CN102482238A - 新颖的缀合物、其制备方法及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与至少一个念珠藻素连接的式(I)靶向剂，其中R1为卤素原子且R2为-OH、由氨基酸AA衍生的酰基或(C1-C4)烷酰基氧基；或R1和R2一起形成环氧单元；AA表示天然或非天然氨基酸；R3为C1-C6)烷基；R4和R5都为H或一起形成在C13和C14之间的双键CH＝CH；R6和R7彼此独立为H或(C1-C6)烷基；R8和R9彼此独立为H或(C1-C6)烷基；R10为苯基母核上的至少一个取代基且选自H、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基或-N((C1-C6)烷基)2；R11为苯基母核上的至少一个取代基且选自H和(C1-C4)烷基；靶向剂和念珠藻素衍生物共价连接且连接位置在带有CR1单元的苯基母核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)。

Description

新颖的缀合物、其制备方法及其治疗用途
技术领域
本发明涉及念珠藻素(cryptophycin)缀合物(conjugate)、包含它们的组合物和它们的治疗用途尤其是作为抗癌剂的用途。本发明还涉及制备这些化合物的方法和念珠藻素衍生物本身。
背景技术
[技术领域]
念珠藻素类化合物作为次级代谢物属于由念珠藻属的蓝细菌产生的缩酚酸肽大环类。它们的名称表明它们对隐球菌属的酵母具有高度的细胞毒性。该类分子的第一种代表性化合物即念珠藻素-1(C-1)在1990年从蓝细菌念珠藻属种(ATCC 53789)中分离(参见Eiβler S.，et al.，Synthesis 2006，22，3747-3789)。这些化合物的结构、通式和碳原子编号(参见WO 98/08505)如下所述：
Figure BDA0000139392070000011
以下述环氧化物官能团为特征的念珠藻素C-1和C-52具有抗癌性质。用C-52(LY 355073)进行了对肺癌的II期临床试验，参见Edelman M.J.，et al.，Lung Cancer 2003，39，197-199和Sessa C.，et al.，Eur.J.Cancer 2002，38，2388-96。念珠藻素C-55(C-52的一种前药)的本身特征在于氯醇官能团而非环氧化物官能团(Bionpally R.R.，et al.，Cancer Chemother Pharmacol 2003，52，25-33)。C-55被证实是极具活性的，但在溶液中是不稳定的。还已披露氯醇甘氨酸酯型衍生物诸如化合物C-55 Gly的稳定性是提高的(Liang J.，et al.，Investigational New Drugs 2005，23，213-224)。
Figure BDA0000139392070000021
[技术问题]
多年以来缀合物化学是已知的且已用于几类细胞毒剂例如类美登素类(WO 04/103272)、紫杉烷类(WO 06/061258)、富山霉素类(WO 09/016516)、来普霉素类(WO 07/144709)和CC-1065及其类似物(WO 2007/102069)；关于缀合物的信息还参见Monneret C.，et al.，Bulletin du Cancer.2000，87(11)，829-38和Ricart A.D.，et al.，Nature Clinical Practice Oncology 2007，4，245-255。然而，尚未将其用于与抗体或其它靶向剂缀合念珠藻素衍生物。
本发明要解决的技术问题是提供基于念珠藻素衍生物的新颖缀合物及适于缀合的新颖念珠藻素衍生物。
[现有技术]
EP 0 830 136和WO 98/08505披露了念珠藻素衍生物，但没有披露念珠藻素缀合物。WO 98/08505披露了式(A)念珠藻素衍生物：
其中Ar可表示下式基团Ar’：
Figure BDA0000139392070000023
其中R54表示H、(C1-C6)烷基、(C 1 -C 6 )烷基(R 57 ，R 57 ’，R 57 ”)、芳基、苯基、杂环烷基、卤素原子、COOR57、PO3H、SO3H、SO2R58、NR59R60、NHOR61、NHOR61’、CN、NO2、OR62、CH 2 OR 62 ’、CH 2 NR 96 R 96 ’、(C 1 -C 6 )烷基OR 100 、或SR63；R55和R56表示H、(C1-C6)烷基、C(R 57 ，R 57 ’，R 57 ”)、芳基、苯基、杂环烷基、卤素原子、COOR57、PO3H、SO3H、SO2R58、NR 59 R 60 、NHOR61、NHCHR61’、CN、NO2、OR62、CH 2 OR 62 ’、CH 2 OCOR 95 、CH 2 NR 96 R 96 ’、(C 1 -C 6 )烷基OR 100 或(C 1 -C 6 )烷基NR 59 R 60 。WO 98/08505尤其披露了以下化合物：
Figure BDA0000139392070000032
Figure BDA0000139392070000041
这些化合物的特征在于末端基团-NHC(＝O)Ot-Bu。WO 98/08505没有指明这些化合物适于进行缀合或旨在进行缀合。
US 2007/0213511披露了Calicheamicin免疫缀合物。在这些Calicheamicin免疫缀合物中提及MYLOTARG
Figure BDA0000139392070000042
(或CMA-676)，其是用于治疗AML的Calicheamicin免疫缀合物(抗CD33-Calicheamicin)。关于缀合物的信息还参见WO 2006/042240。
Al-awar R.S.，et al.，J.Med.Chem.2003，46(14)，2985-3007和Al-awar R.S.，et al.，Mol.Cancer Ther.2004，3(9)，1061-1067披露了念珠藻素衍生物及它们的体内评价。
WO 08/010101披露了抗EphA2单克隆抗体及包含与所述单克隆抗体连接的一个或多个细胞毒性化合物分子的相应缀合物。WO 08/047242披露了抗CD38单克隆抗体及包含与所述单克隆抗体连接的一个或多个细胞毒性化合物分子的相应缀合物。所述细胞毒性化合物可选自类美登素类、紫杉烷类、富山霉素类、来普霉素类和CC-1065及其类似物。
WO 2009/126934披露了抗CD70抗体和它们与细胞毒性化合物的缀合物；在细胞毒剂中提及念珠藻素。WO 2009/134976披露了具有经优化的取代程度以将所需量的细胞毒剂递送到细胞中的缀合物；在细胞毒剂中提及念珠藻素。
WO 2005/116255披露了适体和细胞毒剂的缀合物，所述细胞毒剂可以是念珠藻素(参见[0037]和表2)，其中连接基可包含PEG链([0038])。更具体地，披露了念珠藻素Cryp-NH2：
Figure BDA0000139392070000051
及其具有以下连接基的适体缀合物：NHS-PEG-赤藓醇、pNP-PEG-赤藓醇、NHS-PEG-八PEG、pNP-PEG-八PEG和PEG-comb(表3和4)。苯基环上的序列性质(-CH2O-C(＝O)-CMe2-CH2NH-...)与本发明不同。WO 2006/096754也披露了适体和细胞毒剂的缀合物，所述细胞毒剂也可以是念珠藻素。
WO 2009/002 993披露了式B-L-A细胞毒性缀合物，其包含亲水性连接基例如下式连接基：
Figure BDA0000139392070000052
所述细胞毒剂可以是念珠藻素(第46页)，但没有指明连接基的连接点。缀合物的实例为EC0262：
Figure BDA0000139392070000053
其中连接基和连接点与本发明不同。
发明内容
[定义]
使用以下定义：
●缀合物：与至少一个细胞毒性化合物分子共价连接的细胞结合剂；
●细胞结合剂：对生物靶标具有亲和力的分子，其可以是例如配体、蛋白质、抗体(更具体为单克隆抗体、蛋白质片段或抗体片段)、肽、寡核苷酸或寡糖。结合剂(binding agent)的功能在于将作为细胞毒剂的生物活性化合物引向生物靶标。优选地，结合剂不是适体；
●生物靶标：优选位于癌细胞表面或与该肿瘤相关的基质细胞表面的抗原(或抗原族)；这些抗原可以是例如生长因子受体、癌基因产物、突变“肿瘤抑制剂”基因产物、血管发生相关分子或黏附分子；
●连接基：可使细胞毒性化合物与结合剂共价连接的原子团；
●烷基：饱和脂族烃基，其通过从烷烃中除去氢原子而得到。烷基可以是直链或支链的。可提及的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、2，2-二甲基丙基和己基；
●环烷基：包含3至8个成环碳原子的环状烷基。可提及的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基；
●杂环烷基：包含至少一个与成环碳原子连接的成环杂原子(O、S或N)的环烷基；
●烷氧基：基团-O-烷基，其中所述烷基如上所述；
●烷酰基氧基：基团-O-CO-烷基，其中所述烷基如上所述；
●亚烷基：具有经验式-CnH2n-的饱和二价基团，其通过从烷烃中除去两个氢原子而得到。可提及的实例包括亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和亚己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)或以下支链基团
Figure BDA0000139392070000061
和
Figure BDA0000139392070000062
●优选地，亚烷基具有式-(CH2)n-，其中n表示整数；
●数值范围包括端值(例如范围类型“范围为1至6的n”或“1至6”包括端值1和6)。
所使用的缩写
EtOAc：乙酸乙酯；ALK：(C1-C12)亚烷基，更具体为(C1-C6)亚烷基，更具体为形式-(CH2)n-，其中n为1至12且优选为1至6的整数；aq.：水溶液；TLC：薄层色谱；MSC：甲磺酰氯；crypto表示下式单元：
Figure BDA0000139392070000063
crypto尤其表示下述D1-D8念珠藻素衍生物中的一种或实施例中的念珠藻素衍生物；Rf：保留因子；DAR：取代程度(药物-抗体比例)；DBU：1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；DCC：N，N’-二环己基碳二亚胺；DCM：二氯甲烷；DEAD：偶氮二羧酸二乙酯；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；DMA：二甲基乙酰胺；DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DME：二甲氧基乙烷；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；EEDQ：2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉；EDCl：N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺；EDTA：乙二胺四乙酸；eq.：当量；Fmoc：芴基甲氧基羰基；HOBt：1-羟基苯并三唑；HEPES：4-(2-羟基乙基)-哌嗪-1-乙磺酸；mCPBA：间氯过氧苯甲酸；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；NMP：N-甲基吡咯烷酮；AP：大气压；PABAC：“对氨基苯甲醇碳酸酯”；RP：减压；SEC：空间排阻色谱；SPE：固相萃取；RT：室温；TBDMS：叔丁基二甲基甲硅烷基；TCEP：三(2-羧基乙基)膦盐酸盐；TEA：三乙胺；TFA：三氟乙酸；TIPS：三异丙基甲硅烷基；THF：四氢呋喃；tR：保留时间。
[对本发明的详细描述]
本发明涉及与至少一个念珠藻素衍生物连接的式(I)结合剂：
Figure BDA0000139392070000071
其中
■R1表示卤素原子且R2表示-OH、由氨基酸AA衍生的酰基或(C1-C4)烷酰基氧基；
或可选择地，R1和R2形成环氧单元；
●AA表示天然或非天然氨基酸；
■R3表示(C1-C6)烷基；
■R4和R5都表示H或一起形成在C13和C14之间的双键CH＝CH；
■R6和R7彼此独立表示H或(C1-C6)烷基；
■R8和R9彼此独立表示H或(C1-C6)烷基；
■R10表示苯基母核上的至少一个取代基且选自H、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基或-N((C1-C6)烷基)2；
■R11表示苯基母核上的至少一个取代基且选自H和(C1-C4)烷基；
结合剂和念珠藻素衍生物共价连接且连接位置在带有单元CR1的苯基母核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)。
邻位(o)、间位(m)或对位(p)：
Figure BDA0000139392070000081
R1表示卤素原子，更具体为Cl；R3表示(C1-C6)烷基，更具体为Me(Me为甲基)；R6和R7彼此独立表示H或(C1-C6)烷基，更具体地，它们彼此独立表示H或Me；R8和R9彼此独立表示H或(C1-C6)烷基，更具体地，R8表示H且R9表示异丁基。
R10表示苯基母核上的至少一个取代基且选自H、-OH、(C1-C4)烷氧基或卤素原子。其也可以是-NH2、-NH(C1-C6)烷基或-N((C1-C6)烷基)2诸如-NH2或-NMe2且优选位于所述苯基母核的3位或4位。更具体地，所述苯基母核包含位于所述苯基母核的3位和4位的两个取代基。优选地，其为3-Cl和4-甲氧基。R11表示苯基母核上的至少一个取代基且选自H和(C1-C4)烷基，更具体为H。
更具体地，取代基R1至R11中的一个可选自实施例中描述的那些取代基。取代基R1至R11各自也可呈实施例中描述的空间构型中的一种(例如R或S或Z或E)。
AA表示天然或非天然氨基酸。其可以是α、β或γ氨基酸。尤其可提及以下氨基酸：丙氨酸(Ala)、β-丙氨酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸(Arg)、门冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、γ-氨基丁酸、α，α-二甲基-γ-氨基丁酸、β，β-二甲基-γ-氨基丁酸、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)及所述氨基酸的经保护形式(例如乙酰基、甲酰基、甲苯磺酰基或硝基)。优选地，其为天然氨基酸。更具体地，其为甘氨酸。
R1和R2也可一起形成环氧单元。
念珠藻素衍生物与结合剂通过连接基L来连接，所述连接基L位于带有单元CR1的苯基母核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)；因此，能够缀合的念珠藻素衍生物具有式(II)：
Figure BDA0000139392070000091
结合剂通过存在于结合剂上的反应性基团而与连接基L的另一端连接。因此，L包含至少一个可与存在于结合剂上的反应性化学基团(RCG2)反应的反应性化学基团(RCG1)。RCG1与RCG2的反应确保式(II)化合物与结合剂通过形成共价键来连接。因此，式(II)念珠藻素衍生物能够与结合剂连接。
本发明念珠藻素衍生物(包括示例说明的那些念珠藻素衍生物)可按碱或酸加成盐尤其是药用酸加成盐形式存在。
可提及的RCG1的实例包括：
(i)RCG1为反应性基团-SZa，其中Za表示H或-SRa，且Ra表示(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基；
(ii)RCG1为反应性基团-C(＝O)-ZbRb，其中Zb表示单键、-O-或-NH-，更具体为-O-，且Rb表示H、(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基；
(iii)在式(III)化合物的情况下，RCG1为以下反应性基团中的一种：-Cl、-N3、-OH、-NH2、马来酰亚氨基
Figure BDA0000139392070000092
或卤代乙酰氨基
Figure BDA0000139392070000093
反应性基团，其中R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为Me，
式(III)化合物为：
Figure BDA0000139392070000094
其包含基团G＝-(CH2)nY，其中Y＝-Cl、-N3、-OH、-NH2、
Figure BDA0000139392070000095
或
Figure BDA0000139392070000096
其中R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为Me；
(iv)RCG1为反应性基团马来酰亚氨基
Figure BDA0000139392070000097
或卤代乙酰氨基
Figure BDA0000139392070000098
其中R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为Me。
更具体地，-SZa可表示-SH或-SS(C1-C6)烷基(尤其是-SSMe)或-SS-杂芳基[尤其是
Figure BDA0000139392070000101
或
Figure BDA0000139392070000102
(X1和X2如下所述)]。更具体地，-ZbRb可表示-OH、-OCH3、-OCH2CH＝CH2、
Figure BDA0000139392070000103
或
Figure BDA0000139392070000104
其中GI表示至少一个吸电子基团，诸如-NO2或-Hal，尤其是-F。它们可以是例如以下基团：
Figure BDA0000139392070000105
或
Figure BDA0000139392070000106
另一种类型的基团-C(＝O)ZbRb为
Figure BDA0000139392070000107
反应性基团-SH和
Figure BDA0000139392070000108
显示出良好的反应性。更具体地，RCG1可选自实施例中描述的那些RCG1中的一种。
可提及的RCG2的实例包括赖氨酸中由赖氨酸残基的侧链所带有的存在于抗体表面的ε-氨基、铰链区中的糖基或半胱氨酸中通过还原链内二硫化物键而形成的巯基(Garnett M.C.，et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 2001，53，171-216)。最近已公开了其它方法，例如通过突变来引入半胱氨酸(Junutula J.R.，et al.，Nature Biotechnology 2008，26，925-932和WO 09/026 274)或引入允许进行其它化学反应类型的非天然氨基酸(de Graaf A.J.，et al.，Bioconjugate Chem.2009[公开日期(网络)为2009年2月3日(浏览)]、DOI：10.1021/bc800294a、WO 2006/069246和Chin J.W.，et al.，JACS 2002，124，9026-9027(ReCode
Figure BDA0000139392070000109
技术))。这些与抗体一起使用的连接方法可用于所有已知的结合剂，这是因为在它们的结构中具有官能团。
也可对结合剂进行化学改性以引入新颖的反应性化学基团RCG2。因此，本领域技术人员公知如何在改性剂(modifying agent)的辅助下对抗体进行改性(尤其参见WO 2005/077090第14页)。改性可使缀合反应得以改善且使较多种基团RCG1得以使用。
用于引入二硫化物基团的改性剂
改性剂可以是经活化的具有式
Figure BDA00001393920700001010
的酯NHS，其中R表示(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基、(C3-C7)环烷基或(C3-C7)杂环烷基且ALK表示(C1-C6)亚烷基；例如，可使用吡啶基二硫基丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDP)或吡啶基二硫基丁酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDB或4-(吡啶-2-基二硫基)丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯)以引入二硫基吡啶基反应性基团RCG2(参见Bourdon M.A.，et al.，Biochem.J.1978，173，723-737和US 5208020)，然后可使所述二硫基吡啶基反应性基团RCG2与存在于念珠藻素衍生物中的连接基上的SH型反应性化学基团RCG1反应以形成新颖的S-S键(对于具有二硫化物键的缀合物参见实施例9)。N-羟基琥珀酰亚胺基团优先与存在于抗体上的氨基反应以形成酰胺键。改性剂的另一种实例为WO 2004/016801中公开的式或WO 2009/134976中公开的具有式的PEG化类似物或WO 2009/134977中公开的具有式
Figure BDA0000139392070000113
的磺基类似物，其中
-X3、X4、X5和X6表示H或(C1-C6)烷基，
-X1和X2表示-H、-CONX8X9或-NO2，其中X8和X9表示H或(C1-C6)烷基，
-X7表示-SO3 -M+或H，或可选择地，X7表示季铵基团，
-a表示0至4的整数且b表示范围为0至2000且优选为1至200的整数；a和b分别可取在0和4之间或在0和2000之间的所有值。
用于引入马来酰亚氨基的改性剂
改性剂的另一种实例为4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯(SMCC)、EP 0 306 943中公开的类似化合物或磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚氨基酯)。可提及的其它实例包括
Figure BDA0000139392070000114
诸如3-马来酰亚氨基丙酸N-琥珀酰亚氨基酯；
Figure BDA0000139392070000115
诸如6-(3-马来酰亚氨基丙酰氨基)己酸N-琥珀酰亚氨基酯；
Figure BDA0000139392070000121
其中b为0至2000且优选为1至200的整数(b可取在0和2000之间的所有值)，诸如3-(2-{2-[3-马来酰亚氨基丙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯或SM(PEG)2；
Figure BDA0000139392070000122
诸如琥珀酸马来酰亚氨基乙基酯·N-琥珀酰亚氨基酯；
Figure BDA0000139392070000123
诸如4-(4-马来酰亚氨基苯基)丁酸N-琥珀酰亚氨基酯；或
Figure BDA0000139392070000124
诸如3-马来酰亚氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯。
用于引入巯基的改性剂
改性剂的另一种实例为WO 90/06774中公开的式
Figure BDA0000139392070000125
其中
-Hal表示卤素原子；
-X10表示卤素原子、COOX14、硝基、未取代或卤代的(C1-C8)烷基、未取代或卤代的(C1-C8)烷氧基、未取代或卤代的(C2-C8)烯基、未取代或卤代的(C2-C8)炔基、未取代的(C3-C8)环烷基或未取代或取代有一个至三个选自以下的取代基的芳基：氨基、卤素原子、未取代或卤代的(C1-C8)烷基和未取代或卤代的(C1-C8)烷氧基；
-X11、X12和X13各自独立表示氢原子或可表示X3；
或X10和X11一起形成环(C2-C5)亚烷基，所述环(C2-C5)亚烷基是未取代的或取代有一个至五个(C1-C4)烷基；
或X10和X11与X12一起形成环(C1-C5)亚烷基，所述环(C1-C5)亚烷基是未取代的或取代有一个至五个(C1-C4)烷基；
且X14为-H或(C1-C8)烷基。
优选地，Hal表示氯原子或溴原子。下表给出了可能的X10-X13：
Figure BDA0000139392070000126
亚氨基硫杂环戊烷的优选实例为
Figure BDA0000139392070000132
用于引入卤代乙酰氨基的改性剂
改性剂的另一种实例为4-(N-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亚氨基酯(SIAB)
Figure BDA0000139392070000133
或类似化合物，所述类似化合物包括碘乙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SIA)
Figure BDA0000139392070000134
溴乙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SBA)、3-(N-溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚氨基酯(SBAP)或WO 2009/134 976中公开的类似PEG化化合物
Figure BDA0000139392070000135
其中b如上所述。图1和2显示了用SPDP或上述优选的亚氨基硫杂环戊烷对结合剂中的氨基进行的改性。
因此，在RCG1表示-SH的情况下，可将二硫化物基团RCG2(-SSR)尤其是吡啶基二硫化物型二硫化物基团RCG2(-SSR)
Figure BDA0000139392070000136
或
Figure BDA0000139392070000137
引入到结合剂上。类似地，在RCG1表示二硫化物(即RCG1＝-SZa，其中Za≠H且例如
Figure BDA0000139392070000138
)的情况下，可例如用亚氨基硫杂环戊烷将巯基RCG2(-SH)引入到结合剂上。在这两种情况下，通过RCG1与RCG2的反应而形成的共价键为可裂解的二硫化物键。
在RCG1表示-SH的情况下，可将马来酰亚氨基型RCG2基团
Figure BDA0000139392070000139
或卤代乙酰氨基型RCG2基团(例如溴乙酰氨基或碘乙酰氨基
Figure BDA0000139392070000141
)引入到结合剂的表面上。相反地，在RCG1表示
Figure BDA0000139392070000142
或
Figure BDA0000139392070000143
的情况下，可例如用亚氨基硫杂环戊烷将巯基RCG2(-SH)引入到结合剂上。在该情况下，通过RCG1与RCG2的反应而形成的共价键为不可裂解的硫化物键。
Figure BDA0000139392070000151
Figure BDA0000139392070000161
更具体地，在RCG1具有上述类型(iii)的情况下，可使用合适的改性剂对结合剂进行化学改性或可引入一种或多种非天然氨基酸以引入合适的官能团RCG2。例如：
-对于官能团-N3：RCG2可以是-C≡CH；
-对于官能团-OH或-NH2：RCG2可以是羧酸官能团；
-对于官能团-Cl：RCG2可以是-SH。
在RCG1表示马来酰亚氨基
Figure BDA0000139392070000171
或卤代乙酰氨基反应性基团(其中R12表示H或(C1-C6)烷基且更具体为Me)的情况下，念珠藻素衍生物可具有下式(IIa)或(IIb)：
Figure BDA0000139392070000173
(L*表示连接基L的片段且因此L＝-L*-马来酰亚氨基或L＝-L*-卤代乙酰氨基)
在C-52系列和C-1系列中，念珠藻素衍生物可以是以下D1-D8中的一种：
Figure BDA0000139392070000174
Figure BDA0000139392070000181
或实施例中的一个中描述的等价单元。
更具体地，L位于单元RC1的对位。
制备念珠藻素衍生物的方法
式(II)化合物根据方案1由式(III)念珠藻素衍生物和连接基前体(LP)开始来制备：
Figure BDA0000139392070000182
方案1
G表示基团-CH＝CH2、-(CH2)nY或-(C1-C6)亚烷基-Y，其中n为范围为1至6的整数且Y表示-OH、-SH、-Cl或-OLG，其中LG表示离去基例如甲磺酸酯基团(OMs)或甲苯磺酸酯基团，或可选择地，Y表示-N3、-NH2、-COOH或-NR12-CH2-C≡CH，其中R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为甲基。连接基前体LP具有在基团G与存在于LP上的化学官能团进行反应后将连接基L引入到念珠藻素衍生物中的官能团。
G也可表示基团
Figure BDA0000139392070000183
(即Y表示基团
Figure BDA0000139392070000184
)，其选自以下9种基团中的一种(R12和R’12表示H或(C1-C6)烷基)：
Figure BDA0000139392070000185
Figure BDA0000139392070000186
或-(CH2)n-SH。
在方案1中，几个步骤和/或反应可能是由念珠藻素衍生物(III)开始而得到念珠藻素衍生物(II)所需要的。因此，例如在Za＝H的情况下，优选使用相应的连接基前体来引入其中Za＝-S(C1-C6)烷基的连接基L，然后将二硫化物官能团-SS(C1-C6)烷基还原成巯基官能团-SH。为了进行上述反应，可使用例如TCEP，相关事项参见Burns J.A.，et al.，J.Org.Chem.1991，56(8)，2648-2650。该转化-SS(C1-C6)烷基→-SH可例如用于表II中的连接基L1-4和L21-23。
类似地，在
Figure BDA0000139392070000191
的情况下，其中ZbRb＝-O-烯丙基的连接基L可使用相应的连接基前体来引入，然后对官能团-COOH进行脱保护，且引入
Figure BDA0000139392070000192
脱保护可如下进行：在“清除剂”胺例如吗啉存在下用钯催化剂例如Pd(PPh3)4处理；活化可在碱例如DIPEA存在下用碳酸N，N’-二琥珀酰亚氨基酯进行或在偶联剂例如DCC存在下用NHS进行。上述基团ZbRb向另一种基团ZbRb的转化(例如-O-烯丙基→
Figure BDA0000139392070000193
)可用于得到其它基团ZbRb尤其是上述那些基团ZbRb。
在R1表示卤素原子且R2表示酰基的情况下，优选首先制备其中R2表示-OH的式(II)化合物(在已引入连接基后)，然后使用相应的酰化化合物来引入酰基。
方案1’和1”类似地显示了包含连接基的念珠藻素衍生物的制备，所述连接基分别为马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基(L*表示连接基的片段且因此L＝-L*-马来酰亚氨基或L＝-L*-卤代乙酰氨基)。
方案1’
Figure BDA0000139392070000195
方案1”
这些衍生物如下得到：使包含连接基L’的念珠藻素衍生物与用于分别引入马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基的改性剂反应，所述连接基L’为氨基或巯基。
基团G与存在于LP上的化学官能团进行反应的实例
●使带有胺官能团-NH-(胺盐也可以是适用的)的连接基前体LP与G＝-(CH2)nCl或-(CH2)nOMs进行亲核取代反应(参见例如表II中的LP1-4、LP7a、LP8-10和LP21-23)：该反应可在极性非质子性溶剂中在碱例如TEA或DIPEA存在下进行。参见实施例1化合物7或实施例15化合物48；
●使带有氨甲酰卤官能团的连接基前体LP与G＝-(CH2)nOH进行酰化反应(参见例如表II中的LP5)：该反应可在极性非质子性溶剂中在胺碱例如TEA存在下进行。
在一种变体中，可根据下述方案(R12＝H或(C1-C6)烷基)使带有胺官能团-NH-的连接基前体LP与得自G＝-(CH2)nOH和氯甲酸对硝基苯基酯的G＝-(CH2)nO-C(＝O)-O-(4-硝基苯基)(将醇活化成碳酸酯形式)反应：
-NHR12+crypto-(CH2)nO-C(＝O)-O-(4-硝基苯基)→
crypto-(CH2)nO-C(＝O)-NR12-
●将醇活化成碳酸酯形式也可根据以下相应的方案用于使带有官能团-OH的连接基前体与G＝-(CH2)nNH2或-(CH2)nOH反应以分别得到氨基甲酸酯官能团(-O-C(＝O)-NH-)或碳酸酯官能团(-O-C(＝O)-O-)：-O-C(＝O)-O-(4-硝基苯基)+crypto-(CH2)nNH2→crypto-(CH2)nNH-C(＝O)-O--OH+crypto-(CH2)nO-C(＝O)-O-(4-硝基苯基)→crypto-(CH2)nO-C(＝O)-O-(参见例如表II中的LP6a-6b和LP24-25)
●使带有酸官能团-COOH的连接基前体LP与G＝-(CH2)nOH进行酯化反应(参见例如表II中的LP14b)：该反应可在极性非质子性溶剂中在胺碱例如DMAP和偶联剂例如DCC存在下进行；
●使带有酸官能团-COOH的连接基前体LP与G＝-(CH2)nNH2进行酰胺化反应(参见例如表II中的LP14a)：该反应可在极性非质子性溶剂中在偶联剂例如EDCI或HOBt存在下进行；
●使带有官能团-NH2的连接基前体LP与G＝-(CH2)nCOOH进行酰胺化反应(参见例如表II中的LP7c)：该反应可在极性非质子性溶剂中在偶联剂例如EDCI或HOBt存在下进行；
●使带有末端炔烃官能团的连接基前体LP与G＝-(CH2)nN3进行1，3-偶极环加成反应(1，3-dipolar cycloaddition)(也称为“搭扣(click)”化学反应)或可选择地使带有叠氮官能团的连接基前体LP与G＝-(CH2)nNR12-CH2C≡CH进行1，3-偶极环加成反应(也称为“搭扣”化学反应)(参见例如表II中的LP15-18)：该反应可在极性溶剂中在作为催化剂的Cu(I)存在下进行(Huisgen环加成反应相关事项参见Rostovtsev V.V.，et al.，Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，2596-2599和Tornoe C.W.，et al.，J.Org.Chem.2002，67，3057-3064)；
●使带有乙烯性末端官能团的连接基前体LP与G＝-CH＝CH2进行易位反应(metathesis)(参见表II中的LP19和LP20)：该反应可在极性非质子性溶剂中在第二代Grubbs催化剂(CAS No.246047-72-3，相关事项参见Poeylaut-Palena A.A.，et al.，J.Org.Chem.2008，73，2024-2027)存在下进行。
关于连接基L
连接基L可选自以下基团中的一种：
-G’X(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y’-(CR15R16)u Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t(CR17＝CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17＝CR18)(CR15R16)u Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌嗪基-CO(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-CO(CR15R16)uY’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Y’QRCG1；-G’X(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)uQ RCG1；-G’X(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌嗪基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Q RCG1；或
-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y’-(CR15R16)u Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t(CR17＝CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17＝CR18)(CR15R16)u Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌嗪基-CO(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-CO(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Y’QRCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)uQ RCG1；-G”Y(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌嗪基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌嗪基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u QRCG1；-G”Y(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Q RCG1；
G’表示-CH＝CH-或-(CH2)n-；
G”表示-(CH2)n-；
n表示范围为1至6的整数；
X表示单键、-CO-、-COO-或-CONR12-，其中基团CO与G’连接；
Y表示-O-、-OCO-、-OCOO-、-OCONR12-、-NR12-、-NR12CO-、-NR12CONR’12-、-NR12COO-或-S(O)q-，其中原子O或基团NR12与G”连接；
Y’表示-O-、-OCO-、-OCOO-、-OCONR12-、-NR12-、-NR12CO-、-NR12CONR’12-、-NR12COO-、-S(O)q-、-CO-、-COO-或-CONR12-；
R12、R’12、R13、R14、R15、R16、R17和R18彼此独立表示H或(C1-C6)烷基；
t、u和y表示范围可以是0(在不存在基团的情况下)至20的整数且t+u+y大于或等于1；
q表示可以是0、1或2的整数；
Q表示单键、(C1-C10)亚烷基或(OCH2CH2)i，其中i为具有以下范围的整数，所述范围为1至20，更具体为1至10，甚至更具体为1至8或1至6，且甚至更具体为2至5。i可取这些范围内的每个值且尤其可以是2、3、4或5。
在连接基具有式-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y’-(CR15R16)u Q RCG1的情况下，若y为0(无PEG基团)且若Q表示单键，则u不能为0。更具体地，包含末端基团-NR12-C(＝O)-O-(Y’＝NR12；u＝0；Q＝单键；且RCG1＝-C(＝O)ZbRb)的连接基被排除。
y表示具有以下范围的整数，所述范围为0至20，更具体为1至20，甚至更具体为1至10、1至8或1至6，且甚至更具体为2至5。y可取这些范围内的每个值且尤其可以是2、3、4或5。
这些连接基中的一些参见专利申请WO 07/085930和WO 09/016516。
连接基L可选自那些具有式(IV)的连接基中的一种：
Figure BDA0000139392070000231
其中
●(AA)w表示w个氨基酸AA通过肽键而连接在一起的序列；
●w表示范围为1至12且优选为1至6的整数；
●n表示范围为1至6的整数；
●D表示以下单元中的一种：
Figure BDA0000139392070000241
其中
R12表示H或(C1-C6)烷基；
R19、R20、R21和R22彼此独立表示H、卤素原子、-OH、-CN或(C1-C4)烷基；
与(CH2)n连接的T表示NR12或O；
V1表示O、S或NR12；
V2表示CR22或N；
V3、V4和V5彼此独立选自CR22和N。
D2的实例如下所述：
Figure BDA0000139392070000242
AA表示天然或非天然氨基酸，更具体选自丙氨酸(Ala)、β-丙氨酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸(Arg)、门冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、γ-氨基丁酸、α，α-二甲基-γ-氨基丁酸、β，β-二甲基-γ-氨基丁酸、鸟氨酸(Orn)和瓜氨酸(Cit)。
序列(AA)w具有下式：
Figure BDA0000139392070000243
其中R23表示上述氨基酸中的一种的残基。序列的实例如下所述：Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Val-Cit、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lsy、Ala-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Phe、Gly-Gly-Gly、Gly-Ala-Phe、Gly-Val-Cit、Gly-Phe-Leu-Cit、Gly-Phe-Leu-Gly或Ala-Leu-Ala-Leu。
连接基前体为包含相应-OH单元的那些连接基前体：
Figure BDA0000139392070000251
WO 2005/082 023(尤其参见第61-64页)公开了如何得到某些连接基前体。下述制备连接基前体LP25和LP26的方法也可用于得到其它包含另一种序列(AA)w的类似连接基前体。
连接基L也可选自表II中描述的那些连接基L中的一种或所示例的化合物。在所有连接基结构式中，NR12或NR’12更具体地表示NH或NMe。
式(III)化合物的制备
在G＝-(CH 2 ) n OH或-CH＝CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000252
方案2
P1根据专利申请WO 98/08505、WO 00/23429或WO 00/34252及以下公开出版物的教导来制备：Rej R.，et al.，J.Org.Chem.1996，61，6289-6295、Salamonczyk G.M.，et al.，J.Org.Chem.1996，61，6893-6900或J.Med.Chem.1999，42(14)，2588-2603(并入本申请作为参考)。“The isolation，characterization and development of a novel class of potent antimitoticmacrocyclic depsipeptides：the cryptophycins”，Chap.9，in“Anticancer agentsfrom natural products”，Taylor&Francis，CRC press book，ISBN＝0-8493-1863-7(第158-159页)给出了用于制备各种念珠藻素片段(A、B、C和D)和产生P1的合成方案。Rej R.，et al.，J.Org.Chem.1996，61，6289-6295在方案1-6中公开了得到图1所示念珠藻素衍生物中的一种的途径，但这些方案可使用合适的起始试剂来用于制备P1。
P1在下述步骤的辅助下可用于制备其它念珠藻素衍生物：
步骤(i)：在酸性介质中打开P1中的环氧化物环，从而得到二醇官能团。例如，可使用浓的高氯酸；
步骤(ii)：使用例如高碘酸钠对二醇进行氧化裂解；
步骤(iii)：使用合适的卤化磷例如溴化磷和强碱例如BuLi来进行Wittig反应；
步骤(iv)：在碱例如KOH存在下使用手性锍盐例如三氟甲磺酸盐来进行Corey-Chaykovsky环氧化反应；
步骤(v)：使用例如四丁基氟化铵溶液对甲硅烷基醚进行脱保护。
4-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)苄基三苯基溴化磷得自1-(溴甲基)-4-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)苯(CAS No.934667-38-6)，所述1-(溴甲基)-4-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)苯(CAS No.934667-38-6)的制备(由1，4-苯二甲醇(CASNo.589-29-7，商购产物)开始)参见Potter R.G.，et al.，Organic Letters 2007，9(7)，1187-1190。其中R11表示(C1-C4)烷基的化合物由相应的二醇开始以类似的方式来得到，所述相应的二醇为商购产物或由1，4-苯二甲醇开始通过Friedel-Crafts C-烷基化来得到。
由1-(溴甲基)-4-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)苯(CAS No.135408-73-0)(其制备参见EP 0 496 548中的方案4a或Nevill C.R.Jr.，et al.，Bioorganic&Med.Chem.Lett.1991，1(1)，83-86(第83页))开始，可得到相应的溴化磷。其中R11表示(C1-C4)烷基的化合物由相当于Nevill C.R.Jr.，et al.，Bioorganic&Med.Chem.Lett.1991，1(1)，83-86(第83页)所述化合物1的化合物以类似的方式来得到，所述化合物为商购产物或由对甲苯基乙酸开始通过Friedel-Crafts C-烷基化来得到。
用于步骤(iv)的(1R，4R，5R，6R)-4，7，7-三甲基-6-(4-乙烯基苄基)-6-硫鎓-二环[3.2.1]辛烷三氟甲磺酸盐((1R，4R，5R，6R)-4，7，7-Trimethyl-6-(4-vinylbenzyl)-6-thionia-bicyclo[3.2.1]octanetrifluoromethanesulfonate)由(1R，4R，5R)-异硫代桉树脑((1R，4R，5R)-isothiocineole)来得到(参见Aggarwal V.et al.，JACS 2010，132，1828-1830)，所述(1R，4R，5R)-异硫代桉树脑由(R)-柠檬烯(CAS No.95327-98-3，商购产物)的制备参见该相同的参考文献。
三苯基(对乙烯基苄基)溴化磷(CAS No.118766-51-1)得自相应的溴衍生物(参见Drefahl G.，et al.，Chem.Ber.1961，94(8)，2002-2010)，所述相应的溴衍生物的制备(由4-乙烯基苯甲醇(CAS No.1074-61-9，商购产物)开始)参见Shimomura O.，et al.，Tetrahedron 2005，61，12160-12167。
由P7或P8即其中G＝-(CH2)nOH的式(III)化合物开始，可得到含有其它基团G的其它式(III)化合物。
在G＝-(CH 2 ) n Cl或-(CH 2 ) n N 3 的情况下
方案3
由基团G＝-CH2OH开始，可得到基团G＝-CH2Cl或-CH2N3：
-可在CMS存在下引入-Cl，参见实施例1化合物2；
-可在二苯基磷酰叠氮(PhO)2P(＝O)N3和碱例如DBU存在下进行叠氮化。方案3描述了当n＝1时的这些反应，但其也可用于n＞1的情况。
在G＝-(CH 2 ) n COOH的情况下
Figure BDA0000139392070000272
方案4
由基团G＝-(CH2)2OH开始，可通过氧化来得到基团G＝-CH2COOH。方案4描述了双重氧化：第一氧化使用戴斯-马丁(Dess-Martin)试剂来进行(参见“Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis”；Paquette L.A.，Ed.；Wiley：Chichester，UK，1995，Vol.7，4982-4987或Boeckman R.K.Jr.，et al.，J.J.“TheDess-Martin Periodinane”Org.Synth.2004，10，696-702)，然后在2-甲基丁-2-烯存在下进行Pinnick型第二氧化(Pinnick H.W.，Tetrahedron 1981，37，2091-2096)。方案4描述了当在起始化合物中n＝2时的这些反应，但其也可用于n＞2的情况。
在G＝-(CH 2 ) n NH 2 的情况下
方案5
由基团G＝-CH2N3(其制备在方案3中描述)开始，在使用膦诸如TCEP进行还原反应的辅助下可得到基团G＝-CH2NH2。相关事项参见Faucher A.-M.et al.，Synthetic Comm.2003，33，3503-3511。
方案5’
根据一种变体，由基团G＝-CH2OH开始，在使用三苯基膦和DEAD进行Mitsunobu反应的辅助下可得到基团G＝-CH2NH2。相关事项参见Mitsunobu O.，Synthesis 1981，1-28、Hughes D.L.，Org.Reactions 1992，42，335-656和Hughes D.L.，Org.Prep.1996，28，127-164。方案5和5’描述了n＝1的情况，但其也可用于n＞1的情况。
在G＝-(CH 2 ) n -NR 12 -CH 2 C≡CH的情况下
由基团G＝-(CH2)nCl开始，在使用式NHR12-CH2-C≡CH化合物(R12＝H：炔丙基胺；R12＝(C1-C6)烷基：根据Mock W.L.，et al.，J.Org.Chem.1989，54(22)，5302-8来制备)进行亲核取代反应的辅助下可得到基团G＝-(CH2)n-NR12-CH2-C≡CH。
在G＝-(CH 2 ) n -SH的情况下
Figure BDA0000139392070000291
方案6
由基团G＝-(CH2)nCl开始，在三甲基甲硅烷基硫醇四丁基铵的辅助下可通过直接官能化来得到基团G＝-(CH2)nSH(参见实施例8)，所述三甲基甲硅烷基硫醇四丁基铵由四丁基氟化铵和二(三甲基甲硅烷基)硫烷(hexamethyldisilathiane)根据Hu J.et al.，J.Org.Chem.1999，64，4959-4961来原位制备。方案6描述了当n＝1时的该反应，但其也可用于n＞1的情况。在该反应过程中，可形成具有下式的中间体二聚物：
Figure BDA0000139392070000292
在G＝-ALK-SH的情况下
Figure BDA0000139392070000293
方案7
P3根据方案7而可用于制备其它念珠藻素衍生物：
步骤(i)：使用合适的卤化磷例如溴化磷和强碱例如BuLi来进行Wittig反应；
步骤(ii)：在钯或镍催化剂存在下使用合适的Grignard试剂例如被保护成甲硅烷基醚形式的烷氧基溴化镁来进行Kumada偶联(参见例如OrganicLetters 2009，11，5686-5689或Synthesis 2009，141，2408-2412)。
步骤(iii)至(v)在方案2中描述且步骤(vi)在方案6中描述。
(4-溴苄基)三苯基溴化磷为商购产物(CAS No.51044-13-4)。被保护成甲硅烷基醚形式的烷氧基溴化镁可由相应的溴代醇如下制备：用合适的氯甲硅烷对醇官能团进行保护，然后在无水极性非质子性溶剂例如THF中在镁存在下形成有机镁试剂(参见例如Organic Letters 2005，7，183-186)。含有1至6个碳原子的直链或支链溴代醇是商购的(例如3-溴丙-1-醇(CAS No.627-18-9)或1-溴丙-2-醇(CAS No.19686-73-8))或可由相应的溴代酯或溴代酮根据文献中公开的方法来制备。氯甲硅烷可以是例如叔丁基二甲基氯甲硅烷(CASNo.18162-48-6)或三异丙基氯甲硅烷(CAS No.13154-24-0)。
在G＝-(CH 2 ) n -马来酰亚氨基的情况下
Figure BDA0000139392070000301
方案8
除方案1’(其描述了用于制备包含马来酰亚氨基单元的念珠藻素衍生物的方法)外，由基团G＝-CH2OH开始，可通过在三苯基膦和DEAD存在下根据Matuszak N.et al.，J.Med.Chem.2009，52，7410-7420来进行Mitsunobu反应而得到基团
Figure BDA0000139392070000302
方案8描述了当n＝1时的该反应，但其也可用于n＞1的情况。
上述方案1-8就处于对位的连接基而给出，但也可用于邻位或间位。类似地，它们就念珠藻素衍生物而给出，但也可用于制备其它式(II)衍生物尤其是式D1-D8衍生物。
更具体地，在C-52的情况下，可使用以下化合物，所述化合物的制备参见Al-awar R.S.，et al.，J.Med.Chem.2003，46，2985-3007或WO 98/08505：
Figure BDA0000139392070000303
另外，由其中G＝-CH2OH的化合物31b开始，可得到其中G＝-CH2Cl或-CH2N3的化合物：
●G＝-CH2Cl：参见实施例1化合物2；
●G＝-CH2N3：可在极性非质子性溶剂中在二苯基磷酰叠氮和碱诸如DBU存在下将-CH2OH转化成-CH2N3，参见实施例19化合物60；
●G＝-CH2-马来酰亚氨基：可在极性非质子性溶剂中在马来酰亚胺、三苯基膦和DEAD存在下将-CH2OH转化成-CH2-马来酰亚氨基。
J.Med.Chem.2003，46，2985-3007的教导可用于包含其它取代基R6-R9的其它念珠藻素衍生物。
连接基前体LP的制备
LP可以是以下物质中的一种：
LP1 根据下述方案来制备：
Figure BDA0000139392070000312
步骤(i)：使用NHS对酸进行活化；在室温在偶联剂例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在无水非质子性溶剂诸如DCM中的溶液存在下进行活化。所述操作可基于实施例1化合物4的条件来进行。
步骤(ii)：用哌啶N-Boc进行酰胺化；在极性非质子性溶剂中在室温在碱(所述碱可以是叔胺例如TEA或DIPEA)存在下进行肽偶联。所述溶剂可以是DMF。所述操作可基于实施例1化合物5的条件来进行。
步骤(iii)：使用酸溶液例如盐酸(例如在二噁烷中的溶液)对胺进行脱保护。所述操作可基于实施例1化合物6的条件来进行。
起始酸例如4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酸可以是商购的或由卤代羧酸通过先后用硫代乙酸钾和甲硫代磺酸酯型衍生物进行处理来制备。还参见US2 719 170。
LP2
Figure BDA0000139392070000313
根据下述方案来制备：
Figure BDA0000139392070000314
步骤(i)：用醛进行还原氨化；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如THF中分两步进行：在异丙醇钛存在下形成中间体复合物，然后用还原剂例如氰基硼氢化钠进行原位还原。所述操作可基于实施例5化合物17的条件来进行。
步骤(ii)：用酸溶液例如盐酸(例如在二噁烷中的溶液)对胺进行脱保护。所述操作可基于实施例5化合物18的条件来进行。
起始醛例如2-甲基-2-(甲基二硫基)丙醛可以是商购的或通过对带有二硫化物单元的醇进行氧化来制备，所述带有二硫化物单元的醇由经合适保护的卤代醇(例如呈甲硅烷基醚形式)通过先后用硫代乙酸钾和甲硫代磺酸酯型衍生物进行处理而得到。
LP3 ZaS-ALK-NHR12根据下述方案来制备：
在R 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000321
步骤(i)：形成肟；将上述醛溶于极性质子性溶剂诸如乙醇中，然后在碱诸如氢氧化钠存在下用O-甲基羟胺盐酸盐回流处理。所述操作可基于实施例3化合物11的条件来进行。
步骤(ii)：对肟进行还原；肟通过用硼烷-甲硫醚在无水极性非质子性溶剂诸如THF中的溶液回流处理来还原。所述操作可基于实施例3化合物12的条件来进行。
在R 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000322
步骤(i)：用醛进行还原氨化；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如THF中在还原剂例如三乙酰氧基硼氢化钠存在下进行。
LP4
Figure BDA0000139392070000323
根据下述方案来制备：
该连接基以与就LP2所述类似的方式来制备。
步骤(i)：用醛进行还原氨化；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如THF中分两步进行：在异丙醇钛存在下形成中间体复合物，然后用还原剂诸如氰基硼氢化钠进行原位还原。所述操作可基于实施例5化合物17的条件来进行。
步骤(ii)：用酸溶液例如盐酸(例如在二噁烷中的溶液)对胺进行脱保护。所述操作可基于实施例5化合物18的条件来进行。
LP5
Figure BDA0000139392070000331
根据下述方案来制备：
Figure BDA0000139392070000332
步骤(i)：对胺进行保护；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱例如TEA存在下用一缩二碳酸二叔丁酯对胺进行处理。
步骤(ii)：将醇转化成溴化物；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：在膦例如三苯基膦存在下用CBr4对醇官能团进行处理；相关事项参见Appel R.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1975，14，801-811或DesmarisN.，et al.，Tetrahedron Letters 2003，44(41)，7589-7591。
步骤(iii)：用硫代乙酸酯对溴化物进行取代；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如DMF中使用硫代乙酸钾作为亲核试剂来进行。
步骤(iv)：形成二硫化物键；反应在无水极性质子性溶剂诸如甲醇中在碱例如甲醇钠和包含吡啶基二硫化物单元的试剂存在下进行。
根据一种变体：
步骤(v)：将醇活化成甲磺酸酯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱例如TEA存在下用甲磺酰氯进行处理。
步骤(vi)：形成游离的巯基；反应在回流的极性质子性溶剂诸如乙醇/水混合物中分先后两步进行：用硫脲对甲磺酸酯进行置换，然后通过加入碱诸如NaOH对异硫脲鎓盐进行原位水解。
步骤(vii)：以吡啶基二硫化物形式对巯基进行活化；反应在室温在极性质子性溶剂诸如乙醇中如下进行：在酸诸如乙酸存在下用包含吡啶基二硫化物单元的试剂进行处理。
步骤(viii)：用酸溶液例如盐酸(例如在二噁烷中的溶液)对胺进行脱保护。
步骤(ix)：将胺活化成氨甲酰氯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱诸如TEA存在下用双光气进行处理。
LP6 RbZb-OC-ALK-(OCH2CH2)i-OH根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
步骤(i)：用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液进行脱保护。
步骤(ii)：将羧酸保护成烯丙酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DMF中在烯丙基溴和碱诸如碳酸钾存在下进行。
步骤(iii)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：用在催化量的钠作用下产生的烷氧化物对被保护成酯形式的不饱和酸进行处理。
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000342
步骤(iv)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用被单保护成四氢吡喃(THP)醚形式的PEG二醇的烷氧化物对卤代酯进行处理。该型经单保护的PEG二醇的制备在文献中是公知的，参见例如RichardA.et al.Chem.Eur.J.2005，11，7315-7321或Sakellariou E.G.，et al.Tetrahedron 2003，59，9083-9090。
包含被保护成叔丁酯形式的酸官能团的PEG醇是商购的(例如12-羟基-4，7，10-三氧杂十二烷酸叔丁酯)或由丙烯酸叔丁酯和PEG二醇来制备。起始PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP7 RbZbOC-ALK-(OCH2CH2)i-NHR12根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
在R 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000343
在R 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000351
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
在R 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000352
在R 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000353
步骤(i)：将羧酸保护成烯丙酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中在烯丙醇、偶联剂诸如EDCI和碱诸如DMAP存在下进行。所述操作可基于实施例14化合物42的条件来进行。
步骤(ii)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液进行脱保护。所述操作可基于实施例14化合物43的条件来进行。
步骤(iii)：对氮原子进行烷基化；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：在带有离核基团的试剂诸如烷基卤化物存在下用碱诸如NaH进行处理。所述操作可基于实施例15化合物46的条件来进行。
步骤(iv)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用在NaH或萘钾(potassium naphthalenide)作用下产生的二苯甲酮-亚胺-PEG-醇的烷氧化物对卤代酯进行处理(参见WO 2007/127 440)；
步骤(v)：对酯进行皂化；反应如下进行：在水存在下使酯与氢氧化锂反应。
步骤(vi)：对胺进行保护；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱例如TEA存在下用一缩二碳酸二叔丁酯对胺进行处理。
氨基-PEG-酸对于i＝3、5、6或10是商购的或可由丙烯酸叔丁酯和相应的氨基-PEG-醇来制备。
氨基-PEG-醇例如对于i＝3、4、7或8是商购的或可由PEG二醇根据US 7230101中公开的操作来制备，所述PEG二醇对于i＝3至12是商购的。胺官能团可用二苯甲酮通过在Lewis酸诸如BF3乙醚合物存在下进行共沸脱水来保护。
LP8
Figure BDA0000139392070000361
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000362
步骤(i)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液对起始化合物进行脱保护。所述操作可基于实施例16化合物50的条件来进行。
步骤(ii)：将羧酸官能团保护成烯丙酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DMF中在烯丙基溴和碱诸如碳酸钾存在下进行。所述操作可基于实施例16化合物51的条件来进行。
步骤(iii)：将醇活化成甲磺酸酯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱诸如TEA存在下用甲磺酰氯进行处理。
步骤(iv)：使甲磺酸酯官能团与化合物
Figure BDA0000139392070000363
中的胺官能团反应(烷基化)；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中在碱诸如TEA存在下进行。所述操作可基于实施例16化合物52的条件来进行。
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000364
步骤(v)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用被单保护成四氢吡喃(THP)醚形式的PEG二醇的烷氧化物对卤代酯进行处理。该型经单保护的PEG二醇的制备在文献中是公知的，参见例如Richard A.et al.Chem.Eur.J.2005，11，7315-7321或Sakellariou E.G.，et al.Tetrahedron 2003，59，9083-9090。
包含被保护成叔丁酯形式的酸官能团的PEG醇是商购的(例如12-羟基-4，7，10-三氧杂十二烷酸叔丁酯)或由丙烯酸叔丁酯和PEG二醇来制备。起始PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP9 根据下述方案来制备：
Figure BDA0000139392070000372
步骤(i)：对胺进行烷基化；反应在无水极性非质子性溶剂诸如乙腈中在碱例如TEA存在下用卤代烷基羧酸烯丙酯例如溴乙酸烯丙酯进行。所述操作可基于实施例13化合物38的条件来进行。
步骤(ii)：使用酸溶液例如盐酸(例如在二噁烷中的溶液)对胺进行脱保护。所述操作可基于实施例13化合物39的条件来进行。
卤代烷基羧酸烯丙酯可由烯丙醇和相应的卤代酰氯来得到且对于ALK＝-(CH2)1-6-是商购的(例如溴乙酰溴或4-丁酰氯)。
LP10
Figure BDA0000139392070000373
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000374
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000375
步骤(i)：打开环状酸酐；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中在碱诸如TEA存在下进行。
步骤(ii)：将羧酸保护成烯丙酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中在烯丙醇、偶联剂诸如EDCI和碱诸如DMAP存在下进行。
步骤(iii)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)进行脱保护。
步骤(iv)：进行肽偶联；羧酸与胺的反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中在偶联剂诸如DIC/HOBt系统存在下进行。
步骤(v)：对甲酯进行皂化；反应在室温在极性溶剂混合物诸如THF/水混合物中在氢氧化锂存在下进行。
被单保护成甲酯形式的二酸对于ALK＝-(CH2)1-6-是商购的(诸如1，6-己二酸单甲酯)。
LP11
Figure BDA0000139392070000381
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
在R 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000382
步骤(i)：形成酰胺且对酸进行活化；两个步骤先后在极性非质子性溶剂诸如DCM中进行：使胺官能团与卤代乙酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯反应，然后原位加入偶联剂诸如DIC。所述操作可基于实施例17化合物56的条件来进行。
在R 12 ≠H的情况下
步骤(ii)：将羧酸保护成甲酯形式且将胺保护成三氟乙酰胺形式；反应分先后两步在极性非质子性溶剂诸如DCM中进行：通过在甲醇存在下用三甲基甲硅烷基重氮甲烷进行处理对酸进行保护，然后通过加入三氟乙酸酐和碱诸如TEA对胺进行保护。
步骤(iii)：对胺进行烷基化且对酯进行皂化；反应分先后两步在无水极性非质子性溶剂诸如THF中进行：通过在带有离核基团的试剂例如烷基卤化物R12Hal存在下用碱诸如NaH进行处理对胺进行烷基化，然后加入氢氧化锂和水。
步骤(i)：对于R12＝H，在步骤(iii)后重复步骤(i)的反应。
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
在R 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000391
在R 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000392
步骤(iv)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用在NaH或萘钾作用下产生的二苯甲酮-亚胺-PEG-醇的烷氧化物对卤代酯进行处理(参见WO 2007/127440)；
步骤(v)：亚胺通过在钯/炭存在下进行氢化来选择性裂解(参见Wessjohann，L.et al.，Synthesis 1989，5，359-63)；
步骤(vi)：通过加入三氟乙酸酐和碱诸如TEA对胺进行保护。
氨基-PEG-酸对于i＝3、5、6或10是商购的或可由丙烯酸叔丁酯和相应的氨基-PEG-醇来制备。
氨基-PEG-醇例如对于i＝3、4、7或8是商购的或可由PEG二醇根据US 7 230 101中公开的操作来制备，所述PEG二醇对于i＝3至12是商购的。胺官能团可用二苯甲酮通过在Lewis酸诸如BF3乙醚合物存在下进行共沸脱水来保护。
LP12
Figure BDA0000139392070000393
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000394
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000401
步骤(i)：将醇活化成甲磺酸酯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱诸如TEA存在下用甲磺酰氯进行处理。
步骤(ii)：进行甲磺酸酯/卤素交换；在回流的极性非质子性溶剂诸如丙酮中与卤化钠诸如碘化钠进行反应。
步骤(iii)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。
步骤(iv)：对酸进行活化；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如DCC存在下用NHS进行处理。
步骤(v)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：用在催化量的钠作用下产生的烷氧化物对被保护成酯形式的不饱和酸进行处理。
步骤(vi)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用被单保护成四氢吡喃(THP)醚形式的PEG二醇的烷氧化物对卤代酯进行处理。该型经单保护的PEG二醇的制备在文献中是公知的，参见例如RichardA.et al.Chem.Eur.J.2005，11，7315-7321或Sakellariou E.G.，et al.Tetrahedron 2003，59，9083-9090。在pH为5的情况下将所形成的中间体选择性水解成羟基酯。
包含被保护成叔丁酯形式的酸官能团的PEG醇是商购的(例如12-羟基-4，7，10-三氧杂十二烷酸叔丁酯)或由丙烯酸叔丁酯和PEG二醇来制备。起始PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP13 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i-SH根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000411
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000412
步骤(i)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。在使用三氟乙酸溶液的情况下，可形成羟基官能团的三氟乙酸酯。在以下步骤(ii)中对其进行裂解。
步骤(ii)：将羧酸保护成甲酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如甲醇中如下进行：用三甲基甲硅烷基重氮甲烷进行处理。
步骤(iii)：将醇活化成甲磺酸酯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱诸如TEA存在下用甲磺酰氯进行处理。
步骤(iv)：形成游离的巯基且对甲酯进行皂化；反应在回流的极性质子性溶剂诸如乙醇/水混合物中分先后两步进行：用硫脲对甲磺酸酯进行置换，然后通过加入碱诸如氢氧化钠对异硫脲鎓盐进行原位水解。
步骤(v)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：用在催化量的钠作用下产生的烷氧化物对被保护成酯形式的不饱和酸进行处理。
步骤(vi)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用被单保护成四氢吡喃(THP)醚形式的PEG二醇的烷氧化物对卤代酯进行处理。该型经单保护的PEG二醇的制备在文献中是公知的，参见例如Richard A.et al.Chem.Eur.J.2005，11，7315-7321或Sakellariou E.G.，et al.Tetrahedron 2003，59，9083-9090。
其中n＝8的连接基(3-[2-巯基乙氧基七(亚乙基氧基)]丙酸)是商购的。包含被保护成叔丁酯形式的酸官能团的PEG醇是商购的(例如12-羟基-4，7，10-三氧杂十二烷酸叔丁酯)或由丙烯酸叔丁酯和PEG二醇来制备。起始PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP14
Figure BDA0000139392070000413
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000421
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000422
步骤(i)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：用在催化量的钠作用下产生的烷氧化物对被保护成酯形式的不饱和酸进行处理。
步骤(ii)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。在使用三氟乙酸溶液的情况下，可形成任选存在于结构上的醇官能团的三氟乙酸酯。在以下步骤(iii)中对该三氟乙酸酯进行裂解。
步骤(iii)：将羧酸保护成甲酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如甲醇中如下进行：用三甲基甲硅烷基重氮甲烷进行处理。
步骤(iv)：对甲酯进行皂化；反应在室温在极性溶剂混合物诸如THF/水混合物中在氢氧化锂存在下进行。
步骤(v)：将羧酸保护成烯丙酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中在烯丙醇、偶联剂诸如EDCI和碱诸如DMAP存在下进行。
步骤(vi)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用被单保护成四氢吡喃(THP)醚形式的PEG二醇的烷氧化物对卤代酯进行处理。该型经单保护的PEG二醇的制备在文献中是公知的，参见例如Richard A.et al.Chem.Eur.J.2005，11，7315-7321或Sakellariou E.G.，et al.Tetrahedron 2003，59，9083-9090。
起始PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP15
Figure BDA0000139392070000423
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000431
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
步骤(i)：进行亲核取代反应；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中在碱诸如NaH和炔基卤化物诸如炔丙基溴或4-溴-1-丁炔存在下进行。所述操作可基于实施例20化合物63的条件来进行。
步骤(ii)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。所述操作可基于实施例20化合物65的条件来进行。
步骤(iii)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如载体上的DCC存在下用NHS进行处理。
步骤(iv)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：用在催化量的钠作用下产生的烷氧化物对被保护成酯形式的不饱和酸进行处理。所述操作可基于实施例20化合物64的条件来进行。
步骤(v)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用被单保护成四氢吡喃(THP)醚形式的PEG二醇的烷氧化物对卤代酯进行处理。该型经单保护的PEG二醇的制备在文献中是公知的，参见例如Richard A.et al.Chem.Eur.J.2005，11，7315-7321或Sakellariou E.G.，et al.Tetrahedron 2003，59，9083-9090。
包含被保护成叔丁酯形式的酸官能团的PEG醇是商购的(例如12-羟基-4，7，10-三氧杂十二烷酸叔丁酯)或由丙烯酸叔丁酯和PEG二醇来制备。起始PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP16
Figure BDA0000139392070000441
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000442
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
步骤(i)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：用在催化量的钠作用下产生的烷氧化物对被保护成酯形式的不饱和酸进行处理。
步骤(ii)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。
步骤(iii)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如载体上的DCC存在下用NHS进行处理。
步骤(iv)：延长羟基叠氮基PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用羟基叠氮基PEG的烷氧化物对卤代酯进行处理。
叠氮基PEG醇是商购的或可由相应的PEG醇来制备，所述相应的PEG醇对于i＝3至12是商购的。
LP17
Figure BDA0000139392070000444
根据下述方案来制备：
Figure BDA0000139392070000445
步骤(i)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如载体上的DCC存在下用NHS进行处理。
带有炔性基团的酸对于ALK＝-(CH2)m-(其中m＝1至10)(例如3-丁炔酸)是商购的。
LP18
Figure BDA0000139392070000446
根据下述方案来制备：
Figure BDA0000139392070000447
步骤(i)：通过叠氮化物对卤化物进行亲核取代反应；反应在极性非质子性溶剂诸如丙酮中在叠氮化钠存在下进行。
步骤(ii)：对甲酯进行皂化；反应在室温在极性溶剂混合物诸如THF/水混合物中在氢氧化锂存在下进行。
步骤(iii)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如载体上的DCC存在下用NHS进行处理。
带有卤代烷基单元的甲酯对于ALK＝-(CH2)m-(其中m＝1至6)(例如溴乙酸甲酯)是商购的。
LP19
Figure BDA0000139392070000451
根据下述方案来制备：
在ALK＝CH 2 CH 2 的情况下
Figure BDA0000139392070000452
在ALK≠CH 2 CH 2 的情况下
步骤(i)：进行亲核取代反应；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中在碱诸如NaH和烯基卤化物诸如烯丙基溴或4-溴-1-丁烯存在下进行。
步骤(ii)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。
步骤(iii)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如载体上的DCC存在下用NHS进行处理。
步骤(iv)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：用在催化量的钠作用下产生的烷氧化物对被保护成酯形式的不饱和酸进行处理。
步骤(v)：延长PEG链；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：用被单保护成四氢吡喃(THP)醚形式的PEG二醇的烷氧化物对卤代酯进行处理。该型经单保护的PEG二醇的制备在文献中是公知的，参见例如Richard A.et al.Chem.Eur.J.2005，11，7315-7321或Sakellariou E.G.，et al.Tetrahedron 2003，59，9083-9090。
包含被保护成叔丁酯形式的酸官能团的PEG醇是商购的(例如12-羟基-4，7，10-三氧杂十二烷酸叔丁酯)或由丙烯酸叔丁酯和PEG二醇来制备。起始PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP20
Figure BDA0000139392070000461
根据下述方案来制备：
步骤(i)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如载体上的DCC存在下用NHS进行处理。
带有烯性基团的酸对于ALK＝-(CH2)m-(其中m＝1至10)(例如3-丁烯酸)是商购的。
LP21 ZaS-ALK-CH2-NR12-(CH2CH2O)i-CH2CH2-NHR′12根据下述方案来制备：
在R 12 和R’ 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000463
在R 12 ≠H且R’ 12 ＝H的情况下
在R 12 ＝H且R’ 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000471
在R 12 和R’ 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000472
步骤(i)：将醇活化成甲苯磺酸酯形式；反应在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在氧化银和碘化钾存在下用甲苯磺酰氯进行处理。所述操作可基于实施例6化合物23的条件来进行。
步骤(ii)：对甲苯磺酸酯进行亲核取代反应；反应在极性非质子性溶剂诸如乙腈中如下进行：用叠氮化钠进行处理。所述操作可基于实施例6化合物24的条件来进行。
步骤(iii)：对叠氮化物进行还原；反应在极性溶剂诸如THF/水混合物中在三苯基膦存在下进行。所述操作可基于实施例6化合物26的条件来进行。
步骤(iv)：用醛进行还原氨化；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中在还原剂诸如三乙酰氧基硼氢化钠和任选的乙酸(作为催化剂)存在下进行。所述操作可基于实施例6化合物27的条件来进行。
步骤(v)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。所述操作可基于实施例6化合物29的条件来进行。
步骤(vi)：对NHBoc官能团进行保护；反应在极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：先后用1当量碱诸如氢化钠和苄基卤化物诸如苄基氯进行处理。
步骤(vii)：对苄基进行裂解且对叠氮基官能团进行还原；反应在质子性溶剂诸如甲醇中在催化剂诸如氢氧化钯存在下用氢气进行。
步骤(viii)：对胺进行烷基化；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：在带有离核基团的试剂诸如烷基卤化物存在下用碱诸如氢化钠进行处理。所述操作可基于实施例6化合物25的条件来进行。
任选用Boc基团对胺官能团进行保护的氨基-PEG-醇是商购的(例如N-Boc-氨基乙氧基乙氧基乙醇或1-氨基-3，6，9-三氧杂十一烷-11-醇)或可由PEG二醇根据US 7 230 101中公开的操作来制备，所述PEG二醇对于i＝3至12是商购的。醛ZaSS-ALK-CHO例如2-甲基-2-(甲基二硫基)丙醛是商购的或可通过对带有二硫化物单元的醇进行氧化来制备，所述带有二硫化物单元的醇由经合适保护的卤代醇(例如呈甲硅烷基醚形式)通过先后用硫代乙酸钾和甲硫代磺酸酯型衍生物进行处理来得到。
LP22
Figure BDA0000139392070000481
根据下述方案来制备：
在R 12 和R’ 12 ＝H的情况下
在R 12 ≠H且R’ 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000483
在R 12 ＝H且R’ 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000484
在R 12 和R’ 12 ≠H的情况下
步骤(i)：将醇活化成甲苯磺酸酯形式；反应在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在氧化银和碘化钾存在下用甲苯磺酰氯进行处理。所述操作可基于实施例6化合物23的条件来进行。
步骤(ii)：对甲苯磺酸酯进行亲核取代反应；反应在极性非质子性溶剂诸如乙腈中如下进行：用叠氮化钠进行处理。所述操作可基于实施例6化合物24的条件来进行。
步骤(iii)：对叠氮化物进行还原；反应在极性溶剂诸如THF/水混合物中在三苯基膦存在下进行。所述操作可基于实施例6化合物26的条件来进行。
步骤(iv)：进行肽偶联；反应在极性非质子性溶剂诸如二甲基甲酰胺中在偶联剂诸如N，N’-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑系统和碱诸如TEA存在下进行。
步骤(v)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。所述操作可基于实施例7化合物32的条件来进行。
步骤(vi)：对官能团NHBoc进行保护；反应在极性非质子性溶剂诸如THF或DMF中如下进行：先后用1当量碱诸如氢化钠和苄基卤化物诸如苄基氯进行处理。
步骤(vii)：对苄基进行裂解且对叠氮基官能团进行还原；反应在质子性溶剂诸如甲醇中在催化剂诸如氢氧化钯存在下用氢气进行。
步骤(viii)：通过用醛进行还原氨化对胺进行烷基化；反应在室温在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中在还原剂诸如三乙酰氧基硼氢化钠和任选的乙酸(作为催化剂)存在下进行。
步骤(ix)：对NHBoc基团进行烷基化；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：在带有离核基团的试剂诸如烷基卤化物存在下用碱诸如氢化钠进行处理。所述操作可基于实施例6化合物25的条件来进行。
用Boc基团对胺官能团进行保护或其它处理的氨基-PEG-醇是商购的(例如N-Boc-氨基乙氧基乙氧基乙醇或1-氨基-3，6，9-三氧杂十一烷-11-醇)或可由PEG二醇根据US 7 230 101中公开的操作来制备，所述PEG二醇对于i＝3至12是商购的。羧酸ZaS-ALK-CO2H例如4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酸可以是商购的或由卤代羧酸通过先后用硫代乙酸钾和甲硫代磺酸酯型衍生物进行处理来制备。
LP23 ZaS-(CH2CH2O)i-CH2CH2-NHR12根据下述方案来制备：
在R 12 ＝H的情况下
Figure BDA0000139392070000501
在R 12 ≠H的情况下
Figure BDA0000139392070000502
步骤(i)：将醇活化成甲磺酸酯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在碱诸如TEA存在下用甲磺酰氯进行处理。
步骤(ii)：形成游离的巯基；反应在回流的极性质子性溶剂诸如乙醇/水混合物中分先后两步进行：用硫脲对甲磺酸酯进行置换，然后通过加入碱诸如氢氧化钠对异硫脲鎓盐进行原位水解。
步骤(iii)：对巯基进行保护；反应在极性溶剂混合物诸如乙醇/水混合物中在碱诸如碳酸钠存在下用包含甲硫代磺酸酯官能团的试剂例如甲硫代磺酸甲酯进行。
步骤(iv)：使用盐酸溶液(例如在二噁烷中的溶液)或三氟乙酸溶液来进行脱保护。
步骤(v)：对胺进行烷基化；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：在带有离核基团的试剂诸如烷基卤化物存在下用碱诸如氢化钠进行处理。
用Boc基团或未用Boc基团对胺官能团进行保护的氨基-PEG-醇是商购的(例如N-Boc-氨基乙氧基乙氧基乙醇或1-氨基-3，6，9-三氧杂十一烷-11-醇)或可由PEG二醇根据US 7 230 101中公开的操作来制备，所述PEG二醇对于i＝3至12是商购的。
LP24
Figure BDA0000139392070000503
根据下述方案来制备：
Figure BDA0000139392070000511
步骤(i)：将Fmoc-L-缬氨酸活化成NHS酯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：在偶联剂诸如DCC存在下用NHS进行处理。
步骤(ii)：使Fmoc-L-缬氨酸-NHS与L-瓜氨酸进行肽偶联；反应在极性溶剂诸如二甲氧基乙烷/THF/水混合物中在碱诸如碳酸氢钠存在下进行。
步骤(iii)：与4-氨基苯甲醇进行肽偶联；反应在极性溶剂诸如DCM/甲醇混合物中在偶联剂诸如EEDQ存在下进行。
步骤(iv)：对胺Fmoc进行脱保护；反应在极性溶剂诸如DCM/甲醇混合物中在碱诸如二乙胺存在下进行。
步骤(v)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如EDCI盐酸盐存在下用NHS进行处理。
步骤(vi)：使二肽与NHS酯进行肽偶联；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM/乙腈混合物中进行。
被单保护成烯丙酯形式的二酸对于n＝2是商购的(琥珀酸单烯丙酯)或可通过对单甲酯或单叔丁酯进行酯交换来制备，所述单甲酯或单叔丁酯对于n＝2至6是商购的。
LP25
Figure BDA0000139392070000512
根据下述方案来制备：
步骤(i)：将Fmoc-L-缬氨酸活化成NHS酯形式；反应在无水极性非质子性溶剂诸如THF中如下进行：在偶联剂诸如DCC存在下用NHS进行处理。
步骤(ii)：使Fmoc-L-缬氨酸-NHS与L-瓜氨酸进行肽偶联；反应在极性溶剂诸如DME/THF/水混合物中在碱诸如碳酸氢钠存在下进行。
步骤(iii)：与4-氨基苯甲醇进行肽偶联；反应在极性溶剂诸如DCM/甲醇混合物中在偶联剂诸如EEDQ存在下进行。
步骤(iv)：对胺Fmoc进行脱保护；反应在极性溶剂诸如DCM/甲醇混合物中在碱诸如二乙胺存在下进行。
步骤(v)：将羧酸活化成NHS酯形式；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM中如下进行：在偶联剂诸如载体上的DCC存在下用NHS进行处理。
步骤(vi)：使二肽与NHS酯进行肽偶联；反应在室温在极性非质子性溶剂诸如DCM/乙腈混合物中进行。
被单保护成烯丙酯形式的PEG二酸根据关于制备连接基L14的描述来制备。
LP26
Figure BDA0000139392070000522
溴乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯和碘乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯为商购产物，其CAS编号分别为42014-51-7和39028-27-8。
Figure BDA0000139392070000541
Figure BDA0000139392070000561
制备缀合物的方法
缀合物通过以下方法来得到，所述方法包括：
(i)使任选经缓冲的结合剂的水溶液与式(II)念珠藻素衍生物的溶液接触且使它们发生反应；
(ii)然后任选使步骤(i)中形成的缀合物与念珠藻素衍生物和/或未反应的结合剂和/或所形成的任何聚集物分离。
更具体地，在步骤(ii)中仅使得自步骤(i)的缀合物与未反应的念珠藻素衍生物和所形成的任何聚集物分离，而任何未反应的结合剂被留在溶液中。
进行接触的作用是使化学基团RCG1与化学基团RCG2反应以确保通过形成共价键将念珠藻素衍生物与结合剂连接；优选地
■当RCG1表示-SZa时：结合剂用改性剂改性以将合适的基团RCG2尤其是表I第2列中描述的那些RCG2引入到结合剂上：
○在RCG1表示-SH的情况下，RCG2为二硫化物化学基团；
○在RCG1表示其中Za≠H的-SZa的情况下，RCG2为巯基化学基团；
○在RCG1表示-SH的情况下，RCG2为马来酰亚氨基或碘乙酰氨基化学基团；
在抗体(MAb)的情况下，缀合物的结构式参见表I第4列；
■当RCG1表示-C(＝O)-ZbRb时：反应优选发生在结合剂中的氨基官能团尤其是抗体中由赖氨酸(Lys)残基的侧链所带有的ε-氨基上。在抗体(MAb)的情况下，在该情况下得到下式缀合物：MAb-[NH-C(＝O)-L*-Crypto]d，其中L*＝包含RCG1＝-C(＝O)-ZbRb的连接基L的片段且因此L＝-L*C(＝O)-ZbRb；
■在其中G＝-(CH2)nY的式(III)念珠藻素衍生物存在下，当Y＝-Cl时，结合剂包含基团-SH，当Y＝-N3时，结合剂包含基团-C≡CH，或当Y＝-OH或-NH2时，结合剂包含羧基；
■在包含马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基型反应性化学基团RCG1的念珠藻素衍生物存在下，结合剂包含巯基化学基团。
术语“聚集物”是指可在两个或更多个结合剂之间形成的缔合物，所述结合剂可能已通过缀合来改性。聚集物在很多种参数的影响下是易于形成的，所述参数为诸如结合剂在溶液中的高浓度、溶液的pH、高的剪切力、接枝二聚物的数目和它们的疏水性及温度(参见当涉及J.Membrane Sci.2008，318，311-316时引用的参考文献)，然而由于这些参数中的一些而引起的影响尚未被明确地阐明。在蛋白质或抗体的情况下，可参见AAPS Journal，“ProteinAggregation and Bioprocessing”2006，8(3)，E572-E579。聚集物的含量可通过已知的技术诸如SEC来确定(相关事项参见Analytical Biochemistry 1993，212(2)，469-480)。
结合剂的水溶液可例如用缓冲液诸如磷酸钾或N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES缓冲液)或缓冲液的混合物诸如下述缓冲液A进行缓冲。缓冲液取决于结合剂的性质。将念珠藻素衍生物溶于极性有机溶剂例如DMSO或DMA中。
反应在通常为20至40℃的温度进行。反应时间可为1至24小时。抗体与念珠藻素衍生物的反应可通过带有折射和/或紫外检测器的SEC来监测以确定反应的进度。若取代程度是不充分的，则反应可进行较长时间和/或可加入念珠藻素衍生物。具体的条件可参见实施例章节中较详细给出的一般方法。具体的实施方案参见实施例9、10、11、25、26和27。
本领域技术人员知晓用于在步骤(ii)中进行分离的各种色谱技术：缀合物可例如通过以下方法来纯化：空间排阻色谱(SEC)、吸附色谱(例如离子交换色谱(IEC))、疏水性相互作用色谱(HIC)、亲和色谱、在混合性载体诸如陶瓷性羟基磷灰石上进行的色谱或HPLC。也可通过透析或渗滤来进行纯化。
在步骤(i)或(ii)后，可对缀合物的溶液进行超滤和/或渗滤步骤(iii)。在这些步骤后，由此得到呈水溶液形式的缀合物。
抗体
抗体(相关事项参见Janeway et al.“Immunobiology”，5th edition，2001，Garland Publishing，New York)可选自尤其在WO 04/043 344、WO 08/010 101、WO 08/047 242、WO 05/009 369(抗CA6)或WO 2010/014 812中公开的那些抗体。抗体可任选用改性剂改性，从而促进与念珠藻素衍生物的连接(如上所述)。抗体尤其可以是单克隆、多克隆或多特异性的。其也可以是抗体片段。其也可以是鼠类抗体、人类抗体、人化抗体或嵌合抗体。
缀合物
缀合物通常包含与结合剂共价连接的约1至10个念珠藻素衍生物(其为接枝程度或“药物：抗体比例”或“DAR”)。该数目随结合剂的性质和念珠藻素衍生物的性质及缀合方法中使用的操作条件(例如念珠藻素衍生物相对于结合剂的当量数、反应时间、溶剂的性质和任何共溶剂的性质)而变化。使结合剂与念珠藻素衍生物接触，这得到包含以下物质的混合物：通过不同的DAR而彼此各自区分的几种缀合物；任选的未反应的结合剂；和任选的聚集物。因此，针对最终溶液而确定的DAR相应于平均DAR。
在结合剂为抗体的情况下，UV光谱法可以是用于确定DAR的方法。该方法基于Antony S.Dimitrov(ed)，LLC，2009，“Therapeutic Antibodies andProtocols”，vol.525，445，Springer Science中提供的方法。其包括在分离步骤(ii)后以表示为λ1和λ2的两种波长对缀合物溶液的吸光度进行测量。使用以下裸抗体在缀合前测量的摩尔消光系数和念珠藻素衍生物在缀合前测量的摩尔消光系数。
缀合物溶液在λ1和λ2的吸光度(Aλ1)和(Aλ2)通过SEC谱中的相应峰(这可计算出“DAR(SEC)”)或通过使用标准UV分光光度计(这可计算出“DAR(UV)”)来测量。可将吸光度表示成以下形式：
Aλ1＝(cD×εDλ1)+(cA×εAλ1)
Aλ2＝(cD×εDλ2)+(cA×εAλ2)
对于所述方程：
●cD和cA分别表示溶液中缀合物部分以念珠藻素衍生物计的浓度和溶液中缀合物部分以抗体计的浓度；
●εDλ1和εDλ2分别表示念珠藻素衍生物在缀合前在两种波长λ1和λ2的摩尔吸光系数，这些系数通过其中Za＝甲基S-的SZa型式(II)化合物或其中ZbRb＝甲基O-或OCH2-CH＝CH2的-C(＝O)-ZbRb型式(II)化合物来测量；
●εAλ1和εAλ2分别表示裸抗体在波长λ1和λ2的摩尔吸光系数。
术语“裸抗体”表示没有与念珠藻素衍生物连接的抗体即在缀合步骤前的抗体。
对这两个方程进行的解析得到：
cD＝[(εAλ1×Aλ2)-(εAλ2×Aλ1)]/[(εDλ2×εAλ1)-(εAλ2×εDλ1)]
cA＝[Aλ1-(cD×εDλ1)]/εAλ1
因此，平均DAR相应于cD/cA。在念珠藻素衍生物的情况下，可考虑波长λ1＝280nm，且基于念珠藻素衍生物的性质，在特异性波长范围246nm-252nm内选择λ2。DAR(UV)优选大于0.5，更具体为1至10，且甚至更具体为2至7。
缀合物可用作抗癌剂。由于结合剂的存在，缀合物对肿瘤细胞而非健康细胞具有高度的选择性。这可在与其类似的环境中或直接在其中引导念珠藻素衍生物(相关事项参见以下对单克隆抗体缀合物在治疗癌症中的用途进行描述的公开出版物：“Antibody-drug conjugates for cancer therapy”Carter P.J.，etal.，Cancer J.2008，14，154-169；和“Targeted cancer therapy：conferringspecificity to cytotoxic drugs”Chari R.，Acc.Chem.Res.2008，41，98-107)。其可治疗实体癌症或流体癌症。缀合物可单独使用或与至少一种其它抗癌剂联用。
将缀合物配制成经缓冲的水溶液形式，其浓度通常为1至10mg/ml。该溶液可按灌注形式本身来注射或可被重新稀释以形成灌注溶液。
具体实施方式
[实施例]
所使用的分析方法
高压液相色谱-质谱(LCMS)
方法A1
在70℃用Waters ZQ仪器和XBridge C18 2.5μm(3×50mm)柱进行分析，其中流速为0.9ml/min，洗脱梯度(7min)为(A)水/0.1％甲酸和(B)乙腈/0.1％甲酸(梯度：历时5.3分钟5％至100％B；在5.5分钟为100％B；和在6.3分钟为5％B)，且以阳离子模式和/或阴离子模式进行电喷雾离子化。
方法A2
在50℃用Waters UPLC-SQD仪器和Acquity BEH C18 1.7μm(2.1×50mm)柱进行分析，其中流速为1ml/min，洗脱梯度(2分钟)为(A)水/0.1％甲酸和(B)乙腈/0.1％甲酸(梯度：历时0.8分钟5％至50％B；在1.2分钟为100％B；在1.85分钟为100％B；和在1.95分钟为5％B)，且以阳离子模式和/或阴离子模式进行电喷雾离子化。
方法A3
在70℃用Waters UPLC-SQD仪器和Acquity BEH C18 1.7μm(2.1×50mm)柱进行分析，其中流速为1ml/min，洗脱梯度(2分钟)为(A)水/0.1％甲酸和(B)乙腈/0.1％甲酸(梯度：历时1分钟5％至50％B；在1.3分钟为100％B；在1.45分钟为100％B；和在1.75分钟为5％B)，且以阳离子模式和/或阴离子模式进行电喷雾离子化。
方法A4
在45℃用Waters ZQ仪器和Phenomenex Kinetex C18 100A2.6μm(3×50mm)柱进行分析，其中流速为1ml/分钟，洗脱梯度(6分钟)为(A)水/0.1％甲酸和(B)乙腈/0.1％甲酸(梯度：在0.8分钟为6％B；历时4.1分钟6％至100％B；在4.8分钟为100％B；和在5.0-6.0分钟为6％B)，且以阳离子模式和/或阴离子模式进行电喷雾离子化。
方法A5
在50℃用Waters ZQ仪器和Phenomenex Kinetex C18 2.6μm(3×1000mm)柱进行分析，其中流速为0.8ml/分钟，洗脱梯度(8分钟)为(A)水/0.1％甲酸和(B)乙腈/0.1％甲酸(梯度：在0.15分钟为4％B；历时6.85分钟4％至100％B；在7.1分钟为100％B；和在7.4-8.2分钟为4％B)，且以阳离子模式和/或阴离子模式进行电喷雾离子化。
质谱(MS)
谱图通过直接引入到Waters GCTof仪器中(在不进行LC的情况下直接引入)来得到。
空间排阻色谱-高分辨率质谱(SFC-HRMS)
所述分析可能需要对缀合物进行去糖基化的在先步骤。这如下进行：向缀合物溶液中加入2％(按体积计)的PNG酶F溶液(通过用MilliQ水将一瓶100单位N-聚糖酶冻干物补至100ml来制备)。溶液通过涡旋来匀化且在37℃孵育19小时。经去糖基化的样品供通过SEC-HRMS来分析。在30℃用AgilentHP1100仪器和Waters Biosuite 250HR SEC 4μm(4.6×300mm)柱进行色谱分析，其中流速为0.4ml/分钟且等度洗脱为历时15分钟的(A)25mM甲酸铵pH＝7/(B)乙腈70/30。用Waters QTOF II仪器进行质谱，其中以阳离子模式进行电喷雾离子化。质谱用Waters MaxEnt1软件进行解卷积。
空间排阻色谱(SEC HPLC)
用带有L2455DAD分光光度检测器和Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5μm(7.8×300mm)柱的Merck Lachrom Elite HPLC仪器进行分析，其中流速为0.5ml/分钟且用含有0.2M KCl、0.052M KH2PO4、0.107M K2HPO4和20％(按体积计)异丙醇的pH 7缓冲液进行30分钟等度洗脱。
1 H核磁共振(NMR)
用Bruker Avance波谱仪(型号为DRX-300、DRX-400、DRX-500或DMX-600)得到1H NMR谱。化学位移以ppm给出。
在念珠藻素衍生物包含以-SZ a 为结束的连接基L的情况下用于制备缀合 物的一般方法
方法分先后两步
第一步
抗体首先用经活化的NHS酯改性以将吡啶基二硫化物基团引入到其表面上。抗体hu2H11在含有0.05M磷酸钾和0.05M NaCl的pH 6.5含水缓冲液(称为缓冲液A)中的溶液用5至10当量经活化的NHS酯在DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度为5至10mg/ml且DMA在含水缓冲液中的百分比为5％。反应在室温继续进行2小时。将混合物沉积到在含有0.05M HEPES、0.05M NaCl和2mM EDTA的pH 8含水缓冲液中预平衡的凝胶过滤柱(SephadexTMG25基质，GE Healthcare)上。经改性的抗体用pH 8HEPES缓冲液洗脱，收集，然后通过UV光谱来测定，从而确定样品中的抗体浓度和吡啶基二硫化物基团的数目。经改性的抗体样品用二硫苏糖醇处理，从而对二硫化物键进行还原，且所释放的吡啶-2-硫酮通过光谱来测定(消光系数：对于吡啶-2-硫酮，ε343nm为8080M-1cm-1和ε280nm为5100M-1cm-1，且对于抗体，ε280nm为208380M-1cm-1)。每个抗体分子平均接枝有3至6个吡啶基二硫化物基团。
第二步
将得自第一步的经改性的抗体溶液稀释在上述pH 8含水缓冲液中，然后用念珠藻素衍生物(5当量)的溶液处理，从而使最终抗体浓度为3mg/ml且DMA在含水缓冲液中的百分比为20％；念珠藻素衍生物的当量数相对于在第一步中引入的吡啶基二硫化物分子数来表示。在30℃或在搅拌(约2000rpm)下将反应继续过夜。混合物通过SEC HPLC来分析，从而确定念珠藻素衍生物接枝到抗体上的程度。若取代程度是不充分的，则混合物在30℃或在搅拌(约2000rpm)下再用1至5当量念珠藻素衍生物在DMA中的溶液处理3小时。混合物用Millex
Figure BDA0000139392070000631
-SV 5μm过滤器(PVDF膜，Durapore，Millipore)过滤，然后通过凝胶过滤(使用用含有0.01M磷酸盐、0.14M NaCl和10％至20％NMP的pH 6.5含水缓冲液预平衡的Superdex 200pg基质(HiLoad 16/60脱盐柱，GEHealthcare))来纯化。收集含有呈单体形式的缀合抗体的馏分，合并且用Amicon Ultra-15(Ultracel 10k或50k膜，Millipore)浓缩至浓度为2至5mg/ml。最后改变缓冲液，从而从缀合物贮存缓冲液中除去有机溶剂。将缀合物沉积在凝胶过滤柱上，所述凝胶过滤柱包含用其组成和pH适于每种缀合物的含水缓冲液预平衡的SephadexTMG25基质(Nap-5或Nap-10或PD-10或Hiprep26/10脱盐柱，GE Healthcare)。最终缀合物通过UV光谱(使用就抗体和相应的念珠藻素衍生物而确定的消光系数)来测定，从而测量抗体浓度和平均细胞毒性数/抗体。取代程度也可通过对缀合物的SEC-HRMS谱进行解卷积来计算。
“一锅”两步法
抗体首先通过经活化的NHS酯来改性以将吡啶基二硫化物基团引入到其表面上。抗体hu2H11在含有0.05M磷酸钾和0.05M NaCl的pH 6.5含水缓冲液中的溶液用pH 6.5磷酸缓冲液和1N HEPES水溶液稀释，从而使初始pH6.5磷酸缓冲液与HEPES的最终比例为96/4以得到pH≈7.5-8。该抗体溶液用5至10当量经活化的NHS酯在DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度为5至10mg/ml且DMA在含水缓冲液中的百分比为5％。在室温将反应继续2小时。由此改性的抗体溶液直接用pH 6.5磷酸缓冲液和HEPES的96/4混合物稀释，然后用念珠藻素衍生物(4当量)在DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度为3mg/ml且DMA在含水缓冲液中的百分比为20％；念珠藻素衍生物的当量数相对于在第一步中引入的经活化的NHS酯的当量数来表示。在30℃或在搅拌(约2000rpm)下将反应继续过夜。混合物通过SEC HPLC来分析，从而确定念珠藻素衍生物接枝到抗体上的程度。若取代程度是不充分的，则混合物在30℃或在搅拌(约2000rpm)下再用1至5当量念珠藻素衍生物在DMA中的溶液处理3小时。混合物用Millex
Figure BDA0000139392070000641
-SV 5μm过滤器(PVDF膜，Durapore，Millipore)过滤，然后通过凝胶过滤(使用在含有0.01M磷酸盐、0.14M NaCl和10％至20％NMP的pH 6.5含水缓冲液中预平衡的Superdex200pg基质(HiLoad 16/60脱盐柱，GE Healthcare))来纯化。收集含有呈单体形式的缀合抗体的馏分，合并且用Amicon Ultra-15(Ultracel 10k或50k膜，Millipore)浓缩至浓度为2至5mg/ml。最后改变缓冲液，从而从缀合物贮存缓冲液中除去有机溶剂。将缀合物沉积在凝胶过滤柱上，所述凝胶过滤柱包含用其组成和pH适于每种缀合物的含水缓冲液预平衡的SephadexTMG25基质(Nap-5或Nap-10或PD-10或Hiprep 26/10脱盐柱，GE Healthcare)。最终缀合物通过UV光谱(使用就抗体和相应的念珠藻素衍生物而确定的消光系数)来测定，从而测量抗体浓度和平均细胞毒性数/抗体。取代程度也可通过对缀合物的SEC-HRMS谱进行解卷积来计算。
在念珠藻素衍生物包含以-C(＝O)Z b R b 为结束的连接基的情况下用于制 备缀合物的一般方法
抗体hu2H11在含有0.05M HEPES、0.05M NaCl和2mM EDTA或由含有0.05M磷酸钾和0.05M NaCl的pH 6.5含水缓冲液/1N HEPES的96/4混合物构成的pH 8含水缓冲液中的溶液用过量的念珠藻素衍生物在DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度为3mg/ml且DMA在含水缓冲液中的百分比为20％。在30℃或在搅拌(约2000rpm)下将反应继续3小时。混合物通过SECHPLC来分析，从而确定细胞毒剂接枝到单体抗体群上的程度。若取代程度是不充分的，则混合物在30℃或在搅拌(约2000rpm)下再用1至5当量念珠藻素衍生物在DMA中的溶液处理3小时。混合物用Millex
Figure BDA0000139392070000651
-SV 5μm过滤器(PVDF膜，Durapore，Millipore)过滤，然后通过凝胶过滤(使用在含有0.01M磷酸盐、0.14M NaCl和10％至20％NMP的pH 6.5含水缓冲液中预平衡的Superdex 200pg基质(HiLoad 16/60脱盐柱，GE Healthcare))来纯化。收集含有呈单体形式的缀合抗体的馏分，合并且用Amicon Ultra-15(Ultracel 10k或50k膜，Millipore)浓缩至浓度为2至5mg/ml。最后改变缓冲液，从而从缀合物贮存缓冲液中除去有机溶剂。将缀合物沉积在凝胶过滤柱上，所述凝胶过滤柱包含用其组成和pH适于每种缀合物的含水缓冲液预平衡的SephadexTMG25基质(Nap-5或Nap-10或PD-10柱或Hiprep 26/10脱盐柱，GE Healthcare)。最终缀合物通过UV光谱(使用就抗体和相应的念珠藻素衍生物而确定的消光系数)来测定，从而测量抗体浓度和接枝程度。取代程度也可通过对缀合物的SEC-HRMS谱进行解卷积来计算。
就抗体hu2H11而描述的方法也可类似地用于其它抗体及其它结合剂。
实施例1：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000652
化合物2：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-{(S)-1-[(R)-3-(4-氯甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-3-异丁基-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000661
将化合物1(30mg；42.9μmol，根据Al-awar R.S.，et al.，J.Med.Chem.2003，46，2985-3007来制备)溶于无水DMF(2ml)中且将混合物冷却至0℃，然后先后加入TEA(107μmol)和CMS(64.6μmol)。15分钟后，将浴移开且在室温继续搅拌12小时。混合物通过加入EtOAc(2ml)来稀释且有机相用水(2×1ml)、饱和NaHCO3水溶液(1ml)和饱和NaCl水溶液(1ml)洗涤。有机相用MgSO4干燥且在过滤和减压蒸发掉溶剂后，得到产物2，其呈无色油状物形式，所述油状物发生结晶(25mg；81％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.77-0.83(m，6H)；1.02(s，3H)；1.04-1.07(m，3H)；1.14(s，3H)；1.29-1.36(m，1H)；1.54-1.63(m，2H)；1.80-1.87(m，1H)；2.24-2.33(m，1H)；2.63-2.73(m，2H)；2.96-3.06(m，3H)；3.28-3.32(m，1H)；3.83(s，3H)；3.93(d，J＝1.6Hz，1H)；4.27(ddd，J＝11.3，8.0，3.6Hz，1H)；4.78(s，2H)；4.93(dd，J＝9.6，3.6Hz，1H)；5.13(dd，J＝10.8，5.1Hz，1H)；5.81(d，J＝14.8Hz，1H)；6.49(ddd，J＝15.0，11.2，3.7Hz，1H)；7.07(d，J＝8.5Hz，1H)；7.18(dd，J＝8.5，1.9Hz，1H)；7.23(d，J＝9.6Hz，1H)；7.29(d，J＝1.9Hz，1H)；7.34(d，J＝8.2Hz，2H)；7.47(d，J＝8.2Hz，2H)；8.35(d，J＝8.2Hz，1H)。LCMS(A1)：ESm/z＝713[M+H]+；m/z＝715[M-H]-；tR＝5.17min。
化合物4：4-甲基-4-甲基二硫基戊酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000662
向用氩气吹洗的化合物3(3.05g，15.7mmol，根据WO 2007/085930来制备)在DCM(30ml)中的溶液中先后加入NHS(17.3mmol)和EDCI盐酸盐(17.3mmol)。将混合物在室温搅拌3小时，然后先后用pH 6磷酸缓冲液(2×30ml)和饱和NaCl溶液(30ml)洗涤，用MgSO4干燥且浓缩至干。发生结晶的所得琥珀色油状物用75/25庚烷/EtOAc混合物洗涤且用烧结漏斗过滤，得到化合物4，其呈白色固体形式(2.08g，45％)。将滤液浓缩至干且所得粗产物通过硅胶色谱(用庚烷/EtOAc混合物50/50至0/100洗脱)来纯化。将含有所需产物的馏分浓缩至干且吸收在异丙醚(5ml)中；析出物用烧结漏斗过滤，得到所需化合物4(1g，22％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.29(s，6H)；1.92至1.98(m，2H)；2.41(s，3H)；2.72至2.78(m，2H)；2.81(s，4H)。LCMS(A4)：EI，m/z＝291[M+H]+。
化合物5：4-(4-甲基-4-甲基二硫基戊酰基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000671
将化合物4(200mg，686μmol)、1-Boc-哌嗪(686μmol)、TEA(755μmol)和DMF(1.6ml)置于Wheatton管中。将混合物在室温搅拌过夜，然后用EtOAc(5ml)稀释，用水(2×5ml)洗涤，用MgSO4干燥且浓缩至干。将粗产物吸收在异丙醚(3ml)中；析出物用烧结漏斗过滤，得到化合物5(213g，86％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：1.27(s，6H)；1.41(s，9H)；1.73至1.87(m，2H)；2.34至2.41(m，2H)；2.40(s，3H)；3.23至3.36(部分被遮蔽的多重峰，4H)；3.39至3.45(m，4H)。LCMS(A2)：ES m/z＝363[M+H]+；m/z＝307[M+H-C4H8]-；tR＝1.08min。
化合物6：4-甲基-4-甲基二硫基-1-(哌嗪-1-基)戊-1-酮盐酸盐
向化合物5(213mg，588μmol)在二噁烷(4.4ml)中的溶液中加入4M HCl在二噁烷(4.4ml)中的溶液。在室温继续搅拌4小时。混合物用烧结漏斗过滤且所得固体先后用二噁烷(2ml)和异丙醚(2ml)淋洗，得到化合物6(132mg，75％)，其呈乳色固体形式。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：1.27(s，6H)；1.73至1.85(m，2H)；2.37至2.45(m，2H)；2.40(s，3H)；2.98至3.15(m，4H)；3.62至3.73(m，4H)；9.39(宽多重峰，2H)。LCMS(A1)：ES m/z＝263[M+H]+；tR＝2.40min。
化合物7：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000673
将化合物1(20.3mg；29.0μmol)溶于无水DMF(0.77ml)和TEA(72.6μmol)中，然后加入CMS(43.6μmol)。在室温保持12小时后，不对所形成的产物2进行分离且先后加入TEA(58.0μmol)和4-甲基-4-甲基二硫基-1-(哌嗪-1-基)戊-1-酮盐酸盐6(34.8μmol)。将混合物在室温再搅拌72小时，然后用EtOAc(10ml)稀释。有机相用水(2×2ml)、饱和NaHCO3水溶液(2ml)和饱和NaCl水溶液(2ml)洗涤。用MgSO4干燥且过滤后，将溶剂减压蒸发掉。粗反应产物通过硅胶色谱(用99/1至98/2DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到白色固体即化合物7(5.7mg；21％)。TLC(DCM 90/MeOH 10)：Rf＝0.6。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：0.75-0.81(m，6H)；1.01(s，3H)；1.05(d，J＝6.8Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.26(s，6H)；1.28-1.33(m，1H)；1.52-1.61(m，2H)；1.76-1.83(m，2H)；2.27-2.38(m，4H)；2.39(s，3H)；2.64-2.74(m，2H)；2.95-3.05(m，2H)；3.24-3.34(m，6H)；3.44(宽单峰，4H)；3.49(s，2H)；3.81(s，3H)；3.88(d，J＝1.7Hz，1H)；4.22-4.29(m，1H)；4.92(dd，J＝9.9，3.5Hz，1H)；5.08-5.15(m，1H)；5.81(d，J＝14.2Hz，1H)；6.48(ddd，J＝15.2，11.3，3.5Hz，1H)；7.05(d，J＝8.6Hz，1H)；7.17(dd，J＝8.4，2.3Hz，1H)；7.22(d，J＝9.3Hz，1H)；7.25-7.34(m，5H)；8.34(d，J＝8.1Hz，1H)。LCMS(A1)：ESm/z＝943[M+H]+；m/z＝941[M-H]-；tR＝4.03min。
实施例1：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000681
将产物7(9.6mg；10.2μmol)溶于乙醇(1.2ml)/水(1ml)混合物中且混合物变浑。然后加入TCEP(25.4μmol)且将混合物在室温搅拌5小时。混合物通过加入EtOAc来稀释且有机相用水和饱和NH4Cl水溶液的1/1混合物(1ml)洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤且将溶剂减压蒸发掉，然后得到最终产物即实施例1，其呈白色固体形式(6.5mg；71％)。TLC(DCM 90/MeOH 10)：Rf＝0.56。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76-0.81(m，6H)；1.01(s，3H)；1.06(d，J＝6.8Hz，3H)；1.13(s，3H)；1.24(s，6H)；1.27-1.31(m，1H)；1.56-1.64(m，2H)；1.73-1.85(m，3H)；2.26-2.33(m，3H)；2.36-2.45(m，4H)；2.63-2.75(m，2H)；2.95-3.06(m，3H)；3.34-3.36(m，1H)；3.42-3.51(m，6H)；3.82(s，3H)；3.89(s，1H)；4.22-4.29(m，1H)；4.92(dd，J＝9.8，3.4Hz，1H)；5.12(dd，J＝10.8，4.9Hz，1H)；5.81(d，J＝15.2Hz，1H)；6.48(ddd，J＝15.0，11.4，3.4Hz，1H)；7.06(d，J＝8.3Hz，1H)；7.18(dd，J＝8.3，1，5Hz，1H)；7.24(d，J＝9.8Hz，1H)；7.26-7.36(m，5H)；8.37(d，J＝7.8Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝897[M+H]+；m/z＝895[M-H]-；tR＝0.97min。
实施例2：(E)-(3S，6R，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6-甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000691
化合物9：(E)-(3S，6R，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-{(S)-1-[(R)-3-(4-氯甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-3-异丁基-6-甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000692
将化合物8(49mg；71.4μmol，其可根据Al-awar R.S.，et al.，J.Med.Chem.2003，46，2985-3007来制备)溶于无水DCM(5ml)中且将混合物冷却至0℃，然后先后加入DIPEA(428μmol)和CMS(214μmol)。使混合物返回至室温且在室温继续搅拌40小时。混合物用5ml水进行水解且水相用DCM(3×5ml)萃取。将有机相合并，用饱和NaHCO3水溶液(10ml)和饱和NaCl水溶液(10ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且将溶剂减压蒸发掉后，粗产物通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/MeOH混合物洗脱)来纯化。得到化合物9，其呈白色固体形式(37mg；79％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.78(d，J＝6.6Hz，3H)；0.80(d，J＝6.6Hz，3H)；1.01(d，J＝6.9Hz，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.30(m，1H)；1.54(m，1H)；1.60(m，1H)；1.82(m，1H)；2.27(m，1H)；2.60至2.78(m，3H)；2.97至3.05(m，2H)；3.15(m，1H)；3.41(m，1H)；3.81(s，3H)；3.92(d，J＝1.6Hz，1H)；4.26(ddd，J＝3.8和8.2和11.5Hz，1H)；4.77(s，2H)；4.88(dd，J＝3.8和9.6Hz，1H)；5.12(ddd，J＝1.5和5.3和11.2Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.5和15.0Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.7和11.2和15.0Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.23(dd，J＝2.7和9.1Hz，1H)；7.29(d，J＝2.2Hz，1H)；7.32(d，J＝8.2Hz，2H)；7.45(d，J＝8.2Hz，2H)；8.34(d，J＝8.2Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝703[M+H]+；m/z＝701[M-H]-；m/z＝747[M-H+HCO2H]-基峰；tR＝1.17min。
化合物10：(E)-(3S，6R，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6-甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000701
将化合物9(36.6mg；52μmol)溶于无水乙腈(3ml)中，然后先后加入DIPEA(260μmol)和化合物6(156μmol)。将反应介质在室温搅拌20小时，然后通过加入4ml水来水解。水相用EtOAc(3×4ml)萃取且将有机相合并，用饱和NaHCO3水溶液(5ml)和饱和NaCl水溶液(5ml)洗涤。用MgSO4干燥且过滤后，将溶剂减压蒸发掉。粗反应产物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物10，其呈白色固体形式(39mg；80％)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：0.78(d，J＝6.6Hz，3H)；0.80(d，J＝6.6Hz，3H)；1.01(d，J＝6.9Hz，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.26(s，6H)；1.30(m，1H)；1.53(m，1H)；1.60(m，1H)；1.75至1.84(m，3H)；2.26至2.37(m，7H)；2.39(s，3H)；2.61至2.77(m，3H)；2.96至3.05(m，2H)；3.15(m，1H)；3.38(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.44(m，4H)；3.48(s，2H)；3.81(s，3H)；3.88(d，J＝1.6Hz，1H)；4.27(ddd，J＝4.0和8.1和11.5Hz，1H)；4.88(dd，J＝3.8和9.6Hz，1H)；5.12(ddd，J＝1.6和5.3和11.5Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.6和15.1Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.6和11.5和15.1Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.23(dd，J＝2.6和9.2Hz，1H)；7.27(d，J＝8.4Hz，2H)；7.29(d，J＝2.2Hz，1H)；7.32(d，J＝8.4Hz，2H)；8.35(d，J＝8.1Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝929[M+H]+；m/z＝927[M-H]-；m/z＝973[M-H+HCO2H]-基峰；tR＝0.99min。
实施例2：(E)-(3S，6R，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6-甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000702
将产物10(34mg；36.6μmol)溶于乙醇(4.3ml)/水(3.6ml)混合物中且混合物变浑。然后加入TCEP(146μmol)，混合物变为无色且在室温搅拌2小时。混合物通过加入EtOAc(20ml)来稀释且有机相用水和饱和NH4Cl水溶液的1/1混合物(20ml)洗涤。水相用2×20ml EtOAc萃取且将有机相合并且用饱和NaCl溶液(20ml)洗涤。用MgSO4干燥，过滤且将溶剂减压蒸发掉，然后粗产物通过硅胶色谱(用98/2至90/10DCM/MeOH混合物洗脱)来纯化。得到化合物实施例2，其呈白色固体形式(28.2mg；87％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.77(d，J＝6.6Hz，3H)；0.79(d，J＝6.6Hz，3H)；1.01(d，J＝6.9Hz，3H)；1.04(d，J＝6.9Hz，3H)；1.27(m，1H)；1.31(s，6H)；1.53(m，1H)；1.59(m，1H)；1.77(m，2H)；1.82(m，1H)；2.24至2.32(m，3H)；2.34至2.44(m，4H)；2.62至2.76(m，4H)；2.98至3.04(m，2H)；3.15(m，1H)；3.41(m，1H)；3.46(m，4H)；3.48(s，2H)；3.81(s，3H)；3.88(d，J＝2.0Hz，1H)；4.26(ddd，J＝3.4和8.3和11.5Hz，1H)；4.88(dd，J＝3.7和10.0Hz，1H)；5.12(ddd，J＝2.0和5.3和11.1Hz，1H)；5.80(dd，J＝2.0和15.0Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.7和11.1和15.0Hz，1H)；7.05(d，J＝8.3Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.0和8.3Hz，1H)；7.23(dd，J＝2.9和9.3Hz，1H)；7.27(d，J＝8.5Hz，2H)；7.29(d，J＝2.0Hz，1H)；7.32(d，J＝8.5Hz，2H)；8.35(d，J＝8.3Hz，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝883[M+H]+；m/z＝881[M-H]-；tR＝0.92min。
实施例3：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[(2-巯基-2-甲基丙基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000711
化合物11：2-甲基-2-甲基二硫基丙醛O-甲基肟
Figure BDA0000139392070000712
在惰性气氛下将5g(33.3mmol)2-(甲基二硫基)异丁醛溶于50ml乙醇中。先后加入5.56g(66.54mmol)O-甲基羟胺盐酸盐在50ml乙醇中的混悬液和6.65ml(66.54mmol)NaOH。将浑浊白色混合物回流过夜。冷却至室温后，将混合物倒入500ml水中。水相用EtOAc(3×175ml)萃取且合并的有机相用饱和NaCl溶液(200ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，得到化合物11，其呈无色油状物形式(5.89g，32.9mmol)。
化合物12：2-甲基-2-甲基二硫基丙基胺
Figure BDA0000139392070000713
在室温先后将1.78g(9.9mmol)肟醚11、19ml无水THF和99.5ml 2M硼烷-甲硫醚在THF中的溶液加到用氩气吹洗的圆底烧瓶中。将混合物回流16小时。然后停止反应且将混合物冷却至室温，然后在0℃小心滴加100ml MeOH同时形成泡沫状物，然后保持在室温。将混合物减压蒸发，得到约2.8g黄色油状物，将所述油状物吸收在30ml 5至6N HCl在异丙醇中的溶液中。将混合物回流1小时，然后在室温静置过夜。减压蒸发后，将所得残留物吸收在80ml 1N HCl中，然后用乙醚(3×20ml)萃取。水相用30％氨水处理直到pH达到12.5-13即12ml(浅紫色水相)，然后用3×20ml乙醚再次萃取。将有机相合并，用MgSO4干燥，过滤且减压蒸发至干，得到760mg粗产物。该残留物最后通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物12，其呈浅黄色油状物形式(301mg，20％)。LCMS(A2)：ESm/z＝152[M+H]+；tR＝0.27min。
化合物13：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[(2-甲基-2-甲基二硫基丙基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000721
在室温向用氩气吹洗的25mg(35μmol)化合物2在3.1ml无水DMF中的溶液中先后加入9.8μl(70μmol)TEA和6.3mg(42μmol)化合物12。在40℃继续搅拌。反应72小时后，剩余一些起始化合物2，因此再加入9.8μl(70μmol)TEA和6.3mg(42μmol)胺12。在40℃再保持72小时后，仍剩余一些化合物2：加入6.3mg(42μmol)胺12且在40℃继续搅拌。一天后，反应完成。将混合物稀释在10ml EtOAc中，用2×10ml水、10ml饱和NaHCO3溶液和10ml饱和NaCl溶液洗涤。有机相用MgSO4干燥后，对其进行过滤，然后减压蒸发，得到30mg粗产物。该残留物通过硅胶色谱(用98/2至93/7DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物13，其呈白色粉末形式(23.3mg，81％)。TLC(DCM90/MeOH 10)：Rf＝0.55。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76至0.81(m，6H)；1.02(s，3H)；1.07(d，J＝6.9Hz，3H)；1.13(s，3H)；1.27至1.33(m，7H)；1.52至1.63(m，2H)；1.82(六重峰，J＝6.8Hz，1H)；2.06(宽单峰，1H)；2.25至2.34(m，1H)；2.37(s，3H)；2.57(s，2H)；2.66至2.76(m，2H)；2.97至3.06(m，3H)；3.33至3.38(m，1H)；3.75(s，2H)；3.83(s，3H)；3.88(d，J＝1.6Hz，1H)；4.27(ddd，J＝3.7和8.0和11.4Hz，1H)；4.93(dd，J＝3.7和9.7Hz，1H)；5.12(dd，J＝5.8和11.3Hz，1H)；5.82(dd，J＝1.5和15.2Hz，1H)；6.49(ddd，J＝3.8和11.3和15.2Hz，1H)；7.07(d，J＝8.5Hz，1H)；7.18(dd，J＝1.9和8.5Hz，1H)；7.23(dd，J＝2.6和9.5Hz，1H)；7.26(d，J＝8.2Hz，2H)；7.30(d，J＝1.9Hz，1H)；7.35(d，J＝8.2Hz，2H)；8.35(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝832[M+H]+；m/z＝830[M-H]-；tR＝0.96min。
实施例3：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[(2-巯基-2-甲基丙基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000731
将产物13(10.6mg；12.8μmol)溶于乙醇(1.5ml)/水(1.26ml)混合物中。然后加入TCEP(9.1mg，31.9μmol)且将混合物在室温搅拌2小时30分钟。将混合物稀释在15ml EtOAc中且有机相用水和饱和NH4Cl水溶液的1/1混合物(5ml)洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤且将溶剂减压蒸发掉，然后所得粗产物最后通过硅胶色谱(用98/2至92/8DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物实施例3，其呈白色固体形式(6.4mg；63％)。TLC(DCM 90/MeOH 10)：Rf＝0.47。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.80至0.86(m，6H)；1.06(s，3H)；1.11(d，J＝6.9Hz，3H)；1.18(s，3H)；1.31至1.38(m，7H)；1.57至1.67(m，2H)；1.87(六重峰，J＝6.8Hz，1H)；2.29至2.38(m，1H)；2.56(s，2H)；2.70至2.80(m，2H)；3.00至3.11(m，3H)；3.39至3.43(m，1H)；3.82(s，2H)；3.87(s，3H)；3.92(d，J＝1.9Hz，1H)；4.31(ddd，J＝3.6和8.0和11.5Hz，1H)；4.97(dd，J＝3.7和9.7Hz，1H)；5.17(dd，J＝5.8和11.3Hz，1H)；5.86(dd，J＝1.4和15.1Hz，1H)；6.54(ddd，J＝3.8和11.3和15.1Hz，1H)；7.11(d，J＝8.7Hz，1H)；7.23(dd，J＝1.9和8.7Hz，1H)；7.27(dd，J＝2.7和9.6Hz，1H)；7.31(d，J＝8.0Hz，2H)；7.34(d，J＝1.9Hz，1H)；7.42(d，J＝8.0Hz，2H)；8.40(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝786[M+H]+；m/z＝784[M-H]-；tR＝0.92min。
实施例4：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[({2-巯基-2-甲基丙基}甲基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000741
化合物14：甲基[2-甲基-2-甲基二硫基丙-(E)-亚基]胺
Figure BDA0000139392070000742
在惰性气氛下将1g(6.66mmol)2-(甲基二硫基)异丁醛溶于10ml无水THF中。加入2M甲胺在THF中的溶液(33.3ml，66.6mmol)，然后将混合物在室温搅拌5小时。将其稀释在50ml EtOAc中，用水(30ml)和饱和NaCl溶液(30ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，得到化合物14，其呈浅黄色油状物形式(1.01g，93％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)：1.46(s，6H)；2.36(s，3H)；3.32(s，3H)；7.52(s，1H)。
化合物15：2-甲基-2-甲基二硫基丙基(甲基)胺
Figure BDA0000139392070000743
化合物14(1.01g，6.185mmol)在30ml THF中的溶液用氩气吹洗且冷却至0℃，然后在0℃加入1.44g(6.80mmol)三乙酰氧基硼氢化钠。在室温继续搅拌15小时：剩余一些起始亚胺；在0℃加入1.44g(6.80mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和354μl(6.185mmol)乙酸，然后在室温继续搅拌3小时。将混合物稀释在50ml EtOAc中且用水(50ml)洗涤。通过加入14ml 1N氢氧化钠水溶液将水相的pH调整至约12，然后其用乙醚(3×50ml)萃取。将有机相合并，用饱和NaCl溶液(50ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，得到化合物15，其呈无色油状物形式(695mg，68％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.25(s，6H)；1.47(宽多重峰，1H)；2.31(s，3H)；2.38(s，3H)；2.53(m，2H)。LCMS(A2)：ESm/z＝166[M+H]+；tR＝0.28min。
化合物16：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-{(S)-1-[(2R，3R)-3-(4-{[(2-甲基-2-甲基二硫基丙基)甲基氨基]甲基}苯基)环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000751
化合物16可如下得到：用胺15通过使用就制备化合物30而描述的方法对衍生物2中的氯进行亲核取代反应。
实施例4：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-{(S)-1-[(2R，3R)-3-(4-{[(2-巯基-2-甲基丙基)甲基氨基]甲基}苯基)环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000752
实施例4可通过将就制备实施例6而描述的方法用于化合物16来得到。
实施例5：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(2-巯基-2-甲基丙基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000753
化合物17：4-(2-甲基-2-甲基二硫基丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000754
向用氩气吹洗的1-Boc-哌嗪(1.0g，5.37mmol)在无水THF(20ml)中的溶液中加入2-(甲基二硫基)异丁醛(5.37mmol)和异丙醇钛(IV)(6.71mmol)。将混合物在室温搅拌20分钟且再加入2-(甲基二硫基)异丁醛(5.37mmol)和异丙醇钛(IV)(6.71mmol)。继续搅拌2小时，然后加入12ml乙醇且继续搅拌5分钟。加入氰基硼氢化钠(5.37mmol)且将混合物搅拌1小时，然后再加入5.37mmol氰基硼氢化钠。继续搅拌1小时。将混合物浓缩至干，然后吸收在EtOAc中。加入水，由此形成析出物，所述析出物用烧结漏斗滤出且用EtOAc和水淋洗。将所得固体溶于1N HCl水溶液(50ml)中且介质用5N NaOH水溶液中和，然后用DCM萃取。将有机相合并，用饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤且减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(用100/0至97/3DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物17，其呈浅黄色油状物形式(650mg；40％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：1.26(s，6H)；1.39(s，9H)；2.39(s，3H)；2.42(s，2H)；2.44至2.48(m，4H)；3.27(部分被遮蔽的多重峰，4H)。LCMS(A1)：ESm/z＝321[M+H]+；m/z＝265基峰；tR＝3.02min。
化合物18：1-(2-甲基-2-甲基二硫基丙基)哌嗪盐酸盐
Figure BDA0000139392070000761
向化合物17(322mg，1.01mmol)在二噁烷(13ml)中的溶液中加入4M HCl在二噁烷(5ml)中的溶液。在室温继续搅拌16小时。混合物用烧结漏斗过滤且所得固体用二噁烷淋洗，得到化合物18(231mg，90％)，其呈白色粉末形式。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.31(宽单峰，6H)；2.42(s，3H)；2.59至3.38(非常宽的多重峰，10H)；8.78(宽多重峰，2H)。LCMS(A2)：ES m/z＝221[M+H]+；tR＝0.46min。
化合物19：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(2-甲基-2-甲基二硫基丙基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
向用氩气吹洗的化合物2(15.02mg，20.93μmol)在无水DMF(0.9ml)中的溶液中加入化合物18(25.12μmol)和TEA(52.3μmol)在DMF(1ml)中的溶液。在40℃在氩气下对混合物进行搅拌。24小时后，加入25.12μmol化合物18和31.4μmol TEA。在40℃再保持24小时后，反应完成。混合物用EtOAc(6ml)稀释且用水(2×6ml)、饱和NaHCO3溶液(6ml)和饱和NaCl溶液(6ml)洗涤。有机相用MgSO4干燥后，对其进行过滤，然后减压蒸发，得到46mg粗产物。残留物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物19，其呈白色粉末形式(5.2mg，28％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(d，J＝6.4Hz，3H)；0.78(d，J＝6.4Hz，3H)；1.01(s，3H)；1.06(d，J＝6.8Hz，3H)；1.13(s，3H)；1.25(s，6H)；1.27至1.33(m，1H)；1.51至1.63(m，2H)；1.76至1.85(m，1H)；2.23至2.32(m，1H)；2.37(m，4H)；2.39(s，3H)；2.41(s，2H)；2.53至2.56(m，4H)；2.63至2.76(m，2H)；2.94至3.06(m，3H)；3.34(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.40至3.48(m，2H)；3.82(s，3H)；3.87(d，J＝2.0Hz，1H)；4.26(ddd，J＝3.8和7.8和11.3Hz，1H)；4.92(dd，J＝3.8和9.8Hz，1H)；5.07至5.14(m，1H)；5.81(d，J＝15.2Hz，1H)；6.48(ddd，J＝3.8和11.3和15.2Hz，1H)；7.06(d，J＝8.5Hz，1H)；7.18(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.21至7.32(m，6H)；8.35(d，J＝8.3Hz，1H)。LCMS(A1)：ESm/z＝901[M+H]+；m/z＝451基峰；tR＝4.33min。
实施例5：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(2-巯基-2-甲基丙基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000771
将产物19(5.7mg；6.3μmol)溶于乙醇(0.8ml)/水(0.5ml)混合物中。然后加入TCEP(4.54mg，15.83μmol)且将混合物在室温搅拌1小时。将混合物稀释在7mlEtOAc中且有机相用水和饱和NH4Cl水溶液的1/1混合物(7ml)洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤且将溶剂减压蒸发掉，然后所得粗产物通过硅胶色谱(用99/1至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物实施例5，其呈白色固体形式(2.95mg；55％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.77(d，J＝6.3Hz，3H)；0.78(d，J＝6.3Hz，3H)；1.02(s，3H)；1.06(d，J＝6.9Hz，3H)；1.13(s，3H)；1.27(s，6H)；1.29至1.34(m，1H)；1.52至1.63(m，2H)；1.82(m，1H)；2.29(m，1H)；2.37(s，2H)；2.39至2.41(m，4H)；2.57至2.62(m，4H)；2.65至2.76(m，2H)；2.96至3.06(m，3H)；3.34(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.46(s，2H)；3.83(s，3H)；3.88(d，J＝2.2Hz，1H)；4.27(ddd，J＝3.7和8.0和11.5Hz，1H)；4.93(dd，J＝3.7和9.7Hz，1H)；5.12(m，1H)；5.82(d，J＝15.2Hz，1H)；6.49(ddd，J＝3.7和11.5和15.2Hz，1H)；7.07(d，J＝8.5Hz，1H)；7.18(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.21至7.33(m，6H)；8.36(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A1)：ES m/z＝855[M+H]+；m/z＝428[M+2H]2+基峰；tR＝4.13min。
实施例6：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[({2-[2-(2-{2-甲基[2-巯基-2-甲基丙基]氨基乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}甲基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000772
化合物20：4-甲基苯磺酸2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基酯
Figure BDA0000139392070000781
向用氩气吹洗且冷却至0℃的5g(25.74mmol)四乙二醇在68.7ml DCM中的溶液中先后逐份加入8.95g(38.61mmol)氧化银和5.40g(28.31mmol)对甲苯磺酰氯，从而保持合适的搅拌。逐份加入855mg(5.15mmol)KI，从而保持混合物的温度低于5℃。继续搅拌1小时同时保持温度低于5℃。温热至室温后，混合物用硅藻土过滤，残留物用DCM淋洗，然后将滤液减压浓缩至干。粗产物通过硅胶色谱(使用99/1至95/5DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物20，其呈无色油状物形式(5.4g，60％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：2.43(s，3H)；3.40(m，2H)；3.44至3.52(m，10H)；3.58(m，2H)；4.11(m，2H)；4.53(t，J＝5.4Hz，1H)；7.48(d，J＝8.3Hz，2H)；7.78(d，J＝8.3Hz，2H)。LCMS(A2)：ES m/z＝349[M+H]+；m/z＝371[M+Na]+；tR＝0.69min。
化合物21：1-叠氮基-3，6，9-三氧杂十一烷-11-醇
Figure BDA0000139392070000782
向5.4g(15.51mmol)化合物20在40.6ml无水乙腈中的溶液中加入1.34g(20.63mmol)NaN3，然后将混合物回流6小时30分钟。冷却至室温后，混合物用硅藻土过滤且减压浓缩。剩余一些起始化合物20：将粗产物吸收在25ml无水乙腈中且加入230mg(3.5mmol)NaN3。将混合物回流5小时。冷却至室温后，其用硅藻土过滤且减压浓缩至干，得到化合物21，其呈浅黄色油状物形式(3.37g，99％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：3.37至3.43(m，4H)；3.45至3.58(m，10H)；3.60(m，2H)；4.54(t，J＝5.1Hz，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝220[M+H]+；m/z＝242[M+Na]+基峰；tR＝0.39min。
化合物22：N-Boc-氨基乙氧基乙氧基乙氧基乙醇
Figure BDA0000139392070000783
向在氩气下保持惰性的320mg 10％钯/炭在5ml EtOAc中的溶液中加入3.25g(14.8mmol)化合物21、6.46g(29.6mmol)一缩二碳酸二叔丁酯和4.13ml(29.6mmol)TEA在45ml EtOAc中的溶液。在30℃在压力为2巴的氢气下将反应进行17小时。冷却至室温和大气压后，混合物用硅藻土过滤且减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物22，其呈无色油状物形式(2.92g，67％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.37(s，9H)；3.06(q，J＝6.1Hz，2H)；3.37(t，J＝6.1Hz，2H)；3.42(m，2H)；3.46至3.53(m，10H)；4.54(宽三重峰，J＝5.1Hz，1H)；6.71(宽三重峰，J＝6.1Hz，1H)。LCMS(A1)：ES m/z＝316[M+Na]+；m/z＝194基峰；tR＝2.81min。
化合物23：4-甲基苯磺酸2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基酯
Figure BDA0000139392070000791
向用氩气吹洗的3.06g(10.42mmol)化合物22在20ml DCM中的溶液中加入2.53ml(31.26mmol)吡啶。将混合物冷却至0℃，然后滴加2.98g(15.63mmol)对甲苯磺酰氯在10ml DCM中的溶液。在室温继续搅拌15小时。将混合物稀释在20ml DCM中，用饱和NaHCO3溶液(30ml)、水(2×30ml)和饱和NaCl溶液(30ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用100/0至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物23，其呈浅黄色油状物形式(4.38g，94％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.37(s，9H)；2.42(s，3H)；3.05(q，J＝6.1Hz，2H)；3.36(t，J＝6.1Hz，2H)；3.46(m，8H)；3.58(m，2H)；4.10(m，2H)；6，71(宽三重峰，J＝6.1Hz，1H)；7.48(d，J＝7.8Hz，2H)；7.78(d，J＝7.8Hz，2H)。LCMS(A2)：ES m/z＝448[M+H]+；m/z＝470[M+Na]+；m/z＝348基峰；m/z＝492[M-H+HCO2H]-；tR＝1.00min。
化合物24：(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000792
向4.38g(9.79mmol)化合物23在25ml乙腈中的溶液中加入846mg(13.02mmol)叠氮化钠，然后将混合物回流6小时。剩余很大比例的起始化合物：冷却至室温后，将1.7g(26.13mmol)叠氮化钠加到混合物中。继续回流搅拌24小时。冷却至室温后，混合物用硅藻土过滤且减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物24，其呈浅黄色油状物形式(2.16g，69％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.37(s，9H)；3.06(q，J＝6.1Hz，2H)；3.34至3.43(m，4H)；3.46至3.58(m，8H)；3.60(m，2H)；6.70(宽三重峰，J＝6.1Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝341[M+Na]+；tR＝0.81min。
化合物25：(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)甲基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000801
在0℃向用氩气吹洗且冷却至0℃的2.06g(6.47mmol)化合物24在25ml无水THF中的溶液中先后加入854mg(21.35mmol)NaH(60％在矿物油中的分散液)(逐份)和886μl(14.23mmol)甲基碘。在0℃继续搅拌1小时，然后在室温搅拌16小时。混合物用硅藻土过滤，用THF洗涤且减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(使用99/1至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物25，其呈无色油状物形式(1.67g，78％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.39(s，9H)；2,80(宽单峰，3H)；3.29(部分被遮蔽的三重峰，J＝5.6Hz，2H)；3.38(m，2H)；3.46至3.56(m，10H)；3.60(t，J＝5.4Hz，2H)。
化合物26：(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)甲基氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000802
向用氩气吹洗的1.66g(4.99mmol)化合物25在20ml THF中的溶液中先后加入1.31g(4.994mmol)三苯基膦和108μl(5.99mmol)水。继续搅拌25小时30分钟，然后将混合物浓缩至干且通过在SCX柱(Varian)上进行的SPE过滤来纯化，所述SCX柱(Varian)用甲醇处理和洗涤，然后用氨水在甲醇中的0.5N溶液洗脱。得到化合物26，其呈无色油状物形式(1.23g，80％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：1.39(s，9H)；2.65(t，J＝5.9Hz，2H)；2.80(宽单峰，3H)；3.29(t，J＝5.9Hz，2H)；3.36(t，J＝5.7Hz，2H)；3.45至3.56(m，10H)。LCMS(A2)：ESm/z＝307[M+H]+；tR＝0.49min。
化合物27：甲基[2-(2-{2-[2-(2-甲基-2-甲基二硫基丙基氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
向用氩气吹洗的131mg(426μmol)化合物26在3ml DCM中的溶液中先后加入64mg(426μmol)2-甲基二硫基异丁醛、126mg(596μmol)三乙酰氧基硼氢化钠和24.4μl(426μmol)乙酸。在室温在氩气下继续搅拌6小时，反应通过加入1ml 1N氢氧化钠水溶液来淬灭，然后混合物用10ml乙醚萃取。减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用90/10DCM/异丙醇混合物作为洗脱剂)来纯化，这不能将所需产物与剩余的起始胺分离开来。所得产物通过RP18反相色谱(使用95/5至5/95水/乙腈混合物作为洗脱剂)来再次纯化。得到化合物27，其呈无色油状物形式(67mg，36％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.25(s，6H)；1.39(s，9H)；1.58(宽多重峰，1H)；2.38(s，3H)；2.59(s，2H)；2.68(t，J＝5.6Hz，2H)；2.80(宽单峰，3H)；3.46(t，J＝5.6Hz，2H)；3.48至3.54(m，12H)。LCMS(A1)：ESm/z＝441[M+H]+；tR＝3.29min。
化合物28：甲基{2-[2-(2-{2-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基丙基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000811
向用氩气吹洗且冷却至0℃的65mg(148μmol)化合物27在1ml DCM中的溶液中先后加入19.5mg(487μmol)NaH(60％在矿物油中的分散液)和20μl(325μmol)甲基碘。在0℃继续搅拌45分钟，然后在室温搅拌72小时。混合物用硅藻土过滤，然后减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(使用99/1至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物28，其呈无色油状物形式(43mg，64％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.25(s，6H)；1.39(s，9H)；2.32(s，3H)；2.39(s，3H)；2.54(m，2H)；2.61(t，J＝6.1Hz，2H)；2.80(宽单峰，3H)；3.42至3.54(m，14H)。LCMS(A2)：ES m/z＝455[M+H]+；tR＝0.77min。
化合物29：甲基(2-{2-[2-(2-甲基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)(2-甲基-2-甲基二硫基丙基)胺
Figure BDA0000139392070000812
向43mg(95μmol)化合物28在1.5ml DCM中的溶液中加入351μl TFA。在室温继续搅拌5小时，然后将混合物浓缩至干。粗产物通过在SCX柱(Varian)上进行的SPE过滤来纯化，所述SCX柱(Varian)用甲醇处理和洗涤，然后用氨水在甲醇中的0.5N溶液洗脱。得到化合物29，其呈无色油状物形式(25mg，75％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.25(s，6H)；1.75(宽多重峰，1H)；2.27(s，3H)；2.32(s，3H)；2.39(s，3H)；2.53(m，2H)；2.57至2.64(m，4H)；3.44(t，J＝5.7Hz，2H)；3.46至3.55(m，10H)。LCMS(A2)：ES m/z＝355[M+H]+；tR＝0.30min。
化合物30：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[({2-[2-(2-{2-甲基[2-甲基-2-甲基二硫基丙基]氨基乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}甲基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000821
向用氩气吹洗的15.3mg(21.3μmol)化合物2在1ml无水乙腈中的溶液中先后加入18.6μl(106.6μmol)DIPEA和22.7mg(64μmol)化合物29在1ml无水乙腈中的溶液。在40℃在氩气下继续搅拌24小时。冷却至室温后，混合物用7ml EtOAc稀释，用水(2×3ml)、饱和NaHCO3溶液(3ml)和饱和NaCl溶液(3ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物30，其呈无色固体形式(14.6mg，66％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(d，J＝6.1Hz，3H)；0.76(d，J＝6.1Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.04(d，J＝6.8Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.24(s，6H)；1.29(m，1H)；1.50至1.62(m，2H)；1.81(m，1H)；2.15(s，3H)；2.27(m，1H)；2.31(s，3H)；2.38(s，3H)；2.45至2.54(部分被遮蔽的多重峰，4H)；2.60(t，J＝6.1Hz，2H)；2.63至2.75(m，2H)；2.92至3.06(m，3H)；3.25至3.35(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.44至3.54(m，14H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝2.0Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.9和8.3和11.7Hz，1H)；4.91(dd，J＝3.4和9.8Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.7和11.5Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.5和15.5Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.5和11.5和15.5Hz，1H)；7.05(d，J＝8.8Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.0和8.8Hz，1H)；7.20至7.26(m，3H)；7.27至7.33(m，3H)；8.35(d，J＝8.3Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1035[M+H]+；m/z＝518[M+2H]2+基峰；tR＝0.86min。
实施例6：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[({2-[2-(2-{2-甲基[2-巯基-2-甲基丙基]氨基乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}甲基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
向10.9mg(10.5μmol)化合物30在1.24ml乙醇中的溶液中加入12.06mg(42.1μmol)TCEP在1.04ml水中的溶液。在室温继续搅拌4小时。混合物用6ml EtOAc稀释，用水/NH4Cl饱和的1/1混合物(6ml)和饱和NaCl溶液(6ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用99/1至90/10DCM/甲醇混合物)来纯化。得到化合物实施例6，其呈白色固体形式(7.36mg，71％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(d，J＝5.9Hz，3H)；0.78(d，J＝5.9Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.04(d，J＝6.8Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.25(s，6H)；1.28(m，1H)；1.51至1.62(m，2H)；1.80(m，1H)；2.15(s，3H)；2.27(m，1H)；2.34(s，3H)；2.44(s，2H)；2.51(t，J＝6.4Hz，2H)；2.60(s，1H)；2.63(t，J＝6.4Hz，2H)；2.66至2.74(m，2H)；2.93至3.04(m，3H)；3.25至3.37(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.45至3.55(m，14H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝1.5Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.7和8.0和11.5Hz，1H)；4.91(dd，J＝3.4和9.8Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.6和11.5Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.5和15.2Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.9和11.5和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.8Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.8Hz，1H)；7.20至7.26(m，3H)；7.27至7.32(m，3H)；8.35(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A1)：ES m/z＝989[M+H]+；m/z＝495[M+2H]2+基峰；tR＝3.24min。
实施例7：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[({2-[2-(2-{2-(4-甲基-4-巯基戊酰基氨基)乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}甲基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000831
化合物31：甲基[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基戊酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000832
将270mg(649μmol)化合物4和199mg(649μmol)化合物26溶于1.5mlDMF中，然后将100μl(714μmol)TEA加到混合物中。在室温继续搅拌16小时。混合物用10ml EtOAc稀释，用水(2×5ml)和饱和NaCl溶液(5ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物31，其呈无色油状物形式(251mg，80％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.24(s，6H)；1.39(s，9H)；1.79(m，2H)；2.16(m，2H)；2.40(s，3H)；2，80(宽单峰，3H)；3.18(q，J＝5.9Hz，2H)；3.39(t，J＝5.9Hz，2H)；3.45至3.54(m，12H)；7.88(宽三重峰，J＝5.9Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝483[M+H]+；m/z＝505[M+Na]+；m/z＝527[M-H+HCO2H]-；tR＝1.04min。
化合物32：N-(2-{2-[2-(2-甲基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)-4-甲基-4-甲基二硫基戊酰胺
向251mg(520μmol)化合物31在8ml DCM中的溶液中加入1.93ml(26mmol)TFA。在室温继续搅拌3小时，然后将混合物浓缩至干。将粗产物溶于最小量DCM中，然后用甲苯进行几次夹带。粗产物通过在SCX柱(Varian)上进行的SPE过滤来纯化，所述SCX柱(Varian)用甲醇处理和洗涤，然后用氨水在甲醇中的0.5N溶液洗脱。得到化合物32，其呈无色油状物形式(159mg，80％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.24(s，6H)；1.79(m，2H)；2.15(m，2H)；2.27(s，3H)；2.40(s，3H)；2.58(t，J＝5.7Hz，2H)；3.18(q，J＝5.7Hz，2H)；3.39(t，J＝5.7Hz，2H)；3.44(t，J＝5.7Hz，2H)；3.47至3.54(m，8H)；7.89(宽三重峰，J＝5.7Hz，1H)。LCMS(A1)：ES m/z＝383[M+H]+；tR＝2.68min。
实施例7：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[({2-[2-(2-{2-(4-甲基-4-巯基戊酰基氨基)乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}甲基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
实施例7可如下得到：用胺32通过使用就制备化合物30而描述的方法对衍生物2中的氯进行亲核取代反应，然后通过使用就制备实施例6而描述的方法对二硫化物进行还原。
实施例8：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-{(S)-1-[(2R，3R)-3-(4-巯基甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000851
化合物33：实施例8的二聚物
Figure BDA0000139392070000852
将化合物2(24.5mg；34.1μmol)溶于无水THF(2.5ml)中且将混合物冷却至-10℃，然后先后加入二(三甲基甲硅烷基)硫烷(44.3μmol)和1M四丁基氟化铵在THF(40.9μmol)中的溶液。将混合物冷却至室温且继续搅拌1小时30分钟。混合物通过加入EtOAc(5ml)来稀释且有机相用饱和NH4Cl水溶液(5ml)洗涤。水相用EtOAc(2×5ml)萃取。将有机相合并且用饱和NaCl水溶液(5ml)洗涤。用MgSO4干燥且过滤后，将溶剂减压蒸发掉。粗反应产物通过硅胶色谱(用100/0至97/3DCM/甲醇混合物作为洗脱剂进行洗脱)来纯化。得到白色固体即化合物33(19mg；78％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：0.78(m，12H)；1.00(s，6H)；1.04(d，J＝6.8Hz，6H)；1.11(s，6H)；1.30(m，2H)；1.49-1.63(m，4H)；1.82(m，2H)；2.26(m，2H)；2.63-2.72(m，4H)；2.93-3.05(m，6H)；3.25-3.37(部分被遮蔽的多重峰，2H)；3.81(s，6H)；3.82(s，4H)；3.89(d，J＝2.0Hz，2H)；4.25(ddd，J＝3.7，8.0和11.5Hz，2H)；4.91(dd，J＝3.7，9.6Hz，2H)；5.10(ddd，J＝1.3，5.3和10.8Hz，2H)；5.79(dd，J＝1.3，15.3Hz，2H)；6.47(ddd，J＝3.7，10.8和15.3Hz，2H)；7.05(d，J＝8.6Hz，2H)；7.17(dd，J＝2.0，8.6Hz，2H)；7.22(dd，J＝2.5，9.3Hz，2H)；7.26-7.32(m，10H)；8.34(d，J＝8.0Hz，2H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1427[M+H]+；tR＝1.31min。
实施例8：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-{(S)-1-[(2R，3R)-3-(4-巯基甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070000853
将化合物33(11mg；7.7μmol)溶于甲醇(8.8ml)中。然后加入TCEP(76.7μmol)在2.2ml水中的溶液且将混合物在室温搅拌2小时。将混合物稀释在20ml EtOAc中且有机相用水和饱和NH4Cl水溶液的1/1混合物(20ml)洗涤。水相用EtOAc(2×15ml)萃取。将有机相合并，用饱和NaCl水溶液(15ml)洗涤。用MgSO4干燥且过滤后，将溶剂减压蒸发掉。粗反应产物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到白色固体即实施例8(4.7mg；31％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：0.79(d，J＝6.4Hz，6H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.30(m，1H)；1.50-1.63(m，2H)；1.80(m，1H)；2.27(m，1H)；2.62-2.75(m，2H)；2.84(宽三重峰，J＝6.5Hz，1H)；2.93-3.06(m，3H)；3.34(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.73(宽二重峰，J＝6.5Hz，2H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝1.6Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.7，8.0和11.4Hz，1H)；4.91(dd，J＝3.6，9.6Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.3，5.3和11.4Hz，1H)；5.79(dd，J＝1.3，15.2Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.4，11.3和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝1.9，8.5Hz，1H)；7.22(dd，J＝2.3，9.5Hz，1H)；7.25(d，J＝8.3Hz，2H)；7.28(d，J＝1.9Hz，2H)；7.35(d，J＝8.3Hz，2H)；8.34(d，J＝8.0Hz，2H)。LCMS(A2)：ESm/z＝715[M++H]+；m/z＝713[M-H]-；tR＝1.18min。
实施例9：hu2H11-SPDB-实施例1
Figure BDA0000139392070000861
根据一般两步法，10.4mg(0.071μmol，1.174ml)裸抗体hu2H11(初始浓度为8.86mg/ml)用7当量4-(吡啶-2-基二硫基)丁酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯(0.16mg，0.496μmol)在34.2μl DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度在混合物中为8mg/ml。纯化后，得到2.2ml浓度为4.28mg/ml的经改性的抗体hu2H11(9.42mg，91％)，其中平均4.68个吡啶基二硫化物分子/抗体。1.68ml(7.2mg，0.049μmol)经改性的抗体hu2H11用1.03mg(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮(化合物实施例1，1.148μmol)在101.2μl DMA中的溶液处理。在10％NMP存在下用Superdex进行纯化且用Amicon Ultra-15进行浓缩后，最后将缓冲液变为含有0.01M磷酸盐和0.14M NaCl的pH 6.5含水缓冲液。由此得到1.5ml浓度为1.1mg/ml的缀合物实施例9，其中平均3个念珠藻素衍生物/抗体(HRMS)且单体纯度为99.9％。
实施例10：hu2H11-SPDB-实施例2
Figure BDA0000139392070000871
根据一般一步法，13.5mg(0.092μmol，1.318ml)裸抗体hu2H11(初始浓度为10.24mg/ml)用6当量4-(吡啶-2-基二硫基)丁酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯(0.18mg，0.551μmol)在38.4μl DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度在混合物中为9mg/ml。在室温以约2000rpm搅拌2小时后，先后加入1.333ml(12.0mg，0.081μmol)经改性的抗体hu2H11的混合物、1.760ml pH 7.5-8缓冲液、543μl DMA和1.73mg(E)-(3S，6R，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6-甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮(化合物实施例2，1.958μmol)在182μl DMA中的溶液。在20％NMP存在下用Superdex进行纯化且用Amicon Ultra-15进行浓缩后，最后将缓冲液变为含有0.01M组氨酸、10％蔗糖(w/v)和5％NMP(v/v)的pH 6.5含水缓冲液。由此得到1.5ml浓度为2.83mg/ml的缀合物实施例10，其中平均3.7个念珠藻素衍生物/抗体且单体纯度为98.8％。
实施例11：hu2H11-SPDB-实施例5
根据一般一步法，9.45mg(0.064μmol，0.923ml)裸抗体hu2H11(初始浓度为10.24mg/ml)用6当量4-(吡啶-2-基二硫基)丁酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯(0.13mg，0.398μmol)在26.88μl DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度在混合物中为9mg/ml。在室温以约2000rpm搅拌2小时后，先后加入1.0ml(9.0mg，0.061μmol)经改性的抗体hu2H11的反应介质、1.45ml pH≈7.5-8缓冲液、265μlDMA和1.26mg(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(2-巯基-2-甲基丙基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮(化合物实施例5，1.472μmol)在285μl DMA中的溶液。在20％NMP存在下用Superdex进行纯化且用Amicon Ultra-15进行浓缩后，最后将缓冲液变为含有0.01M组氨酸、10％蔗糖(w/v)和5％NMP(v/v)的pH 6.5含水缓冲液。由此得到2.5ml浓度为1.70mg/ml的缀合物实施例12，其中平均3.7/3.1个念珠藻素衍生物(UV/HRMS)/抗体且单体纯度为98.0％。
实施例12：hu2H11-SPDB-实施例6
Figure BDA0000139392070000881
根据一般一步法，10.31mg(0.070μmol，1.006ml)裸抗体hu2H11(初始浓度为10.24mg/ml)用6当量4-(吡啶-2-基二硫基)丁酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯(0.14mg，0.429μmol)在29.32μl DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度在混合物中为9mg/ml。在室温以约2000rpm搅拌2小时后，向1.1ml(9.9mg，0.067μmol)经改性的抗体hu2H11的混合物中先后加入1.595ml pH≈7.5-8缓冲液、291μl DMA和1.60mg(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[({2-[2-(2-{2-甲基[2-巯基-2-甲基丙基]氨基乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}甲基氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮(化合物实施例6，1.617μmol)在314μl DMA中的溶液。在20％NMP存在下用Superdex进行纯化且用Amicon Ultra-15进行浓缩后，最后将缓冲液变为含有0.01M组氨酸、10％蔗糖(w/v)和5％NMP(v/v)的pH 6.5含水缓冲液。由此得到3ml浓度为1.97mg/ml的缀合物实施例12，其中平均3.4个念珠藻素衍生物/抗体(HRMS)且单体纯度为99.8％。
实施例13：(4-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}哌嗪-1-基)乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000882
化合物34：4-甲氧基羰基甲基哌嗪-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000883
将200mg(1.07mmol)哌嗪-1-羧酸叔丁酯溶于无水乙腈(10ml)中。然后先后加入TEA(1.07mmol)和溴乙酸甲酯(1.61mmol)。将白色混悬液在室温搅拌48小时，然后加入饱和NaHCO3水溶液(10ml)。水相用DCM(3×10ml)萃取且将有机相合并，用饱和NaCl水溶液洗涤且用MgSO4干燥。过滤且将溶剂减压蒸发掉后，得到粗产物。该粗产物通过硅胶色谱(用98/2DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。由此得到无色油状物即所需产物34(174.8mg；63％)。TLC(DCM90/MeOH 10)：Rf＝0.66。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：1.39(s，9H)；2.40至2.48(m，4H)；3.25(s，2H)；3.28至3.33(部分被遮蔽的多重峰，4H)；3.61(s，3H)。
化合物35：哌嗪-1-基乙酸甲酯盐酸盐
将化合物34(174mg；0.67mmol)溶于无水二噁烷(5ml)中且加入4M HCl在二噁烷中的溶液(0.02mmol)。将混合物在室温搅拌5小时，然后混悬液用烧结漏斗过滤。由此得到的固体先后用二噁烷(2ml)和异丙醚(2ml)洗涤，然后真空干燥。得到米色固体即化合物35(131mg；100％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：2.88至2.97(m，4H)；3.09至3.19(m，4H)；3.53至3.59(m，2H)；3.65(s，3H)；8.65至9.22(宽多重峰，2H)。
化合物36：(4-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}哌嗪-1-基)乙酸甲酯
Figure BDA0000139392070000892
将衍生物1(20mg；28.6μmol)溶于无水DCM(1ml)中且先后加入TEA(71.5μmol)和CMS(45.8μmol)。在室温保持12小时后，不对所形成的产物2进行分离。先后加入TEA(85.7μmol)和哌嗪-1-基乙酸甲酯盐酸盐35(42.8μmol)。将混合物在室温再搅拌72小时，然后加入无水DMF(1ml)和NaI(30μmol)。将混合物在45℃搅拌48小时，然后用EtOAc(5ml)稀释。有机相用水(2×2ml)、饱和NaHCO3水溶液(2ml)和饱和NaCl水溶液(2ml)洗涤。用MgSO4干燥且过滤后，将溶剂减压蒸发掉。粗反应产物通过硅胶色谱(用100/0至98/2DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物36，其呈白色固体形式(8.2mg；34％)。TLC(DCM 90/MeOH 10)：Rf＝0.45。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：0.77(d，J＝6.1Hz，3H)；0.78(d，J＝6.1Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝7.1Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.27至1.32(m，1H)；1.50至1.60(m，2H)；1.74至1.84(m，1H)；2.21至2.30(m，1H)；2.37(宽单峰，4H)；2.64至2.74(m，2H)；2.94至3.06(m，3H)；3.18至3.52(部分被遮蔽的多重峰，9H)；3.60(s，3H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝2.0Hz，1H)；4.20至4.31(m，1H)；4.91(dd，J＝3.8和9.9Hz，1H)；5.11(m，1H)；5.80(d，J＝15.2Hz，1H)；6.48(ddd，J＝3.8和11.2和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.3Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.3Hz，1H)；7.20至7.33(m，6H)；8.34(d，J＝8.1Hz，1H)。LCMS(A1)：ES m/z＝839[M+H]+；m/z＝420[M+2H]2+(基峰)；m/z＝837[M-H]-；m/z＝883[M+HCO2H-H]-(基峰)；tR＝3.57min。
化合物37：溴乙酸烯丙酯
将288mg(4.95mmol)烯丙醇溶于25ml DCM中。将溶液冷却至0℃，然后加入760μl(5.45mmol)TEA和3.03mg(24.8μmol)DMAP。将混合物在0℃搅拌，然后加入1.0g(4.95mmol)溴乙酰溴。在室温将反应继续过夜。将水加到混合物中；水相用DCM洗涤。将有机馏分合并，用水和饱和NaCl溶液洗涤且用MgSO4干燥。过滤且将溶剂减压蒸发掉后，得到产物37(747mg，84％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：4.18(s，2H)；4.64(td，J＝1.5和5.4Hz，2H)；5.25(qd，J＝1.5和10.5Hz，1H)；5.35(qd，J＝1.5和17.2Hz，1H)；5.92(tdd，J＝5.4和10.5和17.2Hz，1H)。
化合物38：4-烯丙基氧基羰基甲基哌嗪-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000902
向200mg(1.07mmol)1-Boc-哌嗪在8ml乙腈中的溶液中加入150μl(1.07mmol)TEA和250mg(1.40mmol)溴乙酸烯丙酯37。将混合物在室温搅拌过夜。反应通过加入饱和NaHCO3溶液来停止。混合物用EtOAc(3次)萃取；将有机相合并，用饱和NaCl溶液洗涤且用MgSO4干燥。过滤且将溶剂减压蒸发掉后，粗产物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到所需产物38，其呈黄色油状物形式(314mg；100％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：1.39(s，9H)；2.45至2.48(m，4H)；3.25至3.34(部分被遮蔽的多重峰，6H)；4.57(td，J＝1.5和5.6Hz，2H)；5.22(qd，J＝1.5和10.3Hz，1H)；5.30(qd，J＝1.5和17.1Hz，1H)；5.83至5.98(m，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝285[M+H]+；m/z＝229基峰；tR＝0.51min。
化合物39：哌嗪-1-基乙酸烯丙酯盐酸盐
Figure BDA0000139392070000911
将314mg(1.10mmol)化合物38溶于12.6ml二噁烷中，然后加入5.5ml(22.0mmol)4M HCl在二噁烷中的溶液。在室温继续搅拌过夜。将混合物浓缩至干，得到所需化合物39，其呈黄色油状物形式(260mg；100％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：2.79至2.88(m，4H)；3.07至3.15(m，4H)；3.48至3.51(m，2H)；4.60(td，J＝1.5和5.6Hz，2H)；5.23(qd，J＝1.5和10.3Hz，1H)；5.32(qd，J＝1.5和7.4Hz，1H)；5.86至5.98(m，1H)；8，74(宽单峰，2H)。LCMS(A2)：ESm/z＝185[M+H]+；tR＝0.19min。
化合物40：(4-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}哌嗪-1-基)乙酸烯丙酯
Figure BDA0000139392070000912
向用氩气吹洗的化合物2(28.3mg，39.5μmol)在无水乙腈(2.5ml)中的溶液中加入化合物39(118.5μmol)和TEA(198μmol)在无水乙腈(1ml)中的溶液。在40℃继续搅拌24小时。将混合物稀释在EtOAc(10ml)中。有机相用水(10ml)、饱和NaHCO3水溶液(10ml)和饱和NaCl水溶液(10ml)洗涤。用MgSO4干燥且过滤后，将溶剂减压蒸发掉。粗反应产物通过硅胶色谱(用98/2DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物40，其呈白色固体形式(19.2mg；56％)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：0.75(d，J＝6.3Hz，3H)；0.77(d，J＝6.3Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.25至1.33(m，1H)；1.50至1.61(m，2H)；1.74至1.84(m，1H)；2.27(dt，J＝11.3和14.2Hz，1H)；2.32至2.42(m，4H)；2.52(部分被遮蔽的多重峰，4H)；2.64至2.74(m，2H)；2.94至3.05(m，3H)；3.25(s，2H)；3.32至3.35(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.40至3.48(m，2H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝1.6Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.7和8.0和11.6Hz，1H)；4.56(td，J＝1.5和5.5Hz，2H)；4.91(dd，J＝3.7和9.7Hz，1H)；5.11(m，1H)；5.21(qd，J＝1.5和10.5Hz，1H)；5.30(qd，J＝1.5和17.3Hz，1H)；5.80(d，J＝16.2Hz，1H)；5.86至5.95(m，1H)；6.47(ddd，J＝3.8和11.2和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.19至7.32(m，6H)；8.34(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝865[M+H]+；m/z＝433.5[M+2H]2+(基峰)；m/z＝863[M-H]-；m/z＝909[M+HCO2H-H]-；tR＝0.92min。
化合物41：(4-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}哌嗪-1-基)乙酸
Figure BDA0000139392070000921
在氩气下向化合物40(12.8mg，14.8μmol)在无水THF中的溶液中加入四(三苯基膦)钯(1.48μmol)和吗啉(148μmol)。反应3小时后，将混合物浓缩至干且吸收在5ml DCM中。有机相用1ml 0.1N HCl溶液/3ml水(pH≈5)洗涤，用MgSO4干燥，过滤且蒸发，得到化合物41(6.7mg，55％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(d，J＝6.0Hz，3H)；0.78(d，J＝6.0Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.28(m，1H)；1.52至1.59(m，2H)；1.76至1.84(m，1H)；2.21至2.32(m，1H)；2.42(d，J＝6.6Hz，4H)；2.58至2.76(m，6H)；2.97至3.09(m，3H)；3.14(宽单峰，2H)；3.33(被遮蔽的多重峰，1H)；3.46(宽单峰，2H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝1.8Hz，1H)；4.20至4.29(m，1H)；4.89至4.93(m，1H)；5.06至5.14(m，1H)；5.80(d，J＝15.2Hz，1H)；6.43至6.50(m，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.20至7.32(m，6H)；8.34(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝825[M+H]+；m/z＝413[M+2H]2+(基峰)；m/z＝823[M-H]-；tR＝0.86min。
实施例13：(4-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}哌嗪-1-基)乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000922
实施例13可如下得到：根据就实施例18所描述的方法对酸41进行活化。
实施例14：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000931
化合物42：3-(2-{2-[2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸烯丙酯
向Boc-15-氨基-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸(50mg，137μmol)在1.25mlDCM中的溶液中先后加入EDCI盐酸盐(164.2μmol)、DMAP(13.7μmol)和烯丙醇(164.2μmol)。将混合物在室温搅拌16小时，然后蒸发至干。粗产物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物42，其呈无色油状物形式(37.5mg；67％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.37(s，9H)；2.57(t，J＝6.1Hz，2H)；3.06(q，J＝6.1Hz，2H)；3.37(t，J＝6.1Hz，2H)；3.44至3.53(m，12H)；3.64(t，J＝6.1Hz，2H)；4.55(td，J＝1.6和5.4Hz，2H)；5.20(qd，J＝1.6和10.5Hz，1H)；5.30(qd，J＝1.6和17.3Hz，1H)；5.90(tdd，J＝5.4和10.5和17.3Hz，1H)；6.70(宽三重峰，J＝6.1Hz，1H)。LCMS(A2)ES m/z＝406[M+H]+；m/z＝428[M+Na]+；m/z＝306基峰；tR＝0.91min。
化合物43：3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸烯丙酯盐酸盐
Figure BDA0000139392070000933
向化合物42(37.5mg，92.5μmol)在2ml二噁烷中的溶液中加入460μl(1.85mmol)4M氯化氢在二噁烷中的溶液。在室温继续搅拌过夜，然后将反应介质蒸发至干，得到化合物43，其呈无色油状物形式(31mg，定量)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：2.58(t，J＝6.1Hz，2H)；2.96(t，J＝5.4Hz，2H)；3.48至3.53(m，8H)；3.55至3.58(m，4H)；3.60(t，J＝5.4Hz，2H)；3.65(t，J＝6.1Hz，2H)；4.56(td，J＝1.6和5.4Hz，2H)；5.21(qd，J＝1.6和10.5Hz，1H)；5.30(qd，J＝1.6和17.3Hz，1H)；5.91(tdd，J＝5.4和10.5和17.3Hz，1H)；7.91(宽多重峰，3H)。LCMS(A2)：ES m/z＝306[M+H]+；tR＝0.42min。
化合物44：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸烯丙酯
Figure BDA0000139392070000941
向用氩气吹洗的化合物2(12.7mg，17.7μmol)在1.48ml无水乙腈中的溶液中先后加入22.2μl TEA(159μmol)和30.2mg化合物43(88.4μmol)。在40℃继续搅拌24小时。剩余一些起始化合物2；将22.2μl TEA(159μmol)和30.2mg化合物43(88.4μmol)加到混合物中且在40℃再继续搅拌48小时。将2ml水加到混合物中，然后其用2×2ml EtOAc萃取。将有机相合并，用饱和NaHCO3溶液(2ml)和饱和氯化钠溶液(2ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗反应产物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物44，其呈白色固体形式(4.8mg；27％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.77(m，6H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.29(m，1H)；1.49至1.60(m，2H)；1.81(m，1H)；2.26(m，1H)；2.56(t，J＝6.1Hz，2H)；2.61至2.73(m，4H)；2.93至3.04(m，3H)；3.28至3.38(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.45至3.53(m，14H)；3.63(t，J＝6.1Hz，2H)；3.72(s，2H)；3.81(s，3H)；3.86(宽单峰，1H)；4.25(ddd，J＝3.4和8.2和11.4Hz，1H)；4.55(dm，J＝5.4Hz，2H)；4.90(dd，J＝3.9和9.8Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.4和5.4和11.2Hz，1H)；5.19(dm，J＝10.8Hz，1H)；5.29(dm，J＝17.2Hz，1H)；5.79(dd，J＝1.4和15.2Hz，1H)；5.90(m，1H)；6.47(ddd，J＝3.9和11.2和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.8Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.0和8.8Hz，1H)；7.21(m，1H)；7.24(d，J＝8.3Hz，2H)；7.28(d，J＝2.0Hz，1H)；7.33(d，J＝8.3Hz，2H)；8.35(d，J＝8.2Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝986[M+H]+；m/z＝493.5[M+2H]2+基峰；m/z＝984[M-H]-；m/z＝1030[M-H+HCO2H]-基峰；tR＝0.95min。
实施例14：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000951
实施例14可如下得到：根据就化合物41所描述的方法对化合物44进行脱保护且根据就实施例18所描述的方法对所得到的酸进行活化。
实施例15：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基(甲基)氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000952
化合物45：3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基甲基氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸
将520mg(1.423mmol)Boc-15-氨基-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸溶于14ml无水THF中，然后将混合物冷却至0℃，然后用药匙加入85.4mg(2.135mmol)氢化钠。在0℃继续搅拌10分钟，然后在0℃加入150.6μl(2.419mmol)甲基碘。使温度返回至室温且继续搅拌2小时。将8ml水加到混合物中，然后其pH如下酸化：加入乙酸以得到pH≈4。其用3×10ml EtOAc萃取。将有机相合并，用10ml饱和NaCl溶液洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩至干后，得到化合物45，其呈无色油状物形式(414mg，77％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.38(s，9H)；2.43(t，J＝6.4Hz，2H)；2.80(宽单峰，3H)；3.29(t，J＝5.9Hz，2H)；3.45至3.52(m，14H)；3.60(t，J＝6.4Hz，2H)；12.01(宽多重峰，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝402[M+Na]+；m/z＝378[M-H]-；m/z＝280基峰；tR＝0.95min。
化合物46：3-[2-(2-{2-[2-(叔丁氧基羰基甲基氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸烯丙酯
向540mg(1.423mmol)化合物45在15ml无水DCM中的溶液中先后加入327mg(1.71mmol)EDCI、17.4mg(142μmol)DMAP和116μl(1.71mmol)烯丙醇。在室温继续搅拌15小时，然后将混合物浓缩至干。所得粗产物通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物46，其呈无色油状物形式(337mg；56％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.38(s，9H)；2.57(t，J＝6.1Hz，2H)；2.80(宽单峰，3H)；3.22至3.33(部分被遮蔽的多重峰，2H)；3.44至3.54(m，14H)；3.64(t，J＝6.1Hz，2H)；4.55(宽二重峰，J＝4.9Hz，2H)；5.20(宽二重峰，J＝10.3Hz，1H)；5.30(宽二重峰，J＝17.1Hz，1H)；5.90(m，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝442[M+Na]+；m/z＝320基峰；tR＝0.98min。
化合物47：3-(2-{2-[2-(2-甲基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸烯丙酯
Figure BDA0000139392070000961
向337mg(0.802mmol)化合物46在20ml DCM中的溶液中加入1.19ml(16.04mmol)TFA。在室温继续搅拌3小时，然后将混合物减压浓缩至干。粗产物通过在SCX柱(Varian)上进行的SPE过滤来纯化，所述SCX柱(Varian)用甲醇处理和洗涤，然后用氨水在甲醇中的0.5N溶液洗脱。得到化合物47，其呈无色油状物形式(208mg，81％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：2.27(s，3H)；2.54至2，61(m，4H)；3.44(t，J＝5.6Hz，2H)；3.47至3.52(m，12H)；3.65(t，J＝6.2Hz，2H)；4.56(宽二重峰，J＝5.4Hz，2H)；5.20(宽二重峰，J＝10.5Hz，1H)；5.30(宽二重峰，J＝17.2Hz，1H)；5.90(m，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝320[M+H]+；tR＝0.42min。
化合物48：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基(甲基)氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸烯丙酯
Figure BDA0000139392070000962
向用氩气吹洗的化合物2(40mg，55.7μmol)在5ml无水乙腈中的溶液中先后加入48.5μl DIPEA(279μmol)和53mg化合物47(167μmol)。在40℃继续搅拌15小时；将5ml水加到混合物中，然后其用4×5ml EtOAc萃取。将有机相合并，用饱和NaHCO3溶液(5ml)和饱和NaCl溶液(5ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗反应产物通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物48，其呈无色固体形式(45.3mg；80％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(d，J＝5.9Hz，3H)；0.78(d，J＝5.9Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.04(d，J＝6.8Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.29(m，1H)；1.50至1.61(m，2H)；1.80(m，1H)；2.15(s，3H)；2.28(m，1H)；2.52(t，J＝6.4Hz，2H)；2.56(t，J＝6.4Hz，2H)；2.63至2.73(m，2H)；2.94至3.06(m，3H)；3.25至3.35(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.48(s，2H)；3.49至3.51(m，12H)；3.52(t，J＝6.4Hz，2H)；3.63(t，J＝6.4Hz，2H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝1.5Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.4和8.3和11.5Hz，1H)；4.55(宽二重峰，J＝5.0Hz，2H)；4.91(dd，J＝3.7和9.5Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.7和11.5Hz，1H)；5.19(dm，J＝10.3Hz，1H)；5.29(dm，J＝17.6Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.5和15.2Hz，1H)；5.90(m，1H)；6.47(ddd，J＝3.7和11.5和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.0和8.5Hz，1H)；7.22(dd，J＝2.9和9.8Hz，1H)；7.25(d，J＝8.3Hz，2H)；7.28(d，J＝2.0Hz，1H)；7.30(d，J＝8.3Hz，2H)；8.35(d，J＝8.3Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1000[M+H]+；m/z＝500.5[M+2H]2+；m/z＝1044[M-H+HCO2H]-；tR＝1.01min。
化合物49：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基(甲基)氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸
将19mg(18.9μmol)化合物48溶于3.8ml无水THF中且用氩气吹洗。将6μl(18.9μmol)二乙胺加到混合物中，将其在室温搅拌15分钟，然后加入4.45mg(19.8μmol)二乙酸钯(II)和18.89mg载体上的三苯基膦。在室温继续搅拌6天：剩余一些原料，但反应不再进行。对混合物进行过滤，浓缩至干，吸收在2ml无水THF中且用10μl(31.5μmol)二乙胺和10mg四(三苯基膦)钯处理1小时。混合物用2ml 2M硫酸氢钠水溶液水解且用3×2ml DCM萃取。将有机相合并，用饱和NaCl溶液(2ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过接枝有二醇的硅胶色谱(用98/2至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物49，其呈无色固体形式(5.4mg；30％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(t，J＝5.9Hz，3H)；0.78(t，J＝5.9Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.04(d，J＝6.8Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.31(m，1H)；1.51至1.62(m，2H)；1.80(m，1H)；2.15(s，3H)；2.28(m，1H)；2.42(t，J＝6.4Hz，2H)；2.52(t，J＝6.4Hz，2H)；2.64至2.73(m，2H)；2.94至3.04(m，3H)；3.25至3.44(部分被遮蔽的多重峰，3H)；3.45至3.51(m，12H)；3.53(t，J＝6.4Hz，2H)；3.59(t，J＝6.4Hz，2H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝2.0Hz，1H)；4.25(ddd，J＝4.2和7.8和11.5Hz，1H)；4.91(dd，J＝3.4和9.8Hz，1H)；5.11(dd，J＝5.4和11.2Hz，1H)；5.80(d，J＝15.2Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.7和11.2和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.3Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.0和8.3Hz，1H)；7.21至7.27(m，3H)；7.28至7.32(m，3H)；8.38(宽二重峰，J＝7.8Hz，1H)；11.22(非常宽的多重峰，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝960[M+H]+；m/z＝480.5[M+2H]2+基峰；m/z＝958[M-H]-；tR＝0.90min。
实施例15：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基(甲基)氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000981
实施例15可如下制备：根据就实施例18所描述的方法对酸49进行活化。
实施例16：3-(2-{2-[2-(4-(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)哌嗪-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070000982
化合物50：3-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸
Figure BDA0000139392070000983
向300mg(1.08mmol)12-羟基-4，7，10-三氧杂十二烷酸叔丁酯在6ml DCM中的溶液中加入1.6ml(21.56mmol)TFA。在室温继续搅拌3小时。将混合物浓缩至干，吸收在最小量DCM中且用甲苯进行几次夹带，得到化合物50，其呈浅黄色油状物形式(240mg，定量)。
化合物51：3-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸烯丙酯
Figure BDA0000139392070000991
向240mg(1.08mmol)化合物50在3ml DCM中的溶液中先后加入248mg(1.29mmol)EDCI、13.2mg(1.29mmol)DMAP和88μl(1.29mmol)烯丙醇。在室温继续搅拌15小时，然后将混合物减压浓缩至干且粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物51，其呈无色油状物形式(144mg，51％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：2.57(t，J＝6.2Hz，2H)；3.41(m，2H)；3.46至3.52(m，10H)；3，65(t，J＝6.2Hz，2H)；4.52(t，J＝5.5Hz，1H)；4.56(m，2H)；5.20(dm，J＝10.5Hz，1H)；5，50(dm，J＝17.4Hz，1H)；5.90(m，1H)。
化合物52：4-(2-{2-[2-(2-烯丙基氧基羰基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070000992
向冷却至0℃的94mg(357μmol)化合物51在3.7ml DCM中的溶液中先后加入125μl(893μmol)TEA和30.4μl(393μmol)甲磺酰氯且在室温继续搅拌1小时。将混合物减压浓缩至干，然后吸收在5ml乙腈中。将249μl(1.785mmol)TEA和200mg(1.071mmol)Boc-哌嗪加到上述溶液中且将混合物在40℃搅拌且加热15小时。冷却至室温后，将混合物浓缩至干且通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物52，其呈无色油状物形式(69mg，45％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.39(s，9H)；2.33(m，4H)；2.46(t，J＝5.9Hz，2H)；2.57(t，J＝6.2Hz，2H)；3.28(部分被遮蔽的多重峰，4H)；3.45至3.53(m，10H)；3.64(t，J＝6.2Hz，2H)；4.55(m，2H)；5.20(dm，J＝10.5Hz，1H)；5.30(dm，J＝17.2Hz，1H)；5.90(m，1H)。
化合物53：3-{2-[2-(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸烯丙酯
向110mg(256μmol)化合物52在10ml DCM中的溶液中加入380μl(5.11mmol)TFA。在室温继续搅拌24小时。将混合物浓缩至干，吸收在最小量DCM中且用甲苯进行几次夹带。粗产物通过在SCX柱(Varian)上进行的SPE过滤来纯化，所述SCX柱(Varian)用甲醇处理和洗涤，然后用氨水在甲醇中的0.5N溶液洗脱。得到化合物53，其呈无色油状物形式(47mg，55％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：2.58(t，J＝6.2Hz，2H)；3.10至3.36(宽多重峰，6H)；3.45至3.78(部分被遮蔽的多重峰，16H)；4.56(m，2H)；5.20(dm，J＝10.5Hz，1H)；5.30(dm，J＝17.2Hz，1H)；5.90(m，1H)；9.00(宽多重峰，1H)。
化合物54：3-(2-{2-[2-(4-(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)哌嗪-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸烯丙酯
Figure BDA0000139392070001001
化合物54可如下得到：用胺53通过使用就制备化合物30而描述的方法对衍生物2中的氯进行亲核取代反应。
化合物55：3-(2-{2-[2-(4-(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)哌嗪-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸
Figure BDA0000139392070001002
化合物55可根据就化合物41所描述的方法来得到。
实施例16：3-(2-{2-[2-(4-(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)哌嗪-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001003
实施例16可根据就实施例18所描述的方法来得到。
实施例17：
3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}哌嗪-1-基)-1，1-二甲基-4-氧代丁基硫基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001011
化合物56：3-(2-{2-[2-(2-{2-溴乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001012
向3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸(671mg，2.53mmol)在DCM(10ml)中的溶液中加入溴乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.53mmol)在4.7ml DCM中的溶液。在室温继续搅拌15分钟，然后将DCC加到混合物中。反应4小时后，混合物用烧结漏斗过滤，然后对滤液进行蒸发且通过硅胶色谱(用99/1至94/6DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。所得油状物(800mg)通过接枝有氰基的硅胶色谱(用99/1DCM/甲醇混合物洗脱)来再次纯化。得到化合物56，其呈无色油状物形式(611mg，50％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：2.81(s，4H)；2.92(t，J＝5.9Hz，2H)；3.23(q，J＝5.9Hz，2H)；3.43(t，J＝5.9Hz，2H)；3.48至3.55(m，12H)；3.72(t，J＝5.9Hz，2H)；3.85(s，2H)；8.30(宽三重峰，J＝5.9Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝483[M+H]+；m/z＝481[M-H]-；tR＝0.51min。
化合物7：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
向用氩气吹洗的化合物2(19.8mg，27.6μmol)在无水乙腈(2.5ml)中的溶液中先后加入TEA(138μmol)和4-甲基-4-甲基二硫基-1-(哌嗪-1-基)戊-1-酮盐酸盐6(83μmol)。在40℃继续搅拌24小时，然后将混合物稀释在EtOAc(10ml)中。有机相用水(2×10ml)、饱和NaHCO3水溶液(10ml)和饱和NaCl水溶液(10ml)洗涤。用MgSO4干燥且过滤后，将溶剂减压蒸发掉。粗反应产物通过硅胶色谱(用99/1至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到白色粉末即化合物7(19.4mg；75％)。TLC(DCM 90/MeOH 10)：Rf＝0.6。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：0.75-0.81(m，6H)；1.01(s，3H)；1.05(d，J＝6.8Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.26(s，6H)；1.28-1.33(m，1H)；1.52-1.61(m，2H)；1.76-1.83(m，2H)；2.27-2.38(m，4H)；2.39(s，3H)；2.64-2.74(m，2H)；2.95-3.05(m，2H)；3.24-3.34(m，6H)；3.44(宽单峰，4H)；3.49(s，2H)；3.81(s，3H)；3.88(d，J＝1.7Hz，1H)；4.22-4.29(m，1H)；4.92(dd，J＝9.9，3.5Hz，1H)；5.08-5.15(m，1H)；5.81(d，J＝14.2Hz，1H)；6.48(ddd，J＝15.2，11.3，3.5Hz，1H)；7.05(d，J＝8.6Hz，1H)；7.17(dd，J＝8.4，2.3Hz，1H)；7.22(d，J＝9.3Hz，1H)；7.25-7.34(m，5H)；8.34(d，J＝8.1Hz，1H)。LCMS(A1)：ESm/z＝943[M+H]+；m/z＝941[M-H]-；tR＝4.03min。
注意：化合物7也可由G＝OMs来制备(参见实施例1)。
化合物实施例1：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070001021
将化合物7(17.9mg；18.97μmol)溶于乙醇(2.2ml)/水(1.8ml)混合物中且混合物变浑。然后加入TCEP(47.4μmol)且将混合物在室温搅拌3小时，然后通过加入EtOAc(20ml)来稀释且有机相用水和饱和NH4Cl水溶液的1/1混合物(20ml)洗涤，然后用20ml饱和NaCl溶液洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤且将溶剂减压蒸发掉，然后得到产物实施例1，其呈白色固体形式(15.6mg；92％)。TLC(DCM 90/MeOH 10)：Rf＝0.56。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76-0.81(m，6H)；1.01(s，3H)；1.06(d，J＝6.8Hz，3H)；1.13(s，3H)；1.24(s，6H)；1.27-1.31(m，1H)；1.56-1.64(m，2H)；1.73-1.85(m，3H)；2.26-2.33(m，3H)；2.36-2.45(m，4H)；2.63-2.75(m，2H)；2.95-3.06(m，3H)；3.34-3.36(m，1H)；3.42-3.51(m，6H)；3.82(s，3H)；3.89(s，1H)；4.22-4.29(m，1H)；4.92(dd，J＝9.8，3.4Hz，1H)；5.12(dd，J＝10.8，4.9Hz，1H)；5.81(d，J＝15.2Hz，1H)；6.48(ddd，J＝15.0，11.4，3.4Hz，1H)；7.06(d，J＝8.3Hz，1H)；7.18(dd，J＝8.3，1.5Hz，1H)；7.24(d，J＝9.8Hz，1H)；7.26-7.36(m，5H)；8.37(d，J＝7.8Hz，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝897[M+H]+；m/z＝895[M-H]-；tR＝0.97min。
实施例17：
3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}哌嗪-1-基)-1，1-二甲基-4-氧代-丁基硫基]乙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001031
向用氩气吹洗的化合物实施例1(15.6mg，17.8μmol)在无水乙腈(1.0ml)中的溶液中先后加入DIPEA(19.12μmol)和化合物56(19.12μmol)。在室温继续搅拌4小时，然后再加入29.5μmol DIPEA且继续搅拌16小时。第二天再加入29.5μmol化合物56和DIPEA且将混合物加热至50℃。再反应24小时后，加入22.6μmol化合物56和29.5μmol DIPEA且将混合物在60℃再加热24小时。然后停止加热且在室温继续搅拌64小时。将混合物稀释在10ml EtOAc中且有机相先后用2×10ml水和10ml饱和NaCl溶液洗涤。有机相用MgSO4干燥，过滤且将溶剂减压蒸发掉，然后粗产物通过硅胶色谱(用99/1至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到产物实施例17，其呈无色固体形式(9.2mg；41％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.77至0.82(m，6H)；1.02(s，3H)；1.06(d，J＝6.9Hz，3H)；1.13(s，3H)；1.23(s，6H)；1.26至1.35(m，1H)；1.52至1.64(m，2H)；1.68至1.77(m，2H)；1.78至1.86(m，1H)；2.26至2.33(m，3H)；2.35至2.41(m，4H)；2.68至2.76(m，2H)；2.82(s，4H)；2.93(t，J＝6.0Hz，2H)；2.96至3.07(m，4H)；3.13(s，2H)；3.20(q，J＝5.8Hz，2H)；3.33(m，1H)；3.38至3.57(m，18H)；3.73(t，J＝5.8Hz，2H)；3.83(s，3H)；3.89(s，2H)；4.27(m，1H)；4.93(dd，J＝3.8和10.0Hz，1H)；5.13(m，1H)；5.82(d，J＝15.4Hz，1H)；6.49(ddd，J＝3.8和11.1和15.4Hz，1H)；7.07(d，J＝8.8Hz，1H)；7.15至7.37(m，7H)；8.01(t，J＝5.8Hz，1H)；8.35(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1299[M+H]+；m/z＝650[M+2H]2+；m/z＝1297[M-H]-；tR＝0.92min。
实施例18：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S，3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基氧基羰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001032
化合物58：碳酸4-硝基苯基
酯·4-((2S，3S)-3-{(S)-1-[(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基]乙基}环氧乙烷基)苄基酯
将衍生物57(20mg；28.6μmol，根据Al-awar R.S.，et al.，J.Med.Chem.2003，46，2985-3007来制备)溶于无水DCM(0.3ml)中且溶液用氩气吹洗，然后先后加入TEA(40μmol)和氯甲酸4-硝基苯基酯(32.32μmol)。在室温搅拌3小时30分钟后，对混合物进行水解且稀释在7ml EtOAc中。有机相先后用水和饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤且蒸发至干，得到化合物58，其呈白色固体形式(23mg，93％)。LCMS(A3)：ES m/z＝864[M+H]+；m/z＝908[M+HCO2H-H]-；tR＝1.43min。
化合物59：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S，3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基氧基羰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸
Figure BDA0000139392070001042
向用氩气吹洗的化合物58(23mg，26.6μmol)在无水乙腈(1.6ml)中的溶液中先后加入3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸(39.9μmol)和TEA(53.2μmol)。在室温搅拌24小时后，将混合物稀释在10ml EtOAc中。有机相用10ml含有250μl 0.1N HCl的水(pH≈4)洗涤。水相用10ml EtOAc(2×)萃取；将有机相合并，先后用10ml水和10ml饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤且蒸发至干，得到化合物59，其呈极浅黄色固体形式(18.5mg，70％)。LCMS(A3)：ES m/z＝990[M+H]+；m/z＝988[M-H]-；tR＝1.32min。
实施例18：3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S，3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基氧基羰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向用氩气吹洗的化合物59(18.5mg，18.6μmol)在THF(1.5ml)中的溶液中先后加入DIPEA(55.8μmol)和碳酸N，N’-二琥珀酰亚氨基酯(37.2μmol)。在室温搅拌19小时后，将混合物稀释在10ml EtOAc中，先后用10ml水(两次)和10ml饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥且蒸发至干。粗产物通过硅胶色谱(用100/0至0/100庚烷/EtOAc混合物(含有10％异丙醇)洗脱)来纯化。得到产物实施例18，其呈白色固体形式(6.08mg；30％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.83至0.88(m，6H)；0.97(d，J＝7.1Hz，3H)；1.02(s，3H)；1.15(s，3H)；1.47至1.56(m，1H)；1.58至1.68(m，2H)；1.82至1.90(m，1H)；2.39至2.47(m，1H)；2.60至2.66(m，1H)；2.71(dd，J＝11.5和14.4Hz，1H)；2.80(s，4H)；2.91(t，J＝6.0Hz，2H)；2.94至3.07(m，3H)；3.14(q，J＝6.0Hz，2H)；3.37至3.56(部分被遮蔽的多重峰，15H)；3.71(t，J＝6.0Hz，2H)；3.79(m，1H)；3.81(s，3H)；4.27(ddd，J＝3.8和8.0和11.3Hz，1H)；4.96至5.05(m，3H)；5.11(m，1H)；5.88(d，J＝15.4Hz，1H)；6.48(ddd，J＝3.8和11.3和15.4Hz，1H)；7.05(d，J＝8.8Hz，1H)；7.14至7.39(m，8H)；8.40(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1087[M+H]+；m/z＝1085[M-H]-；tR＝1.09min。
实施例19：4-(1-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}-1H-1，2，3-三唑-4-基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001052
化合物60：(E)-(3S，10R，16S)-16-{(S)-1-[(2R，3R)-3-(4-叠氮基甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070001053
向用氩气吹洗的60mg(85.8μmol)化合物1在9ml无水THF中的溶液中加入25.9μl(120μmol)二苯基磷酰叠氮。将混合物在室温搅拌10分钟，然后冷却至0℃，然后加入18.0μl(120μmol)DBU。在室温继续搅拌15小时。反应不完全：加入25.9μl(120μmol)二苯基磷酰叠氮和18.0μl(120μmol)DBU且继续搅拌24小时。剩余一些起始化合物1：加入25.9μl(120μmol)二苯基磷酰叠氮和18.0μl(120μmol)DBU且继续搅拌24小时。反应混合物通过加入6ml水来水解，然后用DCM(3×6ml)萃取。将有机相合并，用饱和NaCl溶液(8ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用100/0至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物60，其呈白色固体形式(46mg，74％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(d，J＝6.3Hz，3H)；0.78(d，J＝6.3Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.30(m，1H)；1.49至1.63(m，2H)；1.82(m，1H)；2.27(m，1H)；2.63至2.74(m，2H)；2.95至3.05(m，3H)；3.25至3.38(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.81(s，3H)；3.92(d，J＝1.9Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.6和8.0和11.5Hz，1H)；4.46(s，2H)；4.92(dd，J＝3.6和9.6Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.7和11.3Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.5和15.1Hz，1H)；6.48(ddd，J＝3.8和11.3和15.1Hz，1H)；7.05(d，J＝8.6Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.6Hz，1H)；7.22(dd，J＝2.6和9.5Hz，1H)；7.28(d，J＝2.2Hz，1H)；7.34(d，J＝8.3Hz，2H)；7.38(d，J＝8.3Hz，2H)；8.34(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝724[M+H]+；m/z＝722[M-H]-；m/z＝768[M-H+HCO2H]-基峰；tR＝1.18min。
化合物61：4-(1-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}-1H-1，2，3-三唑-4-基)丁酸
Figure BDA0000139392070001061
向22mg(30.4μmol)化合物60在500μl水中的混悬液中加入6.8mg(60.8μmol)5-己炔酸在500μl THF中的溶液。然后加入122μl(12.2μmol)0.1M硫酸铜水溶液和122μl(24.3μmol)0.2M抗坏血酸钠水溶液。在室温继续搅拌2小时。混合物通过加入2ml水来水解，然后用EtOAc(3×2ml)萃取。将有机相合并，用饱和NaCl溶液(3ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物61，其呈白色固体形式(19.4mg，76％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.73(d，J＝6.4Hz，3H)；0.75(d，J＝6.4Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.04(d，J＝6.9Hz，3H)；1.11(s，3H)；1.29(m，1H)；1.50至1.59(m，2H)；1.76至1.85(m，3H)；2.20至2.30(m，3H)；2.62(t，J＝7.7Hz，2H)；2.65至2.72(m，2H)；2.94至3.04(m，3H)；3.28至3.38(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.81(s，3H)；3.89(d，J＝1.6Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.6和8.0和11.5Hz，1H)；4.90(dd，J＝3.6和9.6Hz，1H)；5.10(ddd，J＝1.6和5.2和11.2Hz，1H)；5.53(s，2H)；5.78(dd，J＝1.6和15.0Hz，1H)；6.46(ddd，J＝3.7和11.2和15.0Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝1.9和8.5Hz，1H)；7.22(dd，J＝2.3和9.5Hz，1H)；7.28(d，J＝1.9Hz，1H)；7.31(s，4H)；7.92(s，1H)；8.37(宽二重峰，J＝8.0Hz，1H)；12.03(非常宽的多重峰，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝836[M+H]+；m/z＝418.5[M+2H]2+基峰；m/z＝834[M-H]-；tR＝1.04min。
化合物62：4-(1-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}-1H-1，2，3-三唑-4-基)丁酸甲酯
Figure BDA0000139392070001071
向5mg(6μmol)化合物61在500μl DCM和200μl甲醇中的溶液中加入4.5μl(9.0μmol)2M三甲基甲硅烷基重氮甲烷在己烷中的溶液。继续搅拌30分钟。对混合物进行减压浓缩且通过用硅胶进行过滤(用98/2DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物62，其呈白色固体形式(5mg，98％)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：0.72(d，J＝6.4Hz，3H)；0.75(d，J＝6.4Hz，3H)；0.99(s，3H)；1.04(d，J＝6.8Hz，3H)；1.11(s，3H)；1.28(m，1H)；1.50至1.59(m，2H)；1.79(m，1H)；1.83(m，2H)；2.25(m，1H)；2.35(t，J＝7.6Hz，2H)；2.62(t，J＝7.6Hz，2H)；2.65至2.72(m，2H)；2.94至3.05(m，3H)；3.25至3.38(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.57(s，3H)；3.81(s，3H)；3.89(d，J＝1.5Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.7和8.3和11.4Hz，1H)；4.89(dd，J＝3.4和9.8Hz，1H)；5.09(ddd，J＝1.5和5.4和11.4Hz，1H)；5.53(s，2H)；5.78(dd，J＝1.5和15.2Hz，1H)；6.46(ddd，J＝3.4和11.4和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.8Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.0和8.8Hz，1H)；7.22(dd，J＝2.5和9.8Hz，1H)；7.28(d，J＝2.0Hz，1H)；7.31(s，4H)；7.92(s，1H)；8.34(d，J＝8.3Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝850[M+H]+；m/z＝425.5[M+2H]2+基峰；m/z＝848[M-H]-；m/z＝894[M-H+HCO2H]-基峰；tR＝1.11min。
实施例19：4-(1-{4-[(2R，3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S，10R，16S)-10-[3-氯-4-甲氧基苄基]-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基}乙基)环氧乙烷基]苄基}-1H-1，2，3-三唑-4-基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001081
向用氩气吹洗的13.4mg(16μmol)化合物61在1.2ml THF中的溶液中先后加入8.4μl(48.1μmol)DIPEA和8.21mg(32.04μmol)碳酸N，N’-二琥珀酰亚氨基酯。在室温继续搅拌26小时。混合物通过加入2ml水来水解，然后用2×2mlEtOAc萃取。将有机相合并且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过用硅胶进行过滤(用98/2DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。所得产物含有0.15mol NHS。将其吸收在2ml DCM中且用水(2×3ml)洗涤，然后用MgSO4干燥。过滤且浓缩至干后，得到化合物实施例19，其呈白色固体形式(12.56mg，84％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.73(d，J＝6.3Hz，3H)；0.75(d，J＝6.6Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.04(d，J＝6.9Hz，3H)；1.11(s，3H)；1.30(m，1H)；1.49至1.60(m，2H)；1.79(m，1H)；1.95(五重峰，J＝7.5Hz，2H)；2.26(m，1H)；2.65至2.77(m，6H)；2.81(宽单峰，4H)；2.92至3.05(m，3H)；3.34(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.81(s，3H)；3.89(d，J＝1.9Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.7和8.1和11.5Hz，1H)；4.90(dd，J＝3.6和9.6Hz，1H)；5.09(ddd，J＝1.4和5.5和11.3Hz，1H)；5.54(s，2H)；5.79(dd，J＝1.4和15.1Hz，1H)；6.46(ddd，J＝3.8和11.3和15.1Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.21(dd，J＝2.5和9.6Hz，1H)；7.28(d，J＝2.2Hz，1H)；7.31(s，4H)；7.95(s，1H)；8.33(d，J＝8.1Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝933[M+H]+；m/z＝467[M+2H]2+基峰；m/z＝977[M-H+HCO2H]-基峰；tR＝1.08min。
实施例20：3-(2-{2-[2-(2-{1-[1-(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)-1H-1，2，3-三唑-4-基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-氧代吡咯烷-1-基酯
化合物63：2-{2-[2-(2-(丙-2-炔基氧基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙醇
Figure BDA0000139392070001092
向用氩气吹洗且冷却至0℃的1g(5.15mmol)四乙二醇在25ml无水THF中的溶液中加入144mg(3.60mmol)NaH(60％在矿物油中的分散液)。在0℃继续搅拌30分钟，然后加入194μl(2.58mmol)炔丙基溴。在室温继续搅拌15小时。对混合物进行减压浓缩，然后粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物63，其呈无色油状物形式(789mg，65％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：3.40(t，J＝2.4Hz，1H)；3.42(t，J＝5.5Hz，2H)；3.48(q，J＝5.5Hz，2H)；3.51至3.58(m，12H)；4.14(d，J＝2.4Hz，2H)；4.53(t，J＝5.5Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝233[M+H]+；tR＝0.38min。
化合物64：3-(2-{2-[2-(2-(丙-2-炔基氧基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸叔丁酯
Figure BDA0000139392070001093
向用氩气吹洗的790mg(3.40mmol)化合物63在8.8ml无水THF中的溶液中加入4.4mg(190μmol)钠。将混合物在40℃加热2小时以将其完全溶解；冷却至室温后，将740μl(5.09mmol)丙烯酸叔丁酯加到混合物中。在室温继续搅拌15小时，然后对混合物进行减压浓缩且粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物64，其呈无色油状物形式(944mg，77％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.44(s，9H)；2.41(t，J＝6.2Hz，2H)；3.38(t，J＝2.4Hz，1H)；3.46至3.62(m，16H)；3.59(t，J＝6.2Hz，2H)；4.14(d，J＝2.4Hz，2H)。LCMS(A1)：ES m/z＝361[M+H]+；m/z＝383[M+Na]+；tR＝3.79min。
化合物65：3-(2-{2-[2-(2-(丙-2-炔基氧基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸
Figure BDA0000139392070001094
向944mg(2.62mmol)化合物64的溶液中加入2ml(52.4mmol)TFA。将混合物在室温搅拌6小时，然后浓缩至干，吸收在最小量DCM中且用甲苯进行几次夹带。得到化合物65，其呈无色油状物形式(722mg，91％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：2.44(t，J＝6.4Hz，2H)；3.39(t，J＝2.4Hz，1H)；3.46至3.56(m，16H)；3.60(t，J＝6.4Hz，2H)；4.14(d，J＝2.4Hz，2H)；7.44至9.73(非常宽的多重峰，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝305[M+H]+；m/z＝303[M-H]-；tR＝0.48min。
实施例20：3-(2-{2-[2-(2-{1-[1-(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)-1H-1，2，3-三唑-4-基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸2，5-氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001101
实施例20可由化合物60和65如下得到：实施就化合物61所描述的方法，然后根据就实施例19所描述的方法对酸进行活化。
实施例21：4-(4-{1-[(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)甲基氨基]甲基}-1，2，3-三唑-1-基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001102
化合物66：(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-16-[(S)-1-((2R，3R)-3-{4-[(甲基(丙-2-炔基)氨基)甲基]苯基}环氧乙烷基)乙基]-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070001103
向用氩气吹洗的40mg(55.7μmol)化合物2在5ml无水乙腈中的溶液中先后加入48.5μl(279μmol)DIPEA和13.9μl(167μmol)N-甲基炔丙基胺。将混合物在40℃加热15小时。剩余一些起始化合物2：再加入48.5μl(279μmol)DIPEA和13.9μl(167μmol)N-甲基炔丙基胺。在40℃搅拌24小时后，混合物用5mlEtOAc稀释，然后用5ml水洗涤。水相用3×5ml EtOAc萃取且将有机相合并，用饱和NaHCO3溶液(10ml)和饱和NaCl溶液(10ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩后，粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物66，其呈白色固体形式(45mg，quant.)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：0.78(m，6H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.8Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.30(m，1H)；1.49至1.61(m，2H)；1.81(m，1H)；2.20(s，3H)；2.28(m，1H)；2.63至2.76(m，2H)；2.92至3.07(m，3H)；3.17(t，J＝2.4Hz，1H)；3.27(d，J＝2.4Hz，2H)；3.33(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.50(s，2H)；3.81(s，3H)；3.88(d，J＝1.7Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.4和7.8和11.4Hz，1H)；4.92(dd，J＝3.5和9.7Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.5和11.2Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.5和15.0Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.9和11.2和15.0Hz，1H)；7.05(d，J＝8.6Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.1和8.6Hz，1H)；7.22(dd，J＝2.1和9.4Hz，1H)；7.25至7.33(m，5H)；8.33(d，J＝7.8Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝750[M+H]+；ES m/z＝375.5[M+2H]2+基峰；ESm/z＝748[M-H]-；m/z＝794[M-H+HCO2H]-；tR＝0.91min。
化合物67：4-叠氮基丁酸乙酯
将2.86ml(20mmol)4-溴丁酸乙酯和2.6g(40mmol)NaN3溶于丙酮/水混合物(30ml，2/1)中。将混合物回流7小时。冷却至室温且减压浓缩后，将残留物吸收在50ml水中。水相用3×30ml DCM萃取。将有机相合并，用MgSO4干燥，过滤且减压浓缩，得到化合物67，其呈无色油状物形式(3g，95％)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)：1.27(t，J＝7.2Hz，3H)；1.92(m，2H)；2.41(t，J＝7.2Hz，2H)；3.36(t，J＝6.7Hz，2H)；4.15(q，J＝7.2Hz，2H)。
化合物68：4-叠氮基丁酸
Figure BDA0000139392070001112
向3g(19.9mmol)化合物67在47ml甲醇和37ml水中的溶液中逐份加入5.58g(99.5mmol)氢氧化钾。将混合物在室温搅拌6小时，然后减压浓缩至约28ml。残留物用25ml水稀释且用2×20ml DCM萃取。通过加入浓HCl将水相酸化至pH≈1，然后用3×25ml乙醚萃取。将有机相合并，用饱和NaCl溶液(25ml)洗涤且用MgSO4干燥。过滤且减压浓缩至干后，得到化合物68，其呈无色油状物形式(2.05g，80％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)：1.93(m，2H)；2.49(t，J＝7.1Hz，2H)；3.39(t，J＝6.7Hz，2H)；11.24(宽多重峰，1H)。
化合物69：4-(4-{1-[(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)甲基氨基]甲基}-1，2，3-三唑-1-基)丁酸
Figure BDA0000139392070001121
向24mg(32μmol)化合物66在545μl THF中的溶液中先后加入8.3mg(13μmol)化合物68、545μl水、128μl 0.1M硫酸铜水溶液和128μl 0.2M抗坏血酸钠水溶液。将混合物在室温搅拌45分钟，然后用2ml水稀释。水相用3×2ml EtOAc萃取。将有机相合并，用饱和NaCl溶液(2ml)洗涤且用MgSO4过滤。过滤且减压浓缩后，粗产物通过接枝有二醇的硅胶色谱(使用98/2至90/10DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物69，其呈白色固体形式(22.6mg，80％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.76(d，J＝6.6Hz，3H)；0.78(d，J＝6.6Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.11(s，3H)；1.30(m，1H)；1.50至1.62(m，2H)；1.81(m，1H)；2.03(m，2H)；2.10(s，3H)；2.20(t，J＝7.0Hz，2H)；2.30(m，1H)；2.64至2.74(m，2H)；2.94至3.03(m，3H)；3.35(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.48(s，2H)；3.61(s，2H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝1.6Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.7和7.7和11.5Hz，1H)；4.37(t，J＝7.0Hz，2H)；4.91(dd，J＝3.6和9.6Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.5和11.3Hz，1H)；5.80(dd，J＝1.5和15.1Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.7和11.3和15.1Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.23(dd，J＝2.5和9.8Hz，1H)；7.26(d，J＝8.5Hz，2H)；7.28(d，J＝2.2Hz，1H)；7.34(d，J＝8.5Hz，2H)；8.02(s，1H)；8.39(宽二重峰，J＝7.7Hz，1H)；12.14(宽多重峰，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝879[M+H]+；m/z＝877[M-H]-；tR＝0.86min。
化合物70：4-(4-{1-[(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)甲基氨基]甲基}-1，2，3-三唑-1-基)丁酸甲酯
Figure BDA0000139392070001131
向用氩气吹洗的5.5mg(6.2μmol)化合物69在0.5ml DCM和0.2ml甲醇中的溶液中加入4.7μl(9.3μmol)三甲基甲硅烷基重氮甲烷。将混合物在室温搅拌45分钟，然后浓缩至干。粗产物通过硅胶色谱(使用98/2至95/5DCM/甲醇混合物作为洗脱剂)来纯化。得到化合物70，其呈白色固体形式(3.4mg，62％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.75(d，J＝6.6Hz，3H)；0.77(d，J＝6.6Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.11(s，3H)；1.28(m，1H)；1.49至1.61(m，2H)；1.80(m，1H)；2.07(m，2H)；2.10(m，3H)；2.26(m，1H)；2.31(t，J＝7.0Hz，2H)；2.62至2.74(m，2H)；2.93至3.04(m，3H)；3.27至3.37(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.48(s，2H)；3.58(s，3H)；3.61(s，2H)；3.81(s，3H)；3.87(d，J＝2.0Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.7和8.2和11.6Hz，1H)；4.38(t，J＝7.0Hz，2H)；4.91(dd，J＝3.9和9.8Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.3和11.2Hz，1H)；5.79(dd，J＝1.5和15.2Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.9和11.2和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.6Hz，1H)；7.16(dd，J＝2.2和8.6Hz，1H)；7.22(dd，J＝2.4和9.8Hz，1H)；7.26(d，J＝8.6Hz，2H)；7.28(d，J＝2.2Hz，1H)；7.33(d，J＝8.6Hz，2H)；8.03(s，1H)；8.34(d，J＝8.2Hz，1H)。LCMS(A2)：ESm/z＝893[M+H]+；m/z＝447[M+2H]2+基峰；m/z＝891[M-H]-；m/z＝937[M-H+HCO2H]-基峰；tR＝0.90min。
实施例21：4-(4-{1-[(4-{(2R，3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S，10R，16S)-10-{3-氯-4-甲氧基苄基}-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基)乙基]环氧乙烷基}苄基)甲基氨基]甲基}-1，2，3-三唑-1-基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0000139392070001132
实施例21可如下得到：根据就实施例19所描述的方法对酸69进行活化。
实施例22
Figure BDA0000139392070001141
化合物71：(E)-(3S，10R，16S)-16-{(S)-1-[(2S，3S)-3-(4-叠氮基甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070001142
将醇57(36mg；51.48μmol，根据Al-awar R.S.，et al.，J.Med.Chem.2003，46，2985-3007来制备)溶于无水THF(2ml)中。溶液用氩气吹洗且在冰冷的水浴中冷却，然后先后加入DPPA(74μmol)和DBU(80μmol)。将混合物温热至室温且继续搅拌过夜。第二天将溶液在冰冷的水浴中再次冷却，然后再加入74μmolDPPA和80μmol DBU。在0℃反应2小时且在室温反应2小时后，混合物用5ml水进行水解，然后用DCM萃取3次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤且减压蒸发。然后粗产物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物57，其呈无色固体形式(24mg；64％)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：0.84(d，J＝6.3Hz，3H)；0.86(d，J＝6.3Hz，3H)；0.98(d，J＝7.1Hz，3H)；1.03(s，3H)；1.15(s，3H)；1.48至1.67(m，3H)；1.88(m，1H)；2.45(m，1H)；2.63(m，1H)；2.71(dd，J＝11.5和14.0Hz，1H)；2.97至3.08(m，3H)；3.36(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.82(宽单峰，4H)；4.28(ddd，J＝3.6和8.0和11.5Hz，1H)；4.44(s，2H)；4.99(dd，J＝3.7和9.5Hz，1H)；5.12(ddd，J＝1.4和5.7和11.4Hz，1H)；5.88(dd，J＝1.4和15.2Hz，1H)；6.49(ddd，J＝3.8和11.4和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.18(dd，J＝2.2和8.5Hz，1H)；7.26至7.32(m，4H)；7.36(d，J＝8.5Hz，2H)；8.40(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝722[M-H]-；m/z＝724[M+H]+；m/z＝768[M+HCO2H-H]-；tR＝1.19min。
化合物72：(E)-(3S，10R，16S)-16-{(S)-1-[(2S，3S)-3-(4-氨基甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
Figure BDA0000139392070001151
将化合物71(22mg，30.38μmol)溶于甲醇(1ml)/水(0.2ml)混合物中，然后加入TCEP(34.89μmol)。将所得溶液在室温搅拌过夜，然后减压浓缩。然后将残留物吸收在饱和NaHCO3水溶液中且用DCM萃取3次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。由此得到中间体72，其呈无色固体形式(21mg，99％)，所述固体以粗品形式用于以下步骤。LCMS(A5)：ES m/z＝696[M-H]-；m/z＝698[M+H]+；m/z＝742[M+HCO2H-H]-；tR＝3.19min。
化合物74：Fmoc-Val-Cit-PABAC-α-氨基念珠藻素72
Figure BDA0000139392070001152
将化合物72(21mg，30.08μmol)溶于乙腈(2ml)/无水DMF(0.5ml)混合物中，然后加入化合物73(23mg，30.1μmol；根据WO 2006/110 476来制备)在乙腈(2ml)中的溶液。将混合物在室温搅拌22小时，然后减压浓缩。将残留物吸收在DCM中且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。然后粗产物通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物74，其呈白色固体形式(22mg)，所述固体以粗品形式用于以下步骤。LCMS(A5)：ES m/z＝1325[M+H]+；m/z＝1369[M+HCO2H-H]-；tR＝4.30min。
化合物75：Val-Cit-PABAC-α-氨基念珠藻素72
Figure BDA0000139392070001153
将化合物74(22mg，16.59μmol)溶于DMF(3ml)中，然后加入哌啶(150μl，1.51mmol)且将混合物在室温搅拌30分钟。对混合物进行减压浓缩；将残留物溶于最小量甲醇中且用乙醚进行析出。由此得到化合物75，其呈白色固体形式(15mg，82％)。LCMS(A5)：ES m/z＝1103[M+H]+；m/z＝1101[M-H]-；m/z＝1148[M+HCO2H-H]-；tR＝3.38min。
化合物76：戊二酸-Val-Cit-PABAC-α-氨基念珠藻素72
Figure BDA0000139392070001161
在氩气下将戊二酸酐(8mg，70μmol)在无水DMF(200μl)中的溶液加到化合物75(15mg，13.59μmol)中。将所得溶液在室温搅拌过夜，然后加入饱和NH4Cl水溶液且用DCM萃取3次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。将所得残留物吸收在DCM中且用乙醚进行析出。用烧结漏斗过滤且用乙醚洗涤后，得到化合物76，其呈米色固体形式(8mg，48％)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：0.80至0.92(m，12H)；0.96(d，J＝7.1Hz，3H)；1.02(s，3H)；1.15(s，3H)；1.30至1.72(m，9H)；1.86(m，1H)；2.00(m，1H)；2.11至2.26(m，4H)；2.42(m，1H)；2.60至2.74(m，2H)；2.91至3.11(m，5H)；3.38(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.76(d，J＝1.8Hz，1H)；3.81(s，3H)；4.17(m，3H)；4.27(m，1H)；4.37(m，1H)；4.90至5.04(m，3H)；5.11(m，1H)；5.50(宽多重峰，2H)；5.88(宽二重峰，J＝15.2Hz，1H)；6.20(宽多重峰，1H)；6.48(m，1H)；7.06(d，J＝8.3Hz，1H)；7.11至7.32(m，9H)；7.60(m，2H)；7.75(m，1H)；7.89(m，1H)；8.28(宽多重峰，1H)；8.41(d，J＝7.8Hz，1H)；9.92(宽单峰，1H)；12.06(宽多重峰，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1217[M+H]+；m/z＝1215[M-H]-；tR＝1.05min。
实施例22
Figure BDA0000139392070001162
将化合物76(6mg，4.93μmol)溶于DCM(0.5ml)和DMF(0.1ml)的混合物中，然后先后加入碳酸N，N’-二琥珀酰亚氨基酯(6mg，23.42μmol)和DIPEA(4μl，22.96μmol)。在室温反应3小时后，加入饱和NH4Cl水溶液且混合物用DCM萃取3次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物实施例22，其呈白色固体形式(4mg；61％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：0.80至0.90(m，12H)；0.96(d，J＝7.3Hz，3H)；1.03(s，3H)；1.15(s，3H)；1.32至1.76(m，7H)；1.80至1.89(m，3H)；1.97(m，1H)；2.29(m，2H)；2.44(m，1H)；2.60至2.75(m，4H)；2.81(s，4H)；2.89至3.08(m，5H)；3.41(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.77(d，J＝2.0Hz，1H)；3.81(s，3H)；4.14至4.24(m，3H)；4.27(ddd，J＝3.9和8.3和11.5Hz，1H)；4.38(m，1H)；4.93至5.03(m，3H)；5.11(m，1H)；5.39(宽单峰，2H)；5.88(宽二重峰，J＝15.2Hz，1H)；5.96(t，J＝5.9Hz，1H)；6.48(ddd，J＝3.7和11.1和15.2Hz，1H)；7.05(d，J＝8.3Hz，1H)；7.16至7.36(m，9H)；7.59(d，J＝7.8Hz，2H)；7.76(t，J＝6.1Hz，1H)；7.88(d，J＝8.8Hz，1H)；8.10(d，J＝7.3Hz，1H)；8.41(d，J＝8.3Hz，1H)；9.97(宽单峰，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1314[M+H]+；m/z＝1358[M+HCO2H-H]-；tR＝1.06min。
实施例23
Figure BDA0000139392070001171
化合物77：(E)-(3S，10R，16S)-16-{(S)-1-[(2R，3R)-3-(4-氨基甲基苯基)环氧乙烷基]乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-2，5，9，12-四酮
将化合物60(23mg，31.76μmol)溶于甲醇(1ml)和水(0.2ml)的混合物中，然后加入TCEP(34.90μmol)和DCM(量足以将其溶解)。将所得溶液在室温搅拌过夜，然后减压浓缩。然后将残留物吸收在饱和NaHCO3水溶液中且用DCM萃取3次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。粗产物最后通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。由此得到化合物77，其呈白色固体形式(12mg，59％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：0.78(d，J＝6.4Hz，6H)；1.00(s，3H)；1.05(d，J＝6.9Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.30(m，1H)；1.47至1.62(m，2H)；1.79(m，1H)；2.22至2.32(m，3H)；2.63至2.73(m，2H)；2.92至3.05(m，3H)；3.35(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.71(s，2H)；3.81(s，3H)；3.86(d，J＝1.6Hz，1H)；4.25(ddd，J＝3.6和8.0和11.3Hz，1H)；4.90(dd，J＝3.6和9.6Hz，1H)；5.11(ddd，J＝1.5和5.2和11.3Hz，1H)；5.79(dd，J＝1.5和15.0Hz，1H)；6.47(ddd，J＝3.6和11.3和15.0Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(dd，J＝1.9和8.5Hz，1H)；7.19至7.26(m，3H)；7.28(d，J＝1.9Hz，1H)；7.34(d，J＝8.0Hz，2H)；8.34(d，J＝8.0Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝698[M+H]+；m/z＝696[M-H]-；m/z＝742[M+HCO2H-H]-；tR＝0.87min。
化合物78：Fmoc-Val-Cit-PABAC-α-氨基念珠藻素77
Figure BDA0000139392070001181
将化合物77(10mg，14.32μmol)溶于无水DMF(0.1ml)中，然后加入中间体73(11mg，14.35μmol；根据WO 2006/110476来制备)在乙腈(1ml)和DMF(0.1ml)的混合物中的溶液。将混合物在室温搅拌3小时，然后减压浓缩。然后残留物通过硅胶色谱(用100/0至90/10DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物78，其呈白色固体形式(18mg，95％)。LCMS(A5)：ESm/z＝1325[M+H]+；m/z＝1369[M+HCO2H-H]-；tR＝4.32min。
化合物79：Val-Cit-PABAC-α-氨基念珠藻素77
Figure BDA0000139392070001182
将化合物78(42mg，31.68μmol)溶于DMF(5ml)中，然后加入哌啶(150μl，1.51mmol)且将混合物在室温搅拌30分钟。对混合物进行减压浓缩且将残留物溶于最小量甲醇中且用乙醚进行析出。由此得到化合物79，其呈白色固体形式(21mg，60％)。LCMS(A4)：ES m/z＝1103[M+H]+；m/z＝1101[M-H]-；m/z＝1147[M+HCO2H-H]-；tR＝3.67min。
化合物80：戊二酸-Val-Cit-PABAC-α-氨基念珠藻素77
将化合物79(20mg，18.12μmol)溶于DMF(100μl)和无水DCM(500μl)的混合物中，然后加入戊二酸酐(4mg，35.06μmol)。将所得溶液在室温搅拌过夜，然后减压浓缩。将残留物吸收在最小量DCM和甲醇中，用乙醚和戊烷的混合物进行析出且用烧结漏斗过滤。由此得到化合物80，其呈白色固体形式(23mg，104％粗品)，所述固体以粗品形式用于以下步骤。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.78(d，J＝6.3Hz，6H)；0.84(d，J＝6.6Hz，3H)；0.86(d，J＝6.6Hz，3H)；1.00(s，3H)；1.04(d，J＝6.9Hz，3H)；1.12(s，3H)；1.22至1.47(m，3H)；1.51至1.64(m，3H)；1.72(m，3H)；1.80(m，1H)；1.99(m，1H)；2.20(m，4H)；2.28(m，1H)；2.59至2.73(m，2H)；2.90至3.07(m，5H)；3.32(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.81(s，3H)；3.87(宽单峰，1H)；4.19(m，3H)；4.24(m，1H)；4.38(m，1H)；4.91(dd，J＝3.3和9.6Hz，1H)；4.97(宽单峰，2H)；5.10(dd，J＝4.4和10.7Hz，1H)；5.40(宽单峰，2H)；5.79(宽二重峰，J＝15.1Hz，1H)；5.99(宽多重峰，1H)；6.47(ddd，J＝3.6和11.3和15.1Hz，1H)；7.05(d，J＝8.5Hz，1H)；7.17(宽二重峰，J＝8.5Hz，1H)；7.20至7.34(m，8H)；7.60(宽二重峰，J＝8.2Hz，2H)；7.76(宽三重峰，J＝5.4Hz，1H)；7.83(d，J＝8.5Hz，1H)；8.09(宽二重峰，J＝7.1Hz，1H)；8.34(d，J＝8.0Hz，1H)；9.95(宽单峰，1H)；11.98(宽多重峰，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝1217[M+H]+；m/z＝1215[M-H]-；tR＝1.03min。
实施例23
Figure BDA0000139392070001191
实施例23可如下得到：根据就实施例22所描述的方法对酸80进行活化。
实施例24：[2-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基]甲基氨基甲酸4-((2S，3S)-3-{(S)-1-[(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基]乙基}环氧乙烷基)苄基酯
Figure BDA0000139392070001192
化合物81：甲基[2-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基]胺
Figure BDA0000139392070001193
向胺15(478mg，2.90mmol)在MeOH(35ml)中的溶液中加入TCEP(831mg，2.9mmol)。在室温反应2小时后，在氩气气氛下将所得溶液滴加到2，2’-二吡啶基二硫化物(2，2’-dipyridyl disulfide)(960mg，4.36mmol)在乙醇(70ml)中的溶液中。在室温再反应2小时后，对混合物进行减压浓缩。将残留物吸收在DCM中且用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机相分离出来，然后水相再用DCM萃取两次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(用98/2至85/15DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。得到化合物81，其呈浅黄色油状物形式(587mg，89％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：1.25(s，6H)；1.80(宽多重峰，1H)；2.19(s，3H)；2.45(s，2H)；7.22(ddd，J＝1.5和5.0和7.0Hz，1H)；7.74至7.85(m，2H)；8.42(ddd，J＝1.1和1.5和5.0Hz，1H)。
实施例24：[2-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基]甲基氨基甲酸4-((2S，3S)-3-{(S)-1-[(E)-(3S，10R，16S)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6，6-二甲基-2，5，9，12-四氧代-1，4-二氧杂-8，11-二氮杂环十六碳-13-烯-16-基]乙基}环氧乙烷基)苄基酯
Figure BDA0000139392070001201
向中间体58(21mg，24.3μmol)在无水DCM中的溶液中先后加入胺81(10mg，43.79μmol)和DIPEA(8μl，45.43μmol)。在室温保持24小时后，加入饱和NaHCO3水溶液且混合物用DCM萃取3次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。粗产物通过硅胶色谱(用100/0至95/5DCM/甲醇混合物洗脱)来纯化。由此得到化合物实施例24，其呈无色固体形式(7mg，30％)。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.82(d，J＝6.0Hz，3H)；0.84(d，J＝6.0Hz，3H)；0.97(d，J＝6.8Hz，3H)；1.03(s，3H)；1.14(s，3H)；1.25(宽单峰，6H)；1.45至1.68(m，3H)；1.88(m，1H)；2.42(部分被遮蔽的多重峰，1H)；2.58至2.75(m，2H)；2.83至3.09(m，6H)；3.34(部分被遮蔽的多重峰，1H)；3.46(宽单峰，2H)；3.81(宽单峰，4H)；4.28(m，1H)；4.91至5.17(m，4H)；5.88(宽二重峰，J＝15.2Hz，1H)；6.49(m，1H)；7.05(d，J＝8.6Hz，1H)；7.15至7.38(m，8H)；7.80(宽多重峰，2H)；8.39(d，J＝7.8Hz，1H)；8.43(宽二重峰，J＝4.6Hz，1H)。LCMS(A2)：ES m/z＝953[M+H]+；m/z＝477[M+2H]2+；m/z＝997[M+HCO2H-H]-；tR＝1.23min。
实施例25：hu2H11-实施例17
Figure BDA0000139392070001202
根据一般方法，8.31mg(0.057μmol，1.468ml)裸抗体hu2H11(浓度为5.66mg/ml)用5当量化合物实施例17(0.442mg，0.340μmol)在37.3μl DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度在混合物中为3mg/ml。用Superdex 200pg进行纯化且用Amicon Ultra-15(Ultracel 50k膜，Millipore)进行浓缩后，得到2.15ml在含有0.01M磷酸盐、0.14M NaCl和20％(按体积计)NMP的pH 6.5含水缓冲液中浓度为2.48mg/ml的缀合物，其中平均2.2个细胞毒性单元/抗体且单体纯度为99.7％。最后对于1ml缀合物，将缓冲液变为含有0.01M磷酸盐和0.14M NaCl的pH 6.5含水缓冲液。由此得到1.5ml浓度为1.06mg/ml的缀合物实施例25的溶液，其中平均2.8个念珠藻素衍生物(通过UV来确定)/抗体且单体纯度为99.7％。
实施例26：hu2H11-实施例18
Figure BDA0000139392070001211
根据一般方法，7.8mg(0.053μmol，1.458ml)裸抗体hu2H11(浓度为5.35mg/ml)用6当量化合物实施例18(0.578mg，0.531μmol，纯度为60％)在272μl DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度在混合物中为3mg/ml。用Superdex 200pg进行纯化且用Amicon Ultra-15(Ultracel 50k膜，Millipore)进行浓缩后，得到2.35ml在含有0.01M磷酸盐、0.14M NaCl和20％(按体积计)NMP的pH 6.5含水缓冲液中浓度为2.49mg/ml的缀合物，其中平均2.5个念珠藻素衍生物/抗体且单体纯度为100％。最后对于1ml缀合物，将缓冲液变为含有0.01M磷酸盐和0.14M氯化钠的pH 6.5含水缓冲液。由此得到1.5ml浓度为0.84mg/ml的缀合物实施例26的溶液，其中平均2.22个念珠藻素衍生物(通过UV来确定)/抗体且单体纯度为99.9％。
实施例27：hu2H11-实施例19
根据一般方法，12mg(81.7μmol，1.172ml)裸抗体hu2H11(浓度为10.24mg/ml)用2×5当量化合物实施例19(0.382mg，0.41μmol)在44.3μl DMA中的溶液处理，从而使最终抗体浓度在反应介质中为3mg/ml。在20％NMP存在下用Superdex 200pg进行纯化且用Amicon Ultra-15(Ultracel 50k膜，Millipore)进行浓缩后，得到1.04ml在含有0.01M磷酸盐、0.14M NaCl和20％(按体积计)NMP的pH 6.5含水缓冲液中的缀合物。最后将缓冲液变为含有0.01M组氨酸、10％蔗糖(w/v)和5％NMP(v/v)的pH 6.5含水缓冲液。由此得到1.5ml浓度为2.66mg/ml的缀合物实施例27的溶液，其中平均1.4个念珠藻素衍生物(HRMS)/抗体且单体纯度为99.8％。
上述实施例用具体的念珠藻素衍生物(通常为衍生物D1)制备，但可用于组D1-D8中的另一种衍生物或用于通式(II)念珠藻素衍生物。类似地，实施例10、11、12、25、26和27中的缀合物实例可用于除hu2H11外的其它抗体。
注意：在所述实施例中，-Lys-是指连接发生在抗体中赖氨酸的ε-氨基上。
实施例28：通过用其中Za＝SMe的SZa型式(II)化合物或其中ZbRb＝OMe或OCH2-CH＝CH2的-C(＝O)-ZbRb型式(II)化合物进行的细胞毒剂研究来评价对MDA-MB-231、MDA-A1和HCT116细胞系增殖的抑制
处于其指数生长期的MDA-MB-231、MDA-A1或HCT116细胞用胰蛋白酶处理且重新混悬在其各自的培养基(对于MDA细胞为DMEM/F12Gibco#21331、10％FCS Gibco#10500-056和2nM谷氨酰胺Gibco#25030；对于HCT116细胞为DMEM Gibco#11960、10％FCS Gibco#10500-056和2mM谷氨酰胺Gibco#25030)中。在Cytostar 96孔培养板(GE Healthcare Europe，#RPNQ0163)中将细胞混悬液以5000个细胞/孔(MDA-MB-231、MDA-A1或HCT116)的密度接种在含有血清的完全培养基中。孵育4小时后，将念珠藻素衍生物的连续稀释液以由10-7M降至10-12M的浓度加到各孔中(每种浓度一式三份)。将细胞在37℃在含有5％CO2的气氛下在细胞毒剂存在下培养3天。第4天将10μl 14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔，Perkin Elmer#NEC56825000)加到各孔中。实验开始后96小时使用Microbeta放射性计数器(Perkin Elmer)对14C-胸苷的引入进行测量。通过确定就用细胞毒剂处理的细胞而得到的减少计数和就对照孔中的细胞(仅用培养基处理)而得到的计数之间的比例将数据表示成存活百分比形式。
Figure BDA0000139392070001231
实施例29：评价抗体-细胞毒剂缀合物对MDA-MB-231、MDA-A1和HCT116细胞系增殖的抑制
处于其指数生长期的MDA-MB-231、MDA-A1或HCT116细胞用胰蛋白酶处理且重新混悬在其各自的培养基(对于MDA细胞为DMEM/F12Gibco#21331、10％FCS Gibco#10500-056和2nM谷氨酰胺Gibco#25030；对于HCT116细胞为DMEM Gibco#11960、10％FCS Gibco#10500-056和2mM谷氨酰胺Gibco#25030)中。在Cytostar 96孔培养板(GE Healthcare Europe，#RPNQ0163)中将细胞混悬液以5000个细胞/孔(MDA-MB-231、MDA-A1或HCT116)的密度接种在含有血清的完全培养基中。孵育4小时后，将念珠藻素衍生物的连续稀释液以由10-7M降至10-12M的浓度加到各孔中(每种浓度一式三份)。将细胞在37℃在含有5％CO2的气氛下在抗体-细胞毒剂免疫缀合物存在下培养3天。第4天将10μl 14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔，PerkinElmer#NEC56825000)加到各孔中。实验开始后96小时使用Microbeta放射性计数器(Perkin Elmer)对14C-胸苷的引入进行测量。通过确定就用免疫缀合物处理的细胞而得到的减少计数和就对照孔中的细胞(仅用培养基处理)而得到的计数之间的比例将数据表示成存活百分比形式。在某些实验中，当实验开始时，将裸抗体hu2H11以1μM的浓度加到各孔中且对增殖的抑制如上所述来测量。
Figure BDA0000139392070001232

Claims (34)

1.式(II)念珠藻素衍生物：
Figure FDA0000139392060000011
其中
■R1表示卤素原子且R2表示-OH、由氨基酸AA衍生的酰基或(C1-C4)烷酰基氧基；
或可选择地，R1和R2形成环氧单元；
●AA表示天然或非天然氨基酸；
■R3表示(C1-C6)烷基；
■R4和R5都表示H或一起形成在C13和C14之间的双键CH＝CH；
■R6和R7彼此独立表示H或(C1-C6)烷基；
■R8和R9彼此独立表示H或(C1-C6)烷基；
■R10表示苯基母核上的至少一个取代基且选自H、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基或-N((C1-C6)烷基)2；
■R11表示苯基母核上的至少一个取代基且选自H和(C1-C4)烷基；
■L表示在苯基母核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)优选在苯基母核的对位的连接基且带有选自以下的单元RCG1：
-G’X(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y’-(CR15R16)u Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t(CR17＝CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17＝CR18)(CR15R16)u Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌嗪基-CO(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-CO(CR15R16)uY’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Y’QRCG1；-G’X(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；
-G’X(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)u QRCG1；-G’X(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌嗪基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u Q RCG1；-G’X(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Q RCG1；或
-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y’-(CR15R16)u Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t(CR17＝CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17＝CR18)(CR15R16)u Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)uY’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌嗪基-CO(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-CO(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Y’QRCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u Y’Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Y’Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t-苯基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-呋喃基-(CR15R16)u Q RCG1；
-G”Y(CR13R14)t-噁唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-噻吩基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-咪唑基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌嗪基-(CR15R16)u QRCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌嗪基-(CR15R16)u Q CCR1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-甲基-NR12-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-哌啶基-NR12-(CR15R16)u Q RCG1；-G”Y(CR13R14)t-三唑基-(CR15R16)u Q RCG1；
在所述结构式中
G’表示-CH＝CH-或-(CH2)n-；
G”表示-(CH2)n-；
n表示范围为1至6的整数；
X表示单键、-CO-、-COO-或-CONR12-，其中基团CO与G’连接；
Y表示-O-、-OCO-、-OCOO-、-OCONR12-、-NR12-、-NR12CO-、-NR12CONR’12-、-NR12COO-或-S(O)q-，其中原子O和基团NR12与G”连接；
q表示可以是0、1或2的整数；
Y’表示-O-、-OCO-、-OCOO-、-OCONR12-、-NR12-、-NR12CO-、-NR12CONR’12-、-NR12COO-、-S(O)q-、-CO-、-COO-或-CONR12-；
R12、R’12、R13、R14、R15、R16、R17和R18彼此独立表示H或(C1-C6)烷基；
t、u和y表示范围可以是0至20的整数且t+u+y大于或等于1；
在所述连接基具有式-G”Y(CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y’-(CR15R16)u Q RCG1的情况下，若y为0且Q表示单键，则u不能为0；
Q表示单键、(C1-C10)亚烷基或(OCH2CH2)i，其中i为具有以下范围的整数，所述范围为1至20，更具体为1至10，甚至更具体为1至8或1至6，且甚至更具体为2至5；
■RCG1表示-SZa、-C(＝O)-ZbRb、
Figure FDA0000139392060000031
或其中R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为甲基；
或L选自：
Figure FDA0000139392060000033
Figure FDA0000139392060000041
Figure FDA0000139392060000042
-ALK-SZa；或-(CH2)n-SZa；
在所述结构式中
■
Figure FDA0000139392060000043
表示以下9种基团中的一种：
Figure FDA0000139392060000044
■n表示范围为1至6的整数；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基；
■R12和R’12彼此独立表示H或(C1-C6)烷基，更具体为甲基；
■i表示具有以下范围的整数，所述范围为1至20，更具体为1至10，甚至更具体为1至8或1至6，且甚至更具体为2至5；
或可选择地，L为式(IV)连接基：
Figure FDA0000139392060000045
其中
●(AA)w表示w个氨基酸AA通过肽键而连接在一起的序列；
●w表示范围为1至12且优选为1至6的整数；
●n表示范围为1至6的整数；
●D表示以下单元中的一种：
Figure FDA0000139392060000051
其中
R12表示H或(C1-C6)烷基；
R19、R20、R21和R22彼此独立表示H、卤素原子、-OH、-CN或(C1-C4)烷基；
与(CH2)n连接的T表示NR12或O；
V1表示O、S或NR12；
V2表示CR22或N；
V3、V4和V5彼此独立选自CR22和N；
■Za表示H或-SRa，其中Ra表示(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基；
■Zb表示单键、-O-或-NH-且Rb表示H、(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基。
2.权利要求1的念珠藻素衍生物，其中R10表示苯基母核上的至少一个取代基且选自H、-OH、(C1-C4)烷氧基和卤素原子。
3.权利要求1或2的念珠藻素衍生物，其中RCG1表示-SZa或-C(＝O)-ZbRb。
4.权利要求1至3的念珠藻素衍生物，其中
Figure FDA0000139392060000052
表示以下7种基团中的一种：
Figure FDA0000139392060000061
或
Figure FDA0000139392060000062
5.权利要求1至4的念珠藻素衍生物，其中n为1。
6.权利要求1的念珠藻素衍生物，其中L选自：
Figure FDA0000139392060000063
Figure FDA0000139392060000064
-CH2SZa；或-ALK-SZa。
■R12和R’12彼此独立表示H或(C1-C6)烷基，更具体为甲基；
■i表示具有以下范围的整数，所述范围为1至20，更具体为1至10，甚至更具体为1至8或1至6，且甚至更具体为2至5；
■Za表示H或-SRa，其中Ra表示(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基；
■Zb表示单键、-O-或-NH-且Rb表示H、(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基。
7.权利要求1的念珠藻素衍生物，其中L选自：
R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为甲基。
8.权利要求7的念珠藻素衍生物，其中R12表示H。
9.权利要求7的念珠藻素衍生物，其中R12表示(C1-C6)烷基，更具体为甲基。
10.权利要求1至9的念珠藻素衍生物，其中Za表示H、-S(C1-C6)烷基尤其是甲基S-或-S-杂芳基尤其是
Figure FDA0000139392060000072
或ZbRb表示-O(C1-C6)烷基、-OH、-OCH3、-OCH2CH＝CH2、或
Figure FDA0000139392060000074
其中GI表示至少一个吸电子基团，或可选择地，其中-C(＝O)ZbRb表示
Figure FDA0000139392060000081
11.权利要求1至10中任一项的念珠藻素衍生物，其具有以下结构式中的一种，其中L优选位于对位：
Figure FDA0000139392060000082
12.权利要求1的念珠藻素衍生物，其选自：
Figure FDA0000139392060000083
Figure FDA0000139392060000091
Figure FDA0000139392060000101
Za、Zb和Rb如权利要求1或10中所定义。
13.式(III)念珠藻素衍生物：
Figure FDA0000139392060000102
其中基团R1至R11具有与在权利要求1、11或12中相同的含义且G表示-(CH2)nY，所述-(CH2)nY位于带有单元CR1的苯基母核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)，优选位于对位，
n为范围为1至6的整数且Y表示-N3；-NR12-CH2-C≡CH，其中R12表示H或(C1-C6)烷基；甲磺酰基O-；-OC(＝O)-O-(4-硝基苯基)；
Figure FDA0000139392060000103
或
Figure FDA0000139392060000104
其中R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为甲基。
14.权利要求13的念珠藻素衍生物，其中Y表示-N3；-NR12-CH2-C≡CH，其中R12表示H或(C1-C6)烷基；甲磺酰基O-；或-OC(＝O)-O-(4-硝基苯基)。
15.权利要求1至12中任一项的念珠藻素衍生物或权利要求13的式(III)念珠藻素衍生物，其中G＝-(CH2)nY，其中Y＝-Cl、-N3、-OH、-NH2、马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基且旨在与结合剂缀合。
16.权利要求15的念珠藻素衍生物，其中所述结合剂为配体、蛋白质、抗体更具体为单克隆抗体、蛋白质片段或抗体片段、肽、寡核苷酸或寡糖。
17.制备与至少一个念珠藻素衍生物连接的称为缀合物的结合剂的方法，所述方法包括：
(i)使任选经缓冲的结合剂的水溶液与权利要求1至16中任一项的念珠藻素衍生物的溶液接触且使它们发生反应；
(ii)然后任选使步骤(i)中形成的缀合物与念珠藻素衍生物和/或未反应的结合剂和/或所形成的任何聚集物分离。
18.权利要求17的方法，其中
Figure FDA0000139392060000105
在包含-SZa型反应性化学基团RCG1的念珠藻素衍生物存在下，所述结合剂包含：
■在RCG1表示-SH的情况下，所述结合剂包含二硫化物化学基团；
■在RCG1表示-SZa且Za≠H的情况下，所述结合剂包含巯基化学基团；
■在RCG1表示-SH的情况下，所述结合剂包含马来酰亚氨基或碘乙酰氨基化学基团；
Figure FDA0000139392060000111
在包含-C(＝O)-ZbRb型反应性化学基团RCG1的念珠藻素衍生物存在下，使所述念珠藻素衍生物与所述结合剂中的氨基官能团尤其是抗体中由赖氨酸残基(Lys)的侧链所带有的ε-氨基反应；
Figure FDA0000139392060000112
在其中G＝-(CH2)nY的式(III)念珠藻素衍生物存在下，所述结合剂当Y＝-Cl或马来酰亚氨基时包含-SH，当Y＝-N3时包含-C≡CH，或当Y＝-OH或-NH2时包含羧基；
在包含马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基型反应性化学基团RCG1的念珠藻素衍生物存在下，所述结合剂包含巯基化学基团。
19.权利要求17或18的方法，其中
Figure FDA0000139392060000114
在包含-SZa型反应性化学基团RCG1的念珠藻素衍生物存在下，所述结合剂用改性剂改性，所述改性剂选自下式化合物：
Figure FDA0000139392060000115
其中R表示(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基、(C3-C7)环烷基或(C3-C7)杂环烷基且ALK表示(C1-C6)亚烷基；
下式PEG化类似物：
Figure FDA0000139392060000117
或下式磺基类似物：
Figure FDA0000139392060000118
其中X3、X4、X5和X6表示H或(C1-C6)烷基，X1和X2表示-H、-CONX8X9或-NO2，X8和X9表示H或(C1-C6)烷基，X7表示-SO3 -M+或H或季铵基团，a表示范围为0至4的整数，且b表示范围为0至2000的整数；
Figure FDA0000139392060000121
其中
-Hal表示卤素原子；
-X10表示卤素原子、COOX14、硝基、未取代或卤代的(C1-C8)烷基、未取代或卤代的(C1-C8)烷氧基、未取代或卤代的(C2-C8)烯基、未取代或卤代的(C2-C8)炔基、未取代的(C3-C8)环烷基或未取代或取代有一个至三个选自以下的取代基的芳基：氨基、卤素原子、未取代或卤代的(C1-C8)烷基和未取代或卤代的(C1-C8)烷氧基；
-X11、X12和X13各自独立表示氢原子或可表示X3；
或X10和X11一起形成环(C2-C5)亚烷基，所述环(C2-C5)亚烷基是未取代的或取代有一个至五个(C1-C4)烷基；
或X10和X11与X12一起形成环(C1-C5)亚烷基，所述环(C1-C5)亚烷基是未取代的或取代有一个至五个(C1-C4)烷基；
且X14为-H或(C1-C8)烷基；
Figure FDA0000139392060000122
在包含-SH型反应性化学基团RCG1的念珠藻素衍生物存在下，所述结合剂用改性剂改性，所述改性剂选自4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯；4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚氨基酯；
Figure FDA0000139392060000123
Figure FDA0000139392060000124
其中ALK表示(C1-C12)亚烷基，且b为0至2000的整数；
Figure FDA0000139392060000125
溴乙酸N-琥珀酰亚氨基酯；3-(N-溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚氨基酯；
Figure FDA0000139392060000126
其中b为0至2000的整数。
20.缀合物，其可通过权利要求17至19中任一项的方法来得到。
21.权利要求20的缀合物，其特征在于通过对HRMS谱进行解卷积而确定的DAR大于1，优选为2至10，且更具体为2至7。
22.权利要求20的缀合物，其特征在于使用UV分光光度计而确定的DAR大于0.5，优选大于1，更具体为1至10，且甚至更具体为2至7，其中所述DAR通过以下方程来计算：
DAR＝cD/cA
其中
cD＝[(εAλ1×Aλ2)-(εAλ2×Aλ1)]/[(εDλ2×εAλ1)-(εAλ2×εDλ1)]
cA＝[Aλ1-(cD×εDλ1)]/εAλ1
Aλ1和Aλ2分别表示缀合物溶液分别在波长λ1和λ2的吸光度；
εDλ1和εDλ2分别表示念珠藻素衍生物在缀合前在波长λ1和λ2的摩尔吸光系数，这些系数通过其中Za＝甲基S-的-SZa型式(II)化合物或其中ZbRb＝甲基O-或-OCH2-CH＝CH2的-C(＝O)-ZbRb型式(II)化合物来测量；
εAλ1和εAλ2分别表示裸抗体在缀合前在两种波长λ1和λ2的摩尔吸光系数。
23.权利要求22的缀合物，其中λ1＝280nm，且λ2在具体波长范围246nm-252nm内选择。
24.缀合物溶液，其可通过权利要求17至19中任一项的方法来得到或包含权利要求20至23中任一项的缀合物。
25.权利要求1至13中任一项的念珠藻素衍生物在制备与至少一个所述念珠藻素衍生物连接的结合剂中的用途。
26.念珠藻素衍生物在制备与至少一个所述念珠藻素衍生物连接的结合剂中的用途，
所述念珠藻素衍生物具有式(III)：
Figure FDA0000139392060000131
其中
G表示-CH＝CH2或-(CH2)nY，所述-CH＝CH2或-(CH2)nY位于带有单元CR1的苯基母核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)，优选位于对位；
Y表示-OH；-Cl；-N3；-NH2；-SH；-COOH；-NR12-CH2-C≡CH，其中R12表示H或(C1-C6)烷基，更具体为甲基；-OLG，其中LG表示离去基；-OC(＝O)-O-(4-硝基苯基)；或马来酰亚氨基；或
所述念珠藻素衍生物具有下式：
Figure FDA0000139392060000141
基团R1至R11具有与在权利要求1、11或12中相同的含义，且n为范围为1至6的整数。
27.念珠藻素衍生物在制备与至少一个念珠藻素衍生物连接的结合剂中的用途，所述念珠藻素衍生物选自以下物质中的一种：
Figure FDA0000139392060000142
Figure FDA0000139392060000151
Za、Zb和Rb如权利要求1或10中所定义。
28.下式念珠藻素衍生物：
基团R1至R11具有与在权利要求1、11或12中相同的含义，且n为范围为1至6的整数。
29.权利要求1至15中任一项的念珠藻素衍生物，其用作抗癌剂。
30.权利要求20至23的缀合物，其用作抗癌剂。
31.权利要求24的缀合物溶液，其用作抗癌剂。
32.权利要求1至15中任一项的念珠藻素衍生物在制备抗癌药物中的用途。
33.权利要求20至23的缀合物在制备抗癌药物中的用途。
34.权利要求24的缀合物溶液在制备抗癌药物中的用途。
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