WO2011001052A1 - Nouveaux conjugues, leur preparation et leur application en therapeutique - Google Patents

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WO2011001052A1
WO2011001052A1 PCT/FR2010/050986 FR2010050986W WO2011001052A1 WO 2011001052 A1 WO2011001052 A1 WO 2011001052A1 FR 2010050986 W FR2010050986 W FR 2010050986W WO 2011001052 A1 WO2011001052 A1 WO 2011001052A1
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gcr
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alkyl
cri
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PCT/FR2010/050986
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Hervé Bouchard
Marie-Priscille Brun
Alain Commerçon
Jidong Zhang
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Sanofi-Aventis
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    • C07D273/08—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D261/00 - C07D271/00 having two nitrogen atoms and more than one oxygen atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
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    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D245/00—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D245/04—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D245/06—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring

Definitions

  • the present invention relates to conjugates of cryptophycins, the compositions containing them and their therapeutic application, especially as anticancer agents.
  • the invention also relates to the process for preparing these compounds as well as to the cryptophycin derivatives themselves. [Technical area]
  • Cryptophycins are secondary metabolites belonging to the class of depsipeptide macrocycles produced by cyanobacteria of the genus Nostoc. Their name refers to the fact that they are highly cytotoxic to cryptococcal yeasts.
  • the first representative of this class of molecules, cryptophycin-1 (C-1) was isolated in 1990 from cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (see Ei ⁇ ler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789 ).
  • the structure, the general formula and the numbering of the carbon atoms of these compounds, as described in WO 98/08505, are given below:
  • Cryptophycins C-1 and C-52 which are characterized by an epoxide function shown below, have anticancer properties.
  • Phase II clinical trials in lung cancer were conducted with C-52 (LY 355073): see Edelman MJ. , et al., Lung Cancer 2003,
  • Cryptophycin C-55 a C-52 prodrug, is characterized by a chlorohydrin function instead of the epoxide function (Bionpally R.R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33).
  • C-55 has been very active but is not stable in solution.
  • Chlorhydrin glycinate derivatives such as the compound C-55 Gly have also been described to improve their stability.
  • Conjugate chemistry has been known for many years and has been applied to several cytotoxic families, for example maytansinoids (WO 04103272), taxanes (WO 06061258), tomaymycins (WO 09016516), leptomycins (WO 07144709), CC-1065 and its analogs (WO 2007102069); see also about conjugates, Monneret C, et al., Cancer Bulletin. 2000, 87 (1 1), 829-38; Jamaicart A.D., et al., Nature Clinical Practice Oncology 2007, 4, 245-255. However, it has not been applied to cryptophycin derivatives conjugated to antibodies or other targeting agents.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to propose novel conjugates based on cryptophycin derivatives, as well as novel cryptophycin derivatives capable of being conjugated.
  • EP 0830136 and WO 98/08505 describe cryptophycin derivatives but do not describe cryptophycin conjugates.
  • WO 98/08505 discloses cryptophycin derivatives of formula
  • R 54 is H, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 1 ;
  • ⁇ JaJkyJeORiQQ, SR 63 ; R 55 and R 56 represent H, a (C 1 -C 6 ) alkyl group,
  • WO 08010101 discloses an anti-EphA2 monoclonal antibody and the corresponding conjugates comprising one or more molecules of a cytotoxic compound attached to the monoclonal antibody.
  • WO 08047242 discloses an anti-CD38 monoclonal antibody as well as the corresponding conjugates comprising one or more molecules of a cytotoxic compound attached to the monoclonal antibody.
  • the cytotoxic compound may be selected from maytansinoids, taxanes, tomaymycins, leptomycins, CC-1065 and its analogs.
  • WO 2009/126934 discloses anti-CD70 antibodies and their conjugates with cytotoxic compounds; cryptophycin is cited among the cytotoxics.
  • WO 2009/134976 discloses conjugates with an optimized substitution rate to deliver the required amount of cytotoxic to the cell; cryptophycin is cited among the cytotoxics.
  • WO 2005/116255 discloses aptamer conjugates and a cytotoxic which may be a cryptophycin (see [0037] and Table 2), the linker may comprise a PEG chain ([0038]). More particularly, Cryptophycin Cryp-NH 2 is described:
  • WO 2006/096754 also describes aptamer conjugates and a cytotoxic which can also be a cryptophycin.
  • WO 2009/002993 discloses cytotoxic conjugates of formula BLA comprising hydrophilic linkers, for example the linker of formula:
  • the cytotoxic may be a cryptophycin (page 46) but without specifying the point of attachment of the linker.
  • An example of a conjugate is EC0262:
  • Conjugate a cell targeting agent to which at least one molecule of a cytotoxic compound is covalently attached;
  • Cell targeting agent (or "cell binding agent” in English): a molecule having an affinity for a biological target: it may be for example a ligand, a protein, an antibody, more particularly monoclonal, a protein or antibody fragment, a peptide, an oligonucleotide, an oligosaccharide.
  • the targeting agent has the function of directing the biologically active compound as a cytotoxic agent to the biological target.
  • the targeting agent is not an aptamer;
  • biological target an antigen (or group of antigens) preferentially localized on the surface of the cancerous cells or stromal cells associated with this tumor; such antigens may be, for example, a growth factor receptor, a mutant tumor suppressor or "tumor suppressor” product, a molecule related to angiogenesis, an adhesion molecule;
  • linker a set of atoms to covalently attach a cytotoxic compound to the targeting agent
  • Alkyl group a saturated aliphatic hydrocarbon group obtained by removing a hydrogen atom from an alkane.
  • the alkyl group can be linear or branched.
  • Cycloalkyl group a cyclic alkyl group comprising between 3 and 8 carbon atoms engaged in the cyclic structure.
  • cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl groups By way of examples, mention may be made of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl groups;
  • Heterocycloalkyl group a cycloalkyl group comprising at least one heteroatom (O, S, N) engaged in the ring and connected to the carbon atoms forming the ring;
  • Alkoxy group an -O-alkyl group, wherein the alkyl group is as defined above;
  • Alkanoyloxy group a group -O-CO-alkyl, where the alkyl group is as defined above;
  • Alkylene group a saturated divalent group of the formula -C n H 2n -, obtained by removing two hydrogen atoms from an alkane.
  • methylene groups -CH 2 -
  • ethylene -CH 2 CH 2 -
  • propylene -CH 2 CH 2 CH 2 -
  • butylene -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -
  • AA 'hexylene (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -) or the following branched groups n , / x ;
  • the alkylene group is of the formula - (CH 2 ) n -, n represents an integer;
  • the terminals are included (eg a range of "n from 1 to 6" or “from 1 to 6” includes terminals 1 and 6).
  • AcOEt ethyl acetate
  • ALK (C 1 -C 12 ) alkylene group, more particularly (C 1 -C ⁇ ) alkylene, more particularly of the form - (CH 2 ) n - n being an integer of 1 to 12, preferably 1 to 6
  • TLC thin layer chromatography
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine-ethanesulfonic acid
  • mCPBA m-chloroperbenzoic acid
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • NMP N-methylpyrrolidinone
  • PA atmospheric pressure
  • PABAC "para-aminobenzylic alcohol carbonate"
  • PR reduced pressure
  • SEC chromatography steric exclusion
  • SPE solid phase extraction
  • TA room temperature
  • TBDMS tert-butyldimethylsilyl
  • TCEP tris- (2-carboxyethyl) -phosphine hydrochloride
  • TEA triethylamine
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TIPS triisopropylsilyl
  • THF tetrahydrofuran
  • t R retention time.
  • the invention relates to a targeting agent to which at least one cryptophycin derivative of formula (I) is attached:
  • R 1 represents a halogen atom and R 2 represents an -OH group, an acyl group derived from an amino acid AA or a (C 1 -C 4 ) alkanoyloxy group;
  • R 1 and R 2 together form an epoxy unit
  • AA means a natural or unnatural amino acid
  • R3 represents a group (C 1 -C ⁇ alkyl
  • R ⁇ and R 7 represent independently of each other H or a group (C 1 -C ⁇ alkyl);
  • R 1 0 represents at least one substituent of the phenyl ring selected from: H, -OH, (C 1 -C 4) alkoxy, a halogen atom or -NH 2, -NH (d-C6 ) alkyl or -N (Cr C 6 ) alkyl 2 ;
  • Rn represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H or a (Cr C 4 ) alkyl group;
  • the targeting agent and the cryptophycin derivative being covalently attached, the attachment being in the ortho (o), meta (m) or para (p) position of the phenyl ring bearing the CRi motif. positions ortho (o), meta (m) or para (p):
  • R 1 represents a halogen atom, more particularly Cl.
  • R 3 represents a group (Cr C ⁇ jalkyl, more particularly Me, Re and R 7 represent independently of each other H or a group (C 1 -C ⁇ ) alkyl, more particularly they represent independently of one another H or a group Me.
  • Rs and R 9 represent independently of each other H or a group (Cr C ⁇ alkyl), more particularly R 8 represents H and R 9 represents isobutyl.
  • Rio represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H, an OH group, (Cr C 4 ) alkoxy, a halogen atom. It can also be a group -NH 2 , -NH (C 1 -C 6 ) alkyl or - N (C 1 -C 6 ) alkyl 2 such as for example -NH 2 or -NMe 2 , preferably in position 3 or 4 on the phenyl nucleus. More particularly, the phenyl ring comprises two substituents at the 3- and 4-positions on the phenyl ring. Preferably it is 3-Cl and 4-methoxy. Rn represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H or a (C 1 -C 4 ) alkyl group; more particularly H.
  • each substituent R 1 to R n may also adopt one of the spatial configurations (for example R or S or else Z or E) as described in the examples.
  • AA represents a natural or unnatural amino acid. It can be an amino acid ⁇ , ⁇ or ⁇ . Mention may in particular be made of the following amino acids: alanine (Ala), ⁇ -alanine, 2-amino-2-cyclohexylacetic acid, 2-amino-2-phenylacetic acid, arginine (Arg), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys ), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), praline ( Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ , ⁇ -dimethyl ⁇ -aminobutyric acid,
  • Ri and R 2 may also together form an epoxy unit.
  • the attachment between the cryptophycin derivative and the targeting agent is carried out via a linker L positioned in the ortho (o), meta (m) or para (p) position of the phenyl ring bearing the CR-unit. i; thus, the conjugatable cryptophycin derivative has the formula (II):
  • (H) Attachment at the level of the targeting agent is at the other end of linker L at a reactive group present on the targeting agent.
  • L comprises at least one reactive chemical group (GCR1) with respect to a reactive chemical group (GCR2) present on the targeting agent.
  • GCR1 and GCR2 ensures the attachment of the compound of formula (II) to the targeting agent by formation of a covalent bond.
  • the cryptophycin derivative of formula (II) is capable of being conjugated to a targeting agent.
  • the cryptophycin derivatives of the present invention may exist in the form of bases or addition salts with acids, in particular pharmaceutically acceptable acids.
  • GCR1 As examples of GCR1, mention may be made of:
  • R 2 representing H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly Me; or l
  • the maleimido reactive group with R 2 representing H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly Me. More particularly, -SZ a may represent -SH or -SS (C 1 -C 6 ) alkyl, especially -SSMe, or -
  • Gl represents at least one electroinductive group such as -NO 2 or -HaI, especially -F. It may be for example
  • GCR1 may be chosen from one of those described in the examples.
  • GCR2 mention may be made of the ⁇ -amino groups of the lysines carried by the side chains of the lysine residues which are present on the surface of an antibody, the saccharide groups of the hinge region or thiols of cysteines by reduction of intra-chain disulfide bonds (Garnett M.C. et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216).
  • the modifying agent may be an NHS activated ester of formula in which R represents a (C 1 -C 6 ) alkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) cycloalkyl group, (C 3 - C 7 ) heterocycloalkyl and ALK represents a (C 1 -C 6) alkylene group, for example, N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) or N-succinimidyl pyridyldithiobutyrate (SPDB or N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic) to introduce dithiopyridyl GCR2 reactive groups (see Bourdon MA, et al., Biochem J.
  • SPDP N-succinimidyl pyridyldithiopropionate
  • SPDB N-succinimidyl pyrid
  • X 3 , X 4 , X 5 , Xe represent H or a group (C 1 -C 6 alkyl),
  • - Xi and X 2 represent -H, -CONX 8 Xg, -NO 2 , Xs and X 9 represents H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, - X 7 represents -S ⁇ 3 -M + or H or a quaternary ammonium group
  • a represents an integer ranging from 0 to 4 and b denotes an integer ranging from 0 to 2000, preferably from 1 to 200; a and b can take any value between 0 and 4 or between 0 and 2000, respectively.
  • succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate SMCC
  • SMCC succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • sulfo-SMCC 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane sulfosuccinimidyl) -1-carboxylate
  • N-succinimidyl 3-maleimido-propanoate such as N-succinimidyl 6- (3-maleimidopropionamido) hexanoate
  • b is an integer between 0 and 2000, preferably between 1 and 200 (b can take any value between 0 and 2000), such as 3- (2- ⁇ 2- [3-maleimido-propionylamino] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -N-succinimidylpropanoate or MS (PEG) 2 ; such as maleimidoethyl succinate and N-succinimidyl succinate;
  • modifying agent described in WO 90/06774 is of formula in which :
  • - HaI represents a halogen atom
  • - X 10 represents a halogen atom or COOXi 4, nitro, (C 1 -C 8) unsubstituted or halogenated alkyl, (C 1 -C 8) alkoxy unsubstituted or halogen, (C 2 -C 8) unsubstituted or halogenated alkenyl, (C 2 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkynyl, (C 3 -C 8 ) unsubstituted cycloalkyl, aryl unsubstituted or substituted with one to three substituents selected from amino, halogen, group (C 1 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkyl, (C 1 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkoxy;
  • each of Xn, X 12 , X 13 independently represents a hydrogen atom or may represent X 3 ;
  • X 10 and X 11 together form a (C 2 -C 5 ) alkylene ring, unsubstituted or substituted with one to five (C 1 -C 4 ) alkyl group (s);
  • X 14 is -H or a (C 1 -C 8 ) alkyl group.
  • HaI represents a chlorine or bromine atom.
  • SIA iodoacetate
  • SBA succinimidyl-N-bromoacetate
  • SBAP succinimidyl-3- (N-bromoacetamido) propionate
  • Figures 1 and 2 illustrate modification of an amino group of a targeting agent by SPDP or by the preferred iminothiolane above.
  • GCR1 represents -SH
  • reaction between GCR1 and GCR2 is a cleavable disulfide bond.
  • targeting agent of GCR2 groups of maleimido type ( ) or haloacetamido eg bromo- or iodoacetamido Reciprocally, can be introduced on the targeting agent
  • GCR2 thiol groups (-SH), e.g. with an iminothiolane, in the case where GCR1 represents I
  • GCR2 is a non-cleavable sulfide bond.
  • GCR1 is of type (iii) above
  • a suitable modifying agent or to introduce acid (s) non-natural amine (s) in order to introduce the appropriate GCR2 functions.
  • GCR2 can be a group -C ⁇ CH
  • GCR 2 can be a carboxylic acid function
  • GCR2 can be a group -SH.
  • the cryptophycin derivative may be represented by the formula (IIa) or (Nb) below:
  • the cryptophycin derivative may be, in series C-52 and C-1, one of the following D 1 -D 8 :
  • L is in the para position of the CR-i motif.
  • the function of the PL linker precursor is to introduce the L linker at the level of the cryptophycin derivative after reaction between the group G and a chemical function present on PL.
  • G can also represent the group 2 n ⁇ (that is, Y represents the group
  • the deprotection can be carried out by treatment with a palladium catalyst, for example Pd (PPh 3 ) 4 in the presence of a "scavenger" amine, for example morpholine; activation can be carried out with N-N'-disuccinimidyl carbonate in the presence of a base, for example DIPEA or with NHS in the presence of a coupling agent, for example DCC.
  • a palladium catalyst for example Pd (PPh 3 ) 4
  • a "scavenger" amine for example morpholine
  • activation can be carried out with N-N'-disuccinimidyl carbonate in the presence of a base, for example DIPEA or with NHS in the presence of a coupling agent, for example DCC.
  • Figure 1 These derivatives are obtained by reaction between a cryptophycin derivative having a linker L 'comprising an amino or thiol group and a modifying agent for introducing a maleimido or haloacetamido group, respectively.
  • Nucleophilic substitution between a PL linker precursor carrying an amino function -NH- (an amine salt may also be suitable) and G - (CH 2 ) n CI or - (CH 2 ) n OMs (see, for example, . Table II, 1-4 PL, PL 7a, PL 8- IO PL21-23): this reaction may be conducted in an aprotic polar solvent in the presence of a base, such as TEA or DIPEA. See ex.1, compound 7 or ex.15, compound 48;
  • the linker L can be chosen from one of the following:
  • G represents a group - (CH 2 ) n -;
  • n an integer from 1 to 6;
  • X represents a single bond or a group -CO-, -COO-, or -CONR 12- , the group CO being attached to G ';
  • Y represents -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-, -NR 12 CONR '12 -, - NR 12 COO-, or -S (0 q -, the atom O or the group NR 12 being attached to G ";
  • Y ' represents a group -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-, -NR 12 CONR' 12 -, -
  • R12, R'i2, R13, Ru, R15 and R 16, R 17 and R 18 independently of one another H or (C 1 -C ⁇ Jalkyle;
  • t, u and y represent integers ranging from 0 (case of the absent group) to 20 and such that t + u + y is greater than or equal to 1;
  • q represents an integer that may be 0, 1 or 2;
  • Q represents a single bond, a (C 1 -C -alko) alkylene group or a (OCH 2 CH 2 ) group, i being an integer ranging from 1 to 20, more preferably from 1 to 10, more particularly from 1 to at 8, or from 1 to 6, even more particularly from 2 to 5. i can take each of the values of these ranges, in particular worth 2, 3, 4 or 5.
  • the linker L may be chosen from one of those of formula (IV):
  • W represents an integer ranging from 1 to 12, preferably from 1 to 6;
  • N represents an integer ranging from 1 to 6;
  • R 12 represents H or a group (C 1 -C ⁇ alkyl);
  • R19, R20, R21, R22 represent independently of each other H, an atom
  • T attached to (CH 2 ) n represents NR 12 OR O;
  • V 1 represents O, S, NR 12 ;
  • V 2 represents CR 22 or N
  • V 3 , V 4 , V 5 are chosen independently of one another from CR 22 or N.
  • AA denotes a natural or non-natural amino acid, more particularly chosen from: alanine (Ala), ⁇ -alanine, 2-amino-2-cyclohexylacetic acid, 2-amino-2-phenylacetic acid, arginine (Arg), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ , ⁇ -dimethyl ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ , ⁇ -dimethyl ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ ,
  • sequence (AA) W has the formula: wherein R 23 represents a residue of one of the amino acids described above.
  • sequences are the following: Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val -Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu -Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Al-Leu-Ala-Leu.
  • linker precursors are those comprising the corresponding -OH units:
  • WO 2005/082023 (see especially pages 61-64) describes how to obtain certain linker precursors.
  • the preparations of the PL25 and PL26 linker precursors described hereinafter can also be used to obtain other similar linker precursors comprising a further sequence (AA) W.
  • the linker L may also be selected from one of those described in Table II or from the exemplified compounds. In all linkers of formulas, NR 12 or NR 12 more particularly represents NH or NMe.
  • Pi is prepared according to information from WO 98/08505, WO 00/23429 or WO 00/34252 and the following publications Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295; Salamonczyk G. M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 or J. Med. Cftem. 1999, 42 (14), 2588-2603 (incorporated herein by reference).
  • an acidic medium for example, concentrated perchloric acid may be used;
  • 4- (Triisopropylsiloxymethyl) benzyltriphenylphosphonium bromide is obtained from 1- (bromomethyl) -4- (triisopropylsiloxymethyl) benzene (CAS No. 934667-38-6), the preparation of which is prepared from 1,4-benzenedimethanol (CAS N No. 589-29-7, commercial product) is described by Potier R. G, et al., Organic Letters 2007, 9 (7), 1187-1190.
  • Rn represents a (C 1 -C 4 ) alkyl group
  • diol which is either a commercial product or is obtained by C-alkylation Friedel-Crafts from 1,4-benzenedimethanol. .
  • C 4 ) alkyl are similarly obtained from a compound equivalent to compound 1 described on page 83 of the Nevill CR article. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991, 7 (1), 83-86 which is either a commercial product or is obtained by Friedel-Crafts C-alkylation from p-tolylacetic acid.
  • Triphenyl (p-vinylbenzyl) phosphonium bromide (CAS No. 1 18766-51-1) is obtained from the corresponding brominated derivative (see Drefahl G., et al., Chem.Ber., 1961, 94 (8), 2002-2010) whose preparation from 4-vinylbenzyl alcohol (CAS No. 1074-61-9, commercial product) is described in the article by Shimomura O., et al., Tetrahedron 2005, 61, 12160 -12,167.
  • the groups G-CH 2 CI or -CH 2 N 3 can be obtained: the introduction of -Cl can be carried out in the presence of CMS: see ex.1 -composed 2;
  • the group G -CH 2 NH 2 can be obtained by means of a reduction reaction using a phosphine such as TCEP.
  • a phosphine such as TCEP.
  • the group G-CH 2 NH 2 can be obtained by means of a Mitsunobu reaction using triphenylphosphine and DEAD.
  • a Mitsunobu reaction using triphenylphosphine and DEAD see: Mitsunobu O., Synthesis 1981, 1-28; Hughes DL, Org. Reactions 1992, 42, 335-656; Hughes DL, Org. Prep. 1996, 28, 127-164.
  • Schemes 5 and 5 'describe the case n 1 but they can also apply for n> 1.
  • the intermediate dimer of formula can be formed:
  • a suitable Grignard reagent for example a protected alkoxymagnesium bromide in the form of silylated ether
  • (4-Bromobenzyl) triphenylphosphonium bromide is a commercial product (CAS No. 51044-13-4).
  • the protected alkoxymagnesium bromides in the form of silylated ether can be prepared from the corresponding bromoalcohols by protecting the alcohol function with the appropriate chlorosilane and then by forming the organomagnesium in the presence of magnesium in an aprotic polar solvent anhydrous, such as THF. (see for example Organic Letters 2005, 7, 183-186).
  • Bromoalcohols, linear or branched having 1 to 6 carbon atoms, are commercially available, such as 3-bromo-1-propanol (CAS No.
  • chlorosilane may, for example, be tert-butyldimethylchlorosilane (CAS No. 18162-48-6) or triisopropylchlorosilane (CAS No. 13154-24-0).
  • G-CH 2 N 3 the conversion of -CH 2 OH to -CH 2 N 3 can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence of diphenylphosphorazide and a base such as DBU, see Example 19, compound 60.
  • PL can be one of the following:
  • a coupling agent such as, for example, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride in solution in an anhydrous aprotic solvent such as DCM.
  • a base which may be a tertiary amine such as TEA or DIPEA.
  • the solvent may be DMF.
  • acid for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • the starting acid for example 4-methyl-4- (methyldithio) -pentanoic acid
  • a reducing agent such as, for example, sodium cyanoborohydride.
  • an acid solution for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • the starting aldehyde for example 2-methyl-2- (methyldithio) propanal
  • a suitably protected halogenated alcohol for example as a silyl ether
  • a protic polar solvent such as ethanol
  • O-methylhydroxylamine hydrochloride under reflux
  • a base such as sodium hydroxide
  • a borane dimethylsulfide solution in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF.
  • a reducing agent such as, for example, sodium triacetoxyborohydride.
  • This linker is prepared similarly to what is presented for PL 2 .
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a reducing agent such as sodium cyanoborohydride.
  • the conditions of Example 5, compound 17 can be used.
  • an acid solution for example hydrochloric acid (for example in solution in the dioxane).
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a phosphine for example triphenylphosphine
  • anhydrous protic polar solvent such as methanol
  • a base such as, for example, sodium methanolate
  • a reagent having a pyridyl disulfide unit is formed of the disulfide bond; the reaction is carried out in an anhydrous protic polar solvent such as methanol in the presence of a base such as, for example, sodium methanolate and a reagent having a pyridyl disulfide unit.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • mesyl chloride in the presence of a base such as, for example, TEA.
  • a protic polar solvent such as an ethanol / water mixture
  • a protic polar solvent such as ethanol
  • an acid solution for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • p U RbZb-ALK-OC (OCH 2 CH 2) -OH is prepared
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • an aprotic polar solvent such as DMF
  • a base such as potassium carbonate
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • a halogenated ester with the alcoholate of a monoprotected PEG diol in the form of tetrahydropyran ether (THP).
  • THF tetrahydropyran ether
  • ⁇ are diagrams below. d esS0US!
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as NaH
  • a nucleofugal group such as an alkyl halide
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a Lewis acid such as BF 3 etherate.
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid we can draw inspiration from the conditions of Example 16, compound 50.
  • an aprotic polar solvent such as DMF
  • a base such as potassium carbonate
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • a halogenated ester with the alcoholate of a monoprotected PEG diol in the form of tetrahydropyran ether (THP).
  • THF tetrahydropyran ether
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • an acid solution for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • an aprotic polar anhydride solvent such as DCM
  • a base such as TEA
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a coupling agent such as EDCI
  • a base such as DMAP
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a coupling agent such as the DIC / HOBt system.
  • ALK - (CH 2 ) i-6- (such as 1,6-hexanedioic acid monomethyl ester).
  • aprotic polar solvent such as DCM
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • Step (i): Following step (iii), the reactions of step (i) are repeated for the case R 12 H. case where ALK ⁇ CHpCH?
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • a Lewis acid such as BF 3 etherate.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
  • an aprotic polar solvent such as acetone
  • a sodium halide such as sodium iodide.
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • THF tetrahydropyran ether
  • the preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
  • the intermediate formed is hydrolyzed selectively at pH 5 to the hydroxy ester.
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • an aprotic polar solvent such as methanol
  • a protic polar solvent such as a two-stage ethanol / water mixture successive: displacement of the mesylate by thiourea then hydrolysis in situ of the isothiouronium salt by addition of a base such as sodium hydroxide.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • THF anhydrous aprotic polar solvent
  • THF tetrahydropyran ether
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a fert-butyl ester are commercially available (such as Fert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a diol
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid trifluoroacetic acid
  • an aprotic polar solvent such as methanol
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a coupling agent such as EDCI
  • a base such as DMAP
  • THF anhydrous aprotic polar solvent
  • THF tetrahydropyran ether
  • a base such as NaH
  • an alkynyl halide such as propargyl bromide or 4-bromo-1-butyne.
  • THF tetrahydropyran ether
  • the preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an aprotic polar solvent such as acetone
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as NaH
  • an alkenyl halide such as allyl bromide or 4-bromo-1-butene.
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • THF anhydrous aprotic polar solvent
  • THF tetrahydropyran ether
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • an aprotic polar solvent such as acetonitrile
  • a polar solvent such as a THF / water mixture in the presence of triphenylphosphine.
  • a reducing agent such as sodium triacetoxyborohydride and, if necessary, acetic acid as catalyst.
  • a hydrochloric acid solution e.g. dioxane
  • trifluoroacetic acid we can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 29.
  • an aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • base such as sodium hydride
  • a benzyl halide such as benzyl chloride
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as sodium hydride
  • a nucleofugal group such as an alkyl halide
  • ZaSS-ALK-CHO aldehyde for example 2-methyl-2- (methyldithio) -propanal is commercially available or can be prepared by oxidation of an alcohol carrying a disulfide unit obtained from a suitably protected halogenated alcohol (for example in the form of silylated ether) by successive treatments with potassium thioacetate and a derivative thereof. of methanethiosulfonate type. prepared himself
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • an aprotic polar solvent such as acetonitrile
  • a polar solvent such as a THF / water mixture in the presence of triphenylphosphine.
  • an aprotic polar solvent such as dimethylformamide
  • coupling agents such as the N, N'-diisopropylcarbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole system and a base such as TEA.
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid we can draw inspiration from the conditions of Example 7, compound 32.
  • an aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • base such as sodium hydride
  • a benzyl halide such as benzyl chloride
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • a reducing agent such as sodium triacetoxyborohydride and, if necessary, acetic acid as catalyst.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as sodium hydride
  • a nucleofugal group such as an alkyl halide
  • ZaS-ALK-CO 2 H for example 4-methyl-4- (methyldithio) -pentanoic acid, may be commercially available or prepared from a halogenated carboxylic acid by successive treatments with potassium thioacetate and a derivative of methanethiosulfonate type.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
  • a protic polar solvent such as an ethanol / water mixture
  • a mixture of polar solvents such as an ethanol / water mixture
  • a reagent comprising a methanethiosulphonate function such as methyl-methanethiosulphonate in the presence of a base such as sodium carbonate.
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as sodium hydride
  • a polar solvent such as a dimethoxyethane / THF / water mixture
  • a base such as sodium bicarbonate.
  • a polar solvent such as a DCM / methanol mixture
  • a coupling agent such as EEDQ.
  • an aprotic polar solvent such as a DCM / acetonitrile mixture.
  • a polar solvent such as a DME / THF / water mixture
  • a base such as sodium bicarbonate.
  • a polar solvent such as a DCM / methanol mixture
  • a coupling agent such as EEDQ.
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an aprotic polar solvent such as a DCM / acetonitrile mixture.
  • the PEG monoprotected diacids in allyl form are prepared according to the preparation description of the linker L 14 .
  • 2,5-Dioxo-pyrrolidin-1-yl bromoacetate and iodoacetate are commercial products with CAS numbers 42014-51-7 and 39028-27-8, respectively. Board
  • the conjugate is obtained by the process of:
  • step (ii) then optionally separating the conjugate formed in step (i) from the cryptophycin derivative and / or the unreacted targeting agent and / or aggregates that would have formed.
  • step (i) of the conjugate of step (i) is separated from unreacted cryptophycin derivative and aggregates that would have formed and the targeting agent is left in the solution. who would not have reacted.
  • the function of the contacting is to allow the chemical groups GCR1 and GCR2 to react in order to ensure the attachment of the cryptophycin derivative to the targeting agent by formation of a covalent bond; preferably,
  • GCR1 represents -SZ has: modifying the targeting agent with a modifying agent so as to introduce on the targeting agent of GCR2 groups suitable, including those described in the 2nd column of Table I:
  • the targeting agent comprises thiol chemical groups.
  • Aggregates means the associations that can be formed between two or more targeting agents, the targeting agents having been modified or not by conjugation. Aggregates are likely to form under the influence of a large number of parameters such as high concentration of targeting agent in the solution, pH of the solution, high shear forces, number of graft dimers and their hydrophobicity, temperature (see references cited in the introduction of J. Membrane Sci. 2008 , 318, 31 1-316), the influence of some of them sometimes not being clarified with precision. In the case of proteins or antibodies, reference may be made to AAPS Journal, “Protein Aggregation and Bioprocessing" 2006, 8 (3), E572-E579.
  • Aggregate content can be determined using known techniques such as SEC (see in this regard, Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480).
  • the aqueous solution of the targeting agent may be buffered using, for example, buffers such as, for example, potassium phosphate or N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES buffer) or a buffer mixture such as buffer A described later.
  • the buffer depends on the nature of the targeting agent.
  • the cryptophycin derivative is dissolved in a polar organic solvent, for example DMSO or DMA.
  • the reaction takes place at a temperature generally between 20 and 40 ° C.
  • the duration of the reaction can vary between 1 to 24 hours.
  • the reaction between the antibody and the cryptophycin derivative may be followed by SEC with a refractometric and / or ultraviolet detector to determine its progress. If the substitution rate is insufficient, it is possible to allow a longer reaction time and / or to add cryptophycin derivative.
  • SEC refractometric and / or ultraviolet detector
  • the conjugate can be purified for example by steric exclusion chromatography (SEC), by adsorption chromatography (such as the exchange agent). ions, IEC), by hydrophobic interaction chromatography (HIC), by affinity chromatography, by chromatography on mixed media such as ceramic hydroxyapatite or by HPLC. Purification by dialysis or diafiltration can also be used.
  • SEC steric exclusion chromatography
  • IEC hydrophobic interaction chromatography
  • HPLC hydrophobic interaction chromatography
  • purification by dialysis or diafiltration can also be used.
  • step (i) or (ii) the solution of the conjugate may undergo a step (iii) of ultrafiltration and / or diafiltration. At the end of these steps, the conjugate in aqueous solution is thus obtained.
  • the antibody may be selected from those described in particular in WO 04043344, WO 08010101, WO 08047242, WO 05009369 (anti- CA6) or WO 2010014812.
  • the antibody may be optionally modified with a modifying agent to promote attachment of the derived from cryptophycin (see above).
  • the antibody may be in particular monoclonal, polyclonal or multispecific. It can also be an antibody fragment. It can also be a murine, human, humanized or chimeric antibody. joint
  • a conjugate generally comprises of the order of 1 to 10 cryptophycin derivatives covalently attached to the targeting agent (this is the level of grafting or "drug-to-antibody ratio" or “DAR" " in English). This number varies according to the nature of the targeting agent and the cryptophycin derivative as well as the operating conditions used in the conjugation method (for example number of equivalents of cryptophycin derivative relative to the targeting agent, reaction time, nature of the solvent and the optional cosolvent).
  • Contacting the targeting agent with the cryptophycin derivative results in a mixture comprising a plurality of conjugates individually distinguishable from each other by different DARs; optionally the unreacted targeting agent; possibly aggregates.
  • the DAR that is determined on the final solution therefore corresponds to an average DAR.
  • UV spectroscopy may be a method used to determine the DAR. This method is inspired by that presented in Antony S.
  • a ⁇ 1 (CD x ⁇ D ⁇ 1 ) + (c A x ⁇ A ⁇ i)
  • a ⁇ 2 (c D X ⁇ D ⁇ 2 ) + (c A X ⁇ A ⁇ 2 )
  • CD and CA respectively denote the concentrations in the solution of the part of the conjugate relating to the cryptophycin derivative and the part of the conjugate relating to the antibody;
  • naked antibody is intended to mean the antibody to which no cryptophycin derivative is attached, that is to say the antibody before the conjugation step.
  • CD [( ⁇ A ⁇ ix A ⁇ 2 ) - ( ⁇ A ⁇ 2 x A ⁇ 1 )] / [( ⁇ D ⁇ 2 x ⁇ A ⁇ 1 ) - ( ⁇ A ⁇ 2 x ⁇ D ⁇ 1 )]
  • the average DAR then corresponds to c D / c A.
  • ⁇ 1 280 nm and according to the nature of the cryptophycin derivative, ⁇ 2 is chosen in the specific wavelength range 246 nm - 252 nm.
  • the DAR (UV) is preferably greater than 0.5, more particularly between 1 and 10, even more particularly between 2 and 7.
  • the conjugate can be used as an anti-cancer agent. Because of the presence of the targeting agent, the conjugate is made very selective for tumor cells rather than healthy cells.
  • the conjugate can be used alone or in combination with at least one other anticancer drug.
  • the conjugate is formulated in the form of an aqueous buffered solution at a concentration generally of between 1 and 10 mg / ml.
  • This solution can be injected as an infusion such that it can be rediluted to form an infusion solution.
  • the analysis is carried out on a Waters UPLC-SQD apparatus and an Acquity BEH Ci 8 1, 7 ⁇ m (2.1 ⁇ 50 mm) column at 50 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (2 min) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: from 5% to 50% B in 0.8 min; 1 min: 100% B, 1.85 min: 100% B, 1.95 min: 5% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • the analysis is carried out on a Waters UPLC-SQD apparatus and an Acquity BEH Ci ⁇ 1, 7 ⁇ m (2.1 ⁇ 50 mm) column at 70 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (2 min ) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 5% to 50% B in 1 min; 1, 3 min: 100% B; 1) , 45 min: 100% B, 1.75 min: 5% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • the analysis is carried out on a Waters ZQ apparatus and a Phenomenex Kinetex Ci ⁇ 100A 2.6 ⁇ m column (3 ⁇ 50mm) at 45 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (6 min) of A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 6% B: 0.8 min, 6% to 100% B in 4.1 min; 8 min: 100% B, 5.0-6.0 min: 6% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • the analysis is carried out on a Waters ZQ apparatus and a Phenomenex Kinetex Ci ⁇ 2.6 ⁇ m column (3 ⁇ 1000mm) at 50 ° C. with a flow rate of 0.8 ml / min, an elution gradient (8 min) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 4% B: 0.15 min; 4% to 100% B in 6.85 min; , 1 min: 100% B, 7.4-8.2 min: 4% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • MS Mass spectrometry
  • the spectra were carried out by direct introduction on a WATERS GCTof apparatus (direct introduction without LC).
  • the assay may require a prior step of deglycosylation of the conjugate. This is carried out by adding to the conjugate solution 2% by volume of a PNGase F enzyme solution (prepared by supplementing to 100 ml a vial of 100 units of N-glycanase enzyme lyophilisate with water. milliQ). The solution is homogenized using the vortex and incubated at 37 ° C. 19 h. The degly ⁇ sylated sample is ready to be analyzed by SEC-HRMS.
  • a PNGase F enzyme solution prepared by supplementing to 100 ml a vial of 100 units of N-glycanase enzyme lyophilisate with water. milliQ.
  • the solution is homogenized using the vortex and incubated at 37 ° C. 19 h.
  • the degly ⁇ sylated sample is ready to be analyzed by SEC-HRMS.
  • the 1 H NMR spectra were carried out on a Bruker Avance spectrometer, either DRX-300, DRX-400, DRX-500 or DMX-600. The chemical shifts are given in ppm.
  • the antibody is first modified with an NHS-activated ester, in order to introduce on its surface pyridyldisulphide groups.
  • NHS activated ester dissolved in DMA such that the final concentration of antibody is between 5 and 10 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 5%.
  • the reaction is continued for 2 h at RT.
  • a sample of the modified antibody is treated with dithiothreitol in order to reduce the disulfide bond, the pyridine-2-thione released is assayed by spectrometry (extinction coefficients: ⁇ 343 nm : 8080 M -1 cm -1 , ⁇ 28 o nm: 5100 M -1 cr ⁇ 1 pyridine-2-thione, and ⁇ o 28 nm: 208,380 M -1 cm -1 for the antibody). On average, from 3 to 6 pyridyldisulphide groups are grafted per molecule of antibody.
  • the reaction is continued overnight at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm.
  • the mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the degree of grafting of the cryptophycin derivative to the antibody. If the degree of substitution is insufficient, the mixture is treated with 1 to 5 eq.
  • the fractions containing the conjugated antibody in monomeric form are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml.
  • Amicon Ultra-15 Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore
  • a buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer.
  • the conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a Sephadex TM G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare columns) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pHs adapted to each conjugate.
  • the final conjugate is determined by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the average number of cytotoxic antibodies.
  • the substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
  • the antibody is first modified with an NHS-activated ester, in order to introduce on its surface pyridyldisulphide groups.
  • This antibody solution is treated with 5 to 10 eq.
  • NHS activated ester dissolved in DMA such that the final concentration of antibody is between 5 and 10 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 5%.
  • the reaction is continued for 2 h at RT.
  • the reaction is continued overnight at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm.
  • the mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the degree of grafting of the cryptophycin derivative to the antibody.
  • the mixture is treated with 1 to 5 eq. additional cryptophycin derivative (s) in the DMA for 3 h at 30 ° C or with agitation of about 2000 rpm.
  • the fractions containing the conjugated antibody in monomeric form are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml.
  • Amicon Ultra-15 Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore
  • a buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer.
  • the conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a Sephadex TM G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare columns) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pHs adapted to each conjugate.
  • the final conjugate is determined by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the average number of cytotoxic antibodies.
  • the substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
  • the reaction is continued for 3 h at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm.
  • the mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the level of cytotoxic grafting on the monomeric antibody population.
  • the mixture is treated with 1 to 5 eq. additional cryptophycin derivative (s) in the DMA for 3 h at 30 ° C or with agitation of about 2000 rpm.
  • conjugates containing conjugated antibody in form monomeric are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml.
  • Amicon Ultra-15 Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore
  • a buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer.
  • the conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a SephadexTM G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10 or Hiprep 26/10 desalting columns, GEHealthcare column) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pH adapted to each conjugate.
  • the final conjugate is assayed by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the degree of grafting.
  • the substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
  • Example 1 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - ⁇ 4- [4- (4-Mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Compound 1 (30 mg, 42.9 ⁇ mol, prepared according to Al-awar RS, et al., J. Med., Chem., 2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous DMF (2 ml) and the mixture is cooled to 0 ° C. before adding TEA (107 ⁇ mol) and then CMS (64.6 ⁇ mol). After 15 min, the bath is removed and stirring is continued for 12 h at RT. The mixture is diluted by adding AcOEt (2 ml) and the organic phase is washed with water (2x1 ml), with aq solution. saturated NaHCO 3 (1 ml) and aq. saturated with NaCl (1 ml).
  • Fert -butyl compound 5 4- (4-Methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoyl) -piperazine-1-carboxylate
  • Example 1 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) -1- ( 2R, 3R) -3- ⁇ 4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] - 1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 2 (E) - (3S, 6R, 1 OR, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) 3- ⁇ 4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] -6-methyl-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • the product (34 mg, 36.6 ⁇ mol) is placed in solution in ethanol (4.3 ml) / water (3.6 ml) and the mixture is cloudy.
  • the TCEP (146 ⁇ mol) is then added, the mixture becomes colorless and is stirred for 2 hours at RT.
  • the mixture is diluted by adding AcOEt (20 ml) and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and an aq solution. saturated with NH 4 Cl (20 ml).
  • the phase aq. is extracted with 2x20 ml of AcOEt, the organic phases are combined and washed with a saturated solution of NaCl (20 ml).
  • a solution of the compound 14 (1.11 g, 6.185 mmol) in 30 ml of THF is purged with argon and cooled to 0 ° C. before adding, at 0 ° C., 1.44 g (6.80 mmol). ) of sodium triacetoxyborohydride. Stirring is continued for 15 h at RT: there remains imine starting; 1.44 g (6.80 mmol) of sodium triacetoxyborohydride and 354 ⁇ l (6.185 mmol) of acetic acid are added at 0 ° C. and the stirring is continued at RT for 3 h. The mixture is diluted in 50 ml of AcOEt and washed with water (50 ml). The pH of the aq phase.
  • the compound 16 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with the amine 15 by applying the method described for the preparation of the compound 30.
  • Example 4 can be obtained by applying the method described for the preparation of Example 6 to compound 16.
  • Fert-butyl 17 4- (2-methyl-2-methyl-disulfanyl-propyl) -piperazine-1-carboxylate compound
  • Example 7 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - ⁇ 4- [4 - ( ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoylamino-ethoxy ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethyl ⁇ methylamino) -methyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 7 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - ⁇ 4- [4 - ( ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoylamino-ethoxy ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethyl ⁇ methylamino) -methyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 7 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with amine 32 by applying the method described for the preparation of compound 30 and then by reduction of the disulfide by applying the method described for the preparation of Example 6 .
  • Example 8 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - ⁇ (S) -1 - [(2R, 3R) - 3 (4-Mercaptomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl ⁇ -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 8 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - ⁇ (S) -1 - [(2R, 3R) -3 (4-Mercaptomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl ⁇ -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • modified hu2H11 antibodies are obtained at a concentration of 4.28 mg / ml (9.42 mg, 91%) with an average of 4.68 molecules of pyridyldisulfides per antibody.
  • 1.68 ml (7.2 mg, 0.049 ⁇ mol) of modified hu2H11 antibody are treated with 1.03 mg of (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3- ⁇ 4 [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-te
  • 13.5 mg (0.092 ⁇ mol, 1.318 ml) of naked antibody hu2H11 at an initial concentration of 10.24 mg / ml are treated with 6 eq. N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic acid (0.18 mg, 0.551 ⁇ mol) in solution in 38.4 ⁇ l of DMA so that the final antibody concentration is 9 mg / ml in the mixture.
  • 1.333 ml (12.0 mg, 0.081 ⁇ mol) of the modified antibody mixture hu2H1 1 are successively added to 1. 760 ml of buffer pH ⁇ 7.5.
  • Example 13 (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl ⁇ -piperazin-1-yl) -acetate
  • Tert-Butyl 34 4-Methoxycarbonylmethyl-piperazine-1-carboxylate compound
  • the derivative 1 (20 mg, 28.6 ⁇ mol) is placed in solution in anhydrous DCM (1 ml) and the TEA (71.5 ⁇ mol) and then the CMS (45.8 ⁇ mol) are added. After 12 h at RT, the product 2 formed is not isolated. The TEA (85.7 ⁇ mol) then the piperazin-1-yl-methyl acetate hydrochloride (42.8 ⁇ mol) are added. The mixture is stirred an additional 72 hours at RT before anhydrous DMF (1 ml) and NaI (30 ⁇ mol) are added. The mixture was stirred 48 h at 45 ° C before being diluted with TAcOEt (5 mL). The organic phase is washed with water (2 ⁇ 2 ml), with aq solution.
  • the expected product 38 is obtained in the form of a yellow oil (314 mg, 100%).
  • Example 13 (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl ⁇ -piperazin-1-yl) -acetate
  • Example 13 can be obtained by activating the acid 41 according to the method described for Example 18.
  • Example 14 (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-yl ⁇ ethyl) oxiranyl] benzylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Compound 42 allyl 3- (2- ⁇ 2- [2- (2-tert-butoxycarbonylamino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate
  • Example 14 (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl (1-yl) ethoxy) ethoxy) oxyanyl] benzylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 14 can be obtained by deprotecting compound 44 according to the method described for compound 41 and by activating the acid obtained according to the method described for example 18.
  • Example 15 (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa- ⁇ , 11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-yl ⁇ ethyl) oxiranyl] benzylmethylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 15 Acid (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1- ⁇ - (3S, 10R, 16S) -10- [3 4-chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16- 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] benzylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 15 can be prepared by activating the acid 49 according to the method described for Example 18.
  • Example 16 (2- ⁇ 2- [2- (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S ) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-chloro-4-methoxy-benzyl ⁇ -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo 1, 4-Dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl] -oxiranyl ⁇ -benzyl-piperazin-1-yl) ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl
  • Compound 50 3- ⁇ 2- [2- (2-hydroxyethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -propanoic acid
  • the compound 54 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with the amine 53 by applying the method described for the preparation of the compound 30.
  • Compound 55 can be obtained according to the method described for compound 41.
  • Example 16 (2- ⁇ 2- [2- (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-Chloro 4-methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ethyl] oxiranyl ⁇ -benzyl-piperazin-1-yl) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate
  • Example 16 can be obtained according to the method described for Example 18.
  • Example 17 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 2- [4- (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5 , 9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa- dec-13-en-16-yl) ethyl) oxiranyl] benzyl ⁇ -piperazin-1-yl) -1,1-dimethyl-4-oxo-butylsulfanyl] -acetylamino ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethoxy 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ⁇ ethoxy) propan
  • Example 17 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 2- [4- (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxybenzyl) -S-isobutyl- ⁇ .-dimethyl- .delta.-tetraoxo-1-dioxa- ⁇ .H-diaza-cyclohexadec -IS- ⁇ n- ⁇ -yl) -ethyl-oxiranyl] benzyl-piperazin-1-yl) -1,1-dimethyl-4-oxo-butylsulfanyl-acetylamino-ethoxy) ethoxy-ethoxy ⁇ ethoxy) -propionate of 2,5-dioxyrimidin-1-yl To a solution, purged with argon, of the compound Ex1 (15.6 mg, 17.
  • Example 18 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2S, 3S) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10 - [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa- ⁇ , 11-diaza-cyclohexa-dec-13 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-enyl-16-yl ⁇ -ethyl) -oxiranyl] -benzyloxycarbonylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate
  • Derivative 57 (20 mg, 28.6 ⁇ mol, prepared according to Al-awar RS, et al., J.Med.Chem., 2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous DCM (0.3 ml), the solution is purged with argon before TEA (40 ⁇ mol) and then 4-nitrophenyl chloroformate (32.32 ⁇ mol) are added. . After stirring for 30 minutes at RT, the mixture is hydrolyzed and diluted in 7 ml of AcOEt.
  • Example 18 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2S, 3S) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10 - [3-Chloro-4-methoxybenzyl-5-isobutyl- ⁇ . ⁇ -dimethyl] .delta.-tetraoxo-1-dioxa- ⁇ .H-diaza-cyclohexa-dec-IS-en 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl (5-dioxo-pyrrolidin-1-yl) -5-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] benzyloxycarbonylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 19 (1- ⁇ 4-r (2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10-r3-Chloro-4-methoxy-benzyl) 3-Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] benzyl 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ⁇ -1H-1,2,3-triazol-4-yl) -butanoate
  • Example 19 (1- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl ⁇ -1H-1, 2,3-triazol-4-yl) -butanoate
  • Example 20 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 1 - [1 - (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec Methyl-13-en-16-yl) -ethyl] oxiranyl ⁇ -benzyl) -1,2,3-triazol-1-yl] -methoxy-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate , 5-dioxa-pyrrolidin-1-yl
  • Example 20 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 1- [1- (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -S-isobutyl- ⁇ -dimethyl- ⁇ -diethyl-tetraoxo-1-dioxa- ⁇ -H-diaza-cyclohexadec-IS- 1- (2-yl) -ethyl] -oxiranyl ⁇ -benzyl) -1,2,3-triazol-1-yl] -methoxy ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate 2.5 g. dioxa-pyrrolidin-1-yl
  • Example 20 can be obtained from compounds 60 and 65 according to the method described for compound 61 and then activating the acid according to the method described for example 19.
  • Example 21 (4- ⁇ 1 - [(4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-chloro-4-methoxy-benzyl ⁇ -3-isobutyl-6, 6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl] -oxiranyl ⁇ -benzyl) -methylamino] methyl 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ⁇ -1,2,3-triazol-1-yl) -butanoate
  • Example 21 (4- ⁇ 1 - [(4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-chloro-4 Methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl] oxiranyl ⁇ benzyl) methylamino] methyl] -1,2,3-triazol-1-yl) butanoate
  • Example 21 can be obtained by activation of the acid 69 according to the method described for Example 19.
  • Alolol 57 (36 mg, 51.48 ⁇ mol, prepared according to Al-awar RS, et al., J.Med.Chem.2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous THF (2 ml). The solution is purged with argon and cooled with an ice-water bath before adding the DPPA (74 ⁇ mol) then the DBU (80 ⁇ mol). The mixture is allowed to return to RT and stirring is continued overnight. The next day, the solution is cooled again with an ice-water bath, then 74 ⁇ mol of DPPA and 80 ⁇ mol of additional DBU are added. After 2 h of reaction at 0 ° C.
  • the compound 76 (6 mg, 4.93 ⁇ mol) is dissolved in a mixture of DCM (0.5 ml) and DMF (0.1 ml) and then the N, N'-disuccinimidyl carbonate is successively added. (6 mg, 23.42 ⁇ mol) and DIPEA (4 ⁇ l, 22.96 ⁇ mol). After 3 hours of reaction at RT, a solution aq. Saturated with NH 4 CI is added and the mixture is extracted 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under RP. The crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10.
  • Example 23 can be obtained by activating the acid 80 according to the method described for Example 22.
  • EXAMPLE 24 4 - ((2S, 3S) -3 - ⁇ (S) -1 - [(E) - (3S) [2-Methyl-2- (pyridin-2-yldisulfanyl) -propyl] -methyl-carbamate 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl] -ethyl ⁇ -oxiranyl) -benzyl
  • Example 24 4 - ((2S, 3S) -3 - ⁇ (S) - 1 - [(E) - (3S) [2-Methyl-2- (pyridin-2-yldisulfanyl) -propyl] -methyl-carbamate 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl] -ethyl ⁇ -oxiranyl) -benzyl
  • HRMS cryptophycin derivatives
  • -Lys- means that the attachment is to the ⁇ -amino groups of the lysines of the anti ⁇ rps.
  • the MDA-MB-231, MDA-A1 or HCT116 cells in their exponential growth phase are trypsinized and delivered in suspension in their respective culture medium (DMEM / F12 Gibco # 21331, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2 nM Gibco Glutamine # 25030 for MDA cells, DMEM Gibco # 11960, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2mM Glutamine Gibco # 25030 for HCT116 cells).
  • the cell suspension is seeded into Cytostar 96-well culture plates (GE Healthcare Europe, # RPNQ0163) in the complete culture medium containing serum at a density of 5000 cells / well (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT1 16). After 4 hours of incubation, successive dilutions of the cryptophycin derivatives are added to the wells at decreasing concentrations of 10 -7 to 10 -12 M (in triplicate for each concentration). The cells are cultured for 3 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere in the presence of cytotoxic agents.
  • Example 29 Evaluation of the inhibition of proliferation of MDA-MB-231, MDA-A1 and HCT116 cell lines by antibody-cytotoxic conjugates
  • the MDA-MB-231, MDA-A1 or HCT116 cells in their exponential growth phase are trypsinized and resuspended in their respective culture medium (DMEM / F12 Gibco # 21331, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2 nM Gibco glutamine # 25030 for MDA cells, DMEM Gibco # 1 1960, 10% SVF Gibco # 10500-056, 2 mM Glutamine Gibco # 25030 for 16 HCT1 cells.
  • the cell suspension is seeded into Cytostar 96-well culture plates (GE Healthcare Europe, # RPNQ0163) in the complete culture medium containing serum at a density of 5000 cells / well (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT1 16).
  • the data are expressed as a percentage of survival by making the ratio between the count obtained with the cells treated with the immunoconjugate and that obtained with the cells of the control wells (treated with the culture medium alone).
  • the naked antibody hu2H11 was added to the wells at a concentration of 1 ⁇ M at the start of the experiment and the inhibition of proliferation was measured as previously described.

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Abstract

L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine de formule (I) : dans laquelle : R1 représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe -OH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy; ou bien R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde; AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel; R3 représente un groupe (C1-C6)alkyle; R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13 et C14; R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)Jalkyle; R8 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle; R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH2, -NH(C1-C6)alkyle ou -N(C1- C6)alkyle2; R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1- C4)alkyle; l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon covalente, l'attachement se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR1.

Description

NOUVEAUX CONJUGUES, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN
THERAPEUTIQUE La présente invention se rapporte à des conjugués de cryptophycines, les compositions les contenant et leur application thérapeutique, notamment comme anticancéreux. L'invention se rapporte aussi au procédé de préparation de ces composés ainsi qu'aux dérivés de cryptophycines eux-mêmes. [Domaine technique]
Les cryptophycines sont des métabolites secondaires appartenant à la classe des macrocycles depsipeptidiques produits par les cyanobactéries du genre Nostoc. Leur nom se réfère au fait qu'elles sont hautement cytotoxiques vis-à-vis des levures du genre cryptococcus. Le premier représentant de cette classe de molécules, la cryptophycine-1 (C-1), a été isolé en 1990 de cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (voir Eiβler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789). La structure, la formule générale ainsi que la numérotation des atomes de carbone de ces composés, telle que décrite dans WO 98/08505, sont rappelées ci-dessous :
Figure imgf000003_0001
Les cryptophycines C-1 et C-52, qui se caractérisent par une fonction époxyde représentée ci- dessous, ont des propriétés anticancéreuses. Des essais cliniques de phase II dans le cancer du poumon ont été conduits avec C-52 (LY 355073) : voir Edelman MJ. , et al., Lung Cancer 2003,
39, 197-199 ; Sessa C, et al., Eur.J.Cancer 2002, 38, 2388-96. La cryptophycine C-55, prodrogue de C-52, se caractérise quant à elle par une fonction chlorhydrine en lieu et place de la fonction époxyde (Bionpally R. R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33). C-55 s'est avérée très active mais n'est pas stable en solution. Des dérivés de type glycinate de chlorhydrine tel que le composé C-55 Gly ont également été décrits pour gagner en stabilité
(Liang J., et al., Investigational New Drugs 2005, 23, 213-224).
Figure imgf000003_0002
Figure imgf000004_0001
[Problème technique]
La chimie des conjugués est connue depuis de nombreuses années et a été appliquée à plusieurs familles de cytotoxiques comme par exemple les maytansinoïdes (WO 04103272), les taxanes (WO 06061258), les tomaymycines (WO 09016516), les leptomycines (WO 07144709), le CC-1065 et ses analogues (WO 2007102069); voir aussi à propos des conjugués, Monneret C, et al., Bulletin du Cancer. 2000, 87(1 1 ), 829-38 ; Ricart A.D., et al., Nature Clinical Practice Oncology 2007, 4, 245-255. Cependant, elle n'a pas été appliquée aux dérivés de cryptophycine conjugués à des anticorps ou à d'autres agents de ciblage.
Le problème technique qu'entend résoudre la présente invention est de proposer de nouveaux conjugués à base de dérivés de cryptophycine, ainsi que de nouveaux dérivés de cryptophycine aptes à être conjugués.
[Art antérieur]
EP 0830136 et WO 98/08505 décrivent des dérivés de cryptophycines mais ne décrivent pas de conjugués de cryptophycines. WO 98/08505 décrit des dérivés de cryptophycines de formule
(A) : dans laquelle Ar peut représenter un groupe Ar' de
formu
Figure imgf000004_0002
: dans laquelle R54 représente H, un groupe (C1-C6)alkyle, (C1;
Cfi)alkyle(R57,R57',R57"), aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR57, PO3H, SO3H, SO2R58, NR59R60, NHOR6-I, NHOR6-T, CN, NO2, OR62, CH9OR6?', CH9NRg6Rg6', (C1;
ÇβJaJkyJeORiQQ, SR63 ; R55 et R56 représentent H, un groupe (C1-C6)alkyle,
Figure imgf000004_0003
C(R511R5?', R5?"), aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR57, PO3H, SO3H, SO2R58, NRSgRg2, NHOR6I, NHCHR61', CN, NO2, OR62, CH9OR69', CH9OCORg5, CH9NRg6Rg6', (C1-C6)BIkVIeORi00, (C1-C6JaIkVIeN RMR60. WO 98/08505 décrit notamment les composés suivants :
Figure imgf000005_0001
(∞mposé 24, schéma 4)
Figure imgf000005_0002
(ex.74)
Figure imgf000006_0001
qui se caractérisent pas le groupe terminal -NHC(=O)Ot-Bu. WO 98/08505 ne précise pas que ces composés sont aptes ou destinés à être conjugués. US 2007/0213511 décrit des immunoconjugués de calichéamicine. Parmi ceux-ci, mention est faite du MYLOTARG® (ou CMA-676) qui est un immunoconjugué de calichéamicine utilisé dans le traitement de l'AML (anti-CD33-calichéamicine). Voir aussi à propos des conjugués : WO 2006/042240. Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46(14), 2985-3007 et Al-awar R.S., et al., Mol.Cancer Ther. 2004, 3(9), 1061-1067 décrivent des dérivés de cryptophycine, ainsi que leurs évaluations in vivo.
WO 08010101 décrit un anticorps monoclonal anti-EphA2 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. WO 08047242 décrit un anticorps monoclonal anti-CD38 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. Le composé cytotoxique peut être choisi parmi les maytansinoïdes, les taxanes, les tomaymycines, les leptomycines, le CC-1065 et ses analogues.
WO 2009/126934 décrit des anticorps anti-CD70 et leurs conjugués avec des composés cytotoxiques ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques. WO 2009/134976 décrit des conjugués avec un taux de subsitution optimisé pour délivrer la quantité nécessaire de cytotoxique dans la cellule ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques.
WO 2005/116255 décrit des conjugués d'aptamères et d'un cytotoxique pouvant être une cryptophycine (voir [0037] et Tableau 2), le linker pouvant comprendre une chaîne PEG ([0038]). Plus particulièrement, la cryptophycine Cryp-NH2 est décrite :
Figure imgf000006_0002
ainsi que ses conjugués d'aptamères avec les linkers suivants : NHS-PEG-erythritol, pNP-PEG- erythritol, NHS-PEG-octaPEG, pNP-PEG-octaPEG et PEG-comb (Tableaux 3 et 4). La nature de l'enchaînement sur le cycle phényle (-CH2θ-C(=O)-CMe2-CH2NH-...) est différent de ce qui est envisagé dans la présente invention. WO 2006/096754 décrit également des conjugués d'aptamères et d'un cytotoxique qui peut être aussi une cryptophycine.
WO 2009/002993 décrit des conjugués de cytotoxique de formule B-L-A comprenant des linkers hydrophiles, par exemple le linker de formule :
Figure imgf000007_0001
Le cytotoxique peut être une cryptophycine (page 46) mais sans préciser le point d'attachement du linker. Un exemple de conjugué est le EC0262 :
Figure imgf000007_0002
dont le linker et le point d'ancrage sont différents de ce qui est envisagé dans la présente invention.
[Définitions]
On entend par :
• conjugué : un agent de ciblage cellulaire auquel est attaché de façon covalente au moins une molécule d'un composé cytotoxique ;
• agent de ciblage cellulaire (ou « cell binding agent » en anglais) : une molécule ayant une affinité pour une cible biologique : il peut s'agir par exemple d'un ligand, d'une protéine, d'un anticorps, plus particulièrement monoclonal, d'un fragment de protéine ou d'anticorps, d'un peptide, d'un oligonucléotide, d'un oligosaccharide. L'agent de ciblage a pour fonction de diriger le composé biologiquement actif comme un cytotoxique vers la cible biologique. De préférence, l'agent de ciblage n'est pas un aptamère ;
• cible biologique : un antigène (ou groupe d'antigènes) localisé préférentiellement à la surface des cellules cancéreuses ou cellules stromales associées à cette tumeur; ces antigènes pouvant être par exemple, un récepteur de facteur de croissance, un produit d'oncogène ou de gène « suppresseur de tumeur » muté, une molécule liée à l'angiogénèse, une molécule d'adhésion ;
• linker : un ensemble d'atomes permettant d'attacher de façon covalente un composé cytotoxique à l'agent de ciblage ;
• groupe alkyle : un groupe hydrocarboné aliphatique saturé obtenu en enlevant un atome d'hydrogène d'un alcane. Le groupe alkyle peut être linéaire ou ramifié. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, iso-butyle, tertio-butyle, pentyle, 2,2-diméthylpropyle, hexyle ;
• groupe cycloalkyle : un groupe alkyle cyclique comprenant entre 3 et 8 atomes de carbone engagés dans la structure cyclique. A titre d'exemples, on peut citer les groupes cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle ;
• groupe hétérocycloalkyle : un groupe cycloalkyle comprenant au moins un hétéroatome (O, S, N) engagé dans le cycle et relié aux atomes de carbone formant le cycle ;
• groupe alcoxy : un groupe -O-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci-dessus ;
• groupe alcanoyloxy : un groupe -O-CO-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci- dessus ;
• groupe alkylène : un groupe divalent saturé de formule brute -CnH2n-, obtenu en enlevant deux atomes d'hydrogène d'un alcane. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthylène (-CH2-), éthylène (-CH2CH2-), propylène (-CH2CH2CH2-), butylène (-CH2CH2CH2CH2-),
A A ' hexylène (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) ou les groupes ramifiés suivants n , / x ;
« de préférence, le groupe alkylène est de formule -(CH2)n-, n représentant un nombre entier ;
• dans les plages de valeurs, les bornes sont incluses (par ex. une plage du type « n allant de 1 à 6 » ou bien « compris entre 1 et 6 » inclut les bornes 1 et 6).
Abréviations utilisées
AcOEt : acétate d'éthyle ; ALK : groupe (C1-Ci2)alkylène, plus particulièrement (C1-CβJalkylène, plus particulièrement de la forme -(CH2)n- n étant un entier de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ; aq. : aqueuse ; CCM : chromatographie sur couche mince (TLC en Anglais) ; CMS : chlorure de
méthanesulfonyle ; crypto désigne le motif de
Figure imgf000008_0001
crypto désigne notamment l'un des dérivés de cryptophycine D1-D8 décrits plus loin ou un dérivé de cryptophycine d'un exemple ; Rf : facteur de rétention ; DAR : taux de substitution (drug-antibody ratio) ; DBU : 1 ,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène ; DCC : N,N'-dicyclohexylcarbodiimide ; DCM : dichlorométhane ; DEAD : diéthylazodicarboxylate ; DIC : N,N'-diisopropylcarbodiimide ; DIPEA : N,N-diisopropyléthylamine ; DMA : diméthylacétamide ; DMAP : 4-diméthylaminopyridine ; DME : diméthoxyéthane ; DMF : diméthylformamide ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; EEDQ : 2-éthoxy-1- éthoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoline ; EDCI : N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide ; EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique ; éq. : équivalent ; Fmoc : fluorénylméthoxycarbonyl ; HOBt : 1-hydroxybenzotriazole ; HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazineéthanesulfonique ; mCPBA : acide m-chloroperbenzoïque ; NHS : N- hydroxysuccinimide ; NMP : N-méthylpyrrolidinone ; PA : pression atmosphérique ; PABAC : « para-aminobenzylic alcohol carbonate » ; PR : pression réduite ; SEC : chromatographie d'exclusion stérique ; SPE : extraction sur phase solide ; TA : température ambiante ; TBDMS : tert-butyldiméthylsilyl ; TCEP : chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)-phosphine ; TEA : triéthylamine ; TFA : acide trifluoroacétique ; TIPS : triisopropylsilyl ; THF : tétrahydrofurane ; tR : temps de rétention.
[Description détaillée de l'invention]
L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine de formule (I) :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle :
• Ri représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe -OH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy ;
ou bien R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde ;
• AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ;
• R3 représente un groupe (C1-CβJalkyle ;
• R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13 et C14 ;
• Rβ et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ;
• Rs et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ;
• R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe -OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH2, -NH(d-C6)alkyle ou -N(Cr C6)alkyle2 ;
• Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (Cr C4)alkyle ;
l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon covalente, l'attachement se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi. positions ortho (o), meta (m) ou para( p) :
Figure imgf000009_0002
Ri représente un atome d'halogène, plus particulièrement Cl. R3 représente un groupe (Cr Cβjalkyle, plus particulièrement Me. Re et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; plus particulièrement ils représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe Me. Rs et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (Cr Cβjalkyle ; plus particulièrement R8 représente H et R9 représente isobutyle.
Rio représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H, un groupe OH, (Cr C4)alcoxy, un atome d'halogène. Il peut s'agir aussi d'un groupe -NH2, -NH(C1-C6)alkyle ou - N(C1-C6)alkyle2 tel que par exemple -NH2 ou -NMe2, de préférence en position 3 ou 4 sur le noyau phényle. Plus particulièrement, le noyau phényle comprend deux substituants en position 3 et 4 sur le noyau phényle. De préférence, il s'agit de 3-CI et 4-méthoxy. Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1-C4)alkyle ; plus particulièrement H.
Plus particulièrement, on pourra choisir l'un des substituants Ri à Rn parmi ceux décrits dans les exemples. Chaque substituant R1 à Rn pourra aussi adopter une des configurations spatiales (par ex. R ou S ou bien Z ou E) telle que décrite dans les exemples.
AA représente un acide aminé naturel ou non naturel. Il peut s'agir d'un acide aminé α, β ou γ. On peut citer notamment les acides aminés suivants : alanine (Ala), β-alanine, acide 2-amino-2- cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), praline (Pro), serine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide γ-aminobutyrique, acide α,α-diméthyl γ-aminobutyrique, acide β,β-diméthyl γ-aminobutyrique, omithine (Om), citrulline (Cit) ainsi que les formes protégées desdits acides aminés (par ex. par acétyl, formyl, tosyl, nitro). De préférence, il s'agit d'un acide aminé naturel. Plus particulièrement, il s'agit de la glycine.
Ri et R2 peuvent aussi former ensemble un motif époxyde.
L'attachement entre le dérivé de cryptophycine et l'agent de ciblage est réalisé par l'intermédiaire d'un linker L positionné en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR-i; ainsi, le dérivé de cryptophycine apte à la conjugaison a pour formule (II) :
Figure imgf000010_0001
(H) L'attachement au niveau de l'agent de ciblage se situe à l'autre extrémité du linker L au niveau d'un groupe réactif présent sur l'agent de ciblage. Ainsi, L comprend au moins un groupe chimique réactif (GCR1 ) vis-à-vis d'un groupe chimique réactif (GCR2) présent sur l'agent de ciblage. La réaction entre GCR1 et GCR2 assure l'attachement du composé de formule (II) sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente. Ainsi, le dérivé de cryptophycine de formule (II) est apte à être conjugué à un agent de ciblage.
Les dérivés de cryptophycine de la présente invention, y compris ceux exemplifiés, peuvent exister à l'état de bases ou de sels d'addition à des acides, notamment des acides pharmaceutiquement acceptables.
A titre d'exemples de GCR1 , on peut citer :
(i) le groupe réactif -SZa pour lequel Z3 représente H ou le groupe -SR3 et R3 représentant un groupe (C1-C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ;
(ii) le groupe réactif -C(=O)-ZbRb pour lequel Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, plus particulièrement -O-, et Rb représentant H ou un groupe (C1-CβJalkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ;
(iii) l'un des groupes réactifs suivants : -Cl, -N3, -OH, -NH2, le groupe réactif maléimido
Figure imgf000011_0001
ou haloacétamido.
Figure imgf000011_0002
avec R12 représentant H ou un groupe (C1-CβJalkyle, plus particulièrement Me dans le cas des composés de formule (III) :
Figure imgf000011_0003
I
comprenant le groupe G= -(CH2)nY avec Y= -Cl, -N3, -OH, -NH2,
Figure imgf000011_0004
avec
Ri2 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me ; ou l
(iv) le groupe réactif maléimido
Figure imgf000011_0005
avec Ri2 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me. Plus particulièrement, -SZa peut représenter -SH ou -SS(C1-C6)alkyle, notamment -SSMe, ou -
SS-hétéroaryle, notamment ou
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0006
(Xi et X2 étant définis plus bas). Plus particulièrement, -ZbRb peut représenter -OH, -OCH3, -OCH2CH=CH2, //
Figure imgf000012_0002
— ' dans lequel Gl représente au moins un groupe électroinductif tel que -NO2 ou -HaI, notamment -F. Il peut s'agir par exemple
des groupes suivants :
Figure imgf000012_0003
x— ' ou . Un autre type de groupe -C(=O)ZbRb est
le suivant :
Figure imgf000012_0004
présentent une bonne réactivité.
Plus particulièrement, GCR1 pourra être choisi parmi l'un de ceux décrits dans les exemples. A titre d'exemple de GCR2, on peut citer les groupes ε-amino des lysines portés par les chaînes latérales des résidus lysine qui sont présents à la surface d'un anticorps, les groupes saccharides de la région charnière ou les thiols de cystéines par réduction de liaisons disulfures intra-chaînes (Garnett M. C, et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001 , 53, 171-216). Plus récemment d'autres approches ont été considérées comme l'introduction de cystéines par mutation (Junutula J. R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932; WO 09026274) ou l'introduction d'acides aminés non-naturels permettant d'autres types de chimie (de Graaf AJ. , et al., Bioconjugate Chem. 2009, Publication Date (Web): February 3, 2009 (Review); DOI: 10.1021/bc800294a ; WO 2006/069246 et selon Chin J.W., et al., JACS 2002, 124, 9026-9027 (technologie ReCode®)). Ces modes d'attachement utilisés avec les anticorps sont applicables à l'ensemble des agents de ciblage connus en fonction de leur structure.
Il est également possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage de façon à introduire de nouveaux groupes chimiques réactifs GCR2. Ainsi, il est bien connu de l'homme du métier comment modifier un anticorps à l'aide d'un agent de modification (voir notamment WO 2005/077090 page 14). La modification permet d'améliorer la réaction de conjugaison et d'utiliser une plus grande variété de groupes GCR1.
Agents de modification permettant d'introduire des groupes disulfures
L'agent de modification peut être un ester activé NHS de formule
Figure imgf000012_0005
dans laquelle R représente un groupe (C1-C6)alkyle, aryle, hétéroaryle, (C3-C7)cycloalkyle, (C3- C7)hétérocycloalkyle et ALK représente un groupe (C1-CβJalkylène ; par exemple, on peut utiliser le N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) ou le N-succinimidyl pyridyldithiobutyrate (SPDB ou ester N-hydroxy-succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque) de façon à introduire des groupes réactifs GCR2 dithiopyridyl (voir Bourdon M.A., et al., Biochem. J. 1978, 173, 723- 737 ; US 5208020) lesquels peuvent ensuite réagir avec un groupe chimique réactif GCR1 de type -SH présent sur le linker du dérivé de cryptophycine afin de former une nouvelle liaison -S- S- (voir ex.9 pour un conjugué présentant une liaison disulfure). Le groupe N-hydroxysuccinimide réagit préférentiellement sur les groupes amino présents sur l'anticorps de façon à former des liaisons amides. Un autre exemple d'agent de modification est décrit dans WO 2004/016801 de
formule
Figure imgf000013_0005
ou un analogue pegylé de formule
Figure imgf000013_0001
dans WO 2009/134976 ou un analogue sulfonique
de formule
Figure imgf000013_0002
dans WO 2009/134977 dans lesquelles :
- X3, X4, X5, Xe représentent H ou un groupe (C1-CβJalkyle,
- Xi et X2 représentent -H, -CONX8Xg, -NO2, Xs et X9 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, - X7 représente -Sθ3-M+ ou H ou bien un groupe ammonium quaternaire
- a désigne un entier allant de 0 à 4 et b désigne un entier allant de 0 à 2000, de préférence entre 1 et 200 ; a et b peuvent prendre toutes les valeurs entre respectivement 0 et 4 ou entre 0 et 2000. Agents de modification permettant d'introduire des groupes maléimido
Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane- 1-carboxylate (SMCC), un composé similaire décrit dans EP 0306943 ou un sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate). On peut citer comme
autres exemples :
Figure imgf000013_0003
comme le 3-maléimido-propanoate de N-succinimidyle ;
Figure imgf000013_0004
comme le 6-(3-maléimidopropionamido)hexanoate de N-succinimidyle ;
Figure imgf000014_0001
b étant un nombre entier compris entre 0 et 2000, de préférence entre 1 et 200 (b peut prendre toutes les valeurs entre 0 et 2000), comme le 3-(2-{2-[3- maléimido-propionylamino]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de N-succinimidyle ou SM(PEG)2 ; comme le succinate de maléimidoéthyle et de N-succinimidyle ;
comme le 4-(4-maléimidophényl)butanoate de N-succinimidyle ou
Figure imgf000014_0002
comme le 3-maléimidobenzoate de N-succinimidyle.
Agents de modification permettant d'introduire des groupes thiols
Un autre exemple d'agent de modification décrit dans WO 90/06774 est de formule
Figure imgf000014_0003
dans laquelle :
- HaI représente un atome d'halogène ;
- X10 représente un atome d'halogène ou le groupe COOXi4, nitro, (C1-C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène, (C2-C8)alkényle non substitué ou halogène, (C2-C8) alkynyle non substitué ou halogène, (C3-C8)cycloalkyle non substitué, aryle non substitué ou substitué par un à trois substituants sélectionnés parmi amino, atome d'halogène, groupe (C1- C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène ;
- chacun des Xn, X12, X13 représente indépendamment un atome d'hydrogène ou bien peut représenter X3 ;
ou X10 et X11 forment ensemble un cycle (C2-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupe(s) (C1-C4)alkyle ;
ou X1O ou X11 forment ensemble avec X-12 un cycle (C1-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupes (C1-C4) alkyle
et X14 est -H ou un groupe (C1-C8)alkyle. De préférence, HaI représente un atome de chlore ou de brome. On trouvera dans le tableau ci- dessous des possibilités pour X-10-X13 :
Figure imgf000014_0004
Figure imgf000015_0005
Un exemple d'iminothiolane préféré est le suivant :
Figure imgf000015_0004
Agents de modification permettant d'introduire des groupes haloacétamido
Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidyl-4-(N-iodoacétyl)-aminobenzoate
O
,.0_
/ ^N'
\ 1 "
(SIAB)
Figure imgf000015_0001
X° ° , ou des composés similaires parmi lesquels le succinimidyl-N-
O
/— r °
Figure imgf000015_0002
Y °
iodoacétate (SIA) ° , le succinimidyl-N-bromoacétate (SBA), ou le succinimidyl-3-(N- bromoacétamido)propionate (SBAP) ou un composé pegylé similaire décrit dans WO
I il H
7 O Ofb ^
2009/134976
Figure imgf000015_0003
° ° , b étant tel que décrit précédemment. Les figures 1 et 2 illustrent la modification d'un groupe amino d'un agent de ciblage par le SPDP ou bien par l'iminothiolane préféré ci-dessus.
Ainsi, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 disulfures (-SSR), notamment
— S^. — s^
de type pyridyldisulfures s N ou s N , dans le cas où GCR1 représente -SH. De même, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 thiol (-SH), par ex. avec un iminothiolane, dans le cas où GCR1 représente disulfure (c'est-à-dire GCRI = -SZa avec Za≠H, par exemple Dans les deux cas, la liaison covalente qui se forme par
Figure imgf000016_0004
réaction entre GCR1 et GCR2 est une liaison disulfure clivable.
Il est également possible, dans le cas où GCR1 représente -SH, d'introduire à la surface de
l'agent de ciblage des groupes GCR2 de type maléimido (
Figure imgf000016_0001
) ou haloacétamido (par ex. bromo- ou iodoacétamido Réciproquement, on peut introduire sur l'agent de ciblage
Figure imgf000016_0003
des groupes GCR2 thiol (-SH), par ex. avec un iminothiolane, dans le cas où GCR1 représente I
Figure imgf000016_0002
. Dans ce cas, la liaison covalente qui se forme par réaction entre GCR1 et
GCR2 est une liaison sulfure non-clivable.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Plus particulièrement dans le cas où GCR1 est du type (iii) ci-dessus, il est possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage à l'aide d'un agent de modification adéquat ou d'introduire un/des acide(s) aminé(s) non-naturel(s) afin d'introduire les fonctions GCR2 adéquates. Par exemple,
- avec une fonction -N3 : GCR2 peut être un groupe -C≡CH ;
- avec une fonction -OH ou -NH2 : GCR2 peut être une fonction acide carboxylique ;
- avec une fonction -Cl : GCR2 peut être un groupe -SH.
Dans le cas où GCR1 représente un groupe réactif maléimido
Figure imgf000019_0001
ou haloacétamido
Figure imgf000019_0004
avec Ri2 représentant H ou (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me, le dérivé de cryptophycine peut être représenté par la formule (lia) ou (Nb) ci-dessous :
Figure imgf000019_0002
(L* représente un fragment d'un linker L tel que L= -L*-maléimido ou bien L= -L*-haloacétamido) Le dérivé de cryptophycine pourra être, en série C-52 et C-1 , l'un des suivants D1-D8 :
Figure imgf000019_0003
Figure imgf000020_0001
ou un motif équivalent décrit dans l'un des exemples. Plus particulièrement, L est en position para du motif CR-i.
Procédé de préparation des dérivés de cryptophycine
Les composés de formule (II) sont préparés selon le Schéma 1 à partir d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) et d'un précurseur de linker (PL) :
Figure imgf000020_0002
Schéma 1
G représente le groupe -CH=CH2, -(CH2)nY ou bien -(C1-Cβjalkylène-Y avec n étant un entier allant de 1 à 6 et Y représentant -OH, -SH, -Cl, -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant tel que par exemple le groupe mésylate (OMs) ou tosylate, ou bien Y représentant -N3, -NH2, - COOH, -NR12-CH2-C=CH dans lequel Ri2 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. Le précurseur de linker PL a pour fonction d'introduire le linker L au niveau du dérivé de cryptophycine après réaction entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL.
HS- ( v y K (CH ) > ?
G peut aussi représenter le groupe 2 n < (c'est-à-dire que Y représente le groupe
~-^< ) choisi parmi l'un des 9 groupes suivants (R12 et R'12 représentent H ou un groupe (C1-C6)alkyle) :
Figure imgf000020_0003
(CH2)^ . HS-ALKf
Figure imgf000020_0004
ou -(CH2)n-SH
Sur le Schéma 1 , plusieurs étapes et/ou réactions peuvent être nécessaires pour aboutir au dérivé de cryptophycine (II) à partir du dérivé de cryptophycine (III). Ainsi, par exemple, dans le cas où Z3=H, on préfère introduire un linker L pour lequel Za=-S(C1-C6)alkyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis à réduire la fonction disulfure -SS(C1-C6)alkyle en fonction thiol -SH. On peut utiliser pour cela par exemple le TCEP : voir à ce propos Burns J.A., et al., J.Org.Chem. 1991 , 56(8), 2648-2650. Cette transformation -SS(C1-C6)alkyle * -SH peut s'appliquer par exemple aux linkers L1-4 et L2i-23du Tableau II.
De même, dans le cas où ZbRb=
Figure imgf000021_0001
, on peut introduire un linker L pour lequel ZbRb=-O- allyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis déprotéger la fonction -COOH et
introduire
Figure imgf000021_0002
. La déprotection peut être réalisée par un traitement avec un catalyseur au palladium, par exemple Pd(PPh3)4 en présence d'une aminé « scavenger », par exemple la morpholine ; l'activation peut être réalisée avec le carbonate de N-N'-disuccinimidyle en présence d'une base, par exemple la DIPEA ou avec le NHS en présence d'un agent de couplage, par exemple le DCC. Cette transformation d'un groupe ZbRb à un autre groupe ZbRb (par ex. -O-allyle
•*
Figure imgf000021_0003
) peut s'appliquer pour obtenir d'autres groupes ZbRb, notamment ceux décrits plus haut.
Dans le cas où Ri représente un atome d'halogène et R2 un groupe acyle, on préfère préparer d'abord un composé de formule (II) pour lequel R2 représente un groupe -OH (une fois le linker introduit), et introduire ensuite le groupe acyle à l'aide du composé acylant correspondant. Les Schémas l' et 1 " illustrent de même la préparation d'un dérivé de cryptophycine comprenant un linker comprenant respectivement un groupe maléimido ou haloacétamido (L* représente un fragment d'un linker L tel que L= -L*-maléimido ou bien L= -L*-haloacétamido).
Figure imgf000021_0004
1- -Crypto
(Ma)
Schéma 1'
Figure imgf000021_0005
L'— Crypto
(Mb)
Schéma 1" Ces dérivés sont obtenus par réaction entre un dérivé de cryptophycine∞mprenant un linker L' comprenant un groupe amino ou thiol et un agent de modification permettant d'introduire respectivement un groupe maléimido ou haloacétamido.
Exemples de réactions entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL
• substitution nucléophile entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction aminé -NH- (un sel d'aminé peut également convenir) et G=-(CH2)nCI ou -(CH2)nOMs (voir par ex. Tableau II, PL1-4, PL7a, PL8-IO, PL21-23) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base, comme par exemple la TEA ou la DIPEA. Voir ex.1 , composé 7 ou ex.15, composé 48 ;
• acylation entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction halogénure de carbamoyle et G=-(CH2)nOH (voir par ex. Tableau II, PL5) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base aminé comme, par exemple la TEA.
Selon une variante, on peut également faire réagir un précurseur de linker PL porteur d'une fonction aminé -NH- et G=-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) obtenu à partir de G=-(CH2)nOH et de p-nitrophénylchloroformate (activation de l'alcool sous forme de carbonate) selon le schéma ci-dessous (Ri2= H ou (C1-C6)alkyle) :
-NHR12 + crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) -> crypto-(CH2)nO-C(=O)-NR12-
• l'activation d'un alcool sous forme de carbonate peut aussi être utilisée pour faire réagir un précurseur de linker porteur d'une fonction -OH et G=-(CH2)nNH2 ou -(CH2)nOH pour obtenir respectivement une fonction carbamate (-O-C(=O)-NH-) ou carbonate (-O-C(=O)-O-) selon les schémas respectifs suivants :
-O-C(=O)-O-(4-nitrophényle) + crypto-(CH2)nNH2 -> crypto-(CH2)nNH-C(=O)-O- -OH + crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) ^ crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-. (voir par ex. Tableau II, PL6a-6b, PL24-25)
• estérification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide -COOH et G=- (CH2)nOH (voir par ex. Tableau II, PL14b) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base aminé comme, par exemple la DMAP et d'un agent de couplage, par exemple le DCC ;
• amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide -COOH et G=- (CH2)nNH2 (voir par ex. Tableau II, PL14a) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ;
• amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction -NH2 et G=- (CH2)nCOOH (voir par ex. Tableau II, PL7c) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ; • cycloaddition 1 ,3-dipolaire (appelée aussi chimie « click ») entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction alcyne terminale et G=-(CH2)nN3 ou bien entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction azide et G=-(CH2)nN R12-CH2C=CH (voir par ex. Tableau II, PL15-18) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire en présence de Cu(I) comme catalyseur (voir à ce propos, sur la cycloaddition de Huisgen : Rostovtsev V.V., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599 ; Tornoe C.W., et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057- 3064) ;
• métathèse entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction éthylénique terminale et G-CH=CH2 (voir Tableau II, PL19, PL20) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence du catalyseur de Grubbs de 2eme génération (CAS N°246047-72- 3, voir à ce propos, Poeylaut-Palena A.A., et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 2024-2027.
A propos du linker L
Le linker L pourra être choisi parmi l'un des suivants :
-G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1 ,
-G' X (CR13R14MOCH2CH2VV-(CR15R16)U Q GCR1 ;
-G' X (CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1 ,
-G' X (CR13R14MOCH2CH2)y(CR17=CR18)(CR15R16)u Q GCR1 ,
-G' X (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl- méthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 , -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ,-G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1, -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1,
-G' X (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Q GCR1, -G' X (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-thiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12- (CR15R16)u Q GCR1 , -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ;
ou
-G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1 ,
-G" Y (CR13R14MOCH2CH2Vr-(CR15R16)U Q GCR1 ;
-G" Y (CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1 ,
-G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR18)(CR15R16)u Q GCR1 ,
-G" Y (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; - G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi; -G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-CO(CR15Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéιïdinyl-méthyl- NR12-CO(CRi5Ri6)U Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t~triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ,
-G" Y (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi, -G" Y (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi; -G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q CCRi ; G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-tιïazolyl-
Figure imgf000024_0001
G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ;
G" représente un groupe -(CH2)n- ;
n représente un entier allant de 1 à 6 ;
X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR12-, le groupe CO étant attaché à G' ;
Y représente un groupe -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, - NR12COO- ou -S(0)q-, l'atome O ou le groupe NR12 étant attachés à G" ;
Y' représente un groupe -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, -
NR12COO-, -S(0)q-, -CO-, -COO-, ou -CONR12- ;
R12, R'i2, R13, Ru, R15 et R16, R17 et R18 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ;
t, u et y représentent des nombres entiers pouvant aller de O (cas du groupe absent) à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ;
q représente un entier pouvant valoir O, 1 ou 2 ;
Q représente une liaison simple, un groupe (C1-C-ιo)alkylène ou un groupe (OCH2CH2),, i étant un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. i peut prendre chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5.
Dans le cas du linker de formule -G" Y (CRi3Ri4)I(OCH2CH2V Y'-(CRi5Ri6)u Q GCRi, si y vaut O (pas de groupe PEG) et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir O. Plus particulièrement, on exclut les linkers comprenant le motif terminal -NR12-C(=O)-O- (Y'=NR12 ; u=0 ; Q=liaison simple et GCRi=-C(=O)ZbRb). y représente un entier allant de 0 à 20, plus particulièrement de 1 à 20, plus particulièrement encore de 1 à 10, de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. y peut prendre chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5. Certains de ces linkers ont été décrits dans les demandes WO 07085930 et WO 09016516.
Le linker L pourra être choisi parmi l'un de ceux de formule (IV) :
Figure imgf000025_0001
dans laquelle :
• (AA)W représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ;
• w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ;
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;
• D représente l'un des motifs suivants :
Figure imgf000025_0002
pour lesquels :
R12 représente H ou un groupe (C1-CβJalkyle ;
R19, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome
d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1-C4)alkyle ;
T rattaché à (CH2)n représente NR12OU O ;
V1 représente O, S, NR12 ;
V2 représente CR22 ou N ;
V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N.
Un exemple de D2 est le suivant :
Figure imgf000025_0003
AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel, plus particulièrement choisi parmi : alanine (Ala), β-alanine, acide 2-amino-2-cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide γ-aminobutyrique, acide α,α-diméthyl γ-aminobutyrique, acide β,β-diméthyl γ- aminobutyrique, omithine (Om), citrulline (Cit).
L'enchaînement (AA)W a pour formule :
Figure imgf000026_0001
dans laquelle R23 représente un résidu d'un des acides aminés décrits ci- dessus. Des exemples d'enchaînements sont les suivants : Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu-Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala- Leu-Ala-Leu.
Les précurseurs de linkers sont ceux comprenant les motifs -OH correspondants :
Figure imgf000026_0002
WO 2005/082023 (voir notamment pages 61-64) décrit comment obtenir certains précurseurs de linkers. Les préparations des précurseurs de linkers PL25 et PL26 décrites ci-après peuvent également être utilisées pour obtenir d'autres précurseurs de linkers similaires comprenant un autre enchaînement (AA)W.
Le linker L pourra être choisi également parmi l'un de ceux décrits dans le Tableau II ou parmi les composés exemplifiés. Dans toutes les formules de linkers, NR12 ou NR'12 représente plus particulièrement NH ou NMe.
Préparation des composés de formule (III)
cas où G=-(CH,)nQH ou -CH=CH, Br-
P7 = co P8 = compose de fomule (III) avec
G-CH2CH2OH
Schéma 2
Figure imgf000027_0001
Pi est préparé selon renseignement des demandes WO 98/08505, WO 00/23429 ou WO 00/34252 ainsi que des publications suivantes Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 ; Salamonczyk G. M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 ou J. Med. Cftem.1999, 42 (14), 2588-2603 (incorporées ici par référence). Dans les pages 158-159 de « The isolation, characterization and development of a novel class of potent antimitotic macrocyclic depsipeptides : the cryptophycins », Chap.9, in « Anticancer agents from natural products », Taylor&Francis, CRC press book, isbn=0-8493-1863-7 sont donnés les schémas de synthèse permettant de préparer les différents fragments (A, B, C et D) de cryptophycine et d'aboutir à Pi. Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 décrit sur les schémas 1-6 la voie d'accès à l'un des dérivés de cryptophycine de la Figure 1 mais ces schémas peuvent s'appliquer à la préparation de Pi en utilisant les réactifs de départ idoines.
Pi permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine à l'aide des étapes détaillées ci-après : Etape (i) : ouverture du cycle époxyde de Pi en milieu acide permettant d'obtenir la fonction diol. On peut utiliser par exemple l'acide perchlorique concentré ;
Etape (ii) : coupure oxydante du diol à l'aide par exemple du periodate de sodium ;
Etape (iii) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat, par exemple un bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ;
Etape (iv) : réaction d'époxydation de Corey-Chaykovsky faisant intervenir un sel de sulfonium chiral, par exemple un triflate, en présence d'une base telle que par exemple KOH.
Etape (v) : déprotection de l'éther silylé en utilisant par exemple une solution de fluorure de tétrabutylammonium. Le bromure de 4-(triisopropylsiloxyméthyl)benzyltriphénylphosphonium est obtenu partir du 1- (bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N° 934667-38-6) dont la préparation à partir de 1 ,4-benzènediméthanol (CAS N° 589-29-7, produit commercial) est décrite par Potîer R. G , et ai., Organic Letters 2007, 9(7), 1187-1190. Les composés pour lesquels Rn représente un groupe (C1-C4)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir du diol correspondant qui est soit un produit commercial soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir du 1 ,4- benzènediméthanol.
A partir du 1-(bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N°135408-73-0), dont la préparation est décrite sur le schéma 4a de EP 0496548 ou en page 83 de l'article de Nevill CR.
Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991 , 7(1 ), 83-86, on peut obtenir le bromure de phosphonium correspondant. Les composés pour lesquels Rn représente un groupe (d-
C4)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir d'un composé équivalent au composé 1 décrit en page 83 de l'article de Nevill CR. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991 , 7(1 ), 83-86 qui est soit un produit commercial, soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir de l'acide p-tolylacétique.
Le trifluorométhanesulfonate de (1 R,4R,5R,6R)-4,7,7-triméthyl-6-(4-vinyl-benzyl)-6-thionia- bicyclo[3.2.1]octane utilisé à l'étape (iv) est obtenu à partir du (1 R,4R,5R)-isothiocineole (voir Aggarwal V. et al., JACS 2010, 732, 1828-1830) dont la préparation à partir du (R)-limonène (CAS N°95327-98-3, produit commercial) est décrite dans cette même référence.
Le bromure de triphényl(p-vinylbenzyl)phosphonium (CAS N°1 18766-51-1 ) est obtenu à partir du dérivé brome correspondant (voir Drefahl G., et al., Chem.Ber. 1961 , 94(8), 2002-2010) dont la préparation à partir de l'alcool 4-vinylbenzylique (CAS N°1074-61-9, produit commercial) est décrite dans l'article de Shimomura O. , ét al., Tetrahedron 2005, 61, 12160-12167.
A partir de P7 ou de P8 qui sont des composés de formule (III) pour lesquels G=-(CH2)nOH, on peut obtenir d'autres composés de formule (III) ayant d'autres groupes G.
Figure imgf000028_0001
Schéma 3
A partir du groupe G-CH2OH, on peut obtenir les groupes G-CH2CI ou -CH2N3 : - l'introduction de -Cl peut être réalisée en présence de CMS : voir ex.1 -composé 2 ;
- l'azidation peut être réalisée en présence du diphénylphosphorazide (PhO)2P(=O)N3 et d'une base, par exemple le DBU. Le Schéma 3 décrit ces réactions pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. cas où G-(CH7)XOOH
Figure imgf000029_0001
Schéma 4 A partir du groupe G-(CH2^OH, on peut obtenir le groupe G=-CH2COOH par une oxydation. Le Schéma 4 décrit une double oxydation : 1ere oxydation à l'aide du réactif de Dess-Martin (voir "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis"; Paquette L. A., Ed.; Wiley: Chichester, UK, 1995, Vol. 7, 4982-4987 ou Boeckman R.K. Jr., et al., JJ. "The Dess-Martin Periodinane" Org. Synth. 2004, 10, 696-702) suivie d'une 2ème oxydation de type Pinnick en présence de 2-méthyl- 2-butène (Pinnick H.W., Tetrahedron 1981 , 37, 2091-2096). Le Schéma 4 décrit ces réactions pour le cas d'un composé de départ pour lequel n=2 mais il peut s'appliquer également pour n>2.
Figure imgf000029_0002
Schéma 5
A partir du groupe G-CH2N3 dont la préparation est décrite dans le Schéma 3, on peut obtenir le groupe G -CH2NH2 à l'aide d'une réaction de réduction utilisant une phosphine comme le TCEP. A ce propos, voir : Faucher A.-M. et al., Synthetic Comm 2003, 33, 3503-3511 :
Figure imgf000029_0003
Schéma 5' Selon une variante, à partir du groupe G-CH2OH, on peut obtenir le groupe G-CH2NH2 à l'aide d'une réaction de Mitsunobu utilisant la triphénylphosphine et le DEAD. A ce propos, voir : Mitsunobu O., Synthesis 1981 , 1-28 ; Hughes D. L., Org. Reactions 1992, 42, 335-656 ; Hughes D. L., Org. Prep. 1996, 28, 127-164. Les Schémas 5 et 5' décrivent le cas n=1 mais ils peuvent s'appliquer également pour n>1.
Cas où G≈-fCHpïn-NRip-CHpC≡CH
A partir du groupe G— (CH2)nCI, on peut obtenir le groupe G=- (CH2)n-NR12-CH2-C≡CH à l'aide d'une substitution nucléophile utilisant le composé de formule NHR12-CH2-C=CH (Ri2=H : propargylamine ; Ri2=(C1-C6)alkyle : préparé selon Mock W. L., et al., J. Org. Chem. 1989, 54 (22), 5302-8).
Cas où G=-(CH?)n-SH
Figure imgf000030_0001
Schéma 6
A partir du groupe G=- (CH2)nCI, on peut obtenir le groupe G=-(CH2)nSH par une fonctionnalisation directe à l'aide de triméthylsilylthiolate de tétrabutylammonium préparé in situ à partir de fluorure de tétrabutylammonium et d'hexaméthyldisilathiane selon Hu J. et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 4959-4961 (voir ex.8). Le Schéma 6 décrit cette réaction pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. Au cours de cette réaction, il peut se former le dimère intermédiaire de formule :
Figure imgf000030_0002
Cas où G=-ALK-SH
Figure imgf000030_0003
Schéma 7 P3 permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine selon le Schéma 7 :
Etape (i) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat, par exemple un bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ;
Etape (ii) : couplage de Kumada utilisant un réactif de Grignard adéquat, par exemple un bromure d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé, en présence d'un catalyseur au palladium ou au nickel (voir par exemple Organic Letters 2009, 11, 5686-5689 ou Synthesis 2009, -/47, 2408-2412).
Les étapes (iii) à (v) sont décrites sur le Schéma 2 et l'étape (vi) sur le Schéma 6.
Le bromure de (4-bromobenzyl)triphénylphosphonium est un produit commercial (CAS N° 51044- 13-4). Les bromures d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé peuvent être préparés à partir des bromoalcools correspondants par protection de la fonction alcool avec le chlorosilane adéquat puis par formation de l'organomagnésien en présence de magnésium dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF (voir par exemple Organic Letters 2005, 7, 183-186). Les bromoalcools, linéaires ou ramifiés comportant 1 à 6 atomes de carbone, sont commercialement disponibles, comme le 3-bromo-1-propanol (CAS N° 627-18-9) ou le 1-bromo- 2-propanol (CAS N° 19686-73-8) ou peuvent être préparés à partir des bromoesters ou bromocétones correspondantes selon des méthodes décrites dans la littérature. Le chlorosilane peut, par exemple, être le tert-butyldiméthylchlorosilane (CAS N°18162-48-6) ou le triisopropyl- chlorosilane (CAS N°13154-24-0).
Cas où G=-(CH2)n-maléimido
Figure imgf000031_0001
Schéma 8
En complément du schéma l' qui décrit une méthode de préparation de dérivés de cryptophycine comprenant un motif maléimido, à partir du groupe G-CH2OH, on peut obtenir le groupe
Figure imgf000031_0002
par une réaction de Mitsunobu en présence de triphéhylphosphine et de DEAD selon Matuszak N. et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 7410-7420. Le Schéma 8 décrit cette réaction pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. Les Schémas 1-8 ci-dessus sont données pour un linker en position para mais pourraient s'appliquer identiquement pour les positions ortho ou meta. De même, ils sont donnés pour un dérivé de cryptophycine mais pourraient s'appliquer à la préparation d'autres dérivés de formule (II), notamment D1-D8.
Plus particulièrement, dans le cas de la C-52, on pourra utiliser les composés suivants dont les préparations sont décrites dans Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 ou dans WO 9808505 :
5
9 9
Figure imgf000032_0001
D'autre part, à partir du composé 31 b pour lequel G-CH2OH, il est possible d'obtenir les composés pour lesquels G-CH2CI ou -CH2N3 :
• G-CH2CI : voir exemple 1 , composé 2 ;
• G-CH2N3 : la conversion de -CH2OH en -CH2N3 peut être réalisée dans un solvant polaire aprotique en présence de diphénylphosphorazide et d'une base comme le DBU, voir exemple 19, composé 60.
• G=- CH2maléimido : la conversion de -CH2OH en -CH2maléimido peut être réalisée dans un solvant polaire aprotique en présence de maléimide, de triphénylphosphine et de DEAD. L'enseignement de J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 pourrait s'appliquer à d'autres dérivés de cryptophycine comprenant d'autres substituants Rβ-Rg. Préparation des précurseurs de linker PL
PL pourra être l'un des suivants :
Za S ALK N
PL1 ^NH préparé selon le schéma ci-dessous :
Figure imgf000032_0002
Etape (i) : activation de l'acide à l'aide de NHS ; l'activation est réalisée à TA en présence d'un agent de couplage comme par exemple le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3- éthylcarbodiimide en solution dans un solvant aprotique anhydre comme le DCM. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 4.
Etape (ii) : amidification avec la pipéridine N-Boc ; le couplage peptidique est réalisé dans un solvant polaire aprotique à TA en présence d'une base, qui peut être une aminé tertiaire comme la TEA ou la DIPEA. Le solvant peut être le DMF. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 5.
Etape (iii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 6.
L'acide de départ, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogène par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. Voir aussi US 2719170.
PL2
Figure imgf000033_0001
préparé selon le schéma ci-dessous :
Figure imgf000033_0002
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme par exemple le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 17.
Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 18.
L'aldéhyde de départ, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, peut être commercial ou préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogène convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.
PL3 ZaS ALK-NHR 12 préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où Ri?=H
Figure imgf000033_0003
Etape (i) : formation d'une oxime ; l'aldéhyde précédemment décrit est mis en solution dans un solvant polaire protique comme l'éthanol puis traité par le chlorhydrate de O- méthylhydroxylamine au reflux en présence d'une base comme l'hydroxyde de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 11.
Etape (ii) : réduction de l'oxime ; l'oxime est réduite par un traitement au reflux avec une solution de borane diméthylsulfure dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 12. cas où R-ι?≠H
Figure imgf000034_0002
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'un agent réducteur comme par exemple le triacétoxyborohydrure de sodium.
PL4
Figure imgf000034_0003
préparé selon le schéma ci-dessous
Figure imgf000034_0001
Ce linker est préparé de façon semblable à ce qui est présenté pour PL2.
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 17. Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 18.
Figure imgf000034_0004
Etape (i) : protection de l'aminé ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'aminé avec le dicarbonate de di-fert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.
Etape (ii) : transformation de l'alcool en bromure ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le THF par traitement de la fonction alcool avec CBr4 en présence d'une phosphine par exemple la triphénylphosphine ; voir à ce propos Appel R. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1975, 14, 801-81 1 ou Desmaris N., ét al., Tetrahedron Letters 2003, 44(41 ), 7589-7591.
Etape (iii) : substitution du bromure par le thioacétate ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DMF en utilisant comme nucléophile le thioacétate de potassium.
Etape (iv) : formation de la liaison disulfure ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire protique anhydre comme le méthanol en présence d'une base comme par exemple le méthanolate de sodium et d'un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure.
Selon une variante :
Etape (v) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.
Etape (vi) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme NaOH.
Etape (vii) : activation du thiol sous forme de pyridyl-disulfure ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire protique comme l'éthanol par traitement avec un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure en présence d'un acide comme l'acide acétique.
Etape (viii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane).
Etape (ix) : activation de l'aminé sous forme de chlorure de carbamoyle ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le diphosgène en présence d'une base comme la TEA. pU RbZb-OC-ALK- (OCH2CH2), -OH préparé se|on |e schéma cj.dessous ;
cas où ALK=CH9CH?
voie A:
Figure imgf000035_0001
voie B:
Figure imgf000035_0002
Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium.
Etape (iii) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
cas où ALK≠CHpCH?
X
Figure imgf000035_0003
Etape (iv) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par ex. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., ét al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. pL7 RbZbOC-ALK- (OCH2CH2),-NHR12 préparé se|on ^ schémas ci.desS0US !
Figure imgf000036_0001
cas où R-i? =H
Figure imgf000036_0002
cas où R-i? ≠H
Figure imgf000036_0003
cas où ALK≠CHpCH?
cas où R17=H
Figure imgf000036_0004
Figure imgf000036_0005
Tr-^NHR12
Etape (i) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 14, composé 42.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 14, composé 43.
Etape (iii) : alkylation de l'atome d'azote ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 15, composé 46.
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium comme décrit dans WO 2007/127440 ;
Etape (v) : saponification de l'ester ; la réaction est réalisée par réaction de l'ester avec de la lithine en présence d'eau.
Etape (vi) : protection de l'aminé ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'aminé avec le dicarbonate de di-fert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.
Les amino-PEG-acides sont commercialement disponibles pour i=3,5,6,10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant.
Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction aminé par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF3.
PL8
Figure imgf000037_0002
préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH9CH 2
Figure imgf000037_0001
Etape (i) : déprotection du composé de départ à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 50.
Etape (ii) : protection de la fonction acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 51.
Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.
Etape (iv) : réaction entre la fonction mésylate et la fonction aminé du composé H ,
Figure imgf000038_0004
(alkylation) ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'une base comme la TEA. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 52.
cas où ALK≠ CHpCH?
<") ^ ^^ /^O X ALK^/^OH
Figure imgf000038_0001
Etape (v) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par ex. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i= 3 à 12.
PL9
Figure imgf000038_0003
préparé selon le schéma ci-dessous :
Figure imgf000038_0002
Etape (i) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme l'acétonitrile avec un halogénoalkylcarboxylate d'allyle comme le bromoacétate d'allyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 13, composé 38.
Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 13, composé 39.
L'halogénoalkylcarboxylate d'allyle peut être obtenu à partir de l'alcool allylique et de l'halogénure d'halogénoacyle correspondant et commercialement disponible pour ALK=-(CH2)i-6- (comme le bromure de bromoacétyle ou le chlorure de 4-butanoyle).
PL10 préparé selon les schémas ci-dessous :
Figure imgf000039_0004
Figure imgf000039_0001
cas où ALK≠ CHpCH?
Figure imgf000039_0002
Etape (i) : ouverture de l'anhydride cyclique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydride comme le DCM en présence d'une base comme la TEA.
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.
Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane).
Etape (iv) : couplage peptique ; la réaction entre l'acide carboxylique et l'aminé est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'un agent de couplage comme le système DIC / HOBt.
Etape (v) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.
Les diacides monoprotégés sous forme d'ester méthylique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH2)i-6- (comme l'ester monométhylique de l'acide 1 ,6-hexanedioïque).
PL11
Figure imgf000039_0005
préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH9CH?
Figure imgf000039_0003
Etape (i) : formation de l'amide et activation de l'acide ; les deux étapes sont réalisées successivement dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : réaction entre la fonction aminé et l'halogénoacétate de N-hydroxysuccinimidyle puis addition in situ d'un agent de couplage comme le DIC. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 17, composé 56.
Figure imgf000040_0001
Etape (ii) : protections de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique et de l'aminé sous forme de trifluoroacétamide ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : protection de l'acide par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane en présence de méthanol puis protection de l'aminé par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA.
Etape (iii) : alkylation de l'aminé et saponification de l'ester ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF : alkylation de l'aminé par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle R12HaI puis addition de lithine et d'eau. Etape (i) : suite à l'étape (iii), on reprend les réactions de l'étape (i) pour le cas R12=H. cas où ALK≠CHpCH?
cas où R12=H
HO ΛALK- OV J^^ OJ Tr^ NH,
Figure imgf000040_0002
cas où R12≠H
Figure imgf000040_0003
Z=Br ou I
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium (cf. WO 2007/127440) ;
Etape (v) : clivage sélectif de l'imine par hydrogénation en présence de palladium sur charbon (cf. Wessjohann, L. ét al., Synthesis 1989, 5, 359-63) ; Etape (vi) : protection de l'aminé par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base∞mme la TEA.
Les amino-PEG-acides sont∞mmercialement disponibles pour i=3, 5, 6, 10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant.
Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction aminé par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF3.
Figure imgf000041_0005
PL12 z= Br ou ' préparé selon les schémas ci-dessous :
Figure imgf000041_0001
Voie A :
Figure imgf000041_0002
Voie B :
V- Η:z
Figure imgf000041_0003
cas où ALK≠ CH7CH7
r O ^\ ^>^z
Figure imgf000041_0004
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.
Etape (ii) : échange mésylate / halogène ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire aprotique comme l'acétone avec un halogénure de sodium comme l'iodure de sodium.
Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (iv) : activation de l'acide ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC. Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. L'intermédiare formé est hydrolyse sélectivement à pH 5 en hydroxy ester.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.
PL13 préparé se|on \es schémas ci-dessous :
Figure imgf000042_0005
Figure imgf000042_0001
Voie A :
Figure imgf000042_0002
Voie B :
Figure imgf000042_0003
cas où ALK≠CH?CH2
Figure imgf000042_0004
Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction hydroxy peut se former. Il est clivé lors de l'étape suivante (ii).
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane.
Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.
Etape (iv) : formation du thiol libre et saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium.
Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Le linker avec n = 8 (l'acide 3-[2-mercaptoéthoxy-hepta-(éthylèneoxy)]propionique) est disponible commercialement. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10- trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol
PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.
PL14
Figure imgf000043_0003
préparé selon le schéma ci-dessous :
cas où ALK=CH7CH7
Figure imgf000043_0001
cas où ALK≠CHpCH?
Figure imgf000043_0002
Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction alcool éventuellement présente sur la structure peut se former. Ce trifluoroacétate est clivé lors de l'étape suivante (iii).
Etape (iii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane.
Etape (iv) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.
Etape (v) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. ,
PL15 prépare selon les schémas ci-dessous :
Figure imgf000044_0005
Figure imgf000044_0001
Voie A :
Figure imgf000044_0002
Voie B :
Figure imgf000044_0003
cas ou ALK≠CH ?CH?
Figure imgf000044_0004
Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure d'alkynyle comme le bromure de propargyle ou le 4-bromo-1-butyne. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 63. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 65.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 64.
Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.
PL16 RbZbOc-ALK-(OCH2CH2),' 3 préparé selon les schémas ci-dessous
Figure imgf000045_0001
cas où ALK≠CHpCH?
Figure imgf000045_0002
Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Etape (iv) : élongation de la chaîne hydroxy azido PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate de l'hydroxy azido PEG. Les alcools azido PEG sont commercialement disponibles ou peuvent être préparés à partir des diols PEG correspondants commercialement disponibles pour i=3 à 12.
Figure imgf000046_0003
17 préparé selon le schéma ci-dessous :
Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Les acides porteurs d'un groupement acétylénique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH2)m- avec m=1 à 10 (comme l'acide 3-butynoïque).
PL •18 Rbzb-co-ALK' 'préparé selon le schéma ci-dessous
Figure imgf000046_0005
Etape (i) : substitution nucléophile de l'halogénure par l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétone en présence d'azoture de sodium.
Etape (ii) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Les esters méthyliques porteurs d'un motif halogénoalkyle sont commercialement disponibles pour ALK = -(CH2Jm- avec m=1 à 6 (comme le bromoacétate de méthyle).
PL19
Figure imgf000046_0006
prépare selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH7CH?
voie A :
Figure imgf000046_0001
voie B :
Figure imgf000046_0002
cas où ALK≠CH?CH? |
Figure imgf000047_0001
Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure d'alkènyle comme le bromure d'allyle ou le 4-bromo-1 -butène.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.
PL20
Figure imgf000047_0004
préparé selon le schéma ci-dessous :
Figure imgf000047_0002
Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Les acides porteurs d'un groupement éthylénique sont commercialement disponibles pour ALK=-
(CH2Jm- avec m= 1 à 10 (comme l'acide 3-butènoïque).
PL21 préparé se|on |es schémas ci_desS0US :
Figure imgf000047_0003
cas où Ri ? et R'-i 2= H Boc Boc
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000048_0003
,2,BBoo i,NR'<9Boc
Figure imgf000048_0004
Figure imgf000048_0005
I"1" j.N 'R' Boo
Figure imgf000048_0006
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde0 d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé
23.
Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 24.
5 Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 26.
Etape (iv) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le0 triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 27.
Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 29.
Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle.
Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.
Etape (viii) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'aldéhyde ZaSS-ALK- CHO, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, est commercial ou peut être préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogène convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.
Figure imgf000049_0002
préparé se|on ,es schémas ci_desS0US :
Figure imgf000049_0001
cas où Ri ?=H et R'i 2≠ H
Figure imgf000050_0001
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé
23.
Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 24.
Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 26.
Etape (iv) : couplage peptidique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le diméthylformamide en présence d'agents de couplage comme le système N, N'- diisopropylcarbodiimide/1-hydroxybenzotriazole et d'une base comme la TEA.
Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 7, composé 32.
Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle.
Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.
Etape (viii) : alkylation de l'aminé par amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur.
Etape (ix) : alkylation du groupe NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'acide carboxylique
ZaS-ALK-C02H, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogène par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.
PL23 ZaS-(CH2CH2O)1-CH2CH2-NHR12 préparé selon les schémas ci-dessous
Figure imgf000051_0001
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.
Etape (ii) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium.
Etape (iii) : protection du thiol ; la réaction est réalisée dans un mélange de solvants polaires comme un mélange éthanol/eau avec un réactif comportant une fonction méthanethiosulfonate comme le méthyl-méthanethiosulfonate en présence d'une base comme le carbonate de sodium.
Etape (iv) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (v) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge∞mme un halogénure d'alkyle.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101.
Figure imgf000052_0001
Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC.
Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange diméthoxyéthane/THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium.
Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme l'EEDQ.
Etape (iv) : déprotection de l'aminé Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.
Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le chlorhydrate d'EDCI.
Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.
Les diacides monoprotégés sous forme d'ester allylique sont commercialement disponibles pour n=2 (succinate de monoallyle) ou peuvent être préparés par transestérification des monoesters méthyliques ou tert-butyliques qui sont commercialement disponibles pour n = 2 à 6.
Figure imgf000053_0001
Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC.
Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DME/THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium.
Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme l'EEDQ.
Etape (iv) : déprotection de l'aminé Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.
Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.
Les diacides PEG monoprotégés sous forme allyle sont préparés selon la description de préparation du linker L14.
Figure imgf000053_0002
Le bromoacétate et l'iodoacétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle sont des produits commerciaux dont les numéros CAS sont respectivement 42014-51-7 et 39028-27-8. Tableau
κ>
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
Procédé de préparation du conjugué
Le conjugué est obtenu par le procédé consistant à :
(i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse de l'agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine de formule (II) ;
(ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés.
Plus particulièrement, on ne sépare à l'étape (ii) le conjugué de l'étape (i) que du dérivé de cryptophycine n'ayant pas réagi et des agrégats qui se seraient formés et on laisse dans la solution l'agent de ciblage qui n'aurait éventuellement pas réagi.
La mise en contact a pour fonction de laisser réagir les groupes chimiques GCR1 et GCR2 afin d'assurer l'attachement du dérivé de cryptophycine sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente ; de préférence,
• lorsque GCR1 représente -SZa : on modifie l'agent de ciblage à l'aide d'un agent de modification de façon à introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 adaptés, notamment ceux décrits dans la 2eme colonne du Tableau I :
o des groupes chimiques disulfures dans le cas où GCR1 représente -SH ;
o des groupes chimiques thiol dans le cas où GCR1 représente -SZa avec Za≠H ; o des groupes chimiques maléimido ou iodoacétamido dans le cas où GCR1 représente -SH ;
Dans le cas d'un anticorps (MAb), on trouve les formules des conjugués dans la 4eme colonne du Tableau I ;
• lorsque GCR1 représente -C(=O)-ZbRb : la réaction a lieu préférentiellement sur les fonctions amino de l'agent de ciblage, notamment les groupes ε-amino portés par les chaînes latérales des résidues lysine (Lys) d'un anticorps. Dans le cas d'un anticorps (MAb), on obtient dans ce cas un conjugué de formule : MAb-[N H-C(=O)-L*-Crypto]d avec L* = fragment d'un linker L comprenant GCR1=-C(=O)-ZbRb et tel que L= -L*C(=O)-ZbRb ;
• en présence d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) avec G= -(CH2)nY, l'agent de ciblage comprend des groupes -SH lorsque Y= -Cl, des groupes -C≡CH lorsque Y= -N3 ou des groupes acide carboxylique lorsque Y= -OH ou -NH2 ;
• en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type maléimido ou haloacétamido, l'agent de ciblage comprend des groupes chimiques thiols.
On entend par « agrégats » les associations qui peuvent se former entre deux agents de ciblage ou plus, les agents de ciblage ayant été modifiés ou non par conjugaison. Les agrégats sont susceptibles de se former sous l'influence d'un grand nombre de paramètres tels qu'une concentration élevée en agent de ciblage dans la solution, le pH de la solution, des forces de cisaillement élevées, le nombre de dimères greffés et leur caractère hydrophobe, la température (voir les références citées dans l'introduction de J. Membrane Sci. 2008, 318, 31 1-316), l'influence de certains d'entre eux n'étant parfois pas éclaircie avec précision. Dans le cas des protéines ou des anticorps, on pourra se reporter à AAPS Journal, « Protein Aggregation and Bioprocessing » 2006, 8(3), E572-E579. La teneur en agrégats peut être déterminée à l'aide de techniques connues telles que la SEC (voir à ce propos, Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480). La solution aqueuse de l'agent de ciblage peut être tamponnée à l'aide par exemple de tampons tels que par exemple le phosphate de potassium ou l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2- éthanesulfonique (tampon HEPES) ou un mélange de tampons tel que le tampon A décrit plus loin. Le tampon dépend de la nature de l'agent de ciblage. Le dérivé de cryptophycine est mis en solution dans un solvant organique polaire, par exemple le DMSO ou la DMA.
La réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40°C. La durée de la réaction peut varier entre 1 à 24 h. La réaction entre l'anticorps et le dérivé de cryptophycine peut être suivie par SEC avec un détecteur réfractométrique et/ou ultraviolet afin d'en déterminer l'état d'avancement. Si le taux de substitution est insuffisant, on peut laisser réagir plus longtemps et/ou ajouter du dérivé de cryptophycine. On pourra se reporter à la méthode générale donnée dans la partie exemples pour plus de détails sur des conditions particulières. Des modes particuliers sont décrits dans les exemples 9, 10, 1 1 , 25, 26 ou 27.
L'homme du métier dispose de différentes techniques chromatographiques pour la séparation de l'étape (ii) : le conjugué peut être purifié par exemple par chromatographie d'exclusion stérique (SEC), par chromatographie d'adsorption (comme l'échangeuse d'ions, IEC), par chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), par chromatographie d'affinité, par chromatographie sur des supports mixtes comme l'hydroxyapatite céramique ou par HPLC. La purification par dialyse ou diafiltration peut également être utilisée.
Après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué peut subir une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. On obtient donc à l'issue de ces étapes le conjugué en solution aqueuse.
Anticorps
L'anticorps (voir à ce propos, Janeway et al. « Immunobiology », 5eme édition, 2001 , Garland Publishing, New York) pourra être choisi parmi ceux décrits notamment dans WO 04043344, WO 08010101 , WO 08047242, WO 05009369 (anti CA6) ou WO 2010014812. L'anticorps peut être éventuellement modifié à l'aide d'un agent de modification afin de favoriser l'attachement du dérivé de cryptophycine (voir ci-dessus). L'anticorps peut être notamment monoclonal, polyclonal ou multispécifique. Il peut s'agir aussi d'un fragment d'anticorps. Il peut s'agir aussi d'un anticorps murin, humain, humanisé ou chimérique. Conjugué
Un conjugué comprend généralement de l'ordre de l'ordre de 1 à 10 dérivés de cryptophycine attachés de façon covalente à l'agent de ciblage (il s'agit du taux de greffage ou "drug-to- antibody ratio" ou "DAR" en Anglais). Ce nombre varie en fonction de la nature de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine ainsi que des conditions opératoires utilisées dans le procédé de conjugaison (par exemple nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine par rapport à l'agent de ciblage, temps de réaction, nature du solvant et de l'éventuel cosolvant). La mise en contact de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine conduit à un mélange comprenant plusieurs conjugués se distinguant individuellement les uns des autres par des DAR différents ; éventuellement l'agent de ciblage n'ayant pas réagi ; éventuellement des agrégats. Le DAR qui est déterminé sur la solution finale correspond donc à un DAR moyen.
Dans le cas où l'agent de ciblage est un anticorps, la spectroscopie UV peut être une méthode utilisée pour déterminer le DAR. Cette méthode s'inspire de celle présentée dans Antony S.
Dimitrov (ed), LLC, 2009, « Therapeutic Antibodies and Protocols », vol. 525, 445, Springer Science. Elle consiste à mesurer l'absorbance d'une solution de conjugué après l'étape de séparation (ii) à deux longueurs d'onde notées λ1 et λ2. On utilise les coefficients d'extinction molaires suivants de l'anticorps nu et du dérivé de cryptophycine mesurés préalablement à la conjugaison.
Les absorbances de la solution de conjugué à λ1 et λ2 (Aλ1) et (Aλ2) sont mesurées soit sur le pic correspondant du spectre SEC (ceci permet de calculer un "DAR(SEC)") ou en utilisant un spectrophotomètre UV classique (ceci permet de calculer un "DAR(UV)"). Les absorbances peuvent être exprimées sous la forme :
Aλ1 = (CD x εD λ1) + (cA x εA λi)
Aλ2 = (cD X εD λ2) + (cA X εA λ2)
équations pour lesquelles :
• CD et CA désignent respectivement les concentrations dans la solution de la partie du conjugué relative au dérivé de cryptophycine et la partie du conjugué relative à l'anticorps ;
• εD λi et εD λ2 désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires du dérivé de cryptophycine avant conjugaison aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2, coefficients mesurés sur les composés de formule (II) de type SZa avec Za=-SMe ou de type -C(=O)- ZbRb avec ZbRb= OMe ou OCH2-CH=CH2 ; • εA λi et εA %2 désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires de l'anticorps nu aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2.
On entend par anticorps nu, l'anticorps auquel n'est attaché aucun dérivé de cryptophycine, c'est-à-dire l'anticorps avant l'étape de conjugaison.
La résolution de ces deux équations conduit à :
CD = [(εA λi x Aλ2) - (εA χ2 x Aλ1 )] / [(εD λ2 x εA λ1 ) - (εA λ2 x εD λ1 )]
cA = [Aλi - (cD x εD λ1)] / εA λ1
Le DAR moyen correspond alors à cD / cA. Dans le cas des dérivés de cryptophycine, on peut considérer la longueur d'onde λ1= 280 nm et selon la nature du dérivé de cryptophycine, λ2 est choisie dans la gamme de longueurs d'onde spécifiques 246 nm - 252 nm. Le DAR(UV) est de préférence supérieur à 0,5, plus particulièrement compris entre 1 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7.
Le conjugué peut être utilisé en tant qu'anticancéreux. De par la présence de l'agent de ciblage, le conjugué est rendu très sélectif vis-à-vis des cellules tumorales plutôt que des cellules saines.
Ceci permet de diriger le dérivé de cryptophycine dans un environnement proche de celles-ci ou directement à l'intérieur de celles-ci (à ce propos, voir les publications suivantes qui décrivent l'utilisation de conjugués d'anticorps monoclonaux dans le traitement de cancers : « Antibody- drug conjugates for cancer therapy » Carter PJ. , et al., Cancer J. 2008, 14, 154-169 ;
« Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs » Chari R., Ace. Chem. Res.
2008, 41, 98-107). Il est possible de traiter des cancers solides ou liquides. Le conjugué peut être utilisé seul ou en combinaison avec au moins un autre anticancéreux.
Le conjugué est formulé sous forme d'une solution aqueuse tamponnée à une concentration généralement comprise entre 1 et 10 mg/ml. Cette solution peut être injectée sous forme de perfusion telle qu'elle ou bien être rediluée pour former une solution de perfusion.
[Exemples]
Méthodes analytiques utilisées
Chromatographie liquide haute pression - Spectrométrie de masse (LCMS)
Méthode A1
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne XBridge C-is 2,5 μm (3x50 mm) à 70°C avec un débit de 0,9 ml/min, un gradient d'élution (7 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 100% B en 5,3 min ; 5,5 min : 100% B ; 6,3 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Méthode A2
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH Ci8 1 ,7 μm (2,1 x50 mm) à 50°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 0,8 min ; 1 ,2 min : 100% B ; 1 ,85 min : 100% B ; 1 ,95 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif.
Méthode A3
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH Ciβ 1 ,7 μm (2,1 x50 mm) à 70°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau / 0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile / 0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 1 min ; 1 ,3 min : 100% B ; 1 ,45 min : 100% B ; 1 ,75 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif.
Méthode A4
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex Kinetex Ciβ 100A 2,6 μm (3χ50mm) à 45°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (6 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : 6% B : 0,8 min ; de 6% à 100% B en 4,1 min ; 4,8 min : 100% B ; 5,0-6,0 min : 6% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif.
Méthode A5
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex Kinetex Ciβ 2,6 μm (3χ1000mm) à 50°C avec un débit de 0,8 ml/min, un gradient d'élution (8 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : 4% B : 0,15 min ; de 4% à 100% B en 6,85 min ; 7,1 min : 100% B ; 7,4-8,2 min : 4% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Spectrométrie de masse (MS)
Les spectres ont été réalisés par introduction directe sur un appareil WATERS GCTof (introduction directe sans LC).
Chromatographie d'exclusion stérique - Spectrométrie de masse haute résolution (SEC-HRMS) L'analyse peut nécessiter une étape préalable de déglycosylation du conjugué. Celle-ci est réalisée en ajoutant à la solution de conjugué 2% en volume d'une solution d'enzyme PNGase F (préparée en complétant à 100 ml un flacon de 100 unités de lyophilisât d'enzyme N-glycanase avec de l'eau milliQ). La solution est homogénéisée à l'aide du vortex et incubée à 37°C pendant 19 h. L'échantillon dégly∞sylé est prêt à être analysé par SEC-HRMS. L'analyse chromatographique est réalisée sur un appareil Agilent HP1100 et une colonne Waters Biosuite 250 HR SEC 4 μm (4,6x300 mm) à 30°C avec un débit de 0,4 ml/min et une élution isocratique de (A) formiate d'ammonium 25 mM pH=7 / (B) acétonitrile 70/30 de 15 min. La spectrométrie de masse est réalisée sur un appareil Waters QTOF II avec une ionisation électrospray en mode positif. Les spectres de masse sont déconvolués avec le logiciel Waters MaxEnti .
Chromatographie d'exclusion stérique (SEC HPLC)
L'analyse est réalisée sur un appareil Merck Lachrom Elite HPLC avec un détecteur spectrophotométrique L2455 DAD et une colonne Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL 5μm (7,8x300 mm) avec un débit de 0,5 ml/min et une élution isocratique de 30 min avec un tampon pH=7 contenant 0,2 M de KCI, 0,052 M de KH2PO4, 0,107 M de K2HPO4 et 20% en volume d'isopropanol. Résonance magnétique nucléaire 1H (RMN)
Les spectres RMN 1H ont été réalisés sur un spectromètre Bruker Avance soit DRX-300, DRX- 400, DRX-500 ou DMX-600. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm.
Méthode générale utilisée pour préparer les conjugués dans le cas des dérivés de crvptophvcine comprenant un linker L terminé par -SZ3
Méthode en deux étapes successives
1èrθ étape
L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin d'introduire à sa surface des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H1 1 dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl (désigné par tampon A) est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et 10 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie pendant 2 h à TA. Le mélange est déposé sur une colonne de filtration sur gel (matrice Sephadex™ G25, GE Healthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA. L'anticorps modifié est élue avec le tampon HEPES pH=8, collecté puis dosé par spectrométrie UV afin de déterminer la concentration en anticorps de l'échantillon ainsi que le nombre de groupements pyridyldisulfures. Un prélèvement de l'anticorps modifié est traité avec le dithiothréitol afin de réduire la liaison disulfure, la pyridine-2-thione libérée est dosée par spectrométrie (coefficients d'extinction : ε343 nm : 8080 M-1cm-1, ε28o nm : 5100 M-1crτï1 pour la pyridine-2-thione, et ε28o nm : 208380 M-1cm-1 pour l'anticorps). En moyenne, de 3 à 6 groupements pyridyldisulfures sont greffés par molécule d'anticorps.
2èmθ étape La solution d'anticorps modifié de la 1ere étape est diluée dans le tampon aqueux pH=8 décrit ci- dessus puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (5 éq.) de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20% ; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par rapport au nombre de molécules de pyridyldisulfures introduites lors de la première étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice Sephadex™ G25 (colonnes Nap-5, - 10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen de cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.
Méthode en deux étapes « one-pot »
L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin d'introduire à sa surface des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H1 1 dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl est diluée avec le tampon phosphate pH=6,5 et une solution aq. d'HEPES 1 N de telle sorte que la proportion finale de tampon phosphate initial pH=6,5 et d'HEPES soit de 96/4 afin d'obtenir un pH≈7,5-8. Cette solution d'anticorps est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et 10 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie pendant 2 h à TA. La solution d'anticorps ainsi modifié est directement diluée avec un mélange 96/4 de tampon phosphate pH=6,5 et d'HEPES puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (4 éq.) dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20% ; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par rapport au nombre d'équivalents d'ester activé NHS introduits lors de la première étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice Sephadex™ G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen de cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.
Méthode générale utilisée pour préparer les conjugués dans le cas de dérivés de crvptophvcine comprenant un linker terminé par -C(=O)ZhRh
Une solution d'anticorps hu2H11 dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA ou étant composé d'un mélange 96/4 d'un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl / HEPES 1 N est traitée avec un excès d'une solution dans le DMA du dérivé de cryptophycine de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20%. La réaction est poursuivie pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage de cytotoxique sur la population d'anticorps monomériques. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice SephadexTM G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10 ou colonne Hiprep 26/10 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le taux de greffage. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.
Les méthodes décrites pour le cas de l'anticorps hu2H11 pourraient s'appliquer aussi de façon semblable à d'autres anticorps, ainsi qu'à d'autres agents de ciblage.
Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone
Figure imgf000067_0001
Composé 2 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-16-{(S)-1-[(R)-3-(4-chloro- méthyl-phényO-oxiranylj-éthylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS- ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000067_0002
1 2
Le composé 1 (30 mg ; 42,9 μmol, préparé selon Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DMF anhydre (2 ml) et le mélange est refroidi à 0°C avant ajout de la TEA (107 μmol) puis du CMS (64,6 μmol). Après 15 min, le bain est retiré et l'agitation est poursuivie 12 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (2 ml) et la phase organique est lavée par de l'eau (2x1 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (1 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (1 ml). La phase organique est séchée sur MgSO4 et, après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 2 est obtenu sous forme d'une huile incolore qui cristallise (25 mg ; 81 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 - 0,83 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,04 - 1 ,07 (m, 3 H) ; 1 ,14 (s, 3 H) ; 1 ,29 - 1 ,36 (m, 1 H) ; 1 ,54 - 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,80 - 1 ,87 (m, 1 H) ; 2,24 - 2,33 (m, 1 H) ; 2,63 - 2,73 (m, 2 H) ; 2,96 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,28 - 3,32 (m, 1 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,93 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=11 ,3, 8,0, 3,6 Hz, 1 H) ; 4,78 (s, 2 H) ; 4,93 (dd, J=9,6, 3,6 Hz, 1 H) ; 5,13 (dd, J=10,8, 5,1 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,8 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=15,0, 11 ,2, 3,7 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8.5, 1 ,9 Hz, 1 H) ; 7.23 (d, J=9,6 Hz, 1 H) ; 7,29 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,47 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 713 [M + H]+ ; m/z = 715 [M - H]" ; tR = 5, 17 min.
Composé 4 : 4-Méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000068_0001
3 4
A une solution, purgée à l'argon, du composé 3 (3,05 g, 15,7 mmol, préparé selon WO 2007085930) dans le DCM (30 ml) sont successivement ajoutés le NHS (17,3 mmol) et le chlorure d'EDCI (17,3 mmol). Le mélange est agité 3 h à TA avant d'être lavé avec un tampon phosphate pH=6 (2x30 ml) puis avec une solution saturée de NaCl (30 ml), séché sur MgSO4 et concentré à sec. L'huile ambrée obtenue qui cristallise est lavée par un mélange heptane/AcOEt
75/25 et filtrée sur un verre fritte pour donner le composé 4 sous la forme d'un solide blanc (2,08 g, 45%). Le filtrat est concentré à sec et le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 50/50 à 0/100. Les fractions contenant le produit attendu sont concentrées à sec et reprises dans de l'éther isopropylique (5 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritte pour donner le composé 4 attendu (1 g, 22%). RMN 1H (400
MHz, DMSO-d6): 1 ,29 (s, 6 H) ; 1 ,92 à 1 ,98 (m, 2 H) ; 2,41 (s, 3 H) ; 2,72 à 2,78 (m, 2 H) ; 2,81 (s, 4 H). LCMS (A4) : El, m/z = 291 [M + H]+.
Composé 5 : 4-(4-Méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-piperazine-1-carboxylate de fert-butyle
Figure imgf000068_0002
Dans un tube Wheatton sont chargés le composé 4 (200 mg, 686 μmol), la 1-Boc-pipérazine (686 μmol), la TEA (755 μmol) et le DMF (1 ,6 ml). Le mélange est agité à TA pendant la nuit puis dilué avec de TAcOEt (5 ml), lavé avec de l'eau (2x5 ml), séché sur MgSO4 et concentré à sec. Le brut est repris dans de l'éther isopropylique (3 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritte pour donner le composé 5 (213 g, 86%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,41 (s, 9 H) ; 1 ,73 à 1 ,87
(m, 2 H) ; 2,34 à 2,41 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 3,23 à 3,36 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,39 à 3,45 (m, 4 H). LCMS (A2) : ES m/z = 363 [M + H]+ ; m/z = 307 [M + H - C4H8]" ; tR = 1 ,08 min.
Composé 6 : Chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one
Figure imgf000069_0001
A une solution du composé 5 (213 mg, 588 μmol) dans le dioxane (4,4 ml) est ajoutée une solution HCl 4M dans le dioxane (4,4 ml). L'agitation est poursuivie 4 h à TA. Le mélange est filtré sur verre fritte, le solide obtenu est rincé avec du dioxane (2 ml) puis de l'éther isopropylique (2 ml) pour donner le composé 6 (132 mg, 75%) sous la forme d'un solide crème. RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,73 à 1 ,85 (m, 2 H) ; 2,37 à 2,45 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3H) ; 2,98 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,62 à 3,73 (m, 4H) ; 9,39 (m étalé, 2 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 263 [M + H]+ ; tR = 2,40 min.
Composé 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1-
((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000069_0002
Le composé 1 (20,3 mg ; 29,0 μmol) est placé en solution dans le DMF anhydre (0,77 ml) et la TEA (72,6 μmol) puis le CMS (43,6 μmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé et la TEA (58,0 μmol) puis le chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin- 1-yl-pentan-1-one 6 (34,8 μmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant d'être dilué par de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (2 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 98/2. Un solide blanc, 7, est obtenu (5,7 mg ; 21 %). CCM (DCM 90/MeOH 10): Rf=0,6 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 0,75 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,28 - 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,52 - 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,76 - 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,64 - 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34 (m, 6 H) ; 3,44 (br. s., 4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 - 5,15 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,2, 11 ,3, 3,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34 (m, 5 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H) ; LCMS (A1 ) : ES m/z = 943 [M + H]+ ; m/z = 941 [M - H]" ; tR = 4,03 min.
Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1- ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]- 1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000070_0001
Le produit 7 (9,6 mg ; 10,2 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1 ,2 ml) / eau (1 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (25,4 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 5 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (1 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit final, Ex1 , est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,5 mg ; 71 %). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,27 - 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,56 - 1 ,64 (m, 2 H) ; 1 ,73 - 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,26 - 2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 - 3,36 (m, 1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,0, 11 ,4, 3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8,3, 1 ,5 Hz, 1 H) ; 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; LCMS (A2) : ES m/z = 897 [M + H]+ ; m/z = 895 [M - H]" ; tR = 0,97 min.
Exemple 2 : (E)-(3S,6R,1 OR, 16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 - ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-6-méthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000070_0002
Composé 9 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-16-{(S)-1-[(R)-3-(4-chloro- méthyl-phényO-oxiranyll-éthylJ-S-isobutyl-δ-méthyl-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-ène- 2,5,9, 12-tétraone
Figure imgf000070_0003
â a
Le composé 8 (49 mg ; 71 ,4 μmol, qui peut être préparé selon Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem.
2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (5 ml) et le mélange est refroidi à 0°C avant ajout de la DIPEA (428 μmol) puis du CMS (214 μmol). Le mélange est laissé revenir à TA et l'agitation est poursuivie 40 h à TA. Le mélange est hydrolyse avec 5 ml d'eau, la phase aq. extraite par du DCM (3*5 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aq. saturée de NaHCOs (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/MeOH 100/0 à 90/10. Le composé 9 est obtenu sous forme d'un solide blanc (37 mg ; 79%). RMN 1H (500 MHz, DMSO- d6): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,54 (m, 1 H) ; 1 ,60 (m, 1 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,78 (m, 3 H) ; 2,97 à 3,05 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,92 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et 8,2 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,77 (s, 2 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,5 et 5,3 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,7 et 9,1 Hz, 1 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,45 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 703 [M + H]+ ; m/z = 701 [M - H]" ; m/z = 747 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,17 min. Composé 10 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6-méthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000071_0001
Le composé 9 (36,6 mg ; 52 μmol) est placé en solution dans l'acétonitrile anhydre (3 ml) puis sont successivement ajoutés la DIPEA (260 μmol) et le composé 6 (156 μmol). Le milieu réactionnel est agité 20 h à TA puis hydrolyse par addition de 4 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec de TAcOEt (3*4 ml), les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aq. saturée de NaHCO3 (5 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (5 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 10 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (39 mg ; 80%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,53 (m, 1 H) ; 1 ,60 (m, 1 H) ; 1 ,75 à 1 ,84 (m, 3 H) ; 2,26 à 2,37 (m, 7 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,61 à 2,77 (m, 3 H) ; 2,96 à 3,05 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,44 (m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=4,0 et 8,1 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,6 et 5,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,6 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 1 1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,6 et 9,2 Hz, 1 H) ; 7,27 (d, J=8,4 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,4 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 929 [M + H]+ ; m/z = 927 [M - H]" ; m/z = 973 [M - H + HCO2H]- pic de base ; tR = 0,99 min. Exemple 2 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6-méthyl-16-[(S)-1-
((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-
1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000072_0001
Le produit 10 (34 mg ; 36,6 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (4,3 ml) / eau (3,6 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (146 μmol) est ensuite additionné, le mélange devient incolore et est agité 2 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (20 ml). La phase aq. est extraite par 2x20 ml d'AcOEt, les phases organiques sont rassemblées et lavées avec une solution saturée de NaCl (20 ml). Après séchage sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/MeOH 98/2 à 90/10. Le composé Ex2 est obtenu sous forme d'un solide blanc (28,2 mg ; 87%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,79 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,27 (m, 1 H) ; 1 ,31 (s, 6 H) ; 1 ,53 (m, 1 H) ; 1 ,59 (m, 1 H) ; 1 ,77 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,24 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,34 à 2,44 (m, 4 H) ; 2,62 à 2,76 (m, 4 H) ; 2,98 à 3,04 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,46 (m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,4 et 8,3 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,88 (dd, J=3,7 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=2,0 et 5,3 et 11 ,1 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=2,0 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,1 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,9 et 9,3 Hz, 1 H) ; 7,27 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 883 [M + H]+ ; m/z = 881 [M - H]" ; tR = 0,92 min. Exemple 3 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)- 3-{4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4- dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone
Figure imgf000072_0002
Composé 11 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propionaldéhyde O-méthyl-oxime
Figure imgf000072_0003
5 g (33,3 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans 50 ml d'éthanol, sous atmosphère inerte. Sont successivement ajoutés une suspension de 5,56 g (66,54 mmol) de chlorure d'O-méthylhydroxylamine dans 50 ml d'éthanol puis 6,65 ml (66,54 mmol) de NaOH. Le mélange, blanc trouble, est chauffé au reflux pendant la nuit. Après retour à TA, le mélange est versé dans 500 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec l'AcOEt (3x175 ml), les phases organiques rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (200 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 11 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (5,89 g, 32,9 mmol).
Composé 12 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamine
Figure imgf000073_0001
Dans un ballon purgé à l'argon, sont successivement introduits, à TA, 1 ,78 g (9,9 mmol) d'éther d'oxime 11 , 19 ml de THF anhydre et 99,5 ml d'une solution 2M de borane méthylsulfure dans le THF. Le mélange est chauffé 16 h au reflux. La réaction est ensuite arrêtée, le mélange laissé revenir à TA avant que 100 ml de MeOH soient ajoutés goutte à goutte prudemment, à 0°C tant que la mousse se forme puis à TA. Le mélange est évaporé sous PR pour donner environ 2,8 g d'une huile jaune qui est reprise dans 30 ml d'une solution HCl 5 à 6N dans l'isopropanol. Le mélange est porté au reflux 1 h puis laissé à TA pendant la nuit. Après évaporation sous PR, le résidu obtenu est repris avec 80 ml de HCl 1 N puis extrait avec le diéthyle éther (3*20 ml). La phase aq. est traitée avec de l'ammoniaque aqueux à 30% jusqu'à obtention d'un pH de 12,5-13, ie 12 ml (phase aq. violet pâle) puis à nouveau extraite avec 3*20 ml d'éther. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées à sec sous PR pour donner 760 mg de brut. Ce résidu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 12 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (301 mg, 20%). LCMS (A2) : ES m/z = 152 [M + H]+ ; tR = 0,27 min. Composé 13 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)- 3-{4-[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-méthyl]-phenyl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone
Figure imgf000073_0002
A une solution, purgée à l'argon, de 25 mg (35 μmol) du composé 2 dans 3,1 ml de DMF anhydre sont successivement ajoutés, à TA, 9,8 μl (70 μmol) de TEA et 6,3 mg (42 μmol) du composé 12. L'agitation est poursuivie sous agitation à 40°C. Après 72 h de réaction, il reste du composé 2 de départ, sont alors ajoutés 9,8 μl (70 μmol) de TEA et 6,3 mg (42 μmol) de l'aminé 12. Après 72h supplémentaires à 40°C, il reste encore du composé 2 : 6,3 mg (42 μmol) de l'aminé 12 sont ajoutés et l'agitation poursuivie à 40°C. Un jour plus tard, la réaction est complète. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 2x10 ml d'eau, 10 ml d'une solution saturée de NaHCOs et 10 ml d'une solution saturée de NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, celle- ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 30 mg de brut. Ce résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 93/7. Le composé 13 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (23,3 mg, 81 %). CCM (DCM 90/ MeOH 10) : Rf=0,55 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 à 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,07 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,27 à 1 ,33 (m, 7 H) ; 1 ,52 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H) ; 2,06 (s large, 1 H) ; 2,25 à 2,34 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 3 H) ; 2,57 (s, 2 H) ; 2,66 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,97 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,33 à 3,38 (m, 1 H) ; 3,75 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=5,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,82 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,30 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,35 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 832 [M + H]+ ; m/z = 830 [M - H]" ; tR = 0,96 min.
Exemple 3 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa- 8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone
Figure imgf000074_0001
Le produit 13 (10,6 mg ; 12,8 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1 ,5 ml) / eau (1 ,26 ml). Le TCEP (9,1 mg, 31 ,9 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 2 h 30 à TA. Le mélange est dilué dans 15 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (5 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 92/8. Le composé Ex3 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,4 mg ; 63%). CCM (DCM 90/MeOH 10) : Rf=0,47 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,80 à 0,86 (m, 6 H) ; 1 ,06 (s, 3 H) ; 1 ,1 1 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,18 (s, 3 H) ; 1 ,31 à 1 ,38 (m, 7 H) ; 1 ,57 à 1 ,67 (m, 2 H) ; 1 ,87 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H) ; 2,29 à 2,38 (m, 1 H) ; 2,56 (s, 2 H) ; 2,70 à 2,80 (m, 2 H) ; 3,00 à 3,1 1 (m, 3 H) ; 3,39 à 3,43 (m, 1 H) ; 3,82 (s, 2 H) ; 3,87 (s, 3 H) ; 3,92 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,31 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,97 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,17 (dd, J=5,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,86 (dd, J=1 ,4 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,54 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,1 1 (d, J=8,7 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=1 ,9 et 8,7 Hz, 1 H) ; 7,27 (dd, J=2,7 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 7,34 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,42 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 786 [M + H]+ ; m/z = 784 [M - Hf ; tR = 0,92 min. Exemple 4 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[({2-mercapto-2-méthyl-propyl}-méthyl-amino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone
Figure imgf000075_0001
Composé 14 : Méthyl-[2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-prop-(E)-ylidène]-amine
Figure imgf000075_0002
1 g (6,66 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans 10 ml de THF anhydre, sous atmosphère inerte. La solution de méthylamine 2M dans le THF (33,3 ml, 66,6 mmol) est ajoutée puis le mélange est agité 5 h à TA. Il est dilué dans 50 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (30 ml), une solution saturée de NaCl (30 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 14 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (1 ,01 g, 93%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-d): 1 ,46 (s, 6 H) ; 2,36 (s, 3 H) ; 3,32 (s, 3 H) ; 7,52 (s, 1 H).
Composé 15 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamine
Figure imgf000075_0003
Une solution du composé 14 (1 ,01 g, 6,185 mmol) dans 30 ml de THF est purgée à l'argon et refroidie à 0°C avant que soit ajouté, à 0°C, 1 ,44 g (6,80 mmol) de triacétoxyborohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie 15 h à TA: il reste de l'imine de départ ; 1 ,44 g (6,80 mmol) de triacétoxyborohydrure de sodium et 354 μl (6,185 mmol) d'acide acétique sont ajoutés à 0°C puis l'agitation poursuivie à TA pendant 3 h. Le mélange est dilué dans 50 ml d'AcOEt et lavé avec de l'eau (50 ml). Le pH de la phase aq. est ajusté à 12 environ par ajout de 14 ml d'une solution aq. de soude 1 N puis elle est extraite avec de l'éther diéthylique (3χ50 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (50 ml), séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 15 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (695 mg, 68%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,47 (m étalé, 1 H) ; 2,31 (s, 3 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 166 [M + H]+ ; tR = 0,28 min. Composé 16 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1-[(2R,3R)- 3-(4-{[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-méthyl-amino]-méthyl}-phényl)-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000076_0001
Le∞mposé 16 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 15 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30.
Exemple 4 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-
(4-{[(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-méthyl-amino]-méthyl}-phényl)-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-
1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000076_0002
L'exemple 4 peut être obtenu en appliquant la méthode décrite pour la préparation de l'exemple 6 au composé 16.
Exemple 5 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone
Figure imgf000076_0003
Composé 17 : 4-(2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine-1-carboxylate de fert-butyle
Figure imgf000076_0004
A une solution, purgée à l'argon, de 1-Boc-pipérazine (1 ,0 g, 5,37 mmol) dans le THF anhydre (20 ml) sont ajoutés le 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol). Le mélange est agité 20 min à TA puis un nouvel ajout de 2-(méthyldithio)- isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol) est réalisé. L'agitation est poursuivie 2 h puis 12 ml d'éthanol sont ajoutés et l'agitation poursuivie 5 min. Sont ajoutés du cyanoborohydrure de sodium (5,37 mmol), le mélange est agité 1 h avant que soient ajoutées 5,37 mmoles supplémentaires de cyanoborohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie 1 h. Le mélange est concentré à sec puis repris dans TAcOEt. De l'eau est ajoutée entraînant la formation d'un précipité qui est filtré sur verre fritte, rincé avec de TAcOEt et de l'eau. Le solide obtenu est solubilisé dans une solution aq. HCl 1 N (50 ml), le milieu est neutralisé avec une solution aq. NaOH 5N puis extrait au DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Le composé 17 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (650 mg ; 40%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,42 (s, 2H) ; 2,44 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,27 (m partiellement masqué, 4 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 321 [M + H]+ ; m/z = 265 pic de base ; tR = 3,02 min.
Composé 18 : Chlorhydrate de 1-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine
Figure imgf000077_0001
A une solution du composé 17 (322 mg, 1 ,01 mmol) dans le dioxane (13 ml) est ajoutée une solution HCl 4M dans le dioxane (5 ml). L'agitation est poursuivie 16 h à TA. Le mélange est filtré sur verre fritte, le solide obtenu est rincé avec du dioxane pour donner le composé 18 (231 mg, 90%) sous la forme d'une poudre blanche. RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,31 (s large, 6 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 2,59 à 3,38 (m très étalé, 10 H) ; 8,78 (m étalé, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 221 [M + H]+ ; tR = 0,46 min.
Composé 19 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[4-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000077_0002
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (15,02 mg, 20,93 μmol) dans le DMF anhydre (0,9 ml) est ajoutée une solution du composé 18 (25,12 μmol) et de TEA (52,3 μmol) dans le DMF (1 ml). Le mélange est agité à 40°C sous argon. Après 24 h, 25,12 μmol du composé 18 et 31 ,4 μmol de TEA sont ajoutés. Après 24 h supplémentaires à 40°C, la réaction est terminée. Le mélange est dilué avec de TAcOEt (6 ml) et lavée avec de l'eau (2x6 ml), une solution saturée de NaHCO3 (6 ml) et une solution saturée de NaCl (6 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, celle-ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 46 mg de brut. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 19 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (5,2 mg, 28%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,27 à 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,85 (m, 1 H) ; 2,23 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,37 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,41 (s, 2 H) ; 2,53 à 2,56 (m, 4 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et 7,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,8 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,07 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 901 [M + H]+ ; m/z = 451 pic de base ; tR = 4,33 min.
Exemple 5 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone
Figure imgf000078_0001
Le produit 19 (5,7 mg ; 6,3 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (0,8 ml) / eau (0,5 ml). Le TCEP (4,54 mg, 15,83 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 1 h à TA. Le mélange est dilué dans 7 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (7 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé Ex5 est obtenu sous forme d'un solide blanc (2,95 mg ; 55%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,29 à 1 ,34 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 2 H) ; 2,39 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,57 à 2,62 (m, 4 H) ; 2,65 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,96 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m, partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,12 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,2 Hz, 1 H); 6,49 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,36 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 855 [M + H]+ ; m/z = 428 [M + 2H]2+ pic de base ; tR = 4, 13 min.
Exemple 6 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000078_0002
Composé 20 : Toluène-4-sulfonate de 2-{2-[2-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyle
Figure imgf000079_0001
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 5 g (25,74 mmol) de tetraéthylèneglycol dans 68,7 ml de DCM sont successivement ajoutés, par portion afin de maintenir une agitation convenable, 8,95 g (38,61 mmol) d'oxyde d'argent et 5,40 g (28,31 mmol) de chlorure de tosyle. 855 mg (5,15 mmol) de Kl sont ajoutés par petites portions afin de maintenir la température du mélange inférieure à 5°C. L'agitation est poursuivie 1 h en maintenant la température inférieure à 5°C. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel, le résidu est rincé au DCM puis le filtrat concentré à sec sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé 20 est obtenu sous forme d'une huile incolore (5,4 g, 60%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,43 (s, 3 H) ; 3,40 (m, 2 H) ; 3,44 à 3,52 (m, 10 H) ; 3,58 (m, 2 H) ; 4,11 (m, 2 H) ; 4,53 (t, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,48 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,78 (d, J=8,3 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 349 [M + H]+ ; m/z = 371 [M + Na]+ ; tR = 0,69 min. Composé 21 : 1-Azido-3,6-9-trioxaundecane-11-ol
Figure imgf000079_0002
A une solution de 5,4 g (15,51 mmol) du composé 20 dans 40,6 ml d'acétonitrile anhydre sont ajoutés 1 ,34 g (20,63 mmol) deNaN3 puis le mélange est chauffé 6 h 30 au reflux. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Il reste du composé 20 de départ : le brut est repris dans 25 ml d'acétonitrile anhydre et 230 mg (3,5 mmol) de NaN3 sont ajoutés. Le mélange est chauffé au reflux pendant 5 h. Après retour à TA, il est filtré sur Clarcel et concentré à sec sous PR pour donner le composé 21 sous la forme d'une huile jaune pâle (3,37 g, 99%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 3,37 à 3,43 (m, 4 H) ; 3,45 à 3,58 (m, 10 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 4,54 (t, J=5,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 220 [M + H]+ ; m/z = 242 [M + Na]+ pic de base ; tR = 0,39 min.
Composé 22 : N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthoxy-éthanol
Figure imgf000079_0003
A une solution, inertée à l'argon, de 320 mg de palladium sur charbon 10% dans 5 ml d'AcOEt est ajoutée une solution de 3,25 g (14,8 mmol) du composé 21 , 6,46 g (29,6 mmol) de dicarbonate de fert-butyle et 4,13 ml (29,6 mmol) de TEA dans 45 ml d'AcOEt. La réaction est réalisée 17 h à 30°C sous une pression d'hydrogène de 2 bars. Après retour à TA et PA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 22 est obtenu sous forme d'une huile incolore (2,92 g, 67%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,42 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,53 (m, 10 H) ; 4,54 (t large, J=5,1 Hz, 1 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 316 [M + Na]+ ; m/z = 194 pic de base ; tR = 2,81 min.
Composé 23 : Toluène-4-sulfonate de 2-{2-[2-(2-tert-butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxy]- éthoxy}-éthyle
Figure imgf000080_0001
A une solution, purgée à l'argon, de 3,06 g (10,42 mmol) du composé 22 dans 20 ml de DCM sont ajoutés 2,53 ml (31 ,26 mmol) de pyridine. Le mélange est refroidi à 0°C puis une solution de 2,98 g (15,63 mmol) de chlorure de tosyle dans 10 ml de DCM est ajoutée goutte à goutte. L'agitation est poursuivie 15 h à TA. Le mélange est dilué dans 20 ml de DCM, lavé avec une solution saturée de NaHCOβ (30 ml), de l'eau (2x30 ml), une solution saturée de NaCl (30 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 23 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (4,38 g, 94%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 3,05 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,46 (m, 8 H) ; 3,58 (m, 2 H) ; 4,10 (m, 2 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz, 1 H) ; 7,48 (d, J=7,8 Hz, 2 H) ; 7,78 (d, J=7,8 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 448 [M + H]+ ; m/z = 470 [M + Na]+ ; m/z = 348 pic de base ; m/z = 492 [M - H + HCO2H]- ; tR = 1 ,00 min.
Composé 24 : (2-{2-[2-(2-Azido-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-carbamate de fert-butyle
Figure imgf000080_0002
A une solution de 4,38 g (9,79 mmol) du composé 23 dans 25 ml d'acétonitrile sont ajoutés 846 mg (13,02 mmol) d'azoture de sodium puis le mélange est chauffé 6 h au reflux. Il reste du composé de départ en proportion importante : après retour à TA, 1 ,7 g (26,13 mmol) sont ajoutés au mélange. L'agitation est maintenue 24 h au reflux. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 24 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (2,16 g, 69%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,34 à 3,43 (m, 4 H) ; 3,46 à 3,58 (m, 8 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 341 [M + Na]+ ; tR = 0,81 min. Composé 25 : (2-{2-[2-(2-Azido-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-méthyl-carbamate de tert-butyle
Figure imgf000081_0001
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 2,06 g (6,47 mmol) du composé 24 dans
25 ml de THF anhydre sont successivement ajoutés, à 0°C, 854 mg (21 ,35 mmol) de NaH 60% en dispersion dans une huile minérale (par portion) et 886 μl (14,23 mmol) d'iodure de méthyle.
L'agitation est poursuivie 1 h à 0°C puis 16 h à TA. Le mélange est filtré sur Clarcel, lavé avec du
THF et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange de DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé 25 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (1 ,67 g, 78%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t partiellement masqué,J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,38 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,56 (m, 10 H) ;
3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H).
Composé 26 : (2-{2-[2-(2-Amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-méthyl-carbamate de fert-butyle
Figure imgf000081_0002
A une solution, purgée à l'argon, de 1 ,66 g (4,99 mmol) du composé 25 dans 20 ml de THF sont successivement ajoutés 1 ,31 g (4,994 mmol) de triphénylphosphine et 108 μl (5,99 mmol) d'eau. L'agitation est poursuivie 25h30 puis le mélange est concentré à sec et purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 26 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (1 ,23 g, 80%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,65 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,56 (m, 10 H). LCMS (A2) : ES m/z = 307 [M + H]+ ; tR = 0,49 min.
Composé 27 : Méthyl-[2-(2-{2-[2-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-éthoxy]-éthoxy}- éthoxy)-éthyl]-carbamate de fert-butyle
Figure imgf000081_0003
A une solution, purgée à l'argon, de 131 mg (426 μmol) du composé 26 dans 3 ml de DCM sont successivement ajoutés 64 mg (426 μmol) de 2-méthyldithio-isobutyraldéhyde, 126 mg (596 μmol) de triacétoxyborohydrure de sodium et 24,4 μl (426 μmol) d'acide acétique. L'agitation est poursuivie 6 h à TA sous Ar, la réaction est quenchée par addition de 1 ml d'une solution aq. de soude 1 N puis le mélange est extrait avec 10 ml d'éther diéthylique. Après concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/isopropanol 90/10 qui ne permet pas de séparer l'attendu de l'aminé résiduelle de départ. Le produit obtenu est à nouveau purifié par chromatographie sur phase inverse RP18 en utilisant comme éluant un mélange eau/acétonitrile 95/5 à 5/95. le composé 27 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (67 mg, 36%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 1 ,58 (m étalé, 1 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,59 (s, 2 H) ; 2,68 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,46 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,54 (m, 12 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 441 [M + H]+ ; tR = 3,29 min. Composé 28 : Méthyl-{2-[2-(2-{2-[méthyl-(2-méhyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-amino]-éthoxy}- éthoxy)-éthoxy]-éthyl}-carbamate de fert-butyle
Figure imgf000082_0001
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 65 mg (148 μmol) du composé 27 dans 1 ml de DCM sont successivement ajoutés 19,5 mg (487 μmol) de NaH 60% en dispersion dans une huile minérale et 20 μl (325 μmol) d'iodure de méthyle. L'agitation est poursuivie 45 min à 0°C puis 72 h à TA. Le mélange est filtré sur Clarcel puis concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluent un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé 28 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (43 mg, 64%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,54 (m, 2 H) ; 2,61 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,42 à 3,54 (m, 14 H). LCMS (A2) : ES m/z = 455 [M + H]+ ; tR = 0,77 min.
Composé 29 : Méthyl-(2-{2-[2-(2-méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-(2-méthyl-2-méthyl- disulfanyl-propyl)-amine
Figure imgf000082_0002
A une solution de 43 mg (95 μmol) du composé 28 dans 1 ,5 ml de DCM sont ajoutés 351 μl de TFA. L'agitation est poursuivie 5 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 29 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (25 mg, 75%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,75 (m étalé, 1 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H) ; 2,57 à 2,64 (m, 4 H) ; 3,44 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,46 à 3,55 (m, 10 H). LCMS (A2) : ES m/z = 355 [M + H]+ ; tR = 0,30 min.
Composé 30 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000082_0003
A une solution, purgée à l'argon, de 15,3 mg (21 ,3 μmol) de composé 2 dans 1 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 18,6 μl (106,6 μmol) de DIPEA et une solution de 22,7 mg (64 μmol) du composé 29 dans 1 ml d'acétonitrile anhydre. L'agitation est poursuivie 24 h sous Ar à 40°C. Après retour à TA, le mélange est dilué avec 7 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (2 x 3 ml), une solution saturée de NaHCOs (3 ml), une solution saturée de NaCl (3 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 90/10. Le composé 30 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (14,6 mg, 66%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,31 (s, 3 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,45 à 2,54 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,60 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,63 à 2,75 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,44 à 3,54 (m, 14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,9 et 8,3 et 11 ,7 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 , 5 et 5,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,5 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,5 et 1 1 ,5 et 15,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,33 (m, 3 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1035 [M + H]+ ; m/z = 518 [M + 2H]2+ pic de base ; tR = 0,86 min.
Exemple 6 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000083_0001
A une solution de 10,9 mg (10,5 μmol) du composé 30 dans 1 ,24 ml d'éthanol est ajoutée une solution de 12,06 mg (42,1 μmol) de TCEP dans 1 ,04 ml d'eau. L'agitation est poursuivie 4 h à TA. Le mélange est dilué avec 6 ml d'AcOEt, lavé avec un mélange 1/1 eau/NH4Clsat (6 ml), une solution saturée de NaCl (6 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utlisant un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé Ex6 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (7,36 mg, 71 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,34 (s, 3 H) ; 2,44 (s, 2 H) ; 2,51 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,60 (s, 1 H) ; 2,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,66 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,37 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,45 à 3,55 (m, 14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,6 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,32 (m, 3 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 989 [M + H]+ ; m/z = 495 [M + 2H]2+ pic de base ; tR = 3,24 min.
Exemple 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-({2-[2-(2-{4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone
H
.-CL /N^ I ^) O^ O„ HN^
HS O
y N N O
/ H
Figure imgf000084_0001
Composé 31 : Méthyl-[2-(2-{2-[2-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamino)-éthoxy]-éthoxy}- éthoxy)-éthyl]-carbamate de tert-butyle
Figure imgf000084_0003
270 mg (649 μmol) du composé 4, 199 mg (649 μmol) du composé 26 sont dissous dans 1 ,5 ml de DMF puis 100 μl (714 μmol) de TEA sont ajoutés au mélange. L'agitation est poursuivie 16 h à TA. Le mélange est dilué avec 10 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (2x5 ml), une solution saturée de NaCl (5 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 31 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (251 mg, 80%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 1 ,79 (m, 2 H) ; 2,16 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,18 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,54 (m, 12 H) ; 7,88 (t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + H]+ ; m/z = 505 [M + Na]+ ; m/z = 527 [M - H + HCO2H]- ; tR = 1 ,04 min.
Composé 32 : N-(2-{2-[2-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-4-méthyl-4-méthyl- disulfanyl-pentamide
Figure imgf000084_0002
O 31 O 32 °
A une solution de 251 mg (520 μmol) du composé 31 dans 8 ml de DCM sont ajoutés 1 ,93 ml (26 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 3 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut est dissout dans le minimum de DCM puis plusieurs entraînements au toluène sont réalisés. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 32 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (159 mg, 80%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-Cy6): 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,79 (m, 2 H) ; 2,15 (m, 2 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,58 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,18 (q, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,44 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,47 à 3,54 (m, 8 H) ; 7,89 (t large, J=5,7 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 383 [M + H]+ ; tR = 2,68 min. Exemple 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000085_0001
L'exemple 7 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 32 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30 puis par réduction du disulfure en appliquant la méthode décrite pour la préparation de l'exemple 6.
Exemple 8 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1 -[(2R,3R)- 3-(4-mercaptométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone
Figure imgf000085_0002
Composé 33 : dimère de l'exemple 8
Figure imgf000085_0003
Le composé 2 (24,5 mg ; 34,1 μmol) est placé en solution dans le THF anhydre (2,5 ml) et le mélange est refroidi à -10°C avant ajout d'hexaméthyldisilathiane (44,3 μmol) puis d'une solution de fluorure de tétrabutylammonium 1 M dans le THF (40,9 μmol). Le mélange est ramené à TA et l'agitation est poursuivie 1 h30. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (5 ml) et la phase organique est lavée par une solution aq. saturée de NH4CI (5 ml). La phase aq. est extraite par de TAcOEt (2x5 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl (5 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Un solide blanc, le composé 33, est obtenu (19 mg ; 78%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 0,78 (m, 12 H) ; 1 ,00 (s, 6 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 6 H) ; 1 ,11 (s, 6 H) ; 1 ,30 (m, 2 H) ; 1 ,49 - 1 ,63 (m, 4 H) ; 1 ,82 (m, 2 H) ; 2,26 (m, 2 H) ; 2,63 - 2,72 (m, 4 H) ; 2,93 - 3,05 (m, 6 H) ; 3,25 - 3,37 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,81 (s, 6 H) ; 3,82 (s, 4 H) ; 3,89 (d, J=2,0 Hz, 2 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7, 8,0 et 1 1 ,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7, 9,6 Hz, 2 H) ; 5,10 (ddd, J=1 ,3, 5,3 et 10,8 Hz, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,3, 15,3 Hz, 2 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7, 10,8 et 15,3 Hz, 2 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,17 (dd, J=2,0, 8,6 Hz, 2 H) ; 7,22 (dd, J=2,5, 9,3 Hz, 2 H) ; 7,26 - 7,32 (m, 10 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1427 [M + H]+ ; tR = 1 ,31 min.
Exemple 8 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3- (4-mercaptométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13- ène-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000086_0001
Le composé 33 (11 mg ; 7,7 μmol) est placé en solution dans le méthanol (8,8 ml). Le TCEP (76,7 μmol) en solution dans 2,2 ml d'eau est ensuite additionné et le mélange est agité 2 h à TA. Le mélange est dilué dans 20 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (20 ml). La phase aq. est extraite par de l'AcOEt (2x15 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl (15 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Un solide blanc, Ex8, est obtenu (4,7 mg ; 31 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 0,79 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,50 - 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,62 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,84 (t large, J=6,5 Hz, 1 H) ; 2,93 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,73 (d large, J=6,5 Hz, 2 H) ; 3,81 (s., 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7, 8,0 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,6, 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,3, 5,3 et 1 1 ,4 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,3, 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,4, 11 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9, 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,3, 9,5 Hz, 1 H) ; 7,25 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 2 H) ; 7,35 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 715 [M + H]+ ; m/z = 713 [M - H]-; tR = 1 ,18 min. Exemple 9 : hu2H11 -SPDB-ExI
Figure imgf000086_0002
Selon la méthode générale en deux étapes, 10,4 mg (0,071 μmol, 1 ,174 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 8,86 mg/ml sont traités par 7 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,16 mg, 0,496 μmol) en solution dans 34,2 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 8 mg/ml dans le mélange. Après purification, on obtient 2,2 ml d'anticorps hu2H11 modifiés à une concentration de 4,28 mg/ml (9,42 mg, 91 %) avec en moyenne 4,68 molécules de pyridyldisulfures par anticorps. 1 ,68 ml (7,2 mg, 0,049 μmol) d'anticorps hu2H11 modifié sont traités avec 1 ,03 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4- mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Ex1 , 1 ,148 μmol) en solution dans 101 ,2 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 10% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl. On obtient alors 1 ,5 ml de conjugué Ex9 à une concentration de 1 ,1 mg/ml avec en moyenne 3 dérivés de cryptophycine par anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,9%. Exemple 10 : hu2H11-SPDB-Ex2
Figure imgf000087_0001
Selon la méthode générale en une étape, 13,5 mg (0,092 μmol, 1 ,318 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,18 mg, 0,551 μmol) en solution dans 38,4 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,333 ml (12,0 mg, 0,081 μmol) du mélange d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,760 ml de tampon pH≈7,5-8, 543 μl de DMA puis 1 ,73 mg de (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-6-méthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Ex2, 1 ,958 μmol) en solution dans 182 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 1 ,5 ml de conjugué Ex10 à une concentration de 2,83 mg/ml avec en moyenne 3,7 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 98,8%.
Exemple 11 : hu2H11-SPDB-Ex5
Figure imgf000087_0002
Selon la méthode générale en une étape, 9,45 mg (0,064 μmol, 0,923 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,13 mg, 0,398 μmol) en solution dans 26,88 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,0 ml (9,0 mg, 0,061 μmol) du milieu réactionnel d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,45 ml de tampon pH≈ 7,5-8, 265 μl de DMA puis 1 ,26 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3- isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone (composé Ex5, 1 ,472 μmol) en solution dans 285 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 2,5 ml de conjugué Ex12 à une concentration de 1 ,70 mg/ml avec en moyenne 3,7 / 3,1 dérivés de cryptophycine (UV / HRMS) par anticorps et une pureté monomérique de 98,0%.
Exemple 12 : hu2H11-SPDB-Ex6
Figure imgf000088_0001
Selon la méthode générale en une étape, 10,31 mg (0,070 μmol, 1 ,006 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,14 mg, 0,429 μmol) en solution dans 29,32 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,1 ml (9,9 mg, 0,067 μmol) du mélange d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,595 ml de tampon pH≈ 7,5-8, 291 μl de DMA puis 1 ,60 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16- [(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-éthoxy} -éthoxy)- éthoxy]-éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone (composé Ex6, 1 ,617 μmol) en solution dans 314 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 3 ml de conjugué Ex12 à une concentration de 1 ,97 mg/ml avec en moyenne 3,4 dérivés de cryptophycine par anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,8%. Exemple 13 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}- éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1 -yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1 -yle
Figure imgf000088_0002
Composé 34 : 4-Méthoxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle
Figure imgf000089_0001
200 mg (1 ,07 mmol) de pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle sont placés en solution dans l'acétonitrile anhydre (10 ml). La TEA (1 ,07 mmol) puis le bromoacétate de méthyle (1 ,61 mmol) sont ensuite ajoutés. La suspension blanche est agitée 48 h à TA avant ajout d'une solution aq. saturée de NaHCOs (10 ml). La phase aq. est extraite par du DCM (3x10 ml), les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit brut est obtenu. Ce brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le produit attendu 34, une huile incolore est alors obtenu (174,8 mg ; 63%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,66 ; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,40 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,28 à 3,33 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,61 (s, 3 H).
Composé 35 : Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle
Figure imgf000089_0002
Le composé 34 (174 mg ; 0,67 mmol) est placé en solution dans le dioxane anhydre (5 ml) et une solution HCl 4 M dans le dioxane (0,02 mmol) est ajoutée. Le mélange est agité 5 h à TA puis la suspension est filtrée sur verre fritte. Le solide ainsi obtenu est lavé par du dioxane (2 ml) puis par de l'éther isopropylique (2 ml) avant d'être séché sous vide. Un solide beige, 35, est obtenu (131 mg ; 100%). RMN 1H (300 MHz, DMSO-cfe): 2,88 à 2,97 (m, 4 H) ; 3,09 à 3,19 (m, 4 H) ; 3,53 à 3,59 (m, 2 H) ; 3,65 (s, 3 H) ; 8,65 à 9,22 (m étalé, 2 H).
Composé 36 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate de méthyle
Figure imgf000089_0003
Le dérivé 1 (20 mg ; 28,6 μmol) est placé en solution dans le DCM anhydre (1 ml) et la TEA (71 ,5 μmol) puis le CMS (45,8 μmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé. La TEA (85,7 μmol) puis le chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle 35 (42.8 μmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant que du DMF anhydre (1 ml) et NaI (30 μmol) ne soient ajoutés. Le mélange est agité 48 h à 45°C avant d'être dilué par de TAcOEt (5 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (2 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 98/2. Le composé 36 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (8,2 mg ; 34%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,45 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 0,77 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,27 à 1 ,32 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,74 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,30 (m, 1 H) ; 2,37 (s large, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,18 à 3,52 (m, partiellement masqué, 9 H) ; 3,60 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,31 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,8 et 9,9 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 839 [M + H]+ ; m/z = 420 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 837 [M - H]" ; m/z = 883 [M + HCO2H - H] " (pic de base) ; tR = 3,57 min.
Composé 37 : Bromoacétate d'allyle
Figure imgf000090_0002
288 mg (4,95 mmol) d'alcool allylique sont mis en solution dans 25 ml de DCM. La solution est refroidie à 0°C puis 760 μl (5,45 mmol) de TEA et 3,03 mg (24,8 μmol) de DMAP sont ajoutés. Le mélange est agité à 0°C puis 1 ,0 g (4,95 mmol) de bromure de bromoacétyle sont ajoutés. La réaction est poursuivie pendant la nuit à TA. On ajoute de l'eau au mélange ; la phase aq. est lavée avec du DCM. Les fractions organiques sont rassemblées, lavées avec de l'eau et une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 37 est obtenu (747 mg, 84%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 4,18 (s, 2 H) ; 4,64 (td, J=1 ,5 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,25 (qd, J=1 ,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,35 (qd, J=1 ,5 et 17,2 Hz, 1 H) ; 5,92 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,2 Hz, 1 H).
Composé 38 : 4-Allyloxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de fert-butyle
Figure imgf000090_0001
A une solution de 200 mg (1 ,07 mmol) de 1-Boc-pipérazine dans 8 ml d'acétonitrile sont ajoutés 150 μl (1 ,07 mmol) de TEA et 250 mg (1 ,40 mmol) de bromoacétate d'allyle 37. Le mélange est agité à TA pendant la nuit. La réaction est arrêtée par ajout d'une solution saturée de NaHCOs. Le mélange est extrait avec TAcOEt (3 fois) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation du solvant sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le produit attendu 38 est obtenu sous la forme d'une huile jaune (314 mg ; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,45 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 à 3,34 (m partiellement masqué, 6 H) ; 4,57 (td, J=1 ,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,22 (qd, J=1 ,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,5 et 17,1 Hz, 1 H) ; 5,83 à 5,98 (m, 1 H). LCMS (A2):ES m/z = 285 [M + H]+ ; m/z = 229 pic de base ; tR = 0,51 min.
Composé 39 : Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate d'allyle
Figure imgf000091_0001
314 mg (1 ,10 mmol) du composé 38 sont dissous dans 12,6 ml de dioxane puis 5,5 ml (22,0 mmol) d'une solution HCl 4M dans le dioxane sont ajoutés. L'agitation est poursuivie pendant la nuit à TA. Le mélange est concentré à sec pour donner le composé attendu 39 sous la forme d'une huile jaune (260 mg ; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,79 à 2,88 (m, 4 H) ; 3,07 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,48 à 3,51 (m, 2 H) ; 4,60 (td, J=1 ,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,23 (qd, J=1 ,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,32 (qd, J=1 ,5 et 7,4 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,98 (m, 1 H) ; 8,74 (s large, 2 H). LCMS (A2): ES m/z = 185 [M + H]+ ; tR = 0, 19 min. Composé 40 (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate d'allyle
Figure imgf000091_0002
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (28,3 mg, 39,5 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) est ajoutée une solution du composé 39 (1 18,5 μmol) et de TEA (198 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ml). L'agitation est poursuivie 24 h à 40°C. Le mélange est dilué dans de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (10 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 40 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,2 mg ; 56%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,75 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,25 à 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,74 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,27 (dt, J=11 ,3 et 14,2 Hz, 1 H) ; 2,32 à 2,42 (m, 4 H) ; 2,52 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,32 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 1 1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,56 (td, J=1 ,5 et 5,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,21 (qd, J=1 ,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=16,2 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,95 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,8 et 11 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 865 [M + H]+ ; m/z = 433,5 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 863 [M - H]" ; m/z = 909 [M + HCO2H - H]" ; tR = 0,92 min.
Composé 41 : Acide (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétique
Figure imgf000092_0001
A une solution sous argon du composé 40 (12,8 mg, 14,8 μmol) dans le THF anhydre sont ajoutés le tétrakis(triphénylphospine)palladium (1 ,48 μmol) et la morpholine (148 μmol). Après 3 h de réaction, le mélange est concentré à sec et repris dans 5 ml de DCM. La phase organique est lavée par une solution de 1 ml HCl 0,1 N dans 3 ml d'eau (pH≈5), séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée pour donner le composé 41 (6,7 mg, 55%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,42 (d, J=6,6 Hz, 4 H) ; 2,58 à 2,76 (m, 6 H) ; 2,97 à 3,09 (m, 3 H) ; 3,14 (s large, 2 H) ; 3,33 (m masqué, 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,8 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,29 (m, 1 H) ; 4,89 à 4,93 (m, 1 H) ; 5,06 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,43 à 6,50 (m, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 825 [M + H]+ ; m/z = 413 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 823 [M - H]" ; tR = 0,86 min.
Exemple 13 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000092_0002
L'exemple 13 peut être obtenu en activant l'acide 41 selon la méthode décrite pour l'exemple 18.
Exemple 14 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5- dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000092_0003
Composé 42 : 3-(2-{2-[2-(2-tert-Butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate d'allyle
Figure imgf000093_0001
A une solution d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque (50 mg, 137 μmol) dans 1 ,25 ml de DCM sont successivement ajoutés le chlorhydrate d'EDCI (164,2 μmol), la DMAP (13,7 μmol) et l'alcool allylique (164,2 μmol). Le mélange est agité à TA pendant 16 h puis évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 42 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (37,5 mg ; 67%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,37 (s, 9 H) ; 2,57 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,44 à 3,53 (m, 12 H) ; 3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (td, J=1 ,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (qd, J=1 , 6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,90 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) ES m/z = 406 [M + H]+ ; m/z = 428 [M + Na]+ ; m/z = 306 pic de base ; tR = 0,91 min. Composé 43 : Chlorhydrate du 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle
Figure imgf000093_0002
A une solution du composé 42 (37,5 mg, 92,5 μmol) dans 2 ml de dioxane sont ajoutés 460 μl (1 ,85 mmol) d'une solution d'acide chlorhydrique 4M dans le dioxane. L'agitation est poursuivie à TA pendant la nuit puis le milieu réactionnel est évaporé à sec pour donner le composé 43 sous la forme d'une huile incolore (31 mg, quantitatif). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,58 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,96 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,53 (m, 8 H) ; 3,55 à 3,58 (m, 4 H) ; 3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,65 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,56 (td, J=1 ,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,21 (qd, J=1 ,6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,91 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 7,91 (m étalé, 3 H). LCMS (A2) : ES m/z = 306 [M + H]+ ; tR = 0,42 min.
Composé 44 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl] -S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-i δ-ylJ-éthyl)- oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle
Figure imgf000093_0003
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (12,7 mg, 17,7 μmol) dans 1 ,48 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 22,2 μl de TEA (159 μmol) et 30,2 mg du composé 43 (88,4 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 24 h : il reste du composé 2 de départ ; 22,2 μl de TEA (159 μmol) et 30,2 mg du composé 43 (88,4 μmol) sont à nouveau ajoutés au mélange et l'agitation poursuivie à 40°C pendant 48 h supplémentaires. 2 ml d'eau sont ajoutés au mélange qui est ensuite extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOs (2 ml), une solution saturée de chlorure de sodium (2 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 44 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (4,8 mg ; 27%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 (m, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,56 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,61 à 2,73 (m, 4 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,28 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,45 à 3,53 (m, 14 H) ; 3,63 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ;3,72 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,86 (s large, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 8,2 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,55 (dm, J=5,4 Hz, 2 H) ; 4,90 (dd, J=3,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J= 1 ,4 et 5,4 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,8 Hz, 1 H) ; 5,29 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,21 (m, 1 H) ; 7,24 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 986 [M + H]+ ; m/z = 493,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 984 [M - H]- ; m/z = 1030 [M - H + HCO2H]- pic de base ; tR = 0,95 min. Exemple 14 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]- 3-isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000094_0002
L'exemple 14 peut être obtenu en déprotégeant le composé 44 selon la méthode décrite pour le composé 41 et en activant l'acide obtenu selon la méthode décrite pour l'exemple 18.
Exemple 15 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-δ,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl-méthyl-amino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000094_0001
Composé 45 : Acide 3-[2-(2-{2-[2-(fert-butoxycarbonyl-méthyl-amino)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- éthoxy]-propanoïque ,N. ,-0
Figure imgf000095_0001
520 mg (1 ,423 mmol) d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque sont mis en solution dans 14 ml de THF anhydre puis le mélange est refroidi à 0°C avant que soient ajoutés, par spatulées, 85,4 mg (2,135 mmol) d'hydrure de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 10 min à 0°C puis 150,6 μl (2,419 mmol) d'iodure de méthyle sont ajoutés à 0°C. La température est laissée revenir à TA et l'agitation poursuivie 2 h. 8 ml d'eau sont ajoutés au mélange dont le pH est ensuite acidifié par addition d'acide acétique pour obtenir pH≈4. Il est extrait par 3*10 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filration et concentration à sec sous PR, le composé 45 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (414 mg, 77%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,38 (s, 9 H) ; 2,43 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,52 (m, 14 H) ; 3,60 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 12,01 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 402 [M + Na]+ ; m/z = 378 [M - H]- ; m/z = 280 pic de base ; tR = 0,95 min. Composé 46 : 3-[2-(2-{2-[2-(fert-Butoxycarbonyl-méthyl-amino)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- propanoate d'allyle
Figure imgf000095_0002
A une solution de 540 mg (1 ,423 mmol) du composé 45 dans 15 ml de DCM anhydre sont successivement ajoutés 327 mg (1 ,71 mmol) d'EDCI, 17,4 mg (142 μmol) de DMAP et 116 μl (1 ,71 mmol) d'alcool allylique. L'agitation est poursuivie 15 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 46 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (337 mg ; 56%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,38 (s, 9 H) ; 2,57 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,22 à 3,33 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,44 à 3,54 (m, 14 H) ; 3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (d large, J=4,9 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large, J=10,3 Hz, 1 H) ; 5,30 (d large, J=17,1 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 442 [M + Na]+ ; m/z = 320 pic de base ; tR = 0,98 min.
Composé 47 : 3-(2-{2-[2-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle
Figure imgf000095_0003
A une solution de 337 mg (0,802 mmol) du composé 46 dans 20 ml de DCM sont ajoutés 1 ,19 ml (16,04 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie pendant 3 h à TA puis le mélange est concentré à sec sous PR. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 47 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (208 mg, 81 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 2,27 (s, 3 H) ; 2,54 à 2,61 (m, 4 H) ; 3,44 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,47 à 3,52 (m, 12 H) ; 3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,56 (d large, J=5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (d large, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 320 [M + H]+ ; tR = 0,42 min.
Composé 48 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle
Figure imgf000096_0001
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (40 mg, 55,7 μmol) dans 5 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 48,5 μl de DIPEA (279 μmol) et 53 mg du composé 47 (167 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 15 h ; 5 ml d'eau sont ajoutés au mélange qui est ensuite extrait avec 4x5 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOβ (5 ml), une solution saturée de NaCl (5 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 48 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (45,3 mg ; 80%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,56 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,49 à 3,51 (m, 12 H) ; 3,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 8,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,55 (d large, J=5,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,5 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,3 Hz, 1 H) ; 5,29 (dm, J=17,6 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,25 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,30 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1000 [M + H]+ ; m/z = 500,5 [M + 2H]2+ ; m/z = 1044 [M - H + HCO2H]- ; tR = 1 ,01 min.
Composé 49 : Acide (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy- benzylj-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque
Figure imgf000096_0002
19 mg (18,9 μmol) du composé 48 sont mis en solution dans 3,8 ml de THF anhydre et purgés à l'argon. 6 μl (18,9 μmol) de diéthylamine sont ajoutés au mélange qui est agité 15 min à TA avant que soient ajoutés 4,45 mg (19,8 μmol) d'acétate de palladium (II) et 18,89 mg de triphénylphosphine supportée. L'agitation est poursuivie 6 jours à TA: il reste du départ mais la réaction n'évolue plus. Le mélange est filtré, concentré à sec, repris dans 2 ml de THF anhydre et traité avec 10 μl (31 ,5 μmol) de diéthylamine et 10 mg de tétrakis(triphényl-phospine)palladium pendant 1 h. Le mélange est hydrolyse avec 2 ml d'une solution aq. d'hydrogénosulfate de sodium 2M et extrait avec 3 * 2 ml de DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (2 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice greffée diol en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 49 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (5,4 mg ; 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 (t, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (t, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,42 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,64 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,44 (m partiellement masqué, 3 H) ; 3,45 à 3,51 (m, 12 H) ; 3,53 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,59 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=4,2 et 7,8 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (dd, J=5,4 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,27 (m, 3 H) ; 7,28 à 7,32 (m, 3 H) ; 8,38 (d large, J=7,8 Hz, 1 H) ; 11 ,22 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 960 [M + H]+ ; m/z = 480,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 958 [M - H]- ; tR = 0,90 min.
Exemple 15 : Acide (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{€-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000097_0001
L'exemple 15 peut être préparé en activant l'acide 49 selon la méthode décrite pour l'exemple 18. Exemple 16 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy-benzyl}- 3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)- éthyl]-oxiranyl}-benzyl-piperazin-1 -yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000097_0002
Composé 50 : Acide 3-{2-[2-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoïque
Figure imgf000098_0001
A une solution de 300 mg (1 ,08 mmol) de 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle dans 6 ml de DCM sont ajoutés 1 ,6 ml (21 ,56 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie à TA pendant 3h. Le mélange est concentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués pour donner le composé 50 sous la forme d'une huile jaune pâle (240 mg, quantitatif).
Composé 51 : 3-{2-[2-(2-Hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoate d'allyle
Figure imgf000098_0002
A une solution de 240 mg (1 ,08 mmol) du composé 50 dans 3 ml de DCM sont successivement ajoutés 248 mg (1 ,29 mmol) d'EDCI, 13,2 mg (1 ,29 mmol) de DMAP et 88 μl (1 ,29 mmol) d'alcool allylique. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h puis le mélange est concentré à sec sous PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 51 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (144 mg, 51 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,41 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,52 (m, 10 H) ; 3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,52 (t, J=5,5 Hz, 1 H) ; 4,56 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,50 (dm, J=17,4 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). Composé 52 : 4-(2-{2-[2-(2-Allyloxycarbonyl-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-piperazine-1- carboxylate de fert-butyle
Figure imgf000098_0003
A une solution, refroidie à 0°C, de 94 mg (357 μmol) du composé 51 dans 3,7 ml de DCM sont successivement ajoutés 125 μl (893 μmol) de TEA et 30,4 μl (393 μmol) de chlorure de mésyle, l'agitation est poursuivie à TA pendant 1 h. Le mélange est concentré à sec sous PR puis repris dans 5 ml d'acétonitrile. 249 μl (1 ,785 mmol) de TEA et 200 mg (1 ,071 mmol) de Boc-pipérazine sont ajoutés à la solution et le mélange est agité et chauffé 15 h à 40°C. Après retour à TA, le mélange est concentré à sec et purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 52 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (69 mg, 45%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,33 (m, 4 H) ; 2,46 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,28 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,45 à 3,53 (m, 10 H) ; 3,64 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,55 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). Composé 53 : 3-{2-[2-(2-Piperazin-1-yl-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoate d'allyle
Figure imgf000099_0001
A une solution de 110 mg (256 μmol) du composé 52 dans 10 ml de DCM sont ajoutés 380 μl (5,11 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 24 h à TA. Le mélange est∞ncentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 53 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (47 mg, 55%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,58 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,10 à 3,36 (m large, 6 H) ; 3,45 à 3,78 (m partiellement masqué, 16 H) ; 4,56 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 9,00 (m étalé, 1 H).
Composé 54 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle
Figure imgf000099_0002
Le composé 54 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 53 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30.
Composé 55 : Acide (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy- benzylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque
Figure imgf000099_0003
Le composé 55 peut être obtenu selon la méthode décrite pour le composé 41.
Exemple 16 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000099_0004
L'exemple 16 peut être obtenu selon la méthode décrite pour l'exemple 18. Exemple 17 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4- méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa- dec-13-èn-16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1 -yl)-1 ,1 -diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]- acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1 -yle
Figure imgf000100_0001
Composé 56 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-Bromo-acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000100_0002
A une solution d'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propionique (671 mg, 2,53 mmol) dans le DCM (10 ml) est ajoutée une solution du bromoacétate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle (2,53 mmol) dans 4,7 ml de DCM. L'agitation est poursuivie 15 min à TA puis le DCC est ajouté au mélange. Après 4 h de réaction, le mélange est filtré sur verre fritte puis le filtrat est évaporé et purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 94/6. L'huile obtenue (800 mg) est à nouveau purifiée par chromatographie sur gel de silice greffée cyano, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1. On obtient le composé 56 sous la forme d'une huile incolore (611 mg, 50%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 2,81 (s, 4 H) ; 2,92 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,23 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,43 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,55 (m, 12 H) ; 3,72 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,85 (s, 2 H) ; 8,30 (t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + H]+ ; m/z = 481 [M - H]" ; tR = 0,51 min.
Composé 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1- ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,1 1-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000100_0003
A une solution purgée à l'argon du composé 2 (19,8 mg, 27,6 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) sont successivement ajoutés la TEA (138 μmol) et le chlorhydrate de la 4-méthyl-4- méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one 6 (83 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 24 h puis le mélange est dilué dans de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x10 ml), par une solution aq. saturée de NaHCU3 (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Une poudre blanche, 7, est obtenue (19,4 mg ; 75%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,6 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 0,75 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 , 12 (s, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,28 - 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,52 - 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,76 - 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,64 - 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34 (m, 6 H) ; 3,44 (br. s., 4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 - 5, 15 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,2, 1 1 ,3, 3,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34 (m, 5 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 943 [M + H]+ ; m/z = 941 [M - H]" ; tR = 4,03 min.
Nota : le composé 7 peut être préparé également à partir de G=OMs (voir exemple 1) Composé Ex1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16- [(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone
Figure imgf000101_0001
Le composé 7 (17,9 mg ; 18,97 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (2,2 ml) / eau (1 ,8 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (47,4 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 3 h à TA, puis dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (20 ml) puis par 20 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit Ex1 est obtenu sous forme d'un solide blanc (15,6 mg ; 92%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3
H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,27 - 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,56 - 1 ,64 (m, 2
H) ; 1 ,73 - 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,26 - 2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,95
- 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 - 3,36 (m, 1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 -
4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,0, 11 ,4, 3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8,3, 1 ,5 Hz, 1
H) ; 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z =
897 [M + H]+ ; m/z = 895 [M - H]" ; tR = 0,97 min.
Exemple 17 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-1 ,1-diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]-acétylamino}-éthoxy)- éthoxy]-éthoxy}-éthoxy )-propa noate de 2 , 5-d ioxo-py rrol id i n- 1 -y le
Figure imgf000101_0002
A une solution, purgée à l'argon, du composé Ex1 (15,6 mg, 17,8 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ,0 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (19,12 μmol) et le composé 56 (19,12 μmol). L'agitation est poursuivie à TA pendant 4 h puis 29,5 μmol supplémentaires de DIPEA sont ajoutés et l'agitation poursuivie pendant 16 h. Le lendemain, sont ajoutés 29,5 μmol supplémentaires de composé 56 et de DIPEA et le mélange est chauffé à 50°C. Après 24 h supplémentaires de réaction, 22,6 μmol de composé 56 et 29,5 μmol de DIPEA sont ajoutés et le mélange chauffé à 60°C pendant 24 h supplémentaires. Le chauffage est alors arrêté et l'agitation poursuivie à TA pendant 64 h. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par 2x10 ml d'eau puis par 10 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le produit Ex17 est obtenu sous forme d'un solide incolore (9,2 mg ; 41 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,77 à 0,82 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,23 (s, 6 H) ; 1 ,26 à 1 ,35 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,64 (m, 2 H) ; 1 ,68 à 1 ,77 (m, 2 H) ; 1 ,78 à 1 ,86 (m, 1 H) ; 2,26 à 2,33 (m, 3 H) ; 2,35 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,68 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,82 (s, 4 H) ; 2,93 (t, J=6.0 Hz, 2 H) ; 2,96 à 3,07 (m, 4 H) ; 3,13 (s, 2 H) ; 3,20 (q, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,33 (m, 1 H) ; 3,38 à 3,57 (m, 18 H) ; 3,73 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 2 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,8 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,13 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11 ,1 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,37 (m, 7 H) ; 8,01 (t, J=5,8 Hz, 1 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1299 [M + H]+ ; m/z = 650 [M + 2H]2+ ; m/z = 1297 [M - H]" ; tR = 0,92 min.
Exemple 18 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-δ,11-diaza-cyclohexa-dec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000102_0001
Composé 58 : Carbonate de 4-((2S,3S)-3-{(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle et de 4-nitrophényle
Figure imgf000102_0002
Le dérivé 57 (20 mg ; 28,6 μmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (0,3 ml), la solution est purgée à l'argon avant que soient ajoutés la TEA (40 μmol) puis le chloroformate de 4-nitrophényle (32,32 μmol). Après 3h30 d'agitation à TA, le mélange est hydrolyse et dilué dans 7 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée à sec pour donner le composé 58 sous la forme d'un solide blanc (23 mg, 93%). LCMS (A3) : ES m/z = 864 [M + H]+ ; m/z = 908 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 ,43 min.
Composé 59 : Acide 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.S.Θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexa-dec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque fj η o i o i
Y
Figure imgf000103_0001
5 °8 J T^ i / " Hx TT l— " ° ° 59 ° ~ V ° J Y^ i / " H":ι Ό:°
A une solution, purgée à l'argon, du composé 58 (23 mg, 26,6 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ,6 ml) sont successivement ajoutés l'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propionique (39,9 μmol) et la TEA (53,2 μmol). Après 24 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée avec 10 ml d'eau contenant 250 μl d'HCl 0,1 N (pH≈4). La phase aq. est extraite avec 10 ml d'AcOEt (2x) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'eau puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées à sec pour donner le composé 59 sous la forme d'un solide jaune très pâle (18,5 mg, 70%). LCMS (A3) : ES m/z = 990 [M + H]+ ; m/z = 988 [M - H]" ; tR = 1 ,32 min.
Exemple 18 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexa-dec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5- dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000103_0002
A une solution, purgée à l'argon, du composé 59 (18,5 mg, 18,6 μmol) dans le THF (1 ,5 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (55,8 μmol) et le carbonate de N,N'-disuccinimidyle (37,2 μmol). Après 19 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 10 ml d'eau (2 fois) puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séché sur MgSO4 et évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 100/0 à 0/100 contenant 10% d'isopropanol. Le produit Ex17 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,08 mg ; 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,83 à 0,88 (m, 6 H) ; 0,97 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,47 à 1 ,56 (m, 1 H) ; 1 ,58 à 1 ,68 (m, 2 H) ; 1 ,82 à 1 ,90 (m, 1 H) ; 2,39 à 2,47 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,66 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11 ,5 et 14,4 Hz, 1 H) ; 2,80 (s, 4 H) ;
2.91 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 2,94 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,14 (q, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,37 à 3,56 (m partiellement masqué, 15 H) ; 3,71 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,79 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,8 et 8,0 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,96 à 5,05 (m, 3 H) ; 5,1 1 (m, 1 H) ; 5,88 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,14 à 7,39 (m, 8 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1087 [M + H]+ ; m/z = 1085 [M - H]" ; tR = 1 ,09 min.
Exemple 19 : (1-{4-r(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-r3-Chloro-4-méthoxy-benzvn-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}- éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000104_0001
Composé 60 : (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Azidométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tetraone
Figure imgf000104_0002
A une solution, purgée à l'argon, de 60 mg (85,8 μmol) de composé 1 dans 9 ml de THF anhydre sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide. Le mélange est agité à TA pendant
10 min puis refroidi à 0°C avant que soient ajoutés 18,0 μl (120 μmol) de DBU. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h. La réaction n'est pas complète : sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide et 18,0 μl (120 μmol) de DBU puis l'agitation est poursuivie pendant 24 h.
11 reste encore du composé 1 de départ : sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide et 18,0 μl (120 μmol) de DBU puis l'agitation est poursuivie pendant 24 h. Le milieu réactionnel est hydrolyse par addition de 6 ml d'eau puis extrait avec du DCM (3*6 ml). Les phase organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (8 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 60 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (46 mg, 74%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,76 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ;1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,63 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ;
3.92 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,46 (s, 2 H) ; 4,92 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,7 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,38 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 724 [M + H]+ ; m/z = 722 [M - H]" ; m/z = 768 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,18 min.
Composé 61 : Acide (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoïque
Figure imgf000105_0001
A une suspension de 22 mg (30,4 μmol) du composé 60 dans 500 μl d'eau est ajoutée une solution de 6,8 mg (60,8 μmol) d'acide 5-hexynoïque dans 500 μl de THF. Sont ensuite ajoutés 122 μl (12,2 μmol) d'une solution aq. 0,1 M de sulfate de cuivre et 122 μl (24,3 μmol) d'une solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 2 h à TA. Le mélange est hydrolyse par addition de 2 ml d'eau puis extrait avec de TAcOEt (3 * 2 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (3 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 61 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,4 mg, 76%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,73 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ;1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,20 à 2,30 (m, 3 H) ; 2,62 (t, J=7,7 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,28 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,10 (ddd, J=1 ,6 et 5,2 et 1 1 ,2 Hz, 1 H) ; 5,53 (s, 2 H) ; 5,78 (dd, J=1 ,6 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,3 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,37 (d large, J=8,0 Hz, 1 H) ; 12,03 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 836 [M + H]+ ; m/z = 418,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 834 [M - H]" ; tR = 1 ,04 min. Composé 62 : (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tétraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-en-iδ-ylJ-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de méthyle
Figure imgf000105_0002
A une solution de 5 mg (6 μmol) du composé 61 dans 500 μl de DCM et 200 μl de méthanol sont ajoutés 4,5 μl (9,0 μmol) d'une solution de triméthylsilyldiazométhane 2M dans l'hexane. L'agitation est poursuivie 30 min. Le mélange est concentré sous PR et purifié par filtration sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 62 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (5 mg, 98%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,72 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,99 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,25 (m, 1 H) ; 2,35 (t, J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,62 (t, J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,57 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,3 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,89 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,09 (ddd, J=1 ,5 et 5,4 et 1 1 ,4 Hz, 1 H) ; 5,53 (s, 2 H); 5,78 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,4 et 11 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,5 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 850 [M + H]+ ; m/z = 425,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 848 [M - H]" ; m/z = 894 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,11 min.
Exemple 19 : (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000106_0001
A une solution, purgée à l'argon, de 13,4 mg (16 μmol) du composé 61 dans 1 ,2 ml de THF sont successivement ajoutés 8,4 μl (48,1 μmol) de DIPEA et 8,21 mg (32,04 μmol) de carbonate de N,N'-disuccinimidyle. L'agitation est poursuivie à TA pendant 26 h. Le mélange est hydrolyse par addition de 2 ml d'eau puis extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par filtration sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le produit obtenu contient 0,15 mol de NHS. Il est repris dans 2 ml de DCM et lavé avec de l'eau (2x3 ml) puis séché sur MgSO4. Après filtration et concentration à sec, on obtient le composé Ex19 sous la forme d'un solide blanc (12,56 mg, 84%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,73 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 1 ,95 (quin, J=7,5 Hz, 2 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,65 à 2,77 (m, 6 H) ; 2,81 (s large, 4 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,1 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,09 (ddd, J=1 ,4 et 5,5 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,54 (s, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,4 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 (dd, J=2,5 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,95 (s, 1 H) ; 8,33 (d, JJ==88,,11 HHzz,, 11 HH)).. LLCCMMSS ((AA22)) :: EESS mm//zz == 993333 [[MM ++ H]+ ; m/z = 467 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 977 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,08 min.
Exemple 20 : 3-(2-{2-[2-(2-{1 -[1 -(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1 -((E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-1,2,3-triazol-1-yl]-méthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000107_0001
Composé 63 : 2-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthanol
Figure imgf000107_0002
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 1 g (5,15 mmol) de tetraethylèneglycol dans 25 ml de THF anhydre sont ajoutés 144 mg (3,60 mmol) de NaH à 60% en dispersion dans une huile minérale. L'agitation est poursuivie 30 min à 0°C puis 194 μl (2,58 mmol) de bromure de propargyle sont ajoutés. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h. Le mélange est concentré sous PR puis le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 63 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (789 mg, 65%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 3,40 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,42 (t, J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,48 (q, J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,51 à 3,58 (m, 12 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 4,53 (t, J=5,5 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 233 [M + H]+ ; tR = 0,38 min.
Composé 64 : 3-(2-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de tert- butyle
Figure imgf000107_0003
A une solution, purgée à l'argon, de 790 mg (3,40 mmol) du composé 63 dans 8,8 ml de THF anhydre sont ajoutés 4,4 mg (190 μmol) de sodium. Le mélange est chauffé à 40°C pendant 2 h pour le solubiliser entièrement ; après retour à TA, 740 μl (5,09 mmol) d'acrylate de fert-butyle sont ajoutés au mélange. L'agitation est poursuivie pendant 15 h à TA puis le mélange est concentré sous PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 64 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (944 mg, 77%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,44 (s, 9 H) ; 2,41 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,38 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,46 à 3,62 (m, 16 H) ; 3,59 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 361 [M + H]+ ; m/z = 383 [M + Na]+ ; tR = 3,79 min.
Composé 65 : Acide 3-(2-{2-[2-(2-prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque
Figure imgf000108_0001
A une solution de 944 mg (2,62 mmol) de∞mposé 64 sont ajoutés 2 ml (52,4 mmol) de TFA. Le mélange est agité 6 h à TA puis concentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués. Le composé 65 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (722 mg, 91 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,44 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,46 à 3,56 (m, 16 H) ; 3,60 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 7,44 à 9,73 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 305 [M + H]+ ; m/z = 303 [M - H]-; tR = 0,48 min.
Exemple 20 : 3-(2-{2-[2-(2-{1-[1-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-1 ,2,3-triazol-1-yl]-méthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000108_0002
L'exemple 20 peut être obtenu à partir des composés 60 et 65 selon la méthode décrite pour le composé 61 puis en activant l'acide selon la méthode décrite pour l'exemple 19. Exemple 21 : (4-{1 -[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1 -((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)- éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000108_0003
Composé 66 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[(méthyl-prop-2-ynyl-amino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone
Figure imgf000109_0001
A une solution, purgée à l'argon, de 40 mg (55,7 μmol) du composé 2 dans 5 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 48,5 μl (279 μmol) de DIPEA et 13,9 μl (167 μmol) de N- méthylpropargylamine. Le mélange est chauffé à 40°C pendant 15 h. Il reste du composé 2 de départ : sont à nouveau ajoutés 48,5 μl (279 μmol) de DIPEA et 13,9 μl (167 μmol) de N- méthylpropargylamine. Après 24 h d'agitation à 40°C, le mélange est dilué avec 5 ml d'AcOEt puis lavé avec 5 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*5 ml d'AcOEt, les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOs (10 ml), une solution saturée de NaCl (10 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 66 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (45 mg, quant.). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 0,78 (m, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,20 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,17 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,27 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 3,33 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,50 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 7,8 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,5 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,5 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,1 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,1 et 9,4 Hz, 1 H) ; 7,25 à 7,33 (m, 5 H) ; 8,33 (d, J=7,8 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 750 [M + H]+ ; ES m/z = 375,5 [M + 2H]2+ pic de base ; ES m/z = 748 [M - H]- ; m/z = 794 [M - H + HCO2H]- ; tR = 0,91 min.
Composé 67 : 4-Azido-butyrate d'éthyle
Figure imgf000109_0002
2,86 ml (20 mmol) de 4-bromo-butanoate d'éthyle et 2,6 g (40 mmol) de NaN3 sont mis en solution dans 30 ml d'un mélange acétone/eau 2/1. Le mélange est chauffé 7 h au reflux. Après retour à TA et concentration sous PR, le résidu est repris dans 50 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*30 ml de DCM. Les phases organiques sont réunies, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous PR pour donner le composé 67 sous la forme d'une huile incolore (3 g, 95%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-cf): 1 ,27 (t, J=7,2 Hz, 3 H) ; 1 ,92 (m, 2 H) ; 2,41 (t, J=7,2 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=6,7 Hz, 2 H) ; 4,15 (q, J=7,2 Hz, 2 H).
Composé 68 : Acide 4-azido-butanoïque
Figure imgf000109_0003
A une solution de 3 g (19,9 mmol) du composé 67 dans 47 ml de méthanol et 37 ml d'eau sont ajoutés, par petites fractions, 5,58 g (99,5 mmol) de potasse. Le mélange est agité à TA pendant 6 h puis concentré sous PR jusqu'à environ 28 ml. Le résidu est dilué avec 25 ml d'eau et extrait avec 2x20 ml de DCM. La phase aq. est acidifiée à pH≈1 par addition d'HCl concentré puis extraite avec 3*25 ml d'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (25 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration à sec sous PR, le composé 68 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (2,05 g, 80%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-cf): 1 ,93 (m, 2 H) ; 2,49 (t, J=7,1 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=6,7 Hz, 2 H) ; 11 ,24 (m étalé, 1 H). Composé 69 : Acide (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy- benzylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.S.Θ.^-tétraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-en-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoïque
Figure imgf000110_0001
A une solution de 24 mg (32 μmol) du composé 66 dans 545 μl de THF sont successivement ajoutés 8,3 mg (13 μmol) de composé 68, 545 μl d'eau, 128 μl d'une solution aq. 0,1 M de sulfate de cuivre et 128 μl d'une solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. Le mélange est 45 min agité à TA puis dilué avec 2 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (2 ml) et filtrées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice greffée diol en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 69 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (22,6 mg, 80%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,03 (m, 2 H) ; 2,10 (s, 3 H) ; 2,20 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 2,30 (m, 1 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,03 (m, 3 H) ; 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 7,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,37 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,5 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,5 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,02 (s, 1 H) ; 8,39 (d large, J=7,7 Hz, 1 H) ; 12,14 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 879 [M + H]+ ; m/z = 877 [M - H]- ; tR = 0,86 min.
Composé 70 : (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de méthyle
Figure imgf000111_0001
A une solution, purgée à l'argon, de 5,5 mg (6,2 μmol) du composé 69 dans 0,5 ml de DCM et 0,2 ml de méthanol sont ajoutés 4,7 μl (9,3 μmol) de triméthylsilyldiazométhane. Le mélange est agité 45 min à TA puis concentré à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 95/5. Le composé 70 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (3,4 mg, 62%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,75 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,1 1 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,07 (m, 2 H) ; 2,10 (m, 3 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,31 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 2,62 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,27 à 3,37 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,58 (s, 3 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,2 et 11 ,6 Hz, 1 H) ; 4,38 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,3 et 1 1 ,2 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,16 (dd, J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 8,03 (s, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 893 [M + H]+ ; m/z = 447 [M + 2H]2+ pic de base; m/z = 891 [M - H]- ; m/z = 937 [M -H + HCO2H]- pic de base ; tR = 0,90 min.
Exemple 21 : (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
Figure imgf000111_0002
L'exemple 21 peut être obtenu par activation de l'acide 69 selon la méthode décrite pour l'exemple 19. Exemple 22
Figure imgf000111_0003
Composé 71 : (E)-(3S,10R,16S)-16-((S)-1-r(2S,3S)-3-(4-Azidométhvl-phénvl)-oxiranvll-éthyl)-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone
Figure imgf000112_0001
L'al∞ol 57 (36 mg ; 51 ,48 μmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985- 3007) est placé en solution dans le THF anhydre (2 ml). La solution est purgée à l'argon et refroidie avec un bain d'eau glacée avant d'additionner le DPPA (74 μmol) puis le DBU (80 μmol). Le mélange est laissé revenir à TA et l'agitation est poursuivie toute la nuit. Le lendemain, la solution est de nouveau refroidie avec un bain d'eau glacée puis sont ajoutés 74 μmol de DPPA et 80 μmol de DBU supplémentaires. Après 2 h de réaction à 0°C et 2 h à TA, le mélange est hydrolyse avec 5 ml d'eau puis est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous PR. Le brut est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 57 est obtenu sous forme d'un solide incolore (24 mg ; 64%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,84 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ;0,98 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,48 à 1 ,67 (m, 3 H) ; 1 ,88 (m, 1 H) ; 2,45 (m, 1 H) ;2,63 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11 ,5 et 14,0 Hz, 1 H) ; 2,97 à 3,08 (m, 3 H) ; 3,36 (m partiellement masqué, 1 H); 3,82 (s large, 4 H) ; 4,28 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,44 (s, 2 H) ; 4,99 (dd, J=3,7 et 9,5 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,4 et 5,7 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 5,88 (dd, J=1 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11 ,4 et15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,26 à 7,32 (m, 4 H) ; 7,36 (d,J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 722 [M - H]- ; m/z = 724 [M + H]+ ; m/z = 768 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 , 19 min.
Composé 72 : (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2S,3S)-3-(4-Aminométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone
Figure imgf000112_0002
Le composé 71 (22 mg, 30,38 μmol) est mis en solution dans un mélange méthanol (1 ml) / eau (0,2 ml) avant addition de TCEP (34,89 μmol). La solution obtenue est laissée sous agitation toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est ensuite repris avec une solution aq. saturée en NaHCOβ et extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. L'intermédiaire 72 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide incolore (21 mg, 99%) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. LCMS (A5) : ES m/z = 696 [M - H]- ; m/z = 698 [M + H]+ ; m/z = 742 [M + HCO2H - H]" ; fo = 3,19 min.
Composé 74 : FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72
Figure imgf000113_0001
Le composé 72 (21 mg, 30,08 μmol) est mis en solution dans un mélange acétonitrile (2 ml) / DMF anhydre (0,5 ml) avant l'addition d'une solution du composé 73 (23 mg, 30,1 μmol ; préparé selon WO 2006/110476) dans l'acétonitrile (2 ml). Le mélange est laissé 22 h sous agitation à TA puis est concentré sous PR. Le résidu est repris dans le DCM et lavé avec une solution aq. saturée en NaHCOs puis séché sur Na2SO4, fitré et concentré sous PR. Le brut est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 74 est obtenu sous forme d'un solide blanc (22 mg) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. LCMS (A5) : ES m/z = 1325 [M + H]+ ; m/z = 1369 [M + HCO2H - H]" ; tR = 4,30 min.
Composé 75 : Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72
Figure imgf000113_0002
Le composé 74 (22 mg, 16,59 μmol) est mis en solution dans le DMF (3 ml) avant addition de pipéridine (150 μl, 1 ,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est concentré sous PR ; le résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et précipité avec de l'éther. Le composé 75 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (15 mg, 82%). LCMS (A5) : ES m/z = 1103 [M + H]+ ; m/z = 1101 [M - H]- ; m/z = 1 148 [M + HCO2H - H]" ; tR = 3,38 min.
Composé 76 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72
Figure imgf000113_0003
Une solution d'anhydride glutarique (8 mg, 70 μmol) dans le DMF anhydre (200 μl) est additionnée au composé 75 (15 mg, 13,59 μmol) conditionné sous argon. La solution obtenue est agitée toute la nuit à TA avant addition d'une solution aq. saturée en NH4CI et extraction 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. Le résidu obtenu est repris dans le DCM et précipité à l'éther. Après filtration sur fritte et lavage à l'éther, le composé 76 est obtenu sous la forme d'un solide beige (8 mg, 48%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,80 à 0,92 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ;1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,30 à 1 ,72 (m, 9 H) ; 1 ,86 (m, 1 H) ; 2,00 (m, 1 H) ; 2,11 à 2,26 (m, 4 H) ;2,42 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,91 à 3,1 1 (m, 5 H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,76 (d,J=1 ,8 Hz, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,17 (m, 3 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,37 (m, 1 H) ; 4,90 à 5,04 (m, 3 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,50 (m large, 2 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,20 (m étalé, 1 H) ; 6,48 (m, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,1 1 à 7,32 (m, 9 H) ; 7,60 (m, 2 H) ; 7,75 (m, 1 H) ; 7,89 (m, 1 H) ; 8,28 (m étalé, 1 H) ; 8,41 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 9,92 (s large, 1 H); 12,06 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1217 [M + H]+ ; m/z = 1215 [M - H]- ; tR = 1 ,05 min.
Exemple 22
Figure imgf000114_0001
Le∞mposé 76 (6 mg, 4,93 μmol) est mis en solution dans un mélange de DCM (0,5 ml) et de DMF (0,1 ml) puis sont successivement ajoutés le carbonate de N,N'-disuccinimidyle (6 mg, 23,42 μmol) et la DIPEA (4 μl, 22,96 μmol). Après 3 h de réaction à TA, une solution aq. saturée en NH4CI est additionnée et le mélange est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques reunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé Ex22 est obtenu sous forme d'un solide blanc (4 mg ; 61 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de) δ (ppm) : 0,80 à 0,90 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,3 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,32 à 1 ,76 (m, 7 H) ; 1 ,80 à 1 ,89 (m, 3 H) ; 1 ,97 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 2 H) ; 2,44 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,75 (m, 4 H) ; 2,81 (s, 4 H) ; 2,89 à 3,08 (m, 5 H) ; 3,41 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,77 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,14 à 4,24 (m, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,9 et 8,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,38 (m, 1 H) ; 4,93 à 5,03 (m, 3 H) ; 5,1 1 (m, 1 H) ; 5,39 (s large, 2 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 5,96 (t, J=5,9 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,7 et 11 ,1 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,16 à 7,36 (m, 9 H) ; 7,59 (d, J=7,8 Hz, 2 H) ; 7,76 (t, J=6,1 Hz, 1 H) ; 7,88 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 8,10 (d, J=7,3 Hz, 1 H) ; 8,41 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 9,97 (s large, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1314 [M + H]+ ; m/z = 1358 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 ,06 min.
Exemple 23
Figure imgf000114_0002
Composé 77: (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Aminométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone
Figure imgf000114_0003
Le composé 60 (23 mg, 31 ,76 μmol) est mis en solution dans un mélange de méthanol (1 ml) et d'eau (0,2 ml) avant addition de TCEP (34,90 μmol) et de DCM (la quantité suffisante pour solubiliser). La solution obtenue est laissée sous agitation toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est ensuite repris avec une solution aq. saturée en NaHCOs et extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le brut est enfin purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 77 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (12 mg, 59%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,78 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,47 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 2,22 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,35 (m partiellement maqué, 1 H) ; 3,71 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,86 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,2 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 1 1 ,3 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 698 [M + H]+ ; m/z = 696 [M - H]- ; m/z = 742 [M + HCO2H - H]" ; tR = 0,87 min.
Composé 78 : FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77
Figure imgf000115_0001
Le composé 77 (10 mg, 14,32 μmol) est mis en solution dans le DMF anhydre (0,1 ml) avant l'addition d'une solution de l'intermédiaire 73 (1 1 mg, 14,35 μmol ; préparé selon WO 2006/110476) dans un mélange d'acétonitrile (1 ml) et de DMF (0,1 ml). Le mélange est laissé sous agitation 3 h à TA puis est concentré sous PR. Le résidu est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 78 est obtenu sous forme d'un solide blanc (18 mg, 95%). LCMS (A5) : ES m/z = 1325 [M + H]+ ; m/z = 1369 [M + HCO2H - H]" ; tR = 4,32 min.
Composé 79 : Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77
Figure imgf000115_0002
Le composé 78 (42 mg, 31 ,68 μmol) est mis en solution dans le DMF (5 ml) avant addition de pipéridine (150 μl, 1 ,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est concentré sous PR et le résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et est précipité avec de l'éther. Le composé 79 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (21 mg, 60%). LCMS (A4) : ES m/z = 1103 [M + H]+ ; m/z = 1101 [M - H]- ; m/z = 1 147 [M + HCO2H - H]" ; tR = 3,67 min.
Composé 80 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77
Figure imgf000116_0001
Le composé 79 (20 mg, 18,12 μmol) est mis en solution dans un mélange de DMF (100 μl) et de DCM anhydre (500 μl) avant addition d'anhydride glutarique (4 mg, 35,06 μmol). La solution obtenue est agitée toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est repris dans un minimum de DCM et de méthanol, précipité avec un mélange d'éther et de pentane et est filtré sur fritte. Le composé 80 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (23 mg, 104% brut) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,78 (d, J=6,3 Hz, 6 H) ; 0,84 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,22 à 1 ,47 (m, 3 H) ; 1 ,51 à 1 ,64 (m, 3 H) ; 1 ,72 (m, 3 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 1 ,99 (m, 1 H) ; 2,20 (m, 4 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,59 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,90 à 3,07 (m, 5 H) ; 3,32 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (s large, 1 H) ; 4,19 (m, 3 H) ; 4,24 (m, 1 H) ; 4,38 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,3 et 9,6 Hz, 1 H) ; 4,97 (s large, 2 H) ; 5,10 (dd, J=4,4 et 10,7 Hz, 1 H) ; 5,40 (s large, 2 H) ; 5,79 (d large, J=15,1 Hz, 1 H) ; 5,99 (m large, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (d large, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,34 (m, 8 H) ; 7,60 (d large, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,76 (t large, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,83 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 8,09 (d large, J=7,1 Hz, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H) ; 9,95 (s large, 1 H) ; 1 1 ,98 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1217 [M + H]+ ; m/z = 1215 [M - H]- ; tR = 1 ,03 min.
Exemple 23
Figure imgf000116_0002
L'exemple 23 peut être obtenu en activant l'acide 80 selon la méthode décrite pour l'exemple 22.
Exemple 24 : [2-Méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-méthyl-carbamate de 4-((2S,3S)-3- {(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12- tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle
Figure imgf000116_0003
Composé 81 : Méthyl-[2-méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-amine
Figure imgf000117_0001
A une solution de l'aminé 15 (478 mg, 2,90 mmol) dans le MeOH (35 ml) est additionné le TCEP (831 mg, 2,9 mmol). Après 2 h de réaction à TA la solution obtenue est additionnée goutte à goutte, sous atmosphère d'argon, à une solution de 2,2'-dipyridyldisulfide (960 mg, 4,36 mmol) dans l'éthanol (70 ml). Après en∞re 2 h de réaction à TA le mélange est concentré sous PR. Le résidu est repris dans le DCM et est lavé avec une solution aq. saturée en NaHCOs. La phase organique est séparée puis la phase aq. extraite encore 2 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 85/15. Le composé 81 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (587 mg, 89%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,80 (m étalé, 1 H) ; 2,19 (s, 3 H) ; 2,45 (s, 2 H) ; 7,22 (ddd, J=1 ,5 et 5,0 et 7,0 Hz, 1 H) ; 7,74 à 7,85 (m, 2 H) ; 8,42 (ddd, J=1 ,1 et 1 ,5 et 5,0 Hz,1 H).
Exemple 24 : [2-Méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-méthyl-carbamate de 4-((2S,3S)-3-{(S)- 1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo- 1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle
Figure imgf000117_0002
A une solution de l'intermédiaire 58 (21 mg, 24,3 μmol) dans le DCM anhydre sont successivement ajoutés l'aminé 81 (10 mg, 43,79 μmol) et la DIPEA (8 μl, 45,43 μmol). Après 24 h à TA une solution aq. saturée en NaHCOs est additionnée et le mélange est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2S04, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé Ex24 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide incolore (7 mg, 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,82 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,84 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,97 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,14 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s large, 6 H) ; 1 ,45 à 1 ,68 (m, 3 H) ; 1 ,88 (m, 1 H) ; 2,42 (m partiellement masqué, 1 H) ; 2,58 à 2,75 (m, 2 H) ; 2,83 à 3,09 (m, 6 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s large, 4 H) ; 4,28 (m, 1 H) ; 4,91 à 5,17 (m, 4 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (m, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,38 (m, 8 H) ; 7,80 (m large, 2 H) ; 8,39 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 8,43 (d large, J=4,6 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 953 [M + H]+ ; m/z = 477 [M + 2H]2+ ; m/z = 997 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 ,23 min.
Exemple 25 : hu2H11-Ex17
Figure imgf000118_0001
Selon la méthode générale, 8,31 mg (0,057 μmol, 1 ,468 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration de 5,66 mg/ml sont traités par 5 éq. du composé Ex17 (0,442 mg, 0,340 μmol) en solution dans 37,3 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le mélange. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,15 ml de conjugué à une concentration de 2,48 mg/ml avec en moyenne 2,2 cytotoxiques par anticorps et une pureté monomérique de 99,7% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1 ,5 ml d'une solution de conjugué Ex25 à une concentration de 1 ,06 mg/ml avec en moyenne 2,8 dérivés de cryptophycine (déterminé par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,7%. Exemple 26 : hu2H11-Ex18
Figure imgf000118_0002
Selon la méthode générale, 7,8 mg (0,053 μmol, 1 ,458 ml) d'anticorps nus hu2H11 à une concentration de 5,35 mg/ml sont traités par 6 éq. du composé Ex18 (0,578 mg, 0,531 μmol, pureté 60%) en solution dans 272 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le mélange. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,35 ml de conjugués à une concentration de 2,49 mg/ml avec en moyenne 2,5 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 100% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de chlorure de sodium sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1 ,5 ml de d'une solution de conjugué Ex26 à une concentration de 0,84 mg/ml avec en moyenne 2,22 dérivés de cryptophycine (déterminé par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,9%. Exemple 27 : hu2H11-Ex19
Figure imgf000119_0001
Selon la méthode générale, 12 mg (81 ,7 μmol, 1 ,172 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration de 10,24 mg/ml sont traités par 2 * 5 éq. du composé Ex19 (0,382 mg, 0,41 μmol) en solution dans 44,3 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le milieu réactionnel. Après purification sur Superdex 200 pg en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 1 ,04 ml de conjugués dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH = 6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 1 ,5 ml d'une solution de conjugué Ex27 à une concentration de 2,66 mg/ml avec en moyenne 1 ,4 dérivés de cryptophycine (HRMS) par anticorps et une pureté monomérique de 99,8%.
Les exemples donnés ci-dessus ont été réalisés par un dérivé de cryptophycine particulier (souvent le dérivé D1) mais pourraient s'appliquer à un autre dérivé du groupe D1-D8 ou au dérivé de cryptophycine de formule générale (II). De même, les exemples de conjugués des exemples 10, 1 1 , 12, 25, 26 et 27 pourraient s'appliquer à d'autres anticorps que hu2H11.
note : dans lesdits exemples, -Lys- signifie que l'attachement se fait sur les groupes ε-amino des lysines de l'anti∞rps.
Exemple 28 : évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées cellulaires MDA-MB- 231, MDA-A1 et HCT116 par les cytotoxiques, étude réalisée sur les composés de formule (II) de type SZa avec Za = SMe ou de type -C(=O)-ZbRb avec ZbRb = OMe ou OCH2-CH=CH2 Les cellules MDA-MB-231 , MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance exponentielle sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de culture respectif (DMEM/F12 Gibco #21331 , 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules MDA ; DMEM Gibco #11960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules HCT116). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de culture 96 puits Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) dans le milieu de culture complet contenant du sérum à une densité de 5000 cellules/puits (MDA-MB-231 , MDA-A1 , HCT1 16). Après 4 h d'incubation, des dilutions successives des dérivés de cryptophycine sont ajoutées dans les puits à des concentrations décroissantes de 10-7 à 10-12 M (en triplicate pour chaque concentration). Les cellules sont cultivées 3 jours à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2 en présence des cytotoxiques. Le 4e jour, 10 μl d'une solution de thymidine 14C (0,1 μCi/puits, Perkin Elmer #NEC56825000) sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de thymidine 14C est mesurée 96 heures après le début de l'expérience avec un compteur radioactif microbétâ (Perkin Elmer). Les données sont exprimées sous la forme d'un pourcentage de survie en faisant le ratio entre le décompte obtenu avec les cellules traitées par le cytotoxique et celui obtenu avec les cellules des puits contrôlés (traitées par le milieu de culture seul).
Figure imgf000120_0001
Exemple 29 : évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées cellulaires MDA-MB- 231, MDA-A1 et HCT116 par les conjugués anticorps-cytotoxique
Les cellules MDA-MB-231 , MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance exponentielle sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de culture respectif (DMEM/F12 Gibco #21331 , 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules MDA ; DMEM Gibco #1 1960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules HCT1 16). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de culture 96 puits Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) dans le milieu de culture complet contenant du sérum à une densité de 5000 cellules/puits (MDA-MB-231 , MDA-A1 , HCT1 16). Après 4 h d'incubation, des dilutions successives des dérivés de cryptophycine sont ajoutées dans les puits à des concentrations décroissantes de 10-7 à 10-12 M (en triplicate pour chaque concentration). Les cellules sont cultivées à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2 en présence des immunoconjugués anticorps-cytotoxique pendant 3 jours. Le 4e jour, 10 μl d'une solution de thymidine 14C (0,1 μCi/puits, Perkin Elmer #NEC56825000) sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de thymidine 14C est mesurée 96 h après le début de l'expérience avec un compteur radioactif microbétâ (Perkin Elmer). Les données sont exprimées sous la forme d'un pourcentage de survie en faisant le ratio entre le décompte obtenu avec les cellules traitées par l'immunoconjugué et celui obtenu avec les cellules des puits contrôles (traitées par le milieu de culture seul). Dans certaines expériences, l'anticorps nu hu2H11 a été ajouté dans les puits à une concentration de 1 μM au début de l'expérience et l'inhibition de la prolifération a été mesurée comme précédemment décrit.
Figure imgf000121_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivé de cryptophycine de formule (II) :
Figure imgf000122_0001
dans laquelle :
• Ri représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe -OH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1 -C4)alcanoyloxy ;
ou bien R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde ;
• AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ;
• R3 représente un groupe (C1 -CβJalkyle ;
• R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13 et C14 ;
• Rβ et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ;
• Rs et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ; • R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe
OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH2, -NH(C1-C6)alkyle ou - N(C1-C6)alkyle2 ;
• Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1 -C4)alkyle ;
" L représente un linker en position ortho (o), meta (m) ou para (p), de préférence para, du noyau phényle porteur du motif GCRi choisi parmi :
-G' X (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi5Ri6)u Q GCRi ,
-G' X (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y-Y'-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u(OCH2CH2)y Q GCRi ,
-G' X (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u Q GCRi ,
-G' X (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ,
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi , -G' X (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi,
-G' X (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi,
-G' X (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi;
-G' X (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)rpipéridinyl-méthyl-NRi2-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ,
-G' X (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
ou
-G" Y (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi5Ri6)u Q GCRi ,
-G" Y (CRi3Ri4)I(OCH2CH2Vr-(CRi5Ri6)U Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u(OCH2CH2)y Q GCRi ,
-G" Y (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u Q GCRi ,
-G" Y (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NRi2-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NRi2-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi,
-G" Y (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi;
-G" Y (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q CCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
-G" Y (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ;
formules dans lesquelles :
" G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ;
• G" représente un groupe -(CH2)n- ;
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;
• X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR12-, le groupe CO étant attaché à G' ;
- Y représente un groupe -O-, -OCO, -OCOO, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-,
-NR12CONR'12-, -NR12COO-, ou -S(0)q-, l'atome O ou le groupe NR12 étant attachés à G" ;
• q représente un entier pouvant valoir O, 1 ou 2 ;
- Y' représente un groupe -O-, -OCO, -OCOO, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-,
-NR12CONRV, -NR12COO-, -S(0)q-, -CO-, -COO-, ou -CONR12- ;
" R12, R'i2, R13, Ru, R15, Rie, R17 et R18 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ;
• t, u et y représentent des entiers pouvant aller chacun de O à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ;
- dans le cas du linker de formule -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y'-(CR15R16)u Q
GCR1, si y vaut O et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir O ;
• Q représente une liaison simple, un groupe (C1 -C-ιo)alkylène ou un groupe (OCH2CH2)ι, i représentant un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ;
• GCR1 représente -SZa , -C(=O)-ZbRb,
Figure imgf000124_0002
avec R12 représentant
H ou (C1 -C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; ou bien L est choisi parmi :
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
formules dans lesquelles :
Figure imgf000125_0003
représente l'un des 9 groupes suivants :
Figure imgf000125_0002
^^s ALK~
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;
• ALK représente un groupe (C1-Ci2)alkylène ;
• Ri2 et R'12 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (d- C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; • i représente un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ;
ou bien L est un linker de formule (IV) :
Figure imgf000126_0001
^ dans laquelle :
• (AA)W représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ;
• w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ;
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;
" D représente l'un des motifs suivants :
Figure imgf000126_0002
pour lesquels :
• R12 représente H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ;
• R19, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome
d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1 -C4)alkyle ;
• T rattaché à (CH2)n représente NR12 OU O ;
• V1 représente O, S, NR12 ;
• V2 représente CR22 ou N ;
" V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N ;
• Za représente H ou le groupe -SR3, Ra représentant un groupe (C1 -CβJalkyle, (C3- C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ;
• Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, Rb représentant H ou un groupe (C1- C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle.
2. Dérivé dé cryptophycine selon la revendication 1 dans lequel R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène.
3. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 ou 2 dans lequel GCR1 représente -SZa ou -C(=O)-ZbRb.
4. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 à 3 dans lequel
Figure imgf000127_0003
représente l'un des 7 groupes suivants :
' 12
O)I-CH2CH2'' "(CH2
Figure imgf000127_0001
5. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 à 4 dans lequel n vaut 1.
6. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 dans lequel L est choisi parmi :
Figure imgf000127_0002
Figure imgf000128_0001
• Ri2 et R'12 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (d- C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ;
• i représente un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ;
• Z3 représente H ou le groupe -SR3, R3 représentant un groupe (C1 -C6)alkyle, (C3- C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ;
• Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, Rb représentant H ou un groupe (Cr Cβjalkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle.
7. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 dans lequel L est choisi parmi :
Figure imgf000128_0002
Figure imgf000129_0001
Ri2 représentant H ou un groupe (C1 -C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle.
8. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 7 dans lequel R12 représente H.
9. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 7 dans lequel R12 représente (d- C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle.
10. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 à 9 dans lequel Za représente H ou -S(C1 -C6)alkyle, notamment -SMe, ou -S-hétéroaryle, notamment
Figure imgf000129_0006
ou ZbRb
représente -O(C1 -C6)alkyle, -OH, -OCH3, -OCH2CH=CH2,
Figure imgf000129_0002
ou ou cation
Figure imgf000129_0003
Figure imgf000129_0004
dans lequel Gl représente au moins un groupe électroinductif, ou encore dans lequel -C(=O)ZbRb représente
Figure imgf000129_0007
11. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 10 défini selon l'une des formules suivantes, L étant de préférence en position para :
Figure imgf000129_0005
Figure imgf000130_0001
12. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 choisi parmi :
Figure imgf000130_0002
Figure imgf000131_0001
RbZb
^O
Figure imgf000131_0002
Za, Zb et Rb étant tels que définis à la revendication 1 ou 10.
13. Dérivé de cryptophycine de formule (III) :
Figure imgf000131_0003
dans laquelle les groupes Ri à Rn ont les mêmes significations qu'à la revendication 1 , 1 1 ou 12 et G représente un groupe -(CH2)nY, se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi, de préférence en para,
n étant un entier allant de 1 à 6 et Y désignant -N3 ; -NR12-CH2-C≡CH dans lequel R12
représente H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; -OMs ; -OC(=O)-O-(4-nitrophényle),
Figure imgf000132_0001
ou
Figure imgf000132_0002
, Ri2 représentant H ou (C1 -C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle.
14. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 13 dans lequel Y représente -N3 ; -NR12- CH2-C≡CH dans lequel Ri2 représente H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; -OMs ou -OC(=O)-
O-(4-nitrophényle).
15. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 12 ou bien selon formule (III) de la revendication 13 avec G= -(CH2)nY avec Y= -Cl, -N3, -OH, -NH2, maléimido, haloacétamido destiné à être conjugué à un agent de ciblage.
16. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 15 dans lequel l'agent de ciblage est un ligand, une protéine, un anticorps, plus particulièrement monoclonal, un fragment de protéine ou d'anticorps, un peptide, un oligonucléotide ou un oligosaccharide.
17. Procédé de préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine, dénoté conjugué, consistant à :
(i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse d'un agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine tel que défini à l'une des revendications 1 à 16 ;
(ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés.
18. Procédé selon la revendication 17 dans lequel :
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type -SZa, l'agent de ciblage comprend :
• des groupes chimiques disulfures dans le cas où GCR1 représente -SH ;
• des groupes chimiques thiols dans le cas où GCR1 représente -SZa avec Za≠H ; • des groupes chimiques maléimido ou lodoacétamido dans le cas où GCR1 représente -SH ,
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type -C(=O)-ZbRb, on fait réagir le dérivé de cryptophycine avec les fonctions amino de l'agent de ciblage, notamment les groupes ε-amino portés par les chaînes latérales des résidues lysine (Lys) d'un anticorps ,
> en présence d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) avec G= -(CH2)nY, l'agent de ciblage comprend des groupes -SH lorsque Y= -Cl ou -maléimido, des groupes - C≡CH lorsque Y= -N3 ou des groupes acide carboxyhque lorsque Y= -OH ou -NH2 , > en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif
GCR1 de type maléimido ou haloacétamido, l'agent de ciblage comprend des groupes chimiques thiols
19. Procédé selon la revendication 17 ou 18 dans lequel
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif
GCR1 de type -SZa, l'agent de ciblage est modifié à l'aide d'un agent de modification
choisi parmi un composé de formule
Figure imgf000133_0001
dans laquelle R représente un groupe (C1-CβJalkyle, aryle, hétéroaryle, (C3-C7)cycloalkyle, (C3- C7)hétérocycloalkyle et ALK représente un groupe (C1 -CβJalkylène ,
un analogue pegylé de formule
Figure imgf000133_0002
ou un analogue sulfonique de formule
Figure imgf000133_0003
lesquelles X3 X4, X5, Xe représentent H ou un groupe
(C1 -C6)alkyle, Xi et X2 représentent -H, -CONX8X9, -NO2, X8 et X9 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, X7 représente -SO3-M+ ou H ou bien un groupe ammonium quaternaire et a désigne un entier allant de 0 à 4 et b désigne un entier allant de 0 à
2000 ,
Figure imgf000133_0004
dans laquelle - HaI représente un atome d'halogène ;
- X-io représente un atome d'halogène ou le groupe COOX14, nitro, (C1-C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène, (C2-C8)alkényle non substitué ou halogène, (C2-C8) alkynyle non substitué ou halogène, (C3-C8)cycloalkyle non substitué, aryle non substitué ou substitué par un à trois substituants sélectionnés parmi amino, atome d'halogène, groupe (C1-C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène ;
- chacun des Xn , X12, X13 représente indépendamment un atome d'hydrogène ou bien peut représenter X3 ;
ou X10 et X11 forment ensemble un cycle (C2-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupe(s) (C1-C4)alkyle ;
ou X10 ou X11 forment ensemble avec X12 un cycle (C1-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupes (C1-C4) alkyle
et X14 est -H ou un groupe (C1-C8)alkyle ;
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type -SH, l'agent de ciblage est modifié à l'aide d'un agent de modification choisi parmi succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate ; sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate ;
Figure imgf000134_0001
Figure imgf000134_0002
ALK désignant un groupe
Figure imgf000134_0003
et b étant un nombre
entier compris entre 0 et 2000 ;
Figure imgf000134_0004
; ; succinimidyl-N- bromoacétate ; succinimidyl-3-(N-bromoacétamido)propionate ;
Figure imgf000134_0005
, b étant un nombre entier compris entre 0 et 2000.
20. Conjugué susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 17 à 19.
21. Conjugué selon la revendication 20 caractérisé par un DAR déterminé à partir de la déconvolution du spectre HRMS supérieur à 1 , de préférence compris entre 2 et 10 et plus particulièrement entre 2 et 7.
22. Conjugué selon la revendication 20 caractérisé par un DAR déterminé à l'aide d'un spectrophotomètre UV supérieur à 0,5, de préférence supérieur à 1 , plus particulièrement compris entre 1 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7, le DAR étant calculé par l'équation :
DAR = CD / CA
dans laquelle :
CD = [(εA λi x Aλ2) - (εA χ2 x Aλ1 )] / [(εD λ2 x εA λ1 ) - (εA λ2 x εD λ1 )]
CA = [Aλi - (cD x εD λ1)] / εA λ1
et
Aλ1 et Aλ2 désignant respectivement les absorbances de la solution de conjugué respectivement aux longueurs d'onde λ1 et λ2 ;
εD λ1 et εD λ2 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires du dérivé de cryptophycine avant conjugaison à deux longueurs d'onde λ1 et λ2, coefficients mesurés sur les composés de formule (II) de type -SZa avec Za = -SMe ou de type -C(=O)-ZbRb avec ZbRb = -OMe ou -OCH2-CH=CH2 ;
εA λ1 et εA λ2 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires de l'anticorps nu avant conjugaison aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2.
23. Conjugué selon la revendication 22 dans lequel λ1 = 280 nm et λ2 est choisie dans la gamme de longueurs d'onde spécifiques 246 nm - 252 nm.
24. Solution de conjugué susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 17 à 19 ou comprenant le conjugué tel que défini à l'une des revendications 20 à 23.
25. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 13 pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit dérivé de cryptophycine.
26. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) :
Figure imgf000136_0001
dans laquelle :
G représente un groupe -CH=CH2 ou -(CH2)nY, se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi, de préférence en para ;
Y représente -OH ; -Cl ; -N3 ; -NH2 ; -SH ; -COOH ; -NR12-CH2-C≡CH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant ; -OC(=O)-O-(4- nitrophényle) ; -maléimido. ou de formule :
Figure imgf000136_0002
les groupes Ri à Rn ayant les mêmes significations qu'à la revendication 1 , 1 1 ou 12 et n étant un entier allant de 1 à 6, pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit dérivé de cryptophycine.
27. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine choisi parmi l'un des suivants :
Figure imgf000137_0001
Figure imgf000138_0001
Za, Zb et Rb étant tels que définis à la revendication 1 ou 10, pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine.
28. Dérivé de cryptophycine de formule :
Figure imgf000139_0001
les groupes Ri à Rn ayant les mêmes significations qu'à la revendication 1 , 1 1 ou 12 et n étant un entier allant de 1 à 6,
29. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 15 pour utilisation en tant qu'anticancéreux.
30. Conjugué selon la revendication 20 à 23 pour utilisation en tant qu'anticancéreux.
31. Solution de conjugué selon la revendication 24 pour utilisation en tant qu'anticancéreux.
32. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'un médicament anticancéreux.
33. Utilisation d'un conjugué selon la revendication 20 à 23 pour la préparation d'un médicament anticancéreux.
34. Utilisation d'une solution de conjugué selon la revendication 24 pour la préparation d'un médicament anticancéreux.
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