидные группы, введенные с использованием формилглицинобразующего фермента.

В последнее время были рассмотрены другие подходы к конъюгации, например введение цистеинов путем мутации (Junutula J.R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932), введение неприродных аминокислот, учитывая другие типы химии (Axup J.Y., et al., PNAS 2012, 109, 40, 16101-16106), или конъюгация на гликанах антител (Zhou Q., et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 510-520). Другой подход для сайт-специфических модификаций антител основывается на ферментативном мечении с использованием, например, бактериальной трансглутаминазы (Jeger S., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997; Strop P., et al., Chem. Biol. 2013, 20, 161-167) или формилглицинобразующего фермента (Hudak J.E., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 4161-4165). Для обзора стратегий сайт-специфических конъюгаций см. Agarwal P. and Bertozzi C.R., Bioconjugate Chem 2015, 26, 176-192. Данные технологии конъюгации также могут быть применены к полезным нагрузкам криптофицина, описанным в настоящем изобретении.

Также возможно химическое модифицирование антитела с целью введения новых реакционноспособных химических групп RCG2. Таким образом, специалисту в данной области техники хорошо известно, как модифицировать антитело с помощью модифицирующего агента, вводя, например, активированные дисульфидные, тиольные, малеимидо или галоацетамидогруппы (см., в частности, WO 2005/077090 стр. 14 и WO 2011/001052). Модификация позволяет улучшить реакцию конъюгации и использовать более широкий спектр групп RCG1.

Более конкретно, в случае, когда RCG1 относится к типу (ii) выше, можно химически модифицировать антитело с использованием подходящего модифицирующего агента или ввести одну или более неприродных аминокислот, чтобы ввести соответствующие функциональные группы RCG2. Например, когда RCG1 представляет собой N-гидроксисукцинимидиловый эфир, RCG2 представляет собой группу -NH2;

когда RCG1 представляет собой малеимидо или галогенацетамидо функциональную группу или группу -Cl, RCG2 может представлять собой группу -SH;

когда RCG1 представляет собой группу -N₃, RCG2 может представлять собой группу -C^CH или активированную С^С, такую как фрагмент циклооктина;

когда RCG1 представляет собой группу -OH или -NH₂, RCG2 может представлять собой карбоновую кислоту или амидную функциональную группу;

когда RCG1 представляет собой группу -SH, RCG2 может представлять собой малеимидо или галогенацетамидо функциональную группу;

когда RCG1 представляет собой функциональную группу -C^CH или активированную C^H, RCG2

- 15 035625 может представлять собой группу -N3;

когда RCG1 представляет собой -O-алкилгидроксиламинную функциональную группу или реакционный субстрат Пикте-Шпенглера, RCG2 может представлять собой альдегидную или кетонную функциональную группу.

Примеры G, которые могут быть упомянуты, включают

Изобретение относится к полезным нагрузкам криптофицина формулы (II) и конъюгатам формулы (III)

в которой линкер L имеет формулу (IV) в которой

L1 представляет собой одинарную связь или группу NR₁₆(гетеро)арил-CR₁₅R₁₄-O-C(=O), если Y = (С^С^алкил^^п);

группу NR₁₈-(C₂-C₆)алкил-NR₁₇-C(=O) или группу NR₁₆(гетеро)aрил-CR₁₅R₁₄-O-C(=O)NR₁₈-(C₂C₆)алкил-NR₁₇-C(=O), если Y = (C₁-C₆)алкил-O- или (С_гС₆)алкил^;

группу NRl₆(гетеро)арил-CRl₅Rl₄, если Y = С(=О)О, C(=O)NH, (С1-С₆)алкил-С(=О)О или (С1Сб)алкил-С(=О)№;

R11, R₁₄, R₁₅, R₁₆, R₁₇ и R₁₈ представляют собой независимо друг от друга H или (С1-С₆)алкильную группу;

(AA)_w представляет собой последовательность w аминокислот AA, связанных вместе через пептидные связи;

w представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 6 и более конкретно 2 или 3;

L2 представляет собой одинарную связь, или (С1-С₆)алкильную группу, или группу (С1-С₆)алкил(OCH₂CH₂)i, или (С^С^алкил^ОСН^Н^-О^-С^алкильную группу, или (С^С^ОХ^-С^алкильную группу, или CH(SO₃H)-(C₁-C₆)алкильную группу, или группу (С^С^алкил-СН^О^), или (С1-С₆)алкилциклогексильную группу, или NR₁₉-(C₁-C₆)алкильную группу, или NR₂o-(CH₂CH₂O)_i(C₁-C₆)алкильную группу, или NR₂₁-арильную группу, или NRn-гетероарильную группу, или (C₁-C₆)aлкил-NR₂₂C(=O)-(C₁С₆)алкильную группу, или группу (С₁-С₆)алкил-NR₂₂C(=O)-(C₁-C₆)алкил-(OCH₂CH₂)_i. Более конкретно, L2 представляет собой (С1-С₆)алкильную группу, или группу (C₁-C₆)алкил-(OCH₂CH₂)_i, или dI(SO₃I I)(С1-С₆)алкильную группу;

R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ представляют собой независимо друг от друга H или (С1-С₆)алкильную группу;

i представляет собой целое число от 1 до 50 и предпочтительно от 1 до 10 (i может принимать все значения от 1 до 50).

AA обозначает природную или неприродную аминокислоту конфигурации D или L, более определенно выбранную из аланина (Ala), β-аланина, γ-аминомасляной кислоты, 2-амино-2циклогексилуксусной кислоты, 2-амино-2-фенилуксусной кислоты, аргинина (Arg), аспарагина (Asn), аспарагиновой кислоты (Asp), цитруллина (Сй), цистеина ^ys), а,а-диметил-/-аминомасляной кислоты,

- 16 035625 в,в-диметил-у-аминомасляной кислоты, глутамина (Gln), глутаминовой кислоты (Glu), глицина (Gly), гистидина (His), изолейцина (Ile), лейцина (Leu), лизина (Lys), ε-ацетиллизина (AcLys), метионина (Met) орнитина (Orn), фенилаланина (Phe), пролина (Pro), серина (Ser), треонина (Thr), триптофана (Trp), тирозина (Tyr), валина (Val). Более конкретно, AA выбирают из аланина (Ala), цитруллина (Cit), глутамина (Gln), глицина (Gly), ε-ацетиллизина (AcLys), валина (Val).

Последовательность (AA)_w имеет формулу

Н О >'^N'ALK'^J4_r-.

^23 j ,

в которой R₂₃ представляет собой боковую цепь одной из аминокислот, описанных выше.

Примеры последовательностей являются следующими: Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-AcLys, ValCit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Ala, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu-Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu.

Для Y = (^-^алкил^^п) и более конкретно CH2NH RCG1-L может представлять собой одну из следующих (IV1-17):

RCG1	Примеры RCG1-L
0. 9 03 О	0° 5 /r'^NO ALK'0(AA)w- (IV1) 0
0 0 V^'o3lKHO^3(AA)w- (IV2) 0
/0° 0 V^{(AA)W- (IV3)} 0 SO₃H 0
0. з 0	Ό _Λ /У 0 У ^N ALK ' (AA)w- (IV4) О
J ⁰ Q~ALK30-407U.\|A(AA)w- (IV5) О
0 _zo z. а /У yy^fAAJw- (IV6) r^NALK- 0
⁰ д 7'n^ALK' (AA)w (IV7) VL so,h 0 ³

- 17 035625

1 или В Г	1илиВГ^Л_(АА)^ (\|V8)
и ⁰ ^,иВг - nr_malk- _{(AA\|W (IV9)}
'^xx^NR^^x-'°^^lALK^Jk(AA)w_ (\|V1O)
I Br X ^(IV11) ииВг^^мЧ ' ¹
-nh₂	0 Η N Д ⁿ2^N'ALK^^x(AA)w- (IV12)
H₂ ^N^^X°^_ALD(AA)w- (IV13)
-N₃	^N3ALkD_(AA)_w_ (\|V14)
ν 4 - Ο)ϊ_λι „Д ³ ALK (AA)w (IV15)
0	Οχ 9 9 , · N ALK'-NR^ ALK XAAJw- (IV16)
CC Д. ⁰ ? (IV17)

в которой (AA)_w представляет собой последовательность w аминокислот AA, связанных вместе через пептидные связи, как описано выше;

i представляет собой целое число от 1 до 50 и предпочтительно от 1 до 10 (i может принимать все значения от 1 до 50);

M1, M₂, M₃ и M4 выбраны независимо друг от друга из CR₂₄ и N;

R₁₉, R₂₀, R₂₁, R₂₂ и R₂₄ представляют собой независимо друг от друга атом водорода или (C1С₆)алкильную группу, более конкретно атом водорода или метильную группу.

Для Y = (С_гС₆)алкил-О или (С1-С₆)алкил^ и более конкретно CH₂O или CH₂S RCG1-L может представлять собой одну из следующих (IV18-34):

- 18 035625

RCGl

Примеры RCGl

° о °х	_ζο /Л оо о Y^NO^ALKHO^^(AA)w-NR^ALK-NR^ (IV19)
ζ,Ο 0 Г\ 0 Л УN^A^ALKy(AA)w-NR^ALK-NR> (IV20) 0 S0₃H 0
0_х ГА /^ΝΛ W 0	Л³ ϊ 5 ALK’ !AA;w NR_MALK NR,. (IV21)
J⁵ о ⁰ '.Ν-ALK^M-(O-^Sf^O'ALK''ⁱ^(AA)w-NR^ALK^NR^ (IV22) 0
» ,Λ X W AyrAAJw-NR^ALK-NRTr ₍\|_V23) 7^NALK''·' 0
0 0 0 AN''^ALK'r^K(AA)w-NR_iFALK-NRy ₍\|_V24) VA W о ³
1 или В Г	θ 0 lnBr^\_(AA)w__NR__{ALK NR}y _(\|V25)
⁰ A 9 I «™Br^_NR__AL\|y _(AA)w__NR__ALK__NRy _(IV26)
-νη₂ -Ν₃ ЛЛГ	l”Br^NR^01^_(AA)w__NR__ALK__NRy₍\|_V27) o m^%A Λ ι-вгЛ^(IV28) nr₂₁ M₄ ³ ^H2^NALK^(AA)w-NR^ALK-NR^ (1V29) . ^{0 0} h₂nA</0^_lkA_(aa)w __nr__alk__nrA (_IV30) о о N-- A. a 'VALK^MJwNR^ALK-NRy (IV31) . ^{0 0} ^N3^^^OiALA(AA)w-NR^ALK-NR^ (IV32) У. ° ⁰ A I / N -ALK'-NR₂₂ ALlT'yAAJw-NR^ALK-NR^ (IV33) О
Ci A k ° ⁰ A^N ALK'-NR₂₂ ALKHO^yAfAAJw-NR^ALK-NR^ (IV34) ~y

M1, M₂, M₃ и M4 выбраны независимо друг от друга из CR24 и N;

- 19 035625

R₁₇, R₁₈, R₁₉, R20, R₂₁, R22 и R24 представляют собой независимо друг от друга атом водорода или (C₁С₆)алкильную группу, более конкретно атом водорода или метильную группу.

Для Y = (СгС^алкил-^Дп) и более конкретно CH2NH RCG1-L также может представлять собой одну из следующих (IV35-51):

RCG1	Примеры RCG1-L
Оу Л-% 0	<А Λ У 0 ALK^iAAJw-NR^jf^
W⁰ 0 0 jA^A < u 1 ϊ 1 γ 0 ^(IV36) y^NO^ALKHO'^%A(AA)w-NRyf^{J 3}
J ^15^14 9 0 ^JL ^0^(1737) yN^A^ALK^fAAiw-NR^Jp 0 SO₃H 0
0 ,Ν-Α У 0	Cn A 1 A<^IV38’ К ALK^/x(AA)wNRAJ^³
P 0 !A^R>A A .Λ D ^J1, 10 (1739) [yN-ALK40'^^⁰'ALK^JA(AA)w__NR<y₃ 0
oil· yVSlV40) A rY^iAAJw-NR^jf³ V^ALK¹^ 0
J^15^14 9 К alkX \yAm vy so,H 0 ³
или В Г	I Br-Jl (IV42) lHnMBr-^_(AA)wNRy%₃
n П I ^J2^R?⁵?¹⁴ Λ i Br X A \ yAA⁴³) Ι.™ΒγΗ· _NR__ALK<.(_M)w-NRljf^l3
I-Br IL _{MR (} 0)i A t J ^{0A (IV44) NR}20 AA(AA)w-NRAf 3

- 20 035625

	о j^/J^¹⁴A 0 мАД Vj 0 ^(\|V45) nr₂₁ m₄ ³
-nh₂	Ω l-^JM⁴ A h₂n ... _к Л ² ALK ^(AAJw-NR^jp
jMu 9 , ηϊ Λ ^Jf (^IV47) H₂N'^°)⁾ _AL\|C(_AA)w-NRj'Jf^J3
-N₃	N+ I \ XO^(IV48) ^alk^₍aa)w-nr₁₆j;^j3
J^R15^14 9 »A,o)i А ДАи _N3^^%_LK⁴ _(AA)_W-_NR^_Jf₃
	/7\\ 1^15^/14 9 Ο Λ АД ^Ji /A^(IVS0)/ N ALK¹ NR₂₂ ALK^iAAJw-NR^Jp
FA η η n Д» A О А А Ад I ° f^\|V51> ^N'^LK^,-NR^ALlHO'^A^(M)w-NR^Jf3 О

J1, J₂, J₃ и J4 выбраны независимо друг от друга из CR24 и N;

R14, R₁₅, R₁₆, R₁₉, R₂₀, R₂₁, R₂₂ и R₂₄ представляют собой независимо друг от друга атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу, более конкретно атом водорода или метильную группу.

Для Y = (С1-С₆)алкил-О или (С1-С₆)алкил-8 и более конкретно CH₂O или CH₂S RCG1-L также может представлять собой одну из следующих (IV52-68):

- 21 035625

RCGl	Примеры RCG1-L
° о °г	rY 0 0 S VpkP \ S 0 NRijALK-NRp- (IV52) Y 0 ALK ' (AA)w-NR₁₆ J₄' ³
о .jR,_s% 9 9 Cn A ... A ^Ji T° ^ΑΙΚ-ΝΚΓ (IV53) Y '0 ALK40 A iMjwNR., j; ^J0
0 Игй⁴л A cY 0 Г pO^NR^ALK-NR^ (\|V54) yN.₀^ALKY(AA)w-NR^ jf³ 0 SO₃H θ
0_х гл 0	£> J^R«^R« ? fl P_N ? ^Jl· ^!Po^Anr_1Talk-nrL _(\|V55) Α^ν'αικ^(αα)»-νΓΓ³
⁰ jT⁴ A ? \|r>AL^A_AL Λ _(AA)WJX° ^K^^{K NR} ^VS6)0
^Μ’⁴ fl fl 0 Λ Λ ²'Γθ NR_ffALK-NR% (IV57) AT ATNAAlw-NfC'jf⁴ ValiP 0
aT” a a fl\ _ALK. fl ^Jl· r^O^NR^ALK-NRUdVSS) Y^_(AA)w-_NRpjX ΡΛ so₃h 0 ³
1 или В Г	A^R,5/^u ? fl , _Br fl 4 ²'A'O-^A'NR_1IALK-NR₁U_(IV59) ''~^/X(AA)w-NRT'J;'^J3

- 22 035625

	о о Д \|_илиВк A A l· yO^NR^ALK-NR^dveO)
0 ДД¹⁴ ? J? Ι-ΒτΓΗ-Κ oji j? fp NR^ALK-NlP (IV61) ^NR2o '- ALK' (AA)w NR₁₆' J; ³
R R 0 0 О Μ<Ά У Д°^ЛНК,тА1К-Н Д (ВД ι.™βγΡ7_νΧ_γμ/<^αα)«-^ν<Γ³ nr₂₁ m₄ ³
-nh₂	ρ,ρ 9 9 H _N S Y pO^NF^ALK-NRP (IV63) ² alk'- (aa)w nr₁₆ j;^j3
j^R, _sR'⁴ 9 9 _u , _Qji ? ^Jf ^Po^NR^ALK-NRp (IV64) ^H2^N _ALK^(AA)w-NRAJf ³
-N₃	R R 0 0 0 AAA A V ^J1 Ao^nr^alk-nrA^s) АкД_(ААМ^4
о /Л?⁴ a 5 мЛДД Λ 7 ⁰ NRjALK-NrPivk,)
⁰	АД о 0 о J-^Jpx¹⁴..j 3 УД Л Д Ϊ 1, O NR₁₈ALK NRJ (IV67) ^^ALK-NR>_K'A_(AA)w__NRA._jrJ₃ ^{18 17} VJ
ГУ η jMu S S Q Siy j? ^j£ ^o^-nr^alk-nrY (IV68)

Mi, M₂, M₃ и M4 выбраны независимо друг от друга из CR24 и N;

R14, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈, R₁₉, R₂₀, R₂₁, R₂₂ и R₂₄ представляют собой независимо друг от друга атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу, более конкретно атом водорода или метильную группу.

Для Y = C(=O)O, C(=O)NH, (С1-С₆)алкил-С(=О)О или (С1-С₆)алкил-С(=О)КН и более конкретно C(=O)O или CH₂-C(=O)O RCG1-L может представлять собой одну из следующих (IV69-85):

- 23 035625

RCGl	Примеры RCG1-L
ο Ал Ал 0 0, W 0	У.0 J^R15^14 A a Λ 1Т <^№> Y^O^ALkY^AAJw-NRY^³
_Г/ о о jA^ \ Ν Λ A f^(IV70) γ 0 ALMO^^^AAJw-NVJp 0 J-^J?¹v¹⁴ A 0 1 -j^(IV71) yN^A^ALK^iAA^-NR^Jp 0 SO₃H о ,0 J ^R15^14 \1 I A 4<^IV72> >'^N'ALK<⁴(AA)w-NRpjf3 0 J? ⁰ y^N~^ALK4°^^%L^ ⁽ ) 0 ι R₁₄R₁₄ q ? q Y(IV74) A r^-p-IAAtw-NRpjA VslA 0
	°1 Aik Λ A y^(IV75) y^^ALK _TA₍AA)_w-NR^jf^J3 VA so,h 0 ³
0 УЧ/! илиВГ	0 J/^Ji,A¹⁴ 'АЧЧ¹(AMJW Nrt₁₆ J₄
о о AA⁴ _4\|Д t ?jA ^(IV771NR_1TALK (AA)wNR₁₆ J₄ ^d;>
f? 0 J АД”
. vA' --A ι^βκΑΑ,ΑμΑ nr₂₁ m₄ ³
-νη₂	0 jA ^_41Ka aA^(IV80) ² ALKA\(AA)_W-NRYjf^J3
J^R15^14 0 г%А Ж n)i А Д AAIV81) H₂N'^A/°4lK^x (AA)W-N Jf ^J3
-Ν₃	J ^R15^14 Nx 1 1 YAIV82) ³ ALKAy^w-^yy
Ν-^ΛΛ A JAIV83) % ALK (AA)w-NR^_eJ₄ ^iJ3
χ°	ул 0 0 0 уч A A A A iA^\|V84) ^^N^ALK'-NR4ALK^_(AA)w-NRyjy M

- 24 035625

в которой (AA)W представляет собой последовательность w аминокислот АА, связанных вместе через пептидные связи, как описано выше;

J1, J₂, J₃ и J4 выбраны независимо друг от друга из CR₂₄ и N;

Mi, M₂, M₃ и M4 выбраны независимо друг от друга из CR₂₄ и N;

Для Y = C(=O) или (С1-С₆)алкил-С(=О) изобретение также относится к полезным нагрузкам криптофицина формулы (II) и конъюгатам формулы (III)

в которой линкер L имеет формулу (V) в которой (AA)'_w представляет собой последовательность w аминокислот AA, связанных вместе через пептидные связи;

R₂₅ представляет собой атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу;

L3 представляет собой (С1-С₆)алкильную группу, или (СН₂СН₂О)г(С1-С₆)алкильную группу, или группу (С1-С₆)алкил-(ОСН₂СН₂)ь или СН^О₃Н)-(С1-С₆)алкильную группу, или (С1-С₆)алкил(ОСН₂СН₂)гО(С1-С₆)алкильную группу, или NR₁₉-(C₁-C₆)алкильную группу, или группу NR₂₀(CH₂CH₂O)iCH₂CH₂, или (C₁-C₆)алкил-циклогексил-C(=O)NR₁₉-(C₁-C₆)алкильную группу, или (C1С₆)алкил-циклогексил-С(=О)^₂₀-(СН₂СН₂О)_гСН₂СН₂, или NR₂₁-арил-C(=O)NR₁₉-(C₁-C₆)алкильную группу, или NR₂₁-гетероарил-C(=O)NR₁₉-(C_1-C₆)алкильную группу, или (C1-C6) алкилNR₂₂C(=O)(CH₂CH₂O)_i-(C₁-C₆)алкильную группу;

R₁₉, R₂₀, R₂₁, R₂₂ и R₂₅ представляет собой атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу;

RCG1 представляет собой реакционноспособную химическую группу, которая является реакционноспособной по отношению к реакционноспособной химической группе, присутствующей на антителе, как определено выше;

R1, R₂, R₃, R4, R₅, R₆, R₇, R₈, R9 и R₁₀ представляют собой, как определено выше.

AA обозначает природную или неприродную аминокислоту конфигурации D или L, более определенно выбранную из аланина (Ala), β-аланина, γ-аминомасляной кислоты, 2-амино-2циклогексилуксусной кислоты, 2-амино-2-фенилуксусной кислоты, аргинина (Arg), аспарагина (Asn), аспарагиновой кислоты (Asp), цитруллина (Cit), цистеина (Cys), а,а-диметил^-аминомасляной кислоты, в,в-диметил^-аминомасляной кислоты, глутамина (Gln), глутаминовой кислоты (Glu), глицина (Gly), гистидина (His), изолейцина (Ile), лейцина (Leu), лизина (Lys), ε-ацетиллизина (AcLys), метионина (Met) орнитина (От), фенилаланина (Phe), пролина (Pro), серина (Ser), треонина (Thr), триптофана (Trp), тирозина (Tyr), валина (Val). Более конкретно, AA выбирают из аланина (Ala), цитруллина (Cit), глутамина

- 25 035625 (Gln), глицина (Gly), ε-ацетиллизина (AcLys), валина (Val). Последовательность (AA)'_w имеет формулу •-т alk-n-L.

, в которой R26 представляет собой боковую цепь одной из аминокислот, описанных выше.

Примеры последовательностей являются следующими: Gly-Gly, Lys-Phe, Lys-Val, AcLys-Val, CitVal, Lys-Phe-Phe, Lys-Phe-DPhe, Lys-Phe-Gly, Lys-Ala, Ala-Val, Cit-Phe, Cit-Leu, Cit-Ile, Cit-Trp, Ala-Phe, Phe-Ala, Gly-Gly-Gly, Phe-Ala-Gly, Cit-Val-Gly, Cit-Leu-Phe-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly, Leu-Ala-Leu-Ala.

Для Y = C(=O) или (СгС^лкил-С^О) и более конкретно C(=O) или CH₂-C(=O) RCG1-L может представлять собой одну из следующих (V86-101):

RCG1	Примеры RCG1-L
0 ⁰ Ул λΥ 0	О У V^O^ALK--NR_2T(AA)'w- (V86) 0
Ylho^^nr-<^AA)'^W- <^v87> 0
Ό xY ⁰ V % A^ALK-N^AAJ'w- (V88) 0 SO₃H
0 /N-У 0	^y^'ALK-NR^-(AA)'w- (V89) 0
0 J _(V90) 0

- 26 035625

	0 z° A γΑ Ay^nr^alk-nr^aa)^- (V91) V^alA^ 0
zA° AA^^NR2t^⁰^^NR2i(^AA)'^w-(^V92) VsliM 0
1 или В Г	1илиВГ AL или _ALK__NR_(_AAy_w_ (_V93)
0 i^MnnBrx3^_Nf^^0V^_NR__(AA)^_ _(V94)
0 о m^²A 1ил„ВкА 0 yNR^ALK-NR^AAJ'w- (V95)
-nh₂	H₂N-ALK-NR₂₁(AA)'w- (V96)
H₂NAz/OyALK NR₂₅(AA)’w- (V97)
-N₃	N₃— ALK-NR^AA/w- (V98)
_N Yx^O3iALK-NR₂₇(AA)'w- (V99)
0 у z (jA	О ⁰ AY ALK-NR^iAAJ’w- (V100) О
LA ⁰ ALK-NR₂₂ J^OMK'-NR^AAA (V101) Y^z 0 A

в которой (AA)'_w представляет собой последовательность w аминокислот AA, связанных вместе через пептидные связи, как описано выше;

R19, R₂₀, R₂₁, R₂₂, R₂₄ и R₂₅ представляют собой независимо друг от друга атом водорода или (C1ЗДалкильную группу, более конкретно атом водорода или метильную группу.

Линкер L также может быть выбран из проиллюстрированных соединений.

В соответствии с изобретением соединения общей формулы (I), (II) и (III) могут быть получены с помощью следующих способов.

- 27 035625

Способ получения соединений криптофицина.

Общий путь A для получения соединений формулы (I) в случае, когда W=CH2N₃ или CH2NH2

Схема 1

Фрагменты A, B, C и D позволяют получать соединения криптофицина от P1 до P₃ с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (i): образование пептидной связи между фрагментами AD1 и BC в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOAt и HATU.

Стадия (ii): снятие защиты в кислотных условиях с использованием, например, ТФУК и макроциклизация в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOAt и HATU.

Стадия (iii): окисление олефина с образованием эпоксида с использованием, например, м-MCBA.

Стадия (v): восстановление азидогруппы с использованием, например, ТСЕР.

Фрагменты A и B получали в соответствии с синтезом, описанным ниже. Фрагменты C, защищенные в виде метиловых эфиров, являются коммерчески доступными для R4=H, R5=Me(R), R2=R₃=H (номер CAS [92535-26-7]); R=H R5=Me(S), R2=R3=H (номер CAS [118138-56-0]); R=R5=Me, R2=R3=H (номер CAS [25307-82-8]); R2=H, R₃=Me(R), R4=H, R₅=Me(R) (номер CAS [86544-92-5]); R2=H, R₃=Me(S), R4=H, R₅=Me(R) (номер CAS [86544-93-6]); R2=H, R₃=Me(R), R4=R5=Me (номер CAS [1315052-25-5]); R2=H, R3=Me(S), R4=R5=Me (номер CAS [1315050-96-4]); R2=H, R3=iPr(R), R4 R5 Me (номер CAS [1314999-068]); R2=H, R₃=iPr(S), R₄=R₅=Me (номер CAS [1315054-33-1]); R₂=R₃=R₄=R₅=Me (номер CAS [90886-53-6]); R₄ и R₅ образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, циклопропильную группу (номер CAS [914226-26-9]). Они также могут быть получены, как описано в примерах. Коммерчески недоступные фрагменты С получали, как описано в примерах. Все фрагменты D являются коммерчески доступными: L-Fmoc-Ala-OH (номер CAS [35661-39-3]); L-Fmoc-Val-OH (номер CAS [68858-20-8]); LFmoc-трет-Leu-OH (номер CAS [132684-60-7]); L-Fmoc-Leu-OH (номер CAS [35661-60-0]); L-Fmoc-NMeLeu-OH (номер CAS [103478-62-2]); L-Fmoc-3-диметиламино-Ala-OH (номер CAS [587880-86-2]); LFmoc-(Оαллил)Asp-OH (номер CAS [146982-24-3]); L-Fmoc-4-метил-Leu-OH (номер CAS [139551-74-9]). Структурные элементы AD1 и BC получали в соответствии с синтезом, описанным ниже.

- 28 035625

Общий путь B для получения соединений формулы (I) в случае, когда W=CH₂OH, или CH2N₃, или

CH2NH2.

Схема 2

Фрагменты A, B, C и D позволяют получать соединения криптофицина от P2 до P4 с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (ii): снятие защиты в кислотных условиях с использованием, например, ТФУК, макроциклизация в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOAt и HATU и гидролиз ацетата при pH 6-7 с использованием, например, NaOH в смеси воды и AcOEt.

Стадия (iii): защита бензилового спирта в виде силилового эфира с использованием, например, хлортриизопропилсилана в присутствии основания, такого как, например, имидазол; окисление олефина с образованием эпоксида с использованием, например, м-CPBA; снятие защиты силилового эфира с использованием, например, раствора TBAF.

Стадия (iv): азидирование в присутствии ДФФА и основания, такого как, например, DBU.

Стадия (v): восстановление азидогруппы с использованием, например, TCEP.

Фрагменты A и B получали в соответствии с синтезом, описанным ниже. Фрагменты C были или коммерчески доступны, как описано в предыдущем разделе, или получены, как описано в примерах. Все фрагменты D являются коммерчески доступными, как описано в предыдущем разделе. Структурные элементы AD2 и BC получали в соответствии с синтезом, описанным ниже.

- 29 035625

Общий путь C для получения соединений формулы (I) в случае, когда W=CH₂OH, или CH2N3, или

CH2NH2.

Схема 3

Спирт Сакураи и фрагменты B, C и D позволяют получать соединения криптофицина от P2 до P4 с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (i): образование пептидной связи между фрагментами AD3 и альтернативным BC в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOAt и HATU.

Стадия (ii): макроциклизация посредством реакции метатезиса с замыканием цикла в присутствии катализатора, такого как, например, катализатор Граббса I.

Стадия (iii): снятие защиты с п-метоксибензилового эфира в кислотных условиях, таких как, например, 10% ТФУК.

Стадия (iv): окисление спирта с использованием окислителя, такого как, например, TEMPO в присутствии гипохлорита натрия.

Стадия (v): введение эпоксида путем асимметрической реакции Кори-Чайковского с использованием соответственно замещенного полученного на основе изотиоцинеола хирального сульфония в присутствии основания, такого как, например, фосфазеновое основание P₂-Et.

Стадия (vi): восстановление азидогруппы с использованием, например, TCEP.

Спирт Сакураи и фрагмент B получали в соответствии с синтезом, описанным ниже. Фрагменты C были или коммерчески доступны, как описано в предыдущем разделе, или получены, как описано в примерах. Все фрагменты D являются коммерчески доступными, как описано в предыдущем разделе. Структурные элементы AD3 и альтернативный BC получали в соответствии с синтезом, описанным ниже.

- 30 035625

Получение соединений формулы (I) в случае, когда W=CH₂SH.

Схема 4

P₄ позволяет получать другие соединения криптофицина P5 и P6 с помощью стадий, подробно опи санных ниже.

Стадия (i): введение группы хлора с использованием метансульфонилхлорида в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ii): функционализация с использованием тетрабутиламмония триметилсилилтиолата, полученного in situ из TBAF и гексаметилдисилатиана в соответствии с Hu J., et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 4959-496, в ходе данной реакции обычно образуется промежуточный димер, изображенный на схеме 3.

Стадия (iii): восстановление димера с использованием фосфина, такого как, например, TCEP.

Схемы 1, 2, 3 и 4 описывают случаи n=1, но могут также применяться для получения соединений формулы (I) в случае, когда n>1, исходя из P₂, P₃ или P₄ с помощью стадий, подробно описанных ниже и представленных на схеме 2 WO 2011/001052.

Схема 5

Стадия (i): открытие эпоксидного кольца в кислой среде с получением диольной функциональной группы; например, может быть использована концентрированная хлорная кислота.

Стадия (ii): окислительное расщепление диола с использованием, например, периодата натрия.

Стадия (iii): реакция Виттига с использованием подходящего галогенида фосфония, например, бромида и сильного основания, например, BuLi.

Стадия (iv): окисление олефина с образованием эпоксида с использованием, например, м-CPBA.

Стадия (v): снятие защиты силилового эфира с использованием, например, раствора TBAF.

- 31 035625

Получение соединений формулы (I) в случае, когда W=CO₂H.

Схема 6

P4 позволяет получать другие соединения криптофицина P7 и P8 с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (i): окисление с использованием реагента Десса-Мартина.

Стадия (ii): окисление по Пиннику в присутствии 2-метил-2-бутена (Pinnick H.W., Tetrahedron 1981, 37, 2091-2096).

Схема 6 описывает случай n=0, но может также применяться для получения соединений формулы (I) в случае, когда W=(CH₂)nCO2H, исходя из аналога P4, несущего группу (CH₂)_n+1OH. Схемы 1, 2, 3, 4, 5 и 6 приведены для линкера в пара-положении, но могут одинаково применяться для орто- или метаположений. Аналогично, они даны для соединения криптофицина, но могут также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D₁₉.

Способ получения нагрузок криптофицина.

Соединения формулы (II) могут быть получены в соответствии со схемой 7, исходя из соединения криптофицина формулы (I) и прекурсора линкера (LP).

Схема 7

W представляет собой (С1-С₆)алкил-ЫН(К41), более конкретно (CH₂)_nNHR₁₁;

(С1-С₆)алкил-ОН, более конкретно (CH₂)_nOH;

(С1-С₆)алкил^Н, более конкретно (CH₂)_nSH;

СО2Н;

(С1-С₆)алкил-СО₂Н, более конкретно (CH₂)_nCO₂H; или (С1-С₆)алкил-И₃, в которой R11 представляет собой атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу, более конкретно метильную группу.

Прекурсор линкера LP имеет функциональную группу введения прекурсора линкера L в соединение криптофицина после реакции между группой W и химической функциональной группой, присутствующей на LP.

В схеме 7 может потребоваться несколько стадий и/или реакций для получения полезной нагрузки криптофицина (II), исходя из соединения криптофицина (I). Например, в случае, когда Z_aR_a = -O-NHS, линкер L, для которого Z_aR_a = -O-аллил, может быть введен с использованием соответствующего прекурсора линкера с последующим снятием защитной группы со сложноэфирной функциональной группы и введением -O-NHS. Снятие защитной группы может быть выполнено с помощью обработки палладиевым катализатором, например Pd(PPh₃)₄, в присутствии акцепторного амина, например морфолина; активация может быть проведена с помощью ДСК в присутствии основания, такого как, например, DIEA или с NHS, в присутствии связывающего агента, такого как, например, ДЦК. Данное превращение группы Z_aR_a в другую группу Z_aR_a (например, -O-аллил ^ O-NHS) может быть применено для получения других групп ZaRa, в частности, описанных ранее.

Схема 7' аналогичным образом иллюстрирует получение соединения криптофицина, содержащего линкер, несущий, соответственно, малеимидо, галогенацетамидо, амино или азидогруппу (L* представляет собой фрагмент линкера такой, что L = -Ь*-малеимидо, или L = й*-галогенацетамидо, или L = -L*NH2-, или L = -L*-N₃).

- 32 035625

Схема 7'

Данные соединения получают взаимодействием между соединением криптофицина, содержащим линкер L', содержащий аминогруппу, и модифицирующим агентом для введения соответственно малеимидо, галогенацетамидо, амино или азидогруппы.

Соединения формулы (II) можно альтернативно получить в соответствии со схемой 8, исходя из того же соединения криптофицина формулы (I) и другого прекурсора линкера (LP').

Схема 8

В схеме 8 может потребоваться несколько стадий и/или реакций для поступления полезной нагрузки криптофицина (II), исходя из соединения криптофицина (I). Например, в случае, когда Z_aR_a = -O-NHS, может быть введен защищенный прекурсор линкера L' с последующим снятием защитной группы и связыванием с прекурсором линкера L для введения функциональной группы карбоновой кислоты, который могут непосредственно активировать до Z_aR_a = -O-NHS или сначала снять защитную группу и затем активировать (L' и L представляют собой фрагменты линкера такие, что L=L'-L). Снятие защитной группы может быть проведено с помощью обработки основанием, например пиперидином; связывание с линкером L может протекать через раскрытие циклического ангидрида, например глутарового ангидрида; активация может быть проведена с помощью ДСК в присутствии основания, такого как, например, DIEA или с NHS, в присутствии связывающего агента, такого как, например, ДЦК.

Примером реакции между группой W и химической функциональной группой, присутствующей на LP, является амидирование или между прекурсором линкера LP, несущим функциональную группу карбоновой кислоты, и W=(CH2)nNH2, или между прекурсором линкера LP, несущим функциональную группу амина, и W=CO2H или (CH2)nCO2H; данная реакция может быть проведена в присутствии связывающего агента, такого как, например, EDCI или HOBt. Также возможно взаимодействие прекурсора линкера LP, несущего функциональную группу амина, и W'=(СН₂)_nO-C(=O)-O-(4-нитрофенила), полученного из W=(CH2)nOH и п-нитрофенилхлорформиата (активация спирта в форме карбоната) в соответствии со схемой ниже (R₁₇=H или (^-^алкил):

-NHR₁₇+крипто-(CH₂)_nO-C(=O)-O-(4-нитрофенил) ^ крипто-(СН₂)_пО-С(=О)-КК.₁₇-.

Подобная реакция также может быть проведена между прекурсором линкера LP, несущим спиртовую функциональную группу, активированную в виде карбоната, и W=(CH2)nNH2. Другим примером реакции является этерификация между прекурсором линкера, несущим спиртовую функциональную группу, и W=CO₂H или (CH₂)_nCO₂H; данная реакция может быть проведена в присутствии связывающего агента, такого как, например, MNBA. Другим примером реакции является катализируемое медью азидалкинное циклоприсоединение между прекурсором линкера, несущим алкиновую функциональную группу, и W=(CH2)N₃; данная реакция может быть проведена в присутствии сульфата меди и аскорбата натрия.

- 33 035625

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH2)2NH2 и L=(IV1) с n=1, R₁₅=H и

ALK=(CH2)₃ на основе схемы 7.

Схема 9

Стадия (i): образование пептидной связи в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, EDC и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ii): снятие защитной группы с аллилового эфира в присутствии катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий.

Стадия (iii): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира с помощью обработки ДСК в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH2)_nNH2 и L=(IV1) с n=1, R11=H и ALK=(CH2)₃ на основе схемы 8.

Схема 10

Стадия (i): образование пептидной связи в присутствии связывающих реагентов, таких как, напри- 34 035625 мер, EDC и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ii): снятие защитной группы Fmoc с амина в присутствии основания, такого как, например, пиперидин.

Стадия (iii): связывание с глутаровым ангидридом.

Стадия (iv): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира с помощью обработки ДСК в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Схемы 9 и 10 описывают случай L(IV1) с n=1, R11=H и ALK=(CH₂)₃, но они могут также применяться к другим линкерам L с RCG1=C(=O)ONHS, а именно к случаю L(IV1) с nv1, и/или R11^H, и/или ALK^(CH₂)₃ и случаям L(IV2) и L(IV3). Они предоставлены для линкера в пара-положении, но могут одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, они приведены для соединения криптофицина, но могут также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D19.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)_nNH₂ с n=1, R11=H и RCG1=малеимидо, галогенацетамидо, NH2, N3 или циклооктин, а именно линкеров L(IV4)-L(IV17).

Схема 11

Стадия (i): образование пептидной связи в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, EDC и HOBt и основания, такого как, например, DIEA.

Схема 11 описывает случаи L(IV4) с n=1, R11=H и ALK=(CH2)5, L(IV8) с n=1 и R_n=H, L(IV12) с n=1, R11=H и ALK=(CH₂)₄, L(IV14) с n=1, R11=H и ALK=(CH₂)₃ и L(IV16) с n=1, R_n=H, ALK=(CH₂)₃ и ALK'=(CH₂)₂, но она может также применяться к другим линкерам L(IV4)-L(IV17) с RCG1=малеимидо, иодацетамидо, NH2, N3 или циклооктин. Она приведена для реакционноспособной группы иодацетамидо, но может одинаково применяться для реакционноспособной группы бромацетамидо. Она предоставлена для линкера в пара-положении, но может одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, она приведена для соединения криптофицина, но может также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D₁-D₁9.

- 35 035625

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)nX с X=O или S и L=(IV18) с n=1, R₁₇ и R₁₈=H и ALK=(CH2)₃ на основе схемы 7.

Схема 12

Стадия (i): активация бензилового спирта или бензилового тиола в виде п-нитрофенил(тио)карбоната с помощью обработки п-нитрофенилхлорформиатом в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ii): образование (тио)карбамата с помощью взаимодействия с амином в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iii): снятие защитной группы с аллилового эфира в присутствии катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)_nX с X=O или S и L=(IV18) с n=1, R₁₇и R18=H и ALK=(CH2)3 на основе схемы 8.

Схема 13

- 36 035625

Стадия (i): образование (тио)карбамата с помощью взаимодействия с амином в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Схемы 12 и 13 описывают случай L(IV18) с n=1, R₁₇ и R₁₈=H и ALK=(CH₂)₃, но они могут также применяться к другим линкерам L с RCG1=C(=O)ONHS, а именно к случаю L(IV18) с пР, и/или R₁₇, R₁₈^H, и/или ALK^(CH₂)₃ и случаям L(IV19) и L(IV20). Они предоставлены для линкера в параположении, но могут одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, они приведены для соединения криптофицина, но могут также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D₁-D₁₉.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)_nX с X=O или S и RCG1=мαлеимидо, галогенацетамидо, NH₂, N₃ или циклооктин, а именно линкеров L(IV21)-(IV34).

Схема 14

реакцию проводят в присутствии основания, такого как,

Стадия (i): образование (тио)карбамата, например, DIEA.

Схема 14 описывает случай L(IV21) с n=1, R₁₇ и R₁₈=H и ALK=(CH₂)₅, случай L(IV25) с n=1 и R17 и R18=H, случай L(IV29) с n=1, R_n и Ri8=H и ALK=(CH2)₄, случай L(IV31) с n=1, R_n и Ri8=H и АЬК=(СН2)з и случай L(IV33) с n=1, R₁₇, R₁₈ и R₂₂=H, ALK=(CH₂)₃ и ALK'=(CH₂)₂, но она может также применяться к другим линкерам L(IV21-34) с RCG1=мaлеимидо, иодацетамидо, NH₂, N₃ или циклооктин. Она приведена для реакционноспособной группы иодацетамидо, но может одинаково применяться для реакционноспособной группы бромацетамидо. Она предоставлена для линкера в пара-положении, но может одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, она приведена для соединения криптофицина, но может также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D19.

- 37 035625

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH2)nNH2 и L=(IV35) с n=1,

Rii=Ri4=Ri5=Ri6=H, Ji=J2=J3=J4=CH и ALK=(CH2)3 на основе схемы 7.

Схема 15

Стадия (i): образование карбамата, реакцию проводят в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)_nNH₂ и L=(IV35) с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₄=J₄=CH и ALK=(CH2)₃ на основе схемы 8.

Схема 16

Рз

Стадия (i): образование карбамата, реакцию проводят в присутствии основания, такого как, например, DIEA в присутствии подходящего реагента п-нитрофенилкарбоната.

Схемы 15 и 16 описывают случай L(IV35) с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензило

- 38 035625 вым спиртом и ALK=(CH₂)₃, но они могут также применяться к другим линкерам L с RCG1=C(=O)ONHS, а именно к случаю L(IV35) с n^1, и/или R11, R₁₄, R₁₅, R₁₆^H, и/или J_1? J2, J₃, J₄^CH, и/или ортобензиловым спиртом, и/или ALKv(CH₂)₃ и случаям L(IV36) и L(IV37). Они предоставлены для линкера в пара-положении, но могут одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, они приведены для соединения криптофицина, но могут также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D19.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)_nNH₂, с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH и RCG1=малеимидо, галогенацетамидо, NH2, N₃ или циклооктин, а именно линкеров L(IV38)-L(IV151).

Схема 17

Стадия (i): образование карбамата, реакцию проводят в присутствии основания, такого как, например, DIEA, в присутствии подходящего реагента п-нитрофенилкарбоната.

Схема 17 описывает случаи L(IV38) с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₅, L(IV42) с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, и парабензиловым спиртом, L(IV46) с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₄, L(IV48) с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₃ и L(IV50) с n=1, R₁₁=R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₂₂=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом, ALK=(CH₂)₃ и ALK'=(CH₂)₂, но она может также применяться к другим линкерам L(IV38)-L(IV51) с RCG1=малеимидо, иодацетамидо, NH2, N₃ или циклооктин. Она приведена для парабензилового спирта, но она может также применяться для ортобензилового спирта. Она приведена для реакционноспособной группы иодацетамидо, но может одинаково применяться для реакционноспособной группы бромацетамидо. Она предоставлена для линкера в пара-положении, но может одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, она приведена для соединения криптофицина, но может также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D19.

- 39 035625

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)nX с X=O или S и L=(IV52) с n=1,

R14=R15=R16=R17=R18=H, Ji=J2=J3=J4=CH и ALK=(CH2)n на основе схемы 7.

Схема 18

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)_nX с X=O или S и L=(IV52) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH и ALK=CH₂)₃ на основе схемы 8.

Схема 19

Рю

Схемы 18 и 19 описывают случай L(IV52) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₃, но они могут также применяться к другим линкерам L с RCG1=C(=O)ONHS, а именно к случаю L(IV52) с п^1, и/или R₁₄, R₁₅, R₁₆, R₁₇, R₁₈^H, и/или J1, J₂, J₃, J₄^CH, и/или ортобензиловым спиртом, и/или ALK^(CH₂)₃ и случаям L(IV53) и L(IV54). Они предоставлены для линкера в пара-положении, но могут одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, они приведены для соединения криптофицина, но могут также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D₁₉.

- 40 035625

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=(CH₂)nX с X=O или S и RCG1=MareuMugo, галогенацетамидо, NH2, N₃ или циклооктин, а именно линкеров L(IV55)-(IV68).

Схема 20

Схема 20 описывает случай L(IV55) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H, J₁=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом, ALK=(CH2)2 и ALK'=(CH₂)₅, случай L(IV59) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH2)2, случай L(IV63) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом, ALK=(CH2)2 и ALK'=(CH2)4, случай L(IV65) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом, ALK=(CH2)2 и ALK'=(CH2)₃ и случай L(IV67) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₁₇=R₁₈=R₂₂=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом, ALK=(CH2)2, ALK'=(CH₂)₅ и ALK=(CH₂)₂, но она может также применяться к другим линкерам L(IV55-68) с RCG1=малеимидо, иодацетамидо, NH2, N₃ или циклооктин. Она приведена для реакционноспособной группы иодацетамидо, но может одинаково применяться для реакционноспособной группы бромацетамидо. Она предоставлена для линкера в пара-положении, но может одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, она приведена для соединения криптофицина, но может также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D₁₉.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=C(=O)O и L=(IV69) с R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH и ALK=(CH2)₃ на основе схемы 7.

Схема 21

- 41 035625

Стадия (i): этерификация в присутствии связывающего реагента, такого как, например, MNBA и основания, такого как, например, ДМАП и DIEA.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=C(=O)O и L=(IV69) с R14=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J4=CH и ALK=(CH2)₃ на основе схемы 8.

Схема 22

Стадия (i): этерификация в присутствии связывающего реагента, такого как, например, MNBA, и основания, такого как, например, ДМАП и DIEA.

Схемы 21 и 22 описывают случай L(IV69) с R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₃, но они могут также применяться к другим линкерам L с RCG1=C(=0)ONHS, а именно к случаю L(IV69) с R₁₄, R₁₅, R₁₆^H, и/или J1, J₂, J₃, J₄^CH, и/или ортобензиловым спиртом, и/или ALK^(CH₂)₃ и случаям L(IV70) и L(IV71). Они предоставлены для линкера в пара-положении, но могут одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, они приведены для соединения криптофицина, но могут также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D19.

- 42 035625

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=C(=O)O с R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH и

RCG1=малеимидо, галогенацетамидо, NH2, N₃ или циклооктин, а именно линкеров L(IV72)-L(IV85).

Схема 23

Схема 23 описывает случаи L(IV72) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₅, L(IV76) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, и парабензиловым спиртом, L(IV80) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₄, L(IV82) c n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом и ALK=(CH₂)₃ и L(IV84) с n=1, R₁₄=R₁₅=R₁₆=R₂₂=H, J1=J₂=J₃=J₄=CH, парабензиловым спиртом, ALK=(CH₂)₃ и ALK'=(CH₂)₂, но она может также применяться к другим линкерам L(IV72)-L(IV85) с RCG1=малеимидо, иодацетамидо, NH2, N₃ или циклооктин. Она приведена для парабензилового спирта, но она может также применяться для ортобензилового спирта. Она приведена для реакционноспособной группы иодацетамидо, но может одинаково применяться для реакционноспособной группы бромацетамидо. Она предоставлена для линкера в параположении, но может одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, она приведена для соединения криптофицина, но может также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D19.

- 43 035625

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=C(=O)O и L=(V86) с R₂₅=H и ALK=(CH₂)₇.

Схема 24

Стадия (i): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира с помощью обработки ДСК в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ii): образование пептидной связи в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Схема 24 описывает случай L(V86) с R₂₅=H и ALK=(CH₂)7, но она может также применяться к другим линкерам L с RCG1=C(=O)ONHS, а именно к случаю L(V86) с R₂₅^H и/или ALK^(CH₂)₇ и случаям L(V87) и L(V88). Она предоставлена для линкера в пара-положении, но может одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, она приведена для соединения криптофицина, но может также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D1-D19.

Получение соединений формулы (II) в случае, когда W=C(=O)O с R₃₀=H и RCG1=мαлеимидо, галогенацетамидо, NH₂, N3 или циклооктин, а именно линкеров L(V89)-L(V101).

Схема 25

Стадия (i): образование пептидной связи в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

- 44 035625

Стадия (ii): восстановление азидо с помощью обработки восстановителем, таким как, например,

TCEP.

Схема 25 описывает случаи L(V89) с R₂₅=H и ALK=(CH₂)₅, L(V93) с R₂₅=H и ALK=(CH₂)₃, L(V96) с R₂₅=H и ALK=(CH₂)₄, L(V98) c R₂₅=H и ALK=(CH₂)₃ и L(V100) с R₂₂=R₂₅=H, ALK=(CH₂)₃ и ALK'=(CH₂)₂, но она может также применяться к другим линкерам L(V89)-L(V101) с RCG1=мαлеимидо, иодацетамидо, NH₂, N₃ или циклооктин. Она приведена для реакционноспособной группы иодацетамидо, но может одинаково применяться для реакционноспособной группы бромацетамидо. Она предоставлена для линкера в пара-положении, но может одинаково применяться для орто- или мета-положений. Аналогичным образом, она приведена для соединения криптофицина, но может также применяться для получения других соединений формулы (I), в частности D₁-D₁₉.

Способ получения конъюгатов криптофицина.

Соединения формулы (III) могут быть получены в соответствии со схемой 26, исходя из полезной нагрузки криптофицина формулы (II) и антитела (Ab).

Схема 26

в которой

Y представляет собой (C₁-C₆)aлкил-NR₁₁ или (C₁-C₆)алкил-O или (ДА^алкилД или, альтернативно, Y представляет собой C(=O)O или Ο^^^^λΑ^Ο^;

или, альтернативно, Y представляет собой (C₁-C₆)aлкил-триазол-подобный

Ν=Ν (C_fC₆)alkyr^N/^S .

R11 представляет собой атом водорода или (Д-^алкильную группу;

L представляет собой линкер, расположенный в орто- (о), мета- (м) или пара- (п) положении фенильного ядра, как определено выше;

Ab представляет собой антитело.

Способ получения структурных элементов для синтеза соединений криптофицина формулы (I).

Общий синтез фрагмента A.

Схема 27

Фрагмент A может быть получен за 12 стадий, исходя из соответствующих гидроксиэфиров, с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (i): защита спирта в виде п-метоксибензилового эфира с использованием пметоксибензилового спирта, активированного в виде трихлорацетимидата, в присутствии каталитического количества кислоты, такой как, например, п-TsOH.

Стадия (ii): восстановление сложного эфира с использованием восстановителя, такого как, например, боргидрид лития.

Стадия (iii): окисление спирта с использованием окислителя, такого как, например, TEMPO, в присутствии гипохлорита натрия.

- 45 035625

Стадия (iv): диастереоселективное аллилирование с использованием аллилтрибутилолова в присутствии тетрахлорида олова.

Стадия (v): кросс-метатезис с использованием трет-бутилакрилата в присутствии катализатора, такого как, например, катализатор Граббса II.

Стадия (vi): снятие защитной группы с п-метоксибензилового эфира с использованием ЦАН и последующая обработка этандитиолом в присутствии каталитического количества кислоты, такой как, например, п-TsOH.

Стадия (vii): защита спиртов в виде силиловых эфиров с использованием хлортриэтилсилана в присутствии основания, такого как, например, имидазол.

Стадия (viii): окисление по Сверну с использованием ДМСО и оксалилхлорида в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ix): реакция Виттига с использованием подходящего галогенида фосфония, например бромида, и сильного основания, такого как, например, BuLi.

Стадия (x): снятие защитной группы с силилового эфира с использованием, например, раствора TBAF.

Стадия (xi): окисление бензилового спирта с использованием окислителя, такого как, например, оксид марганца.

Стадия (xii): изомеризация двойной связи с использованием AIBN в присутствии бензолтиола.

Гидроксиэфиры являются коммерчески доступными для R₁=Me (номер CAS [72657-23-9]), Et (номер CAS [72604-81-0]) и iPr (номер CAS [72604-82-1]). Получение галогенидов фосфония описано в WO 2011/001052.

Общий синтез фрагмента B.

Схема 28

Фрагмент B может быть получен за 2 стадии, исходя из соответствующих аминокислот, с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (i): защита амина с помощью обработки Boc₂O в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (ii): омыление метилового эфира с использованием основания, такого как, например, LiOH.

Аминокислоты, защищенные в виде метиловых эфиров, являются коммерчески доступными для R=3-Cl, 4-OMe (номер CAS [704870-54-2]); 3-Cl, 4-OEt (номер CAS [1256963-00-9]); 3-Cl, 4-OPr (номер CAS [1259709-59-9]); 3-Cl, 4-OMe, 5-F (номер CAS [1213670-98-4]); 3-Cl, 4-OMe, 5-Cl (номер CAS [1259701-42-2]); 3-Cl, 4-OMe, 5-OMe (номер CAS [1212820-34-2]); 3-Cl, 4-OH, 5-OMe (номер CAS [1213426-93-7]); 3-Cl, 4-NH2 (номер CAS [1213672-64-0]); 2-Cl, 3-Cl, 4-NH2 (номер CAS [1213607-49-8]); 3-Cl, 4-NH2, 5-F (номер CAS [1213400-66-8]); 3-Cl, 4-NH2, 5-Cl (номер CAS [1213480-30-8]).

Общий синтез структурного элемента AD1.

Схема 29

(iv)

Фрагменты A и D позволяют получить структурный элемент AD1 с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (i): этерификация фрагмента D фрагментом A в присутствии связывающего реагента, такого как, например, MNBA, и основания, такого как, например, ДМАП и DIEA.

Стадия (ii): восстановление альдегида в спирт с использованием восстановителя, такого как, например, триметоксиборгидрид натрия.

Стадия (iii): активация спирта в виде мезилата с помощью обработки метансульфонилхлоридом в присутствии основания, такого как, например, ТЭА; замещение мезилата азидогруппой с помощью обра- 46 035625 ботки азидом натрия.

Стадия (iv): снятие защитной группы с амина с помощью обработки основанием, таким как, например, пиперидин.

Общий синтез структурного элемента AD2.

Схема 30

Фрагменты A и D позволяют получить структурный элемент AD2 с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (iii): снятие защитной группы с амина с помощью обработки основанием, таким как, напри мер, пиперидин.

Общий синтез структурного элемента AD3.

Схема 31

Стадия (i): этерификация фрагмента D спиртом Сакураи в присутствии связывающего реагента, такого как, например, MNBA, и основания, такого как, например, ДМАП и DIEA.

Стадия (ii): снятие защитной группы с амина с помощью обработки основанием, таким как, напри мер, пиперидин.

Общий синтез структурного элемента BC.

Схема 32

Фрагменты B и C позволяют получить структурный элемент BC с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (i): образование пептидной связи фрагмента B с фрагментом C в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOBt и EDC, и основания, такого как, например, DIEA.

Общий синтез альтернативного структурного элемента BC.

Схема 33

Фрагменты B и C позволяют получить альтернативный структурный элемент BC с помощью стадий, подробно описанных ниже.

- 47 035625

Стадия (ii): снятие защитной группы Boc в кислых условиях с использованием, например, ТФУК.

Стадия (iii): образование акриламида с помощью обработки акрилоилхлоридом в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iv): омыление метилового эфира с использованием основания, такого как, например, tBuOK.

Получение прекурсоров линкера LP.

LP может представлять собой один из следующих: LP1-LP101 описаны с использованием Lаминокислот, но могут также применяться D-аминокислоты. Они приведены для w=2, но могут аналогичным образом применяться к w>2, повторяя столько раз, сколько потребуется, стадию образования пептидной связи.

LPi

RbZbOC-ALK ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Fmoc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): снятие защитной группы с амина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии основания, такого как, например, пиперидин.

Стадия (iii): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EDC.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/C I₃CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; дикислоты, монозащищенные в виде аллилового эфира, являются коммерчески доступными для n=2 (моноаллилсукцинат) или могут быть получены с помощью переэтерификации метиловых или трет-бутиловых моноэфиров, которые являются коммерчески доступными для n=2-6.

RbZbOC-ALK-(OCH₂CH₂)i п полученный в соответствии со схемой ниже

lp₂

Стадия (iii): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, ДЦК на подложке.

- 48 035625

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/СН₃СЫ.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; ПЭГ-дикислоты, монозащищенные в виде аллилового эфира, могут быть получены в соответствии со схемой ниже:

когда ALK=CH2CH2

когда ALK / CH2CH2

Стадия (i): удлинение ПЭГ-цепи; реакцию проводят в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или ДМФ, с помощью обработки ненасыщенной защищенной кислоты алкоксидом, полученным действием натрия в каталитическом количестве.

Стадия (ii): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. В последнем случае может быть образован трифторацетат спиртовой функциональной группы, присутствующей в структуре. Данный трифторацетат расщепляется в течение следующей стадии (iii).

Стадия (iii): защита карбоновой кислоты в виде метилового эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как MeOH, с помощью обработки триметилсилилдиазометаном.

Стадия (iv): омыление метилового эфира; реакцию проводят в смеси полярных растворителей, такой как смесь ТГФ/Н₂О, в присутствии LiOH.

Стадия (v): защита карбоновой кислоты в виде аллилового эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии аллилового спирта, связывающего агента, такого как, например, EDC, и основания, такого как, например, ДМАП.

Стадия (vi): удлинение ПЭГ-цепи; реакцию проводят в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или ДМФ, с помощью обработки галогенированного эфира алкоксидом ПЭГ-диола, монозащищенного в виде эфира ТГФ. Получение данного типа монозащищенного ПЭГ-диола подробно описано в литературе: см., например, Richard A., et al., Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 или Sakellariou E.G., et al., Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Исходные ПЭГ-диолы являются коммерчески доступными для i=3-12.

О R₂₇ и о

RbZbOC^KA^^

SO₃H ^Н О R'₃ ^Lp3 > полученный в соответствии со схемой ниже

- 49 035625

Стадия (i): образование пептидной связи между 1л1К)с-1.-аминокислотой-ОХ1^ и L-аминокислотой;

реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (iii): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМФ/Н2О, с помощью обработки Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CHsCN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; сульфодикислоты, монозащищенные в виде аллиловых эфиров, могут быть получены в соответствии со схемой ниже

альтернативно, когда ALK=CH2CH2

Стадия (i): защита карбоновой кислоты в виде аллилового эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии аллилового спирта, связывающего агента, такого как, например, EDC, и основания, такого как, например, ДМАП;

Стадия (ii): α-сульфирование карбоновой кислоты; реакцию проводят при 75°С в полярном апротонном растворителе, таком как ДХЭ, с помощью обработки хлорсульфоновой кислотой, в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iii): образование фрагмента карбоновой кислоты; реакцию проводят с помощью обработки гидроксидом натрия.

Стадия (iv): замещение бромида тиоацетилом; реакцию проводят при -20°С в полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ, с использованием тиоуксусной кислоты в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (v): образование фрагмента сульфоновой кислоты; реакцию проводят при КТ с помощью обработки пероксидом водорода и уксусной кислотой.

Цианокарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для n=1-12.

lp₄ ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Fmoc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/II2O, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CHsCN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидокарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для n=1-12.

- 50 035625 п полученный в соответствии со схемой ниже о

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/C^CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидокислоты являются коммерчески доступными для ALK=ALK'=CH₂CH₂ и i=1-7 и могут быть получены иным образом в соответствии со схемой ниже:

когда ALK=ALK'=CH₂CH₂ и i>7

когда ALK^CH₂CH₂ и ALK-CH2CH2 когда ALK=CH2CH2 и ALK’^CH₂CH₂ когда ALK и ALK'^CH₂CH₂

- 51 035625

Стадия (ii): реакция Мицунобу на малеимиде; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ, с помощью обработки малеимида ПЭГ-гидроксикислотой в присутствии PPh₃ и DIAD.

Стадия (iii): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (iv): удлинение ПЭГ-цепи; реакцию проводят в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или ДМФ, с помощью обработки галогенированного эфира алкоксидом ПЭГ-диола, монозащищенного в виде эфира ТГФ. Получение данного типа монозащищенного ПЭГ-диола подробно описано в литературе, см., например, Richard A., et al., Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 или Sakellariou E.G., et al., Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Стадия (v): селективное снятие защитной группы с эфира ТГФ; реакцию проводят в полярном протонном растворителе, таком как MeOH, с использованием каталитического количества ацетилхлорида.

Стадия (vi): активация спирта в виде мезилата; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки метансульфонилхлоридом в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (vii): нуклеофильное замещение; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДМФ, в присутствии основания, такого как, например, гидрид натрия.

Стадия (viii): защита спирта в виде бензилового эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ, с помощью обработки бензилбромидом в присутствии основания, такого как, например, гидрид натрия.

Стадия (ix): снятие защитной группы со спирта с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане).

Стадия (x): снятие защитной группы со спирта с помощью гидрогенолиза в присутствии катализатора, такого как, например, палладий на угле.

Исходные ПЭГ-диолы являются коммерчески доступными для i=3-12. Исходные ALK-диолы являются коммерчески доступными для n=1-12.

^полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (iii): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном рас- 52 035625 творителе, таком как смесь ДМФ/Н2О, с помощью обработки Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/ОI₃CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидоциклогексанкарбоновая кислота является коммерчески доступной для ALK=CH2 и может быть получена иным образом в соответствии со схемой ниже.

Когда n=2-4

0 о о

Когда n>4

Стадия (i): гидрирование; реакцию проводят при 60°С в уксусной кислоте в присутствии катализатора, такого как оксид платины, под давлением водорода, например, 60 фунт/кв.дюйм.

Стадия (ii): защита амина; реакцию проводят в полярном протонном растворителе, таком как смесь диоксан/H₂O, с помощью обработки бензилхлорформиатом в присутствии основания, такого как, например, NaOH.

Стадия (iii): защита карбоновой кислоты; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки трет-бутанолом в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EDC, и основания, такого как, например, ДМАП.

Стадия (iv): снятие защитной группы с амина; реакцию проводят с помощью гидрогенолиза в полярном протонном растворителе, таком как MeOH, в присутствии катализатора, такого как, например, палладий.

Стадия (v): введение фрагмента малеимидо; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДМФ, с помощью обработки малеиновым ангидридом в присутствии NHS и связывающего реагента, такого как, например, EDC.

Стадия (vi): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (vii): катализируемое палладием образование связи; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ, с помощью обработки бром-ALK-цианопроизводным в присутствии хлорида лития, цинка и триметилхлорсилана и катализатора, такого как, например, тетракис(трифенилфосфин)палладий.

Подходящие бром-ALK-цианопроизводные являются коммерчески доступными для n=1-12.

lp₇ ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 53 035625

Стадия (i): образование пептидной связи между Fmoc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой;

реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (iii): α-сульфирование карбоновой кислоты; реакцию проводят при 75°С в полярном апротонном растворителе, таком как ДХЭ, с помощью обработки хлорсульфоновой кислотой в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iv): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят при КТ в полярном растворителе, таком как смесь ДМФ/Н₂О, с помощью обработки ^№-дисукцинимидилкарбонатом в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (v): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/ChCN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидокислоты являются коммерчески доступными для n=1-12.

lp₈ он ' полученный в соответствии со схемой ниже 'й ϊ ^{χ н} о к

Стадия (iii): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/C I3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; N-сукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными.

п полученный в соответствии со схемой ниже

lp₉

Стадия (iii): образование связи и активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; образование связи N-сукцинимидилбромо- и иодоацетата с аминокарбоновой кислотой проводят при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/ДМФ, с последующим добавлением N,N'дисукцинимидилкарбоната и основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в

- 54 035625 полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CI I3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; N-сукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными, аминокарбоновые кислоты также для n=1-12 и Nметилированные аминокарбоновые кислоты для n=1-7.

/_он ^н О ^R9 ₈ ^LP1° ²⁸ ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Fmoc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (iii): образование связи и активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; образование связи N-сукцинимидилбромо- и иодоацетата с аминокарбоновой кислотой проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/ДМФ, с последующим добавлением N,N'дисукцинимидилкарбоната и основания, такого как, например, DIEA.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; N-сукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными; в случае, когда ALK=CH2CH2 и R₂₀=H, амино-ПЭГкарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для i=1-6 и иным образом могут быть получены из трет-бутилакрилата и соответствующего амино-ПЭГ-спирта; в случае, когда ALK^CH2CH2, они могут быть получены в соответствии со схемами ниже:

в случае, когда ALK=CH2CH2 и R₂₀^H

в случае, когда ALK^CH2CH2, в случае, когда R₂₀=H

в случае, когда R₂(CH

Стадия (i): защита амина; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки амина ди-трет-бутилдикарбонатом в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (ii): защита карбоновой кислоты; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки трет-бутанолом в присутствии связывающего реагента, такого

- 55 035625 как, например, EDC, и основания, такого как, например, ДМАП.

Стадия (iii): алкилирование атома азота; реакцию проводят в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ, с помощью обработки основанием, таким как гидрид натрия, в присутствии реагента, содержащего уходящую группу, такую как галогенид.

Стадия (iv): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (v): удлинение ПЭГ-цепи; реакцию проводят в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или ДМФ, с помощью обработки галогенированного эфира алкоксидом бензофенонимин-ПЭГ-спирта, полученного посредством действия гидрида натрия или нафталинида калия, как описано в WO 2007/127440.

Стадия (vi): омыление сложного эфира; реакцию проводят с помощью взаимодействия сложного эфира с LiOH в присутствии H₂O.

Амино-ПЭГ-спирты являются коммерчески доступными, например, для i=3, 4, 7, 8 или могут быть получены из ПЭГ-диолов, которые являются коммерчески доступными для i=3-12 в соответствии с методикой, описанной в US 7230101. Защиту функциональной аминогруппы бензофеноном можно проводить с помощью азеотропной дегидратации в присутствии кислоты Льюиса, такой как эфират BF₃.

п полученный в соответствии со схемой ниже

LP

Стадия (ii): снятие защитной группы Fmoc с амина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии основания, такого как, например, пиперидин.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CHXN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; N-сукцинимидилбромо- и доступными; амино-(гетеро)арилкарбоновые кислоты являются 4-амино-2-бензойная кислота, 6-амино-3-пиридинкарбоновая кикислота, 2-амино-5-пиримидинкарбоновая кислота или 6-аминоиодоацетаты являются коммерчески коммерчески доступными, например слота, 5-амино-2-пиразинкарбоновая 1,2,4,5-тетразинкарбоновая кислота.

’ полученный в соответствии со схемой ниже

LP

- 56 035625

Стадия (i): образование пептидной связи между 1ч11ос-к-а\ишокислотой-ОУ1 IS и L-аминокислотой;

реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГ Ф/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; аминокарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для n=1-11.

. 9 ^R27 μ О

LP13 θ ^R2S ..

¹³ ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между 1тос^-аминокислотой-ОХ№ и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/^О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; в случае, когда ALK=CH2CH2, Fmoc-защищенные амино-ПЭГ-карбоновые кислоты являются коммерчески доступными для i=1-6 и иным образом могут быть получены из трет-бутилакрилата и соответствующего амино-ПЭГспирта; в случае, когда ALK^CH₂CH₂, они могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LPio. Защита функциональной аминогруппы Fmoc-группой может быть реализована с помощью обработки FmocOSu (номер CAS [82911-69-1]) в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

о r_{27 н} о ^Ν3ΆΙ.Κ^ν ^Ν ^-^ΌΗ

Τ D . θ ^R28 - ___ ^ЬР14 ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Fmoc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГ Ф/^О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

- 57 035625

Стадия (iii): введение азидогруппы; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ацетон/H₂O, с помощью обработки азидом натрия.

Стадия (iv): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EDC.

Стадия (v): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CI I3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; бромокарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для n=1-11.

LPi₅ ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Fmoc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/I СО в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; азидо-ПЭГ-кислоты могут быть получены в соответствии со схемами ниже:

когда ALK=CH2CH2

когда Al .K / Cl CCI С

Стадия (ii): активация спиртовой функциональной группы; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как ДХМ, с использованием метансульфонилхлорида в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (iii): замещение мезилата азидогруппой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ацетон/И₂О, с помощью обработки азидом натрия.

- 58 035625

Стадия (iv): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане).

Стадия (v): удлинение ПЭГ-цепи; реакцию проводят в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или ДМФ, с помощью обработки галогенированного эфира алкоксидом ПЭГ-диола, монозащищенного в виде эфира ТГФ, алкоксида, полученного, например, с гидридом натрия. Получение данного типа монозащищенного ПЭГ-диола подробно описано в литературе, см., например, Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 или Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

Стадия (vi): омыление метилового эфира; реакцию проводят при КТ в смеси полярных растворителей, такой как смесь ТГФ/Н₂О, в присутствии LiOH.

Исходные ПЭГ-диолы являются коммерчески доступными для i=3-12; бромметиловые эфиры являются коммерчески доступными для n=1-12.

' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (iii): образование связи циклооктина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как ДХМ.

Стадия (v): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; циклооктины являются коммерчески доступными для n'=1,2, 3 и 5; дикислоты, моноактивированные в виде NHS-эфира, являются коммерчески доступными для n=1-3 и для n=4-10, они могут быть получены путем активации коммерчески доступных дикислот с NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, ДЦК, и основания, такого как, например, ДМАП.

Q ° j п^? я л / Ν' ALK'-N^ALhHO -Ji \J ^H o rL ^LPi7 ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 59 035625

Стадия (i): образование пептидной связи между Fmoc-L-aMHHOKuc.TOTOH-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (v): активация циклооктин-ПЭГ-карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EDC.

Стадия (vi): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; циклооктины являются коммерчески доступными для n'=1, 2, 3 и 5; ПЭГ-дикислоты, моноактивированные в виде NHS-эфира, получают в соответствии со схемой ниже:

когда ALK=CH2CH2

когда ALI<.vC’H₂C’H₂

Стадия (ii): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (iii): моноактивация одной кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как ТГФ, с использованием NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, ДЦК, и основания, такого как, например, ДМАП.

Стадия (iv): удлинение ПЭГ-цепи; реакцию проводят в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или ДМФ с помощью обработки галогенированного эфира алкоксидом ПЭГ-диола, монозащищенного в виде эфира ТГФ. Получение данного типа монозащищенного ПЭГ-диола подробно описано в литературе, см., например, Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 или Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.

- 60 035625

Стадия (v): защита карбоновой кислоты в виде метилового эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как MeOH, с помощью обработки триметилсилилдиазометаном.

Стадия (vi): омыление метилового эфира; реакцию проводят в смеси полярных растворителей, такой как смесь ТГФ/Н₂О, в присутствии LiOH.

Стадия (vii): активация кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как ТГФ, с использованием NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, ДЦК, и основания, такого как, например, ДМАП.

' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия, или в полярном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид, и основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (v): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R18=H или Me независимо друг от друга. Дикислоты, монозащищенные в виде аллиловых эфиров, являются коммерчески доступными для n=2 (моноаллилсукцинат) или могут быть получены с помощью переэтерификации метиловых или трет-бутиловых моноэфиров, которые являются коммерчески доступными для n'=2-6.

п полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (ii): снятие защитной группы с амина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком

- 61 035625 как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии основания, такого как, например, пиперидин.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/ОI3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; ПЭГдикислоты, монозащищенные в виде аллиловых эфиров, получают в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP₂.

I j^OjH fl ^R _r Η fl

RbZboc _lk

II II ; 1o 17 ^H θ *28 ^L₽20 ' полученный в соответствии со схемой ниже.

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия, или в полярном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид, и основания, такого как, например, ТЭА.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; сульфодикислоты, монозащищенные в виде аллилового эфира, получают в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP₃. .о

Д_А, д Хд Д

V -_ALK-n_HR _TD ^{0 н} д „ „ ^LP21 ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 62 035625

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/d I3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R18=H или Me независимо друг от друга; малеимидокарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для n=1-12. о

У О ^r _{27 н} ⁰

Q-alk-IO-mP^V _fN _{nr alk}__nhr k ^H 0 R= ^{L₽22 0 28} ' полученный в соответствии со схемой ниже

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; малеимидо-ПЭГ-кислоты являются коммерчески доступными для ALK=ALK'=CH₂CH₂ и i=1-1 и иным образом могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP5.

О R-ηγ I I О |z° А д й А

ГА ( О A A nr.alk nhr,₇

Vⁿ'aAA ^н 0 r„ // ALK^-^ ²⁸ _Lp„ ⁰ - ^bF23 ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 63 035625

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия или в полярном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид, и основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/C I3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R_|7 и Ri₈=H или Me независимо друг от друга; малеимидоциклогексанкарбоновая кислота является коммерчески доступной для ALK=CH₂ и иным образом может быть получена в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP6.

о J? л ^н У n^A'n-'^N'->'NR-_ALk-n_HR17

Μ-θ SO₃H^H 0 Rj_s ^L₽24 ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (v): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CHsCN.

- 64 035625

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R18=H или Me независимо друг от друга; малеимидокислоты являются коммерчески доступными для n=1-12.

О R__ .. О п полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (iii): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/C^CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; Nсукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными.

U 9 ^R27 Н ⁰ । ^Br^Ak_NR__ALK,A_N-Y^ⁿ^A-_nr__alk__NHRi7 _LP„ ^{Н 0 R}5« , „„ „ „ .........„„ „ ²⁶ ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия, или в полярном раство рителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид, и основания, такого как, например, ТЭА.

- 65 035625

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R18=H или Me независимо друг от друга; Nсукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными; аминокарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для n=1-12 и N-метилированные аминокарбоновые кислоты для n=1-7.

I ii 0 Roy ц О

Χ N.

^nk20 ALK'^_N-yy'-^_NR^ALK-NHR₁₇ ^н о Ч ^LE>27 ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/СИ₃СЧ

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; Nсукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными; в случае, когда ALK=CH₂CH₂и R₂₀=H, амино-ПЭГ-карбоновые кислоты являются коммерчески доступными для i=1-6 и иным образом могут быть получены из трет-бутилакрилата и соответствующего амино-ПЭГ-спирта; в случае, когда

ALK^CH₂CH₂, они могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP10.

п полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как

- 66 035625 смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия или в полярном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид, и основания, такого как, например, ТЭА.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; Nсукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными; амино-(гетеро)арилкарбоновые кислоты являются коммерчески доступными, например 4-амино-2-бензойная кислота, 6-амино-3пиридинкарбоновая кислота, 5-амино-2-пиразинкарбоновая кислота, 2-амино-5-пиримидинкарбоновая кислота или 6-амино-1,2,4,5-тетразинкарбоновая кислота.

о r_{27 н} о ^FmocHNnn/A Л ν Λ ^ALK NR.g ALK NHR,₇

.. ^H 0 „ ' полученный в соответствии со схемой ниже lp₂₉

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CI hCN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; аминокарбоновые кислоты являются коммерчески доступными для n=1-12.

, у о R₂₇ н о

FmocHN ⁰ ALK'^_NX^N_xA-_{N LK}__NHR ^H 0 ^R28 ^LP3° ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 67 035625

Стадия (iii): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как ДХМ, с помощью обработки NHS в присутствии связывающего реагента, такого как, например, ДЦК, на подложке.

Стадия (iv): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CI I3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; Fmocзащищенные амино-ПЭГ-карбоновые кислоты являются коммерчески доступными для i=1-6 и иным образом могут быть получены из трет-бутилакрилата и соответствующего амино-ПЭГ-спирта; в случае, когда ALK^CH₂CH₂, они могут быть получены в соответствии со схемами для прекурсора линкера LP₁₀. Защита функциональной аминогруппы Fmoc-группой может быть реализована с помощью обработки

FmocOSu (номер CAS [82911-69-1]) в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

LP

полученный в соответствии со схемой ниже

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины

- 68 035625 являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R18=H или Me независимо друг от друга; азидокарбоновые кислоты могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера

LP14 полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия, или в полярном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид и основания, такого как, например, ТЭА.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R₁₇ и R₁₈=H или Me независимо друг от друга; азидоПЭГ-карбоновые кислоты могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP₁₅.

- полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/И₂О, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия, или в полярном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид, и основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (iv): снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (на- 69 035625 пример, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R18=H или Me независимо друг от друга; циклооктиновые линкеры, активированные в виде NHS-эфиров, могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP16.

' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия, или в полярном растворителе, таком как ДХМ. в присутствии связывающего реагента, такого как пропилфосфоновый ангидрид. и основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (iii): образование пептидной связи между дипептидом и NHS-эфиром; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CI I3CN.

NHS-эфиры Fmoc-L-аминокислот являются коммерчески доступными; монозащищенные диамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и R17 и R18=H или Me независимо друг от друга; циклооктиновые линкеры, активированные в виде NHS-эфиров, могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP17.

' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP₁ и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

Стадия (ii): активация бензилового спирта в виде п-нитрофенилкарбоната с помощью обработки пнитрофенилхлорформиатом в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Многие производные анилина являются коммерчески доступными, такие как, например, 4(гидроксиметил)анилин (номер CAS [623-04-1]), 4-(1-гидроксиэтил)анилин (рацемический (номер CAS [14572-89-5]) или энантиомер (R) (номер CAS [210754-25-9]) или (S) (номер CAS [500229-84-5])), 4амино-а,а-диметилбензолметанол (номер CAS [23243-04-1]), 4-амино-а-метокси-а-метилбензолметанол (номер CAS [1379318-81-6]), 4-амино-а-метил-а-трифторметилбензолметанол (номер CAS [851652-567]), 2-аминобензолметанол (номер CAS [5344-90-1]), 2-амино-а-метилбензолметанол (рацемический (номер CAS [10517-50-7]) или энантиомер (R) (номер CAS [3205-21-8]) или (S) (номер CAS [3205-21-8])),

- 70 035625

6-амино-3-пиридинметанол (номер CAS [113293-71-3]), 6-амино-а-метил-3-пиридинметанол (номер CAS [1335054-83-5]), 6-амино-а-этил-3-пиридинметанол (номер CAS [1355225-85-2]), 6-амино-а,а-диметил3-пиридинметанол (номер CAS [843646-03-8]), 5-амино-3-пиридинметанол (номер CAS [873651-92-4]), 2амино-3-пиридинметанол (номер CAS [23612-57-9]), 2-амино-а-метил-3-пиридинметанол (рацемический (номер CAS [869567-91-9]) или энантиомер (R) (номер CAS [936718-01-3]) или (S) (номер CAS [93671800-2])), 2-амино-а-этил-3-пиридинметанол (номер CAS [914223-90-8]), 2-амино-а,а-диметил-3пиридинметанол (номер CAS [213666-96-7]), 3-амино-4-пиридинметанол (номер CAS [152398-05-5]), 3амино-а-метил-4-пиридинметанол (номер CAS [1242470-88-7]), 3-амино-а,а-метил-4-пиридинметанол (номер CAS [13357-81-8]), 4-амино-3-пиридинметанол (номер CAS [138116-34-4]), 4-амино-а-метил-3пиридинметанол (номер CAS [741223-49-4]), 4-амино-а,а-метил-3-пиридинметанол (номер CAS [1339013-26-1]), 3-амино-2-пиридинметанол (номер CAS [52378-63-9]), 3-амино-а-метил-2пиридинметанол (номер CAS [954240-54-1]), 3-амино-а,а-метил-2-пиридинметанол (номер CAS [89943857-4]).

_н о

Λ Λ ν Λ λ X ⁰⁰

RbZbOC-ALK-(OCH,CH₂)i ΝPf NR^Jf ³ ^Lp36 ⁰ ' ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP₂ и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

Многие производные анилина являются коммерчески доступными, такие как, например, перечисленные для LP₃₅.

Io r,_{7 н} о Гр‘Л.,0 so₃h ^м о ρς₈ ^ЬРз7 ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP₃ и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

Многие производные анилина являются коммерчески доступными, такие как, например, перечисленные для LP35.

полученный в соответствии со схемой ниже

- 71 035625

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP4 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP5 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP6 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

- 72 035625 полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP₇ и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP8 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP₉ и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

- 73 035625

-NO;

lp₄₄ ' полученный в соответствии со схемой ниже о

А

Д 5 alk _nY^l4V^NR^jf3 о r=₈

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP₁₀ и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

п полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP11 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

w,

LP₄₆

О R.

' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP12 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

- 74 035625 полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP13 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP14 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP15 и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

- 75 035625 (j J ίΐ ^{0 R}27 Η ⁰ \J ^H 0 ^R28 о . _____.

^Lp5° ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP₁₆ и производным анилина; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между прекурсором линкера LP17 и производным анилина;

реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/MeOH, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, EEDQ.

полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP₃₅ и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

J ^R15% 9

S X К XI X^Xo^Anr_salk-nhr_I7

RbZbOC-ALK-(XH₂CH₂)i^N^Y^N'-^^VNR'yjf^J3 ^W О ^R28 lp₅₃ ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 76 035625

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP36 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

R 0 J^/JA¹⁵A¹⁴y

RbZbOC alkA г й У a ,j '° n_R18alk-nhr₁₇γ 'Ν· NR,. ,Υ

SO₃H ^Η 0 R;_{8 w w} ^1,: п полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP37 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

^/0 I ^15^14 9

ICX A A. N Л A J °Х«А1К-МНК,,

U П Q ^{L₽55 20} п полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP38 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

I P j ^RYl4 9

-У „Л 9 ^R27 η ? Y Υ Ό' NR..ALK NHR₁₇ ^l₽5« ⁰ '* полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP39 и монозащищенным диамином;

реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

J ^R15^14 9

I J ^RfH 5 ^Jl, ²pO^ANRi8ALK-NHR₁₇

Y%liP ^{Η 0} ^{LPs7 0} ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP40 и монозащищенным диамином;

реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

полученный в соответствии со схемой ниже

- 77 035625

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP41 и монозащищенным диамином;

^R27 н 9 ^J1 r'O^NR^ALK -ΝΗΚ, |_| II ; 15 4 _LPcq ^{H 0} ___ . . _____- .

^ЬР5Э ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP₄₂ и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

⁰ OR 0 χΥΥ¹⁴ Л

Н л полученный в соответствии со схемой ниже

^LP«

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP43 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

О Р ^R15^R14 9 'Мр-оуД Г J Ji Т° ^NR«^ALK-^NHR» μ ΤΙ - J₄ полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP44 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

АД¹⁴ fl м 9 ^R27 н fl ^Ji У Ό' NR_1SALK NHR, □ R₂₃ п полученный в соответствии со схемой ниже lp₆₂

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP45 и монозащищенным диамином;

J ^R15y14 9

FmocHN,5 45 \ Т° NR_SALK-NHR₁₇ ^ALK й i i . ³

LP. ° . . _____~ полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP46 и монозащищенным диамином;

- 78 035625 реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (наFmocHN п полученный в соответствии со схемой ниже lp₆₄ пример, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

O)i А л й A Y γΦ nr_iTalk-nhr₁₇А-К _N ' ^Ν _ΝΛ Д

LI II : 1θ 4 ^н 0

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP47 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

j j?

²VSo^NR^ALK NHR₁₇ ^Н 0 1¾

ЬР_б5 ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP48 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

J *15^14 Д

«.'.......ϊ , ’,Σ'λ ⁰ ^н О RL ^{16 4} _ „ „

LP₆₆ ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP49 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

’ полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование карбамата между прекурсором линкера LP50 и монозащищенным диамином; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

ДД о о Oro jAASA¹⁴ А

ДД Λ 1 <4 A Λ N A A pO^NR^ALK-NHR^ ζ N^ALK'-NRAALHO^^N'^^N'^NR'AjA 'VJ ^Η 0 *28 .„о ^LP“ ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 79 035625

Стадия (i): образование карбамата; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии основания, такого как, например, DIEA; снятие защитной группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. J ^R15^14

IO R_?7 и 0 <

II f Η II 11 ОН

RbZbOC-ALK-N Af ^N N RM Jf

Ц II ί 16 4 ^{0 R}2S ^{LP69 1} полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₃₅.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₃₆.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₃₇.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₃8.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₃₉.

' полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP40.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₄₁.

линкера LP42.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора

' полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₄₃.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP44.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP45.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP46.

J ^15^14

IO R„ ц о Jf

И 0 R·, „ , „ „ . „ ^⁸¹ п полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₄₇.

- 80 035625 полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекур-

сора линкера LP48.

<· и. °.;,* ^{н 0} „ , „ „ „ ^{LP83 г} полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP49.

\/9 9 ^or27h° ^Ji^j2-t^z

W Д JL II Г □ LI г I ^он ^NVLK'-NAALKX^^NRyr^ ^н О r₂₈ ^Lpe4 , полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекур сора линкера LP50.

полученный в соответствии с 1-й стадией, описанной для прекурсора линкера LP₅₁.

О О 11 Rn_n

ΗθΑίΚ-Ν(4>^Ν3^ΝΗ2

О CF₃CO₂H ^Lp86 п полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование связи кислоты на смоле Ванга с помощью этерификации; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как ДХМ, в присутствии связывающего реагента, такого как, например, ДИК, и основания, такого как, например, ДМАП.

Стадия (ii): снятие защитной Fmoc-группы; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как ДМФ, с помощью обработки основанием, таким как, например, пиперидин.

Стадия (iii): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как ДМФ, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOBt и HATU, и основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iv): расщепление смолы; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДХМ/Н₂О, в присутствии кислоты, такой как, например, ТФУК.

Fmoc-защищенные алкиламинокислоты являются коммерчески доступными для n=1-9; Fmoc-L аминокислоты являются коммерчески доступными.

О ?29 9

... NR _,.A_hrA.....NH₇

HO^ALKAO^Vi ²⁵ II [j ; CF₃CO₂H ³⁰ ____ _ ~___________ ____ _ ~ _ ³⁷ ' полученный в соответствии со схемой ниже о

- 81 035625

Стадия (iii): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как

ДМФ, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOBt и HATU, и основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iv): расщепление смолы; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь

ДХМ/Н₂О, в присутствии кислоты, такой как, например, ТФУК.

Fmoc-защищенные амино-ПЭГ-карбоновые кислоты являются коммерчески доступными для i=1-6 и иным образом могут быть получены из трет-бутилакрилата и соответствующего амино-ПЭГ-спирта; в случае, когда ALK^CH2CH2, они могут быть получены в соответствии со схемами, описанными для прекурсора линкера LP₁₀. Защита функциональной аминогруппы Fmoc-группой может быть реализована с помощью обработки FmocOSu (номер CAS [82911-69-1]) в присутствии основания, такого как, например, DIEA; Fmoc-L-аминокислоты являются коммерчески доступными.

HoX^/ALK-NR25 _tXnX^^NH2 so₃h о н ,4 cm

т.Р„„ ^{3 υ} Vo _ _ _ ., _ ⁸⁸ ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Boc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с сульфоаминокислотами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iii): снятие защитной Boc-группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане).

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Boc-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; сульфоаминокислоты являются коммерчески доступными для n=1 и 2 или иным образом могут быть получены в соответствии со схемой ниже о о оо ^_oJL.ALK-Br Br _ ^_oJI^ALK-Br 0») _ ^_qA^,ALK-N₃

Br SAc SO₃HSO |(^jv) оо

Д ALK NH_? M JL ..ALK N, но γ но γ so,hso

Стадия (i): замещение бромида тиоацетилом; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ТГФ, с использованием тиоуксусной кислоты в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ii): образование фрагмента сульфоновой кислоты; реакцию проводят с помощью обработки пероксидом водорода и уксусной кислотой.

Стадия (iii): замещение бромида азидо; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как, например, ДМА, с помощью обработки азидом натрия.

Стадия (iv): снятие защитной группы метилового эфира; реакцию проводят в кислых условиях, таких как, например, смесь HCl и AcOH.

Стадия (v): восстановление азидо; реакцию проводят с помощью гидрогенолиза в полярном растворителе, таком как H₂O, в присутствии катализатора, такого как палладий на угле.

Дибромпроизводные являются коммерчески доступными для n=3, 4 и 9.

Ό

X Y 9 н дзо

A^NALK NRz?-^Nr' NH₉ _Τϋ„ о О CIH ~ ~ ^LP89 ' полученный в соответствии со схемой ниже

- 82 035625

Стадия (i): образование пептидной связи между Boc-I А1минокисжушй-О\11S и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с малеимидоаминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃C\, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Boc-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидоамины являются коммерчески доступными для n=2-6. о

Л.......... IJ И г» о

lp₉₀

ALK NR„< ДГ NH₉

R₂₉ о cih ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Вос-1-аминокислотой-О\№ и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с малеимидо-ПЭГ-аминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Boc-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидо-ПЭГ-амины являются коммерчески доступными для ALK=ALK'=CH₂CH₂ и i=0 и 1 или иным образом могут быть получены в соответствии со схемой ниже, когда ALK=ALK'=CH₂CH₂ и i>1

когда ALK^CH₂CH₂ и ALK'=CH₂CH₂

когда ALK=CH₂CH₂ и ALKYCH2CH2

- 83 035625

когда ALK и ALKACH₂CH₂

Стадия (i): реакция Мицунобу на малеимиде; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ТГФ, с помощью обработки малеимида ПЭГ-гидроксикислотой в присутствии PPh₃ и DIAD.

Стадия (iii): активация спирта в виде тозилата; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ДХМ, с помощью обработки тозилхлоридом в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (iv): замещение тозильной группы; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ТГФ, в присутствии основания, такого как, например, гидрид натрия.

Стадия (v): снятие защитной бензильной группы; реакцию проводят с помощью гидрогенолиза в полярном растворителе, таком как, например, MeOH, в присутствии каталитического количества катализатора, такого как, например, палладий на угле.

Стадия (vi): активация спирта в виде мезилата; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ДХМ, с помощью обработки метансульфонилхлоридом в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (vii): нуклеофильное замещение; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ДМФ, в присутствии основания, такого как гидрид натрия.

Исходные Boc-защищенные ПЭГ-аминоспирты являются коммерчески доступными для i=2-4 или могут быть получены с помощью обработки коммерчески доступных ПЭГ-аминоспиртов Boc₂O для i=58; исходные ALK-аминоспирты являются коммерчески доступными для n=1 и от 3 до 10; исходные ПЭГдиолы, монозащищенные бензильной группой, являются коммерчески доступными для i=1-9; исходные ALK'-диолы являются коммерчески доступными для n=1-12.

О 0 ii Ron .о /хА Ι.ΛΑ

AA^NR_?FALK-NRy<Y^NH₂

А < о ^С1Н ^{LP91 0} ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (ii): образование пептидной связи с малеимидоаминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

- 84 035625

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Boc-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидоамины могут быть получены в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): активация карбоновой кислоты в виде NHS-эфира; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМФ/Н₂О, с помощью обработки Х№-дисукцинимидилкарбонатом в присутствии основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (ii): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/ОI3CN.

Малеимидоциклогексанкарбоновая кислота является коммерчески доступной для ALK=CH2 или иным образом может быть получена в соответствии со схемами, описанными для LP6; диамины, монозащищенные Boc-группой, являются коммерчески доступными для n=1-10.

γ-f⁰ yJJ ^Ν4ϊΡ ^Lp92 > полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (ii): образование пептидной связи с малеимидо-ПЭГ-аминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Boc-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; малеимидо ПЭГ-амины могут быть получены в соответствии со схемой ниже

Стадия (ii): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/ОI₃CN.

Стадия (iii): снятие защитной Boc-группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты

- 85 035625 (например, раствора в диоксане).

Малеимидоциклогексанкарбоновая кислота является коммерчески доступной для ALK=CH2 или иным образом может быть получена в соответствии со схемами, описанными для LP6; ПЭГ-диамины, монозащищенные Boc-группой, являются коммерчески доступными для i=1-9.

9 Η ?3ΰ ]ил_Ивг\ А А ν А nr^alk-nra^ Υ^νη₂

О ^С1Н lp₉₃ но γ

NHSO Λ Г NHBoc

О -------------^ж НО ' полученный в соответствии со схемой ниже о

MR^j-ALK-NHR^ О О R_M

CIH А А А А

------------* NR^ALK-NR^ Y Ii NHBoc R,_a О н !^эо

R_M О

О ^0

NR^-ALK-NrAC 'γ^ν’ΝΗ_ϊR_M о CIH

Стадия (i): образование пептидной связи между Boc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с галогенацетамидо-ПЭГ-аминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и IOBt и основания, такого как, например, DIEA.

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Boc-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; галогенацетамидоамины являются коммерчески доступными для n=2-4 и 8 или могут быть получены в соответствии со схемой ниже

Стадия (ii): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ДХМ/CI I3CN.

N-сукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными; диамины, монозащищенные Boc-группой, являются коммерчески доступными для n=1-10.

lp₉₄

NR' nr₂₅f

NH,

CIH ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (ii): образование пептидной связи с галогенацетамидо-ПЭГ-аминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CI₃CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

- 86 035625

N-сукцинимидилбромо- и иодоацетаты являются коммерчески доступными; ПЭГ-диамины, монозащищенные Boc-группой, являются коммерчески доступными для i=1-9.

М ff ? Н £з° । ? ^МГ D^nr«^alk-ⁿD^^NY^^nh2 τη ^клиВг'-^Л^^м4^Мз ιχ9 о ^С|Н ~ ~ ~ ___ _ ____~ ~ ^{ЬРэ5 79} ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Вос-С-аминокислотой-ОХ! IS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с галогенацетамидоаминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

Стадия (iii): снятие защитной Вос-группы с использованием раствора хлористоводородной кислоты (например, раствора в диоксане).

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Вос-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; галогенацетамидоамины могут быть получены в соответствии со схемой ниже

NHS-эфиры галогенацетамидов могут быть получены, как описано для прекурсора линкера LP11; диамины, монозащищенные Вос-группой, являются коммерчески доступными для n=1-10.

^н JL³⁰ n₃-alk^fA'%Anh₂

М ® „ ' полученные в соответствии со схемой ниже

LP95 И LPgg

Стадия (ii): образование пептидной связи с азидоаминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и НОВ^ и основания, такого как, например, DIEA.

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Вос-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; азидоамины являются коммерчески доступными для n=2-8 и 10.

^н

LP„, и LPoo ^R2S° ____ _ _____________ ____ „ _ ⁹⁷ п ^^99 л полученные в соответствии со схемой ниже

- 87 035625

Стадия (i): образование пептидной связи между Boc-Ι Ааминокислотой-ОХ! IS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н2О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с азидо-ПЭГ-аминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

L-аминокислоты являются коммерчески доступными; NHS-эфиры Boc-защищенных L-аминокислот являются коммерчески доступными; для ALK=CH2CH2 азидо-ПЭГ-амины являются коммерчески доступными для i=1-8 и 10, для ALK^CH₂CH₂ азидо-ПЭГ-амины могут быть получены в соответствии со схемой ниже:

Стадия (i): активация спирта в виде мезилата; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ДХМ, с помощью обработки метансульфонилхлоридом в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (ii): замещение мезилата азидогруппой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ацетон/^О, с помощью обработки азидом натрия.

Исходные ПЭГ-аминоспирты могут быть получены, как описано для прекурсора линкера LP9₀.

' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между Boc-L-аминокислотой-ONHS и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/^О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с циклооктинаминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH3CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

Циклооктинамины являются коммерчески доступными для n=1,2, 3 и 5.

- 88 035625 ' полученный в соответствии со схемой ниже

Стадия (i): образование пептидной связи между ВосА-аминокислотой-ОКНБ и L-аминокислотой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как смесь ДМЭ/ТГФ/Н₂О, в присутствии основания, такого как, например, бикарбонат натрия.

Стадия (ii): образование пептидной связи с циклооктин-ПЭГ-аминами; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как CH₃CN, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, ДЦК и

HOBt, и основания, такого как, например, DIEA.

Циклооктин-ПЭГ-амины могут быть получены в соответствии со схемой ниже

Стадия (ii): нуклеофильное замещение; реакцию проводят в полярном апротонном растворителе, таком как, например, ДМФ, в присутствии основания, такого как гидрид натрия.

Стадия (iv): защита амина Boc-группой; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как, например, ДХМ, с помощью обработки Boc₂O в присутствии основания, такого как, например, ТЭА.

Стадия (v): образование пептидной связи; реакцию проводят в полярном растворителе, таком как, например, ДХМ, в присутствии связывающих реагентов, таких как, например, HOBt и EDC.

Исходные ALK-аминоспирты являются коммерчески доступными для n=1-10; циклооктины являются коммерчески доступными для п=1,2, 3 и 5.

- 89 035625

Таблица I

Прекурсор линкера	Загрузки криптофицина формулы (II)^{1, 2}
LP	Примеры LP	RCG1-L семейство, полученное из прекурсора LP	rcg₁ VY^CI X й'^н^{0 ;;} °^Me c RCG1-L-Y =
LPi	^aiioy—#A°^Hо о а ^н о	Li	H RbZbOC-ALK.N,, Y i 0 ^R27	9 ^R28 h ^Λν/Υ ^H 0	9 H 9 I h λν-/ΛΎ ΥΛ ο ο Υ\ ^н о 0
lp₂	aiio^^Ao^A-n. Y Ί 0 о ,..	⁰ 1 A'V^H 4 H Й	l₂	H RbZbOC-ALK-(OCH_zCH₂)i^N. 0 R	^{0 R}2S H A'V-f 27 ^H 0	о н 9 ι н Υ^ογγ·^οΥγ^ΝΥν^ VY ο ο ,. ^Η 0 0
LP₃	SO,H H 0 0 ¹	) 1 ΥΛ,οη ν Y ^H 0	L₃	H RbZbOC,„ALK,N„ 1 Tl SO₃H 0 R,	0 H ΛΛ^Ν4 7 ^H 0	0 SO₃H Η t_N.oy>_Y ^N· \Д_о 0 о .	AV- Μ ^Η 0
lp₄	/0 /Y H 0 0 A	⁰ 1 A-Yoh u , ^H 0	l₄	/ н 9 н Q-alk/AnV^ b ^{0 H 0}	Ζζ° _Λ 0 0 ^Η ο
lp₅	0 о о	^nAt^oh,,,, ^H 0	L5	Yal^o-mO-alk/. 4 ⁰	9 ^R28 H q₇ ^H °	Ύ-ο—Ύ 0 0,·^:	γ ^Η 0
LP₆	0 My 0 A	/_N\-^0H H 0	^L6	Yn-alk 0 ΟγΝ 0	9 ^R28 H A-vy*27 ^H 0	0 Ν 'Λ 0 /	,^Η ο
lp₇	A° m a-V0 0,..	⁰ 1 aV^hY H 0	l₇	A° A ? ^R*« ^H.'-^NALK\|^N-'n't^N··' 0 0 R₂₇ ^h 0	ζθ s°3^ 9 I Η υ^νΎ^νΑνΑ^ν-!о о а ^Η ο
lp₈	ΞΕ o /^o ΞΞΞΕ °A......../ t°	Lg	H 9 ^28 H МДА 0 R₂₇ ^H 0	η 9 ι η Υ_Υ ^νΑΛ'^ν'4· 0 Α\ ^Η 0
lp₉	H ^{H 0} 1 Λ 0 0 A ^H 0	l₉	i\A ^H '^Yr^alk^n. 0 R	9 ^R28 H Αγζ· 27 ^H 0	η η 9 ι η ,-Α·^ ΥΥ 0 0 Α\ ^Η 0
LPio	H Ι'Α^Ν'^0'^°'-γ 0 C	) ,,- ,, ^H о	Lio	1 МоЛ^К/ ^N 0 OR	9 ^2S H Л'УА 2, ^H 0	Η Η 0 0 /	^f.'.V Α ^Η 0
LP11	0 , ,. . . , ^H 0	Ln	0 1™вг^Л._м^у Τ'	9 ^R28 H ^ΛνΛι^Ν^ H 0	ιΆΑϊ η 0 ΥΥ/Ν 0 .	9 ι η av^ ^{? Η} 0
LP12	H FmocHN^^-yN^, o ,-	⁰ 1 Λ_ν\οη	L12	Η 9 ^R28 Η H₂N-ALK_rN_>Y_NX_rNA' 0 Rf ^h 0	Η 0 Α\	⁵ I ^Η Αγ¹^' ^Η 0

- 90 035625

LP₁₃	H FmocHN^^Q— 0	⁰ 1 χγ	L13	\|-\| 0 R₂₈ Η Η₂Ν-Κ,0)^ιΑίΚ_γΝγί_Ν/<_τΝ^ 0 R₂₇ ^Η 0	H H₂N^—₀—_γΝ, o ,	х»А < h Й
lp₁₄	0 Y ^H	_Τ°Η 0	L14	Η 9 ^R28 Η Nj-ALK^N^X^0 R^₇ ^Η 0	AV 0 , A ^H	H Y^N'^A 0
lp₁₅	H N.—Q—°—A 0 A	Ар	L15	u 0 R,_r η Π ii 2ο Π \|\\|^4y^-0^ALK^ Ν 'Ύ^ N^yy ^-^4 ³ ο r=₇ ^Η ο	H N₃^o^°-Xr^N- 0 и	9 I h AiAⁿ<x N -' \ H 0
LP₁₆	Y? ООО ’к ’ О	ΡΧ 0 ²	L16	XXkAaAPnJA \Α ^Η 0 Rj,	ΧΛ ooo XX A/-. AY / r^Ax···vJ ^H Xj	Χ,Ααη Γ^Α Υ ^NH
lp₁₇	XX О О 1 ) ^н	Ρ(5χΧ^0Η	Li?	XX ^Η ο r;₈ VT		«γΥ/Υ
lp₁₈	? ϊ Τ Η αιιοΧ^-Χνυ^ν^ η ο ^:	Д—^Ш _г Η	^L18	9 ^R _? ^? н о RbZbOC-ALK'^NXf^N'XNR₁-_BALK-NR₁₇^O^ ^{0 R}28 0	X^s.......°.l,» 0 H Q =	Λ—p ^H 0
lp₁₉	9 9 Υ н ΑΙΙΟ^^—Υ0'^ΑΥνΧ'^Ν ^Η 0	0 Ρ4\|^^\^ΝΗ₂ _; Η	L19	9 н ° ^bZbOC-ALK4O''X^kNX^N'-^>kNR_liALK-NR₁₇_O^ ^{H 0} г s	VP'^O'^nXi'N 0 H Д	9 h hA_n—n ov = H

LP₂o	aiioV^^nXt^ SO₃H ^H 0	A—NH₂ H	L₂o	A^,H 8 ”” H RbZbOcALK'AYN^ ^H 0 ^R;	0 ^ANR^LK-NR_17i0v 8 0	,o ,, rY ο ο γ _HγΧΑγ^ΧχΧχ 0 SO₃H ^H 0	θ h An—^Νγ°Η । h S
LP₂i	;........ ΞΕΗ ξ_/ПО °A oX	0 ^Λ _Ν—NH₂H	L₂i	A⁰ Xn J H fl V X\LKXXr^NXX_l7ALK-NR 0-^ ^{U H} ° ^R28 J	·, . °J a ' Χχ H 0 i 0	H ^H Y—N_Y0^ ^H 0
LP₂2	Λ_Ν—^°—-₀-hX_N'V^N^N'^^NH2 Μ. h q : h 0	l₂₂	X-ALK^-VO^K.yy.HX, _ALK__Nо ^н о Г J	⁰ 9 A p_N—Α_Νχ H ^{H c}	h 9 ^Hr*y ^n: 3 ^H 0
lp₂₃	x W yN-XX Η о 0	0 X\v.νπ₂ : H	L₂₃	^{0 R}27 H zY° PpXXrA V^N'ALkX^ ^{H 0 R}28 0	0 Xr^alk-nr^ov 0	v ДХ1 ГРО A 0	Д— N_Y°H H 0
lp₂₄	^//° π ,- XY 9 । h Χ·Ν,_Ζ·-,.--. к,·¹·,.·N. Д i ΰ 0 SOA 0	0 H_N—NH, H	l₂₄	q 0 R₂₇ h 0 4^^AL4SXr^N^^ANR_lIALK-NR 0,,, VA_o soy 0 R³ _B J	.0 , . V ° γ h YvAa 0 SO₃hn 0	9 h '^An—^N _Y0H ^H 0
lp₂₅	АХАХ'- ^nh2 H 0 h	L₂5	YA¹ ΝΚ,-ίΑΙΚΝΡ,,.,Ο,Α ^н o Rj. S	0 Y H 0 H YPAn'-Voy h о ^{e н} о
LP₂₆	Αν-Χ-νΧ^Ρν^νη, H H Q H	l₂₆	^lYNR_liALKY_NX_rNY_NR__ALK__NRiΗ η _R= П ^{U K}28 0	X -”?X	⁰ H ^A N—V-H ^H 0
lp₂₇	9 ο Y h ^\|hA_n^xX'^yⁿ'- H H i	0 A_n--NH₂H	l₂₇	‘YrYWPX/ ^H 0	A 'n^NR^ALK-NR^y V ^Ris о	A.....“Xi	о H ^AN—N_Y0._Z ^H 0

- 91 035625

LP₂8	H	У*28	A “i^Hr^NR^LK-NR —Yr>A ^н о r₂₈ J	> Д\| J°s'?-V Η	н -Ν_γΟ-Α 0
LP29	FmocHN '' x’ '^J Ч-N ^NH2 H 0 ^έ h	L₂9	Η Ν ? A Η 9 ² ^ΛΛ^^ΝΚΑίΚ-ΝΡ ^{н 0} A J	h₂n--^—λΠΑ-Α- ² H A Η	н ,Ν_γ0Α 0
LP30	FirccHr·'^	L30	9 А и ° h,nA^oMk'a4<ⁿA%r ALK_NR о.^ ^{2 н} 0 r;3 ^{18 ,7}А	Η₂Ν	н нАуОА 0
LP31	N ³ H q = H	^L31	_N 9 А н 9 3%^LK'^AN4f^N V^х NRA-K-NR, ₇.0..., ^{н 0} A J	νΛ-Ύν44ν-'- ³ Η Π ^Η	н Νγ(Κ% 0
LP32	Α·-^σ^ ³ H Q H	^32	0 R„, η θ ^н 0 А й	⁰ 1 Η ⁰ν^ο^^νΑΑν·-	н ΝγΟΑ 0
LP33	Ча^ЛЛ/а¹A	L33	СД 5 ? 9 А н 9 н 4'n4lK’-NRALK^J^n4^NX^ⁿ'^'^NY⁰^ 1 ) ^Н 0 R,_s ^Н 0 о	ΡΛΑ-ΥΥΛ Η Η ί Η	н .-..Ή,Ό,τ 0
LP34	чV f 4	L34	Д ν ¹ Ч А - % ° < G ^я	ΑΓ .Λ. , » -,- ° '_£ ^! -°и\! ''7 · 0
LP35	0 *%—луА ό ο о лА ο ν no₂	L35	IШ °А RbZbOC-ALK^N'Y^AARAp и II - 1b 4 ^н 0 А	^Η ? ι Ογ^γΝ^ Ай 0 0 хи ^Η ο	0 и АН 0 А,Л
LP₃₆	0 H 0 1 fT°! ¢1 no₂	L36	j RiA U Н л ^raaa К У^{0 ν}λ- RbZbOC-ALK4OCHqH₂\|HN'qf^l4'H'NR1pj''^{J3 н} 0 r2S ⁴	АНО^^йД Ай^Хо о ...- Α о	0 •'όΊ,λ
LP37	0 αΥΠαΠ' λ о о ' ^н о т νο₂	L37	j^RiA 9 Η ο r„ н ο Α ²Αο^λν Ρ RbZbOC^LKA SO₃H ^Η 0 R^₈	S°,^H Η 0 1 A «ДА An Ан 0 0 = ^н 0	аАа
LP38	Л ду , о о а. ^н о Д νο₂	L38	A j?«» н о Г\ U ^{11 :} 16 4 ⁰ Η ο R^; и п.₂₈	ΗνΠ дУ 0 0 А\ ^н о	Па
lp₃₉	Ч~АЧП°Ф νο₂	L39	Ακ'^θΑΑΑΥ''⁰^⁴' о ^н 0 %	^”^ο·^°”ΑΤ^νΧ^νΛ<η о о А, ^н θ	хих А^нX\|'ON..,.
LP40	Дата н ⁰ ι Х7Л° Л ОлА О Т νο₂	L40	J ^R1s8l4 9 \|_J пчпдч⁰0	0 аЧ\'Ад_гП о и-А о	0 . Ан ΟΝχ

- 92 035625

LP₄i	ЖЖ Q no₂	L₄i	0 ° ^R\|, H ° аГГ iA ГЧ-ГЖ⁴ Vy SOjI-n 0 r₂₈	AAA- M^Ha m 9 1 ,CT° jf Ύ fr 0 0 Aa ^H 0
lp₄₂	а-УдА ft Ο/·^Η ο γ no₂	L₄₂	J ^R15^14 9 u 0 R₂₇ h 0 А^ЖсЛй-ж HtnBr^_Ny,N^A_NRyJ₃ ^H 0 r=₈	0 „ 0 . хг^°^лх 'А^муГгн 0 aa ^H 0
lp₄₃	aA A^€r°0 0 0,-Ж 0 V no₂	^L43	° ? H 9 А Жо^лУ -“^ΒΓ'Τ<ΝΚ₁₉ΑίκΥ_ΝΧ_/Ν_Α_Ν^₃ ^{H 0 R}2S	0 н н о ГГ°^ЛХ А^А'МУ ' 0 0А.^Н о
lp₄₄	0% φ no₂	l₄₄	^H 0 X	0 л/-. Ан н н 0 , £Х ° 0 0 а ^н о
lp₄₅	An h 0 1 XT⁰A 0 Ж\Ж A 0 ...... ^H 0 t no₂	^L45	.... 1 iA⁴ A'^{A 4} A, M₄ ³ 0 r-₈	0 н /х и Ан А< А.Л — 0 .„А ^Н о
lp₄₆	- Οθο FmocHN. no₂	L46	0 ^R27 ^h 0 ^F-^HNALANy^N^NRy^J3 ^H 0 r;8	0 н 9 । ХГ^оЛЙА· 0 А\ ^Н 0
lp₄₇	_H 0 . yr A Q 0 A ^h 0 a NOj	L47	FmocHNA^Oii_ALKA_N^N^_NRY_JX^<10 ^H 0 R⁴ _S	н о \| JX°°^ FmocHN^^₀^^O^^N^_NyN-^A 0 Ж ^н о
lp₄₈	0 ^н ? 1 X JJ° Jr 0 0 a^h 0 У no₂	L48	n. 1Г й J. rA'A ALK%-'AⁿH'_Nr<j<s ^H 0 Rj,	0 _ _ Ан Н 0 1 ХТ° α^α^νΑνΑ« Оа ^Н 0
lp₄₉	H 0 1 iJT⁰ A иж^жУрн A] no₂	l₄₉	j MAh .....Ή¹ ^H 0 r;₅	^н i 1 ХГ°^Л\|Ь Ν₃^₀~°'^^ΝΜ·_ΝΑ_γΝ^ 0 Ж ^н о
LP50	R а_яълГГй¹^'° ф 0 ^N°²	^50	Q 0 0 0 _R27 h 0 AAry у N Alk-nr^al k-% Xr^NRyjA ^H 0 Rj_s	0 Лужуму ° ~
LP51	,Α^ΑιΧΧ О “°^!	^L51	ft A ° A ^RX Й A .'фУ' л1К'Г:лик (0 ^ -Τ'νιΤΑ	ХАЖ~^°~аХ\А^го
LP52	_n жАж^NX н 9 I J J h ΑΙΙΟ_Ύ^^_γΝ^Α_ΝΛ_γΝ'^ 0 0 ,^{; H} 0	^52	j M« u A A ν A 1У0 nr^alk-nr 0a RbZbOC-ALK N ΆΤ '’ NR A A A H 0 R_a	_н о . ^0-жЖ АЮ γ^γΝ^ А-А 0 0 А\ ^Н 0
LP53	..,. ,n -.'· 0 0 a ^H 0	L53	_r, „ _n 9 A X Ν Λ t \| O NR_tALK ΝΡ,_;. .0. .ν K>ZbOC-ALK-(OCH,CH,)i'‘N --\|^JI ?' NR^AjA У	н о , /уА_нЖ-А-· *^II0A⁰AⁿAnA» ^А 0 0 А ^н 0

- 93 035625

LP₅4	S°3^H H 9 1 .P- H ^aiioA-yVnA^ 0 0 ^{E H} 0	L54	.-, . 0 ,*M ^,wc SOjH ^H 0 Ri	?°3^Η Η 0 \| 33° Η X ^AII03-VXn3!V 0 0 ^{Α Η} 0
LP55	П ZzAzj H ° 1 IX⁰ fi V—-r-^ _йАй 0 0 ,.-,. ^H 0	Г*55	,0 _ 1У14 ? X Д А й it YO^NR^ALK-NR ₁₇ 0,,>₃-^МА1К'У'-Д-уДиА J ^{0 H} ° 1¾	0 <^ΑΧ^ΑΑ’0^ΑΝ^ΑΑ^^χ^ν'θΑ' V Η 0 ι XX ⁰ Η g ΥΝ-γΝγ. χ,Ν^Α θ ο ο ^Η 0
LP₅₆	0 .-z.z-.A..,,,Z, p h 0 1 Xj ⁰ h	^L56	^N-ALK'-0-b-01_ALKA^VJ<X^oXN^^ALK'^N^V°'^·	° Η ο χχ'οΑ_Ν'^^Νγ°'ζ¥ ?·.-·_ι·5’/^ϊ ·
lp₅₇	Z ... ..... Anyy _h 0 . f j ⁰ й 4 Зала 0,-1,^-1 0	^L5₇	W ^h 0 T 0	0 Α Ν 0 у YyapV ⁰ « а Oz, ^н 0
lp₅₈	0 YwY “ 0 0 ,Z - H 0	L58	YYaM»A^Ar’*^ik^ vl S0,rfi 0 R_ 0 ^{3 28}	о . ,0-oVy-< τ^Ν-^Λ лаДй о 0 Х\ ^Н о
LP₅₉	_n ZZoY*, н ? 1 ΛΧ ^H \|-~_γΝ-Ζ'Ν'¹γΒ 0,-, ^H 0	L59	^H 0 R‘_s °	0 μ ργ^ο^ΛΝ~^Νγ°Α ’ .'А ^н 0 ,Ζ ^Η 0
LP₆o	.йЧЦА ^н 0 OZ, ^н 0	Leo	J ^R1S^R14 4 .,..,81, 7. J ^RJ Й JL Y Yo^NR^ALK-NR, Oyz ^m6rvV-^AhYYr^. ^b у H 0 R_2S	в О 1 ..рЛД
LP₆i	,.γ_₀_ο_ν γυ 0 0 >4 ^Η о	^L61	'-M^O _R^O^LKt_M ^RYXNij?^^NR^^L^^NRl°^	η Ζγ-Ό-Ζ—-·^ΝΥ°4- YpPA « 0 0 Η- ^Η 0
lp₆₂	0 t¹! Ζ^^γΛι^ΖΖ/ΝΗ, Ή r'l н 1 1 ί ,Ι н ⁰ ΥχΑιι 0,-, ^Η 0	^62	s «,^лЛХадАУ°^А’^1А1Иг⁰'⁴' ^ - - ArzX N S _Ri ^{NR,eJ4 0}	'^“ri^μ ϊ j. ,p°Y ⁰ ^3x3 ™ 0 /Z, ^H 0
LP₆₃	н ?, χΑ FitoiHN .,..-,,--,y A-._N·0 ^H 0	^63	^»._Лк\ЦаЛХД^А^-у^оч· η J R, · »	_{0 ΓΓ}οΑ~Β_γο,ζ FmocHN^z^x-NP-_NXN3t ^H 0 C Z, ^H 0
lp₆₄	Η ο [ jyAfY^NH2 Fn_ecHN^₀^O^NXL_NA_fN^ 0 A, ^H 0	l₆4	F.^-wXaA.iiF^K-»^^ ^H 0 Ri	γτ_Γ FmocHN^_oz^O^_yNX,_fjyN-^ 0 zZ ^H 0
lp₆₅	₀-\—, O,z ^H 0	Les	П D П />№ 2 < 8 A 11 po nr^alk-nr, 0^· ^^ALK%y^N-^_NRAjA₃ ¥ ^H 0 r;₈ ^u	„ чу'о-АА-уч ^н ? i AJ ^H 0 ------xAr 0 /Z, ^H 0
LP₆₆	_n 33A н 9 1 Д J h 0 .. - , ¹¹ 0	^L66	0 R. U Cl J А&Д’⁴ S VYXyX⁰ Valk-nr _17γ.0Μ- Η I R, ^NRA 0	H11 V Ay
lp₆₇	О	^L6₇	ΥΥ^-ΝΗ>κΑρ^Ν·Α-_№<χ « 'Ύ 6 ⁰	^лруууА^ААр
lp₆₈		Les	РХХ«а_яаа.77^оЯ ^,“₇ ^о'⁴ Μ	Q 0 0 HO. jyAVx-z Χ·_ΝΗ^_ΝΛ^Ζ,_οΖ^,0^--_οΖ^,0^-γ^ΝΠ,^ χ,Ν τ

- 94 035625

- 95 035625

lp₈₃	о ll f °^H	Ь₈з	, _0)i V= Η Ϊ Άφ ^Ns ALK _N ' N .j' _NR'' ,J, у ^H A “ ^{4 0}	^H « 1 XT °A 0 ,v.^H 0
lp₈₄	i! у ^{н н} о = ^M	l₈₄	ft ^0Ri‘	p. .' A' S K I 7 Pj η H q ί H
lp₈₅	о	L₈5	X ^{H 0Rl}	d
lp₈₆	⁰ H \| ΑγΝ./_ΝΗ2 o ^H .. = , 0	^L86	9 9 η ?зо, A An Ал HO ALK-NRft \|· Ν<··	0 U 1 H°Y——/yⁿAKi о ^н A o g
lp₈₇	О О ^н ·	l₈₇	0 ?29 9 Η HO^ALK4O%r^NR25T N^A^Nd ο ^Η R₃₀ ⁰	ΗΟγ^,Ο^,θ^,Ο^θ,^ΒΑ’Αϋγ 0 0 ^{H Ξ} 0
^LP88	⁰ н Y ⁰ ho'^J\^^ⁿy^n^^^nh2 SO₃H 0 ^н =	l₈₈	dft 9 ?29 9 н ^n_oA_yalk-nr_26/A_nAyN^ 0 SO₃H 0 ^H R₃₀ 0	ο η V о u hoA-tAav SO₃H 0 ^{H Ξ} 0
lp₈₉	”, vi, ^н γ, 0 0	l₈₉	.0 Ά цй h гЧк-nrX ii ^NX ⁰ А о A	%N-- AA ^H , v 0 П ^-0 0
lp₉₀	/Х° 9 н ί V^N^0^°^N^Ar^NT¹'NH2 0 ^н о	L₉o	/)/ 0 \|_\| R— I^n-alk4o-^^°'_ALK__nrA_t-ⁿyA_n^ 0 ^R29 ⁰ 0	/0 Af 9 η 1_μ о ^H A\ о g
LP₉i	^{0 0} Н 1 у° А А_г ,-Ν.,.,ί,,Ι ^{н н} А. 0 0	L₉i	О О и R,„ , о , Λ A n , ' A Γί T ^nrA^lk^A if N,^, V^N'ALld^ ^R29 ⁰ 0 0	_z0 XK X /, A N JLh ДаАД ^{h h}/-k0 ft 0
lp₉₂	,_;А^^ 0	l₉₂	А кл-. LA AAi^ΝΧΓγ 0	0
lp₉₃	9 9 н ! н ^нл.о	Ь₉з	'ArAX/L ° J	'X_H—nA«Aaw, U ₀
lp₉₄	0 0 н г i^_n^o^_o^o^,_nJVn_¥A_nh^ Н Н ,,, Q	l₉₄	0 0 \|_\| Rgn iu_nuBr^A,_NRA^oLvK_NR^N^A{j , R₂₉ о J	0 0 h I Ι/Α^Ο^_ο/^Ο^^Ν0,Η^
lp₉₅	⁰ о Η 1 0 <=-·'^Ε kA_nAJ ^{н н} ,= . 0 ²н	L₉5	i вг A ^MC^Md^NRA^LK-^NRd^NY^X'N^> ΙηπηΒγ^Α_ν^Μ₃ 13 II Y	0 0 U I A oVa ftft v H
lp₉₆ и	9 н I ^Η ,ν, 0	L₉6	9 H ?3Q, A n An H₂N-ALK-NRA^ Г n,>^R29 0 Ϊ	--------„ДЯ -A ^Hv, S x
lp₉₈		l₉₈	АА N₃--ALK-NRA I NA R₂₉ 0 S	N,^^, Х,Я Ан N-VyY
lp₉₇ и lp₉₉	^Н /V, 0	l₉₇	я h ?®h Η^-Κ,Ο/ΑίΚ-Νίςγ'Ί'ιΥ-Ν^· ⁰ 0	^H V, 0 J
l₉₉	NK^OilALK-NRjS-yV!^ ¹ 0 J,
LPioo	С /' ^н Ж 0	Lioo	ft A aAA 0^^LK-^Nft?o V	P^? 1......”8,1, Γ.....ϊsp w
LPioi	W ) ^{Н h} О d	Lioi	Q А ц Й ALK-NR₂₂γ^Ο)ίΑίΚ·-ΝΒΥν^Ν J 'N .,,·	A 0 0 0 H [ _H d ⁰

¹ примеры приведены для определенного соединения криптофицина, но могут применяться к любому соединению криптофицина формулы (I), в частности D₁-D₁₉.

² в табл. I L приведен в настоящем описании в пара-положении, но можно получить соединения аналогичным образом с L в орто- или мета-положении.

- 96 035625

Способ получения конъюгатов формулы (III).

Конъюгаты настоящего изобретения могут быть получены с помощью способа, включающего стадии, которые заключаются в (i) помещении во взаимодействие и предоставлении взаимодействия необязательно буферного водного раствора антитела, необязательно сначала модифицированного с помощью модифицирующего агента и раствора полезной нагрузки криптофицина формулы (II), при этом химическая группа RCG1 соединения формулы (II) является реакционноспособной по отношению к химическим группам RCG2, присутствующим на антителе, в частности к аминогруппам, присутствующим на антителах, при этом указанные химические группы RCG2 были введены, когда это необходимо, с помощью модифицирующего агента, чтобы присоединить соединение формулы (II) к антителу с помощью образования ковалентной связи;

(ii) и затем необязательном отделении конъюгата, образованного на стадии (i), от полезной нагрузки криптофицина, и/или от непрореагировавшего антитела, и/или от любых образовавшихся агрегатов.

В соответствии с одним вариантом и более конкретно в стадии (ii) конъюгат из стадии (i) отделяют только от непрореагировавшей полезной нагрузки криптофицина и от любых образовавшихся агрегатов, и любое непрореагировавшее антитело остается в растворе.

Функция помещения во взаимодействие заключается в реакции химических групп RCG1 и RCG2, чтобы обеспечить присоединение полезной нагрузки криптофицина к антителу с помощью образования ковалентной связи; предпочтительно, когда RCG1 представляет собой -C(=O)-Z_aRa, реакция предпочтительно протекает по функциональным аминогруппам антитела, в частности ε-аминогруппам, находящимся на боковых цепях остатков лизина (Lys) антитела и α-аминогруппам N-концевых аминокислот тяжелых и легких цепей антитела. В данном случае получают конъюгат следующей формулы: mAb-[NHС(=О)-Е*-КРипто]<ь при этом L*=фрαгмент линкера L содержит RCG1 = -C(=O)-Z_aR_a и такой, что L = -L*C(=O)-Z_aR_a и d представляет собой соотношение лекарственного средства и антитела или DAR;

когда RCG1 представляет собой -Cl или малеимидо- или галогенацетамидогруппу, антитело может содержать тиольные химические группы;

когда RCG1 представляет собой азидогруппу, антитело может содержать фрагмент -C.=CH или активированную тройную связь, такую как циклооктин;

когда RCG1 представляет собой -NH₂, реакция может протекать по амидной функциональной группе антитела с использованием ферментативного катализа, в частности амидным группам, находящихся на боковых цепях остатков глутамина (Gln) антитела. В данном случае получают конъюгат следующей формулы: mAb-[C(=O)-NH-L*-Крипто]_d, при этом L*=фрαгменm линкера L содержит RCG1 = -NH2 и такой, что L = -L*NH₂ и d представляет собой соотношение лекарственного средства и антитела или DAR;

когда RCG1 представляет собой -C.=CH или активированную CAC. такую как фрагмент циклооктина, антитело может содержать азидогруппы.

Термин агрегаты означает ассоциации, которые могут образовываться между двумя или более антителами, причем антитела, возможно, были модифицированы конъюгацией. Агрегаты могут образовываться под влиянием широкого спектра параметров, таких как высокая концентрация антител в растворе, рН раствора, высокое усилие сдвига, количество привитых лекарственных средств и их гидрофобный характер, температура (см. ссылки, приведенные во введении J. Membrane Sci. 2008, 318, 311-316), влияние некоторых из них, однако, не было четко выявлено. В случае белков или антител ссылка может быть сделана на AAPS Journal, Protein Aggregation and Bioprocessing 2006, 8(3), E572-E579. Содержание агрегата может быть определено с помощью известных методик, таких как SEC (см. в этом отношении Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480).

Водный раствор антитела может быть заполнен буферами, такими как, например, фосфат калия, или HEPES, или смесь буферов, таких как буфер A, описанный ниже. Буфер зависит от природы антитела. Полезная нагрузка криптофицина растворяется в полярном органическом растворителе, таком как, например, ДМСО или ДМА.

Реакция протекает при температуре обычно от 20 до 40°С. Время реакции может варьироваться от 1 до 24 ч. Реакция между антителом и полезной нагрузкой криптофицина может контролироваться SEC с помощью рефрактометрического и/или ультрафиолетового детектора и/или МСВР для определения ее степени протекания. Если степень замещения является недостаточной, реакция может быть оставлена на более длительный период и/или может быть добавлено соединение криптофицина. Для более подробной информации относительно конкретных условий ссылка может быть сделана на раздел примеров. Конкретные варианты осуществления описаны в примерах 3, 7, 10, 14, 20 и 23.

Специалист в данной области техники располагает различными хроматографическими методами для разделения стадии (ii): конъюгат может быть очищен, например, с помощью пространственноэксклюзионной хроматографии (SEC), с помощью адсорбционной хроматографии (например, ионного обмена, IEC), с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), с помощью афинной хроматографии, с помощью хроматографии на смешанных носителях, таких как керамический гидроксиапатит или с помощью ВЭЖХ. Также можно использовать очистку с помощью диализа или диафильтрации.

- 97 035625

После стадии (i) или (ii) раствор конъюгата может подвергаться стадии (iii) ультрафильтрации и/или диафильтрации. После данных стадий таким образом получают конъюгат в водном растворе.

Антитело.

Антитело может быть моноклональным антителом, выбранным из группы, состоящей из мышиного, химерного, гуманизированного и человеческого антитела.

В одном варианте осуществления антитело представляет собой моноспецифическое антитело, т.е. антитело, специфически связывающееся с одной единственной мишенью. Альтернативно, оно может представлять собой мультиспецифическое антитело.

В одном варианте осуществления антитело представляет собой антитело IgG, например антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

Антитело в соответствии с изобретением специфически связывается с мишенью, таким образом направляя биологически активное соединение в виде цитотоксического соединения по направлению к указанной мишени. Используемый в настоящем описании специфически связывается, или связывается специфически, или связывается с или подобное означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который является относительно стабильным при физиологических условиях. Специфическое связывание может быть охарактеризовано равновесной константой диссоциации (KD), по меньшей мере, приблизительно 1x10-8 М или менее (например, меньшее KD обозначает более жесткое связывание). Способы определения, специфически связываются ли две молекулы, хорошо известны в данной области техники и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и подобные. Как описано в настоящей заявке, антитела были охарактеризованы, например, их специфическим связыванием с мишенью и/или антигеном-мишенью с использованием поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™.

Мишень обычно соответствует белку, экспрессируемому на поверхности клетки, например белку, экспрессируемому на поверхности опухолевых клеток.

В одном варианте осуществления мишень представляет собой рецептор EphA2. Рецептор EphA2 представляет собой эфриновый рецептор и также упоминается как рецептор EPH A2 или рецепторный белок тирозинкиназы эпителиальных клеток (см., например, OMIM Entry *176946, доступный на сайте omim.org/entry/176946, версия обновлена 21 июля 2016 г.). Антитело, специфически связывающееся с рецептором EphA2, может, например, соответствовать одному из антител, описанных в WO 2008/010101 или WO 2011/039724.

В другом варианте осуществления мишенью является CD19. CD19 представляет собой молекулу клеточной поверхности, специфически экспрессируемую B-лимфоцитами и фолликулярными дендритными клетками гематопоэтической системы, и также называется B-лимфоцитарным антигеном CD19 (см., например, OMIM Entry *107265, доступный на сайте omim.org/entry/107265, последняя версия которого была обновлена 11 мая 2015 г.). Антитело, специфически связывающееся с CD19, может, например, соответствовать колтуксимабу, т.е. части (фрагменту) антитела колтуксимаба равтансина.

Антитело может быть необязательно модифицировано модифицирующим агентом, чтобы способствовать прикреплению нагрузок криптофицина, описанных ранее. Антитело может быть в частности моноклональным, поликлональным или мультиспецифическим. Оно также может быть фрагментом антитела. Оно также может представлять собой мышиное, человеческое, гуманизированное или химерное антитело. Антитело, используемое в примерах настоящего изобретения, представляет собой hu2H11_R3574, антитело-антагонист против EphA2-рецептора.

Последовательность hu2H11_R3574 описана в WO 02011/039724 (SEQ ID NO: 18 для тяжелой цепи и SEQ ID NO: 16 для легкой цепи).

Конъюгат.

Конъюгат обычно содержит от приблизительно 1 до 10 соединений криптофицина, ковалентно связанных с антителом (это степень слияния, или соотношение лекарственного средства и антитела, или DAR). Это число изменяется в зависимости от природы антитела и соединения криптофицина, а также от условий работы, используемых в процессе конъюгации (например, количество эквивалентов соединения криптофицина по отношению к антителу, время реакции, природа растворителя и любого сорастворителя). Помещение антитела и соединения криптофицина во взаимодействие приводит к смеси, содержащей несколько конъюгатов, которые индивидуально отличаются друг от друга различными DAR; необязательно непрореагировавшее антитело; необязательно агрегаты. Таким образом, DAR, определенный в конечном растворе, соответствует среднему значению DAR. DAR можно рассчитать по развертке спектра SEC-BCMP конъюгата. DAR (BCMP) представляет собой предпочтительно более 0,5, более конкретно от 1 до 10 и даже более конкретно от 2 до 7.

Конъюгат может быть использован в качестве противоопухолевого средства. Благодаря наличию антитела конъюгат получают высокоселективным по отношению к опухолевым клеткам, а не к здоровым клеткам. Это позволяет направлять соединение криптофицина в окружающую среду, сходную с ними или непосредственно в них; (в этом отношении см. следующие публикации, в которых описывается использование конъюгатов моноклональных антител при лечении рака: Antibody-drug conjugates for cancer

- 98 035625 therapy Carter P.J., et al., Cancer J. 2008, 14, 154-169; Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs Chari R., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98-107). Можно лечить твердые или жидкие раковые образования. Конъюгат можно использовать отдельно или в комбинации по меньшей мере с одним другим противоопухолевым средством.

Конъюгат составляют в форме буферного водного раствора при концентрации обычно от 1 до 10 мг/мл. Данный раствор может быть инъецирован в форме перфузии сам по себе или может быть повторно разбавлен с образованием перфузионного раствора.

Примеры

Следующие примеры описывают получение определенных соединений в соответствии с изобретением. Данные примеры не являются ограничивающими и просто иллюстрируют настоящее изобретение.

Используемые аналитические способы.

Высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (ЖХМС).

Способ A1.

Спектры были получены в системе Waters UPLC-SQD в режиме положительного и/или отрицательного электрораспыления (ES±) с использованием детектирования ELSD и УФ (210-400 нм).

Хроматографические условия были следующими:

колонка: ACQUITY ВЕН C18-1,7 мкм - 2,1x50 мм;

растворители: A: H2O (0,1% муравьиная кислота), B: CH3CN (0,1% муравьиная кислота);

температура колонки: 50°С;

скорость потока: 0,8 мл/мин;

градиент (2,5 мин): от 5 до 100% B через 1,8 мин; 2,4 мин: 100% B; 2,45 мин: от 100 до 5% B через 0,05 мин.

Способ A2.

Спектры были получены в системе Waters XeVo-QTof в режиме положительного электрораспыления (ES+) с использованием детектирования ELSD и УФ (210-400 нм).

колонка: ACQUITY ВЕН С18-1,7 мкм - 2,1x100 мм;

температура колонки: 70°С;

скорость потока: 0,55 мл/мин;

градиент (11 мин): от 5 до 97% B через 8,3 мин; 8,6 мин: 97% B; 9 мин: от 97 до 5% B через 0,7 мин и 5% B в течение 2 мин.

Способ A3.

Спектры были получены в системе Waters XeVo-QTof в режиме положительного электрораспыления (ES+).

колонка: ACQUITY ВЕН С18-1,7 мкм - 2,1x100 мм;

температура колонки: 45°С;

скорость потока: 0,6 мл/мин;

градиент (5,3 мин): 5% B в течение 0,3 мин; от 5 до 100% B через 3,7 мин; 4,6 мин: 100% B; 5,3 мин 5% B.

Способ A4.

колонка: ACQUITY ВЕН С18-1,7 мкм - 2,1x50 мм;

растворители: A: H2O (0,1% муравьиная кислота), B: CH₃CN (0,1% муравьиная кислота);

температура колонки: 45°С;

скорость потока: 0,8 мл/мин;

градиент (10 мин): от 5 до 100% B через 8,6 мин; 9,6 мин: 100% B; 9,8 мин: 5% B.

Способ A5.

колонка: ACQUITY CSH C18-1,7 мкм - 2,1x50 мм;

температура колонки: 40°С;

скорость потока: 0,85 мл/мин;

- 99 035625

1Н ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

Спектры 1Н-ЯМР были получены на спектрометре Bruker Avance или модели DRX-300, или DRX400, или DRX-500.

Химические сдвиги (δ) приведены в м.д.

Эксклюзионная хроматография - масс-спектрометрия высокого разрешения (SEC-MCBP).

Хроматографический анализ проводили на устройстве Agilent HP1100 и колонке Waters ВЕН SEC 200 1,7 мкм (2,1x150 мм) при 30°С со скоростью потока 0,5 мл/мин и изократическим элюированием (A) 25 мМ формиата аммония+1% муравьиной кислоты/(В) CH₃CN+0,l% муравьиной кислоты 70/30 в течение 15 мин. Масс-спектрометрию проводили на устройстве Waters QTOF-II с ионизацией электрораспылением в положительном режиме (ES+). Для масс-спектров проводили развертку с помощью программного обеспечения Waters MaxEnt1.

Аналитическая эксклюзионная хроматография (SEC).

Анализ проводили в системе ВЭЖХ Waters Alliance или системе Hitachi Lachrom, оснащенной детектором на фотодиодной матрице и колонкой Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL 5 мкм (7,8x300 мм) со скоростью потока 0,5 мл/мин и изократическим элюированием 30 мин с буфером рН 7, содержащим 0,2М KCl, 0,052М KH2PO4, 0,107М K2HPO4 и 20 об.% изопропанола.

Буферы.

Буфер A (pH 6,5): NaCl (50 мМ), фосфат калия (50 мМ), ЭДТА (2 мМ).

Буфер B (pH 6,5): NaCl (140 мМ), фосфат калия и натрия (9,6 мМ).

ФСБ (pH 7,4): KH2PO4 (1,06 мМ), NaCl (155,17 мМ), Na2HPO4-7H2O (2,97 мМ).

DPBS: KCl (2,67 мМ), KH2PO4 (1,47 мМ), NaCl (136,9 мМ), Na2HPO4 (8,10 мМ) при рН 6,5 с HCl 5N (1 мл на 1000 мл буфера).

Общий способ, используемый для получения конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC).

Раствор антитела в водном буфере, состоящем из смеси буфера A и 1N HEPES 96:4, обрабатывали избытком раствора при приблизительно 10 мМ полезной нагрузки криптофицина в ДМА, так что конечная концентрация антитела составляла 3 мг/мл и процент ДМА в водном буфере составлял 20%. После перемешивания в течение 2 ч смесь анализировали с помощью SEC-MCBP для определения DAR по популяции мономерных антител. Если DAR находили недостаточным, смесь обрабатывали дополнительным избытком (1-5 экв.) раствора криптофицина в ДМА в течение 2 дополнительных часов при КТ при перемешивании. Смесь очищали гель-фильтрацией с использованием матрицы Superdex 200 pg (HiLoad 16/60 или 26/60 колонка для обессоливания, GEHealthcare), предварительно уравновешенной в водном буфере с pH 6,5 (буфер В или DPBS), содержащем от 10 до 20% NMP. Фракции, содержащие мономерное конъюгированное антитело, объединяли и концентрировали на Amicon Ultra-15 (10k или 50k мембрана Ultracel, Millipore) до концентрации от 2 до 5 мг/мл. Затем проводили обмен или разбавление буфера в соответствующем буфере для образования конъюгата в конечном буфере. В случае буферного обмена его осуществляли с помощью гель-фильтрации с использованием матрицы Sephadex™ G25 (NAP5, NAP-10, NAP-25/PD-10 или Hiprep 26/10 колонки для обессоливания, GEHealthcare), предварительно уравновешенной конечным водным буфером, композиция и рН которого соответствуют каждому конъюгату. Конъюгат окончательно отфильтровывали через фильтрующее устройство Steriflip® (0,22 мкм мембрана ПВДФ Durapore®, Millipore). Конечный конъюгат анализировали с помощью УФспектрометрии или SEC-MCBP для измерения концентрации конъюгата с помощью SEC-ВЭЖХ, чтобы определить мономерную чистоту и с помощью SEC-MCBP, чтобы определить DAR из развертки массспектра конъюгата.

Синтез фрагмента A: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-8-(4-формилфенил)-5-гидрокси-6-метилокта-2,7диеноата

спирт Саку рай

Соединение 1: (2E,5S,6R)-трет-бутил-5-гидрокси-7-((4-метоксибензил)окси)-6-метилгепт-2-еноат.

В атмосфере аргона к раствору (2R,3S)-1-[(4-метоксифенил)метокси]-2-метил-5-гексен-3-ола или спирта Сакураи (номер CAS [203926-55-0], 100 г, 399,5 ммоль) в ДХМ (350 мл) добавляли третбутилакрилат (354,7 мл, 2,435 моль) и катализатор Граббса (4,849 г, 2,435 моль). После перемешивания в

- 100 035625 течение 17 ч при КТ реакционную смесь отфильтровывали на 230 г диоксида кремния и элюировали смесью гептан/AcOEt (50/50, 6x300 мл). После концентрирования остаток очищали с помощью флэшхроматографии на 1,2 кг силикагеля (градиентное элюирование гептан/EtOAc) с получением 140,8 г коричневого масла. Масло растворяли в безводном ДХМ (550 мл), добавляли 10 г смолы quadraPure™ TU для удаления избытка катализатора. Смесь перемешивали в течение 3 ч при 35°С. Смолу отфильтровывали и промывали ДХМ, фильтрат концентрировали и высушивали под вакуумом с получением 135,75 г соединения 1 в виде коричневого масла (97%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,85 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,42 (с, 9H); 1,72 (м, 1H); 2,18 (м, 1H); 2,30 (м, 1H); 3,24 (дд, J=7,0 и 9,3 Гц, 1H); 3,46 (дд, J=7,7 и 9,3 Гц, 1H); 3,49 (м, 1H); 3,73 (с, 3H); 4,35 (с, 2H); 4,65 (д, J=5,8 Гц, 1H); 5,76 (тд, J=1,5 и 15,6 Гц, 1H); 6,83 (тд, J=7,4 и 15,6 Гц, 1H); 6,90 (д, J=8,8 Гц, 2H); 7,23 (д, J=8,8 Гц, 2H).

Соединение 2: (2E,5S,6R)-трет-бутил-5,7-дигидрокси-6-метилгепт-2-еноат.

К раствору соединения 1 в CH₃CN (910 мл) добавляли H2O (90 мл) и смесь охлаждали при 12°С перед добавлением через 25 мин раствора ЦАН (196,7 г, 358,9 ммоль) в H2O (300 мл). Перемешивание продолжали в течение 1 ч при КТ. Добавляли дополнительное количество ЦАН (18,83 г, 34,36 ммоль), растворенное в смеси CH₃CN (70 мл) и H2O (30 мл), и перемешивали в течение 1 ч при КТ для завершения реакции. Смесь гасили NaCl до насыщения водн. слоя, затем добавляли МТБЭ (400 мл). После декантации водн. слой экстрагировали МТБЭ (2x80 мл). Объединенные органические слои промывали смесью 3:1 5% NaHCO₃/H₂O (3x200 мл), насыщ. солевым раствором (2x130 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали. Водн. слой подкисляли 2N HCl до рН 4, затем насыщали NaCl и экстрагировали МТБЭ (2x150 мл). Данный второй органический слой промывали 5%-ным раствором NaHCO₃ (60 мл), насыщ. солевым раствором (60 мл), высушивали над MgSO₄, концентрировали и объединяли с первым органическим слоем с получением коричневого оранжевого масла.

Смесь растворяли в МеТГФ (300 мл), затем добавляли 1,2-этандитиол (22 мл, 0,260 моль) и п-TsOH (1,651 г, 8,590 ммоль). После перемешивания при 60°С в течение 5 ч к реакционной смеси добавляли МТБЭ (200 мл) и промывали 5%-ным раствором NaHCO₃ (2x120 мл), насыщ. солевым раствором (120 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 520 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/МТБЭ) с получением 29,48 г соединения 2 в виде желтого масла (75%).

Соединение 3: (2E,5S,6R)-трет-бутил-6-метил-5,7-бис((триэтилсилил)окси)гепт-2-еноат.

В атмосфере аргона к раствору соединения 2 (39,38 г, 0,171 моль) в безводном ДХМ (500 мл) добавляли имидазол (51,540 г, 0,749 моль). Желтую смесь охлаждали при 0°С, затем добавляли триэтилхлорсилан (63,99 мл, 0,374 моль) и раствор оставляли нагреваться до КТ в течение ночи. Реакционную смесь гасили насыщ. NH4C1 (400 мл), МТБЭ (300 мл) и льдом. рН доводили до 4 с помощью 2М NaHSO₄, слои разделяли после интенсивного перемешивания. Водн. слой экстрагировали МТБЭ (200 мл). Объединенные органические слои промывали полунасыщ. NH4C1 (2x250 мл), фосфатным буфером рН 7 (150 мл), насыщ. солевым раствором (150 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 490 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/ЕЦО) с получением 74,52 г соединения 3 в виде бледно-желтого масла (95%).

Соединение 4: (2Е^^)-трет-бутил-6-метил-7-оксо-5-((триэтилсилил)окси)гепт-2-еноат.

В атмосфере аргона к раствору ДМСО (102,400 мл, 1,427 моль) в ДХМ (300 мл) добавляли по каплям при -75°С оксалилхлорид (63 мл, 0,719 моль) через 1 ч и перемешивание продолжали в течение 15 мин перед добавлением при -75°С раствора соединения 3 в ДХМ (150 мл), поддерживая температуру ниже -70°С. Реакционную смесь оставляли нагреваться до -40°С и перемешивание продолжали в течение 2 ч. Реакционную смесь снова охлаждали при -75°С, затем добавляли DIEA (425 мл, 2,432 моль) через 75 мин, поддерживая температуру ниже -65°С. Реакционную смесь оставляли нагреваться до КТ и затем гасили МТБЭ (500 мл), льдом, насыщ. NH4Cl (200 мл) и 2М NaHSO4 до достижения рН 4. Слои разделяли после интенсивного перемешивания. Водн. слой экстрагировали МТБЭ (200 мл). Объединенные органические слои промывали NH4C1 (3x300 мл), фосфатным буфером рН 7 (300 мл), насыщ. солевым раствором (300 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 1,25 кг силикагеля (градиентное элюирование гептан/ЕЦО) с получением 51,74 г соединения 4 в виде оранжевого масла (93%).

Соединение 5: (2E,5S,6R,7E)-Ίрет-бутил-5 -гидрокси-8-(4-(гидроксиметил)фенил)-6-метилокта-2,7диеноат.

В атмосфере аргона к суспензии бромида фосфония (синтез, описанный в WO 2011/001052, 147 г, 0,237 моль) в безводном ТГФ (1,5 л) добавляли при -50°С 2,5М раствор н-BuLi в гексане (90 мл, 0,225 моль). Температуре позволяли нагреваться до -40°С и перемешивание продолжали в течение 15 мин. После нагревания до КТ красную смесь перемешивали в течение 1 ч. Реакционную среду охлаждали при -70°С перед добавлением раствора соединения 4 (51,63 г, 126,6 ммоль) в ТГФ (200 мл), поддерживая температуру ниже -65°С. Когда добавление завершали, реакционную смесь оставляли нагреваться до КТ и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь отфильтровывали для удаления не

- 101 035625 растворимого вещества, которое промывали МТБЭ (500 мл). Фильтрат частично концентрировали при 42°С (1/3), затем гасили льдом, NH₄Cl (500 мл), МТБЭ (500 мл) и 2М NaHSO₄ до достижения рН 4. Слои разделяли и водн. слой экстрагировали МТБЭ (200 мл). Объединенные органические слои промывали полунасыщ. NH₄Cl (250 мл), фосфатным буфером рН 7 (250 мл), насыщ. солевым раствором (250 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и полуконцентрировали под вакуумом до 250 мбар. Суспензию разбавляли 50:50 гептан/МТБЭ (600 мл), охлажденной на ледяной бане, отфильтровывали и промывали 50:50 гептан/МТБЭ. Фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 100,05 г в виде коричневого масла.

Неочищенное соединение растворяли в безводном ТГФ (320 мл), затем добавляли тригидрат TBAF (90 г, 282,40 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч. После концентрирования под вакуумом неочищенный продукт разбавляли 10:1 МТБЭ/ТГФ (770 мл), промывали полунасыщ. NH₄Cl (3x200 мл), 1М NaHSO4 (200 мл), фосфатным буфером рН 7 (200 мл), насыщ. солевым раствором (200 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали. Водн. слой экстрагировали МТБЭ. После декантации органический слой промывали фосфатным буфером рН 7 (30 мл), насыщ. солевым раствором (30 мл), высушивали над MgSO₄ и отфильтровывали. После концентрирования объединенные органические слои очищали с помощью флэш-хроматографии на 1,25 кг силикагеля (градиентное элюирование гептан/Et2O) с получением 36,91 г соединения 5 в виде коричнево-красного масла (88%).

Фрагмент A: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-8-(4-формилфенил)-5-гидрокси-6-метилокта-2,7-диеноат.

В атмосфере аргона к раствору соединения 5 (30,3 г, 91,7 ммоль) в безводном ДХМ (600 мл) добавляли при 10°С оксид марганца (175 г, 3,013 моль) и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при 35°С. Окислитель отфильтровывали через слой целита и промывали теплым ацетоном. Фильтрат концентрировали с получением 30,43 г красно-оранжевого масла.

В атмосфере аргона масло разбавляли бензолом (800 мл) и нагревали с обратным холодильником в присутствии AIBN (880 мг, 4,58 ммоль) и тиофенола (2,81 мл, 27,51 ммоль) в течение 1 ч. Добавляли дополнительное количество AIBN (530 мг, 0,03 экв.) и тиофенола (1,03 мл, 10,087 ммоль) и продолжали нагревать с обратным холодильником в течение дополнительного 1 ч. Добавляли дополнительное количество AIBN (530 мг, 0,03 экв.) и тиофенола (1,03 мл, 10,087 ммоль) и продолжали нагревать с обратным холодильником в течение 3 ч. Добавляли дополнительное количество AIBN (353 мг, 1,834 ммоль) и тиофенола (468 мкл, 4,58 ммоль) и продолжали нагревать с обратным холодильником в течение 1 ч. Превращение E/Z составляло 92/8, добавляли 352,6 мг AIBN и продолжали нагревать с обратным холодильником в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждали до КТ и концентрировали под вакуумом с получением 28,03 г фрагмента A в виде оранжевого масла (92%) с соотношением E/Z выше 98/2.

Синтез фрагмента B: (К)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропановой кислоты

К раствору метил-(К)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропаноата (номер CAS [162465-44-3], 30 г, 87,26 ммоль) в ТГФ (225 мл) добавляли H₂O (30 мл) и моногидрат LiOH (4,4 г, 104,85 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 2 ч при КТ. По истечении этого времени реакционную среду разбавляли H₂O (200 мл), затем подкисляли при рН 25N HCl (20 мл) и экстрагировали EtOAc (2x250 мл). Объединенные органические фазы промывали H₂O (500 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом, разбавляли Et₂O и концентрировали под вакуумом с получением 26,9 г фрагмента В в виде белого твердого вещества (94%).

1Н-ЯМР (300 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 1,21-1,37 (м, 9H); 2,74 (дд, J=11,0 и 14,3 Гц, 1H); 2,96 (дд, J=5,0 и 14,3 Гц, 1H); 3,81 (с, 3H); 4,04 (м, 1H); 6,99-7,09 (м, 2H); 7,18 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,29 (д, J=2,3 Гц, 1H); 12,60 (уш.м, 1H).

Синтез фрагмента С1: метил-3-амино-2,2-диметилпропаноата гидрохлорида но Vnhboc — JUhb. - о ° М HCl nU X NHdOC U X NHdOC и X Г\1г1₂, ни

С1

Соединение 6: метил-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2,2-диметилпропаноат.

В атмосфере аргона к раствору 3-([(трет-бутокси)карбонил]амино)-2,2-диметилпропановой кислоты (номер CAS [180181-02-6], 250 мг, 1,09 ммоль) в ДХМ (6 мл) и MeOH (2 мл) добавляли по каплям при 0°С (триметилсилил)диазометан (819,86 мкл, 1,64 ммоль) до желтого стойкого цвета. Затем добавляли АсОН до полного обесцвечивания. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом, затем разбавляли H₂O и дважды экстрагировали ДХМ. Объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым

- 102 035625 раствором, высушивали над MgSO4, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением

260 мг соединения 6 в виде бесцветного масла (колич.).

Фрагмент C1: метил-3-амино-2, 2-диметилпропаноата гидрохлорид.

К раствору соединения 6 (260 мг, 1,12 ммоль) в 1,4-диоксане (10 мл) добавляли 4N HCl в 1,4диоксане (2,81 мл, 11,24 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, затем концентрировали под вакуумом с получением 200 мг фрагмента C1 (колич.).

Синтез фрагмента C2: метил-3-амино-2,2-диметилбутаноата гидрохлорида

Соединение 7: 3-((трет-бутоксикарбонил)амино)бутановая кислота.

К раствору DL-3-аминомасляной кислоты (номер CAS [541-48-02], 18,72 г, 176,09 ммоль) в H₂O (96 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (39,62 г, 176,09 ммоль) и NaOH (8,03 г, 200,74 ммоль) в H2O (76 мл), затем трет-бутиловый спирт (132 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. По истечении этого времени реакционную среду концентрировали под вакуумом, затем разбавляли EtOAc (200 мл) и подкисляли при рН 3 разбавленной HCl. После осаждения водн. фазу экстрагировали EtOAc (200 мл). Объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 34,5 г соединения 7 в виде бесцветного масла (82%).

1Н-ЯМР (300 МГц, δ в м.д., CDCl₃-di): 1,25 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,45 (с, 9H); 2,55 (м, 2H); 4,04 (м, 1H); 4,93 (уш.м, 1H); 8,41 (уш.м, 1H).

Соединение 8: метил-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)бутаноат.

В атмосфере аргона раствор соединения 7 (10 г, 49,20 ммоль) в толуоле (350 мл) и MeOH (100 мл) перемешивали при +5°С. Между +5°С и +10°С добавляли по каплям (триметилсилил)диазометан (73,81 мл, 147,61 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 3 ч, затем испаряли под вакуумом с получением 10,8 г соединения 8 в виде бледно-желтого масла (колич.).

1Н-ЯМР (300 МГц, δ в м.д., CDCl3-d1): 1,20 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,45 (с, 9H); 2,50 (м, 2H); 3,69 (с, 3H); 4,03 (м, 1H); 4,90 (уш.м, 1H).

Соединение 9: метил-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-метилбутаноат.

В атмосфере аргона к раствору LDA (2M в ТГФ, 25,32 мл, 50,63 ммоль) в ТГФ (48 мл) при -70°С добавляли по каплям раствор соединения 8 (5 г, 23,01 ммоль) в ТГФ (62 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при -75°С, затем по каплям добавляли иодометан (5,79 мл, 92,05 ммоль) при -70°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при -75°С, затем при КТ в течение ночи. По истечении этого времени добавляли водн. раствор 20% NH4Cl (100 мл) и Et2O (125 мл). После осаждения органическую фазу промывали насыщ. NaHCO₃ (80 мл), затем насыщ. NaCl (80 мл). Объединенные водн. фазы экстрагировали Et₂O (125 мл). Объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 5,49 г неочищенного масла. Кристаллизация пентаном (15 мл) обеспечивала 2,65 г соединения 9 после сушки под вакуумом. Раствор пентана концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 100 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/Е^О) с получением 1,98 г соединения 9. Две партии объединяли (87%) и использовали как таковые на следующей стадии.

Соединение 10: метил-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2,2-диметилбутаноат.

В атмосфере аргона ТГФ (46 мл) охлаждали при -72°С, затем добавляли LDA (2M в ТГФ, 22 мл, 44,0 ммоль) и по каплям добавляли при -72°С (±2°С) раствор соединения 9 (4,60 г, 19,89 ммоль) в ТГФ (64 мл). Реакционную смесь перемешивали 1 ч 15 при -75°С, затем по каплям добавляли иодометан (5 мл, 79,55 ммоль) при -72°С (±2°С). Реакционную среду перемешивали в течение 3 ч при -75°С, затем в течение ночи при КТ. По истечении этого времени добавляли водн. раствор 20% NH₄Cl (50 мл) и Et₂O (80 мл). После осаждения органическую фазу промывали насыщ. NaHCO3 (50 мл) и насыщ. солевым раствором (50 мл). Объединенные водн. фазы экстрагировали Et2O (80 мл). Объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 6,5 г неочищенного масла, которое очищали с помощью флэш-хроматографии на 200 г силикагеля (градиентное элюирование гептанЛРг₂О) с получением 1,9 г соединения 10 в виде бесцветного масла (39%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО^): 0,92 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,02 (с, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,48 (с, 9H); 3,58 (с, 3H); 3,88 (м, 1H); 6,62 (уш.д, J=10,5 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=146, m/z=246 [М+Н]⁺; t_R=1,2 мин.

Фрагмент С2: метил-3-амино-2,2-диметилбутаноата гидрохлорид.

В круглодонную колбу при магнитном перемешивании вводили соединение 10 (0,3 г, 1,22 ммоль) с

- 103 035625 последующим добавлением 1,4-диоксана (5 мл) и 4N HCl в 1,4-диоксане (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, затем концентрировали под вакуумом. Полученное неочищенное твердое вещество осаждали в iPr₂O (15 мл), отфильтровывали и высушивали с получением 210 мг фрагмента C2 в виде белого твердого вещества (95%).

ЖХМС (A1): ES m/z=146 [M+H]+; t_R=0,8 мин.

Синтез фрагмента C3: этил-2-(1-аминоциклопропил)-2,2-диметилпропаноата

В атмосфере аргона к раствору этил-2-циано-2-метилпропионата (номер CAS [1572-98-1], 2 г, 13,88 ммоль) в Et₂O (48 мл) добавляли изопропоксид титана(^) (4,63 г, 15,97 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 10 мин при КТ, затем охлаждали при -5°С. Раствор этилмагнийбромида 3М в Et₂O (9,72 мл, 29,16 ммоль) добавляли по каплям при (-5)-0°С через 25 мин, затем реакционную смесь перемешивали 40 мин без охлаждающей бани. В это время ТСХ показала, что реакция была завершена. Реакционную среду охлаждали при 0°С и добавляли по каплям при 0°С диэтилэфират трифторида бора (3М в Et₂O, 3,6 мл, 29,16 ммоль).

Реакционную смесь перемешивали 30 мин без охлаждающей бани. По истечении этого времени 1N HCl добавляли при 0°С до рН 1-2 (8 мл), затем 2N NaOH до рН 8 (28 мл), реакционную смесь экстрагировали EtOAc (3x150 мл). Объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 2,4 г неочищенного желтого масла, которое очищали с помощью флэш-хроматографии на 70 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 915 мг фрагмента C3 в виде бледно-желтого масла (39%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., CDCl₃-d1): 0,52 (м, 2H); 0,70 (м, 2H); 1,11 (с, 6H); 1,27 (т, J=7,2 Гц, 3H); 1,64 (уш.с, 2H); 4,18 (к, J=7,2 Гц, 2H).

Синтез фрагмента C4: метил-3-амино-2-(гидроксиметил)-2-метилпропаноата гидрохлорида

С4 13

Соединение 11: 3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-метилпропановая кислота.

К раствору DL-3-аминоизомасляной кислоты (номер CAS [10569-72-9], 5 г, 47,52 ммоль) в 2N NaOH (24,7 мл) добавляли по каплям раствор Boc₂O (11,73 г, 53,22 ммоль) в ТГФ (75 мл), поддерживая температуру реакционной среды ниже 30°С с помощью холодной водяной бани. Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 18 ч, затем концентрировали под вакуумом, разбавляли в H2O (75 мл) и промывали МТБЭ (3x150 мл). Водную фазу подкисляли до рН 3 с помощью добавления лимонной кислоты при 100 г/л (150 мл) и экстрагировали EtOAc (3x150 мл). Объединенные органические фазы промывали H2O (3x45 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 9,4 г соединения 11 в виде бесцветного масла (97%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО^): 1,01 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,38 (с, 9H); 2,48 (м, 1H); 2,91 (дт, J=6,1, 6,5 и 13,5 Гц, 1H); 3,15 (ддд, J=6,1, 7,4 и 13,5 Гц, 1H); 6,80 (т, J=6,1 Гц, 1H); 12,15 (уш.с, 1H).

Соединение 12: метил-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-метилпропаноат.

К раствору соединения 11 (9,4 г, 46,25 ммоль) в ацетоне (300 мл) добавляли K2CO3 (16,14 г, 115,63 ммоль) и CH₃I (13,26 г, 92,5 ммоль). Реакционную среду, желтую суспензию, перемешивали при КТ в течение 20 ч, затем отфильтровывали через Clarcel. Полученный таким образом осадок промывали ацетоном, фильтрат концентрировали под вакуумом, разбавляли ДХМ (100 мл), отфильтровывали через Clarcel, полученный таким образом осадок промывали ДХМ и фильтрат концентрировали под вакуумом с получением 9,4 г соединения 12 в виде желтой жидкости (93%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО^): 1,01 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,37 (с, 9H); 2,54 (м, 1H); 2,91 (дт, J=6,2 и 13,5 Гц, 1H); 3,15 (ддд, J=6,2, 6,9 и 13,5 Гц, 1H); 3,59 (с, 3H); 6,90 (т, J=6,2 Гц, 1H).

Соединение 13: метил-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-(((4-метоксибензил)окси)метил)-2метилпропаноат.

К раствору DIEA (3,2 мл, 22,45 ммоль) в ТГФ (10 мл), охлажденном при -75°С, по каплям добавляли раствор 1,6М н-BuLi в ТГФ (14 мл, 22,4 ммоль). Реакционную среду перемешивали при -75°С в течение 20 мин; затем добавляли по каплям при -75°С раствор соединения 12 (2 г, 9,21 ммоль) в ТГФ (16 мл) и реакционную смесь перемешивали при -75°С в течение 10 мин. Затем к реакционной смеси быстро до- 104 035625 бавляли раствор 1-((хлорметокси)метил)-4-метоксибензола (1,72 г, 9,21 ммоль) в ТГФ (16 мл) и перемешивание продолжали при -25°С в течение 4 ч. Реакционную среду разбавляли ДХМ (100 мл) перед добавлением раствора лимонной кислоты при 100 г/л (50 мл), поддерживая температуру ниже 5°С. Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 15 мин. Органическую фазу промывали раствором лимонной кислоты при 100 г/л (2x50 мл), H₂O (3x50 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 4,08 г желто-оранжевого масла, которое очищали с помощью флэш-хроматографии на 150 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/EtOAc) с получением 2,05 г соединения 13 в виде бесцветного масла (60%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСОЧ): 1,03 (с, 3H); 1,37 (с, 9H); 3,14 (д, J=6,8 Гц, 2H); 3,31 (д, J=9,1 Гц, 1H); 3,48 (д, J=9,1 Гц, 1H); 3,58 (с, 3H); 3,73 (с, 3H); 4,38 (с, 2H); 6,76 (т, J=7,1 Гц, 1H); 6,90 (д, J=8,9 Гц, 2H); 7,20 (м, 2H).

Фрагмент C4: метил-3-амино-2-(гидроксиметил)-2-метилпропаноата гидрохлорид.

Соединение 13 (1,5 г, 4,08 ммоль) обрабатывали 4М раствором HCl в диоксане (24 мл) при КТ в течение 1 ч. Реакционную среду затем концентрировали под вакуумом и совместно испаряли в присутствии толуола с получением 794 мг фрагмента C4 в виде вязкого масла (колич.).

Синтез AD1: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-амино-4-метилпентаноил)окси)-8-(4-(αзидометил) фенил)-6-метилокта-2,7-диеноата

Соединение 14: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)4-метилпентаноил)окси)-8-(4-формилфенил)-6-метилокта-2,7-диеноат.

В атмосфере аргоне в круглодонной колбе при магнитном перемешивании вводили Fmoc-Leu-OH (4,9 г, 13,86 ммоль) с последующим добавлением фрагмента A (3,5 г, 10,59 ммоль) в ДХМ (100 мл) и DIEA (6,6 мл, 38,13 ммоль). Затем добавляли MNBA (5 г, 14,52 ммоль) и ДМАП (620 мг, 5,07 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при КТ. По истечении этого времени реакционную среду промывали H2O (100 мл) и насыщ. солевым раствором (100 мл). Органическую фазу высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 9,1 г неочищенного оранжевого масла, которое очищали с помощью флэш-хроматографии на 400 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 5 г соединения 14 в виде бледно-желтого масла (71%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,77 (д, J=6,8 Гц, 6H); 1,05 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,33-1,64 (м, 4H); 1,38 (с, 9H); 2,39-2,63 (частично скрытый м, 2H); 4,01 (м, 1H); 4,13-4,31 (м, 3H); 4,95 (м, 1H); 5,81 (д, J=15,9 Гц, 1H); 6,37 (дд, J=8,8 и 16,2 Гц, 1H); 6,52 (д, J=16,2 Гц, 1H); 6,70 (тд, J=7,3 и 15,9 Гц, 1H); 7,29 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,40 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,56 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,67 (дд, J=7,9 Гц, 2H); 7,74-7,82 (м, 3H); 7,87 (д, J=7,9 Гц, 2H); 9,93 (с, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=666 [M+H]+, m/z=689 [M+Na]⁺; t_R=1,92 мин.

Соединение 15: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)4-метилпентаноил)окси)-8-(4-(гидроксиметил)фенил)-6-метилокта-2,7-диеноат.

В атмосфере аргона к раствору соединения 14 (5 г, 7,51 ммоль) в МеТГФ (60 мл) порциями добавляли триметоксиборгидрид натрия (1,2 г, 8,91 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 5 ч при КТ. По истечении этого времени добавляли насыщ. NH₄Cl (100 мл) и ацетон (20 мл). Реакционную среду перемешивали в течение 1 ч при КТ. После осаждения органическую фазу промывали H2O, затем насыщ. солевым раствором (50 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 5,3 г неочищенного желтого масла, которое очищали с помощью флэшхроматографии на 300 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 3,15 г соединения 15 в виде белого полутвердого вещества (63%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,80 (м, 6H); 1,02 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,35-1,66 (м, 4H); 1,38 (с, 9H); 2,35-2,56 (частично скрытый м, 2H); 4,02 (м, 1H); 4,15-4,32 (м, 3H); 4,43 (д, J=5,5 Гц, 2H); 4,92 (м,

- 105 035625

1H); 5,12 (т, J=5,5 Гц, 1H); 5,80 (д, J=15,9 Гц, 1H); 6,10 (дд, J=8,8 и 16,2 Гц, 1H); 6,39 (д, J=16,2 Гц, 1H);

6,69 (м, 1H); 7,20 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,28-7,33 (м, 4H); 7,41 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,69 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,80 (д,

J=8,2 Гц, 1H); 7,88 (д, J=7,9 Гц, 2H). ЖХМС (A1): ES m/z=668 [М+Н]+; m/z=690 [M+Na]+; m/z=712 [MH+HCO2H]^-; tR=1,84 мин.

Соединение 16: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)4-метилпентаноил)окси)-8-(4-(азидометил)фенил)-6-метилокта-2,7-диеноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили соединение 15 (3,15 г, 4,72 ммоль) и ДХМ (50 мл). При 0°С добавляли ТЭА (987 мкл, 7,08 ммоль) с последующим добавлением метансульфонилхлорида (438 мкл, 5,66 ммоль), реакционную среду перемешивали в течение 1 ч при 0°С и 13 ч при КТ. По истечении этого времени добавляли ДХМ (50 мл) и воду (50 мл). После осаждения органическую фазу промывали насыщ. солевым раствором (3x25 мл), высушивали над MgSO₄ и концентрировали под вакуумом. В атмосфере аргона полученный таким образом неочищенный продукт растворяли в ДМФ (50 мл) и добавляли азид натрия (644 мг, 9,91 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение ночи при КТ. По истечении этого времени ДМФ концентрировали под вакуумом и добавляли AcOEt. Полученную смесь промывали 0,1N HCl (25 мл), насыщ. NaHCO₃ (25 мл) и насыщ. солевым раствором (25 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 3,3 г неочищенного продукта, который очищали с помощью флэш-хроматографии на 200 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 1,8 г соединения 16 в виде бесцветной смолы (55%) и 740 мг соединения AD1 (33%).

ЖХМС (A2): ES m/z=715 [M+Na]+; t_R=8,95 мин.

Соединение AD1: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-амино-4-метилпентаноил)окси)-8-(4-(азидометил)фенил)-6-метилокта-2,7-диеноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу при магнитном перемешивании вводили соединение 16 (1,8 г, 2,6 ммоль) и ДХМ (50 мл) с последующим добавлением пиперидина (1,6 мл, 16,2 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение ночи при КТ. По истечении этого времени ее промывали 1N HCl, затем насыщ. NaHCO₃, насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 2 г неочищенного продукта, который очищали с помощью флэшхроматографии на 130 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 1,48 г соединения AD1 в виде бледно-желтого масла (колич.).

ЖХМС (A3): ES m/z=471 [M+H]+; t_R=2,65 мин.

Синтез AD2: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-амино-4,4-диметилпентаноил)окси)-8-(4-(гидроксиметил)фенил)-6-метилокта-2,7-диеноата гидрохлорида

Соединение 17: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)4,4-диметилпентаноил)окси)-8-(4-формилфенил)-6-метилокта-2,7-диеноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения A (1,633 г, 4,94 ммоль) в ДХМ (60 мл) добавляли L-Fmoc-трет-Leu-OH (1,82 г, 4,94 ммоль), DIEA (2,57 мл, 14,83 ммоль), MNBA (1,70 г, 4,94 ммоль) и ДМАП (241,51 мг, 1,98 ммоль). После перемешивания в течение 2 ч при КТ реакционную среду разбавляли H₂O (50 мл) и дважды экстрагировали ДХМ. Объединенные органические фазы промывали лимонной кислотой (2x50 мл), насыщ. NaHCO₃ (50 мл) и насыщ. солевым раствором (50 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 3,24 г неочищенного соединения 17, используемого непосредственно в последующем восстановлении (96%).

Соединение 18: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)4,4-диметилпентаноил)окси)-8-(4-(гидроксиметил)фенил)-6-метилокта-2,7-диеноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 17 (3,24 г, 4,77 ммоль) в МеТГФ (60 мл) добавляли триметоксиборгидрид натрия (670,56 мг, 5,24 ммоль) при 0°С. После перемешивания в течение 1 ч при КТ добавляли дополнительное количество триметоксиборгидрида натрия (304 мг, 2,38 ммоль) и перемешивали в течение 2 ч. Затем реакционную среду охлаждали при 0°С, разбавляли ацетоном (18 мл) и насыщ. NH₄Cl (36 мл) и экстрагировали AcOEt. Объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 100 г силикагеля (градиент гептан/AcOEt) с по- 106 035625 лучением 2,61 г соединения 18 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (80%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,80 (с, 9H); 1,02 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,35-1,60 (м, 4H); 1,38 (с, 9H); 2,37-2,58 (частично скрытый м, 2H); 4,04 (м, 1H); 4,16-4,33 (м, 3H); 4,45 (д, J=5,7 Гц, 2H); 4,91 (м, 1H); 5,12 (т, J=5,7 Гц, 1H); 5,80 (д, J=16,0 Гц, 1H); 6,10 (дд, J=8,8 и 16,2 Гц, 1H); 6,39 (д, J=16,2 Гц, 1H); 6,69 (м, 1H); 7,21 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,25-7,33 (м, 4H); 7,40 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,68 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,78 (д, J=8,3 Гц, 1H); 7,88 (д, J=7,9 Гц, 2H). ЖХМС (A1): ES m/z=608; m/z=682 [M+H]+; m/z=726 [M-H+HCO2H]^-; tR=1,85 мин.

Соединение AD2: (2E,5S,6R,7E)-трет-бутил-5-(((S)-2-амино-4,4-диметилпентаноил)окси)-8-(4(гидроксиметил)фенил)-6-метилокта-2,7-диеноата гидрохлорид.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 18 (2,61 г, 3,83 ммоль) в ДХМ (40 мл) добавляли пиперидин (7,60 мл, 76,56 ммоль) и реакционную среду перемешивали в течение 1 ч при КТ. Затем ее концентрировали и экстрагировали AcOEt. Объединенные органические слои промывали 1N HCl, H₂O и насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом. Остаток разбавляли iPr₂O (50 мл) и перемешивали в течение 40 ч при КТ. Неочищенный продукт отфильтровывали, промывали iPr₂O и высушивали под вакуумом в течение 3 ч при 40°С с получением 1,706 г соединения AD2 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (90%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,88 (с, 9H); 1,10 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,39-1,49 (м, 1H); 1,42 (с, 9H); 1,75 (дд, J=6,1 и 15,1 Гц, 1H); 2,47-2,64 (частично скрытый м, 2H); 3,92 (т, J=5,5 Гц, 1H); 4,47 (д, J=5,7 Гц, 2H); 5,02 (м, 1H); 5,15 (т, J=5,7 Гц, 1H); 5,90 (д, J=15,9 Гц, 1H); 6,15 (дд, J=8,3 и 16,1 Гц, 1H); 6,44 (д, J=16,1 Гц, 1H); 6,77 (тд, J=7,3 и 15,9 Гц, 1H); 7,26 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,34 (д, J=8,4 Гц, 2H); 8,10 (уш.м, 3H). ЖХМС (A1): ES m/z=460 [M+H]+; t_R=0,95 мин.

Синтез AD3: (2R,3S)-1-((4-метоксибензил)окси)-2-метилгекс-5-ен-3-ил-(S)-2-амино-4,4-диметилпентаноата

Соединение 19: (2К^)-1-((4-метоксибензил) окси)-2-метилгекс-5-ен-3-ил-(S)-2-((((9H-флуорен-9ил)метокси)карбонил)амино)-4,4-диметилпентаноат.

К раствору спирта Сакураи (1,02 г, 4,08 ммоль) и (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил) амино)-4,4-диметилпентановой кислоты (1,5 г, 4,08 ммоль) в ТГФ (15 мл) добавляли 2,4,6трихлорбензоилхлорид (1,02 г, 4,08 ммоль), по каплям ТЭА (1,14 мл, 8,16 ммоль) и ДМАП (126,0 мг, 1,02 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 5 ч, затем охлаждали, используя ледяную баню, перед добавлением 1N HCl (60 мл), поддерживая температуру ниже 10°С. Полученную среду перемешивали при КТ в течение 15 мин и экстрагировали EtOAc (3x50 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщ. NaHCO₃ (15 мл), насыщ. солевым раствором (3x15 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью трех последовательных флэшхроматографий на силикагеле (150 г, градиентное элюирование гептан/EtOAc, 150 г и 20 г, градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 1,78 г соединения 19 в виде бесцветного масла (72%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,85 (д, J=7,1 Гц, 3H); 0,89 (с, 9H); 1,51 (дд, J=2,8 и 14,3 Гц, 1H); 1,61 (дд, J=9,0 и 14,3 Гц, 1H); 1,95 (м, 1H); 2,21 (м, 1H); 2,31 (м, 1H); 3,20 (дд, J=6,5 и 9,6 Гц, 1H); 3,35 (м, 1H); 3,73 (с, 3H); 4,04 (м, 1H); 4,18-4,34 (м, 5H); 4,83 (м, 1H); 5,00 (дк, J=2,1 и 10,3 Гц, 1H); 5,05 (дк, J=2,1 и 7,3 Гц, 1H); 5,70 (м, 1H); 6,87 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,17 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,30 (м, 2H); 7,41 (т, J=7,8 Гц, 2H); 7,70 (д, J=7,8 Гц, 2H); 7,75 (д, J=8,3 Гц, 1H); 7,90 (д, J=7,8 Гц, 2H). ЖХМС (A5): ES m/z=600 [M+H]+; m/z=617 [M+H+NH₃]+; m/z=644 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,86 мин.

Соединение AD3: (2R,3 S)-1 -((4-метоксибензил)окси)-2-метилгекс-5-ен-3 -ил-^)-2-амино-4,4диметилпентаноат.

К раствору соединения 19 (1,78 г, 2,98 ммоль) в ДХМ (63 мл) добавляли по каплям пиперидин (1,77 мл, 17,9 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 4 ч, разбавляли ДХМ (150 мл), промывали 1N HCl (2x20 мл), насыщ. NaHCO₃ (20 мл), насыщ. солевым раствором (3x20 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэшхроматографии на 50 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/EtOAc) с получением 644 мг соединения AD3 в виде бесцветного масла (57%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,88 (с, 9H); 0,89 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,21 (дд, J=6,9 и 13,9 Гц, 1H); 1,56 (дд, J=5,0 и 13,9 Гц, 1H); 1,66 (уш.с, 2H); 2,00 (м, 1H); 2,24 (м, 1H); 2,33 (м, 1H); 3,26 (м, 2H); 3,38 (дд, J=5,5 и 9,4 Гц, 1H); 3,74 (с, 3H); 4,36 (с, 2H); 4,84 (м, 1H); 5,00-5,10 (м, 2H); 5,72 (м, 1H); 6,89 (д, J=8,8 Гц, 2H); 7,22 (д, J=8,8 Гц, 2H). ЖХМС (A5): ES m/z=378 [M+H]+; t_R=0,88 мин.

- 107 035625

Синтез BC1: 3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2диметилпропановой кислоты

Соединение 20: метил-3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилпропаноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили фрагмент C1 (981,45 мг, 4,00 ммоль) и ДХМ (50 мл) с последующим добавлением DIEA (1,84 мл, 10,92 ммоль), фрагмента B (1,2 г, 3,64 ммоль), HOBt (563,40 мг, 4,00 ммоль) и EDC (1,45 мл, 8,01 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение ночи при КТ. По истечении этого времени реакционную среду разбавляли H₂O (30 мл) и дважды экстрагировали ДХМ. Объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 2,5 г неочищенного масла, которое очищали с помощью флэш-хроматографии на 110 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 1,06 г соединения 20 в виде белого безе (66%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-д6): 1,06 (с, 3H); 1,07 (с, 3H); 1,30 (с, 9H); 2,65 (дд, J=11,6 и 13,9 Гц, 1H); 2,82 (дд, J=4,0 и 13,9 Гц, 1H); 3,18 (дд, J=6,1 и 13,4 Гц, 1H); 3,29 (частично скрытый м, 1H); 3,60 (с, 3H); 3,81 (с, 3H); 4,11 (м, 1H); 6,90 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=2,3 и 8,6 Гц, 1H); 7,33 (уш.с, 1H); 7,75 (большой т, J=6,1 Гц, 1H).

Соединение BC1: 3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилпропановая кислота.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили соединение 20 (1,06 г, 2,39 ммоль) и ТГФ (25 мл) с последующим добавлением LiOH (70,18 мг, 2,87 ммоль) и H2O (1 мл). Реакционную среду перемешивали в течение нескольких часов перед добавлением 70 мг LiOH и перемешивали в течение ночи при КТ. По истечении этого времени добавляли смолу Amberlit до рН 4, отфильтровывали, затем промывали ТГФ и концентрировали под вакуумом с получением 1 г соединения BC1 в виде белого твердого вещества (97%).

Синтез ВС2: 3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2диметилбутановой кислоты

Соединение 21: метил-3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутаноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили фрагмент B (1,02 г, 2,78 ммоль) и ДХМ (25 мл) с последующим добавлением EDC (592 мг, 3,03 ммоль) и HOBt (478 мг, 3,03 ммоль). Реакционную среду перемешивали 15 мин, затем добавляли фрагмент C2 (0,5 г, 2,75 ммоль) и DIEA (1,7 мл, 9,73 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение ночи при КТ. По истечении этого времени реакционную среду концентрировали под вакуумом, затем разбавляли AcOEt. Органический слой промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 1,45 г неочищенного масла, которое очищали с помощью флэш-хроматографии на 100 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 845 мг соединения 21 в виде белой пены (67%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСОМ₆): смесь диастереомеров 50:50; 0,87 (д, J=6,8 Гц, 1,5H); 0,97 (д, J=6,8 Гц, 1,5H); 1,01 (с, 1,5H); 1,03 (с, 1,5H); 1,07 (с, 3H); 1,31 (с, 9H); 2,58-2,87 (м, 2H); 3,59 (с, 1,5H); 3,60

- 108 035625 (с, 1,5H); 3,81 (с, 3H); 3,99-4,20 (м, 2H); 6,90 (д, J=9,0 Гц, 0,5H); 6,97 (д, J=9,0 Гц, 0,5H); 7,05 (уш.д, J=8,6

Гц, 1H); 7,19 (расщепл. дд, J=2,4 и 8,6 Гц, 1H); 7,32 (д, J=2,4 Гц, 0,5H); 7,34 (д, J=2,4 Гц, 0,5H); 7,54 (д,

J=10,1 Гц, 0,5H); 7,62 (д, J=10,1 Гц, 0,5H). ЖХМС (A3): смесь диастереомеров 50:50; ES m/z=457 [M+H]+;

m/z=479 [M+Na]+; t_R=3,19-3,2 мин.

Соединение 21 стереоизомеры 1 и 2: метил-3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутаноат стереоизомеры 1 и 2.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору фрагмента B (1,17 г, 3,55 ммоль) в ДХМ (30 мл) добавляли EDC (741,75 мг, 3,87 ммоль), HOBt (592,57 мг, 3,87 ммоль). После перемешивания в течение 15 мин при КТ добавляли фрагмент C2 (639 мг, 3,52 ммоль) и DIEA (2,17 мл, 12,31 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 4 ч, затем концентрировали и разбавляли AcOEt (100 мл). Органические слои промывали H2O (2x10 мл) и насыщ. солевым раствором (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали с помощью флэшхроматографии на 50 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 1,306 г смеси диастереомеров (81%), которые разделяли двумя последовательными флэш-хроматографиями, первая на 100 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 376 мг соединения 21 стереоизомера 1 (23%), вторая на 70 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 181 мг соединения 21 стереоизомера 1 (11%), 279 мг соединения 21 стереоизомера 2 (17%) и 476 мг смеси диастереомеров.

Соединение 21 стереоизомер 1

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСОО: 0,85 (д, J=6,8 Гц, 3H); 1,07 (с, 6H); 1,31 (с, 9H); 2,57 (м, 1H); 2,80 (дд, J=5,2 и 13,8 Гц, 1H); 3,60 (с, 3H); 3,81 (с, 3H); 4,05 (м, 1H); 4,16 (м, 1H); 6,99 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,34 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,57 (д, J=10,1 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=381; m/z=401; m/z=455 [M-H]-; m/z=457 [M+H]+; t_R=1,29 мин.

Соединение 21 стереоизомер 2

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,95 (д, J=6,8 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,03 (с, 3H); 1,31 (с, 9H); 2,55 (м, 1H); 2,80 (дд, J=5,0 и 14,3 Гц, 1H); 3,59 (с, 3H); 3,81 (с, 3H); 4,09-4,22 (м, 2H); 6,92 (д, J=8,8 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,34 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,64 (д, J=10,1 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=381; m/z=401; m/z=455 [M-H]^-; m/z=457 [M+H]+; t_R=1,29 мин.

Соединение BC2: 3 -(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3 -(3 -хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутановая кислота.

Соединение 21 (0,845 г, 1,85 ммоль) и MeOH (20 мл) вводили в круглодонную колбу с последующим добавлением 1,8 мл 10М NaOH. Раствор перемешивали и нагревали при 50°С в течение ночи. Реакционную среду испаряли под вакуумом, затем разбавляли H2O (20 мл) и нейтрализовали 5N HCl. Раствор дважды экстрагировали AcOEt. Объединенные органические слои промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 800 мг соединения BC2 в виде белой пены (97%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-d^: смесь диастереомеров 50:50; 0,91 (д, J=6,8 Гц, 1,5H); 0,97 (д, J=6,8 Гц, 1,5H); 1,00 (с, 3H); 1,03 (с, 1,5H); 1,07 (с, 1,5H); 1,31 (с, 9H); 2,57 (м, 1H); 2,83 (м, 1H); 3,81 (с, 3H); 4,01-4,16 (м, 2H); 6,90 (д, J=9,0 Гц, 0,5H); 6,95 (д, J=9,0 Гц, 0,5H); 7,03 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,20 (уш., J=8,6 Гц, 1H); 7,31 (уш.с, 1H); 7,49 (д, J=10,1 Гц, 0,5H); 7,54 (д, J=10,1 Гц, 0,5H); 11,94 (уш.м, 1H). ЖХМС (A1): смесь диастереомеров 50:50; ES m/z=387; m/z=443 [M+H]+; t_R=1,20-l,21 мин.

Соединение BC2 стереоизомер 1: 3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутановая кислота стереоизомер 1.

Соединение 21 стереоизомер 1 (0,325 г, 1,85 ммоль) и MeOH (8 мл) вводили в круглодонную колбу с последующим добавлением 0,692 мл 10М NaOH. Желтый раствор перемешивали и нагревали при 50°C в течение ночи. Реакционную среду испаряли под вакуумом, затем разбавляли H2O (20 мл) и экстрагировали AcOEt (3x5 мл). Водн. слои подкисляли 5N HCl и экстрагировали AcOEt (3x30 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором (5 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 303 мг соединения BC2 стереоизомера 1 в виде белой пены (96%), используемой непосредственно в следующей реакции.

Соединение BC2 стереоизомер 2: 3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутановая кислота стереоизомер 2.

Соединение 21 стереоизомер 2 (1,094 г, 2,39 ммоль), ТГФ (5 мл) и H2O (5 мл) вводили в круглодонную колбу с последующим добавлением LiOH (301 мг, 7,18 ммоль). Раствор перемешивали в течение 44 ч при КТ. Реакция не была завершена, добавляли LiOH (301 мг). Смесь перемешивали в течение 48 ч, затем добавляли 301 мг LiOH в ТГФ (10 мл) и H2O (5 мл) и реакционную среду перемешивали в течение 40 ч при 60°C. Реакционную среду испаряли под вакуумом. 1М лимонную кислоту добавляли до рН 2 и смесь экстрагировали AcOEt (2x20 мл). Объединенные органические слои промывали H2O, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 1,096 г соединения BC2 стереоизомера 2 в виде белого аморфного твердого вещества (колич.), используемого непосредственно в следующей реакции.

- 109 035625

Синтез BC3: эти.1-2-((И)-1 -(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)циклопропил)-2-метилпропановой кислоты

Соединение 22: этил-2-(да-1-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)циклопропил)-2-метилпропаноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили фрагмент C3 (1,2 г, 7,01 ммоль) и ТГФ (16,5 мл) с последующим добавлением фрагмента B (2,54 г, 7,71 ммоль), HOBt (1,77 г, 8,76 ммоль), EDC (1,23 г, 8,06 ммоль) и DIEA (1,35 мл, 7,71 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 2 ч при КТ. По истечении этого времени реакционную среду разбавляли H₂O (25 мл) и экстрагировали AcOEt (250 мл). Органические слои промывали H₂O (2x25 мл), насыщ. солевым раствором (2x25 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии, первая на 200 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 2,16 г соединения 22 в виде бесцветной пены (64%) и 343 мг смеси, содержащей ожидаемое соединение, которое дополнительно очищали на 30 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 160 мг соединения 22 в виде бесцветной пены (4,7%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,62 (м, 1H); 0,74-0,99 (м, 3H); 1,03 (с, 3H); 1,10 (с, 3H); 1,24 (т, J=7,2 Гц, 3H); 1,42 (с, 9H); 2,90 (м, 2H); 3,88 (с, 3H); 4,08 (м, 1H); 4,10 (к, J=7,2 Гц, 2H); 4,96 (м, 1H); 6,33 (уш.с, 1H); 6,85 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,03 (дд, J=2,4 и 8,5 Гц, 1H); 7,17 (д, J=2,4 Гц, 1H).

Соединение BC3: 2-((R)-1 -(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)циклопропил)-2-метилпропановая кислота.

Соединение 22 (2,09 г, 4,33 ммоль), ТГФ (10 мл) и H₂O (8 мл) вводили в круглодонную колбу с последующим добавлением LiOH (726,33 мг, 17,31 ммоль). Раствор перемешивали и нагревали при 65°С. Через 16 ч реакция не была завершена, добавляли 726,33 мг LiOH в 10 мл H₂O. Смесь перемешивали в течение 48 ч при 65°С. После охлаждения реакционную среду разбавляли H₂O (20 мл), затем экстрагировали AcOEt (3x40 мл). Органические слои промывали H₂O (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 1,29 г смеси сложного эфира/кислоты. Водн. слой подкисляли 5N HCl до рН 3, затем экстрагировали AcOEt (3x50 мл). Органические слои промывали H₂O (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 787 мг соединения BC3 в виде бежевой пены (40%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСОА): 0,50-0,90 (м, 4H); 1,03 (с, 6H); 1,30 (с, 9H); 2,60 (дд, J=10,5 и 14,1 Гц, 1H); 2,78 (дд, J=5,0 и 14,1 Гц, 1H); 3,81 (с, 3H); 3,97 (м, 1H); 6,80 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,18 (дд, J=2,0

Синтез BC4: бутановой кислоты и 8,5 Гц, 1H); 7,31 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,86 (с, 1H); 12,11 (уш.м, 1H).

^)-3-(да-2-акриламидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметил-

Соединение 23: метил-^)-3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутаноат.

К раствору фрагмента B (2 г, 6,06 ммоль) в ДХМ (60 мл) добавляли EDC (1,13 мл, 7,06 ммоль) и

- 110 035625

HOBt (948 мг, 6,67 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 15 мин, затем добавляли метил-^)-3-амино-2,2-диметилбутаноат (881 мг, 6,06 ммоль) и DIEA (1,53 мл, 9,10 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 4 ч, концентрировали под вакуумом и разбавляли EtOAc (100 мл) и H₂O (20 мл). Водную фазу экстрагировали EtOAc (20 мл); объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором (2x20 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 150 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/EtOAc) с получением 2,21 г соединения 23 в виде бесцветного лака (79%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-dg): 0,88 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,08 (с, 6H); 1,32 (с, 9H); 2,67 (дд, J=9,9 и 13,6 Гц, 1H); 2,82 (дд, J=5,2 и 13,6 Гц, 1H); 3,62 (с, 3H); 3,83 (с, 3H); 4,06 (м, 1H); 4,77 (м, 1H); 6,97 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,4 и 8,6 Гц, 1H); 7,33 (д, J=2,4 Гц, 1H); 7,55 (д, J=9,8 Гц, 1H).

Соединение 24: метил-^)-3-(^)-2-амино-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутаноата 2,2,2-трифторацетат.

К раствору соединения 23 (2,2 г, 4,81 ммоль) в ДХМ (25 мл) добавляли ТФУК (3,6 мл, 48,1 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение ночи, концентрировали под вакуумом и соиспаряли в присутствии толуола с получением 2,0 г соединения 24 в виде диастереомерной смеси (88%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-dg): 0,80 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,10 (с, 3H); 2,95 (д, J=7,0 Гц, 2H); 3,62 (с, 3H); 3,84 (с, 3H); 4,00 (м, 1H); 4,15 (м, 1H); 7,10-7,30 (м, 3H); 8,00 (д, J=9,5 Гц, 1H); 8,22 (уш.с, 3H).

Соединение 25: метил-^)-3-(^)-2-акриламидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2диметилбутаноат.

К раствору соединения 24 (2,0 г, 4,25 ммоль) в ДХМ (20 мл) добавляли акрилоилхлорид (536 мкл, 6,37 ммоль) и DIEA (2,5 мл, 12,74 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 2 ч, затем разбавляли H₂O (20 мл). Водную фазу экстрагировали ДХМ (2x20 мл), объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором (2x20 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 100 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/EtOAc) с получением 850 мг соединения 25 в виде смеси диастереомеров 85:15 (68%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,85 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,03 (с, 3H); 1,04 (с, 3H); 2,72 (дд, J=9,7 и 13,9 Гц, 1H); 2,86 (дд, J=5,8 и 13,9 Гц, 1H); 3,58 (с, 3H); 3,80 (с, 3H); 4,15 (м, 1H); 4,56 (м, 1H); 5,56 (дд, J=2,3 и 10,2 Гц, 1H); 6,03 (дд, J=2,3 и 17,2 Гц, 1H); 6,28 (дд, J=10,2 и 17,2 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,17 (дд, J=2,2 и 8,5 Гц, 1H); 7,31 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,72 (д, J=9,8 Гц, 1H); 8,36 (д, J=8,6 Гц, 1H).

Соединение BC4: ^)-3-(^)-2-акриламидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутановая кислота.

К раствору tBuOK (1,11 г, 9,86 ммоль) в ТГФ (4 мл), охлажденному при 0°С, добавляли H2O (47 мкл) и соединение 25 (450 мг, 1,10 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 3 ч, затем подкисляли 1N HCl (5 мл). Водную фазу экстрагировали ДХМ (2x20 мл); объединенные органические фазы промывали H₂O (30 мл), насыщ. солевым раствором (20 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом. Два диастереомера разделяли с помощью сверхкритической флюидной хроматографии на колонке Chiralpak AS 10 мкм (изократическое элюирование при 85/15 СО₂/[MeOH+0,1% ТЭА] с получением 385 мг соединения BC4 в виде аморфного твердого вещества (89%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,88 (д, J=6,9 Гц, 3H); 0,99 (с, 3H); 1,00 (с, 3H); 2,71 (дд, J=9,4 и 13,7 Гц, 1H); 2,88 (дд, J=5,3 и 13,7 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,10 (м, 1H); 4,54 (м, 1H); 5,55 (дд, J=2,3 и 10,2 Гц, 1H); 6,01 (дд, J=2,3 и 17,1 Гц, 1H); 6,28 (дд, J=10,2 и 17,1 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,17 (дд, J=2,4 и 8,7 Гц, 1H); 7,32 (д, J=2,4 Гц, 1H); 7,80 (д, J=9,8 Гц, 1H); 8,39 (д, J=8,8 Гц, 1H); 12,00 (уш.с, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=395 [M-H]^-; m/z=397 [M+H]⁺; tR=0,92 мин.

Синтез BC5: ^)-3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)2,2-диметилбутановой кислоты

Соединение BC5 получали, исходя из метил-^)-3-амино-2,2-диметилбутаноата (MFCD09256689) и после общего синтеза структурного элемента BC, изображенного на схеме 32 и описанного для соединений BC1 и BC2.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,89 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,02 (с, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,30 (с, 9H); 2,68 (дд, J=13,6 и 10,2 Гц, 1H); 2,82 (дд, J=5,2 и 13,6 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,05 (м, 1H); 4,12 (м, 1H); 7,00 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,32 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,52 (д, J=9,9 Гц, 1H); 12,35 (уш.с, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=441 [М-Н]^-; m/z=443 [M+H]⁺; m/z=883 [2M-H]^-; t_R=1,16 мин.

- 111 035625

Синтез BC6 : 3-(^)-2-акриламидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2-(гидроксиметил)-2метилпропановой кислоты

Соединение 26: метил-3-(^)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2-(гидроксиметил)-2-метилпропаноат.

К раствору фрагмента C4 (1,059 г, 5,77 ммоль) в ТГФ (60 мл) добавляли DIEA (2,06 мл, 11,76 ммоль), фрагмент B (1,90 г, 5,77 ммоль), HOBt (935 мг, 6,92 ммоль) и EDC (1,23 мл, 6,92 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 48 ч, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 200 г силикагеля (изократическое элюирование гептан/EtOAc) с получением 1,05 г соединения 26 в виде бесцветного масла (39%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,98 (с, 3H); 1,30 (с, 9H); 2,63 (м, 1H); 2,83 (м, 1H); 3,18-3,48 (м, 4H); 3,60 (с, 3H); 3,80 (с, 3H); 4,10 (м, 1H); 4,81 (м, 1H); 6,98 (д, J=8,9 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,1 и 8,7 Гц, 1H); 7,35 (д, J=2,1 Гц, 1H); 7,83 (м, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=457 [M-H]^-; m/z=459 [M+H]+; m/z=503 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,1 мин.

Соединение 27: метил-3-(^)-2-амино-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2-(гидроксиметил)2-метилпропаноата гидрохлорид.

Соединение 26 (1,05 г, 2,29 ммоль) обрабатывали HCl 4М в диоксане (16 мл, 64 ммоль) в течение 1 ч при КТ. Реакционную среду концентрировали под вакуумом и дважды соиспаряли в присутствии толуола. Неочищенный продукт растирали с iPr₂O (10 мл), отфильтровывали и дважды промывали iPr₂O (5 мл). Затем осадок растворяли в ДХМ, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 809 мг соединения 27 в виде белой пены (90%), которую использовали без дополнительной очистки.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,92 (с, 1,5H); 0,97 (с, 1,5H); 2,88 (м, 1H); 3,00 (м, 1H); 3,193,47 (м, 4H); 3,60 (с, 3H); 3,85 (с, 3H); 4,05 (м, 1H); 4,89 (м, 1H); 7,11 (расщепл. д., J=8,6 Гц, 1H); 7,19 (расщепл. дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,38 (расщепл. д, J=2,0 Гц, 1H); 8,15 (уш.с, 3H); 8,39 (м, 1H).

Соединение 28: метил-3-(^)-2-амино-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2-метил-2(((триэтилсилил)окси)метил)пропаноат.

К раствору соединения 27 (809 мг, 2,05 ммоль) в ДХМ (4 мл), охлажденному на ледяной бане, добавляли ТЭА (1,43 мл, 10,23 ммоль) и хлортриэтилсилан (1,37 мл, 8,19 ммоль), поддерживая при этом температуру ниже 4°С. Перемешивание при 4°С проводили в течение 10 мин, затем реакционную среду перемешивали при КТ в течение 20 ч. Насыщ. солевой раствор (20 мл) и ДХМ добавляли к среде, которую перемешивали в течение 10 мин. Органическую фазу промывали насыщ. солевым раствором (3x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 70 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 706 мг соединения 28 в виде бледно-желтого масла (73%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,52 (к, J=8,0 Гц, 6H); 0,89 (т, J=8,0 Гц, 9H); 0,98 (с, 3H); 1,70 (уш.с, 2H); 2,54 (м, 1H); 2,82 (м, 1H); 3,18-3,45 (м, 3H); 3,58 (м, 2H); 3,60 (с, 3H); 3,80 (с, 3H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,14 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,28 (расщепл. д, J=2,3 Гц, 1H); 7,78 (м, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=471 [M-H]^-; m/z=473 [M+H]⁺; m/z=517 [M-H+HCO2H]^-; t_R=0,97 мин.

Соединение 29: метил-3-(^)-2-акриламидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2-метил-2(((триэтилсилил)окси)метил)пропаноат.

К раствору соединения 28 (704 мг, 1,49 ммоль) в ДХМ (19 мл), охлажденному на бане лед/ацетон, добавляли DIEA (780 мкл, 4,46 ммоль) и по каплям акрилоилхлорид (181 мкл, 2,23 ммоль). Реакционную среду перемешивали при 0-5°С в течение 1 ч, затем добавляли EtOAc (38 мл) и среду промывали 1N HCl (5 мл), насыщ. NaHCO₃ (5 мл), насыщ. солевым раствором (3x15 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 30 г силика- 112 035625 геля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 742 мг соединения 29 в виде бесцветного масла (94%).

¹Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСОЛ6): 0,52 (расщепл. к, J=8,0 Гц, 6H); 0,89 (расщепл. т, J=8,0 Гц, 9H); 0,99 (с, 1,5H); 1,01 (с, 1,5H); 2,69 (м, 1H); 2,87 (м, 1H); 3,20 (м, 1H); 3,28 (м, 1H); 3,50 (дд, J=3,1 и 9,9 Гц, 1H); 3,58 (с, 3H); 3,68 (д, J=9,9 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,59 (м, 1H); 5,55 (д, J=10,3 Гц, 1H); 6,00 (д, J=17,3 Гц, 1H); 6,25 (расщепл. дд, J=10,3 и 17,3 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,18 (расщепл. дд, J=2,0 и 8,5 Гц, 1H); 7,31 (расщепл. д, J=2,0 Гц, 1H); 7,96 (м, 1H); 8,39 (д, J=8,9 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=525 [M-H]^-; m/z=527 [M+H]+; m/z=571 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,54 мин.

Соединение BC6: 3-(^)-2-акриламидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2-(гидроксиметил)-2-метилпропановая кислота.

К суспензии tBuOK (1,42 г, 12,65 ммоль) в ТГФ (7 мл), охлажденной на бане лед/ацетон, добавляли H₂O (50 мкл), среду перемешивали в течение 10 мин перед добавлением раствора соединения 29 (741 мг, 1,41 ммоль) в ТГФ (7 мл). Перемешивание проводили при 0°С в течение 10 мин, затем при КТ в течение 1 ч. Реакционную среду охлаждали с помощью ледяной бани перед добавлением 1N HCl (16,9 мл). После 15 мин перемешивания реакционную среду экстрагировали ДХМ (3x25 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором (2x15 мл), H₂O (15 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 656 мг соединения BC6 в виде желтой пены (колич.).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,91 (с, 3H); 2,69 (м, 1H); 2,90 (дд, J=4,8 и 13,6 Гц, 1H); 3,183,42 (м, 4H); 3,80 (с, 3H); 4,59 (м, 1H); 4,73 (уш.с, 1H); 5,55 (д, J=2,3 и 10,3 Гц, 1H); 6,00 (дд, J=2,3 и 17,2 Гц, 1H); 6,24 (дд, J=10,3 и 17,2 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=2,0 и 8,7 Гц, 1H); 7,35 (д, J=2,0 Гц, 1H); 8,00 (м, 1H); 8,39 (д, J=8,8 Гц, 1H); 12,30 (уш.с, 1H). ЖХМС (А5): ES m/z=397 [M-H]^-; m/z=399 [M+H]⁺; t_R=0,77 мин.

Синтез примеров 1-3: бензилового амина азаА52, NHS-эфира глутарил-Val-Ala-аза-C52 бензилового амина и соответствующего ADC

Соединение 30: (6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-1-(4-(азидометил)фенил)-8-(трет-бутокси)-3-метил-8оксоокта-1,6-диен-4 -ил-6-(3 -хлор-4 -метоксибензил)-13 -изобутил-2,2,10,10-тетраметил-4,7,11 -триооксо-3 окса-5,8,12-триазатетрадекан-14-оат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили соединение BC1 (899,55 мг, 2,10 ммоль) в ДМФ (25 мл), HATU (861 мг, 2,20 ммоль) и HOAt (302 мг, 2,20 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин при КТ. После этого добавляли соединение AD1 (940 мг, 2 ммоль) и DIEA (1,05 мл, 5,99 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 4 ч при КТ. По истечении этого времени реакционную среду разбавляли H₂O (50 мл) и экстрагировали AcOEt (2x40 мл). Органические слои промывали насыщ. солевым раствором (25 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью

- 113 035625 флэш-хроматографии на 80 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 1,011 г соединения 30 в виде желтого полутвердого вещества (57%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,76 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,78 (д, J=6,7 Гц, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,07 (с, 6H); 1,39 (с, 9H); 1,37-1,63 (м, 3H); 1,41 (с, 9H); 2,36-2,60 (частично скрытый м, 3H); 2,64 (дд, J=9,5 и 14,1 Гц, 1H); 2,86 (дд, J=5,6 и 14,1 Гц, 1H); 3,18 (дд, J=6,1 и 13,5 Гц, 1H); 3,25 (дд, J=6,9 и 13,5 Гц, 1H); 3,79 (с, 3H); 4,09 (м, 1H); 4,26 (м, 1H); 4,40 (с, 2H); 4,92 (м, 1H); 5,81 (д, J=15,9 Гц, 1H); 6,17 (дд, J=8,4 и 16,1 Гц, 1H); 6,44 (д, J=15,9 Гц, 1H); 6,70 (м, 1H); 6,94 (д, J=8,9 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,18 (дд, J=2,3 и 8,9 Гц, 1H); 7,31 (м, 3H); 7,42 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,59 (т, J=6,3 Гц, 1H); 7,77 (д, J=7,9 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=879 [М-Н]^-; m/z=881 [M+H]+; m/z=925 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,89 мин.

Соединение 31: (3S,10R,16S,E)-16-((R,E)-4-(4-(αзидометил)фенил)бут-3-ен-2-ил)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12-тетраон.

Соединение 31 получали за две стадии.

Стадия 1: в круглодонную колбу вводили соединение 30 (1,011 г, 1,15 ммоль) в ДХМ (10 мл). После охлаждения до 0°С добавляли ТФУК (1,72 мл, 22,94 ммоль) и 100 мкл H2O. Реакционную среду перемешивали в течение 72 ч при КТ. По окончании добавления к среде добавляли толуол и концентрировали под вакуумом с получением 900 мг интермедиата амино/кислоты (колич.).

1НЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,76 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,78 (д, J=6,7 Гц, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,07 (с, 3H); 1,08 (с, 3H); 1,38-1,62 (м, 3H); 2,35-2,58 (частично скрытый м, 3H); 2,79 (дд, J=11,0 и 13,8 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=4,1 и 13,8 Гц, 1H); 3,16 (дд, J=5,9 и 13,5 Гц, 1H); 3,28-3,39 (скрытый м, 1H); 3,81 (с, 3H); 4,03 (м, 1H); 4,26 (м, 1H); 4,40 (с, 2H); 4,92 (м, 1H); 5,82 (д, J=16,1 Гц, 1H); 6,16 (дд, J=8,8 и 16,4 Гц, 1H); 6,42 (д, J=16,4 Гц, 1H); 6,73 (м, 1H); 7,09 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,18 (дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,32 (д, J=8,6 Гц, 2H); 7,37 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,41 (Д, J=8,6 Гц, 2H); 7,84 (д, J=7,9 Гц, 1H); 8,01 (уш.с большой, 3H); 8,10 (т, J=6,4 Гц, 1H); 12,2 (уш.с, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=723 [M-H]^-; m/z=725 [M+H]+; t_R=1,09 мин.

Стадия 2: в круглодонную колбу к раствору интермедиата амино/кислоты (840 мг, 1,16 ммоль) в 200 мл CH₃CN добавляли DIEA (1,95 мл, 11,58 ммоль), HOAt (159,23 мг, 1,16 ммоль) и HATU (499,40 мг, 1,27 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 3 ч при КТ. После концентрирования под вакуумом неочищенный продукт разбавляли AcOEt (200 мл), нейтрализовали 0,5М лимонной кислотой (12 мл) и 1N HCl (6 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщ. NaHSO₃, насыщ. NaHSO₃, насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на 40 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 558 мг соединения 31 в виде белого твердого вещества (68%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,60 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,61 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,97 (с, 3H); 1,07 (с, 3H); 1,09 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,15 (м, 1H); 1,33-1,48 (м, 2H); 2,24 (м, 1H); 2,53-2,70 (м, 2H); 2,88 (уш.д, J=13,6 Гц, 1H); 3,01 (дд, J=3,5 и 14,5 Гц, 1H); 3,23-3,32 (скрытый м, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,18 (м, 1H); 4,35 (м, 1H); 4,40 (с, 2H); 4,95 (м, 1H); 5,86 (дд, J=1,7 и 15,8 Гц, 1H); 6,13 (дд, J=8,8 и 16,1 Гц, 1H); 6,40 (м, 1H); 6,47 (д, J=16,1 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,18 (дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,29 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,32 (д, J=8,6 Гц, 2H); 7,41 (уш.д, J=8,6 Гц, 3H); 7,89 (д, J=8,9 Гц, 1H); 8,1 (д, J=8,2 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=705 [M-H]^-; m/z=707 [M+H]+; t_R=1,58 мин.

Соединение 32: (3S,10R,16S,Е)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(αзидометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

В круглодонную колбу к раствору соединения 31 (410 мг, 0,579 ммоль) в ДХМ (50 мл) добавляли при 0°С м-СРВА (259 мг, 1,16 ммоль). После перемешивания в течение 16 ч при КТ добавляли дважды м-СРВА (130 мг) в течение 24 ч. После завершения реакции неочищенную смесь перемешивали в течение 1 ч с насыщ. NaHCO₃ (15 мл) и насыщ. Na₂S₂O₃ (15 мл), затем экстрагировали ДХМ (3x15 мл). Органические слои промывали насыщ. солевым раствором (15 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 440 мг смеси а- и β-эпоксидов в виде желтого полутвердого вещества. а- и β-эпоксиды разделяли с помощью хиральной жидкой хроматографии, которую проводили на колонке 76x350 мм, заполненной 1,1 кг 10 мкм Chiralpak AD (трис-3,5-диметилфенилкарбамат амилозы, покрытый на носителе из силикагеля, Chiral Technologies Europe), используя изократическое элюирование с 80:20 гептан/EtOH. После концентрирования получали 185 мг соединения 32 в виде белого твердого вещества (44%) и 118 мг а-эпоксида получали в виде белого твердого вещества (28%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,72 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,74 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,96 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,08 (с, 3H); 1,11 (м, 1H); 1,40-1,55 (м, 2H); 1,79 (м, 1H); 2,26 (м, 1H); 2,64 (м, 2H); 2,85 (уш.д, J=13,2 Гц, 1H); 3,00 (м, 2H); 3,25 (дд, J=10,2 и 13,2 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,90 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,17 (м, 1H); 4,35 (м, 1H); 4,46 (с, 2H); 5,12 (м, 1H); 5,80 (дд, J=1,7 и 16,0 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,8, 11,6 и 16,0 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,18 (дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,29 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,31-7,40 (м, 5H); 7,94 (д, J=9,1 Гц, 1H); 8,40 (д, J=8,1 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=723 [М+Н]+; 1r=1,48 мин.

Пример 1. (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12- 114 035625 тетраон.

В круглодонную колбу к раствору соединения 32 (185 мг, 255,79 мкмоль) в ДХМ (6 мл), MeOH (6 мл) и H₂O (0,8 мл) добавляли TCEP (81,47 мг, 281,37 мкмоль). Раствор перемешивали в течение 16 ч при КТ. После завершения реакции неочищенную смесь разбавляли насыщ. NaHCO₃ (15 мл) и экстрагировали ДХМ (2x30 мл). Органические слои промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью двух последовательных флэшхроматографий на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 90 мг примера 1 в виде белого твердого вещества (51%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО<): 0,72 (д, J=6,6 Гц, 3H); 0,75 (д, J=6,6 Гц, 3H); 0,97 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,07 (с, 3H); 1,14 (м, 1H); 1,42-1,57 (м, 2H); 1,77 (м, 1H); 1,92 (уш.м, 2H); 2,26 (м, 1H); 2,64 (м, 2H); 2,86 (уш.д, J=13,0 Гц, 1H); 2,94 (дд, J=2,0 и 8,0 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=3,6 и 14,4 Гц, 1H); 3,27 (дд, J=10,2 и 13,0 Гц, 1H); 3,70 (с, 2H); 3,80 (с, 3H); 3,84 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,18 (м, 1H); 4,34 (м, 1H); 5,11 (м, 1H); 5,79 (дд, J=1,7 и 15,6 Гц, 1H); 6,38 (ддд, J=4,1, 11,6 и 15,6 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,22 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,28 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,31 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,35 (д, J=10,2 Гц, 1H); 7,91 (д, J=9,0 Гц, 1H); 8,38 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=695 [M-H]^-; m/z=697 [M+H]+; t_R=0,83 мин.

Соединение 33: (S)-2-амино-N-((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил) оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-метилбутанамид.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору примера 1 (90 мг, 129,01 мкмоль) в ДХМ (20 мл) добавляли (S)-2-((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропановой кислоты или FmocValAla (номер CAS [150114-97-9], 79,47 мг, 193,61 мкмоль), EDC (34,27 мкл, 193,61 мкмоль) и HOBt (20,93 мг, 154,9 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в течение ночи при КТ. По истечении этого времени добавляли пиперидин (129 мкл, 1,29 ммоль) и перемешивали в течение 2 ч. Растворитель удаляли и неочищенный остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 50 мг соединения 33 (45%) в виде белого твердого вещества.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,75 (м, 9H); 0,88 (д, J=7,1 Гц, 3H); 0,96 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,08 (с, 3H); 1,18 (м, 1H); 1,23 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,42-1,57 (м, 2H); 1,70 (уш.м, 2H); 1,79 (м, 1H); 1,92 (м, 1H); 2,26 (м, 1H); 2,63 (м, 2H); 2,86 (уш.д, J=13,0 Гц, 1H); 2,99 (м, 3H); 3,22-3,33 (частично скрытый м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,86 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,18 (м, 1H); 4,28 (д, J=6,3 Гц, 2H); 4,33 (м, 2H); 5,11 (м, 1H); 5,79 (дд, J=1,7 и 15,6 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=4,1, 11,6 и 15,6 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,0 и 8,6 Гц, 1H); 7,24 (с, 4H); 7,28 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,37 (д, J=10,2 Гц, 1H); 7,92 (д, J=9,1 Гц, 1H); 8,07 (уш.д, J=8,3 Гц, 1H); 8,38 (д, J=8,1 Гц, 1H); 8,42 (т, J=6,3 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=434 [М+2Н]²⁺; m/z=865 [M-H]^-; m/z=867 [M+H]+; m/z=911 [M-H+HCO2H]^-; t_R=0,88 мин.

Соединение 34: 5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил)оксиран2-ил)бензил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2-ил)амино)-5-оксопентановая кислота.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 33 (54 мг, 57,64 мкмоль) в ДМФ (5 мл) добавляли глутаровый ангидрид (8 мг, 69,17 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в течение 3,5 ч при КТ. По истечении этого времени растворитель удаляли и неочищенный остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на 1,8 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 51 мг соединения 34 в виде белого твердого вещества (90%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО<): 0,73 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,76 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,81 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,84 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,97 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,2 Гц, 3H); 1,05 (с, 3H); 1,15 (м, 1H); 1,22 (д, J=7,2 Гц, 3H); 1,43-1,52 (м, 2H); 1,70 (м, 2H); 1,77 (м, 1H); 1,97 (м, 1H); 2,17 (м, 2H); 2,24 (м, 1H); 2,55-2,68 (м, 2H); 2,85 (уш.д, J=12,7 Гц, 1H); 2,96 (дд, J=1,8 и 7,7 Гц, 1H); 2,99 (дд, J=3,0 и 14,6 Гц, 1H); 3,23-3,40 (частично скрытый м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,85 (д, J=1,8 Гц, 1H); 4,22-4,38 (м, 4H); 5,11 (м, 1H); 5,79 (д, J=14,9 Гц, 1H); 6,37 (ддд, J=4,1, 11,3 и 14,9 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,15 (дд, J=2,0 и 8,7 Гц, 1H); 7,23 (уш.с, 4H); 7,28 (д, J=2,0 Гц, 1H); 7,37 (уш.д, J=10,7 Гц, 1H); 7,87 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,93 (д, J=9,2 Гц, 1H); 8,06 (м большой, 1H); 8,37 (уш.м, 1H); 8,41 (уш.м, 1H); 12,03 (уш.м, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=979 [M-H]^-; m/z=981 [M+H]+; t_R=1,17 мин.

Пример 2. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-5-оксопентаноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 34 (30 мг, 30,56 мкмоль) в ТГФ (5 мл) добавляли DIEA (5,34 мкл, 30,56 мкмоль) и ДСК (16,31 мг, 61,13 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в течение 2 ч при КТ. По истечении этого времени растворитель удаляли и неочищенный остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на 1,3 г силикагеля (градиентное элюирование

- 115 035625

ДХМ/iPrOH) с получением 9 мг примера 2 в виде белого твердого вещества. Вторую партию, содержащую ожидаемое соединение, а также примесь, разбавляли МеТГФ, дважды промывали H₂O, насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO4, отфильтровывали и концентрировали с получением 15 мг примера 2 в виде белого твердого вещества (общий выход 73%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-д6): 0,73 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,77 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,82 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,84 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,96 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,2 Гц, 3H); 1,07 (с, 3H); 1,15 (м, 1H); 1,23 (д, J=7,2 Гц, 3H); 1,43-1,56 (м, 2H); 1,78 (м, 1H); 1,81 (м, 1H); 1,97 (м, 1H); 2,20-2,33 (м, 3H); 2,58-2,69 (м, 4H); 2,80 (с, 4H); 2,85 (уш.д, J=12,7 Гц, 1H); 2,98 (дд, J=2,1 и 7,9 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=3,2 и 14,7 Гц, 1H); 3,22-3,34 (частично скрытый м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,85 (д, J=2,1 Гц, 1H); 4,15 (м, 2H); 4,22-4,38 (м, 4H); 5,11 (м, 1H); 5,79 (д, J=15,1 Гц, 1H); 6,38 (ддд, J=3,9, 11,2 и 15,1 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,15 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,22 (уш.с, 4H); 7,29 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,36 (уш.д, J=10,3 Гц, 1H); 7,89 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,92 (д, J=8,9 Гц, 1H); 8,04 (д, J=7,4 Гц, 1H); 8,32 (т, J=6,1 Гц, 1H); 8,39 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=540; m/z=1076 [M-H]^-; m/z=1078 [M+H]+; m/z=1122 [M-H+HCO2H]-; t_R=1,23 мин.

Пример 3. mAb-Пр. 2.

Общий способ, описанный ранее, был использован для получения примера 3. 60 мг hu2H11_R35-74 подвергали взаимодействию с 161 мкл 9,96 мМ раствора примера 2 в ДМА (1,733 мг, 4 экв.) в течение 2 ч. В это время добавляли 121 мкл раствора примера 2 (3 экв.) и среду перемешивали в течение 2 ч. В это время добавляли 121 мкл раствора примера 2 (3 экв.) и перемешивали в течение 2 ч. После очистки на Superdex 200 pg в DPBS рН 6,5+20% NMP, концентрирования на Amicon Ultra-15, буферного обмена на PD-10 в буфере B рН 6,5+5% NMP и фильтрования на Steriflip 39,9 мг примера 3 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 2,28 мг/мл с DAR 4,6 (MCBP), мономерной чистотой 99% и общим выходом 66%.

SEC-MCBP: спектр для интактного ADC на фиг. 1; m/z=150346 (D1); m/z=151307 (D2); m/z=152274 (D3); m/z=153240 (D4); m/z=154200 (D5); m/z=155165 (D6); m/z=156133 (D7); m/z=157095 (D8).

Синтез примеров 4-7: бензилового амина (S)-3-неопентил-аза-C52, NHS-эфира глутарил-Val-Ala(S)-3-неопентил-аза-C52 бензилового амина и соответствующего ADC

- 116 035625

Пример 5

Соединение 35: (6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-8-(TpeT-6yTOKCu)-1-(4-(rugpoKCUMeTua^eHua)-3-MeTua-8оксоокта-1,6-диен-4-ил-6-(3-хлор-4-метоксибензил)-2,2,10,10-тетраметил-13-неопентил-4,7,11-триооксо3-окса-5,8,12-триазатетрадекан-14-оат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору фрагмента BC1 (1,32 г, 3,08 ммоль) в ДХМ (60 мл) добавляли DIEA (1,53 мл, 9,25 ммоль), HOAt (503,75 мг, 3,70 ммоль) и HATU (1,41 г, 3,70 ммоль). Желтую суспензию перемешивали в течение 30 мин при КТ, затем добавляли фрагмент AD2 (1,7 г, 3,08 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 2 ч при КТ. По истечении этого времени добавляли 1,53 мл DIEA и перемешивали в течение 1 ч. Смесь нейтрализовали 1М лимонной кислотой (50 мл) и экстрагировали AcOEt (2x80 мл). Органические слои промывали 1М NaHSO₄, H₂O, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на 100 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 1,475 г соединения 35 в виде бесцветного твердого вещества (57%).

Соединение 36: (2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-(3-((R)-2-амино-3-(3-хлоp-4-метоксифенил)пpопанамидо)2,2-диметилпропанамидо)-4,4-диметилпентаноил)окси)-8-(4-(гидроксиметил)фенил)-6-метилокта-2,7диеновая кислота.

В круглодонную колбу к раствору соединения 35 (1,475 г, 1,69 ммоль) в ДХМ (20 мл) добавляли ТФУК (8 мл, 52,27 ммоль) и H2O (2 мл). Реакционную среду перемешивали в течение 5 ч при КТ. Растворитель удаляли. Остаток разбавляли H₂O (20 мл) и AcOEt (20 мл) и обрабатывали 2М NaOH (2 мл) в течение 2 ч при КТ. Органический слой отделяли и водн. слой экстрагировали AcOEt (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 1,24 г бесцветного твердого вещества. Твердое вещество растворяли в AcOEt (10 мл) и H₂O (10 мл) и обрабатывали 2М NaOH (400 мкл) в течение 2 ч при КТ. Органический слой отделяли, водн. слои экстрагировали AcOEt (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на 100 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 990 мг соединения 36 в виде белого твердого вещества (82%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,80 (с, 9H); 0,99 (с, 3H); 1,02 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,05 (с, 3H); 1,52 (дд, J=2,0 и 14,8 Гц, 1H); 1,69 (дд, J=9,9 и 14,8 Гц, 1H); 2,36-2,61 (частично скрытый м, 4H); 2,84 (дд, J=5,0 и 13,9 Гц, 1H); 3,18 (д, J=7,5 Гц, 2H); 3,40 (дд, J=5,1 и 8,1 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,29 (м, 1H); 4,45 (с, 2H); 4,90 (м, 1H); 5,12 (уш.м, 1H); 5,81 (д, J=15,5 Гц, 1H); 6,10 (дд, J=8,4 и 15,9 Гц, 1H); 6,40 (д, J=15,9 Гц, 1H); 6,70 (тд, J=7,5 и 15,5 Гц, 1H); 7,01 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,11 (дд, J=2,4 и 8,7 Гц, 1H); 7,25 (м, 3H); 7,32 (д,

- 117 035625

J=8,2 Гц, 2H); 7,72 (т, J=6,5 Гц, 1H); 7,79 (д, J=7,8 Гц, 1H).

ЖХМС (A1): ES m/z=712 [M-H]^-; m/z=714 [M+H]+; t_R=0,94 мин.

Соединение 37: (3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((R,E)-4-(4-(гидроксиметил)фенил) бут-3 -ен-2-ил)-6,6-диметил-3 -неопентил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен-2,5,9,12-тетраон.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили соединение 36 (990 мг, 1,39 ммоль) и CH₃CN (150 мл), нагревали на водяной бане при 50°С до полной солюбилизации и перемешивали в течение 10 мин. После этого добавляли DIEA (687,20 мкл, 4,16 ммоль), HOAt (207,51 мг, 1,52 ммоль) и HATU (579,7 мг, 1,52 ммоль) и перемешивали в течение 30 мин при КТ. Реакционную среду нейтрализовали 1М лимонной кислотой (30 мл). Растворитель удаляли и водн. слой экстрагировали AcOEt (2x40 мл). Органические слои промывали 1М NaHSO₄, H2O, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали. Неочищенное твердое вещество разбавляли H2O (200 мл) и перемешивали в течение 1 ч. Твердое вещество отфильтровывали, затем разбавляли AcOEt, высушивали над MgSO4, отфильтровывали и концентрировали с получением смеси соединения 37 и HATU. Твердое вещество перемешивали с МеТГФ (50 мл) и H2O (50 мл). Органический слой отделяли, промывали H2O (4x20 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на 10 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 680 мг соединения 37 в виде бесцветного твердого вещества (70%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО^): 0,68 (с, 9H); 0,98 (с, 3H); 1,03 (с, 3H); 1,09 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,19 (уш.д, J=14,5 Гц, 1H); 1,58 (дд, J=10,3 и 14,5 Гц, 1H); 2,23 (м, 1H); 2,52-2,70 (м, 3H); 2,86 (уш.д, J=12,7 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=3,3 и 14,8 Гц, 1H); 3,22-3,33 (частично скрытый м, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,18 (м, 1H); 4,42 (м, 1H); 4,46 (д, J=6,0 Гц, 2H); 4,91 (м, 1H); 5,13 (т, J=6,0 Гц, 1H); 5,85 (уш.д, J=15,0 Гц, 1H); 6,05 (дд, J=8,4 и 15,9 Гц, 1H); 6,40 (м, 2H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,18 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,25 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,29 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,31 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,42 (д, J=10,6 Гц, 1H); 7,94 (д, J=9,1 Гц, 1H); 8,41 (д, J=8,2 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=694 [M-H]^-; m/z=696 [M+H]+; t_R=1,36 мин.

Соединение 38: (3S,10R,16S,Е)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6-диметил-3-неопентил-16-((R,E)-4(4-(((триизопропилсилил)окси)метил)фенил)бут-3-ен-2-ил)-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен2,5,9,12-тетраон.

В атмосфере аргона при 0°С в круглодонную колбу к раствору соединения 37 (680 мг, 0,976 ммоль) в CHCl₃ (10 мл) добавляли 1Н-имидазол (305,84 мг, 4,49 ммоль) и хлортриизопропилсилан (480,13 мкл, 2,25 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 5 ч при КТ, затем разбавляли насыщ. NH4Cl и МТБЭ (30 мл). Органический слой промывали 1М NaHSO₄, насыщ. NaHCO₃, насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 970 мг соединения 38 в виде оранжевого аморфного твердого вещества (колич.).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-д6): 0,63 (с, 9H); 0,87-1,17 (м, 31Н); 1,53 (дд, J=10,9 и 14,3 Гц, 1H); 2,22 (м, 1H); 2,51-2,70 (м, 3H); 2,86 (уш.д, J=13,0 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=3,2 и 14,9 Гц, 1H); 3,24-3,35 (частично скрытый м, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,18 (м, 1H); 4,41 (м, 1H); 4,76 (с, 2H); 4,91 (м, 1H); 5,87 (уш.д, J=15,4 Гц, 1H); 6,06 (дд, J=8,9 и 15,9 Гц, 1H); 6,40 (м, 2H); 7,03 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,18 (уш.д, J=8,5 Гц, 1H); 7,25 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,28 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,30 (уш.с., 1H); 7,42 (д, J=10,5 Гц, 1H); 7,93 (д, J=9,2 Гц, 1H); 8,42 (д, J=8,1 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=850 [M-H]^-; m/z=852 [M+H]+; m/z=896 [M-H+HCO2H]^-; tR=2,15 мин.

Пример 4. (3S,10R,16S,Е)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(гидроксиметил)) фенил)оксиран-2-ил)этил)-6,6-диметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

Пример 4 получали за 2 стадии.

Стадия 1: в атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 38 (832 мг, 0,976 ммоль) в ДХМ (10 мл) добавляли за три раза м-СРВА (339,15 мг, 1,51 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 50 ч при КТ, затем разбавляли ДХМ (10 мл) и перемешивали в течение 15 мин с насыщ. NaHCO₃ (30 мл) и Na₂S₂O₃ (30 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 1,1 г смеси α- и βэпоксидов в виде бесцветной пены (колич.).

Стадия 2: смесь α- и β-эпоксидов разбавляли в ТГФ (30 мл) и добавляли 1М TBAF (952,32 мкл). После перемешивания в течение 2 ч добавляли 952 мкл TBAF. После перемешивания в течение 1 ч смесь разбавляли H2O (50 мл) и экстрагировали AcOEt (3x50 мл). Органические слои промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO4, отфильтровывали и концентрировали с получением 770 мг смеси α- и β-эпоксидов в виде желтого твердого вещества (колич.). α- и β-эпоксиды разделяли с помощью хиральной жидкостной хроматографии, которую проводили на колонке 76x350 мм, заполненной 1,1 кг 10 мкм Chiralpak AD (трис-3,5-диметилфенилкарбамат амилозы, покрытый на носителе из силикагеля, Chiral Technologies Europe), используя изократическое элюирование с 75:25 гептан/EtOH. После концентрирования получали 190 мг примера 4 в виде белого твердого вещества (31%) и 125 мг α-эпоксида в виде белого твердого вещества (20%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,81 (с, 9H); 0,98 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,05 (с, 3H);

- 118 035625

1,26 (м, 1H); 1,71 (дд, J=10,4 и 14,5 Гц, 1H); 1,82 (м, 1H); 2,26 (м, 1H); 2,52 (м, 2H); 2,84 (д, J=12,8 Гц, 1H); 2,92 (дд, J=2,1 и 7,8 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=3,1 и 14,5 Гц, 1H); 3,24-3,36 (частично скрытый м, 1H); 3,81 (с, 3H); 3,90 (д, J=2,1 Гц, 1H); 4,17 (ддд, J=3,4, 8,0 и 11,7 Гц, 1H); 4,42 (м, 1H); 4,50 (д, J=6,0 Гц, 2H); 5,10 (м, 1H); 5,20 (т, J=6,0 Гц, 1H); 5,79 (дд, J=1,8 и 15,4 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,8, 11,5 и 15,4 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,1 и 8,6 Гц, 1H); 7,26 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,29 (д, J=2,1 Гц, 1H); 7,32 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,41 (д, J=10,3 Гц, 1H); 8,02 (д, J=9,2 Гц, 1H); 8,38 (д, J=8,2 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=710 [M-H]^-; m/z=712 [M+H]+; t_R=1,28 мин.

Соединение 39: (3S,10R,16S,Е)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(азидометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10(3 -хлор-4-метоксибензил)-6,6-диметил-3 -неопентил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен-2,5,9,12тетраон.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору примера 4 (100 мг, 140 мкмоль) в ТГФ (5 мл) добавляли ДФФА (156,82 мкл, 701,98 мкмоль) и DBU (110,22 мкл, 701,98 мкмоль). Раствор перемешивали в течение 6 ч при КТ, затем разбавляли H2O и экстрагировали AcOEt (3x30 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/iPrOH) с получением 100 мг соединения 39 в виде белого твердого вещества (40%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,80 (с, 9H); 0,97 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,28 (д, J=14,5 Гц, 1H); 1,69 (дд, J=10,7 и 14,5 Гц, 1H); 1,84 (м, 1H); 2,28 (м, 1H); 2,62 (м, 2H); 2,84 (д, J=12,8 Гц, 1H); 2,93-3,03 (м, 2H); 3,22-3,34 (частично скрытый м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,92 (уш.с, 1H); 4,17 (м, 1H); 4,40-4,49 (м, 3H); 5,10 (м, 1H); 5,80 (д, J=15,8 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,8, 11,7 и 15,8 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,28 (д, J=2,1 Гц, 1H); 7,32 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,39 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,41 (м, 1H); 8,00 (д, J=9,1 Гц, 1H); 8,36 (д, J=8,2 Гц, 1H). ЖХМС (А1): ES m/z=735 [M-H]^-; m/z=737 [M+H]+; t_R=1,54 мин.

Пример 5. (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6,6-диметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

В круглодонную колбу к раствору соединения 39 (100 мг, 122,07 мкмоль) в ДХМ (2,5 мл) и MeOH (2,5 мл) добавляли по каплям раствор ТСЕР (38,88 мг, 134,28 мкмоль) в H2O (500 мкл). Реакционную среду перемешивали в течение 24 ч при КТ. Реакционную смесь разбавляли H2O и насыщ. NaHCO₃, экстрагировали ДХМ (3x10 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 73 мг примера 5 в виде белого твердого вещества (84%), используемого без дополнительной очистки на следующей стадии.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,82 (с, 9H); 0,97 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,29 (д, J=14,4 Гц, 1H); 1,70 (дд, J=10,2 и 14,4 Гц, 1H); 1,80 (м, 1H); 2,02 (уш.м, 2H); 2,25 (м, 1H); 2,62 (м, 2H); 2,83 (д, J=13,0 Гц, 1H); 2,93 (дд, J=2,2 и 7,8 Гц, 1H); 2,99 (дд, J=3,4 и 14,5 Гц, 1H); 3,23-3,35 (частично скрытый м, 1H); 3,71 (с, 2H); 3,80 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,17 (ддд, J=3,5, 8,5 и 11,5 Гц, 1H); 4,41 (м, 1H); 5,09 (м, 1H); 5,79 (д, J=15,7 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,7, 11,4 и 15,7 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,22 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,28 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,34 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,40 (д, J=10,3, 1H); 8,02 (д, J=8,9 Гц, 1H); 8,38 (д, J=8,2 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=709 [M-Н]^-; m/z=711 [M+H]+; t_R=0,86 мин.

Соединение 40: (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6,6-диметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек13 -ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2-ил)карбамат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили пример 5 (73 мг, 82,10 мкмоль) и ДМФ (1 мл) с последующим добавлением FmocValAla (50,55 мг, 123,16 мкмоль), HOBt (17,75 мг, 131,37 мкмоль), ДХМ (10 мл) и EDC (14,53 мкл, 82,10 мкмоль). Раствор перемешивали в течение 4 ч при КТ, затем разбавляли H2O (10 мл) и экстрагировали ДХМ (3x20 мл). Органический слой отделяли, промывали H2O, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/iPrOH) с получением 90 мг соединения 40 в виде бесцветного твердого вещества (99%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,80 (с, 9H); 0,84 (д, J=7,1 Гц, 3H); 0,86 (д, J=7,1 Гц, 3H); 0,93 (с, 3H); 1,02 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,24 (д, J=7,3 Гц, 3H); 1,29 (д, J=14,5 Гц, 1H); 1,70 (дд, J=10,5 и 14,5 Гц, 1H); 1,81 (м, 1H); 1,99 (м, 1H); 2,25 (м, 1H); 2,60 (м, 2H); 2,82 (д, J=13,0 Гц, 1H); 2,91 (дд, J=1,9 и 7,6 Гц, 1H); 2,99 (дд, J=3,4 и 14,5 Гц, 1Н); 3,29 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,88 (д, J=1,9 Гц, 1H); 3,90 (м, 1H); 4,16 (ддд, J=3,4, 8,0 и 11,8 Гц, 1H); 4,20-4,35 (м, 6H); 4,41 (м, 1H); 5,09 (м, 1H); 5,79 (д, J=15,7 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,7, 11,6 и 15,7 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,15 (дд, J=2,5 и 8,6 Гц, 1H); 7,21 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,24 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,28 (д, J=2,5 Гц, 1H); 7,32 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,38-7,47 (м, 4H); 7,73 (т, J=7,9 Гц, 2H); 7,89 (д, J=7,9 Гц, 2H); 8,03 (д, J=9,1 Гц, 1H); 8,05 (д, J=7,9 Гц, 1H); 8,39 (м, 2H). ЖХМС (A1): ES m/z=1103 [M+H]+; m/z=1147 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,71 мин.

Соединение 41: (S)-2-амино-N-((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6-диметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)

- 119 035625 этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-метилбутанамид.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили соединение 40 (104 мг, 76,65 мкмоль) в ДХМ (5 мл) с последующим добавлением пиперидина (138,87 мкл, 1,40 ммоль). Раствор перемешивали в течение ч при КТ, затем концентрировали и очищали на 10 г силикагеля (градиентное элюирование

ДХМ/МеОН/H₂O) с получением 50 мг соединения 41 в виде бесцветного твердого вещества (60%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-d;): 0,76 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,81 (с, 9H); 0,88 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,97 (с, 3H); 1,02 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,22 (д, J=7,3 Гц, 3H); 1,29 (д, J=14,6 Гц, 1H); 1,66 (уш.м, 2H); 1,70 (дд, J=10, 6 и 14,6 Гц, 1H); 1,81 (м, 1H); 1,92 (м, 1H); 2,25 (м, 1H); 2,60 (м, 2H); 2,83 (д, J=13,0 Гц, 1H); 2,93 (дд, J=1,9 и 7,4 Гц, 1H); 2,99 (м, 2H); 3,28 (дд, J=10,4 и 13,0 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,89 (д, J=1,9 Гц, 1H); 4,16 (ддд, J=3,2 и 8,2 и 11,8 Гц, 1H); 4,29 (д, J=6,0 Гц, 2H); 4,34 (м, 1H); 4,41 (м, 1H); 5,09 (м, 1H); 5,79 (дд, J=1,7 и 15,5 Гц, 1H); 6,38 (ддд, J=3,8, 11,3 и 15,5 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,25 (м, 4H); 7,29 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,40 (д, J=10,4 Гц, 1H); 8,02 (д, J=9,1 Гц, 1H); 8,08 (д большой, J=7,7 Гц, 1H); 8,39 (д, J=8,2 Гц, 1H); 8,45 (т, J=6,0 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=441 [М+2Н]2+; m/z=879 [M-H]^-; m/z=881 [M+H]+; m/z=925 [M-H+HCO2H]^-; t_R=0,99 мин.

Соединение 42: 5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)6,6-диметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-5-оксопентановая кислота.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили соединение 41 (50 мг, 51,05 мкмоль) в ДХМ (10 мл) с последующим добавлением глутарового ангидрида (10,48 мг, 91,89 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в течение 2 ч при КТ, концентрировали и очищали на 10 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/МеОН/H₂O) с получением 42 мг соединения 42 в виде бесцветного твердого вещества (82%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО<): 0,80 (с, 9H); 0,82 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,97 (с, 3H); 1,02 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,23 (д, J=7,2 Гц, 3H); 1,29 (д, J=14,2 Гц, 1H); 1,70 (м, 3H); 1,81 (м, 1H); 1,96 (м, 1H); 2,18-2,25 (м, 5H); 2,61 (м, 2H); 2,83 (д, J=13,0 Гц, 1H); 2,93 (дд, J=2,0 и 7,4 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=3,1 и 14,5 Гц, 1H); 3,29 (дд, J=10,4 и 13,0 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,89 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,16 (м, 2H); 4,25-4,31 (м, 3H); 4,42 (м, 1H); 5,09 (м, 1H); 5,79 (дд, J=1,9 и 15,5 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,8, 11,6 и 15,5 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,15 (дд, J=2,1 и 8,7 Гц, 1H); 7,23 (м, 4H); 7,28 (д, J=2,1 Гц, 1H); 7,40 (д, J=10,4 Гц, 1H); 7,83 (д, J=8,7 Гц, 1H); 8,02 (м, 2H); 8,35 (т, J=6,1 Гц, 1H); 8,39 (д, J=8,0 Гц, 1H); 12,04 (уш.м, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=498 [М+2Н]²⁺; m/z=993 [M-H]^-; m/z=995 [M+H]+; t_R=1,27 мин.

Пример 6. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-5-((^)-1-((^)-1-((4-(^^)-3-(^)-1-(^,10К^,Е)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6,6-диметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек13 -ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2-ил)амино)-5-оксопентаноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили соединение 42 (23 мг, 23,10 мкмоль) в ДХМ (5 мл) с последующим добавлением ДСК (8,29 мг, 32,34 мкмоль) и DIEA (5,63 мкл, 32,34 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в течение 2 ч при КТ. По истечении этого времени добавляли 2 мг ДСК, 1 мкл DIEA и ДХМ (2 мл) и перемешивали в течение 1 ч при КТ. Растворитель удаляли и неочищенный остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на 10 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/iPrOH) с получением 20 мг примера 6 в виде бесцветного твердого вещества (79%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСОА): 0,80 (с, 9H); 0,82 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,97 (с, 3H); 1,02 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,23 (д, J=7,2 Гц, 3H); 1,30 (д, J=14,2 Гц, 1H); 1,70 (дд, J=10,7 и 14,7 Гц, 1H); 1,81 (м, 3H); 1,97 (м, 1H); 2,21-2,32 (м, 3H); 2,61 (м, 2H); 2,68 (т, J=7,8 Гц, 2H); 2,80 (уш.с, 4H); 2,83 (д, J=13,0 Гц, 1H); 2,94 (дд, J=2,0 и 7,6 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=3,4 и 14,9 Гц, 1H); 3,28 (дд, J=10,5 и 13,0 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,16 (м, 2H); 4,23-4,31 (м, 3H); 4,42 (м, 1H); 5,10 (м, 1H); 5,79 (дд, J=1,9 и 15,3 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,8, 11,4 и 15,3 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,8 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,2 и 8,8 Гц, 1H); 7,23 (м, 4H); 7,28 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,40 (д, J=10,5 Гц, 1H); 7,89 (д, J=8,7 Гц, 1H); 8,02 (д, J=9,1 Гц, 1H); 8,06 (д, J=7,5 Гц, 1H); 8,34 (т, J=6,1 Гц, 1H); 8,39 (д, J=8,1 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=546,5 [M+2H]²⁺; m/z=1090 [M-H]^-; m/z=1092 [М+Н]+; m/z=1136 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,34 мин.

Пример 7. mAb-Пр. 6.

Общий способ, описанный ранее, был использован для получения примера 7. 60 мг hu2H11_R35-74 подвергали взаимодействию с 233 мкл 10,6 мМ раствора примера 6 в ДМА (5 экв.) в течение 2 ч. После очистки на Superdex 200 pg в DPBS рН 6,5+20% NMP, концентрирования на Amicon Ultra-15, буферного обмена на NAP-25 в буфере B рН 6,5+5% NMP и фильтрования на Steriflip 39 мг примера 7 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 1,98 мг/мл с DAR 4,1 (MCBP), мономерной чистотой 100% и общим выходом 66%.

SEC-MCBP: спектр для интактного ADC на фиг. 2; m/z=149370 (голое mAb); m/z=150357 (D1); m/z=151330 (D2); m/z=152307 (D3); m/z=153285 (D4); m/z=154262 (D5); m/z=155238 (D6); m/z=156222 (D7).

Синтез примеров 8-10: бензилового амина 7-Me-аза-C52 стереоизомера 1, NHS-эфира глутарил-ValAla-7-Me-аза-C52-бензилового эфира стереоизомера 1 и соответствующего ADC

- 120 035625

Соединение 43: (6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-1-(4-(a3ug,OMeTua^eHua)-8-(TpeT-6yTOKCu)-3-MeTua-8оксоокта-1,6-диен-4-ил-6-(3 -хлор-4-метокси6ензил)-13 -изобутил-2,2,9,10,10-пентаметил-4,7,11 -триоксо3-окса-5,8,12-триазатетрадекан-14-оат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили фрагмент BC2 (1,10 г, 2,48 ммоль) в ДМФ (5 мл) с последующим добавлением HATU (950 мг, 2,5 ммоль) и HOAt (340 мг, 2,5 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин при КТ, затем добавляли фрагмент AD1 (1,24 г, 2,18 ммоль) и DIEA (1,2 мл, 6,87 ммоль). Желтый раствор перемешивали в течение 16 ч при КТ, гасили H₂O и экстрагировали AcOEt (3x30 мл). Органические слои промывали H2O, насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали на 200 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/AcOEt) с получением 1,55 г соединения 43 в виде белого безе (77%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-dg): 55/45 смесь диастереомеров; 0,82-0,89 (м, 6H); 0,85 (д, J=7,0 Гц, 1,65H); 0,91 (д, J=7,0 Гц, 1,35H); 0,99-1,09 (м, 9H); 1,30 (с, 9H); 1,40 (с, 10H); 1,50-1,70 (м, 2H); 2,382,59 (частично скрытый м, 3H); 2,68 (м, 1H); 2,84 (м, 1H); 3,79 (с, 1,35H); 3,81 (с, 1,65H); 4,00-4,18 (м, 2H); 4,30 (м, 1H); 4,40 (уш.с, 2H); 4,92 (м, 1H); 5,81 (д, J=15,7 Гц, 1H); 6,18 (дд, J=8,3 и 16,1 Гц, 1H); 6,45 (д, J=16,1 Гц, 1H); 6,71 (тд, J=7,3 и 15,7 Гц, 1H); 6,94 (д, J=8,1 Гц, 0,45H); 6,96 (д, J=8,1 Гц, 0,55H); 7,04 (расщепл. д J=8,7 Гц, 1H); 7,19 (уш.д, J=8,7 Гц, 1H); 7,30 (д, J=7,8 Гц, 2H); 7,32 (уш.с, 1H); 7,41 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,52 (д, J=10,1 Гц, 0,45H); 7,59 (д, J=10,1 Гц, 0,55H); 7,74 (м, 1H). ЖХМС (А1): смесь диастереомеров 55/45; ES m/z=895 [M+H]+; m/z=917 [M+Na]⁺; t_R=6,94-6,98 мин.

Соединения 44 и 45: (3S,10R,16S,Е)-16-((R,E)-4-(4-(азидометил)фенил)бут-3-ен-2-ил)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-3-изобутил-6,6,7-триметил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12-тетраон.

Соединения 44 и 45 получали за две стадии.

Стадия 1: при 0°С в круглодонную колбу к раствору соединения 43 (1,50 г, 1,67 ммоль) в 11 мл ДХМ добавляли ТФУК (2,6 мл, 34,65 ммоль) и 100 мкл H₂O. Смесь перемешивали в течение 15 мин при 0°С и при КТ в течение 6,5 ч. Реакционную среду затем испаряли под вакуумом и соиспаряли в присут- 121 035625 ствии толуола с получением 1,7 г незащищенного интермедиата в виде оранжевого твердого вещества.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-dg): смесь диастереомеров 55/45; 0,70-0,80 (м, 7,65H); 0,90 (с, 1,35H); 0,95 (м, 3H); 1,01-1,09 (м, 6H); 1,38-1,68 (м, 3H); 2,40-2,60 (частично скрытый м, 3H); 2,80-3,02 (м, 2H); 3,81 (с, 1,35H); 3,82 (с, 1,65H); 3,96-4,08 (м, 1H); 4,18 (м, 1H); 4,28 (м, 1H); 4,41 (с, 2H); 4,91 (м, 1H); 5,83 (д, J=15,7 Гц, 0,45H); 5,85 (д, J=15,7 Гц, 0,55H); 6,18 (м, 1H); 6,43 (д, J=16,1 Гц, 0,45H); 6,46 (д, J=16,1 Гц, 0,55H); 6,74 (м, 1H); 7,08-7,20 (м, 2H); 7,30 (скрытый м, 0,45H); 7,32 (д, J=7,8 Гц, 2H); 7,37 (д, J=2,0 Гц, 0,55H); 7,42 (м, 2H); 7,76 (д, J=8,00 Гц, 0,45H); 7,79 (д, J=8,00 Гц, 0,55H); 7,86 (д, J=10,1 Гц, 0,55H); 8,00 (д, J=10,1 Гц, 0,45H); 8,11 (уш.м, 3H); 12,22 (уш.м, 1H). ЖХМС (А1): смесь диастереомеров 55/45; ES m/z=737 [M-H]^-; m/z=739 [M+H]+; t_R=1,07-1,09 мин.

Стадия 2: в круглодонную колбу к раствору незащищенного интермедиата (1,43 г, 1,68 ммоль) в 25 мл CH₃CN добавляли DIEA (3 мл, 16,23 ммоль), HOAt (250,91 мг, 1,84 ммоль) и HATU (700,91 мг, 1,84 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1 ч при КТ. Затем растворитель удаляли, среду разбавляли AcOEt (200 мл), нейтрализовали 0,5М лимонной кислотой и HCl. Органический слой отделяли, промывали насыщ. NaHSO₃, насыщ. NaHCO₃, насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали на 100 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 640 мг соединений 44 и 45 в виде желтого твердого вещества (53%).

Диастереомеры при C7 разделяли с помощью хиральной жидкостной хроматографии, которую проводили на колонке 76,5x350 мм, заполненной 1,1 кг 10 мкм Whelk 01 SS (4-(3,5динитробензамидо)тетрагидрофенантрен, Regis Technologies) с использованием изократического элюирования с 50:50 гептан/EtOH. После концентрирования 210 мг соединения 44 (стереоизомер 1) получали в виде белого твердого вещества (17%) и 236 мг соединения 45 (стереоизомер 2) получали в виде белого твердого вещества (19%).

Соединение 44 (стереоизомер 1):

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО<): 0,60 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,62 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,98 (с, 3H); 1,05 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,10 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,14 (с, 3H); 1,18 (м, 1H); 1,40-1,54 (м, 2H); 2,24 (м, 1H); 2,48-2,61 (частично скрытый м, 2H); 2,65 (дд, J=11,8 и 14,5 Гц, 1H); 3,04 (дд, J=3,2 и 14,5 Гц, 1H); 3,55 (м, 1H); 3,81 (с, 3H); 4,19 (м, 2H); 4,40 (с, 2H); 4,96 (м, 1H); 5,91 (дд, J=1,4 и 15,5 Гц, 1H); 6,13 (дд, J=8,9 и 16,1 Гц, 1H); 6,40 (ддд, J=3,9, 11,3 и 15,5 Гц, 1H); 6,46 (д, J=16,1 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=2,1 и 8,7 Гц, 1H); 7,30 (д, J=2,1 Гц, 1H); 7,32 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,41 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,87 (д, J=8,9 Гц, 1H); 8,36 (д, J=9,9 Гц, 1H); 8,40 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=719 [M-H]^-; m/z=721 [M+H]+; 1r=1,61 мин.

Соединение 45 (стереоизомер 2):

1Н-ЯМР (δ в м.д., ДМСО^): 0,59 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,67 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,88 (д, J=6,7 Гц, 3H); 1,03 (с, 3H); 1,10 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,21 (м, 1H); 1,49-1,60 (м, 2H); 2,23 (м, 1H); 2,46-2,61 (частично скрытый m, 2H); 2,71 (дд, J=11,3 и 14,5 Гц, 1H); 2,98 (дд, J=3,7 и 14,5 Гц, 1H); 3,48 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,05 (м, 1H); 4,11 (ддд, J=3,7, 7,6 и 11,3 Гц, 1H); 4,40 (с, 2H); 4,90 (м, 1H); 5,93 (д, J=15,7 Гц, 1H); 6,14 (дд, J=8,7 и 16,1 Гц, 1H); 6,47 (д, J=16,1 Гц, 1H); 6,51 (ддд, J=5,2, 10,3 и 15,5 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,21 (дд, J=2,4 и 8,7 Гц, 1H); 7,31 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,37 (д, J=2,4 Гц, 2H); 7,41 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,87 (д, J=6,9 Гц, 1H); 7,89 (д, J=9,0 Гц, 1H); 8,51 (д, J=7,6 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=719 [М-Н]^-; m/z=721 [M+H]+; t_R=1,61 мин.

Соединение 46: (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(азидометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-3 -изобутил-6,6,7-триметил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен-2,5,9,12-тетраон.

При 0°С в атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 44 (154 мг, 213,51 мкмоль) в ДХМ (10 мл) добавляли м-СРВА (80 мг, 324,51 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 5 д. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (15 мл) и перемешивали 15 мин с насыщ. NaHCO₃ (6 мл) и Na₂S₂O₃ (6 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщ. солевым раствором (2x3 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 150 мг соединения 46 в виде белого твердого вещества (колич.).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО^₆): смесь диастереомеров 60/40; 0,75 (д, J=6,8 Гц, 1,8Н); 0,79 (д, J=6,8 Гц, 3H); 0,85 (д, J=6,8 Гц, 1,2H); 0,95-0,99 (м, 4,2H); 1,02-1,09 (м, 4,8Н); 1,15 (с, 1,8Н); 1,18 (с, 1,2H); 1,20 (м, 0, 6H); 1,38 (м, 0,4H); 1,59-1,62 (м, 2H); 1,80 (м, 0,6H); 1,89 (м, 0,4H); 2,25 (м, 0,6H); 2,40-2,71 (частично скрытый м, 2,4H); 2,96-3,08 (м, 2H); 3,54 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,82 (д, J=1,9 Гц, 0,4H); 3,92 (д, J=1,9 Гц, 0,6H); 4,14-4,29 (м, 2H); 4,40-4,50 (м, 2H); 5,11 (м, 1H); 5,85 (дд, J=2,0 и 15,5 Гц, 0,6H); 5,95 (дд, J=2,0 и 15,5 Гц, 0,4H); 6,38 (м, 1H); 7,04 (расщепл. д J=8,8 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,2 и 8,8 Гц, 0,6H); 7,19 (дд, J=2,2 и 8,8 Гц, 0,4H); 7,28 (д, J=2,2 Гц, 0,6H); 7,30 (д, J=2,2 Гц, 0,4H); 7,30-7,40 (м, 4H); 7,89 (д, J=8,1 Гц, 0,6H); 7,92 (д, J=8,1 Гц, 0,4H); 8,29 (д, J=10,0 Гц, 0,6H); 8,32 (д, J=8,1 Гц, 0,6H); 8,35 (д, J=10,0 Гц, 0,4H); 8,40 (д, J=8,1 Гц, 0,4H). ЖХМС (A1): ES m/z=735 [M-H]^-; m/z=737 [M+H]+; t_R=1,52 мин.

Пример 8. (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-3 -изобутил-6,6,7-триметил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен-2,5,9,12-тетраон.

При 0°С в круглодонную колбу к раствору соединения 46 (60 мг, 81,38 мкмоль) в ДХМ (3 мл) и MeOH (3 мл) добавляли по каплям раствор ТСЕР (38,9 мг, 134,3 мкмоль) в 1 мл H2O. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 35 ч, затем разбавляли ДХМ (15 мл) и насыщ. NaHCO₃. После переме- 122 035625 шивания в течение 10 мин органический слой отделяли, промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSOy отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали на 5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 23 мг примера 8 в виде белого твердого вещества (40%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): смесь диастереомеров 60/40; 0,77 (д, J=7,0 Гц, 1,8Н); 0,81 (расщепл. д, J=7,0 Гц, 3H); 0,88 (д, J=7,0 Гц, 1,4H); 0,95 (д, J=7,0 Гц, 1,2H); 0,98 (с, 1,8Н); 1,00 (с, 1,2H); 1,02-1,09 (м, 4,8Н); 1,17 (с, 1,8Н); 1,19 (с, 1,2H); 1,22 (м, 0,6H); 1,40 (м, 0,4H); 1,51-1,64 (м, 2H); 1,78 (м, 0,6H); 1,89 (м, 0,4H); 2,28 (м, 0,6H); 2,40-2,71 (частично скрытый м, 2,4H); 2,96 (дд, J=2,2 и 7,5 Гц, 0, 6H); 2,99 (дд, J=2,2 и 7,5 Гц, 0,4H); 3,03 (м, 1H); 3,55 (м, 1H); 3,70 (с, 1,2H); 3,72 (с, 1,8Н); 3,78 (д, J=2,2 Гц, 0,4H); 3,81 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,2 Гц, 0,6H); 4,12-4,30 (м, 2H); 5,12 (м, 1H); 5,84 (дд, J=1,8 и 15,6 Гц, 0,6H); 5,96 (дд, J=1,8 и 15,6 Гц, 0,4H); 6,39 (м, 1H); 7,05 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,16-7,38 (м, 6H); 7,90 (д, J=8,1 Гц, 0,6H); 7,93 (д, J=8,1 Гц, 0,4H); 8,28 (д, J=10,0 Гц, 0,6H); 8,32 (д, J=8,1 Гц, 0,6H); 8,37 (д, J=10,0 Гц, 0,4H); 8,41 (д, J=8,1 Гц, 0,4H). ЖХМС (A1): ES m/z=709 [M-H]^-; m/z=711 [M+H]+; t_R=0,8 6 мин.

Соединение 47: (9H-флуорен-9-ил)метил((S)-1-(((S)-1-((4-(3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-3-изобутил-6,6,7-триметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили пример 8 (110 мг, 154,65 мкмоль) и ДМФ (2 мл) с последующим добавлением FmocValAla (90 мг, 219 мкмоль), HOBt (30 мг, 222 мкмоль), ДХМ (10 мл) и EDC (35 мкл, 197,52 мкмоль). Раствор перемешивали при КТ в течение 3 ч 30, затем гасили H2O (10 мл) и экстрагировали ДХМ (3x10 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщ. NaHCO₃, насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали в присутствии толуола и очищали на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 49 мг соединения 47 в виде белого твердого вещества (46%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСОД₆): смесь диастереомеров 60/40; 0,76 (д, J=7,0 Гц, 1,8Н); 0,80 (м, 3H); 0,82-0,89 (м, 6,4 Гц); 0,95 (д, J=7,0 Гц, 1,2H); 0,98 (с, 1,8Н); 1,00 (с, 1,2H); 1,02-1,09 (м, 4,8Н); 1,17 (с, 1,8Н); 1,19 (с, 1,2H); 1,20-1,32 (м, 3,6H); 1,40 (м, 0,4H); 1,51-1,63 (м, 2H); 1,78 (м, 0,6H); 1,85 (м, 0,4H); 2,00 (м, 1H); 2,27 (м, 0,6H); 2,40-2,72 (частично скрытый м, 2,4H); 2,96 (м, 1H); 3,04 (м, 1H); 3,55 (м, 1H); 3,77 (д, J=2,2 Гц, 0,4H); 3,81 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,2 Гц, 0,6H); 3,90 (м, 1H); 4,15-4,38 (м, 6H); 5,12 (м, 1H); 5,85 (дд, J=1,8 и 15,6 Гц, 0,6H); 5,95 (дд, J=1,8 и 15,6 Гц, 0,4H); 6,39 (м, 1H); 7,05 (расщепл. д, J=8,7 Гц, 1H); 7,15-7,48 (м, 19Н); 7,73 (т, J=8,1 Гц, 2H); 7,90 (д, J=8,1 Гц, 2,6H); 7,92 (д, J=8,1 Гц, 0,4H); 8,05 (д, J=8,1 Гц, 1H); 8,25-8,45 (м, 3H). ЖХМС (А1): ES m/z=552 [M+2H]²⁺; m/z=1103 [M+H]+; m/z=1147 [MH+HCO2H]^-; t_R=1,55-1,57 мин.

Соединение 48: ^)-2-амино-Ы-(^)-1-((4-(^А)-3-((А-1-(^,10К^,Е)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-3-изобутил-6,6,7-триметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-метилбутанамид.

В круглодонную колбу добавляли пиперидин (60 мкл, 600,6 мкмоль) к раствору соединения 47 (50 мг, 45,30 мкмоль) в ДХМ (5 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 24 ч при КТ, концентрировали под вакуумом и очищали на 5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 70 мг α- и β-эпоксидов.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): смесь диастереомеров 60/40; 0,75 (д, J=7,0 Гц, 1,8Н); 0,80 (м, 3H); 0,82-0,92 (м, 6,4H); 0,96 (д, J=7,0 Гц, 1,2H); 0,98 (с, 1,8Н); 1,00 (с, 1,2H); 1,02-1,09 (м, 4,8Н); 1,15 (с, 1,8Н); 1,19 (с, 1,2H); 1,20-1,42 (м, 4H); 1,50-1,70 (скрытый м, 2H); 1,78 (м, 0, 6H); 1,85 (м, 0,4H); 2,00 (м, 1H); 2,25 (м, 0,6H); 2,40-2,72 (частично скрытый м, 2,4H); 2,92-3,08 (м, 3H); 3,54 (м, 1H); 3,79 (д, J=2,1 Гц, 0,4H); 3,81 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,1 Гц, 0,6H); 4,13-4,41 (м, 6H); 5,12 (м, 1H); 5,85 (д, J=15,4 Гц, 0,6H); 5,93 (д, J=15,4 Гц, 0,4H); 6,38 (м, 1H); 7,05 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,15-7,32 (м, 6H); 7,90 (д, J=8,3 Гц, 0,6H); 7,93 (д, J=8,3 Гц, 0,4H); 8,10-8,55 (м, 7H). ЖХМС (A1): ES m/z=441 [M+2H]²⁺; m/z=879 [M-H]^-; m/z=881 [M+H]+; m/z=925 [M-H+HCO2H]^-; tR=0,92 мин.

α- и β-эпоксиды разделяли с помощью хиральной жидкостной хроматографии, которую проводили на колонке 76x350 мм, заполненной 1,1 кг 10 мкм Chiralpak AD (трис-3,5-диметилфенилкарбамат амилозы, покрытый на носителе из силикагеля, Chiral Technologies Europe), используя изократическое элюирование с 70:30 гептан/EtOH. После концентрирования получали 28 мг соединения 48 в виде белого твердого вещества (70%) и 19 мг α-эпоксида в виде белого твердого вещества.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,75 (д, J=7,0 Гц, 6H); 0,80 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,88 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,98 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 6H); 1,17 (с, 3H); 1,23 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,35 (м, 1H); 1,50-1,68 (м, 2H); 1,78 (м, 1H); 1,91 (м, 1H); 2,26 (м, 1H); 2,58-2,70 (м, 2H); 2,96 (дд, J=1,9 и 7,7 Гц, 1H); 2,99 (д, J=4,8 Гц, 1H); 3,02 (дд, J=3,3 и 14,8 Гц, 1H); 3,53 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,89 (д, J=1,9 Гц, 1H); 4,10-4,23 (м, 3H); 4,28 (д, J=6,1 Гц, 2H); 4,35 (м, 1H); 5,11 (м, 1H); 5,83 (дд, J=1,9 и 15,2 Гц, 1H); 6,37 (ддд, J=4,0, 11,2 и 15,2 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,8 Гц, 1H); 7,18 (дд, J=2,4 и 8,8 Гц, 1H); 7,26 (с, 4H); 7,29 (д, J=2,4 Гц, 1H); 7,90 (д, J=8,2 Гц, 1H); 8,08 (уш.д, J=7,7 Гц, 1H); 8,29 (д, J=10,1 Гц, 1H); 8,33 (д, J=8,2 Гц, 1H); 8,46 (т, J=6,7 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=441 [M+2H]²⁺; m/z=879 [М-Н]^-; m/z=881 [M+H]+; m/z=925 [M-H+HCO2H]^-; t_R=0,92 мин.

- 123 035625

Соединение 49: 5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)3-изобутил-6,6,7-триметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-5-оксопентановая кислота.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору глутарового ангидрида (3,78 мг, 32,44 мкмоль) в ДХМ (4 мл) добавляли раствор соединения 48 (26 мг, 29,5 мкмоль) в ДХМ (9 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 2 ч при КТ, концентрировали под вакуумом и очищали на 2,5 г силикагеля (градиентное элюирование ,3,ΧΜ/ΜόΟΗ/Η₂Ο) с получением 18 мг соединения 49 в виде белого твердого вещества (61%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,78 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,80 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,82 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,84 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,97 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 6H); 1,15 (с, 3H); 1,23 (уш.д, J=7,0 Гц, 4H); 1,491,61 (м, 2H); 1,70 (м, 2H); 1,78 (м, 1H); 1,97 (м, 1H); 2,20 (м, 4H); 2,25 (м, 1H); 2,62 (м, 2H); 2,95 (м, 1H); 3,02 (м, 1H); 3,53 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,88 (с, 1H); 4,10-4,22 (м, 3H); 4,24-4,31 (м, 3H); 5,11 (м, 1H); 5,83 (д, J=15,7 Гц, 1H); 6,36 (м, 1H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,19 (уш.д, J=8,7 Гц, 1H); 7,23 (м, 4H); 7,29 (уш.с, 1H); 7,87 (д, J=8,9 Гц, 1H); 7,90 (д, J=8,1 Гц, 1H); 8,06 (д большой, J=7,3 Гц, 1H); 8,29 (д, J=10,1 Гц, 1H); 8,37 (м, 2H); 12,0 (уш.м, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=993 [M-H]^-; m/z=995 [M+H]+; t_R=1,21 мин.

Пример 9. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-5-((^)-1-((^)-1-((4-(^^)-3-(^)-1-(^,10К^,Е)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6,7-триметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек13 -ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2-ил)амино)-5-оксопентаноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 49 (15 мг, 15,07 мкмоль) в ДХМ (5 мл) добавляли ДСК (5,63 мг, 21,09 мкмоль) и DIEA (3,56 мкл, 21,09 мкмоль). Полученную смесь перемешивали в течение 1 ч при КТ, концентрировали под вакуумом и очищали на 2,5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 7,7 мг примера 9 в виде белого твердого вещества (47%).

¹Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,78 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,80 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,82 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,99 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,2 Гц, 6H); 1,18 (с, 3H); 1,26 (м, 4H); 1,57 (м, 2H); 1,79 (м, 1H); 1,83 (м, 2H); 1,99 (м, 1H); 2,22-2,33 (м, 3H); 2,60-2,71 (м, 4H); 2,82 (с, 4H); 2,97 (дд, J=2,1 и 7,7 Гц, 1H); 3,04 (дд, J=3,4 и 14,7 Гц, 1H); 3,55 (м, 1H); 3,81 (с, 3H); 3,89 (д, J=2,1 Гц, 1H); 4,19 (м, 3H); 4,26-4,34 (м, 3H); 5,12 (м, 1H); 5,86 (дд, J=2,0 и 15,7 Гц, 1H); 6,38 (ддд, J=3,8, 11,2 и 15,7 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,26 (м, 4H); 7,29 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,91 (м, 2H); 8,09 (м, 1H); 8,29 (д, J=9,9 Гц, 1H); 8,35 (м, 2H). ЖХМС (A1): ES m/z=1092 [M+H]+; m/z=1136 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,26 мин.

Пример 10. mAb-пр. 9.

Общий способ, описанный ранее, был использован для получения примера 10. 60 мг hu2H11_R3574 подвергали взаимодействию с 198 мкл 10,78 мМ раствора примера 9 в ДМА (5 экв.) в течение 2 ч. В это время добавляли 120 мкл раствора примера 9 (3 экв.) и среду перемешивали в течение 2 ч. После очистки на Superdex 200 pg в DPBS рН 6,5+20% NMP, концентрирования на Amicon Ultra-15, буферного обмена на PD-10 в буфере B рН 6,5+5% NMP и фильтрования на Steriflip 46 мг примера 10 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 2,23 мг/мл с DAR 4,7 (MCBP), мономерной чистотой 99,2% и общим выходом 78%.

SEC-MCBP: спектр для интактного ADC на фиг. 3; m/z=150345 (D1); m/z=151319 (D2); m/z=152297 (D3); m/z=153274 (D4); m/z=154251 (D5); m/z=155222 (D6); m/z=156202 (D7); m/z=157183 (D8).

Синтез примеров 11-14: бензилового амина 3-(S)-неопентил-7-Me-аза-C52 стереоизомера 1, NHSэфира глутарил-Vαl-Ala-3-(S)-неопентил-7-Me-аза-C52-бензилового амина стереоизомера 1 и соответствующего ADC

- 124 035625

Соединение 50: (6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-8-(TpeT-6yTOKCu)-1-(4-(rugpoKCUMeTua^eHua)-3-Mema-8оксоокта-1,6-диен-4-ил-6-(3-хлор-4-метоксибензил)-2,2,9,10,10-пентаметил-13-неопентил-4,7,11-триоксо3 -окса-5,8,12-триазатетрадекан- 14-оат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору фрагмента ВС2 (742 мг, 1,68 ммоль) в ДМФ (20 мл) добавляли HATU (716 мг, 1,83 ммоль) и HOAt (251 мг, 1,83 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин при КТ. Затем добавляли раствор фрагмента AD1 (730 мг, 1,59 ммоль) в ДМФ (10 мл) и DIEA (981 мкл, 5,56 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 24 ч при КТ. По истечении этого времени реакционную среду разбавляли льдом (200 г), экстрагировали AcOEt (4x200 мл). Органические слои промывали H₂O (80 мл), насыщ. солевым раствором (2x80 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью двух последовательных флэш-хроматографий, первая на 300 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) и вторая на 70 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 428 мг соединения 50 в виде бесцветной пены (30%).

Соединение 51: (2E,5S,6R,7E)-5-(((2S)-2-(3-((R)-2-амино-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)2,2-диметилбутанамидо)-4,4-диметилпентаноил)окси)-8-(4-(гидроксиметил)фенил)-6-метилокта-2,7диеновая кислота.

В круглодонную колбу вводили соединение 50 (428 мг, 483,87 мкмоль) и ДХМ (27 мл). Раствор охлаждали при 0°С, затем добавляли ТФУК (8 мл, 106,62 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1,5 ч при КТ. Растворитель удаляли и соиспаряли при пониженном давлении с толуолом (3x100 мл). Неочищенное масло разбавляли 1:1 AcOEt/H₂O (75 мл) и нейтрализовали 2М NaOH (250 мкл) до рН 6-7. Смесь перемешивали в течение 6 ч при КТ. Слои разделяли. Водн. слой экстрагировали AcOEt (3x50 мл). Органиче- 125 035625 ские слои промывали насыщ. солевым раствором (2x15 мл), высушивали над MgSO.4. отфильтровывали и концентрировали с получением 374 мг соединения 51 в виде бесцветной пены (колич.).

Соединение 52: (3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((R,E)-4-(4-(гидроксиметил)фенил)бут-3-ен-2-ил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 51 (352 мг, 483,31 мкмоль) в CH3CN (60 мл) добавляли HATU (208 мг, 531,64 ммоль), HOAt (73,09 мг, 531,64 мкмоль) и DIEA (244,52 мкл, 1,4 5 ммоль). Реакционную среду перемешивали в течение 45 мин при КТ. По истечении этого времени реакционную среду нейтрализовали 0,5N лимонной кислотой до рН 4, концентрировали частично под вакуумом и экстрагировали AcOEt (150 мл). Органический слой промывали насыщ. NaHCO₃ (10 мл), насыщ. солевым раствором (3x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 188 мг соединения 52 в виде бесцветной пены (54%).

Соединение 53: (3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-16-((R,E)4-(4-(((триизопропилсилил)окси)метил)фенил)бут-3-ен-2-ил)-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен2,5,9,12-тетраон.

При 0°С в атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 52 (188 мг, 264,68 мкмоль) в ДХМ (7 мл) добавляли Ш-имидазол (83,72 мг, 1,2 ммоль) и 1М хлортриизопропилсилан (134,15 мкл). Реакционную среду перемешивали в течение 5 ч при КТ, затем гасили насыщ. NH₄Cl и перемешивали в течение 15 мин. Слои разделяли. Водн. слой экстрагировали ДХМ (3x25 мл). Органические слои промывали 1М NaHSO₄ (10 мл), насыщ. NaHCO₃ (10 мл), насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на 10 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 137 мг соединения 53 в виде бесцветной пены (59%).

Пример 11. (3S,10R,16S,Е)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(гидроксиметил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

Пример 11 получали за две стадии.

Стадия 1: при 0°С в атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 53 (137 мг, 158,08 мкмоль) в ДХМ (5,5 мл) добавляли раствор м-СРВА (50,66 мг, 205,51 мкмоль) в ДХМ (2 мл) и реакционную среду перемешивали в течение 2 ч. Затем дважды добавляли 39 мг м-СРВА после 2 ч перемешивания. После 16 ч перемешивания смесь гасили насыщ. NaHCO₃ (30 мл) и Na₂S₂O₃ (30 мл), перемешивали в течение 15 мин и разбавляли ДХМ (40 мл). Слои разделяли. Водн. слой экстрагировали ДХМ (2x20 мл). Органические слои промывали насыщ. солевым раствором (2x8 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 160 мг α- и β-эпоксидов в виде бесцветного твердого вещества (колич.).

¹Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-Л₆): смесь диастереомеров 60/40; 0,80-0,91 (м, 12H); 0,97-1,09 (м, 24H); 1,12-1,21 (м, 6H); 1,32 (д, J=14,7 Гц, 0,6H); 1,40 (д, J=14,7 Гц, 0,4H); 1,70-1,87 (м, 1H); 1,90 (дд, J=10,1 и 14,7 Гц, 0,4H); 1,97 (дд, J=10,1 и 14,7 Гц, 0,6H); 2,28 (м, 0,6H); 2,40 (м, 0,4H); 2,55-2,79 (м, 2H); 2,90-3,00 (м, 2H); 3,44 (м, 1H); 3,79 (д, J=2,1 Гц, 0,4H); 3,80 (с, 3H); 3,90 (д, J=2,1 Гц, 0,6H); 4,03-4,22 (м, 2H); 4,78 (с, 0,8Н); 4,80 (с, 1,2H); 5,03 (м, 1H); 5,90 (дд, J=1,5 и 15,5 Гц, 0,6H); 5,99 (дд, J=1,5 и 15,5 Гц, 0,4H); 6,40-6,55 (м, 1H); 7,02-7,07 (м, 1H); 7,13-7,38 (м, 6H); 7,85-7,93 (м, 2H); 8,40 (д, J=7,3 Гц, 0,6H); 8,51 (д, J=7,3 Гц, 0,4H). ЖХМС (A1): ES m/z=880 [M-H]^-; m/z=882 [M+H]+; m/z=926 [M-H+HCO2H]^-; tR=2,05-2,06 мин.

Стадия 2: при 0°С в атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору α- и β-эпоксидов (177 мг, 200,53 мкмоль) в ТГФ (7,5 мл) добавляли по каплям 1М TBAF (221 мкл, 221 мкмоль). После перемешивания в течение 2 ч при КТ добавляли 50 мкл TBAF и перемешивали в течение 3,5 ч. Реакционную среду разбавляли H2O (9 мл), перемешивали в течение 10 мин и экстрагировали ДХМ (3x25 мл). Объединенные органические слои промывали насыщ. солевым раствором (3x8 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 210 мг α- и β-эпоксидов в виде бесцветного твердого вещества (колич.).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): смесь диастереомеров 60/40; 0,82-1,25 (м, 21Н); 1,32 (д, J=14,5 Гц, 0,6H); 1,42 (д, J=14,5 Гц, 0,4H); 1,80 (м, 1H); 1,91 (дд, J=10,0 и 14,5 Гц, 0,4H); 1,98 (дд, J=10,0 и 14,5 Гц, 0,6H); 2,22-2,48 (м, 1H); 2,55-2,78 (м, 2H); 2,89-3,03 (м, 2H); 3,44 (м, 1H); 3,79 (д, J=2,2 Гц, 0,4H); 3,80 (с, 3H); 3,90 (д, J=2,2 Гц, 0,6H); 4,04-4,22 (м, 2H); 4,48 (д, J=5,8 Гц, 0,8Н); 4,50 (д, J=5,8 Гц, 1,2H); 5,03 (м, 1H); 5,16 (т, J=5,8 Гц, 0,4H); 5,19 (т, J=5,8 Гц, 0,6H); 5,89 (дд, J=1,9 и 15,6 Гц, 0, 6H); 5,99 (дд, J=1,9 и 15,6 Гц, 0,4H); 6,40-6,52 (м, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 0,6H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 0,4H); 7,16-7,37 (м, 6H); 7,83-7,94 (м, 2H); 8,39 (д, J=7,4 Гц, 0,6H); 8,50 (д, J=7,4 Гц, 0,4H). ЖХМС (А1): ES m/z=724 [M-H]-; m/z=726 [M+H]+; t_R=1,29 мин.

α- и β-эпоксиды разделяли с помощью хиральной жидкостной хроматографии, которую проводили на колонке 76x350 мм, заполненной 1,1 кг 10 мкм Chiralpak AD (трис-3,5-диметилфенилкарбамат амило- 126 035625 зы, покрытый на носителе из силикагеля, Chiral Technologies Europe), используя изократическое элюирование с 75:25 гептан/EtOH. После концентрирования получали 66 мг примера 11 в виде белого твердого вещества (45%) и 45 мг α-эпоксида в виде белого твердого вещества (31%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,82-0,89 (м, 12H); 0,99 (с, 3H); 1,03 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,34 (д, J=14,6 Гц, 1H); 1,80 (м, 1H); 1,98 (дд, J=10,1 и 14,6 Гц, 1H); 2,26 (м, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,1 и 14,6 Гц, 1H); 2,91 (дд, J=2,1 и 7,8 Гц, 1H); 2,94 (дд, J=3,7 и 14,6 Гц, 1H); 3,42 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,91 (д, J=2,1 Гц, 1H); 4,03-4,14 (м, 2H); 4,50 (д, J=5,8 Гц, 2H); 5,03 (м, 1H); 5,19 (т, J=5,8 Гц, 1H); 5,89 (дд, J=2,1 и 15,5 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=4,7, 10,9 и 15,5 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,23 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,30 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,33 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,86 (д, J=8,4 Гц, 1H); 7,92 (д, J=7,1 Гц, 1H); 8,39 (д, J=9,1 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=724 [M-H]^-; m/z=726 [M+H]+; t_R=1,29 мин.

Соединение 54: (3S,10R,16S,Е)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(азидометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору примера 11 (66 мг, 90,87 мкмоль) в ТГФ (5 мл) добавляли при 0°С ДФФА (100,23 мкл, 454,36 мкмоль) и DBU (69,27 мкл, 454,36 мкмоль). Раствор перемешивали в течение 5 ч при КТ, затем разбавляли H2O и экстрагировали AcOEt (2x15 мл). Органический слой отделяли, промывали насыщ. солевым раствором (2x5 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/iPrOH) с получением 64 мг соединения 54 в виде бесцветного твердого вещества (94%).

Пример 12. (3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

В круглодонную колбу к раствору соединения 54 (64 мг, 85,18 мкмоль) в ДХМ (3 мл), MeOH (3 мл) и H2O (400 мкл) добавляли TCEP (26,86 мг, 93,70 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в течение 24 ч при КТ. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (15 мл) и насыщ. NaHCO₃, перемешивали в течение 10 мин и экстрагировали ДХМ (3x15 мл). Объединенные органические слои промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали и очищали с помощью флэшхроматографии на 4,5 г аминопропилмодифицированного силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 42 мг примера 12 в виде белого твердого вещества (68%).

Соединение 55: (9H-флуорен-9-ил)метил-((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек- 13-ен- 16-ил)этил)оксиран-2 -ил)бензил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан2-ил)карбамат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу вводили пример 12 (42 мг, 57,91 мкмоль) и ДМФ (1 мл) с последующим добавлением FmocValAla (34,44 мг, 86,86 мкмоль), HOBt (13,20 мг, 93,81 мкмоль), ДХМ (10 мл) и EDC (10,36 мкл, 57,91 мкмоль).

Реакционную среду перемешивали в течение 3 ч при КТ и затем разбавляли H2O (15 мл), перемешивали в течение 10 мин при КТ и экстрагировали ДХМ (3x20 мл). Объединенные органические слои высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали с получением 83 мг соединения 55 в виде белого твердого вещества (колич.).

Соединение 56: (2S)-2-амино-N-((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-6,6,7-триметил-3 -неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-метилбутанамид.

В круглодонную колбу добавляли пиперидин (57,8 мкл, 579,10 мкмоль) к раствору соединения 55 (64,73 мг, 57,91 мкмоль) в ДХМ (10 мл). После перемешивания в течение 5 ч добавляли 57,8 мкл пиперидина и среду перемешивали в течение ночи при КТ. Реакционную среду концентрировали под вакуумом и очищали на 15 г силикагеля (градиент ДУМ/МеОИ/ИЮ) с получением 30 мг соединения 56 в виде бесцветного твердого вещества (58%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,86 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,82-0,90 (м, 15H); 1,00 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,24 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,34 (д, J=14,6 Гц, 1H); 1,66 (уш.м, 2H); 1,80 (м, 1H); 1,91 (м, 1H); 1,98 (дд, J=10,2 и 14,6 Гц, 1H); 2,27 (м, 1H); 2,60 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,1 и 14,6 Гц, 1H); 2,91 (дд, J=2,0 и 7,7 Гц, 1H); 2,94 (дд, J=3,7 и 14,6 Гц, 1H); 2,99 (д, J=4,9 Гц, 1H); 3,43 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,91 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,03-4,12 (м, 2H); 4,29 (д, J=6,2 Гц, 2H); 4,34 (м, 1H); 5,03 (м, 1H); 5,89 (дд, J=1,8 и 15,6 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=4,8, 10,9 и 15,6 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,2 и 8,6 Гц, 1H); 7,22 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,26 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,32 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,86 (д, J=8,4 Гц, 1H); 7,92 (д, J=7,2 Гц, 1H); 8,07 (уш.д, J=7,9 Гц, 1H); 8,40 (д, J=7,3 Гц, 1H); 8,45 (т, J=6,2 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=448 [M+2H]²⁺; m/z=893 [M-H]^-; m/z=895 [M+H]+; m/z=939 [M-H+HCO2H]^-; tR=1,29 мин.

Соединение 57: 5-(((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-6,6,7-триметил-3 -неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-5оксопентановая кислота.

- 127 035625

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору глутарового ангидрида (4,29 мг, 36,85 мкмоль) в ДХМ (2 мл) добавляли раствор соединения 56 (30 мг, 33,5 мкмоль) в ДХМ (6 мл). Реакционную среду перемешивали в течение 2 ч при КТ, концентрировали частично под вакуумом и очищали на

2,5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/МеОН/И^) с получением 34 мг соединения 57 в виде бесцветного лака (колич.).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО^): 0,80-0,89 (м, 18Н); 0,99 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,24 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,34 (д, J=14,6 Гц, 1H); 1,70 (м, 2H); 1,80 (м, 1H); 1,97 (м, 2H); 2,19 (м, 4H); 2,26 (м, 1H); 2,60 (м, 1H); 2,70 (дд, J=11,2 и 14,6 Гц, 1H); 2,90 (дд, J=2,2 и 7,8 Гц, 1H); 2,95 (дд, J=3,7 и 14,6 Гц, 1H); 3,43 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,91 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,03-4,18 (м, 3H); 4,22-4,33 (м, 3H); 5,03 (м, 1H); 5,90 (д, J=15,5 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=4,9, 11,0 и 15,5 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,19-7,28 (м, 5H); 7,32 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,85 (уш.д, J=8,9 Гц, 2H); 7,91 (д, J=7,2 Гц, 1H); 8,06 (уш.д, J=7,5 Гц, 1H); 8,36 (уш.т, J=6,6 Гц, 1H); 8,42 (д, J=7,8 Гц, 1H); 12,10 (уш.м, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=1007 [M-Н]^-; m/z=1009 [M+H]+; t_R=1,21 мин.

Пример 13. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-5-((^)-1 -(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1 S)-1-((3S, 10R, 16S,E)10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13 -ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан2-ил)амино)-5-оксопентаноат.

В атмосфере аргона в круглодонную колбу к раствору соединения 57 (33 мг, 32,69 мкмоль) в ДХМ (8 мл) добавляли ДСК (11,72 мг, 45,76 мкмоль) и DIEA (7,7 мкл, 45,76 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в течение 1 ч при КТ, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью двух последовательных флэш-хроматографий на 2,5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/iPrOH) с получением 17,9 мг примера 13 в виде бесцветного твердого вещества (49%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСОО: 0,80-0,90 (м, 18Н); 1,00 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,24 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,34 (д, J=14,6 Гц, 1H); 1,80 (м, 1H); 1,83 (м, 2H); 1,98 (м, 2H); 2,26 (м, 1H); 2,29 (м, 2H); 2,60 (м, 1H); 2,68 (т, J=7,5 Гц, 2H); 2,70 (дд, J=11,2 и 14,6 Гц, 1H); 2,80 (с, 4H); 2,91 (дд, J=2,2 и 7,6 Гц, 1H); 2,95 (дд, J=3,7 и 14,6 Гц, 1H); 3,43 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,90 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,06-4,15 (м, 2H); 4,18 (дд, J=6,9 и 8,7 Гц, 1H); 4,21-4,33 (м, 3H); 5,03 (м, 1H); 5,89 (д, J=15,5 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=4,9, 10,9 и 15,5 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,23 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,25 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,31 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,84 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,89 (м, 2H); 8,04 (д, J=7,5 Гц, 1H); 8,33 (т, J=6,5 Гц, 1H); 8,39 (д, J=7,6 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=796; m/z=1104 [M-H]^-; m/z=1106 [М+Н]+; m/z=1150 [MH+HCO2H]^-; t_R=1,26 мин.

Пример 14. mAb-пр. 13.

Общий способ, описанный ранее, был использован для получения примера 14. 60 мг hu2H11_R3574 подвергали взаимодействию с 200 мкл 10,05 мМ раствора примера 13 в ДМА (5 экв.) в течение 2 ч. В это время добавляли 180 мкл раствора примера 13 (4,5 экв.) и среду перемешивали в течение 2 ч. После очистки на Superdex 200 pg в буфере B рН 6,5+10% NMP, концентрирования на Amicon Ultra-15, буферного обмена на PD-10 в буфере В рН 6,5+5% NMP и фильтрования на Steriflip 46 мг примера 14 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 2 мг/мл с DAR 3,5 (MCBP), мономерной чистотой 99,7% и общим выходом 77%.

SEC-MCBP: спектр для интактного ADC на фиг. 4; m/z=149336 (голое mAb); m/z=150328 (D1); m/z=151319 (D2); m/z=152311 (D3); m/z=153302 (D4); m/z=154295 (D5); m/z=155290 (D6); m/z=156282 (D7).

Пример 15. (3S,10R, 16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((S)-1-(3-(4-(гидроксиметил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-3,6,6-триметил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен-2,5,9,12-тетраон

Пример 15 получали по следующему общему пути B, изображенному на схеме 2 и описанному для примеров 4 и 11.

¹Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСОЛ6): смесь диастереомеров 65/35; 0,93-1,26 (м, 12H); 1,75 (м, 0,65H); 1,83 (м, 0,35H); 2,22 (м, 0,65H); 2,41 (м, 0,35H); 2,55-2,70 (м, 2H); 2,81 (д, J=13,7 Гц, 0,65H); 2,88 (д, J=13,7 Гц, 0,35H); 2,93 (дд, J=2,1 и 8,2 Гц, 0,65H); 3,00 (м, 1,35H); 3,22-3,35 (частично скрытый м, 1H); 3,77 (д, J=2,1 Гц, 0,35H); 3,81 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,1 Гц, 0,65H); 4,25-4,39 (м, 1,65H); 4,34 (м, 0,35H); 4,48 (д, J=6,0 Гц, 0,7H); 4,50 (д, J=6,0 Гц, 1,3H); 5,08 (м, 1H); 5,17 (т, J=6,0 Гц, 0,35H); 5,20 (т, J=6,0 Гц, 0,65H); 5,78 (дд, J=1,9 и 15,5 Гц, 0,65H); 5,89 (дд, J=1,9 и 15,5 Гц, 0,35H); 6,40 (м, 1H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,16 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 0,65H); 7,19 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 0,35H); 7,20-7,34 (м, 5H); 7,58 (уш.д, J=10,2 Гц, 0,65H); 7,64 (уш.д, J=10,2 Гц, 0,35H); 8,00 (д, J=8,4 Гц, 0,65H); 8,07 (д, J=8,4 Гц, 0,35H); 8,35 (д, J=8,3 Гц, 0,65H); 8,44 (д, J=8,3 Гц, 0,35H). ЖХМС (A1): ES m/z=654 [M-H]^-; m/z=656 [M+H]⁺; tR=1,06 мин.

- 128 035625

Пример 16. (3S,10R, 16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((S)-1 -(3-(4-(гидроксиметил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-6,6-диметил-3 -изопропил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен-2,5,9,12-тетраон

Пример 16 получали по следующему общему пути B, изображенному на схеме 2 и описанному для примеров 4 и 11.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-dg): смесь диастереомеров 60/40; 0,72 (д, J=7,0 Гц, 1,8Н); 0,82 (д, J=7,0 Гц, 1,2H); 0,84 (д, J=7,0 Гц, 1,8Н); 0,87 (д, J=7,0 Гц, 1,2H); 0,98 (с, 1,8Н); 0,99 (д, J=7,0 Гц, 1,8Н); 1,01 (с, 1,2H); 1,05 (д, J=7,0 Гц, 1,2H); 1,09 (с, 1,8Н); 1,11 (с, 1,2H); 1,82 (м, 1H); 1,91 (м, 0,6H); 2,01 (м, 0,4H); 2,30 (м, 1H); 2,52-2,72 (м, 2H); 2,88-3,04 (м, 3H); 3,25-3,35 (скрытый м, 1H); 3,79 (д, J=2,2 Гц, 0,4H); 3,80 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,2 Гц, 0,6H); 4,09-4,21 (м, 2H); 4,48 (д, J=5,8 Гц, 0,8Н); 4,50 (д, J=5,8 Гц, 1,2H); 5,14-5,29 (м, 2H); 5,79 (дд, J=1,7 и 15,4 Гц, 0,6H); 5,90 (дд, J=1,7 и 15,4 Гц, 0,4H); 6,40-6,52 (м, 1H); 7,05 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,10 (дд, J=2,0 и 10,2 Гц, 1H); 7,17 (м, 1H); 7,21-7,35 (м, 5H); 7,70 (д, J=9,3 Гц, 0,6H); 7,80 (д, J=9,3 Гц, 0,4H); 8,39 (д, J=8,0 Гц, 0,6H); 8,44 (д, J=8,0 Гц, 0,4H). ЖХМС (A1): ES m/z=682 [М-Н]’; m/z=684 [M+H]+; t_R=1,16 мин.

Пример 17. (3S,10R, 16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((S)-1 -(3-(4-(гидроксиметил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-3 -трет-бутил-6,6-диметил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен-2,5,9,12-тетраон

Пример 17 получали по следующему общему пути В, изображенному на схеме 2 и описанному для примеров 4 и 11.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСОМ6): смесь диастереомеров 50/50; 0,90 (с, 4,5H); 0,91 (с, 4,5H); 1,00 (д, J=7,0 Гц, 1,5H); 1,03 (с, 1,5H); 1,05 (с, 1,5H); 1,06 (д, J=7,0 Гц, 1,5H); 1,10 (с, 1,5H); 1,12 (с, 1,5H); 1,85 (м, 1H); 2,32 (м, 1H); 2,55-2,72 (м, 2H); 2,90-3,03 (м, 3H); 3,25-3,35 (скрытый м, 1H); 3,81 (с, 3H); 3,90 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,15 (м, 1H); 4,36 (д, J=10,0 Гц, 0,5H); 4,43 (д, J=10,0 Гц, 0,5H); 4,49 (д, J=5,9 Гц, 1H); 4,51 (д, J=5,9 Гц, 1H); 5,15 (т, J=5,9 Гц, 0,5H); 5,18 (т, J=5,9 Гц, 0,5H); 5,29 (м, 1H); 5,79 (дд, J=2,0 и 15,4 Гц, 0,5H); 5,90 (д, J=15,4 Гц, 0,5H); 6,39 (м, 1H); 6,91 (дд, J=2,5 и 10,4 Гц, 0,5H); 6,98 (дд, J=2,5 и 10,4 Гц, 0,5H); 7,05 (расщепл. д, J=8,7 Гц, 1H); 7,15 (расщепл. дд, J=2,4 и 8,7 Гц, 1H); 7,20-7,39 (м, 6H); 8,32 (д, J=7,9 Гц, 0,5H); 8,40 (д, J=7,9 Гц, 0,5H). ЖХМС (A4): ES m/z=696 [M-H]’; m/z=698 [M+H]⁺; t_R=4,13-4,16 мин.

Пример 18. (3S,10R, 16S,E)-16-((S)-1 -((2R,3R)-3 -(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3 хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6,7-триметил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон

Пример 18 получали по следующему общему пути A, изображенному на схеме 1 и описанному для примера 8.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,78 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,84 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,87 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,30 (м, 1H); 1,50-1,90 (м, 5H); 2,28 (м, 1H); 2,55-2,76 (м, 2H); 2,90-3,00 (м, 2H); 3,48 (м, 1H); 3,70 (с, 2н); 3,80 (с, 3H); 3,89 (с, 1H); 4,02-4,15 (м, 2H); 5,06 (м, 1H); 5,88 (д, J=15,5 Гц, 1H); 6,47 (м, 1H); 7,03 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (м, 3H); 7,31 (м, 3H); 7,80 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,89 (д, J=7,3 Гц, 1H); 8,41 (д, J=8,2 Гц, 1H).

Пример 19. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-5-((^)-1 -(((S)-1 -((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3 S, 10R, 16S,E)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6,7-триметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2ил)амино)-5-оксопентаноат

- 129 035625

Пример 19 получали, как показано на схеме 3 и описано для примеров 2, 6, 9 и 13.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО^): 0,79 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,81-0,89 (м, 18Н); 1,01 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,20 (с, 3H); 1,24 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,31 (м, 1H); 1,60-1,74 (м, 2H); 1,78-1,86 (м, 3H); 1,96 (м, 1H); 2,21-2,31 (м, 3H); 2,55-2,72 (м, 4H); 2,80 (с, 4H); 2,96 (м, 2H); 3,47 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,89 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,03-4,14 (м, 2H); 4,17 (дд, J=6,8 и 8,6 Гц, 1H); 4,21-4,33 (м, 3H); 5,06 (м, 1H); 5,89 (д, J=15,5 Гц, 1H); 6,47 (ддд, J=5,2, 10,5 и 15,5 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,23 (м, 4H); 7,32 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,80 (д, J=8,3 Гц, 1H); 7,89 (м, 2H); 8,04 (д, J=7,6 Гц, 1H); 8,32 (т, J=6,3 Гц, 1H); 8,42 (д, J=7,6 Гц, 1H). ЖХМС (A1): ES m/z=1092 [M+H]+; m/z=1136 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,23 мин.

Пример 20. mAb-пр. 19

Пример 20 получали аналогично примерам 3, 7, 10 и 14. 45 мг примера 20 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 2,55 мг/мл с DAR 4,4 (MCBP), мономерной чистотой 99,1% и общим выходом 78%.

SEC-MCBP: спектр для интактного ADC на фиг. 5; m/z=150368 (D1); m/z=151350 (D2); m/z=152327 (D3); m/z=153304 (D4); m/z=154281 (D5); m/z=155255 (D6); m/z=156237 (D7); m/z=157217 (D8).

Пример 21. (3S,10R, 16S,E)-16-((S)-1-(3 -(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3 -хлор-4метоксибензил)-7-циклопропил-3-изобутил-6,6-диметил-1-окса-4,8,11-триазацикло-гексадек-13-ен2,5,9,12-тетраон

Пример 21 получали по следующему общему пути A, изображенному на схеме 1 и описанному для примеров 1 и 8.

Пример 22. 2,5-Диоксоπирролидин-1-ил-5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-7-циклопропил-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11триазациклогексадек-13 -ен- 16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)амино)-3 -метил1 -оксобутан-2-ил)амино)-5 -оксопентаноат

Пример 22 получали, как показано на схеме 3 и описано для примеров 2, 6, 9 и 13.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО^): 0,34 (м, 1H); 0,66 (м, 1H); 0,74 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,76 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,78 (с, 3H); 0,80 (м, 1H); 0,82 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,04 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,08 (с, 3H); 1,11 (м, 1h); 1,20 (м, 1h); 1,23 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,43-1,54 (м, 2H); 1,78 (м, 1H); 1,82 (м, 2H); 1,98 (м, 1H); 2,22 (м, 1H); 2,28 (м, 2H); 2,65 (м, 3H); 2,79 (м, 1H); 2,81 (с, 4H); 2,97 (дд, J=2,2 и 7,9 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,89 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,02 (м, 1H); 4,17 (дд, J=6,7 и 8,7 Гц, 1H); 4,27 (д, J=6,3 Гц, 2H); 4,30 (м, 1H); 4,37 (м, 1H); 5,10 (м, 1H); 5,79 (дд, J=1,8 и 15,5 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=4,0, 11,6 и 15,5 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,11 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,20 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,22 (м, 4H); 7,46 (с, 1H); 7,77 (д, J=9,0 Гц, 1H); 7,89 (д, J=8,6 Гц, 1H); 8,05 (д, J=7,5 Гц, 1H); 8,29 (д, J=7,6 Гц, 1H); 8,32 (т, J=6,3 Гц, 1H).

- 130 035625

Пример 23. mAb-пр. 22

Пример 23 получали аналогично примерам 3, 7, 10 и 14. 45 мг примера 23 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 2,14 мг/мл с DAR 3,6 (MCBP), мономерной чистотой 100% и общим выходом 75%.

SEC-MCBP: спектр для интактного ADC на фиг. 6; m/z=150341 (D1); m/z=151329 (D2); m/z=152317 (D3); m/z=153308 (D4); m/z=154296 (D5); m/z=155287 (D6); m/z=156279 (D7); m/z=157267 (D8).

Пример 24. (3S,7S,10R, 16S,E)-16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(азидометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон

Пример 24 получали по следующему общему пути C, изображенному на схеме 3 и описанному для примера 32.

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСОЧ): 0,83 (с, 9H); 0,88 (д, J=6,8 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,33 (д, J=14,5 Гц, 1H); 1,84 (м, 1H); 1,97 (дд, J=9,8 и 14,5 Гц, 1H); 2,27 (дд, J=11,1 и 14,5 Гц, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,1 и 14,2 Гц, 1H); 2,92 (дд, J=2,1 и 7,7 Гц, 1H); 2,96 (дд, J=3,6 и 14,2 Гц, 1H); 3,43 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,96 (д, J=2,1 Гц, 1H); 4,08 (ддд, J=3,6, 7,1 и 11,1 Гц, 1H); 4,12 (м, 1H); 4,46 (с, 2H); 5,05 (ддд, J=1,3, 3,9 и 11,3 Гц, 1H); 5,90 (дд, J=1,3 и 15,3 Гц, 1H); 6,45 (ддд, J=4,7, 10,7 и 15,3 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,4 и 8,7 Гц, 1H); 7,32 (м, 3H); 7,40 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,88 (д, J=8,4 Гц, 1H); 7,92 (д, J=7,1 Гц, 1H); 8,40 (д, J=7,4 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=749 [M-H]^-; m/z=751 [M+H]+; m/z=795 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,52 мин.

Пример 25. (3S,7S,10R, 1 6S,E)- 16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон

Пример 25 получали, как описано для примеров 1, 5, 8 и 11.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,86 (с, 9H); 0,88 (д, J=6,9 Гц, 3H); 0,98 (с, 3H); 1,02 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,18 (с, 3H); 1,34 (д, J=14,5 Гц, 1H); 1,80 (м, 1H); 1,98 (дд, J=9,8 и 14,5 Гц, 1H); 2,27 (дд, J=11,1 и 14,5 Гц, 1H); 2,40 (уш.м, 2H); 2,62 (м, 1H); 2,68 (дд, J=11,1 и 14,2 Гц, 1H); 2,90 (дд, J=2,1 и 7,7 Гц, 1H); 2,96 (дд, J=3,6 и 14,2 Гц, 1H); 3,43 (м, 1H); 3,76 (с, 2H); 3,80 (с, 3H); 3,91 (д, J=2,1 Гц, 1H); 4,02-4,15 (м, 2H); 5,04 (ддд, J=1,3, 3,9 и 11,3 Гц, 1H); 5,88 (дд, J=1,3 и 15,4 Гц, 1H); 6,45 (ддд, J=4,7, 10,7 и 15,3 Гц, 1H); 7,03 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,2 и 8,5 Гц, 1H); 7,23 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,32 (д, J=2,2 Гц, 2H); 7,36 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,86 (д, J=8,3 Гц, 1H); 7,93 (д, J=6,9 Гц, 1H); 8,40 (д, J=7,1 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=723 [M-H]^-; m/z=725 [M+H]⁺; m/z=769 [М-Н+НСО2Н]^-; t_R=0,87 мин.

Синтез примеров 26-28: 3-(S)-неопентил-7-(S)-Ме-аза-C52-бензилового спирта, NHS-эфира глутарил-Val-Ala-EDA-3-(S)-неопентил-7-(S)-Ме-аза-С52-бензилового спирта и соответствующего ADC

- 131 035625

Соединение 58: (2R,3S)-1-((4-MeTOKCu6eH3Hn)oKCu)-2-MeTunreKC-5-eH-3-Hn-(S)-2-((S)-3-((R)-2-aKpHnамидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-2,2-диметилбутанамидо)-4,4-диметилпентаноат.

К раствору соединения BC4 (365 мг, 919,7 мкмоль) в ДМФ (12 мл) добавляли HATU (402 мг, 1,06 ммоль) и HOAt (144 мг, 1,06 ммоль), реакционную среду перемешивали при КТ в течение 30 мин, затем добавляли раствор соединения AD3 (365 мг, 965,7 мкмоль) в ДМФ (5 мл) и DIEA (562 мкл, 3,22 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 4 ч, затем разбавляли H₂O (50 мл) и экстрагировали

- 132 035625

EtOAc (3x50 мл). Объединенные органические фазы промывали H2O (15 мл), насыщ. солевым раствором (3x15 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью двух последовательных флэш-хроматографий на 30 г силикагеля (градиентное элюирование

ДХМ/MeOH и гептан/EtOAc) с получением 564 мг соединения 58 в виде бесцветной пены (81%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,83 (д, J=6,9 Гц, 3H); 0,85 (с, 9H); 0,87 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,03 (с, 3H); 1,55 (дд, J=2,4 и 14,5 Гц, 1H); 1,78 (дд, J=9,5 и 14,5 Гц, 1H); 1,96 (м, 1H); 2,20 (м, 1H); 2,30 (м, 1H); 2,72 (дд, J=9,6 и 13,9 Гц, 1H); 2,87 (дд, J=5,3 и 13,9 Гц, 1H); 3,20 (дд, J=6,5 и 9,5 Гц, 1H); 3,37 (дд, J=5,4 и 9,5 Гц, 1H); 3,76 (с, 3H); 3,80 (с, 3H); 4,19 (м, 1H); 4,28 (м, 1H); 4,34 (с, 2H); 4,55 (м, 1H); 4,82 (м, 1H); 5,00 (д, J=10,2 Гц, 1H); 5,07 (д, J=17,4 Гц, 1H); 5,55 (дд, J=2,3 и 10,2 Гц, 1H); 5,71 (м, 1H); 6,01 (дд, J=2,3 и 17,1 Гц, 1H); 6,28 (дд, J=10,2 и 17,1 Гц, 1H); 6,90 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,02 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,17 (дд, J=2,3 и 8,6 Гц, 1H); 7,22 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,32 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,65 (д, J=9,5 Гц, 1H); 7,70 (д, J=7,9 Гц, 1H); 8,35 (д, J=8,4 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=754 [M-H]^-; m/z=756 [M+H]+; m/z=800 [MH+HCO2H]^-; t_R=1,62 мин.

Соединение 59: (3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((R)-1-((4-метоксибензил)окси)пропан-2-ил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12-тетраон.

К раствору соединения 58 (560 мг, 740,4 мкмоль) в ДХМ (56 мл) добавляли в атмосфере Ar катализатор Граббса I (31,0 мг, 37,02 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 1 ч 30 мин до добавления 31,0 мг катализатора. Перемешивание проводили при КТ в течение 1 ч 30 мин до добавления 31,0 мг катализатора. Перемешивание проводили при КТ в течение 1 ч 30 мин до добавления 31,0 мг катализатора и реакционную среду перемешивали при КТ в течение 1 ч. 30 мин. Концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 25 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 330 мг соединения 59 (61%) и 220 мг, которые дополнительно очищали с помощью флэш-хроматографии на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 204 мг соединения 59 (37%) в виде смеси с трициклогексилфосфиноксидом.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,85 (с, 9H); 0,88 (д, J=6,9 Гц, 3H); 0,91 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,04 (с, 3H); 1,20 (с, 3H); 1,29 (д, J=14,5 Гц, 1H); 1,95 (дд, J=9,8 и 14,5 Гц, 1H); 1,99 (м, 1H); 2,26 (м, 1H); 2,43 (м, 1H); 2,72 (дд, J=10,1 и 14,3 Гц, 1H); 2,97 (дд, J=3,6 и 14,3 Гц, 1H); 3,27 (дд, J=6,1 и 9,3 Гц, 1H); 3,40 (дд, J=5,8 и 9,3 Гц, 1H); 3,46 (м, 1H); 3,72 (с, 3H); 3,80 (с, 3H); 4,10 (м, 1H); 4,13 (м, 1H); 4,38 (с, 2H); 4,97 (м, 1H); 5,93 (д, J=15,4 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=4,8, 10,7 и 15,4 Гц, 1H); 6,90 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,02 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,17 (д, J=8,6 Гц, 3H); 7,36 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,88 (м, 2H); 8,48 (д, J=7,5 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=726 [M-H]^-; m/z=728 [М+Н]+; m/z=772 [M-H+HCO2H]^-; tR=1,54 мин.

Соединение 60: (3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((R)-1-гидроксипропан-2-ил)6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12-тетраон.

Соединение 59 (532 мг, 730,4 мкмоль) обрабатывали раствором ТФУК (3,93 мл) в ДХМ (36 мл) при КТ в течение 30 мин. Реакционную среду выливали в 9% водн. NaHCO₃ (130 мл) при магнитном перемешивании. Перемешивание продолжали в течение 30 мин, затем водную фазу экстрагировали ДХМ (2x70 мл). Объединенные органические фазы промывали H2O (3x20 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 30 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 299 мг соединения 60 в виде белой пены (67%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,88 (д, J=6,9 Гц, 3H); 0,89 (с, 9H); 0,90 (д, J=7,0 Гц, 3H) 1,03 (с, 3H); 1,20 (с, 3H); 1,36 (дд, J=1,8 и 14,5 Гц, 1H); 1,80 (м, 1H); 1,96 (дд, J=9,6 и 14,5 Гц, 1H); 2,25 (м, 1H); 2,43 (м, 1H); 2,72 (дд, J=11,1 и 14,3 Гц, 1H); 2,97 (дд, J=3,8 и 14,3 Гц, 1H); 3,25 (м, 1H); 3,45 (м, 2H); 3,80 (с, 3H); 4,10 (м, 1H); 4,16 (м, 1H); 4,57 (т, J=5,3 Гц, 1H); 4,98 (м, 1H); 5,93 (дд, J=1,3 и 15,3 Гц, 1H); 6,45 (ддд, J=4,9, 10,7 и 15,3 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,22 (дд, J=2,3 и 8,6 Гц, 1H); 7,36 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,89 (м, 2H); 8,48 (д, J=7,3 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=606 [M-H]^-; m/z=608 [M+H]+; t_R=1,2 мин.

Соединение 61: ^)-2-(^А,10К^,Е)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)пропаналь.

К раствору соединения 60 (297 мг, 488,4 мкмоль) в ДХМ (6 мл), охлажденному на бане лед/ацетон, добавляли при 0°С раствор KBr (58,11 мг, 488,4 мкмоль) в H2O (1,18 мл), TEMPO (1,57 мг, 9,8 мкмоль) и по каплям водный раствор 1,56М гипохлорита натрия рН 9,5 (467,6 мкл, 732,52 мкмоль). Перемешивание проводили при 0°С в течение 15 мин, затем добавляли при 0°С насыщ. Na₂S₂O₃ (3,56 мл), ледяную баню удаляли и реакционную среду перемешивали в течение 10 мин. Затем его экстрагировали ДХМ (3x25 мл), объединенные органические фазы промывали H2O (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 139 мг соединения 61 в виде белого лака (47%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,85 (с, 9H); 0,90 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,03 (с, 3H); 1,04 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,20 (с, 3H); 1,26 (д, J=15,3 Гц, 1H); 1,95 (м, 1H); 2,44 (м, 1H); 2,57 (м, 1H); 2,72 (дд, J=11,2 и 14,4 Гц, 1H); 2,80 (м, 1H); 2,98 (дд, J=3,1 и 14,4 Гц, 1H); 3,80 (с, 3H); 4,10 (м, 3H); 5,22 (м, 1H); 5,98 (д, J=15,3 Гц, 1H); 6,47 (ддд, J=4,9, 10,8 и 15,3 Гц, 1H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,22 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,37 (с, 1H); 7,90 (м, 1H); 7,92 (д, J=8,2 Гц, 1H); 8,53 (д, J=7,6 Гц, 1H); 9,68 (с, 1H). ЖХМС (А5): ES m/z=604 [M- 133 035625

H]^-; m/z=606 [М+Н]+; m/z=650 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,28 мин.

Соединение 62: (4-(((триизопропилсилил)окси)метил)фенил)метанол.

К раствору 1,4-бензолдиметанола (2 г, 14,33 ммоль) в ТГФ (100 мл) добавляли имидазол (1,13 г, 16,48 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 15 мин, затем добавляли триизопропилсилилхлорид (3,14 мл, 14,33 ммоль) и перемешивание продолжали при КТ в течение ночи. К реакционной смеси добавляли Et₂O (50 мл) и органическую фазу дважды промывали насыщ. солевым раствором (100 мл), отфильтровывали над MgSO₄, концентрировали под вакуумом, растворяли в ДХМ, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 200 г силикагеля (изократическое элюирование 8:2 гептан/EtOAc) с получением 1,9 г соединения 62 в виде бесцветного масла (45%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 1,04 (д, J=6,7 Гц, 18H); 1,15 (м, 3H); 4,48 (д, J=5,7 Гц, 2H); 4,78 (с, 2H); 5,13 (т, J=5,7 Гц, 1H); 7,29 (с, 4H).

Соединение 63: ((4-(бромметил)бензил)окси)триизопропилсилан.

К суспензии N-бромсукцинимида (1,29 г, 7,16 ммоль) в ДХМ (65 мл), охлажденной при 0°С, добавляли по каплям диметилсульфид (953 мкл, 12,9 ммоль). Перемешивание проводили при 0°С в течение 10 мин, затем реакционную среду охлаждали при -20°С и перемешивали при -20°С в течение 10 мин. Затем по каплям добавляли раствор соединения 62 (1,9 г, 6,4 5 ммоль) в ДХМ (30 мл), охлажденный до -20°С. Перемешивание проводили при -20°С в течение 15 мин, затем при 0°С в течение 15 мин и при КТ в течение ночи. Реакционную среду дважды промывали насыщ. солевым раствором (100 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью двух последовательных флэш-хроматографий на 40 г силикагеля (градиентное элюирование гептан/EtOAc). Фракции, содержащие ожидаемое соединение, объединяли, концентрировали под вакуумом и растворяли в гептане (8 мл). Суспензию отфильтровывали, фильтрат концентрировали под вакуумом, растворяли в Et2O (5 мл), охлаждали при -20°С, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом с получением 1,18 г соединения 63 в виде бледно-желтого масла (51%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 1,04 (д, J=6,8 Гц, 18Н); 1,15 (м, 3H); 4,70 (с, 2H); 4,81 (с, 2H); 7,29 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,41 (д, J=8,4 Гц, 2H). ЖХМС (A5): ES m/z=104; m/z=356 [М]⁺; tR=1, 99 мин.

Соединение 64: (1R, 4S, 5R, 6S)-4,7,7-триметил-6-(4-(((триизоnропилсилил)окси)метил)бензил)-6тиабицикло[3.2.1]октан-6-ил трифторметансульфонат.

К (1R,4R,5R)-4,7,7-триметил-6-тиабицикло[3.2.1]октαну (номер CAS [5718-75-2], 562,3 мг, 3,3 ммоль) добавляли раствор соединения 63 (1,18 г, 3,3 ммоль) в ДХМ (3,4 мл). Затем по каплям добавляли раствор трифторметансульфоната лития (2,63 г, 16,51 ммоль) в H₂O (3 мл) и реакционную среду перемешивали при КТ в течение ночи. Затем в реакционную среду добавляли H₂O (15 мл) и ДХМ (15 мл) и перемешивание продолжали при КТ в течение 10 мин. Водную фазу экстрагировали ДХМ (3x20 мл), объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором (3x8 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом. Бледно-желтое масло растирали в iPr₂O (5 мл), таким образом полученное твердое вещество отфильтровывали, промывали iPr2O (2x5 мл) и высушивали под вакуумом с получением 1,125 г соединения 64 в виде белого твердого вещества (57%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 1,04 (м, 21Н); 1,15 (м, 3H); 1,45 (м, 1H); 1,60 (м, 2H); 1,68 (с, 3H); 1,71 (м, 1H); 1,74 (с, 3H); 1,98 (м, 1H); 2,40 (д, J=14,6 Гц, 1H); 2,45 (м, 1H); 2,58 (уш.д, J=14,6 Гц, 1H); 3,85 (м, 1H); 4,56 (д, J=12,6 Гц, 1H); 4,83 (с, 2H); 4,90 (д, J=12,6 Гц, 1H); 7,44 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,57 (д, J=8,4 Гц, 2H).

Соединение 65: (3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-16((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(((триизоnропилсилил)окси)метил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-1-окса-4,8,11-триaзациклогексадек-13-ен-2,5,9,12-тетраон.

К раствору соединений 61 (138 мг, 227,7 мкмоль) и 64 (149,5 мг, 250,4 мкмоль) в ДХМ (4 мл), охлажденному до -70°С, добавляли по каплям ВЕМР (номер CAS [98015-45-3], 90,2 мкл, 296,0 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при -70°С в течение 2 ч, к реакционной смеси добавляли насыщ. солевой раствор (7 мл), баню удаляли и продолжали энергичное перемешивание до КТ. Водную фазу экстрагировали ДХМ (3x20 мл), объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 10 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 163 мг соединения 65 в виде бесцветного масла (30%) и 60 мг соединения 61 (43%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,84 (с, 9H); 0,88 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,05 (д, J=7,3 Гц, 18Н); 1,15 (м, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,32 (д, J=14,8 Гц, 1H); 1,82 (м, 1H); 1,97 (дд, J=9,9 и 14,8 Гц, 1H); 2,28 (дт, J=11,1 и 14,9 Гц, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,2 и 14,3 Гц, 1H); 2,91 (дд, J=2,2 и 7,6 Гц, 1H); 2,95 (дд, J=3,8 и 14,3 Гц, 1H); 3,43 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,91 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,08 (ддд, J=3,8, 7,4 и 11,2 Гц, 1H); 4,12 (м, 1H); 4,81 (с, 2H); 5,04 (ддд, J=1,5, 4,5 и 11,1 Гц, 1H); 5,89 (дд, J=1,5 и 15,2 Гц, 1H); 6,44 (ддд, J=4,5, 10,6 и 15,2 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,36 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,88 (д, J=8,4 Гц, 1H); 7,91 (д, J=7,1 Гц, 1H); 8,39 (д, J=7,4 Гц, 1H). ЖХМС (A4): ES m/z=120; m/z=882 [M+H]+; tR=7,65 мин.

Пример 26. (зS,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(гидроксиметил)

- 134 035625 фенил)оксиран-2-ил)этил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

К раствору соединения 65 в ТГФ, охлажденному при 0°С, добавляли TBAF. Реакционную среду перемешивали при 0°С в течение 1 ч 30 мин, затем добавляли H₂O (5 мл) и перемешивание продолжали в течение 20 мин. Реакционную среду экстрагировали ДХМ (3x20 мл), объединенную органическую фазу промывали насыщ. солевым раствором (3x5 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 15 г силикагеля (градиентное элюирование EtOAc/MeOH/H₂O) с получением 69 мг примера 26 в виде белого лака (91%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,85 (с, 9H); 0,89 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,35 (д, J=14,8 Гц, 1H); 1,80 (м, 1H); 1,99 (дд, J=9,9 и 14,8 Гц, 1H); 2,27 (дт, J=11,1 и 14,9 Гц, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,2 и 14,3 Гц, 1H); 2,90 (дд, J=2,2 и 7,6 Гц, 1H); 2,95 (дд, J=3,8 и 14,3 Гц, 1H); 3,43 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,91 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,06-4,15 (м, 2H); 4,50 (д, J=5,9 Гц, 2H); 5,03 (дд, J=1,5, 3,7 и 11,5 Гц, 1H); 5,20 (т, J=5,9 Гц, 1H); 5,89 (дд, J=1,5 и 15,3 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=4,6, 10,7 и 15,3 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,2 и 8,6 Гц, 1H); 7,23 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,32 (м, 3H); 7,87 (д, J=8,3 Гц, 1H); 7,92 (д, J=7,0 Гц, 1H); 8,40 (д, J=7,4 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=724 [M-H]^-; m/z=726 [M+H]+; m/z=770 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,29 мин.

Соединение 66: 4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил(4-нитрофенил)карбонат.

К раствору примера 26 (68 мг, 93,6 мкмоль) в ДХМ (5 мл) добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (118,7 мг, 374,5 мкмоль) и по каплям DIEA (49 мкл, 281,0 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 6 д, затем добавляли насыщ. солевой раствор и экстрагировали ДХМ (3x10 мл). Объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 79 мг соединения 66 в виде белого лака (94%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО<): 0,85 (с, 9H); 0,89 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,05 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,34 (д, J=14,6 Гц, 1H); 1,83 (м, 1H); 1,97 (дд, J=9,9 и 14,6 Гц, 1H); 2,28 (дт, J=11,1 и 14,9 Гц, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,2 и 14,3 Гц, 1H); 2,93 (м, 2H); 3,42 (м, 1H); 3,79 (с, 3H); 3,99 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,09 (м, 2H); 5,05 (дд, J=1,3, 4,0 и 11,1 Гц, 1H); 5,31 (с, 2H); 5,89 (дд, J=1,3 и 15,3 Гц, 1H); 6,47 (ддд, J=4,8, 10,8 и 15,3 Гц, 1H); 7,01 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,21 (дд, J=2,2 и 8,6 Гц, 1H); 7,31 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,36 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,50 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,59 (д, J=9,3 Гц, 2H); 7,87 (д, J=8,3 Гц, 1H); 7,92 (д, J=7,0 Гц, 1H); 8,32 (д, J=9,3 Гц, 2H); 8,39 (д, J=7,4 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=889 [М-Н]^-; m/z=891 [M+H]+; m/z=935 [M-H+HCO2H]^-; tR=1,55 мин.

Соединение 67: (9Н-флуорен-9-ил)метил-(^)-1 -((^)-1-((2-ХВос-аминоэтил)амино)-1 -оксопропан-2ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2-ил)карбамата гидрохлорид.

К суспензии Fmoc-Val-Ala-OH (3,5 г, 8,53 ммоль) в ДХМ (100 мл) добавляли ТЭА (3,6 мл, 25,58 мл), что приводило к полному растворению исходного материала, N-Boc-EDA (1,62 мл, 10,23 ммоль) и раствор пропилфосфонового ангидрида (6,51 г, 10,23 ммоль) 50% в ДХМ. Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 3 ч, затем добавляли 1N NaOH (50 мл) и суспензию отфильтровывали, промывали H2O и ДХМ. Органическую фазу фильтрата промывали H2O. Осадок и органическую фазу объединяли, частично концентрировали под вакуумом, отфильтровывали, промывали ДХМ и высушивали с получением 3,952 г соединения 67 в виде белого порошка (84%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,84 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,86 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,19 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,37 (с, 9H); 1,99 (м, 1H); 2,92-3,14 (м, 4H); 3,88 (дд, J=6,9 и 9,1 Гц, 1H); 4,19-4,35 (м, 4H); 6,71 (м, 1H); 7,32 (м, 2H); 7,38 (м, 1H); 7,42 (м, 2H); 7,73 (м, 2H); 7,84 (т, J=6,8 Гц, 1H); 7,89 (д, J=7,8 Гц, 2H); 7,92 (д, J=7,8 Гц, 1H).

Соединение 68: (9Н-флуорен-9-ил)метил-(^)-1 -(((S)-1 -((2-аминоэтил)амино)-1-оксопропан-2ил)амино)-3 -метил-1 -оксобутан-2-ил)карбамата гидрохлорид.

К суспензии соединения 67 (100 мг, 159,5 мкмоль) в диоксане (3 мл) добавляли HCl 4N в диоксане (905 мкл, 3,62 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 20 ч, затем концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт ресуспендировали в iPr₂O (3 мл), погружали в ультразвуковую баню и отфильтровывали. Полученный таким образом осадок промывали iPr₂O (2x3 мл) и высушивали под вакуумом с получением 78 мг соединения 68 в виде белого твердого вещества (88%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-сГ): 0,85 (д, J=6,9 Гц, 3H); 0,87 (д, J=6,9 Гц, 3H); 1,23 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,99 (м, 1H); 2,83 (м, 2H); 3,29 (м, 2H); 3,89 (дд, J=6,9 и 8,9 Гц, 1H); 4,19-4,38 (м, 4H); 7,33 (м, 2H); 7,42 (м, 3H); 7,75 (м, 2H); 7,88 (уш.с, 3H); 7,90 (д, J=7,6 Гц, 2H); 8,08 (д, J=7,3 Гц, 1H); 8,14 (д, J=5,9 Гц, 1H).

Соединение 69: 4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-Ίриметил3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил-(2-(^)-2-(^)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)этил)карбамат.

К суспензии соединений 66 (78 мг, 87,5 мкмоль) и 68 (51,4 мг, 105,0 мкмоль) в ДХМ добавляли

- 135 035625

DIEA (44,0 мкл, 262,5 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение ночи, затем добавляли соединение 68 (24 мг, 49 мкмоль) и DIEA (15 мкл) и перемешивание продолжали при КТ в течение 1 д. Добавляли пиперидин (87,0 мкл, 875,0 мкмоль) и перемешивание продолжали при КТ в течение ночи. Реакционную среду концентрировали под вакуумом и очищали с помощью двух последовательных флэш-хроматографий на 5 г силикагеля (градиентное элюирование EtOAc/MeOH/H₂O) с получением 57 мг соединения 69 в виде белого лака (66%).

¹Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,75 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (с, 9H); 0,86 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,87 (д, J=6,7 Гц, 3H); 0,99 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,18 (м, 6H); 1,33 (д, J=14,5 Гц, 1H); 1,75 (уш.с, 2H); 1,81 (м, 1H); 1,92 (м, 1H); 1,98 (дд, J=10,0 и 14,5 Гц, 1H); 2,28 (м, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,3 и 14,7 Гц, 1H); 2,90 (дд, J=2,0 и 7,5 Гц, 1H); 2,96 (м, 1H); 2,98 (д, J=4,7 Гц, 1H); 3,05 (м, 2H); 3,12 (м, 2H); 3,43 (м, 1H); 3,81 (с, 3H); 3,93 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,09 (м, 2H); 4,26 (м, 1H); 5,01 (с, 2H); 5,04 (м, 1H); 5,89 (дд, J=1,5 и 15,2 Гц, 1H); 6,45 (ддд, J=4,5, 10,4 и 15,2 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,8 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,4 и 8,8 Гц, 1H); 7,26 (т, J=6,0 Гц, 1H); 7,29 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,32 (д, J=2,5 Гц, 1H); 7,37 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,88 (д, J=8,4 Гц, 1H); 7,93 (д, J=7,1 Гц, 1H); 8,00 (т, J=6,0 Гц, 1H); 8,03 (д, J=8,1 Гц, 1H); 8,41 (д, J=7,2 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=492 [M+2H]2+; m/z=980 [M-H]^-; m/z=982 [M+H]+; m/z=1026 [M-H+HCO2H]^-; t_R=0,91 мин.

Соединение 70: (9S,12S)-1-(4-((2R, 3R)-3-((S)-1-((зS,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)6,6,7-триметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)фенил)-12-изопропил-9-метил-3,8,11,14-тетраоксо-2-окса-4,7,10,13-тетраазаоктадекан-18-овая кислота.

К раствору соединения 69 (56,0 мг, 56,8 мкл) в ДХМ (8 мл) добавляли раствор глутарового ангидрида (7,27 мг, 62,5 мкмоль) в ДХМ (4 мл). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 2 ч, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/МеОН/ИА с получением 35,5 мг соединения 70 в виде белого лака (56%).

¹Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,81 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,83 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (с, 9H); 0,87 (д, J=6,5 Гц, 3H); 0,99 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,19 (м, 6H); 1,32 (д, J=14,3 Гц, 1H); 1,70 (м, 2H); 1,81 (м, 1H); 1,92 (м, 1H); 1,98 (м, 2H); 2,15 (м, 2H); 2,19 (т, J=7,5 Гц, 2H); 2,27 (м, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=11,1 и 14,1 Гц, 1H); 2,91 (д, J=7,6 Гц, 1H); 2,95 (м, 1H); 3,04 (м, 2H); 3,10 (м, 2H); 3,41 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,93 (с, 1H); 4,03-4,16 (м, 3H); 4,19 (м, 1H); 5,01 (с, 2H); 5,04 (м, 1H); 5,89 (д, J=15,6 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=5,3, 11,0 и 15,6 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,28 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,30 (м, 1H); 7,32 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,36 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,88 (м, 2H); 7,93 (д, J=7,4 Гц, 1H); 7,98 (уш.с, 1H); 8,06 (уш.с, 1H); 8,42 (д, J=7,4 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=549 [M+2H]²⁺; m/z=1094 [M-H]^-; m/z=1096 [M+H]+; t_R=1,21 мин.

Пример 27. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-^,^)-1-(4-(^А)-3-(^)-1-(АА,10К^,Е)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)этил)оксиран-2-ил)фенил)-12-изопропил-9-метил-3,8,11,14-тетраоксо-2-окса4,7,10,13 -тетраазаоктадекан- 18-оат.

К раствору соединения 70 (14,6 мг, 13,3 мкмоль) в ДХМ (5 мл) в атмосфере Ar добавляли ДСК (4,3 мг, 16,0 мкмоль) и DIEA (2,8 мкл, 16,0 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 3 ч, затем добавляли ДСК (1,5 мг, 5,6 мкмоль) и DIEA (1 мкл, 5,7 мкмоль) и перемешивание проводили при КТ в течение 1 ч.

Реакционную среду концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 16,4 г диол-модифицированного силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/iPrOH) с получением 11,4 мг примера 27 в виде белого лака (72%).

¹Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,81 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,83 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (с, 9H); 0,88 (д, J=6,5 Гц, 3H); 0,99 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,19 (м, 6H); 1,34 (д, J=14,4 Гц, 1H); 1,83 (м, 3H); 1,98 (м, 2H); 2,26 (м, 1H); 2,29 (м, 2H); 2,60 (м, 1H); 2,68 (т, J=7,6 Гц, 2H); 2,70 (дд, J=11,2 и 14,3 Гц, 1H); 2,80 (с, 4H); 2,91 (дд, J=2,3 и 7,6 Гц, 1H); 2,95 (дд, J=3,7 и 14,3 Гц, 1H); 2,99-3,20 (м, 4H); 3,43 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,93 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,05-4,25 (м, 4H); 5,01 (м, 2H); 5,03 (м, 1H); 5,89 (дд, J=1,6 и 15,4 Гц, 1H); 6,44 (ддд, J=4,6, 10,9 и 15,4 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,20 (м, 2H); 7,28 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,31 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,37 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,86 (м, 3H); 7,91 (д, J=7,1 Гц, 1H); 7,95 (д, J=7,6 Гц, 1H); 8,39 (д, J=7,3 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=311; m/z=1191 [M-H]^-; m/z=1193 [M+H]+; m/z=1237 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,26 мин.

Пример 28. mAb-пр. 27.

Пример 28 получали аналогично примерам 3, 7, 10 и 14. 1,56 мг примера 28 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 0,78 мг/мл с DAR 4 (MCBP), мономерной чистотой 100% и общим выходом 13%.

SEC-MCBP: m/z=149405 (голое mAb); m/z=150486 (D1); m/z=151568 (D2); m/z=152645 (D3); m/z=153725 (D4); m/z=154802 (D5); m/z=155882 (D6); m/z=156961 (D7); m/z=158039 (D8).

Синтез примера 29: малеимидо-mc-vc-PABA-3-(S)-неопенmил-7-(S)-Me-аза-C52-бензилового амина

- 136 035625

Соединение 71: 4-(^)-2-(^)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил(4-нитрофенил)карбонат.

Соединение 72 получали, как описано Verma V.A., et al., in Bioorg Med Chem Lett 2015, 25, 864-868.

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,83 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,87 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,18 (м, 2H); 1,31-1,75 (м, 8Н); 1,96 (м, 1H); 2,10 (м, 1H); 2,18 (м, 1H); 2,96 (м, 1H); 3,01 (м, 1H); 3,37 (т, J=7,2 Гц, 2н); 4,19 (дд, J=7,0 и 8,6 Гц, 1H); 4,38 (м, 1H); 5,24 (с, 2H); 5,42 (с, 2H); 5,98 (т, J=6,0 Гц, 1H); 7,00 (с, 2H); 7,40 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,57 (д, J=9,2 Гц, 2H); 7,66 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,81 (д, J=8,6 Гц, 1H); 8,12 (д, J=7,9 Гц, 1H); 8,31 (д, J=9,2 Гц, 2H); 10,08 (с, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=738 [M+H]+; m/z=782 [M-H+HCO₂H]^-; t_R=1,1 мин.

Пример 29. 4-(^)-2-(^)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)карбамат.

К соединению 71 (16,0 мг, 21,7 мкмоль) добавляли раствор примера 25 (14,3 мг, 19,7 мкмоль) в ДХМ (2,5 мл) и DIEA (3,4 мкл, 19,7 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение ночи, затем добавляли ДМФ (1 мл) и перемешивание продолжали при КТ в течение 1 д. H2O (8 мл) добавляли к реакционной среде, перемешивание продолжали в течение 15 мин, затем водную фазу экстрагировали ДХМ (3x10 мл). Объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом, дважды соиспаряли с толуолом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 5 г на силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 15,8 мг примера 29 в виде белого твердого вещества (60%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-d;): 0,81 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,85 (д, J=7,0 Гц, 3H); 0,86 (с, 9H); 0,89 (д, J=6,8 Гц, 3H); 0,99 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,0 Гц, 3H); 1,18 (с, 3H); 1,19 (м, 2H); 1,31-1,75 (м, 9H); 1,80 (м, 1H); 1,96 (м, 2H); 2,10 (м, 1H); 2,18 (м, 1H); 2,27 (м, 1H); 2,61 (м, 1H); 2,69 (дд, J=10,8 и 14,3 Гц, 1H); 2,90 (дд, J=2,1 и 7,6 Гц, 1H); 2,96 (м, 2H); 3,01 (м, 1H); 3,37 (т, J=7,2 Гц, 2H); 3,42 (м, 1H); 3,80 (с, 3H); 3,90 (д, J=2,1 Гц, 1H); 4,08 (м, 1H); 4,11 (м, 1H); 4,20 (м, 3H); 4,39 (м, 1H); 4,97 (с, 2H); 5,04 (м, 1H); 5,40 (с, 2H); 5,89 (дд, J=1,7 и 15,5 Гц, 1H); 5,97 (т, J=6,2 Гц, 1H); 6,45 (ддд, J=4,8, 10,7 и 15,5 Гц, 1H); 6,99 (с, 2H); 7,01 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,21-7,30 (м, 6H); 7,31 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,59 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,78 (м, 2H); 7,85 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,90 (д, J=6,9 Гц, 1H); 8,07 (д, J=7,8 Гц, 1H); 8,39 (д, J=7,3 Гц, 1H); 9,97 (с, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=662 [М+2Н]²⁺; m/z=1322 [M-H]^-; m/z=1324 [M+H]⁺; m/z=1368 [MH+HCO2H]^-; t_R=1,3 мин.

Синтез примеров 30 и 31: NHS-эфира нерасщепляемого триазол-3-^)-неопентил-7-^)-Ме-аза-С52 и соответствующего ADC

- 137 035625

Соединение 72: трет-бутил-3-(проп-2-ин-1-илокси)пропаноат.

К раствору пропаргилового спирта (1,362 мл, 23,4 ммоль) в ТГФ (23 мл) добавляли натрий (20,08 мг, 0,874 ммоль), реакционную среду нагревали при 60°С до полной солюбилизации натрия, затем охлаждали при КТ перед добавлением трет-бутилакрилата (2,286 мл, 15,6 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение ночи, затем добавляли H2O (25 мл) и водную фазу экстрагировали EtOAc (3x25 мл). Объединенную органическую фазу высушивали над Na₂SO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом с получением 2 г соединения 72 в виде бесцветного масла (70%).

Соединение 73: 3-(проп-2-ин-1-илокси)пропановая кислота.

К раствору соединения 72 (2,0 г, 10,86 ммоль) в ДХМ (50 мл) добавляли ТФУК (8,065 мл, 108,6 ммоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение ночи, концентрировали под вакуумом, соиспаряли с толуолом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 80 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 1,1 г соединения 73 в виде масла (80%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 2,46 (т, J=6,4 Гц, 2H); 3,43 (т, J=2,4 Гц, 1H); 3,63 (т, J=6,4 Гц, 2H); 4,11 (д, J=2,4 Гц, 2H); 12,20 (уш., 1H).

Соединение 74: 3-((1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3S,7S,10R, 16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6,6,7триметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек- 13-ен-16-ил)этил)оксиран2-ил)бензил)-Ш-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)пропановая кислота.

К раствору примера 24 (50 мг, 66,6 мкмоль) в ТГФ (0,5 мл) добавляли соединение 73 (17,05 мг, 113,1 мкмоль), 0,1М водн. сульфат меди(П) (266 мкл, 26,6 мкмоль) и 0,2М водн. аскорбат натрия (266 мкл, 53,2 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 1 д, затем добавляли H2O (1 мл) и водную фазу экстрагировали EtOAc (3x1 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором, высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью фильтрования на Sephadex LH20 (элюирование ДХМ) с получением 40 мг масла, которое дополнительно очищали с помощью флэш-хроматографии на 5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 20 мг соединения 74 (35%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,82 (с, 9H); 0,88 (д, J=6,7 Гц, 3H); 1,00 (с, 3H); 1,04 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,18 (с, 3H); 1,31 (д, J=14,6 Гц, 1H); 1,80 (м, 1H); 1,97 (дд, J=10,0 и 14,6 Гц, 1H); 2,25 (м, 1H); 2,42 (т, J=6,6 Гц, 2H); 2,60 (м, 1H); 2,70 (дд, J=10,9 и 14,4 Гц, 1H); 2,90 (дд, J=2,2 и 7,6 Гц, 1H); 2,95 (дд, J=3,6 и 14,4 Гц, 1H); 3,44 (м, 1H); 3,62 (т, J=6,6 2H); 3,80 (с, 3H); 3,94 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,08 (м, 2H); 4,49 (с, 2H); 5,03 (м, 1H); 5,59 (с, 2H); 5,89 (дд, J=1,7 и 15,3 Гц, 1H); 6,43 (ддд, J=4,8, 10,8 и 15,3 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,7

- 138 035625

Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,4 и 8,7 Гц, 1H); 7,29 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,32 (д, J=2,4 Гц, 1H); 7,35 (д, J=8,4 Гц, 2H);

7,85 (д, J=8,4 Гц, 1H); 7,90 (д, J=7,0 Гц, 1H); 8,13 (с, 1H); 8,46 (м, 1H); 12,20 (уш, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=440 [M+2H]2+; m/z=877 [M-H]^-; m/z=879 [M+H]⁺; t_R=1,24 мин.

Пример 30. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-3-((1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4метоксибензил)-6,6,7-триметил-3-неопентил-2,5,9,12-тетраоксо-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен16-ил)этил)оксиран-2-ил)бензил)- 1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)пропаноат.

К раствору соединения 74 (20 мг, 22,7 мкмоль) в ДХМ (5 мл) добавляли DIEA (5,0 мкл, 28,5 мкмоль) и ДСК (6,34 мг, 23,8 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 3 ч, затем добавляли ДСК (3 мг, 11,3 мкмоль) и DIEA (5 мкл, 28,5 мкмоль) и перемешивание проводили при КТ в течение 2 ч. Затем реакционную среду концентрировали под вакуумом и очищали с помощью двух последовательных флэш-хроматографий на 1,5 г диол-модифицированного силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/iPrOH) с получением 11,5 мг примера 30 (50%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-06): 0,83 (с, 9H); 0,87 (д, J=6,6 Гц, 3H); 0,99 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,04 (д, J=6,6 Гц, 3H); 1,19 (с, 3H); 1,32 (д, J=14,5 Гц, 1H); 1,81 (м, 1H); 1,96 (дд, J=10,2 и 14,5 Гц, 1H); 2,25 (м, 1H); 2,60 (м, 1H); 2,70 (дд, J=11,2 и 14,5 Гц, 1H); 2,80 (с, 4H); 2,90 (дд, J=2,0 и 7,4 Гц, 1H); 2,94 (т, J=6,1 Гц, 2H); 2,97 (дд, J=3,6 и 14,1 Гц, 1H); 3,42 (м, 1H); 3,74 (т, J=6,1 Гц, 2H); 3,80 (с, 3H); 3,92 (д, J=2,0 Гц, 1H); 4,09 (м, 2H); 4,55 (с, 2H); 5,03 (м, 1H); 5,59 (с, 2H); 5,89 (дд, J=1,6 и 15,2 Гц, 1H); 6,44 (ддд, J=4,7, 10,6 и 15,2 Гц, 1H); 7,02 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,20 (дд, J=2,4 и 8,6 Гц, 1H); 7,29 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,32 (м, 3H); 7,86 (д, J=8,4 Гц, 1H); 7,90 (д, J=6,9 Гц, 1H); 8,14 (с, 1H); 8,39 (д, J=7,5 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=120; m/z=974 [M-H]^-; m/z=976 [M+H]⁺; m/z=1020 [M-H+HCO2H]^-; tR=1,29 мин.

Пример 31. mAb-пр. 30.

Пример 31 получали аналогично примерам 3, 7, 10 и 14. 5,4 мг примера 31 получали в виде бесцветного прозрачного раствора в концентрации 1,8 мг/мл с DAR 4 (MCBP), мономерной чистотой 98,1% и общим выходом 45%.

SEC-MCBP: m/z=149399 (голое mAb); m/z=150245 (D1); m/z=151101 (D2); m/z=151965 (D3); m/z=152831 (D4); m/z=153679 (D5); m/z=154546 (D6); m/z=155408 (D7); m/z=156273 (D8); m/z=157284 (D9).

Синтез примера 32: 3-(S)-неопентил-6-Me-6-CH₂OH-аза-C52-бензилового амина

Соединение 75: (2R,3S)-1-((4-метоксибензил)окси)-2-метилгекс-5-ен-3-ил-(2S)-2-((4-((R)-2-акриламидо-3-(3-хлор-4-метоксифенил)пропанамидо)-3-(гидроксиметил)-3-метил-2-оксобутил)амино)-4,4диметилпентаноат.

К раствору соединения BC6 (385,6 мг, 773,5 мкмоль) в ДМФ (12 мл) добавляли HATU (348,7 мг, 889,5 мкмоль) и HOAt (122,3 мг, 889,5 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 30 мин, затем добавляли раствор соединения AD3 (292 мг, 773,5 мкмоль) в ДМФ (5 мл) и DIEA (475,2 мкл,

- 139 035625

2,71 ммоль) и перемешивание продолжали при КТ в течение 4 ч. Добавляли H₂O (50 мл) и водную фазу экстрагировали EtOAc (3x50 мл). Объединенные органические фазы промывали H2O (15 мл), насыщ.

солевым раствором (3x15 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 30 г силикагеля (градиентное элюирование

ДХМ/MeOH) с получением 383 мг соединения 75 в виде желтого масла (65%).

¹Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): смесь диастереомеров 55/45; 0,85-0,88 (м, 12H); 0,91 (с, 1,65H); 0,92 (с, 1,35H); 1,56 (м, 1H); 1,60 (м, 1H); 1,98 (м, 1H); 2,21 (м, 1H); 2,30 (м, 1H); 2,71 (м, 1H); 2,92 (м, 1H); 3,19-3,45 (м, 6H); 3,73 (с, 3H); 3,80 (с, 3H); 4,29 (м, 1H); 4,33 (м, 2H); 4,58 (м, 1H); 4,82 (м, 1H); 4,95-5,09 (м, 3H); 5,55 (дд, J=2,2 и 10,2 Гц, 1H); 5,71 (м, 1H); 6,01 (дд, J=2,2 и 17,2 Гц, 1H); 6,23 (дд, J=10,2 и 17,2 Гц, 1H); 6,89 (м, 2H); 7,01 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,17 (дд, J=2,2 и 8,6 Гц, 1H); 7,21 (м, 2H); 7,34 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,82 (д, J=8,0 Гц, 0,45H); 7,84 (д, J=8,0 Гц, 0,55H); 7,98 (т, J=6,5 Гц, 0,45H); 8,00 (т, J=6,5 Гц, 0,55H); 8,39 (д, J=8,6 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=756 [M-H]^-; m/z=758 [M+H]+; m/z=802 [M-H+HCO2H^-]; t_R=1,54-1,56 мин.

Соединение 76: (3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6-(гидроксиметил)-16-((R)-1-((4метоксибензил)окси)пропан-2-ил)-6-метил-3 -неопентил-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13 -ен2,5,9,12-тетраон.

К раствору соединения 75 (380 мг, 501,1 мкмоль) в ДХМ (38 мл) в атмосфере Ar добавляли катализатор Граббса I (20,97 мг, 25,05 мкмоль). Реакционную среду перемешивали в атмосфере Ar при КТ в течение 4 ч, затем добавляли катализатор Граббса I (20,97 мг, 25,05 мкмоль). Перемешивание продолжали при КТ в течение 3 ч, затем добавляли катализатор Граббса I (20,97 мг, 25,05 мкмоль) и перемешивание продолжали при КТ. После 24 ч реакции добавляли катализатор Граббса I (20,97 мг, 25,05 мкмоль) и перемешивание продолжали в течение 4 ч. Реакционную среду концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 20 г силикагеля (изократическое элюирование гептан/EtOAc) с получением 170 мг соединения 76 стереоизомера 1 (56%) и 138 мг соединения 76 стереоизомера 2 (37%).

Соединение 16 стереоизомер 1

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО<): 0,83 (с, 9H); 0,91 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,02 (с, 3H); 1,30 (дд, J=2,4 и 14,6 Гц, 1H); 1,53 (дд, J=9,9 и 14,6 Гц, 1H); 1,99 (м, 1H); 2,28 (м, 1H); 2,45 (м, 1H); 2,67 (м, 1H); 2,91 (дд, J=3,0 и 13,7 Гц, 1H); 2,97 (дд, J=4,0 и 14,5 Гц, 1H); 3,17-3,49 (м, 5H); 3,72 (с, 3H); 3,80 (с, 3H); 4,18 (м, 1H); 4,37 (м, 2H); 4,50 (тд, J=2,4 и 9,6 Гц, 1H); 5,00 (м, 3H); 5,82 (дд, J=1,9 и 15,4 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=4,2, 11,6 и 15,4 Гц, 1H); 6,90 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,04 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,12 (м, 1H); 7,15 (дд, J=2,3 и 8,6 Гц, 1H); 7,21 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,28 (д, J=2,3 Гц, 1H); 8,09 (д, J=9,6 Гц, 1H); 8,38 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A4): ES m/z=728 [M-H]^-; m/z=730 [M+H]+; m/z=774; t_R=5,15 мин.

Соединение 16 стереоизомер 2

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,83 (с, 9H); 0,88 (с, 3H); 0,91 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,28 (дд, J=2,4 и 14,6 Гц, 1H); 1,67 (дд, J=9,9 и 14,6 Гц, 1H); 1,99 (м, 1H); 2,28 (м, 1H); 2,45 (м, 1H); 2,67 (м, 1H); 3,02 (дд, J=3,3 и 14,2 Гц, 1H); 3,08 (дд, J=1,9 и 13,5 Гц, 1H); 3,25-3,42 (м, 4H); 3,55 (дд, J=5,1 и 11,0 Гц, 1H); 3,73 (с, 3H); 3,81 (с, 3H); 4,17 (м, 1H); 4,37 (м, 2H); 4,44 (тд, J=2,1 и 9,3 Гц, 1H); 4,80 (т, J=5,1 Гц, 1H); 5,00 (м, 2H); 5,86 (дд, J=1,6 и 15,1 Гц, 1H); 6,38 (ддд, J=4,0, 11,4 и 15,3 Гц, 1H); 6,90 (д, J=8,8 Гц, 2H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=2,2 и 8,7 Гц, 1H); 7,22 (д, J=8,8 Гц, 2H); 7,30 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,42 (д, J=10,4 Гц, 1H); 7,92 (д, J=8,9 Гц, 1H); 8,45 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A4): ES m/z=728 [M-H]^-; m/z=730 [M+H]+; m/z=774; tR=4,79 мин.

Соединение 77: (3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((R)-1-((4-метоксибензил)окси) пропан-2-ил)-6-метил-3 -неопентил-6-(((триэтилсилил)окси)метил)-1-окса-4,8,11 -триазациклогексадек-13ен-2,5,9,12-тетраон.

К раствору соединения 76 стереоизомера 1 (170 мг, 232,8 мкмоль) в ДХМ (3 мл), охлажденному на ледяной бане, добавляли при 4°С хлортриэтилсилан (159,3 мкл, 931,1 мкмоль) и по каплям ТЭА (131,1 мкл, 931,1 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при 4°С в течение 30 мин, затем при КТ в течение 20 ч. Реакционную среду разбавляли ДХМ (50 мл) и солевым раствором (10 мл) и перемешивание продолжали в течение 10 мин. Органическую фазу промывали насыщ. солевым раствором (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом. Другой диастереомер соединения 76 (138 мг, 189,0 мкмоль) защищали подобным образом, обе партии объединяли и очищали с помощью флэш-хроматографии на 20 г силикагеля (изократическое элюирование гептан/EtOAc) с получением 139 мг соединения 77 стереоизомера 1 в виде бесцветной пены (39%) и 107 мг соединения 77 стереоизомера 2 в виде бесцветной пены (30%).

Соединение 77 стереоизомер 1

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,62 (к, J=8,1 Гц, 6H); 0,83 (с, 9H); 0,91 (д, J=7,1 Гц, 3H); 0,96 (т, J=8,1 Гц, 9H); 1,04 (с, 3H); 1,66 (дд, J=3,4 и 14,4 Гц, 1H); 1,43 (дд, J=9,3 и 14,4 Гц, 1H); 1,99 (м, 1H); 2,28 (м, 1H); 2,47 (м, 1H); 2,68 (м, 1H); 2,92 (дд, J=3,0 и 13,5 Гц, 1H); 2,99 (дд, J=4,0 и 14,8 Гц, 1H); 3,213,40 (м, 3H); 3,48 (м, 1H); 3,63 (д, J=10,3 Гц, 1H); 3,73 (с, 3H); 3,81 (с, 3H); 4,17 (м, 1H); 4,36 (м, 2H); 4,51 (тд, J=2,9 и 9,4 Гц, 1H); 5,02 (м, 1H); 5,82 (дд, J=1,8 и 15,4 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=4,3, 11,6 и 15,4 Гц, 1H); 6,89 (д, J=8,7 Гц, 2H); 7,02 (м, 1H); 7,04 (д, J=8,7 Гц, 1H); 7,15 (дд, J=2,3 и 8,7 Гц, 1H); 7,21 (д, J=8,7 Гц,

- 140 035625

2H); 7,29 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,96 (д, J=9,4 Гц, 1H); 8,31 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A4): ES m/z=842 [M-H]^-;

m/z=844 [M+H]+; m/z=888 [M-H+HCO2H]^-; tR=7,08 мин.

Соединение 77 стереоизомер 2

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,52 (к, J=8,1 Гц, 6H) 0,84 (с, 9H); 0,88-0,93 (м, 15H); 1,29 (дд, J=2,6 и 14,5 Гц, 1H); 1,68 (дд, J=10,1 и 14,5 Гц, 1H); 1,99 (м, 1H); 2,28 (м, 1H); 2,47 (м, 1H); 2,68 (м, 1H); 3,01 (дд, J=3,4 и 14,5 Гц, 1H); 3,15 (д, J=12,8 Гц, 1H); 3,33 (м, 1H); 3,48 (д, J=10,4 Гц, 1H); 3,73 (с, 3H); 3,81 (с, 3H); 3,83 (д, J=10,4 Гц, 1H); 4,17 (м, 1H); 4,36 (м, 2H); 4,45 (тд, J=2,4 и 9,2 Гц, 1H); 5,01 (м, 1H); 5,84 (дд, J=1,8 и 15,3 Гц, 1H); 6,39 (ддд, J=3,9, 11,4 и 15,3 Гц, 1H); 6,90 (д, J=8,8 Гц, 2H); 7,05 (д, J=8,6 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=2,2 и 8,6 Гц, 1H); 7,22 (д, J=8,8 Гц, 2H); 7,30 (д, J=2,2 Гц, 1H); 7,47 (д, J=10,4 Гц, 1H); 8,01 (д, J=9,2 Гц, 1H); 8,41 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A4): ES m/z=842 [M-H]^-; m/z=844 [M+H]+; m/z=888 [M-H+HCO2H]^-; tR=6,88 мин.

Соединение 78: (3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-16-((R)-1-гидроксипропан-2-ил)-6метил-3-неопентил-6-(((триэтилсилил)окси)метил)-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-2,5,9,12тетраон.

К раствору обоих диастереомеров соединения 77 (245 мг, 290,1 мкмоль) в ДХМ (10 мл) и H2O (2,5 мл), охлажденному на бане лед/ацетон, добавляли DDQ (339,4 мг, 1,45 ммоль) и 2,6-ди-третбутилпиридин (171,7 мг, 870,3 мкмоль). Реакционную среду перемешивали при 0°С в течение 2 ч, затем разбавляли водн. NaHCO₃ (10 мл) и ДХМ (10 мл) и перемешивание продолжали в течение 10 мин. Водную фазу экстрагировали ДХМ (3x20 мл), объединенные органические фазы промывали насыщ. солевым раствором (3x5 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 20 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 155 мг соединения 78 в виде белой пены (74%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,49-0,65 (м, 6H); 0,80-1,07 (м, 24H); 1,35-1,71 (м, 2H); 1,83 (м, 1H); 2,28 (м, 1H); 2,47 (м, 1H); 2,68 (м, 1H); 2,90-3,50 (м, 5,96H); 3,65 (д, J=10,6 Гц, 0,52H); 3,80 (с, 3H); 3,82 (д, J=10,6 Гц, 0,52H); 4,18 (м, 1H); 4,29-4,70 (м, 2H); 5,02 (м, 1H); 5,80-5,89 (м, 1Н); 6,05 (м, 0,11Н); 6,39 (м, 0,89Н); 6,98-7,31 (м, 3,48Н); 7,47 (д, J=10,6 Гц, 0,52H); 7,87 (д, J=9,4 Гц, 0,11Н); 7,96 (д, J=9,4 Гц, 0,52H); 8,00 (д, J=9,4 Гц, 0,37H); 8,31 (д, J=8,0 Гц, 0,63Н); 8,42 (д, J=8,4 Гц, 0,37H). ЖХМС (A4): ES m/z=722 [M-H]^-; m/z=724 [M+H]+; m/z=768 [M-H+HCO2H]^-; t_R=5,68-5,78 мин.

Соединение 79: (2S)-2-((3S,10R,16S,E)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-6-метил-3-неопентил-2,5,9,12тетраоксо-6-(((триэтилсилил)окси)метил)-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек-13-ен-16-ил)пропаналь.

К раствору соединения 78 (154 мг, 212,6 мкмоль) в ДХМ (1,5 мл), охлажденному на бане лед/ацетон, добавляли при 0°С раствор KBr (25,6 мг, 212,6 мкмоль) в H2O (612 мкл), раствор TEMPO при 5 мг/мл в ДХМ (137 мкл, 4,25 мкмоль) и по каплям водный раствор 1,56М гипохлорита натрия рН 9,5 (204 мкл, 318,9 мкмоль). Перемешивание продолжали при 0°С в течение 15 мин, затем добавляли при 0°С насыщ. Na₂S₂O₃ (1,9 мл), ледяную баню удаляли и реакционную среду перемешивали в течение 10 мин. Затем ее экстрагировали ДХМ (3x20 мл), объединенные органические фазы промывали H2O (2x10 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 15 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 36 мг соединения 61 (23%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): смесь диастереомеров 72/28: 0,49-0,65 (м, 6H); 0,80-1,08 (м, 24H); 1,32-1,69 (м, 2H); 2,40 (м, 1H); 2,68 (м, 2H); 2,79 (м, 1H); 2,89-3,70 (м, 5H); 3,80 (с, 3H); 4,10-4,53 (м, 2H); 5,02 (м, 0,28Н); 5,28 (м, 0,72H); 5,78-5,91 (м, 1H); 6,07 (м, 0,28Н); 6,40 (м, 0,72H); 7,00-7,51 (м, 4H); 7,90 (д, J=9,4 Гц, 0,28Н); 7,98 (д, J=9,4 Гц, 0,72H); 8,34 (м, 1H); 9,59 (д, J=2,5 Гц, 0,28Н); 9,63 (д, J=1,8 Гц, 0,72H). ЖХМС (А5): m/z=722 [M+H]+; t_R=1,71 мин.

Соединение 80: 1-(азидометил)-4-(бромметил)бензол.

К раствору п-ксилолдибромида (2,0 г, 7,2 ммоль) в ДМФ (20 мл) добавляли через 20 мин раствор азида натрия (584,9 мг, 8,64 ммоль) в ДМФ (20 мл). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение 20 ч, затем выливали на лед (100 г) и экстрагировали EtOAc (3x50 мл). Объединенную органическую фазу промывали насыщ. солевым раствором (3x15 мл), высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом, соиспаряли с толуолом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 70 г силикагеля (элюирование Et₂O) с получением 773 мг соединения 80 в виде бесцветного масла (47%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСОА): 4,45 (с, 2H); 4,71 (с, 2H); 7,35 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,47 (д, J=8,5 Гц, 2H).

Соединение 81: (1Р^.5Р.6А-6-(4-(азидометил)бензил)-4.7.7-триметил-6-тиабицикло|3.2.1|октан-6ия трифторметансульфонат.

К (1R,4R,5R)-4,7,7-триметил-6-тиабицикло[3.2.1]октану (номер CAS [5718-75-2], 580,1 мг, 3,41 ммоль) добавляли раствор соединения 80 (770 мг, 3,41 ммоль) в ДХМ (2,2 мл). Затем по каплям добавляли раствор трифторметансульфоната лития (2,71 г, 17,03 ммоль) в H2O (2 мл) и реакционную среду перемешивали при КТ в течение 2 д. Затем в реакционную среду добавляли H2O (15 мл) и ДХМ (15 мл) и перемешивание продолжали при КТ в течение 10 мин.

Водную фазу экстрагировали ДХМ (3x15 мл), объединенные органические фазы промывали насыщ.

- 141 035625 солевым раствором (3x8 мл), высушивали над MgSO4, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом. Бледно-желтое масло растирали в iPr₂O (5 мл), таким образом полученное твердое вещество отфильтровывали, промывали iPr₂O (2x5 мл) и высушивали под вакуумом с получением 1,266 г соединения в виде белого твердого вещества (79%).

1Н-ЯМР (400 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 1,08 (д, J=7,2 Гц, 3H); 1,45 (м, 1H); 1,55-1,80 (м, 3H); 1,69 (с, 3H); 1,75 (с, 3H); 1,99 (м, 1H); 2,40 (д, J=13,8 Гц, 1H); 2,45 (м, 1H); 2,59 (дм, J=13,8 Гц, 1H); 3,88 (т, J=4,6 Гц, 1H); 4,52 (с, 2H); 4,60 (д, J=12,8 Гц, 1H); 4,90 (д, J=12,8 Гц, 1H); 7,47 (д, J=8,5 Гц, 2H); 7,61 (д, J=8,5 Гц, 2H).

Соединение 82: (3S,10R, 1 6S,E)- 16-((S)-1 -((2R,3R)-3-(4-(азидометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10(3-хлор-4-метоксибензил)-6-метил-3-неопентил-6-(((триэтилсилил)окси)метил)-1-окса-4,8,11-триазациклогексадек- 13-ен-2,5,9,12 -тетраон.

К раствору соединений 79 (35 мг, 48,5 мкмоль) и 81 (24,8 мг, 53,3 мкмоль) в ДХМ (1,5 мл), охлажденному до -70°С, добавляли по каплям ВЕМР (номер CAS [98015-45-3], 18,6 мкл, 63,0 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при -70°С в течение 2 ч 30 мин, в реакционную смесь добавляли насыщ. солевой раствор (1,5 мл), баню удаляли и продолжали энергичное перемешивание до КТ. Водную фазу экстрагировали ДХМ (3x10 мл), объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/MeOH) с получением 10,2 мг соединения 82 в виде бесцветного лака (24%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-dp 0,61 (к, J=8,1 Гц, 6H); 0,80 (с, 9H); 0,98 (т, J=8,1 Гц, 9H); 1,02 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,34 (дд, J=2,5 и 14,4 Гц, 1H); 1,44 (дд, J=10,0 и 14,4 Гц, 1H); 1,85 (м, 1H); 2,27 (м, 1H); 2,62 (м, 2H); 2,88 (дд, J=2,6 и 13,5 Гц, 1H); 2,97 (дд, J=3,7 и 14,2 Гц, 1H); 3,00 (дд, J=2,3 и 7,3 Гц, 1H); 3,35 (м, 1H); 3,48 (дд, J=9,5 и 14,2 Гц, 1H); 3,61 (д, J=10,3 Гц, 1H); 3,81 (с, 3H); 3,92 (д, J=2,3 Гц, 1H); 4,15 (м, 1H); 4,46 (с, 2H); 4,48 (тд, J=2,5 и 9,7 Гц, 1H); 5,10 (м, 1H); 5,78 (дд, J=2,2 и 15,3 Гц, 1H); 6,40 (ддд, J=4,3, 11,6 и 15,3 Гц, 1H); 7,04 (м, 2H); 7,14 (дд, J=2,3 и 8,6 Гц, 1H); 7,28 (д, J=2,3 Гц, 1H); 7,33 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,39 (д, J=8,4 Гц, 2H); 7,96 (д, J=9,7 Гц, 1H); 8,28 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (А5): ES m/z=120; m/z=865 [M-H]^-; m/z=867 [M+H]+; m/z=911 [M-H+HCO2H]^-; t_R=1,87 мин.

Пример 32. (3S,10R, 16S,E)- 16-((S)-1 -((2R,3R)-3 -(4-(аминометил)фенил)оксиран-2-ил)этил)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-6-метил-3 -неопентил-6-(((триэтилсилил)окси)метил)-1 -окса-4,8,11 -триазациклогексадек- 13-ен-2,5,9,12 -тетраон.

К раствору соединения 82 (9,4 мг, 10,84 мкмоль) в ДХМ (1,3 мл) и MeOH (0,7 мл) добавляли раствор TCEP (3,45 мг, 11,9 мкмоль) в H2O (0,7 мл). Реакционную среду перемешивали при КТ в течение ночи, затем добавляли водн. NaHCO₃ (2,5 мл) и перемешивание продолжали в течение 10 мин. Водную фазу экстрагировали ДХМ (3x10 мл), объединенные органические фазы высушивали над MgSO₄, отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и очищали с помощью флэш-хроматографии на 5 г силикагеля (градиентное элюирование ДХМ/МеОН/И₂О) с получением 4,55 мг примера 32 в виде белого лака (57%).

1Н-ЯМР (500 МГц, δ в м.д., ДМСО-de): 0,82 (с, 9H); 1,01 (с, 3H); 1,03 (д, J=7,1 Гц, 3H); 1,33 (дд, J=2,3 и 14,5 Гц, 1H); 1,56 (дд, J=10,1 и 14,5 Гц, 1H); 1,82 (м, 1H); 2,27 (м, 1H); 2,64 (м, 2H); 2,88 (дд, J=2,6 и 13,5 Гц, 1H); 2,92 (дд, J=2,2 и 7,3 Гц, 1H); 2,96 (дд, J=4,0 и 11,2 Гц, 1H); 3,19 (дд, J=4,3 и 10,9 Гц, 1H); 3,41 (м, 2H); 3,74 (с, 2H); 3,81 (с, 3H); 3,88 (д, J=2,2 Гц, 1H); 4,18 (м, 1H); 4,47 (тд, J=2,1 и 9,4 Гц, 1H); 4,91 (дд, J=4,2 и 6,2 Гц, 1H); 5,08 (м, 1H); 5,76 (дд, J=2,3 и 15,5 Гц, 1H); 6,40 (ддд, J=3,7, 11,5 и 15,5 Гц, 1H); 7,05 (д, J=8,8 Гц, 1H); 7,11 (м, 1H); 7,14 (дд, J=2,4 и 8,8 Гц, 1H); 7,22 (д, J=8,3 Гц, 2H); 7,25 (д, J=2,4 Гц, 1H); 7,35 (д, J=8,3 Гц, 2H); 8,08 (д, J=9,4 Гц, 1H); 8,31 (д, J=8,0 Гц, 1H). ЖХМС (A5): ES m/z=725 [М-Н]^-; m/z=727 [M+H]⁺; t_R=0,79 мин.

Фармакологические результаты

Соединения изобретения подвергали фармакологическим исследованиям для определения их противоопухолевого действия. ADC формулы (III) также оценивали с точки зрения стабильности в плазме.

В целях иллюстрации также были исследованы два конъюгата, ADC1 и ADC2, приведенные ниже, полученные из WO 2011/001052.

- 142 035625

Оценка ингибирования пролиферации клеточных линий HCT116 и MDA-MB-231 с помощью соединений криптофицина формулы (I).

Клетки HCT116 и MDA-MB-231 в фазе их экспоненциального роста трипсинизировали и ресуспендировали в их соответствующей культуральной среде (DMEM/F12 Gibco #21331, 10% ФБС Gibco #10500-056, 2 нМ глутамин Gibco #25030 для клеток MDA-MB-231; DMEM Gibco #11960, 10% ФБС Gibco #10500-056, 2 мМ глутамина Gibco #25030 для клеток HCT116). Клеточную суспензию высевали в 96луночные культуральные планшеты Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) в полную культуральную среду, содержащую сыворотку с плотностью 5000 клеток/лунка. После инкубирования в течение 4 ч последовательные разведения соединений криптофицина добавляли в лунки при концентрациях, снижающихся от 10^-7 до 10^-12 М (в трех повторностях для каждой концентрации). Клетки культивировали при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2, в присутствии соединений криптофицина в течение 3 д. На 4-й день в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора ^-тимидина (0,1 мкКи/лунка, Perkin Elmer #NEC56825000). Включение ^-тимидина измеряли через 96 ч после начала эксперимента с помощью счетчика микробета-радиоактивности (Perkin Elmer). Данные были выражены в виде процента выживаемости с помощью определения соотношения между уменьшенным количеством, полученным с клетками, обработанными соединением криптофицина, и количеством, полученным с клетками контрольных лунок (обработанных только культуральной средой).

Ингибирующая активность представлена концентрацией, которая ингибирует 50% активности.

Таблица II

	Структурный комментарий¹	1С₅₀ (пМ) НСТ116	1С₅₀ (пМ) MDA-MD-231
С52	β-эпоксид	76	90
Пр.1	β-эпоксид	163	250
Пр. 4	β-эпоксид	51	82
Пр. 8	α/β-эпоксид 3:7	518	564
Пр. 11	β-эпоксид	не иссл.	102
Пр. 15	α/β-эпоксид 35:65	не иссл.	511
Пр. 16	α/β-эпоксид 4:6	не иссл.	2815
Пр. 17	α/β-эпоксид 5:5	не иссл.	856
Пр. 18	β-эпоксид	179	228
Пр. 21	α/β-эпоксид 3:7	не иссл.	456
Пр. 32	β-эпоксид	не иссл.	1777

Соединения криптофицина формулы (I) исследовали или в виде чистых β-эпоксидов, или в виде смеси α- и β-эпоксидов, как указано в колонке, озаглавленной структурный комментарий. Из литературы известно, что β-эпоксиды обычно являются в 50-100 раз более эффективными, чем α-эпоксиды (см., например, Al-Awar R.S., et al., J. Med. Chem 2003, 46, 2985-3007).

Было обнаружено, что соединения криптофицина формулы (I) ингибируют пролиферацию клеточных линий HCT116 и MDA-MB-231 с IC₅₀ в диапазоне от 50 пМ до 2,815 нМ.

Оценка ингибирования пролиферации клеточной линии MDA-MB-231 с помощью ADC формулы (III).

Клетки MDA-MB-231 в фазе их экспоненциального роста трипсинизировали и ресуспендировали в их культуральной среде (DMEM/F12 Gibco #21331, 10% ФБС Gibco #10500-056, 2 нМ глутамин Gibco #25030). Клеточную суспензию высевали в 96-луночные культуральные планшеты Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) в полную культуральную среду, содержащую сыворотку с плотностью 5000 клеток/лунка. После инкубирования в течение 4 ч последовательные разведения ADC добавляли в лунки при концентрациях, снижающихся от 10^-7 до 10^-12 М (в трех повторностях для каждой концентрации). Клетки культивировали при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂, в присутствии ADC в течение 3 д. На 4-й день в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора ^-тимидина (0,1 мкКи/лунка, Perkin Elmer #NEC56825000). Включение ^-тимидина измеряли через 96 ч после начала эксперимента с помощью

- 143 035625 счетчика микробета-радиоактивности (Perkin Elmer). Данные были выражены в виде процента выживаемости с помощью определения соотношения между уменьшенным количеством, полученным с клетками, обработанными ADC, и количеством, полученным с клетками контрольных лунок (обработанных только культуральной средой). В некоторых экспериментах голые антитела добавляли в лунки в концентрации 1 мкМ в начале эксперимента и ингибирование пролиферации измеряли, как описано ранее.

Таблица III

Было обнаружено, что ADC криптофицина формулы (III), также как ADC1 и ADC2 ингибируют пролиферацию клеточной линии MDA-MB-231 с IC50 в диапазоне от 20 до 130 пМ и коэффициент селективности только ADC в сравнении с ADC + голое антитело между 185 и 500.

Определение МПД ADC формулы (III) после однократного в/в введения у мышей SCID.

МПД определяли как максимальную дозу, которая не вызывает 15% потери массы тела в течение 3 последующих дней для отдельной мыши, или 20% потери массы тела в течение 1 дня, или смертность. Ее оценивали после однократной внутривенной (в/в) болюсной инъекции у 3 самок мышей SCID и в течение 28 дней после обработки.

ТаблицаIV

МПД (мг/кг)

Пр. 3	20
Пр. 7	30
Пр. 10	40
Пр. 14	>50
Пр. 20	20
Пр. 23	>40

ADC криптофицина формулы (III) продемонстрировало МПД у мышей SCID в диапазоне от 20 до >50 мг/кг.

Оценка противоопухолевой активности in vivo ADC формулы (III) в отношении MDA-MB-231 у мышей SCID после однократного в/в введения.

Противоопухолевую активность in vivo оценивали при 3 концентрациях доз в отношении измеряемых ксенотрансплантатов MDA-MB-231 груди, имплантированных п/к у самок мышей SCID. Контрольные группы оставались необработанными. Конъюгаты вводили с помощью однократной в/в болюсной инъекции, день лечения был указан на каждом графике стрелкой (▼).

Для оценки противоопухолевой активности конъюгатов животных взвешивали два раза в неделю и опухоли измеряли два раза в неделю циркулем. Вес тела животных включал вес опухоли. Объем опухоли рассчитывали по формуле масса (мм³)=[длина (мм)хширина (мм)2]/2. Первичными конечными точками эффективности являлись ΔΤ/AC, процентная медианная регрессия, частичная и полная регрессии (PR и CR). Изменения объема опухоли для каждой обработанной (T) и контрольной (C) рассчитывали для каждой опухоли путем вычитания объема опухоли в день первой обработки (день постановки) из объема опухоли в указанный день наблюдения. Медиана ΔΤ была рассчитана для группы, подвергавшейся обработке, и медиана ΔC была рассчитана для контрольной группы. Затем вычисляли соотношение ΔT/ΔС и

- 144 035625 выражали в процентах ΔT/ΔC=(дельта T/дельта C)x100.

Процент регрессии опухоли определяли как % уменьшения объема опухоли в группе, подвергавшейся обработке, в определенный день наблюдения (t) по сравнению с ее объемом в первый день первой обработки (t0). В определенный момент времени и для каждого животного рассчитывали % регрессии.

Затем рассчитывали медиану % регрессии для группы.

% регрессии (при t) = ((объем₁₀-объем₁/объем₁₀)х100.

Регрессии определяли как частичные (PR), если объем опухоли уменьшался до 50% от объема опухоли в начале обработки, и полные (CR), когда объем опухоли не мог быть измерен (0 мм³). Выживших без опухоли (TFS) определяли как животных с необнаруживаемыми опухолями в конце исследования (>100 дней после последней обработки).

Оценка противоопухолевой активности in vivo пр. 3 в отношении MDA-MB-231 у мышей SCID после однократного в/в введения.

Таблица V

Доза (мг/кг)	Медиана Δτ/Лс в % (день)	Медиана % регрессии	Регрессии
PR	CR	TFS
-	-	-	-	-	-
2,5	<0 (д53)	90%	4/6	3/6	0/6
1,25	18 (д49)	-	0/6	0/6	0/6
2,5	<0 (д53)	100%	6/6	5/6	0/6
1,25	9 (Д53)	-	2/6	0/6	0/6
0, 625	44 (д42)	-	0/6	0/6	0/6

Оценка противоопухолевой активности in vivo пр. 7 в отношении MDA-MB-231 у мышей SCID после однократного в/в введения.

Таблица V

	Доза (мг/кг)	Медиана Δτ/Лс в % (день)	Медиана % регрессии	Регрессии
PR	CR	TFS
Контроль	-	-	-	-	-	-
ADC2	2,5	<0 (д53)	90%	4/6	3/6	0/6
	1,25	18 (д49)	-	0/6	0/6	0/6
Пр. 7	2,5	<0 (д53)	100%	6/6	6/6	1/6
	1,25	<0 (д53)	64%	5/6	1/6	0/6
	0, 625	42 (д42)	-	0/6	0/6	0/6

Оценка противоопухолевой активности in vivo пр. 10 в отношении MDA-MB-231 у мышей SCID после однократного в/в введения.

Таблица VI

	Доза (мг/кг)	Медиана Δτ/Лс в % (день)	Медиана % регрессии	Регрессии
PR	CR	TFS
Контроль	-	-	-	-	-	-
ADC2	2,5	<0 (д42)	14%	0/6	0/6	0/6
	1,25	6 (д42)	-	0/6	0/6	0/6
Пр. 10	2,5	<0 (д59)	95%	6/6	3/6	0/6
	1,25	<0 (д46)	32%	0/6	0/6	0/6
	0, 625	16 (д42)	-	0/6	0/6	0/6

- 145 035625

Оценка противоопухолевой активности in vivo пр. 14 в отношении MDA-MB-231 у мышей SCID после однократного в/в введения.

__________________________________________________________ Таблица VII

	Доза (мг/кг)	Медиана Лт/Лс в % (Д34)	Медиана % регрессии	Регрессии
PR	CR	TFS
Контроль	-	-	-	-	-	-
ADC2	2,5	21	-	0/6	0/6	0/6
	1,25	48	-	0/6	0/6	0/6
Пр. 14	5	<0	100%	6/6	6/6	1/6
	2,5	<0	11%	1/6	0/6	0/6
	1,25	39	-	0/6	0/6	0/6

Оценка противоопухолевой активности in vivo пр. 20 в отношении MDA-MB-231 у мышей SCID после однократного в/в введения.

Таблица VIII

	Доза (мг/кг)	Медиана Δτ/Лс в % (день 40)	Медиана % регрессии	Регрессии
PR	CR	TFS
Контроль	-	-	-	-	-	-
ADC2	2,5	<0	49%	4/6	0/6	0/6
	1,25	14	-	0/6	0/6	0/6
Пр. 20	5	<0	100%	6/6	6/6	6/6
	2,5	<0	100%	6/6	4/6	1/6
	1,25	<0	3%	3/6	1/6	0/6

Оценка противоопухолевой активности in vivo пр. 23 в отношении MDA-MB-231 у мышей SCID после однократного в/в введения.

Таблица VIII

	Доза (мг/кг)	Медиана Δτ/Лс в % (день 40)	Медиана % регрессии	Регрессии
PR	CR	TFS
Контроль	-	-	-	-	-	-
ADC2	2,5	<0	49%	4/6	0/6	0/6
	1,25	14	-	0/6	0/6	0/6
Пр. 23	5	<0	81%	6/6	3/6	0/6
	2,5	16	-	1/6	0/6	0/6
	1,25	36	-	0/6	0/6	0/6

Данные результаты показали, что все исследованные примеры изобретения, также как ADC2 проявляли противоопухолевую активность при дозах в диапазоне от 0,625 до 5 мг/кг.

Определение ФК-параметров пр. 3 и пр. 7 после однократного в/в введения у мышей SCID (5 мг/кг).

Фармакокинетику in vivo ADC и общего антитела оценивали у самок мышей SCID после введения конъюгата с помощью однократной в/в болюсной инъекции. Самок мышей SCID (5-6 недель, масса в среднем 20-25 г) помещали в стерильную комнату в асептических условиях в ламинарный бокс и кормили неограниченно. ADC вводили (несерийный дизайн, n=3/время выборки) в виде в/в болюса при одной величине дозы (10 мл/кг). Для каждого животного и в каждый выбранный момент времени (т.е. 0,083, 0,25, 24, 72, 96, 168, 240, 336 ч) 600 мкл крови собирали через пункцию сердца и затем образцы крови центрифугировали (15 мин при 4°С и 3500 об/мин). Количественное определение ADC и общего антитела в образцах плазмы проводили с использованием иммуноанализов. Концентрация в плазме в зависимости от временных профилей и ФК-параметры конъюгата и общего антитела у мышей были охарактери- 146 035625 зованы с использованием некомпартментного анализа (Phoenix, WinNonLin версия 6.3) и показаны на фиг. 15 и 16. Площадь под кривой концентрация-время AUC (мкг.день/мл) оценивали с помощью правила трапеций. Концентрация при t=0 C₀ (мкг/мл), клиренс CL (л/(день.кг) и терминальный период полувыведения t₁/₂ (день) были получены и рассчитаны по кривой.

Табл ица IX	Анализир уемые вещества	Со	АПС_посл	tnocn	AUC	CL	v_ss	tl/2z
	(мкг/м л)	(мкг.де нь/мл)	(день)	(мкг.день/ мл)	(л/(день. кг) )	(л/кг )	(день )
Пр. 3	ADC	62,8	191	14	217	0, 023	0,14	4,8
	общее	74,9	455	14	791^а	0,0063^а	0,10^а	11^а
Пр. 7	ADC	81,8	235	14	266	0, 019	0,12	4,8
	общее	77,4	368	14	741^ь	0,0067^ь	0,14^ь	16^ь

a: информативные данные только как AUC_ext>>30% (т.е. 42%);

b: информативные данные только как AUC_ext>>30% (т.е. 50%).

Оценка с помощью МСВР плазменной стабильности ADC криптофицина формулы (III) после однократного в/в введения у мышей SCID при 5 мг/кг.

Образцы плазмы из ФК-исследования также анализировали с помощью ЖХ-МСВР. Хроматографический анализ проводили на колонке Waters Acquity I Class и Waters Mass Prep Micro Desalting 20 мкм (2,1x5 мм) при 80°С с градиентным элюированием (A) вода+0,1% муравьиной кислоты/(В) CH₃CN+0,l% муравьиной кислоты, описанным ниже. ._______________________________________

Время (мин)	%В	Поток (мл/мин)
0,00	5	0,5
0,50	5	0,5
0,51	5	0,2
2,00	90	0,2
2,10	5	0,5
2,70	90	0,5
2,80	5	0,5
3,40	90	0,5
3,50	5	0,5
4,00	5	0,5

Масс-спектрометрию проводили на устройстве Waters QTOF Synapt G2-S с ионизацией электрораспылением в положительном режиме (ES+). Для масс-спектров проводили развертку с помощью программного обеспечения Waters Biopharmalynx. Спектры МСВР были получены для всех исследуемых примеров и показаны на фиг. 20-25.

Данные результаты показали, что все исследуемые примеры изобретения не проявили метаболизирования, наблюдаемого с эталонными ADC, ADC1 и ADC2.

Поэтому очевидно, что соединения изобретения обладают противоопухолевой активностью и что конъюгаты изобретения демонстрируют улучшенную стабильность в плазме мышей.

Соответственно, в другом своем аспекте изобретение также относится к применению соединений криптофицина формулы (I) или конъюгатов формулы (III) в качестве противоопухолевых средств.

Настоящее изобретение в соответствии с другим своим аспектом также обеспечивает лекарственные средства, которые содержат конъюгат формулы (III).

Данные лекарственные средства применяются терапевтически, в частности при лечении рака.

В соответствии с другим своим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве действующего начала конъюгат формулы (III) в соответствии с изобретением. Данные фармацевтические композиции содержат эффективную дозу по меньшей мере одного конъюгата формулы (III) в соответствии с изобретением и также по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.

Указанные эксципиенты выбирают в соответствии с фармацевтической формой и желаемым способом введения из стандартных эксципиентов, которые известны специалисту в данной области техники.

Настоящее изобретение в соответствии с другим своим аспектом также обеспечивает способ лече- 147 035625 ния указанных выше патологий, который включает введение пациенту эффективной дозы конъюгата формулы (III) в соответствии с изобретением.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение криптофицина формулы (I)

в которой

R₁ представляет собой (Аралкильную группу;

R2 представляет собой атом водорода или (Аралкильную группу;

R3 представляет собой атом водорода;

или, альтернативно, R₂ и R₃ образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, (АРциклоалкильную группу;

R4 представляет собой (Аралкильную группу или группу (АРалкил-OH;

R5 представляет собой (Аралкильную группу;

R6 представляет собой атом водорода;

R7 представляет собой (Аралкильную группу;

R8 представляет собой атом водорода;

R₉ представляет собой один или два заместителя фенильного ядра, выбранных независимо друг от друга из атома водорода, (АРалкокси или атома галогена;

R₁₀ представляет собой четыре заместителя фенильного ядра, которые пердставляют собой атом водорода;

W представляет собой (АРалкил^ЩА), (АРалкил-OH или (АРалкил-И₃;

R11 представляет собой атом водорода.
2. Соединение криптофицина формулы (I) по п.1, имеющее следующую структуру:
3. Соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1 или 2, отличающееся тем, что R1 представляет собой метильную группу.
4. Соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что каждый из R2 и R3 представляет собой атом водорода, или один из R2 и R3 представляет собой метильную группу и другой представляет собой атом водорода, или

R₂ и R₃ образуют вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, циклопропильную группу.
5. Соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что каждый из R₄ и R₅ представляет собой метильную группу.
6. Соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что R₉ представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора.
7. Соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что каждый из R2 и R3 представляет собой атом водорода; и

R₉ представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора.
8. Соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что

R2 и R3 представляет собой (АРалкил и другой представляет собой атом водорода; и

R9 представляет собой два заместителя, выбранных из метоксигруппы и атома хлора.
9. Соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что W представляет собой группу CH₂-NH₂ или CH₂-OH.
10. Соединения криптофицина формулы (I) по п.1, которые выбраны из следующего списка:

- 148 035625
11. Соединение формулы (II)

в которой

Ri, R2, R₃, R4, R5, R₆, R7, R8, R9 и R₁₀ представляют собой, как определено по пп.1-8;

Y представляет собой (СгСДалкил-^п, (С₁-С₆)алкил-О, C(=O)O, C(=O)NH или (С₁-С₆)алкилтриазольную группу;

L представляет собой линкер;

RCG1 представляет собой реакционноспособную химическую группу, присутствующую на конце

- 149 035625 линкера, где L имеет формулу (IV)

О

TL2 >AA)w-L1t _(IV)в которой

L1 представляет собой одинарную связь или группу NR₁₆(гетеро)арил-CR₁₅R₁₄-O-C(=O), если Y = (С1-С₆)алкил-^Хц);

группу NR₁₈-(C₂-C₆)алкил-NR₁₇-C(=O) или группу NR₁₆(гетеро)арил-CR_l5R₁₄-O-C(=O)NR₁₈-(C₂Ο₆)3λκηλ-ΝΚι₇-Ο(=Ο), если Y = (С1-С₆)алкил-О- или (C₁-C₆)алкил-S;

группу NR₁₆(гетеро)арил-CR₁₅R₁₄, если Y = C(=O)O, C(=O)NH, (С₁-С₆)алкил-С(=О)О или (С1С%К'1кил-С( O)NI I;

гетероарильная группа состоит из арильной группы, содержащей от 2 до 10 атомов углерода и от 1 до 5 гетероатомов, таких как азот, кислород или сера, включенных в кольцо и связанных с атомами углерода, образующими кольцо; арильная группа состоит из циклической ароматической группы, содержащей от 5 до 10 атомов углерода;

R11, R₁₄, Ri₅, R₁₆, Ri₇ и R_i8 представляют собой независимо друг от друга атом водорода или (С1С₆)алкильную группу;

(AA)_w представляет собой последовательность w аминокислот AA, связанных вместе через пептидные связи;

w представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 12;

L2 представляет собой одинарную связь, или (С1-С₆)алкильную группу, или группу (С1-С₆)алкил(OCH₂CH₂)i, или (С1-С₆)алкил-(ОСН₂СН₂)гО(С1-С₆)алкильную группу, или (СН₂СН₂ОДС1-С₆)алкильную группу, или СН(БО₃Н)-(С1-С₆)алкильную группу, или группу (С1-С₆)алкил-СН(БО₃Н), или (С1-С₆)алкилциклогексильную группу, или NR₁₉-(C₁-C₆)алкильную группу, или NR₂₀-(CH₂CH₂O)_i(C₁-C₆)алкильную группу, или NR₂₁-арильную группу, или NR₂₁-гетероарильную группу, или (C₁-C₆)алкил-NR₂₂C(=O)-(C₁С₆)алкильную группу, или группу (C₁-C₆)алкил-NR₂₂C(=O)-(C₁-C₆)алкил-(OCH₂CH₂)_i; гетероарильная группа состоит из арильной группы, содержащей от 2 до 10 атомов углерода и от 1 до 5 гетероатомов, таких как азот, кислород или сера, включенных в кольцо и связанных с атомами углерода, образующими кольцо; арильная группа состоит из циклической ароматической группы, содержащей от 5 до 10 атомов углерода;

R₁₉, R₂₀, R₂i и R₂₂ представляют собой независимо друг от друга атом водорода или (С1С₆)алкильную группу;

i представляет собой целое число от 1 до 50;

AA обозначает природную или неприродную аминокислоту конфигурации D или L, выбранную из аланина (Ala), β-аланина, γ-аминомасляной кислоты, 2-амино-2-циклогексилуксусной кислоты, 2-амино2-фенилуксусной кислоты, аргинина (Arg), аспарагина (Asn), аспарагиновой кислоты (Asp), цитруллина (Cit), цистеина (Cys), а,а-диметил^-аминомасляной кислоты, в,в-диметил^-аминомасляной кислоты, глутамина (Gln), глутаминовой кислоты (Glu), глицина (Gly), гистидина (Kis), изолейцина (Ile), лейцина (Leu), лизина (Lys), ε-ацетиллизина (AcLys), метионина (Met) орнитина (Orn), фенилаланина (Phe), пролина (Pro), серина (Ser), треонина (Thr), триптофана (Trp), тирозина (Tyr), валина (Val);

RCG1 выбран из группы -C(=O)-Z_aR_a, для которой Z_a представляет собой одинарную связь, O или NH и Ra представляет собой Н или (С1-С₆)алкильную, (С₃-С₇)циклоалкильную, (С₆-С1₀)арильную, (С₅-С1₀)гетероарильную или (С₃-С₇)гетероциклоалкильную группу или сукцинимидильную группу;

одной из следующих реакционноспособных групп: малеимидо ⁰ группа; галогенацетамидо ^13 . N . ·._п .

Ά j ВГили I

О группа с R13, представляющим атом водорода или (С1-С₆)алкильную группу; -Cl; -N₃; -ОН; -БН; -КН₂; о /=\

-C=C'I I, ' группа или группа О-(С_1-С₆)алкилгидроксиламина;

гетероарильная группа состоит из арильной группы, содержащей от 1 до 5 гетероатомов, таких как азот, кислород или сера, включенных в кольцо и связанных с атомами углерода, образующими кольцо;

гетероциклоалкильная группа состоит из циклоалкильной группы, содержащей от 1 до 3 гетероатомов, таких как азот, кислород или сера, включенных в кольцо и связанных с атомами углерода, образующими кольцо.
12. Соединение формулы (II) по п.11, имеющее следующую структуру:

- 150 035625
13. Соединение формулы (II) по любому из пп.11 или 12, отличающееся тем, что Y представляет собой (Q-C^k^-NRh, предпочтительно Y представляет собой CH2-NH.
14. Соединение формулы (II) по п.11, отличающееся тем, что последовательность AA представляет собой аланин (Ala), цитруллин (Cit), глутамин (Gln), глицин (Gly), ε-ацетиллизин (AcLys), валин (Val).
15. Соединение формулы (II) по любому из пп.11-14, отличающееся тем, что L2 представляет собой (С-Оалкильную группу или группу (Q-C^k^^OCHYHY или СН(SO₃H)-(C₁-C₆)алкильную группу.
16. Соединение формулы (II) по п.11, которое выбрано из следующего списка:
17. Конъюгат формулы (III)

- 151 035625

в которой

R1, R2, R3, R4, R₅, Кб, R₇, R₈, R9 и R₁₀ представляют собой, как определено по пп.1-8;

Y и L представляют собой, как определено по пп.11-15;

G получают взаимодействием между RCG1, реакционноспособной химической группой, присутствующей на конце линкера, и RCG2, ортогональной реакционноспособной химической группой, присутствующей на (Ab);

Ab представляет собой антитело; где

G выбран из
18. Конъюгат формулы (III) по п.17, имеющий следующую структуру:
19. Конъюгат формулы (III) по любому из пп.17 или 18, отличающийся тем, что RCG2 выбран из ε-аминогрупп лизинов, находящихся на боковых цепях остатков лизина, которые присутствуют на поверхности антитела;

α-аминогрупп N-концевых аминокислот тяжелых и легких цепей антитела;

групп сахаридов шарнирной области;

тиолов цистеинов, образованных путем восстановления внутрицепочечных дисульфидных связей, или тиолов сконструированных цистеинов;

амидных групп, находящихся на боковых цепях некоторых остатков глутамина, которые присутствуют на поверхности антитела;

альдегидных групп, введенных с использованием формилглицинобразующего фермента.
20. Конъюгат формулы (III) по любому из пп.17 или 18, отличающийся тем, что когда RCG1 представляет собой N-гидроксисукцинимидиловый эфир, RCG2 представляет собой группу -NH2;

когда RCG1 представляет собой малеимидо или галогенацетамидо функциональную группу или группу -Cl, RCG2 представляет собой группу -SH;

когда RCG1 представляет собой группу -N3, RCG2 представляет собой группу -CACH или активированную CY;

когда RCG1 представляет собой группу -OH или -NH2, RCG2 представляет собой карбоновую кислоту или амидную функциональную группу;

когда RCG1 представляет собой группу -SH, RCG2 представляет собой малеимидо или галогенацетамидо функциональную группу;

когда RCG1 представляет собой функциональную группу -CACH или активированную CY, RCG2 представляет собой группу -N₃;

когда RCG1 представляет собой -O-алкилгидроксиламинную функциональную группу или реакционный субстрат Пикте-Шпенглера, RCG2 представляет собой альдегидную или кетонную функциональную группу.
21. Способ получения соединения криптофицина формулы (I), включающий стадию

- 152 035625

в которой стадия (i) представляет собой пептидное сочетание между фрагментами AD3 и альтернативным BC в присутствии реагентов сочетания;

стадия (ii) представляет собой макроциклизацию посредством реакции метатезиса с замыканием цикла в присутствии катализатора;

стадия (iii) представляет собой снятие защитной группы п-метоксибензилового эфира в кислых условиях;

стадия (iv) представляет собой окисление спирта с использованием окислителя;

стадия (v) представляет собой введение эпоксида путем асимметрической реакции КориЧайковского с использованием соответственно замещенного полученного на основе изотиоцинеола хирального сульфония в присутствии основания;

стадия (vi) представляет собой восстановление азидогруппы.
22. Способ получения конъюгата формулы (III), включающий стадии:

(i) взаимодействие необязательно буферизованного водного раствора антитела, необязательно модифицированного с помощью модифицирующего агента, и раствора соединения формулы (II), как определено из пп.11-16, при этом химическая группа RCG1 соединения формулы (II) является реакционноспособной по отношению к химическим группам RCG2, присутствующим на антителе, в частности к аминогруппам, присутствующим на антителах, при этом указанные химические группы RCG2 были введены, когда это необходимо, с помощью модифицирующего агента, чтобы присоединить соединение формулы (II) к антителу с помощью образования ковалентной связи;

(ii) и затем необязательное отделение конъюгата, образованного на стадии (i), от соединения формулы (II), и/или от непрореагировавшего антитела, и/или от любых образовавшихся агрегатов.
23. Фармацевтическая композиция для лечения рака, отличающаяся тем, что она содержит конъюгат формулы (III) по любому из пп.17-20 и один фармацевтически приемлемый эксципиент.
24. Применение соединения криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-10 в качестве противоопухолевого средства.
25. Применение конъюгата формулы (III) по любому из пп.17-20 в качестве противоопухолевого средства.
26. Лекарственное средство для лечения рака, отличающееся тем, что оно содержит соединение криптофицина формулы (I) по любому из пп.1-10.
27. Лекарственное средство для лечения рака, отличающееся тем, что оно содержит конъюгат формулы (III) по любому из пп.17-20.