EA024627B1

EA024627B1 - Производные криптофицина и его конъюгаты, их получение и применение в терапии

Info

Publication number: EA024627B1
Application number: EA201270096A
Authority: EA
Inventors: Эрве Бушар; Мари-Присцилл Брэн; Ален Коммерсон; Цзидун Чжан
Original assignee: Санофи
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2010-05-20
Publication date: 2016-10-31
Also published as: ECSP11011553A; AU2010267917A1; CO6430462A2; CA2766762C; FR2947271B1; CL2011003229A1; EA201270096A1; WO2011001052A1; KR20120101981A; CN102482238B; JP5746692B2; TW201110986A; IL217208A; ZA201109537B; TN2011000636A1; DOP2011000376A; MX2011013764A; FR2947271A1; SG10201607595WA; FR2947269A1

Abstract

Изобретение относится к производному криптофицина формулы (II), в которой Rозначает (C-C)алкильную группу; Rи Rозначают, независимо один от другого, Н или (C-C)алкильную группу; Rи Rозначают, независимо один от другого, Н или (C-С)алкильную группу; Rозначает Н или по меньшей мере один заместитель фенильного кольца, выбранный из группы (C-С)алкокси, атома хлора; Rозначает Н или по меньшей мере один заместитель, выбранный из (C-C)алкильной группы; L означает линкер в положении орто(о)-, мета(м)- или пара(п)-, выбранный изRозначает Н или (С-С)алкильную группу, Zозначает Н или группу -SR, где Rозначает группу (С-С)алкил; Zозначает простую связь, -О- или -NH-, причем Rозначает Н или группу (C-C)алкил. Кроме того, изобретение относится к применению указанного производного криптофицина для образования конъюгата с моноклональным антителом, способу получения коньюгата, представляющего собой моноклональное антитело, с которым ковалентно связано по меньшей мере одно производное криптофицина формулы (II), а также конъюгату для применения в качестве противоракового агента, получаемого описанным способом.

Description

Настоящее изобретение относится к конъюгированным криптофицинам, к содержащим их фармацевтическим композициям и применению их в терапии, в частности, в качестве противораковых агентов. Изобретение относится также к способу получения этих соединений, а также к самим производным криптофицинов.

Область техники

Криптофицины являются вторичными метаболитами, относящимися к классу депсипептидных макроциклов, продуцируемых цианобактериями вида Νοδΐοο. Их название связано с тем, что эти соединения являются высоко цитотоксичными соединениями по отношению к дрожжам вида Сгур!ососси8. Первый представитель этого класса молекул, криптофицин-1 (С-1), был выделен в 1990 г. из цианобактерии Νοδ1ос δρ (АТСС 53789) (ΕίβΙβΓ δ., е! а1., 8уп1йе818 2006, 22, 3747-3789). Структура, общая формула и нумерация атомов углерода в этих соединениях, такие как описано в заявке \УО 98/08505, и представлены ниже

Криптофицины С-1 и С-52, характеризующиеся наличием эпоксидной функциональной группы, показанной ниже, обладают противораковыми свойствами. Клинические испытания были проведены на раке легких, фаза II, с С-52 (ЬУ 355073): см. Ейе1тап М.1. е! а1., Ьипд Сапсег 2003, 39, 197-199; δеδδа С. е! а1., Еиг. 1. Сапсег 2002, 38, 2388-96. Сам криптофицин С-55, являющийся пролекарством С-52, характеризуется наличием хлоргидриновой функциональной группы вместо и на месте эпоксидной функциональной группы (Вюпра11у Р.Р.. е! а1., Сапсег Сйешо1йег Рйагшасо1. 2003, 52, 25-33). С-55 проявил себя очень активным продуктом, но нестабильным в растворе. Описаны также производные типа хлоргидринглицинатных производных, такие как соединение С-55 О1у, для увеличения стабильности (Ыап§ 1., е! а1., Iпνеδί^да!^οпа1 Νον Ωπίβδ 2005, 23, 213-224).

С52

Техническая задача

Химия конъюгатов известна в течение несколько лет и была применена для изучения нескольких семейств цитотоксических соединений, таких как, например, майтансиноиды (\УО 04103272), таксаны (\УО 06061258), томаймицины (\УО 09016516), лептомицины (\УО 07144709), СС-1065 и его аналоги (\УО 2007102069); см. также о конъюгированных соединениях: Моппеге! С., е! а1., Ви11ейп йи Сапсег, 2000, 87(11), 829-38; Исай А.Э. е! а1., №!иге Сйшса1 Ргасйсе Опсо1оду 2007, 4, 245-255. Однако эта химия не занималась производными криптофицина, конъюгированными с антителами или другими агентами клеточного связывания.

Техническая задача, которую предлагает решить настоящее изобретение, заключается в предоставлении новых конъюгатов на основе производных криптофицина, а также новых производных криптофицина, способных к конъюгированию.

Уровень техники

Документы ЕР 0830136 и \УО 98/08505 описывают производные криптофицинов, но не описывают конъюгированные криптофицины. Заявка \УО 98/08505 описывает производные криптофицинов формулы (А)

в которой Аг может означать группу Аг' формулы в которой К₅₄ означает Н, группу

- 1 024627 (С1-С₆)алкил, (С1-Сб)алкил(К₅₇, К₅₇·, К₅₇»), арил, фенил, гетероциклоалкил, атом галогена, СООК₅₇, РО₃Н, 8О₃Н, δΟ₇Ρ₇8. N^59^60, ΝΗΟΚβι, ΝΗΟΚβΐ', СЫ, ΝΟ₇. ОР₇2· СН₇ОРб₇'· ΟΒ^ΝΚ^Ρ^', (С1-Сб)алкил-ОКюо,

Ν Ν-Κ,,,

- δΚ₆₃; К₅₅ и К₅₆ означают Н, группу (С₁-С₆)алкил, С(К₅₇, К₅₇, К₅₇), арил, фенил, гетероциклоалкил, атом галогена, СООК₅₇, РО₃Н, §О₃Н, §О₂К₅₈, ΝΚ₅₉Κ₆₀, ЦНОКбь ННСНК_6Г, ΟΝ, NΟ₂, ОК₆₂, СН₂ОК₆₂₃ СН₂ОСОК₉₅, СН₂НК₉₆К₉₆', (С₁-С₆)алкил-ОК₁₀₀, (С₁-С₆)алкил-НК₅₉, К₆₀. Заявка \УО 98/08505 описывает, в частности, следующие соединения:

соединение 24, схема 4

соединение 33,схема 5

которые характеризуются конечной группой -ЯНС(=О)О1-Ви. Однако заявка \УО 98/08505 не конкретизирует, что эти соединения могут быть конъюгированы или используются для конъюгирования.

И8 2007/0213511 описывает иммуноконъюгаты калихеамицина. Среди них упоминается МУЪОТАКО® (или СМА-676), который является иммуноконьюгатом калихеамицина, используемым для лечения АМЬ (анти-СО33-калихеамицин). О конъюгатах см. также \УО 2006/042240.

А1-а^аг Κ.δ., е! а1., 1. Меб. СЬет. 2003, 46(14), 2985-3007 и А1-а^аг Κ.δ., е! а1., Мо1. Сапсег ТЬег. 2004, 3(9), 1061-1067 описывают производные криптофицина, а также оценивают их активность ίη νίνο.

\УО 08010101 описывает моноклональное антитело против ЕрЬА2, а также соответствующие конъюгаты, включающие одну или несколько молекул цитотоксического соединения, связанного(ых) с моноклональным антителом. \УО 08047242 описывает моноклональное антитело против СЭ38. а также соответствующие конъюгаты, включающие одну или несколько молекул цитотоксического соединения, свя- 2 024627 занного(ых) с моноклональным антителом. Цитотоксическое соединение может быть выбрано из майтансиноидов, таксанов, томаймицинов, лептомицинов, СС-1065 и его аналогов.

\νϋ 2009/126934 описывает антитела против СЭ70 и их конъюгаты с цитотоксическими соединениями; среди цитотоксических соединений назван криптофицин. νθ 2009/134976 описывает конъюгаты с оптимальной степенью замещения для подачи необходимого количества цитотоксических соединений в клетку; среди цитотоксических соединений назван криптофицин.

νθ 2005/116255 описывает конъюгаты аптамеров с цитотоксическим соединением, которым может быть криптофицин (см. [0037] и табл. 2), причем линкер может включать ПЭГ-цепочку ([0038]). В частности, описан криптофицин Сгур-ΝΗ формулы

а также его конъюгаты на основе аптамеров со следующими линкерами: ΝΗδ-ПЭГ-эритритол, ρΝΡПЭГ-эритритол, ΝΗδ-ПЭГ-октаПЭГ, ρΝΡ-ПЭГ-октаПЭГ и ПЭГ-еотЬ (табл. 3 и 4). Природа цепи на фенильном кольце (-СН₂О-С(=О)-СМе₂-СН₂МН-...) отличается от того, что предложено в настоящем изобретении. νθ 2006/096754 также описывает конъюгаты аптамеров с цитотоксическим соединением, которым тоже может быть криптофицин.

νθ 2009/002993 описывает конъюгаты цитотоксического соединения формулы В-Ь-Л, включающие гидрофильные линкеры, например линкер формулы о со_£н

Цитотоксическим соединением может быть криптофицин (с.46), при этом не уточнено место присоединения линкера. Примером конъюгированного соединения является ЕС0262

у которого линкер и место его присоединения отличаются от тех, которые предложены в настоящем изобретении.

Определения

Подразумевают под конъюгатом: агент клеточного связывания, с которым ковалентно соединена по меньшей мере одна молекула цитотоксического соединения;

агентом клеточного связывания (или по-английски се11 ЫпФпд адеи!): молекулу, имеющую сродство к биологической мишени: в настоящей заявке это моноклональное антитело. Функция агента клеточного связывания заключается в том, чтобы направлять биологически активное соединение, такое как цитотоксическое соединение, к биологической мишени. Предпочтительно, чтобы агент клеточного связывания не был аптамером;

биологической мишенью: антиген (или группу антигенов), локализованный предпочтительно на поверхности раковых или стромальных клеток, ассоциированных с этой опухолью; этими антигенами могут быть, например, рецептор фактора роста, онкогенный продукт или мутированный ген-супрессор опухоли, молекула, связанная с ангиогенезом, адгезивная молекула;

линкером: совокупность атомов, позволяющая ковалентно соединить цитотоксическое соединение с моноклональным антителом;

алкильной группой: углеводородную алифатическую насыщенную группу, получаемую удалением атома водорода из алкана. Алкильная группа может быть линейной или разветвленной. В качестве примера можно назвать группы: метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, 2,2диметилпропил, гексил;

циклоалкильной группой: циклическую алкильную группу, содержащую 3-8 атомов углерода, встроенных в циклическую структуру. В качестве примера можно назвать группы: циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил;

гетероциклоалкильной группой: циклоалкильную группу, содержащую по меньшей мере один гетероатом (О, 8, Ν), встроенный в цикл и связанный с атомами углерода, образующими цикл;

алкоксигруппой: О-алкильную группу, в которой алкильная группа такая, как определена выше; алканоилоксигруппой: О-СО-алкильную группу, в которой алкильная группа такая, как определена выше;

алкиленовой группой: двухвалентную насыщенную группу брутто-формулы -С_мН_2м-. получаемую

- 3 024627 удалением двух атомов водорода из алкана. В качестве примера можно назвать метиленовую (-СН₂-), этиленовую (-СН₂СН₂-), пропиленовую (-СН₂СН₂СН₂-), бутиленовую (-СН₂СН₂СН₂СН₂-), гексиленовую

.....^у о?

(-СН₂СН₂СН₂СН₂СН₂СН₂-) группу или следующие разветвленные группы ^: предпочтительно алкиленовая группа отвечает формуле -(СН₂)_П-, где η означает целое число; в диапазон величин включены граничные значения (например, диапазон типа η от 1 до 6 или между 1 и 6 включены граничные значения 1 и 6).

Используемая аббревиатура.

ΛοΘΕί: этилацетат; ЛЬК: группа (С₁-С₁₂)алкилен, более конкретно (С₁-С₆)алкилен, более конкретно в виде -(СН₂)_п-, где η означает целое число от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 6; ад.: водный; ССМ: хроматография в тонком слое (по-английски ТЬС); СМ8: метансульфонилхлорид; крипто означает звено формулы '·!>· в частности крипто означает одно из производных криптофицина Ό₁-Ό_δ, описанных ниже, или производное криптофицина согласно какому-либо примеру; Κί: коэффициент удерживания; ΌΑΚ: степень замещения (йтид-апйЬойу тайо); ИВИ: 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен; ИСС: Ν,Ν'дициклогексилкарбодиимид; ИСМ: дихлорметан; ΌΕΆΌ: диэтилазодикарбоксилат; И1С: Ν,Ν'диизопропилкарбодиимид; ΌΙΡΕΑ: Ν,Ν-диизопропилэтиламин; ΌΜΑ: диметилацетамид; ΌΜΑΡ: 4диметиламинопиридин; ΌΜΕ: диметоксиэтан; ΌΜΡ: диметилформамид; ДМСО: диметилсульфоксид; ΕΕΌΟ: 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин; ЕИС1: ^(3-диметиламинопропил)-№этилкарбодиимид; ΕΌΤΑ: этилендиаминтетрауксусная кислота; экв.: эквивалент; Ртос: флуоренилметоксикарбонил; НОВ!: 1-гидроксибензотриазол; ΗΕΡΕ8: 4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфоновая кислота; тСРВА: м-хлорпербензойная кислота; ΝΗ8: Ν-гидроксисукцинимид; ΝΜΡ: Ν-метилпирролидинон; АД: атмосферное давление; РАВАС: карбонат парааминобензилового спирта; ПД: пониженное давление; 8Ε& эксклюзионная стерическая хроматография; 8ΡΕ: твердофазная экстракция; КТ: комнатная температура; ΤΒΌΜ8: трет-бутилдиметилсилил; ТСЕР: гидрохлорид трис-(2-карбоксиэтил)фосфина; ΤΕΑ: триэтиламин; ТРА: трифторуксусная кислота; ΤΙΡ8: триизопропилсилил; ТНР: тетрагидрофуран; !_К: время удерживания.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к моноклональному антителу, с которым соединено по меньшей мере одно производное криптофицина формулы (I)

в которой К₃ означает (С1-С₆)алкильную группу;

Кб и К₇ означают, независимо один от другого, Н или (С1-С₆)алкильную группу;

К₈ и К₉ означают, независимо один от другого, Н или (С1-С₆)алкильную группу;

К₁₀ означает Н или по меньшей мере один заместитель фенильного кольца, выбранный из: группы (С1-С₄)алкокси, атома хлора;

Кп означает Н или по меньшей мере один заместитель фенильного кольца, выбранный из (С1-С₄)алкильной группы;

при этом моноклональное антитело и производное криптофицина ковалентно соединены и место их соединения находится в орто(о)-, мета(м)- или пара(п)-положении на фенильном кольце, несущем звено СК1.

орто(о)-, мета(м)- или пара(п)-Положения.

где К₃ означает (С1-С₆)алкильную группу, более конкретно Μβ;

К6 и К7 означают, независимо один от другого, Н или (С1-С6)алкильную группу; более конкретно они означают, независимо один от другого, Н или группу Μβ;

К₈ и К₉ означают, независимо один от другого, Н или (С1-С₆)алкильную группу; более конкретно К₈означает Н и К₉ означает изобутил;

Κι₀ представляет собой Н или по меньшей мере один заместитель фенильного кольца, выбранный из группы -ОН, (С1-С₄)алкоксигруппы, атома хлора. Более конкретно на фенильном кольце имеется два заместителя в положении 3 и 4. Предпочтительно ими являются 3-С1 и 4-метокси. К_п представляет собой Н или по меньшей мере один заместитель фенильного кольца, выбранный из (С1-С₄)алкильной группы; более конкретно Н.

- 4 024627

В более конкретном случае можно выбрать один из заместителей К₃ и Кб-Кц среди тех, которые описаны в примерах. Каждый заместитель К₃ и Κβ-Κπ может также принять одну из пространственных конфигураций (например, К или δ или же Ζ или Е), как описано в примерах.

Связывание производного криптофицина с моноклональным антителом осуществляется через линкер Ь, занимающий орто(о)-, мета(м)- или пара(п)-положение на фенильном кольце, несущем звено СК/ так, производное криптофицина, способное к конъюгированию, имеет формулу (II)

Место соединения с моноклональным антителом находится на другом конце линкера Ь на уровне реакционноспособной группы, имеющейся на моноклональном антителе. Так, Ь содержит по меньшей мере одну химическую реакционноспособную группу (ССК1) напротив химической реакционноспособной группы (ССК2), имеющейся на моноклональном антителе. Взаимодействие между ССК1 и ССК2 обеспечивает связывание соединения формулы (II) с моноклональным антителом посредством образования ковалентной связи. Таким путем производное криптофицина формулы (II) способно конъюгироваться с моноклональным антителом.

Производные криптофицина согласно настоящему изобретению, в том числе производные криптофицина согласно примерам, могут существовать в форме оснований или кислотно-аддитивных солей с кислотами, в частности с фармацевтически приемлемыми кислотами.

В качестве примеров группы ССК1 можно назвать:

(ί) реакционноспособную группу -δΖ_α, в которой Ζ,, означает Н или группу -δΚ,,. где К_а означает группу (С₁-С₆)алкил;

(ίί) реакционноспособную группу -ί’(=ϋ)-Ζ|_:ιΚ|, в которой Ζ_|:, означает простую связь, -О- или -ΝΗ-, более конкретно -0-, и К_| означает Н или группу (С₁-С₆)алкил.

Более конкретно -δΖ_α может означать -δΗ или -δδ(С₁-С₆)алкил, в частности -δδΜе. Более конкретно -Ζ_|:Κ_|:, может означать -ОН, -ОСН₃. Более конкретно группа ССК1 может быть выбрана из тех групп, которые описаны в примерах.

В качестве примера ССК2 можно назвать ε-аминогруппы лизинов, находящиеся на боковых цепях лизиновых остатков, которые имеются на поверхности антитела, сахаридные группы соединительной цепи или тиольные группы цистеинов, образующиеся восстановлением дисульфидных межцепочечных связей (Сагпс!! М.С., с! а1., Абтапссб Эгид ЭсПусгу Кс\ас\У5 2001, 53, 171-216). В последнее время появились другие технические решения, такие как введение цистеинов путем мутации (1ипи!и1а ЕК. с! а1., ΝαШгс В|о1ссНпо1оду 2008, 26, 925-932; АО09026274) или введение аминокислот не природного происхождения другими химическими методами (СгааГ А.Е с! а1., Вюсопщда!с СНст. 2009, РиЬПсаНоп Оа1с (Ас|): февраль, 3, 2009 (КсуюА); Ό0Ε 10.1021/|с800294а; АО 2006/069246 и согласно СЫп ЕА., с! а1., 1АС8 2002, 124, 9026-9027 (технология КсСобс®)). Все эти используемые варианты связывания с антителами можно применять ко всем известным моноклональным антителам в зависимости от их структуры.

Можно также химически модифицировать моноклональное антитело так, чтобы можно было ввести новые химические реакционноспособные группы ССК2. Так, специалисту известно, каким путем можно модифицировать антитело с помощью модифицирующего агента (см., в частности, АО 2005/077090, с.14). Модификация позволяет улучшить реакцию конъюгирования и использовать более разнообразные виды групп ССК1.

Модифицирующие агенты, позволяющие вводить дисульфидные группы.

Модифицирующим агентом может быть активированный сложный эфир ΝΗδ формулы о о !—'·.

Р ,8--А1К-И. N.. /

О ό

Г в которой К означает группу (С1-С₆)алкил и АЬК означает (С1-С₆)алкиленовую группу; например, можно ввести реакционноспособные дитиопиридильные группы ССК2 (см. Воигбоп М.А., с! а1., ВюсНст. I. 1978, 173, 723-737; υδ 5208020), которые затем можно ввести во взаимодействие с химической реакционноспособной группой ССК1 типа -δΗ, находящейся на линкере производного криптофицина, с образованием новой связи -δ-δ- (см. пример 9 конъюгата, имеющего дисульфидную связь). Ν-гидроксисукцинимидная группа взаимодействует предпочтительно с аминогруппами, имеющимися на антителе, с образованием амидных связей.

Модифицирующие агенты, позволяющие вводить малеимидные группы.

Другим примером модифицирующего агента является сукцинимидил-4-^малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат ^МСС), аналогичное ему соединение описано в ЕР 0306943, или сульфо^МСС (сульфосукцинимидил-4-^-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат). В

- 5 024627 качестве других примеров можно назвать г „ ϊ такое как Ν-сукцинимидил-З-малеимидопропаноат;

« ’Ά такое как М-сукцинимидил-6-(3-малеимидопропионамидо)гексаноат; ''·% где Ь означает целое число между 0 и 2000, предпочтительно между 1 и 200 (Ь может принимать любые значения между 0 и 2000), такое как М-сукцинимидил-3-(2-{2-[3малеимидопропиониламино]этокси}этокси)пропаноат или 5М(ПЭГ)₂; Э ^! Уу такое как Νсукцинимидилмалеимидоэтилсукцинат;

такое как

М-сукцинимидил-4-(4малеимидофенил)бутаноат или ⁶ . такое как Ν-сукцинимидил-З-малеимидобензоат.

Модифицирующие агенты, позволяющие вводить галогенацетамидные группы.

Другим примером модифицирующего агента является сукцинимидил-4-(И-иодацетил)аминобензоат (δΙΑΒ) - ” . или аналогичные соединения, среди которых сукцинимидил-И-иодацетат (δΙΑ) ° ° % сукцинимидил-И-бромацетат (δΒΑ), или сукцинимидил-3-(М-бромацетамидо)пропионат (δΒΑΡ), или (Д, X аналогичное пэгилированное соединение, описанное в \¥О 2009/134976 ^а ° где Ь имеет указанные выше значения. На фиг. 1 и 2 иллюстрирован способ модификации аминогруппы моноклонального антитела с помощью δΡΌΡ или предпочтительного вышеупомянутого иминотиолана.

Таким путем можно вводить в моноклональные антителодисульфидные (-δδΚ) группы ОСК2, в случае, когда ОСК1 означает -δΗ. Аналогично этому, можно ввести в моноклональное антителотиольные (-δΗ) группы ОСК2, в случае, когда ОСК1 означает дисульфид. В обоих случаях ковалентная связь, образующаяся в результате реакции между ОСК1 и ОСК2, представляет собой расщепляемую дисульфидную связь.

Возможно также, в случае, когда ОСК1 означает -δΗ, ввести на поверхность моноклонального антителагруппы ОСК2 типа малеимидо < > или иодацетамидо • И, наоборот, можно ввести в моноклональное антитело тиольные (-δΗ) группы ОСК2, например, с помощью иминотиолана, в случае, когда

ОСК1 означает ° или °

В этом случае ковалентная связь, образующаяся в результате реакции между ОСК1 и ОСК2, представляет собой нерасщепляемую сульфидную связь.

Таблица Ι

Примеры модификаций агента клеточного связывания в случае, когда ΟΤ’Β1=-δΖα

д - Число функциональных групп ОСК2 на модифицированном моноклональном антителе; ά - число производных криптофицина, связанных с моноклональным антителом МАЬ;

I,* - такой фрагмент линкера I,. содержащего ОСК1 -δΖ,,. чтобы I, -Ι+δΖ,,.

-Ь

В случае, когда ОСК1 означает реакционноспособную группу малеимидо > или гелогенацетамидо ° > где К₁₂ означает Н или (С1-С₆)алкил, более конкретно Ме, производное криптофицина может быть представлено нижеописанной формулой (11а) или (11Ь)

где Ь* означает такой фрагмент линкера, чтобы Ь—Щ-малеимидо или Ь-Щ-иодацетамидо.

- 6 024627

Производным криптофицина из серии С-52 и С-1 может быть одно из следующих производных:

или эквивалентное звено, описанное в одном из примеров.

Более конкретно Ь находится в пара-положении к звену СК₁. Способ получения производных криптофицина

Соединения формулы (II) получают согласно схеме 1 из производного криптофицина формулы (III) и предшественника линкера (РП).

где С означает группу -СН=СН₂, -(СН₂)_ПУ или -(С₁-С₆)алкилен-У, где η является целым числом от 1 до 6, и Υ означает -ОН, -8Н, -С1, -ОСР, где СР означает уходящую группу, такую как, например, мезилатная (ΟΜδ) или тозилатная группа, или Υ означает -Ν₃, ΝΗ₂, -СООН, -ЛК.₁₂-СН₂-С=СН, в которой К₁₂означает Н или (С1-С6)алкильную группу, более конкретно метильную группу. Предшественник линкера РЬ выполняет роль, заключающуюся во введении линкера Ь в производное криптофицина после взаимодействия группы С с химической функциональной группой, находящейся на РЬ.

С может также означать группу выбираемую из 9 сле(т.е. Υ означает группу *' дующих групп (К₁₂ и К'₁₂ означают Н или (С₁-С₆)алкильную группу)

или -(СН₂)_П-8Н.

Согласно схеме 1 для получения производного криптофицина (II) из производного криптофицина (III) могут быть необходимы несколько стадий и/или реакций. Так, например, в случае, когда Ζ_α=4, предпочитают вводить линкер Ь, в котором 2_а=-§(С1-С₆)алкил, используя соответствующий предшественник линкера, затем восстанавливают дисульфидную функциональную группу 88(С1-С₆)алкил до тиольной функциональной группы -8Н. Для этого можно использовать, например, ТСЕР: в этой связи см. Вигп5 ТА., е! а1., I. Огд. СЬет. 1991, 56(8), 2648-2650. Это превращение -88 (Ц-СДалкил -8Н может применяться, например, к линкерам Ь_1-4 и Ь₂1_-23 табл. II.

Схемы 1' и 1 иллюстрируют также получение производного криптофицина, включающего линкер, содержащий соответственно группу малеимидо или иодацетамидо (Ь* означает такой фрагмент линкера Ь, чтобы Е=-Ь*-малеимидо или Е=-Ь*-иодацетамидо).

Схема 1'

Эти производные получают взаимодействием производного криптофицина, включающего линкер Ь', содержащий амино- или тиольную группу, с модифицирующим агентом, позволяющим ввести соответственно малеимидо- или иодацетамидогруппу.

- 7 024627

Примеры реакций между группой С и химической функциональной группой, находящейся на РЬ.

Реакция нуклеофильного замещения между предшественником линкера РЬ, несущим аминогруппу -ΝΗ- (может быть использована также соль амина) и С=-(СН₂)_ПС1 или -(СН₂)_пОМк (см., например, табл. II, РЬ_1-4, РЬ_7а, РЬ_8-1о, РЬ₂1_-2з): эту реакцию можно проводить в полярном апротонном растворителе в присутствии основания, такого как, например, ТЕА или ОГРЕА; см. пример 1, соединение 7 или пример 15, соединение 48.

Реакция ацилирования между предшественником линкера РЬ, несущим функциональную карбамоилгалогенидную группу, и С=-(СН₂)_пОН (см., например, табл. II, РЬ₅): эту реакцию можно вести в полярном апротонном растворителе в присутствии аминного основания, такого как, например, ТЕА.

В соответствии с вариантом можно также осуществить реакцию между предшественником линкера РЬ, несущим функциональную аминогруппу -ΝΗ-, и С=-(СН₂)_пО-С(=О)-О-(4-нитрофенил), полученным из С=-(СН2)пОН и п-нитрофенилхлорформиата (активация спирта в форме карбоната) согласно схеме, представленной ниже: (К₁₂=Н или (С₁-С₆)алкил):

-ΝΗΚ₁₂ + крипто-(СН₂)_пО-С(=О)-О-(4-нитрофенил) крипто-(СН₂)_пО-С(=О)^К₁₂-активация спирта в форме карбоната может быть также использована для осуществления реакции между предшественником линкера, несущим функциональную группу -ОН, и С=-(СН₂)_пМН₂ или -(СН₂)_пОН для получения соответственно карбаматной (-О-С(=О)-МН-) или карбонатной (-О-С(=О)-О-) функциональной группы согласно соответственно следующим схемам:

-О-С(=О)-О-(4-нитрофенил) + крипто-(СН₂)_пМН₂ крипто-(СН₂)_пМН-С(=О)-О-,

-ОН + крипто-(СН₂)_пО-С(=О)-О-(4-нитрофенил) крипто-(СН₂)_пО-С(=О)-О- (см., например, табл.

П, ΡΡ·6,ι-6Η· РР'2-1-25) реакция этерификации между предшественником линкера РЬ, несущим функциональную кислотную группу -СООН, и С=-(СН₂)_пОН (см., например, табл. II, РЬ_14Ь): эту реакцию можно вести в полярном апротонном растворителе в присутствии аминного основания, такого как, например, ОМАР, и сочетающего агента, например ЭСС;

реакция амидирования между предшественником линкера РЬ, несущим функциональную кислотную группу -СООН, и С=-(СН₂)_пМН₂ (см., например, табл. II, РЬ_14а): эту реакцию можно вести в полярном апротонном растворителе в присутствии сочетающего агента, например ЕЭС1 или НОВ!;

реакция амидирования между предшественником линкера РЬ, несущим функциональную группу -ΝΠ₂, и С=-(СН₂)_пСООН (см., например, табл. II, РЬ_7с): эту реакцию можно вести в полярном апротонном растворителе в присутствии сочетающего агента, например ЕЭС1 или НОВ!;

1,3-диполярное циклоприсоединение (в химии называемое также сйск реакцией), реакция между предшественником линкера РЬ, несущим терминальную алкиновую функциональную группу, и С=-(СН₂)^₃, или между предшественником линкера РЬ, несущим азидную функциональную группу, и С=-(СН₂)_пМК₁₂-СН₂С^СН (см., например, табл. II, РЬ_15-18): эту реакцию можно вести в полярном растворителе в присутствии СиД) в качестве катализатора (см. циклоприсоединение по Хьюзгену: РокЮуйсу У.У., е! а1., Апдем.СйетТпкЕб. 2002, 41, 2596-2599; Тогпое С.^., е! а1., Ютд.СЬет. 2002, 61, 3057-3064);

метатезис, реакция между предшественником линкера РЬ, несущим терминальную этиленненасыщенную функциональную группу, и С=-СН=СН₂ (см., например, табл. II, РЬ₁₉, РЬ₂₀): эту реакцию можно вести в полярном апротонном растворителе в присутствии катализатора Груббса 2-го поколения (САЗ №246047-72-3, см. об этой реакции Роеу1аи!-Ра1епа А.А. е! а1., ЕОтд.Сйет. 2008, 13, 2024-2027).

О линкере Ь.

Линкер Ь может быть выбран из следующих соединений:

К₁₂ означает Н или (С₁-С₆)алкильную группу;

2_а означает Н или группу -ЗК_а, где К_а означает группу (С₁-С₆)алкил;

Ζ|. означает простую связь, -О- или -Ν4-, причем К_Ь означает Н или группу (С₁ -С₆)алкил;

где группу -3Ζ₃ или -С(=О)^_ЬК_Ь обозначают как химическую реакционноспособную группу (ССК.1).

Получение соединений формулы (III), когда С=-(СН₂)_пОН или -СН=СН₂.

- 8 024627

Схема 2

Ρ₁ получают согласно сведениям, содержащимся в заявках \νϋ 98/08505, \νϋ 00/23429 и \νϋ 00/34252, а также в следующих публикациях: Ке.) К., е! а1., 1. Огд. СЬет. 1996, 61, 6289-6295; 8а1атопс/ук С.М., е! а1., 1. Огд. СЬет. 1996, 61, 6893-6900 или 1. Меб. СЬет. 1999, 42(14), 2588-2603 (включены в описание в качестве ссылок). На с. 158-159 публикации ТЬе 1во1аЬои, сНагас!еп/а!юп апб беуе1ортей о£ а поуе1 с1ав5 о£ ро!еп! апйтйойс тасгосусЬс берв1рерЬбев: !Ье стурФрЬутпв, глава 9, в ЛпЬсапсет адейв £тот па!ига1 ртобийв, Тау1от&Ртапсе, СКС ртевв Ьоок, 1вЬп=0-8493-1863-7. даны схемы синтеза, позволяющего получить различные фрагменты (А, В, С и И) криптофицина и получить в результате Ρ₁. Авторами Ке.) К., е! а1., 1. Огд. СЬет. 1996, 61, 6289-6295 изображен на схемах 1-6 путь получения одного из производных криптомифицина согласно фиг. 1, однако эти схемы могут быть применимы в случае получения Ρ1 с использованием иодиновых исходных реагентов.

Ρ₁ позволяет получить другие производные криптофицина с помощью стадий, подробно описанных ниже.

Стадия (ί): раскрытие эпоксидного цикла Ρ₁ в кислой среде с получением диольной функциональной группы. Можно использовать, например, концентрированную перхлорную кислоту.

Стадия (и): окислительное расщепление диола с помощью, например, периодата натрия.

Стадия (ίίί): реакция Виттига, использующая соответствующий галогенид фосфония, например бромид, и сильное основание, такое как, например, ВиЫ.

Стадия (ίν): реакция эпоксидирования Кори-Чайковского с использованием хиральной соли сульфония, например трифлата, в присутствии основания, такого как, например, КОН.

Стадия (ν): снятие защиты с силилированного простого эфира, используя, например, раствор тетрабутиламмонийфторида.

Бромид 4-(триизопропилсилоксиметил)бензилтрифенилфосфония получают из 1-(бромметил)-4(триизопропилсилоксиметил)бензола (СА8№ 934667-38-6), получение которого из 1,4-бензолдиметанола (СА8№ 589-29-7, рыночный продукт) описано Ьо!!ег К.О., е! а1., Огдашс Ьейетв 2007, 9(7), 1187-1190. Соединения, в которых К₁₁ означает (С₁-С₄)алкильную группу, получают аналогичным способом, исходя из соответствующего диола, который либо является рыночным продуктом, либо получают С-алкилированием по Фриделю-Крафтсу из 1,4-бензолдиметанола.

Исходя из 1-(бромметил)-4-(триизопропилсилоксиметил)бензола (СА8№ 135408-73-0), получение которого описано на схеме 4а патента ЕР 0496548, или на странице 83 статьи №νίίί С.К. Ьу е! а1., Вюогдатс & Меб. СЬет. Ьей. 1991, 1(1), 83-86, можно получить соответствующий бромид фосфония. Соединения, в которых К₁₁ означает (С₁-С₄)алкильную группу, получают аналогичным способом, исходя из соединения, эквивалентного соединению 1, описанному на странице 83 статьи №νίίί С.К. ίτ., е! а1., Вюогдатс & Меб. СЬет. Ьей. 1991, 1(1), 83-86, которое либо является рыночным продуктом, либо получают С-алкилированием по Фриделю-Крафтсу из п-толуолуксусной кислоты.

Трифторметансульфонат (1К,4К,5К,6К)-4,7,7-триметил-6-(4-винилбензил)-6-тиониабицикло[3.2.1]октана, используемый на стадии (ίν), получают из (1К,4К,5К)-изотиоцинеола (см. Аддаг\уа1 V. е! а1., 1АС8 2010, 132, 1828-1830), получение которого из (К)-лимонена (СА8 № 95327-98-3), рыночный продукт) описано в этой же самой ссылке.

Бромид трифенил(п-винилбензил)фосфония (СА8 № 118766-51-1) получают из соответствующего бромпроизводного (см. Ите£аЬ1 О., е! а1., СЬет.Вег. 1961, 94(8), 2002-2010), получение которого из 4винилбензилового спирта (СА8 № 1074-61-9, рыночный продукт) описано в статье 81йтотига О., е! а1., ТейаЬебгоп 2005, 61, 12160-12167.

Исходя из Р₇ или Р₈, которые являются соединениями формулы (III), в которых О=-(СН₂)_п ОН, можно получить другие соединения формулы (III), имеющие другие группы О.

- 9 024627

Случай, когда О=-(СН₂)_ПС1 или -(ΟΗ₂)_ηΝ₃.

Схема 3

Исходя из группы О=-СН₂ОН можно получить группы О=-СН₂С1 или -ί'Ή₂Ν₃: введение -С1 может быть осуществлено в присутствии СМ8: см. пример 1, соединение 2; азидирование может быть осуществлено в присутствии дифенилфосфоразида (ΡΠΟ)₂Ρ(=Ο)Ν₃ и основания, например ИВИ. Схема 3 описывает эти реакции для случая, когда п=1, но способ может быть также применен для случая, когда η>1.

Случай, когда О=-(СН₂)_ПСООН.

Схема 4

Исходя из группы О=-СН₂ОН можно получить группу О=-СН₂СООН путем окисления. Схема 4 описывает двойное окисление: 1-е окисление с помощью реагента Десс-Мартина (см. Епсус1ореФа οί КеадепЩ ίοτ Отдашс 8уп!Ье515; Расщепе Ь.Л., Εά.; \УПеу: СЬ1сЬе8!ег, ИК, 1995, т. 7, 4982-4987 или Воесктап К.К. ίτ., е! а1., ТТ ТЬе Ие88-Магйп РетюДшапе Огд. 8уп!Ь. 2004, 10, 696-702), и последующее 2-е окисление по типу Ршшск в присутствии 2-метил-2-бутена (Р1пп1ск Н.\У.. ТейаЬеДтоп 1981, 37, 20912096). Схема 4 описывает эти реакции в случае использования исходного соединения, когда п=2, но этот способ применим также для п>2.

Случай, когда Ο=-(СΗ₂)_ηNΗ₂.

Схема 5

ΥΧ ул ^н» а, к_ен ^,СЁР _т

Исходя из группы О=-СН^₃, получение которой описано на схеме 3, можно получить группу Ο-Ο^Ν^ с помощью реакции восстановления, используя фосфин, такой как ТСЕР; см. об этой реакции РаисЬет А.-М. е! а1., 8уп!Ье!ю Сотт 2003, 33, 3503-3511.

Схема 5'

Согласно варианту исходя из группы О=-СН₂ОН можно получить группу Ο=-СΗ₂NΗ₂ с помощью реакции Мицунобу, используя трифенилфосфин и ΌΕΑΌ. Об этой реакции см. МЬъипоЪи О., 8уп!Ье818 1981, 1-28; НидЬек Ό.Ό., Огд. КеасЬопк 1992, 42, 335-656; НидЬек Ό.Ό., Огд. Ргер. 1996, 28, 127-164. Схемы 5 и 5' описывают случай, когда п=1, но они могут быть применены также для п>1.

Случай, когда О=-(СН₂)_1пЖ₁₂-СН₂С=СН.

Исходя из группы О=-(СН₂)_пС1 можно получить группу О=-(СН₂)_п-ИК₁₂-СН₂-С^СН с помощью нуклеофильного замещения, используя соединение формулы NΗΚ₁₂-СΗ₂-СΞСΗ (К₁₂=Н:пропаргиламин; Рз₂=(С1-С₆)алкил: получено согласно Моск \У.Е, е! X, ί. Огд. СЬет. 1989, 54, (22), 5302-8).

Случай, когда О=-(СН₂)_п-8Н.

Схема 6

Исходя из группы О=-(СН₂)_пС1 можно получить группу О=-(СН₂)_п8Н прямой функционализацией с помощью триметилсилилтиолата тетрабутиламмония, получаемого ш 5Пи из тетрабутиламмонийфторида

- 10 024627 и гексаметилдисилатиана согласно Ни 1. е! а1., 1. Огд. СЬет. 1999, 64, 4959-4961 (см. пример 8). Схема 6 описывает эту реакцию для случая, когда п=1, но способ может быть применен также для п>1. В процессе этой реакции может образоваться промежуточный димер формулы

Случай, когда С=-АЬК-8Н.

Схема 7

Р₃ позволяет получить другие производные криптофицина согласно схеме 7.

Стадия (ί): реакция Виттига с использованием подходящего галогенида фосфония, например бромида, и сильного основания, например ВиЫ.

Стадия (ίί): сочетание Кумады с использованием подходящего реактива Гриньяра, например бромида алкоксимагния, защищенного в форме силилированного простого эфира, в присутствии палладиевого или никелевого катализатора (см., например, Огдатс ЬеИегз 2009, 11, 5686-5689 или §уп1Ьез1з 2009, 141, 2408-2412).

Стадии (ίίί)-(ν) описаны на схеме 2, а стадия (νί) описана на схеме 6.

Бромид (4-бромбензил)трифенилфосфония является рыночным продуктом (СА8 № 51044-13-4). Бромиды алкоксимагния, защищенные в форме силилированного простого эфира, могут быть получены из соответствующих бромспиртов путем защиты спиртовой группы соответствующим хлорсиланом с последующим получением магнийорганического соединения в присутствии магния, в апротонном полярном безводном растворителе, таком как ТГФ (см., например, Огдатс ЬеИегз 2005, 7, 183-186). Бромспирты, линейные или разветвленные, содержащие 1-6 атомов углерода, являются коммерчески доступными, такие как 3-бром-1-пропанол (СА8 №627-18-9) или 1-бром-2-пропанол (СА8 № 19686-73-8), или могут быть получены из соответствующих сложных бромэфиров или бромкетонов согласно способам, описанным в литературе. Хлорсиланом может быть, например, трет-бутилдиметилхлорсилан (СА8 № 18162-48-6) или триизопропилхлорсилан (СА8 № 13154-24-0).

Случай, когда С=-(СН₂)_п-малеимидо.

Схема 8

В дополнение к схеме 1', которая описывает способ получения производных криптофицина, содержащего малеимидное звено, и исходя из группы С=-СН₂ОН можно получить группу

осуществляя реакцию Мицунобу в присутствии трифенилфосфина и ПЕАН согласно МаШз/ак N. е! а1., 1. Меб. СЬет. 2009, 52, 7410-7420. Схема 8 описывает эту реакцию для случая, когда п=1, но она применима и к случаю, когда п>1.

На схемах 1-8, представленных выше, линкер находится в пара-положении, однако эти схемы одинаково действительны для линкеров в орто- или мета-положениях. Аналогично этому, хотя эти схемы приведены для производного криптофицина, они применимы для получения других производных формулы (II), в частности Όι-Ό₈.

В частности, в случае С-52 можно использовать следующие соединения, получение которых описано в А1-а^аг К8., е! а1., 1. Меб. СЬет. 2003, 46, 2985-3007 или в АО 9808505

- 11 024627

С1

ОМе

О=-СН₂ОН: соединение 31Ь схемы 5 С=-СН₂СН₂ОН: соединение 49 схемы 9 соединение 51 схемы 9 в НО 9808505

С=-СН₂СООН: или пример <3=-С(=О)Н: пример 80 в НО 9808505

С другой стороны, исходя из соединения 31Ь, у которого С=-СН₂ОН, можно получить соединения, у которых С=-СН₂С1 или -СН₂Ы₃:

С=-СН₂С1: см. пример 1, соединение 2;

О=-СН₂Ы₃: конверсия -СН₂ОН в -СН₂Ы₃ может быть осуществлена в полярном апротонном растворителе в присутствии дифенилфосфоразида и основания, такого как ΌΒυ, см. пример 19, соединение 60.

С=-СН2малеимидо: конверсия -СН2ОН в -СН2малеимидо может быть осуществлена в полярном апротонном растворителе в присутствии малеимида, трифенилфосфина и ΌΕΛΌ.

Сведения, изложенные в I. Меб. Сйет. 2003, 46, 2985-3007, могут быть применены для получения других производных криптофицина, содержащих другие заместители К₆-К₉.

Получение предшественников линкера РЬ.

РЬ может быть одним из следующих предшественников:

О

-·...

2аЫЧ.К N >

Г,, I ΝΜ

РЬ₁ ' получаемый согласно нижеописанной схеме

νη а

Стадия (ί): активация кислоты с помощью ΝΉδ; активацию проводят при КТ в присутствии сочетающего агента, такого как, например, гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, растворенного в безводном апротонном растворителе, таком как ΌίΜ. Можно использовать условия примера 1 получения соединения 4.

Стадия (ίί): амидирование Ν-Вос-пиперидином; пептидное сочетание осуществляют в полярном апротонном растворителе при КТ в присутствии основания, которым может быть третичный амин, такой как ΤΕΑ или ΌΙΡΕΆ. Растворителем может быть ΌΜΡ. Можно использовать условия примера 1 для получения соединения 5.

Стадия (ίίί): реакция снятия защиты с амина при помощи раствора кислоты, например соляной кислоты (например, растворенной в диоксане). Можно использовать условия примера 1 получения соединения 6.

Исходная кислота, например 4-метил-4-(метилдитио)пентановая кислота, может быть коммерчески доступна или получена из галогенсодержащей карбоновой кислоты путем последовательных обработок тиоацетатом калия и производным типа метантиосульфоната; см. также υδ 2719170.

РЬ₂ получаемый согласно нижеописанной схеме

Стадия (ί): восстановительное аминирование с помощью альдегида; реакцию осуществляют при КТ в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР, в две стадии: образование промежуточного комплекса в присутствии изопропоксида титана, затем восстановление ίη δίΐιι восстановительным агентом, таким как, например, цианборгицрид натрия. Можно использовать условия примера 5 получения соединения 17.

Стадия (ίί): реакиия снятия защиты с амина при помощи раствора кислоты, например соляной кислоты (например, растворенной в диоксане). Можно использовать условия примера 5 получения соединения 18.

Исходный альдегид, например 2-метил-2-(метилдитио)пропаналь, может быть коммерчески доступен или получен окислением спирта, несущего дисульфидное звено, получаемого из галогенсодержащего спирта, защищенного должным образом (например, в форме силилированного простого эфира), в результате последовательных обработок тиоацетатом калия и производным типа метантиосульфоната.

РЬ₃ 2а§-АЬК-МНК.₁₂, получаемый согласно нижеописанной схеме.

В случае, когда К.₁₂=Н.

Стадия (ί): образование оксима; описанный выше альдегид растворяют в полярном протонном растворителе, таком как этанол, затем обрабатывают гидрохлоридом О-метилгидроксиамина при нагревании с обратным холодильником в присутствии основания, такого как гидроксид натрия. Можно исполь- 12 024627 зовать условия примера 3 получения соединения 11.

Стадия (ίί): восстановление оксима; оксим восстанавливают обработкой при нагревании с обратным холодильником раствором диметилсульфидборана в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР. Можно использовать условия примера 3 получения соединения 12.

В случае, когда К₁₂^Н о инн,,

Л и м газ АГК- Н ♦ _{μ Ν} --- гаЗ-АЬК

Стадия (ί): восстановительное аминирование с помощью альдегида; реакцию осуществляют при КТ в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР, в присутствии восстановительного агента, такого как, например, триацетоксиборгидрид натрия.

Λ3ΑΙ.Κ ' ψ '(

РЬ₄ ’' получаемый согласно нижеописанной схеме

Этот линкер получают аналогично способу, описанному для РЬ₂.

Стадия (ί): восстановительное аминирование с помощью альдегида; реакцию осуществляют при КТ в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР, в две стадии: образование промежуточного комплекса в присутствии изопропоксида титана, затем восстановление ίη вЬи восстановительным агентом, таким как, например, цианборгидрид натрия. Можно использовать условия примера 5 получения соединения 17.

Стадия (ίί): реакция снятия защиты с амина с помощью раствора кислоты, например соляной кислоты (например, растворенной в диоксане). Можно использовать условия примера 5 получения соединения

18.

РЬ₅ иаах»А1.к ω«.«-«»!„ а, получаемый согласно нижеописанной схеме

ΒΓ-ΑίΚ-Ν(ΒθΟΡ₁₂ (О

ΗΟ-ΑίΚ-ΝΗΚ,₂ --► ΗΟ-ΑΙΚ Ν(Βοο)Κ₁₂

ΜδΟ-ΑΙ,Κ“Ν(Βοο)Κ₁₂

Стадия (ί): снятие защиты с амина; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ. обработкой амина ди-трет-бутилдикарбонатом в присутствии основания, такого как, например, ТЕА.

Стадия (ίί): превращение спирта в бромид; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ТНР, обработкой спиртовой функциональной группы при помощи СВг₄ в присутствии фосфина, например трифенилфосфина; см. об этом Арре1 К. Апдете. СЬет. ίηΐ. Ей. Епд1. 1975, 14, 801-811 или Эевтапв Ν., е! а1., ТеЦаЬейгоп Ьейегв 2003, 44(41), 7589-7591.

Стадия (ίίί): замещение бромида тиоацетатом; реакцию осуществляют при КТ в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ЭМР, используя в качестве нуклеофила тиоацетат калия.

Стадия (ίν): образование дисульфидной связи; реакцию осуществляют в полярном протонном безводном растворителе, таком как метанол, в присутствии основания, такого как, например, метанолят натрия, и реагента, содержащего пиридилдисульфидное звено.

Согласно варианту стадия (ν): активация спирта в форме мезилата; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ЭСМ, обработкой мезилхлоридом в присутствии основания, такого как, например, ТЕА;

стадия (νί): образование свободного тиола; реакцию осуществляют при нагревании с обратным холодильником в полярном протонном растворителе, таком как смесь этанола/воды, в две стадии, осуществляемые последовательно: замещение мезилата на тиомочевину, затем гидролиз ίη βίΐπ соли изотиоурония путем добавления основания, такого как ΝαΟΗ;

стадия (νίί): активация тиола в форме пиридилдисульфида; реакцию осуществляют при КТ в полярном протонном растворителе, таком как этанол, при обработке реагентом, содержащим пиридилдисульфидное звено, в присутствии кислоты, такой как уксусная кислота;

стадия (νίίί): снятие защиты с амина при помощи раствора кислоты, например соляной кислоты (например, растворенной в диоксане);

стадия (ΐχ): активация амина в форме карбамоилхлорида; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, путем обработки дифосгеном в присутствии основания, такого как ТЕА.

РЬ₆ КЬ2Ь-ОС-АЕК-(ОСН₂СН₂)₁-ОН, получаемый согласно нижеописанной схеме.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂

- 13 024627 путь А путь В

Стадия (ί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (и): защита карбоновой кислоты в форме сложного аллилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как, ΌΜΡ, в присутствии аллилбромида и основания, такого как карбонат калия.

Стадия (ίίί): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, путем обработки ненасыщенной кислоты, защищенной в форме сложного эфира, алкоголятом, генерируемым под действием натрия в каталитическом количестве.

В случае, когда АЬК^СН₂СН₂

I ΐ Г Λ Ί -ί¹»' I П о дьк-на* нр Цогнр Ά о'_ди< г

Ц-ОТНР о

. д ⁰ Μ.Κ {о- 4^е

Стадия (ίν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР или ИМР, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом ПЭГ диола, монозащищенного в форме простого эфира тетрагидропирана (ТНР). Получение этого типа монозащищенного ПЭГ диола описано в литературе, см., например, КюЬатб А. е! а1., Сйет. Еиг. ί. 2005, 11, 7315-7321 или 8аке11атюи Е.С., е! а1., Те1гайеагоп 2003, 59, 9083-9090.

ПЭГ спирты, содержащие кислотную функциональную группу, защищенную в форме сложного трет-бутилового эфира, коммерчески доступны (такой как трет-бутил-12-гидрокси-4,7,10триоксадодеканоат) или их получают из трет-бутилакрилата и ПЭГ диола. Исходные ПЭГ диолы коммерчески доступны для 1=3-12.

РЬ₇ Β6ΖΒ-Οί.’-ΑΡ1<-(ΟίΉ₂ίΉ₂)ι-ΝΗΒι₂. получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂

Случай, когда К₁₂=Н.

Случай, когда К ^Н

В случае, когда АЕК^СН₂СН₂. Случай, когда К₁₂=Н

Случай, когда К ^Н

Стадия (ί): защита карбоновой кислоты в форме сложного аллилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как, ИСМ, в присутствии аллилового спирта, сочетающего агента, такого как ЕИС1, и основания, такого как ИМАР. Можно использовать условия примера 14 получения соединения 42.

Стадия (ίί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. Можно использовать условия примера 14 получения соединения 43.

- 14 024627

Стадия (ίίί): алкилирование атома азота; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР, путем обработки основанием, таким как NаΗ, в присутствии реагента, несущего уходящую группу (нуклеофуг), такого как алкилгалогенид. Можно использовать условия примера 15 получения соединения 46.

Стадия (ίν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР или ЭМР, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом бензофенонимин-ПЭГ-спирта, генерируемого под действием NаН или нафталенида калия, как описано в АО 2007/127440;

Стадия (ν): омыление сложного эфира; реакцию осуществляют путем взаимодействия сложного эфира с гидроксидом лития в присутствии воды.

Стадия (νί): защита амина; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, путем обработки амина ди-трет-бутилдикарбонатом в присутствии основания, такого как, например, ТЕА.

Амин-ПЭГ-кислоты являются коммерчески доступными при 1=3, 5, 6, 10 или могут быть получены из трет-бутилакрилата и соответствующего амин-ПЭГ-спирта.

Амин-ПЭГ-спирты являются коммерчески доступными, например, при 1=3, 4, 7, 8 или могут быть получены из ПЭГ диолов, коммерчески доступных при 1=3-12, согласно процедуре, описанной в υδ 7230101. Защита аминофункции бензофеноном может быть осуществлена в процессе азеотропной дегидратации в присутствии кислоты Льюиса, такой как эфират ВР₃.

РЬ2ЬОС-А1К (ОСН.СНЛ к .ΝΗ

РЬ₈ ” ' получаемый согласно схемам, описанным ниже.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂.

Стадия (ί): снятие защиты с исходного соединения с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. Можно использовать условия примера 16 получения соединения 50.

Стадия (ίί): защита карбоксильной функциональной группы кислоты в форме сложного аллилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭМР. в присутствии аллилбромида и основания, такого как карбонат калия. Можно использовать условия примера 16 получения соединения 51.

Стадия (ίίί): активация спирта в форме мезилата; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, обработкой мезилхлоридом в присутствии основания, такого как ТЕА.

Вое N 5

Стадия (ίν): реакция между мезилатной и аминной функиональной группой соединения ^т (алкилирование); реакцию осуществляют при КТ в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, в присутствии основания, такого как ТЕА. Можно использовать условия примера 16 получения соединения 52.

В случае, когда АЬК+СН₂СН₂.

Стадия (ν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР или ЭМР, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом ПЭГ диола, монозащищенного в форме простого эфира тетрагидропирана (ТНР). Получение этого типа монозащищенного ПЭГ диола описано в литературе, см., например, МсЬагй А. е! а1., СЬет. Еиг. ί. 2005, 11, 7315-7321 или 5аке11апои Е.С., е! а1., Те!гаЬейгоп 2003, 59, 9083-9090.

ПЭГ спирты, содержащие кислотную функциональную группу, защищенную в форме сложного трет-бутилового эфира, коммерчески доступны (такой как трет-бутил-12-гидрокси-4,7,10триоксадодеканоат) или их получают из трет-бутилакрилата и ПЭГ диола. Исходные ПЭГ диолы коммерчески доступны при 1=3-12.

- 15 024627

РЬ₉

' получаемый согласно нижеописанной схеме.

Стадия (ί): алкилирование амина; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ацетонитрил, с использованием аллилгалогеналкилкарбоксилата, такого как аллилбромацетат, в присутствии основания, такого как, например, ТЕА. Можно использовать условия примера 13 получения соединения 38.

Стадия (ίί): снятие защиты с амина с помощью раствора кислоты, например соляной кислоты (например, растворенной в диоксане). Можно использовать условия примера 13 получения соединения 39.

Аллилгалогеналкилкарбоксилат может быть получен из аллилового спирта и соответствующего галогенацилгалогенида и может быть коммерчески доступным, когда АЬК=-(СН₂)_1-6- (такой как бромацетилбромид или 4-бутаноилхлорид).

О

Л гьдь-со-Αΐκ м ριτ к. .МН _

РЬю * получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда АЬК=Сн₂СН₂.

В случае, когда АЬК^СН₂СН₂.

Стадия (ί): раскрытие циклического ангидрида; реакцию осуществляют при КТ в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, в присутствии основания, такого как ТЕА.

Стадия (ίί): защита карбоновой кислоты в форме сложного аллилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, в присутствии аллилового спирта, сочетающего агента, такого как ΕΌΟ, и основания, такого как ОМАР.

Стадия (ίίί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане).

Стадия (ίν): пептидное сочетание; реакцию между карбоновой кислотой и амином осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, в присутствии сочетающего агента, такого как система ОКУНОВ!

Стадия (ν): омыление сложного метилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в смеси полярных растворителей, такой как смесь ТНР/вода, в присутствии гидроксида лития.

Двухосновные кислоты, монозащищенные в форме сложного метилового эфира, являются коммерчески доступными при АЬК=-(СН₂)1_-6- (такого как сложный монометиловый эфир 1,6-гександиовой кислоты).

РЬ_П

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂. Случай, когда К.₁₂=Н.

получаемый согласно нижеописанным схемам.

Стадия (ί): образование амида и активация кислоты; осуществляют последовательно две стадии в полярном апротонном растворителе, таком как ΌΕΜ: реакцию между аминофункцией и Ν-гидроксисукцинимидил-галогенацетатом, затем введение ίη Юн сочетающего агента, такого как ΌΚ''. Можно использовать условия примера 17 получения соединения 56.

- 16 024627

Случай, когда К₁₂+Н.

Стадия (ίί): защита карбоновой кислоты в форме сложного метилового эфира и амина в форме трифторацетамида; реакцию осуществляют в две последовательные стадии в полярном апротонном растворителе, таком как, ЭСМ: защита кислоты путем обработки триметилсилилдиазометаном в присутствии метанола, затем защита амина добавлением трифторуксусного ангидрида и основания, такого как ТЕА.

Стадия (ίίί): алкилирование амина и омыление сложного эфира; реакцию осуществляют в две последовательные стадии в среде полярного апротонного безводного растворителя, такого как ТНР: алкилирование амина обработкой основанием, таким как ΝαΗ, в присутствии реагента, несущего нуклеофуг, такого как алкилгалогенид К₁₂На1, затем введение гидроксида лития и воды.

Стадия (ί): продолжение стадии (ίίί), повторяют реакции стадии (ί), описанные для случая К.1₂=Н.

В случае, когда АЬК+СН₂СН₂.

Случай, когда Κι₂=Η.

Случай, когда К +Н

Стадия (ίν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ТНР или ΌΜΡ, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом бензофенонимин-ПЭГ-спирта, генерируемым под действием ΝαΗ или нафталенида калия (см. νθ 2007/127440).

Стадия (ν): селективное расщепление имина путем гидрирования в присутствии палладия на угле (см. Vе55^оЬаηη, Ь. е! а1., 8уйБе515 1989, 5, 359-63).

Стадия (νί): защита амина введением трифторуксусного ангидрида и основания, такого как ТЕА.

Амин-ПЭГ-кислоты являются коммерчески доступными при ί=3, 5, 6, 10, или могут быть получены из трет-бутилакрилата и соответствующего амин-ПЭГ-спирта.

Амин-ПЭГ-спирты являются коммерчески доступными, например, при ί=3, 4, 7, 8, или могут быть получены из ПЭГ диолов, коммерчески доступных при 1=3-12, согласно процедуре, описанной в И8 7230101. Защита аминофункции бензофеноном может быть осуществлена в процессе азеотропной дегидратации в присутствии кислоты Льюиса, такой как эфират ВР₃.

РЬ2Ъ-СО-А1_К-(ОСН₂СН-,)| ''^ζ

РЬ₁₂ ' где Ζ=Βτ или I, получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂путь А путь В

- 17 024627

В случае, когда АЬК^СН₂СН₂.

4Хк|о -г — 4οΑ-4ο-4°)у^ы [θ'’ '·· |'^Σ

О

Стадия (ί): активация спирта в форме мезилата; реакцию осуществляют в безводном полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, путем обработки мезилхлоридом в присутствии основания, такого как ТЕА.

Стадия (ίί): обмен мезилат/галоген; реакцию осуществляют при нагревании с обратным холодильником в полярном апротонном растворителе, таком как ацетон, с использованием галогенида натрия, такого как иодид натрия.

Стадия (ίίί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (ίν): активация кислоты; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, путем обработки с помощью ΝΉ8 в присутствии сочетающего агента, такого как ИСС.

Стадия (ν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, путем обработки ненасыщенной кислоты, защищенной в форме сложного эфира, алкоголятом, генерируемым под действием натрия в каталитическом количестве.

Стадия (νί): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР или ЭМР, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом ПЭГ диола, монозащищенного в форме простого эфира тетрагидропирана (ТНР). Получение этого типа монозащищенного ПЭГ диола описано в литературе, см., например, КгсЬагб А. е! а1., СЬет. Еиг. ί. 2005, 11, 7315-7321 или 8аке11апои Е.С., е! а1., ТеКаЬебгоп 2003, 59, 9083-9090.

Образующееся промежуточное соединение селективно гидролизуют при рН 5 до сложного гидроксиэфира.

ПЭГ спирты, содержащие кислотную функциональную группу, защищенную в форме сложного трет-бутилового эфира, коммерчески доступны (такие как трет-бутил-12-гидрокси-4,7,10триоксадодеканоат) или их получают из трет-бутилакрилата и ПЭГ диола. Исходные ПЭГ диолы коммерчески доступны, когда 1=3-12.

РЬ₁₃ КЬ2Ь-СО-АЬК-(ОСН₂СН₂)₁-§Н, получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂путь А но+ --4 -А-М. _μοί, оР'-. он -М- НО К % у, ⁰ ° О ⁰ (Μ ^ύ н4-,°4у^н о

путь В

В случае, когда АЬК^СН₂СН₂

Стадия (ί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. В последнем случае может образоваться трифторацетат гидрокси функциональной группы. Эта соль расщепляется на следующей стадии (ίί).

Стадия (ίί): защита карбоновой кислоты в форме сложного метилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как метанол, путем обработки триметилсилилдиазометаном.

Стадия (ίίί): активация спирта в форме мезилата; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ИСМ, путем обработки мезилхлоридом в присутствии основания, такого как ТЕА.

Стадия (ίν): образование свободного тиола и омыление метилового сложного эфира; реакцию осуществляют при нагревании с обратным холодильником в полярном протонном растворителе, таком как смесь этанол/вода, в две последовательные стадии: замещение мезилата тиомочевиной, затем гидролиз щ зЬи соли изотиоурония введением основания, такого как гидроксид натрия.

- 18 024627

Стадия (νί): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР или ИМР, путем обработки галогенировакного сложного эфира алкоголятом ПЭГ диола, монозащищенного в форме простого эфира тетрагидропирана (ТНР). Получение этого типа монозащищенного ПЭГ диола описано в литературе, см., например, КюЬагб А. е! а1., СЬет. Еиг. ί. 2005, 11, 7315-7321 или δ;ιΚνΊ1;ιποιι Е.О., е! а1., ТебаЬебгоп 2003, 59, 9083-9090.

Линкер, у которого п=8 (3-[2-меркаптоэтоксигепта-(этиленокси)]пропионовая кислота), коммерчески доступен. ПЭГ спирты, содержащие кислотную функциональную группу, защищенную в форме сложного трет-бутилового эфира, коммерчески доступны, (такие как трет-бутил-12-гидрокси-4,7,10триоксадодеканоат), или их получают из трет-бутилакрилата и ПЭГ диола. Исходные ПЭГ диолы коммерчески доступны в случае 1=3-12.

О

л.

Κ2Ζ3ΙΧ-ΑΙ-К-1ОСН.СНЛ, ОН „ „

РЬ₁₄ ' получаемый согласно нижеописанной схеме.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂.

В случае, когда АЬК^СН₂СН₂.

Стадия (ί): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, путем обработки ненасыщенной кислоты, защищенной в форме сложного эфира, алкоголятом, образующимся под действием натрия в каталитическом количестве.

Стадия (ίί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. В последнем случае, может образоваться трифторацетат гидроксильной функциональной группы, необязательно находящейся в структуре соединения. Этот трифторацетат расщепляется на следующей стадии (ίίί).

Стадия (ίίί): защита карбоновой кислоты в форме сложного метилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как метанол, путем обработки триметилсилилдиазометаном.

Стадия (ίν): омыление метилового сложного эфира; реакцию осуществляют при КТ в смеси полярных растворителей, такой как смесь ТНР/вода, в присутствии гидроксида лития.

Стадия (ν): защита карбоновой кислоты в форме сложного аллилового эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ИСМ, в присутствии аллилового спирта, сочетающего агента, такого как ЕИС1, и основания, такого как ИМАР.

Стадия (νί): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР или ИМР, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом ПЭГ диола, монозащищенного в форме простого тетрагидропиранового эфира (ТНР). Получение этого типа монозащищенного ПЭГ-диола описано в литературе, см., например, КюЬагб А. е! а1., СЬет. Еиг. ί. 2005, 11, 7315-7321 или δ;ιΚνΊ1;ιποιι Е.О., е! а1., ТебаЬебгоп 2003, 59, 9083-9090.

Исходные ПЭГ диолы коммерчески доступны, когда 1=3-12.

пьгь<о-Аик-;осн.сн₂||О,.

РЬ1₅ ' получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂путь А

- 19 024627 путь В

В случае, когда АЬК^СН .

Стадия (ί): нуклеофильное замещение; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, в присутствии основания, такого как ΝαΗ, и алкинилгалогенида, такого как пропаргилбромид или 4-бром-1-бутин. Можно использовать условия примера 20 получения соединения 63.

Стадия (ίί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. Можно использовать условия примера 20 получения соединения 65.

Стадия (ίίί): активация карбоновой кислоты в форме сложного АН8-эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как Όί'Μ. путем обработки с помощью АН8 в присутствии сочетающего агента, такого как ЭСС на носителе.

Стадия (ίν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, путем обработки ненасыщенной кислоты, защищенной в форме сложного эфира, алкоголятом, генерируемым под действием натрия в каталитическом количестве. Можно использовать условия примера 20 получения соединения 64.

Стадия (ν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР или ΌΜΡ, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом ПЭГ диола, монозащищенного в форме простого эфира тетрагидропирана (ТНР). Получение этого типа монозащищенного ПЭГ диола описано в литературе, см., например, КюЬагб А. е! а1., СЬет. Ειιγ. ί. 2005, 11, 7315-7321 или 8аке11апои Ε.Ο., е! а1., Те1гаЬейгоп 2003, 59, 9083-9090.

ПЭГ спирты, содержащие кислотную функциональную группу, защищенную в форме сложного трет-бутилового эфира, коммерчески доступны, (такой как трет-бутил-12-гидрокси-4,7,10триоксадодеканоат), или их получают из трет-бутилакрилата и ПЭГ диола. Исходные ПЭГ диолы коммерчески доступны, когда 1=3-12.

N

КЬгЬОС-АСКЧОСНгСН^' ’

ΡΕι₆ ' получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂.

, о

Ао-Мс

Л. Л.

\ О ' ^н+о А'·

----А ,о

ГУ ?

У^м'о-У-Эо·'' о

у.

В случае, когда АЬК^СН₂СН₂.

Стадия (ί): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, путем обработки ненасыщенной кислоты, защищенной в форме сложного эфира, алкоголятом, генерируемым под действием натрия в каталитическом количестве.

Стадия (ίί): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (ίίί): активация карбоновой кислоты в форме сложного АН8-эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ΌΓΜ, путем обработки с помощью АН8 в присутствии сочетающего агента, такого как ЭСС на носителе.

Стадия (ίν): элонгация цепи ПЭГ-гидроксиазида; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР или ΌΜΕ, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом ПЭГ-гидроксиазида.

Азид-ПЭГ-спирты являются коммерчески доступными или могут быть получены из соответствующих ПЭГ диолов, коммерчески доступных, когда 1=3-12.

ΡΚ получаемый согласно нижеописанной схеме.

.0

У Ό Άικ— о

Стадия (ί): активация карбоновой кислоты в форме сложного АН8-эфира; реакцию осуществляют

- 20 024627 при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ. путем обработки с помощью ΝΉδ в присутствии сочетающего агента, такого как ЭСС на носителе.

Кислоты, имеющие ацетиленненасыщенную группу, являются коммерчески доступными при

АЬК=-(СН₂)_т, где т=1-10 (такие как 3-бутиновая кислота).

г’ьгь-со-лк'''’ „ „

РБ]₈ ' получаемый согласно нижеописанной схеме.

Стадия (ί): нуклеофильное замещение галогенида азидом; реакцию осуществляют в полярном апротонном растворителе, таком как ацетон, в присутствии азида натрия.

Стадия (ίί): омыление метилового сложного эфира; реакцию осуществляют при КТ в смеси полярных растворителей, такой как смесь ТНР/вода в присутствии гидроксида лития.

Стадия (ίίί): активация карбоновой кислоты в форме сложного ΝΉδ-эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, путем обработки с помощью Ν4δ в присутствии сочетающего агента, такого как ЭСС на носителе.

Сложные метиловые эфиры, несущие галогеналкильное звено, являются коммерчески доступными, когда АЬК=-(СН₂)_т, где т=1-6 (такие как метилбромацетат).

ЗЬ’Ь-СО-ЛЬК-ЮСН-СН ,«О

РЦу ¹² - получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда АЬК=СН₂СН₂путь А

путь В

В случае, когда АЬК^СН₂СН

Стадия (ί): нуклеофильное замещение; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, в присутствии основания, такого как ΝαΚ и алкенилгалогенида, такого как аллилбромид или 4-бром-1-бутен.

Стадия (ίίί): активация карбоновой кислоты в форме сложного ΝΠδ-эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как НСМ, путем обработки с помощью Ν4δ в присутствии сочетающего агента, такого как НСС на носителе.

Стадия (ίν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, путем обработки ненасыщенной кислоты, защищенной в форме сложного эфира, алкоголятом, генерируемым под действием натрия в каталитическом количестве.

Стадия (ν): элонгация ПЭГ цепи; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР или НМР, путем обработки галогенированного сложного эфира алкоголятом ПЭГ диола, монозащищенного в форме простого эфира тетрагидропирана (ТНР). Получение этого типа монозащищенного ПЭГ диола описано в литературе, см., например, Юсйагб А. е1 а1., Сйет. Еиг. ί. 2005, 11, 7315-7321 или δаке11а^^ои Е.С., е! а1., Тейайебгоп 2003, 59, 9083-9090.

ПЭГ спирты, содержащие кислотную функциональную группу, защищенную в форме сложного трет-бутилового эфира, коммерчески доступны (такие как трет-бутил-12-гидрокси-4,7,10триоксадодеканоат), или их получают из трет-бутилакрилата и ПЭГ диола. Исходные ПЭГ диолы коммерчески доступны, когда 1=3-12.

РЬ₂, получаемый согласно нижеописанной схеме.

Υ с

НО А1_К—'--О (I) //

Стадия (ΐ): активация карбоновой кислоты в форме сложного NΉδ-эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ОСМ, путем обработки с помощью Ν4δ в при- 21 024627 сутствии сочетающего агента, такого как ЭСС на носителе.

Кислоты, несущие этиленненасыщенную группу, являются коммерчески доступными при

АЬК=-(СН₂)_т, где т=1-10 (такие как 3-бутеновая кислота).

РЬ₂₁ Ζаδ-А^К-СН₂-NΚ₁₂-(СН₂СН₂О)1-СН₂СН₂-NΚ'₁₂, получаемый согласно нижеописанным схемам. В случае, когда К₁₂ и К'₁₂=Н н_о _( МНВос ». I 1^0 ^.,^,ΝΗΒΟΟ + -^Ц^НВос .Μ- [.КНВоо °О ’ I о м Л „

I Н АЬК 52$

2а$ ΑίΚ N _ч ΐΝΗ, , Γ^{νι 2β5ΑΙ}-^Κ4^Ν. _Ν ъЦНЭос

- го -1, ^г * '' |о --Й ι

В случае, когда К,₂+Н и К.'₁₂=Н.

В случае, когда К.₁₂=Н и К'₁₂+Н.

В случае, когда К₁₂ и К'₁₂+Н.

|(ν) ) на

2а5М_К .К_К].

Стадия (ί): активация спирта в форме тозилата; реакцию осуществляют в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, обработкой тозилхлоридом в присутствии оксида серебра и иодида калия. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 23.

Стадия (ίί): нуклеофильное замещение тозилата; реакцию осуществляют в полярном апротонном растворителе, таком как ацетонитрил, обработкой азидом натрия. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 24.

Стадия (ίίί): реакция азидирования; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь ТНР/воды, в присутствии трифенилфосфина. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 26.

Стадия (ίν): восстановительное аминирование с использованием альдегида; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ЭСМ, в присутствии восстановительного агента, такого как триацетоксиборгидрид натрия, и, если необходимо, уксусной кислоты в качестве катализатора. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 27.

Стадия (V): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 29.

Стадия (νί): защита функциональной группы в форме N4^^ реакцию осуществляют в полярном апротонном растворителе, таком как ТНР или ЭМР, обработкой 1 эквивалентом основания, такого как гидрид натрия, с последующей обработкой бензилгалогенидом, таким как бензилхлорид.

Стадия (νίί): отщепление бензильной группы и восстановление функциональной азидогруппы; реакцию осуществляют в протонном растворителе, таком как метанол, водородом в присутствии катализатора, такого как гидроксид палладия.

Стадия (νίίί): алкилирование амина; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, обработкой основанием, таким как гидрид натрия, в присутствии реагента, несущего нуклеофуг, такого как алкилгалогенид. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 25.

Амин-ПЭГ-спирты, незащищенные или защищенные группой Вос на аминофункции, являются коммерчески доступными, (такие как Ν-Вос-аминоэтоксиэтоксиэтанол или 1-амино-3,6,9триоксаундеканил-11-ол), или могут быть получены из ПЭГ диолов, коммерчески доступных, когда 1=312, согласно процедуре, описанной в АО 7230101. Альдегид Ζаδδ-А^К-СНО, например 2-метил-2(метилтио)пропаналь, является рыночным продуктом, или может быть получен окислением спирта, несущего дисульфидное звено, полученного из галогенированного спирта, защищенного соответствующим

- 22 024627 образом (например, в форме силилированного простого эфира), путем последовательных обработок сначала тиоацетатом калия, затем производным типа метантиосульфоната.

о гаЗ-АЬК ΝΡ.,,-ιΌΗ.ΟΗ,Ο) -СН..СН,-Г; НК',.

РЙ21

В случае, когда К₁₂ и К'₁₂=Н.

' получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда К =Н.

В случае, когда К +Н.

Стадия (ίίί): восстановление азида; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь ТНР/воды, в присутствии трифенилфосфина. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 26.

Стадия (ίν): пептидное сочетание; реакцию осуществляют в полярном апротонном растворителе, таком как диметилформамид, в присутствии сочетающих агентов, таких как система И,№-диизопропилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазол, и основания, такого как ТЕА.

Стадия (ν): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты. Можно использовать условия примера 7 получения соединения 32.

Стадия (νί): защита функциональной группы в форме ИНВос; реакцию осуществляют в полярном апротонном растворителе, таком как ТНР или ΌΜΡ, обработкой 1 экв. основания, такого как гидрид натрия, с последующей обработкой бензилгалогенидом, таким как бензилхлорид.

Стадия (νίίί): алкилирование амина путем восстановительного аминирования с использованием альдегида; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ЭСМ, в присутствии восстановительного агента, такого как триацетоксиборгидриц натрия, и, если необходимо, уксусной кислоты в качестве катализатора.

Стадия (ίχ): алкилирование группы ИНВос; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, обработкой основанием, таким как гидрид натрия, в присутствии

- 23 024627 реагента, несущего нуклеофуг, такого как алкилгалогенид. Можно использовать условия примера 6 получения соединения 25.

Амин-ПЭГ-спирты, незащищенные или защищенные группой Вос на аминофункции, являются коммерчески доступными (такие как Ν-Вос-аминоэтоксиэтоксиэтанол или 1-амино-3,6,9триоксаундеканил-11-ол) или могут быть получены из ПЭГ диолов, коммерчески доступных, когда 1=312, согласно процедуре, описанной в ^О 7230101. Карбоновая кислота 2а8-АЬК-СО₂Н, например 4метил-4-(метилдитио)пентановая кислота, может быть рыночным продуктом, или может быть получена из галогенсодержащей карбоновой кислоты последовательными обработками сначала тиоацетатом калия, затем производным типа метантиосульфоната.

Ρ^3 Ζа8-(СН₂СН₂О)₁-СН₂СН₂-NНК₁₂, получаемый согласно нижеописанным схемам.

В случае, когда К₁₂=Н.

НО . ' о Ί ΝΗΗκ _о | ,.ΝΙ-Ιιχ-, ^|м> . Н5 { ' _о ЫНВос - 7дЗ-^.· ''□--'к МННнг.

|<М гай 4.---0α ..ΝΗ, ‘ НС¹

В случае, когда К₁₂^Н

НО Ц ₀--| .. ΝΗΒΚ ^(|>. , ΜΐΟ.ρ- ₀

,.ΝΗβΟΟ .№_1}вос

Стадия (ί): активация спирта в форме мезилата; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ИСМ, обработкой мезилхлоридом в присутствии основания, такого как ТЕА.

Стадия (ίί): образование свободного тиола; реакцию осуществляют при нагревании с обратным холодильником в полярном протонном растворителе, таком как смесь этанола/воды в две последовательные стадии: замещение мезилата на тиомочевину, затем гидролиз ш ы!и соли изотиоурония введением основания, такого как гидроксид натрия.

Стадия (ίίί): защита тиола; реакцию осуществляют в смеси полярных растворителей, такой как смесь этанола/воды, с использованием реагента, содержащего метантиосульфонатную функциональную группу, такого как метилметантиосульфонат, в присутствии основания, такого как карбонат натрия.

Стадия (ίν): снятие защиты с помощью раствора соляной кислоты (например, раствора в диоксане) или трифторуксусной кислоты.

Стадия (ν): алкилирование амина; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, путем обработки основанием, таким как гидрид натрия, в присутствии реагента, несущего нуклеофуг, такого как алкилгалогенид.

Амин-ПЭГ-спирты, незащищенные или защищенные группой Вос на аминофункции, являются коммерчески доступными (такие как Ν-Вос-аминоэтоксиэтоксиэтанол или 1-амино-3,6,9триоксаундеканил-11-ол) или могут быть получены из ПЭГ диолов, коммерчески доступных, когда 1=312, согласно процедуре, описанной в ^О 7230101.

ΡΡ₂

получаемый согласно нижеописанной схеме.

Стадия (ί): активация Ртос-Ь-валина в форме сложного NН8-эфира; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ТНР, обработкой с помощью ΝΉ8 в присутствии сочетающего агента, такого как ЭСС.

Стадия (ίί): пептидное сочетание между Ртос-Ь-валин^Н8 и Ь-цитруллином; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь диметоксиэтана/ТНР/воды, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия.

Стадия (ίίί): пептидное сочетание с 4-аминобензиловым спиртом; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь ИСМ/метанола, в присутствии сочетающего агента, такого как ЕЕИЦ.

Стадия (ίν): снятие защиты с Ртос-амина; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь ИСМ/метанола, в присутствии основания, такого как диэтиламин.

Стадия (ν): активация карбоновой кислоты в форме сложного NН8-эфира; реакцию осуществляют в полярном апротонном растворителе, таком как ИСМ, обработкой с помощью ΝΉ8 в присутствии соче- 24 024627 тающего агента, такого как гидрохлорид ЕЭС1.

Стадия (νί): пептидное сочетание между дипептидом и сложным ΝΗδ-эфиром; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как смесь ЭСМ/ацетонитрила.

Дикислоты, монозащищенные в форме сложного аллилового эфира, являются коммерчески доступными, когда п=2 (моноаллилсукцинат) или могут быть получены переэтерификацией метиловых или трет-бутиловых сложных моноэфиров, которые являются коммерчески доступными, когда п=2-6.

Ϊ й А ,'-он π„ζκκ.λικ<οοη_;™_λ N - _Й(1 (

РЬ₂₅ ^г получаемый согласно нижеописанной схеме.

Стадия (ί): активация Ртос-Ь-валина в форме сложного ΝΗδ-эфира; реакцию осуществляют в полярном апротонном безводном растворителе, таком как ΤΗΡ, обработкой с помощью ΝΗδ в присутствии сочетающего агента, такого как ЭСС.

Стадия (ίί): пептидное сочетание между Ртос-Ь-валин-ΝΗδ и Ь-цитруллином; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь диметоксиэтана/ТНР/воды, в присутствии основания, такого как бикарбонат натрия.

Стадия (ίίί): пептидное сочетание с 4-аминобензиловым спиртом; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь ЭСМ/метанола, в присутствии сочетающего агента, такого как ЕЕЭЦ.

Стадия (ίν): снятие защиты с Ртос-амина; реакцию осуществляют в полярном растворителе, таком как смесь ЭСМ/метанола, в присутствии основания, такого как диэтиламин.

Стадия (ν): активация карбоновой кислоты в форме сложного ΝΗδ-эфира; реакцию осуществляют при КТ в полярном апротонном растворителе, таком как ЭСМ, обработкой с помощью ΝΗδ в присутствии сочетающего агента, такого как ЭСС на носителе.

Двухосновные ПЭГ кислоты, монозащищенные в аллиловой форме, получают согласно описанию получения линкера Ь₁₄.

ΡΟΖΟ... , -Г ¹о

РЬ₂₆ '^; йодацетат 2,5-диоксопирролидин-1-ила является рыночным продуктом и имеет номер

САδ 39028-27-8.

Таблица II

Предшественники линкеров	С	Реакциями)’	Прои но пн те кртнофицииа форму ιι.ι ГП) ^{2 5}
РЬ	Примеры РЬ	Ь	Семейство линкеров происходящих от предшественника РЬ	_г , ?’ ,.о , А О о о НМ С1 ) ». .* ] < О у' Н О ОМе при Ь =
рь,	о	-(СН_г)пС1	^д 1 а. ⁵ = = 1 § ? ! § 1 =	ь,	О Я га$ди<· N М (СН_г)_л —	κε _λ ίί _Ν ^λ 1 к
РЬ_г	^{5 5} Ϋ Ί	-(СН_г)пС1	Ьг	гаЗАЬК ^Ν (СНД —	¹⁴³ < ν'4
РЬз	3 ынр_1г К,5 НкпиЯ,_г Ме	.(СН₂)_ПС1	Ьз	Р,_г 2а8 АТК ^Ν ,с_Нг)_п --	Ρ. НЗ -- Р,_г-Н 1трЗют((?„=Ме ТР4
ΡΙ-4	Κι₇-Η·“<Κ ,=Ме	-(СНг)тС1	и	% N газ аьк \| - N (СНгК,—	^ν * Г 7
рц	О Т * , м Л ь \ к а о О	-(СНг)пОН	ацилирование	Ь₅	К,_г РЬ7о СО А1К 33 ΑΙ.Κ ^М-ц ° (СИД-О	⁸ 5
РЦ	ч -о У-ь 4™	-(СН₂)пОН	ацилирование сочетание [необязательно преьраше ниеоддою/ЬНЪ в 1р>юе ΖΚΚΗ например котла -4 2_ОК_Ь= о снятие защиты «ыивгит посредством N145)	1-6а	ΡΟΖΟ СО-А1К (ОСН_гСНр ° \|\| ° (СИД— о	о, о „ ι т ° ^г Т '-‘О о о
(СНгСНг.	1-6Ь	РЬ2Ь-С0 АЬК (ОСН_гСН_?)\| ° ή ^Ν (СН^-ао	⁰ и “1 οΐ 1 ' - о о о
(СНЛ СО_гН	ттерифюэдко, (необязательно кгреьрашение одного /ЬР.0	ί-ве	О ΡΟΖΟ СО АЬК (0СН₂СН_г)\| ₀ - _(С\|\|) .	-I О 0

- 25 024627

			4 2=«ь= ⁰ сняше защиты, активация посредством ΝΗ5)
Рк	о° · К_\|; = НоиМе	-(СН₂)пС1	нуклеофильное замещение [необязательно, превраще ние одного ΖΒΡ6 в другое ?,ЪКЬ, например, когда -0-^ 2ьРь= ⁰ снятие защиты, активация посредством ΝΉ5)	ка	К_ц РЬгЬ-С0-А1К-(ОСН_гСН₂)\| ' АсНД—	о % —Ч- 0 0 К,=Н Пр14н»К„=Ме Пр15
-(СН₂)п он	активация, сочетание, [необязательно, превраще' ине одного Ζ6Κ6 в другое 2ЬКЪ, например, когда -У ДКь= ° снятие защиты, активация посредством ΝΗ5]	кь	% ΡΟΖΟ СО-АЬК-(ОСН₂СН_г)\| ^Νγ ⁰ (СН_г)„-А0 “	о _; ^λ№-Α'·'^θΑ'_ΟΑ-^Νγ^οΑ ''—1 0 0 ⁰ К,_г=Н пр 1вн»К„=Ме
-(СН₂)_П СО₂Н	амидирование, [необязательно, превращение одного гькь в другое гькь, например, когда ч Ζ₀Ρ_Β= ⁰ снятие защити, активация посредством ΝΗ5)	кс	о Къ2Ь-СО-А1.К-(ОСН,СН_г)\|, А „ ·> у *^снл~Р,_г	0 /—> О 0 у” ο^Λ--/ο^4°'^'ν^ΛΑ 6 ‘ Й В₁₂=Нн».Ме ^,г
Рк	0 к-,Ν*	-(СН₂)пС1	нуклеофильное замещение [необязательно, превращение одного гЬКЬ в другое ΖΒΚΒ, например, когда	к	«Ь2Г>СО-А1-К-(ОСН_гСН_г)\|.. \ N ' (СНгХ, -	.0 ,—χ 0 УаМ^аа-аа
Рк	^У'У,	-(СН₂)пС1	к	кьге-со-А1.к ν η N > - (Сн_г>_п-<-	0 С Ϊ. ^{0 1} Пр 13

			ч г_ьРь= ⁰ снятие защиты, активация посредством ΝΗ5)
Рк	(Ч ίο 4₄ ^ΝΗβ” К₁₂ = Ним Ме	-<СН₂)пС1	нуклеофильное замещение [необязательно превращение одного Ζ6Κ6 в другое Ζ№6, например, когда -4 г_ьКь= ° снятие защити, активация посредством ΝΗ5]	ка	н,₂ кьгь СО АЬК \|ОСН_гСН_г)\| ^Ν (СН,)„ А	Λ,^Α'-θΑ о-А·’'' •-Л о
-<сн₂)п он	активация сочетание [необязательно, превраще·¹ние одного Ζ6Κ6 в другое ΖΒΚΗ, например, когда ч г_ьк_в= ° снятие защиты, аыивацня посредством ΝΗ5]	кь	К,₂ ΡΟΖΟ СО АЬК (ОСН_гСН₂)\| ^Ν <\| ° о	о в„ Л»⁰»-'-⁰! Ю ,°- •—-У о о ⁰ К,_?«Н пр 18КП» К _г8Ме
-(СН₂)п СО₂Н	амидирование. (иеобязате> явно, превращение οληοι о Ζ6ΚΒ в другое ΖΒΚΗ, например, когда -ч Ζ_βΚ_β= 0 снятие защиты, активация посредством ΝΗ5)	кс	0 рьгьсоАьк(ОСн,сн,)\|-. А -, ^{2 1} N (СНД-А- н_1г	0 /—С о о Α^Ν О^Д-^0^Аз°^ N У< ° _%=Н„,Ме
Рк	о Α^^ΝΗ	-(СН_г)„С1	нуклеофильное замещение (необязательно, превращение одного ΖόΚΒ в другое 2,ЪКЬ, например, когда	к	ΗΡΖυ-ΟΟ-ΑΙΚ (ОСЬ^СН, к N (οη,κ,Α	пр 16
Рк	^У'лу	-(СН₂)пС!	к	кьгосо-дьк ,--, к ,Ν > «Αχ,Α	0 У о у ι ч ι 5:гыа

Рко	о с ΝΚ Л ,- N ) - ⁰ ' 'ί 0	-(СН₂)„С1	°У 2ьКь= ⁰ снятие защиты, активация посредству	ко	0 Ньгр-СОАСК ~ N ₍ ^Ν (СН₂>„-—	0 ' N А' —0 0	0 У Ί ,
	0				о	___ 0
Рк1	, Ί А? ° ⁰ ^ν^Λ''^Βγ	^И8<>,си νΑ	нуклеофильное замещение	к)	кьгь-со-А1.к-(осн,сн,>1.. А 5-< к - ¹ ’ А (СНД,— к,_г	«у ° А-.......!° '4,°—»	А ° ^А Αν „г
	^н					Пр17
	0						0
Ркг	/—( ⁰ Υ^Ν О^Л-Ао^ЗУ -~вг 0	нуклеофильное замещение	кг	КЬгЬ-СО-АЬК-(ОСН_гСН₂>А А	0	Юу^А-'.-,
Ркз	о Ηθ'^Ύ'Ο'Ά,°''''~'δΗ	-(СН_г)„С1	нуклеофильное замещение	кз	рьгь-со-А1К-(осн_гсн₂)1 '⁸' (сн_г)„ А	<> Уа-Л о
			амидирование. снятие		А КЬ2Ь-СО-АЬК-(ОСН,СН,)\| , , N ^г !Г <сн₂)_Г^	о .—I' О
	0	(СН₂)_ПЫН₂	зашиты, активация	к 4а	Αν Α,-τ ο 'Άθ	Αθ-_ΥΝΑ·
Ркд	^•о^Л-^о^Ч°-А'°^Н				о		о

	0		этерификация, снятие		Кьгь-СОАЬКЧОСН.СНЛ, .0, ,	/А О
		-(сн₂)_пок	защиты, активация	1~14Ъ	А (Сн_г)„А о	γ·^Ν </ -Ао'	У°-А'⁰^
						ό	О
						0	Ν-Ν
	0 /А' 9					У°А°^	₀4г-^Л~^ы-!
	•^Νο¹ ;с А -		ци клоп рисоед и некие			0 0
Ркб	ό	-(ΟΗ₂)πΝ₃		кб	регь.со-А1.к-(ОСн₂сн_г)1°'(-кУ-'^м'(Сн₂)_пА	Л-° Α	0
	о					пр 20	—0 Ν=Ν
							4Ν_Μ.

РЦб	м Ц , О 7 о ]О _\|2 Ν,	(сн₂)цмр₁₂ СНгСиСН	циклоприсоединение	Цб	^{Ν Ν К}12 Ρ6ΖΙ>ΟΟ.ΑΙ.Κ-(ΟΟΗ₂ΟΗ₂> Ν _Ν (Сн₂у—	О N О ° 1 ΐ
РЦ₇	0 4 5 0 ° или 5 текенковая кислота	(СН₂)„Щ		1-17	Ν-Ν КЬ2ЬСО-А1.К ^Ν (СН^Ц-	0 /~4 О Ν-Ν Да α ν ι ⁰ пр 19
РЦв		(СНг^МЯ.г- СН₂С=СН		Ϊ-1Β	Ν-Ν Ρ., Ν Λ Η ηβζοοο-αικ (сн₂>„—	0 Г~< 0 Ν-Ν Р ,
РЦв	РоМо-Ч?	-СН=СН₂	метатезис	1-19	Рс2Ь СО ΑΙΚ (ОСН_гСН_г)\|	/+4 V оД-4-
Ρί-го	/‘Ύ° Ч ν^Ν о - о	-сн=сн₂	—	1-20	рьгь со-ацк	^₀А..^ 0
ΡΙ-2,	Ме55-А ΝΜβ г „ , МНР 'У К ,2= Н или Ме	-(СН₂)„С1	нуклеофильное замещение (при Ζβ Н дополнительно стадия восстановления	I—21	р,₂ Р₁₂ ΖόώΑίΚ-ΟΗ? Ίο р (СНД,—	У λ -.Да Н5 '
ΡΙ-22	/ ^Н ΝΗΚ Ме$5 '''Ι⁰''/ о В₁₂=Н«ли Ме	-(СН_г),С1	^22	«,_г А1_К _ N о	1 и ^я« 4,404“-· Ц,гНилнК,₂’^у« пр 7
ΡΙ-23	Ме55-(СН₂СН_?О)₃ СН_гСН_г ΝΗΚ_ι:К₁₂=Нили Ме	-(СН₂)пС1	Ьгз	в,_г га$-(СН_гсн₂о).-сн₂сц₂ ^Ν (СН₂)„—	НЗ До 44Р₁₂-Н илтМе
Р1-24	о 0 ,~У~ ‘'о	(ΟΗ₂)„ΝΗ₂	ί I ε ί ί * 1 1 В !	Ι-24	о _н у-о (СК-.Ю -Г- <Α Κν о ( Η,Ν-<	ΑΛ- АА ⁴ о » - ^НА'П ^ΝΗ
ΡΙ-2!		(СНгСНг	снязие защиты активация	Ι-25	О N.. 1 (Сну^ о Γί 'А О. ΝΗ АА '-—к «Ро В02Ь СО-АКК (ОСН₂СН₂)\|	4 - χ ” 5^_ - 0 ¹ ^~ζ о 0 0 Ао
ΡΙ-26	о /~~ 0 \ N Д г д о ⁰ Ζ-,	Ор,) ц	нуклеофильное	Ι-26	О кьгь	О 0 4 чо к ;

¹ Более подробно см. раздел Примеры реакций, изложенный выше.

² Примеры даны на конкретное производное криптофицина, но может быть использовано любое производное криптофицина формулы (II), в частности Ό₁-Ό₈.

³ , -'(сн,:,, соответствует расщепляемой дисульфидной структуре линкера, выбираемой из линкеров Ь₁-Ь₄ или Ь₂₁-Ь₂₃.

⁴ К₁₂ или К'₁₂: Н или (С₁-С₆)алкильная группа, например метил; п: целое число от 1 до 6; ί: целое число от 1 до 20, более конкретно от 1 до 10, более конкретно от 1 до 8 или от 1 до 6, еще более конкретно от 2 до 5. ί может принимать любое значение из указанных диапазонов, в частности 2, 3, 4 или 5.

⁵ В табл. II Ь находится в пара-положении, однако можно получить аналогичным способом соединения с Ь в орто- и мета-положениях.

Способ получения конъюгата.

Конъюгат получают способом, заключающимся в том, что:

(ί) вводят в контактирование и осуществляют взаимодействие между водным раствором моноклонального антитела, необязательно забуференного, и раствором производного криптофицина формулы(П);

(ίί) необязательно, отделяют конъюгат, образовавшийся на стадии (ί), от непрореагировавших производного криптофицина и/или моноклонального антитела, и/или от агрегатов, которые могут сформироваться.

Более конкретно на стадии (ίί) отделяют конъюгат, полученный на стадии (ί), только от непрореагировавшего производного криптофицина и возможно образовавшихся агрегатов, и оставляют в растворе моноклональное антитело, который возможно не был прореагирован.

Введение в контакт необходимо для реализации взаимодействия химических групп ССК1 и ОСК2, чтобы связать таким путем производное криптофицина с моноклональным антителом и образовать ковалентную связь; предпочтительно когда ССК1 означает -δΖ_α: модифицируют моноклональное антитело с помощью модифицирующего агента таким образом, чтобы ввести на поверхность моноклонального антитела подходящие группы ОСК2, в частности группы, описанные во 2-й колонке табл. I:

химические дисульфидные группы, в случае, когда ССК1 означает -δΗ; химические тиольные группы, в случае, когда ССК1 означает -δΖ_α, где Ζ4Η; химические малеимидо- или иодацетамидогруппы, в случае, когда ССК1 означает -δΗ.

В случае антител (МАЬ) в 4-й колонке табл. I приведены формулы конъюгатов:

когда ССК1 означает -С(=О)^_ЬК_Ь: реакция протекает по аминофункциям агента клеточного связывания, в частности, по группам ε-амино, которые несут боковые цепи остатков лизина (Ьук) антитела. В случае антитела (МАЬ) получают конъюгат формулы: МАГОСМИ-САОЦА-СгурШ],!, где Ь*=такой фраг- 27 024627 мент линкера Ь, содержащего ОСК1=-С(=О)^_ЬК_Ь, чтобы Ь=-Ь*С(=О)^_ьК_ь;

в присутствии производного криптофицина формулы (III), где С=-(СН₂)_пУ, моноклональное антитело содержит -§Н-группы, если У=-С1, группы -С^СН, если Υ=-Ν₃ или карбоксильные кислотные группы, если Υ—ОН или -ΝΉ₂;

в присутствии производного криптофицина, содержащего химическую реакционноспособную группу ОСК1 типа малеимидо или йодацетамидо, агент клеточного связывания включает химические тиольные группы.

Под термином агрегаты понимают ассоциации, которые могут формироваться между двумя или более агентами клеточного связывания, при этом агенты клеточного связывания могут быть модифицированы или нет методом конъюгирования. Агрегаты способны формироваться под действием большого числа параметров, таких как высокая концентрация агента клеточного связывания в растворе, рН раствора, высокие усилия сдвига, число привитых димеров и их гидрофобный характер, температура (см. ссылки, цитированные в предисловии в I. МетЬгапе §сЕ 2008, 318, 311-316), однако влияние некоторых из них точно не выяснено до сих пор. В случае работы с белками или антителами, можно сослаться на ААР§ 1оигпа1, Рго!еш АддгедаНоп апб Вюргосе55шд 2006, 8(3), Е572-Е579. Содержание агрегатов может быть определено при помощи известных методов, таких как §ЕС (см. в этой связи Апа1уБса1 ВюсйептПл 1993, 212(2), 469-480).

Водный раствор моноклонального антитела может быть забуферирован посредством, например, таких буферов, как, например, калий-фосфатный буфер или буфер, содержащий Ν-2гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновую кислоту (буфер НЕРЕ§), или смесь буферов, такая, как буфер А, описанный ниже. Буфер зависит от природы моноклонального антитела. Производное криптофицина растворяют в полярном органическом растворителе, например в ПМ§О или ОМА.

Реакция протекает при температуре главным образом в интервале от 20 до 40°С. Продолжительность реакции варьируется от 1 до 24 ч. За реакцией между антителом и производным криптофицина можно следить при помощи §ЕС-хроматографии с рефрактометрическим и/или ультрафиолетовым детектором для того, чтобы определять ход реакции. Если степень замещения недостаточна, то можно продлить время реакции и/или добавить производное криптофицина. Можно сослаться на общий метод, раскрытый в части описания примеров осуществления, чтобы узнать подробности относительно конкретных условий реакции. Частные варианты осуществления описаны в примерах 9, 10, 11, 25, 26 или 27.

Специалист располагает различными хроматографическими методами для осуществления разделения на стадии (ίί): конъюгат может быть очищен, например, методом эксклюзионной стерической хроматографии (§ЕС), адсорбционной хроматографии (такой как ионообменная хроматография, 1ЕС), хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С), аффинной хроматографии, хроматографии на смешанных носителях, таких как керамический гидроксиапатит, или ВЭЖХ. Может быть также использована очистка методом диализа или диафильтрации.

После стадии (ί) или (ίί) раствор конъюгата можно направить на стадию (ίίί) ультрафильтрации и/или диафильтрации. После выхода из этих стадий получают таким путем конъюгат в виде водного раствора.

Антитела.

Антитела (см. о них 1апе^ау е! а1., 1тгаипоЬю1о§у, 5-е изд., 2001, Оаг1апб РиЬ15Ыпд, Нью-Йорк) могут быть выбраны из тех, которые описаны, в частности, в \УО 04043344, \УО 08010101, \УО 08047242, \УО 05009369 (против СА6) или \УО 2010014812. Антитело необязательно может быть модифицировано посредством модифицирующего агента для того, чтобы способствовать связыванию с производным криптофицина (см. выше). Антитела могут быть, в частности, моноклональными, поликлональными или мультиспецифичными, предпочтительно моноклональными. Это могут быть также фрагменты антител. Это могут быть также муриновые, человеческие, гуманизированные или химерные антитела.

Конъюгат.

Конъюгат обычно включает около 1-10 производных криптофицина, связанных ковалентно с моноклональным антителом (речь идет о степени сшивки или, по-английски, о бгадЧо-апБЬобу гаБо или ПАК). Это число меняется в зависимости от природы моноклонального антитела и производного криптофицина, а также от рабочих условий, используемых в способе конъюгирования (например, количество эквивалентов производного криптофицина по отношению к моноклональному антителу, время реакции, природа растворителя и, возможно, сорастворителя). Контактирование моноклонального антитела с производным криптофицина приводит к смеси, содержащей несколько конъюгатов, отличающихся индивидуально друг от друга по различным показателям ПАК; при этом возможно, что моноклональное антителоне полностью прореагировало; возможно наличие агрегатов. Следовательно, величина ИАК, определяемая в конечном растворе, соответствует средней величине ПАК

В случае, когда агентом клеточного связывания является антитело, может быть использован метод УФ-спектроскопии для определения ПАК Этот метод основан на методе, изложенном в АЩопу §. ΠίιηίίϊΌν (еб), ЬЬС, 2009, ТБегареиБс АпБЬоФе5 апб РгоФсок, т. 525, 445, §рБпдег §щепсе. Он заключается в измерении поглощения раствора конъюгата, полученного после стадии разделения (ίί), на двух длинах

- 28 024627 волн, обозначемых λ1 и λ2. Используют следующие коэффициенты молярной экстинкции голого антитела и производного криптофицина, измеренные перед конъюгированием.

Поглощение раствора конъюгата при λ1 и λ2 (А_м) и (Α_λ2) измеряют либо при соответствующем пике спектра ЗЕС (это позволяет расчитать ИАК(ЗЕС)) или с использованием классического УФспектрофотометра (это позволит расчитать ИАК(иУ)). Значения поглощения могут быть выражены в форме уравнений

Αχι. ( ε_Εχι) + (СдХЕдхх)

А\2= (с_Ех ε_Ε\2) + (Сдх ) в которых с, и с_А обозначают соответственно концентрации в растворе части конъюгата, относящейся к производному криптофицина, и части конъюгата, относящейся к антителу;

ε_ϋλ1 и ε_ϋλ2 обозначают коэффициенты молярного поглощения производного криптофицина перед конъюгированием на двух длинах волн λ1 и λ2 соответственно, причем коэффициенты измерены с соединениями формулы (II) типа 8Ζ₃, где Ζ^-ЗМе или типа -С^О)^^, где Ζ_ЬК_Ь=ОМе;

ε_Αλ1 и ε_Αλ2 обозначают коэффициенты молярного поглощения голых антител на двух длинах волн λ1 и λ2 соответственно.

Под голым антителом понимают антитело, к которому не присоединено ни одно производное криптофицина, т.е. антитело перед конъюгированием.

Решение указанных двух уравнений приводит к

Сп= [ ( Га? ι ) - ( ГддгхАы ) ] / [ ( Год2^х ε Αλί) - ^х £с?.1) ] ^сд=[Αχι-] /САМ

Тогда среднее значение ИАК соответствует с₂/с_Л. В случае производных криптофицина можно установить длину волны λ1=280 нм, и, в зависимости от природы криптофицина, λ2 выбирают из интервала специфических длин волны 246-252 нм. Значение ИАК(иУ)предпочтительно выше 0,5, более конкретно между 1 и 10, еще более конкретно между 2 и 7.

Конъюгат может быть использован в качестве противораковых агентов. Благодаря присутствию моноклонального антитела, конъюгат становится значительно более избирательным к опухолевым клеткам, чем к здоровым клеткам. Это позволяет направлять производное криптофицина в пространство, близкое к опухолевым клеткам, или непосредственно внутрь этих клеток (см. об этом следующие публикации, которые описывают использование конъюгатов с моноклональными антителами при лечении раковых опухолей: АпбЬобу-бгид соп)ида!е8 Гог сапсег Легару Сайег Р.1, е! а1., Сапсег Т 2008, 14, 154-169; Тагде!еб сапсег Легару: сопГегппд вресШсИу !о су!о!охю бгидк СЬап К., Асе. СЬет. Ке8. 2008, 41, 98107). Это также дает возможность лечить солидные и жидкие опухоли. Конъюгат может быть использован индивидуально или в комбинации по меньшей мере с одним другим противораковым агентом.

Конъюгат входит в рецептуры, выпускаемые в форме забуференного водного раствора, в концентрации, как правило, между 1 и 10 мг/мл. Этот раствор может быть инъецирован в форме перфузии как таковой или разбавлен с получением перфузионного раствора.

Примеры

Используемые методы анализа.

Жидкостная хроматография высокого давления - масс-спектрометрия (ЖХМС).

Метод А1.

Анализ проводят в аппарате ^а!егк ΖΟ на колонке ХВйбде С₁₈ 2,5 мкм (3x50 мм) при 70°С со скоростью потока 0,9 мл/мин, градиент элюирования (7 мин)(А)вода/0,1% муравьиная кислота и (В) ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота (градиент: от 5 до 100% В за 5,3 мин; 5,5 мин: 100% В; 6,3 мин: 5% В) и ионизация электрораспылением в положительном и/или отрицательном режиме.

Метод А2.

Анализ проводят в аппарате ^а!егк иРЬС-ЗОЭ на колонке Асцийу ВЕН С₁₈ 1,7 мкм (2,1x50 мм) при 50°С со скоростью потока 1 мл/мин, градиент элюирования (2 мин) (А)вода/0,1% муравьиная кислота и (В) ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота (градиент: от 5 до 50% В за 0,8 мин; 1,2 мин: 100% В; 1,85 мин: 100% В; 1,95 мин: 5% В) и ионизация электрораспылением в положительном и/или отрицательном режиме.

Метод А3.

Анализ проводят в аппарате ^а!егк иРЬС-ЗОЭ на колонке Асцийу ВЕН Οι₈ 1,7 мкм (2,1x50 мм) при 70°С со скоростью потока 1 мл/мин, градиент элюирования (2 мин) (А)вода/0,1% муравьиная кислота и (В) ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота (градиент: от 5 до 50% В за 1 мин; 1,3 мин: 100% В; 1,45 мин: 100% В; 1,75 мин: 5% В) и ионизация электрораспылением в положительном и/или отрицательном режиме.

Метод А4.

Анализ проводят в аппарате ^а!егк ΖΟ на колонке РЬепотепех Кше!ех С_!8 100А 2,6 мкм (3x50 мм) при 45°С со скоростью потока 1 мл/мин, градиент элюирования (6 мин) (А)вода/0,1% муравьиная кислота и (В) ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота (градиент: 6% В: 0,8 мин; от 6 до 100% В за 4,1 мин; 4,8

- 29 024627 мин: 100% В; 5,0-6,0 мин: 6% В) и ионизация электрораспылением в положительном и/или отрицательном режиме.

Метод А5.

Анализ проводят в аппарате \Уа1ег5 ΖΟ на колонке РЬепотепех Кше1ех С₁₈ 2,6 мкм (3x1000 мм) при 50°С со скоростью потока 0,8 мл/мин, градиент элюирования (8 мин) (А)вода/0,1% муравьиная кислота и (В) ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота (градиент: 4% В: 0,15 мин; от 4 до 100% В за 6,85 мин; 7,1 мин: 100% В; 7,4-8,2 мин: 4% В) и ионизация электрораспылением в положительном и/или отрицательном режиме.

Масс-спектрометрия (МС).

Спектры получают путем прямого введения в аппарат ХУАТЕКЗ ОСТоГ (прямое введение без ЖХ).

Эксклюзионная стерическая хроматография. Масс-спектрометрия высокого разрешения (§ЕСНКМ8).

Анализ может потребовать проведения предварительной стадии дегликозилирования конъюгата. Эту стадию осуществляют добавлением к 2%-му (об.) раствору конъюгата раствора фермента РNΟа5е Р (полученного добавлением воды милли-Ц к 100 единицам лиофилизата фермента Ν-гликаназы, доводя объем во флаконе до 100 мл). Раствор гомогенизируют с помощью прибора вортекс и инкубируют при 37°С в течение 19 ч. Дегликозилированный образец готов к анализу 8ЕС-НКМ§. Хроматографический анализ осуществляют на аппарате АдПеп1 НР 1100 и на колонке \Уа1ег5 ВювиЪе 250 НК §ЕС 4 мкм (4,6x300 мм) при 30°С, при скорости потока 0,4 мл/мин и изократическом элюировании смесью (А) формиат аммония 25 мМ рН 7/(В) ацетонитрил 70/30 за 15 мин. Масс-спектрометрию осуществляют на аппарате \Уа1ег5 РТОЕ ίί с ионизацией электрораспылением в положительном режиме. Масс-спектры подвергают деконволюции с использованием программного обеспечения \Уа1ег5 МахЕпЙ.

Эксклюзионная стерическая хроматография (§ЕС НРЬС).

Анализ проводят на аппарате Мегск ЬасЬтот Е1Ье НРЬС со спектрофотометрическим детектором Ь2455 ОАЭ и колонкой ТовоЬ Вювшепсе Т§Кде1 03000 ЗХУХБ 5 мкм (7,8x300 мм) при скорости потока 0,5 мл/мин и изократическом элюировании в течение 30 мин буфером рН 7, содержащим 0,2 М КС1, 0,052 М КН₂РО₄, 0,107 М К₂НРО₄ и 20% об. изопропанола.

Ядерный магнитный резонанс ¹Н (ЯМР).

Спектры ¹Н ЯМР снимали на спектрометре Вгикег Ауапсе, модель ΌΚΧ-300, ΌΚΧ-400, ΌΚΧ-500 или ОМХ-600. Химические сдвиги даны в м.д.

Общий способ, используемый для получения конъюгатов, в которых производные криптофицина содержат линкер Ь с концевой группой -δΖ₃.

Способ осуществления в две последовательные стадии.

Стадия 1.

Антитело сначала модифицируют активированным сложным ΝΉδ-эфиром для введения на поверхность антитела пиридилсульфидных групп. Раствор антитела Ьи2Н11 в водном буфере с рН 6,5, содержащем 0,05 М фосфата калия и 0,05 М №С1, (обозначаемого как буфер А), обрабатывают с помощью 510 экв. активированного сложного ΝΉδ-эфира, растворенного в ОМА таким образом, чтобы конечная концентрация антитела составляла от 5 до 10 мг/мл и процентное содержание ОМА в водном буфере составляло 5%. Реакцию продолжают в течение 2 ч при КТ. Смесь наносят на гель-фильтрующую колонку (матрица δерЬайеx™ 025, ОЕ НеаЪЬсате), предварительно уравновешенную водным буфером рН 8, содержащим 0,05 М НЕРЕδ, 0,05 М Ν;·ιΟ и 2 мМ БЭТА. Модифицированные антитела элюируют буфером НЕРЕδ рН 8, собирают и количественно анализируют методом УФ-спектрометрии для определения концентрации антител в образце и числа пиридилсульфидных групп. Пробу модифицированного антитела обрабатывают дитиотреитолом для восстановления дисульфидной связи, высвободившийся пиридин-2тион подвергают количественному анализу методом спектрометрии (коэффициенты экстинкции: ε_{343 нм}: 8080 М^-1см^-1, ε280 нм: 5100 М^-1см^-1 для пиридин-2-тиона и ε280 нм: 208380 М^-1см^-1 для антитела). В среднем от 3 до 6 пиридилдисульфидных групп прививаются к молекуле антитела.

Стадия 2.

Раствор модифицированного антитела, полученного на 1-й стадии, разбавляют водным буфером рН 8, описанным выше, затем обрабатывают раствором производного криптофицина (5 экв.) таким образом, чтобы конечная концентрация антитела была 3 мг/мл, а процентное содержание ОМА в водном буфере составило 20%; количество эквивалентов производного криптофицина выражено по отношению к количеству молекул пиридилсульфида, введенных на первой стадии. Реакция продолжается в течение ночи при 30°С или при перемешивании со скоростью около 2000 об/мин. Смесь анализируют методом δЕС НРЬС, чтобы определить степень прививки производного криптофицина к антителу. Если степень замещения недостаточна, смесь обрабатывают дополнительно 1-5 экв. производного криптофицина в ОМА в течение 3 ч при 30°С или при перемешивании со скоростью около 2000 об/мин. Смесь фильтруют через фильтр МШехФ-δν 5 мкм (мембрана РУЭЕ, Эигароге, МПЬроте), затем очищают гель-фильтрацией с использованием матрицы δире^йеx 200 рд (колонка НПоай 16/60 обессоливающая, ОЕ НеаЪЬсате), предварительно уравновешенной водным буфером рН 6,5, содержащим 0,01 М фосфата, 0,14 М ΝηΟ и 10%- 30 024627

20% NМΡ. Фракции, содержащие конъюгированное антитело в мономерной форме, собирают, объединяют и концентрируют на приборе Атюоп иЬга-15 (мембрана И11гасе1 10к или 50к, МПНроге) до концентрации от 2 до 15 мг/мл. Замену буфера окончательно производят для того, чтобы удалить органический растворитель из буфера для хранения конъюгата. Конъюгат наносят на гель-фильтрационную колонку, состоящую из матрицы 8ирегДех™ Ο25 (колонки Мар-5,-10, ΡΌ-10, Нргер 26/10 обессоливающая, ΟΕ Неа1!Ьсаге), предварительно уравновешенной водным буфером, имеющим состав и рН, подобранные для каждого конъюгата. Конечный конъюгат количественно анализируется методом УФ-спектрометрии с использованием коэффициентов экстинкции, установленных для антитела и соответствующего производного криптофицина, с целью определения концентрации антитела и среднего значения индекса токсичности, вносимого антителом. Степень замещения может быть рассчитана путем деконволюции 8ЕСНКМ8-спектра конъюгата.

Двухстадийный способ опе-ро!.

Антитело сначала модифицируют активированным сложным МН8-эфиром для введения на поверхность антитела пиридилдисульфидных групп. Раствор антитела Ьи2Н11 в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,05 М фосфата калия и 0,05 М №С1, разбавляют фосфатным буфером с рН 6,5 и 1н. водным раствором НЕРЕ8 таким образом, чтобы конечное соотношение между первоначальным фосфатным буфером с рН 6,5 и НЕРЕ8 составляло 96/4 для достижения рН«7,5-8. Этот раствор антитела обрабатывают 510 экв. активированного сложного NΗ8-эфира, растворенного в ЭМА таким образом, чтобы конечная концентрация антитела составляла от 5 до 10 мг/мл и процентное содержание ЭМА в водном буфере составляло 5%. Реакцию продолжают 2 ч при КТ. Раствор модифицированного таким путем антитела разбавляют непосредственно в смеси 96/4 фосфатного буфера рН 6,5 и НЕРЕ8, затем обрабатывают раствором производного криптофицина (4 экв.) в ЭМА таким образом, чтобы конечная концентрация антитела составляла 3 мг/мл и процентное содержание ЭМА в водном буфере составило 20%; число эквивалентов производного криптофицина выражают по отношению к числу эквивалентов активированного сложного NΗ8-эфира, введенных на первой стадии. Реакцию продолжают в течение ночи при 30°С или при перемешивании со скоростью около 2000 об/мин. Смесь анализируют методом 8ЕС НРЬС для определения степени прививки производного криптофицина к антителу. Если степень замещения недостаточна, смесь обрабатывают дополнительно 1-5 экв. производного криптофицина в ЭМА в течение 3 ч при 30°С или при перемешивании со скоростью около 2000 об/мин. Смесь фильтруют через фильтр МП1ех®-8У 5 мкм (мембрана РУЭР, Эитароте, МПНроге), затем очищают гель-фильтрацией с использованием матрицы 8ирегДех 200 рд (колонка НПоаД 16/60 обессоливающая, ОЕ Неа1!Ьсаге), предварительно уравновешенной водным буфером рН 6,5, содержащим 0,01 М фосфата, 0,14 М Ν;·ιΟ и 10%-20% ММР. Фракции, содержащие конъюгированное антитело в мономерной форме, собирают, объединяют и концентрируют на приборе Атюоп И1!та-15 (мембрана иНтасе1 10к или 50к, МПНроге) до концентрации от 2 до 15 мг/мл. Замену буфера окончательно производят для того, чтобы удалить органический растворитель из буфера для хранения конъюгата. Конъюгат наносят на гель-фильтрационную колонку, состоящую из матрицы 8ирегДех™ О25 (колонки Мар-5, -10, РЭ-10, Шргер 26/10 обессоливающая, ОЕ Неа1!Ьсаге), предварительно уравновешенной водным буфером, имеющим состав и рН, подобранные для каждого конъюгата. Количественный анализ конечного конъюгата осуществляется методом УФ-спектрометрии с использованием коэффициентов экстинкции, установленных для антитела и соответствующего производного криптофицина, с целью определения концентрации антитела и среднего значения индекса токсичности, вносимого антителом. Степень замещения может быть расчитана путем деконволюции 8ЕС-НРМ8-спектра конъюгата.

Общий способ, используемый для получения конъюгатов, в которых производные криптофицина содержат линкер Ь с концевой группой -С(=О)2_ЪК_Ъ.

Раствор антитела Ьи2Н11 в водном буфере рН 8, содержащем 0,05 М НЕРЕ8, 0,05 М МаС1 и 2 мМ ЕЭТА или состоящем из смеси 96/4 водного буфера рН 6,5, содержащего 0,05 М фосфата калия и 0,05 М МаС1/1н. НЕРЕ8, обрабатывают избытком раствора в ЭМА производного криптофицина таким образом, чтобы конечная концентрация антитела была 3 мг/мл, а процентное содержание ЭМА в водном буфере составило 20%. Реакцию продолжают 3 ч при 30°С или при перемешивании со скоростью около 2000 об/мин. Смесь анализируют методом 8ЕС НРЬС для определения степени прививки цитотоксического соединения к мономерной популяции антитела. Если степень замещения недостаточна, смесь обрабатывают дополнительными 1-5 экв. производного криптофицина в ЭМА в течение 3 ч при 30°С или при перемешивании со скоростью около 2000 об/мин. Смесь фильтруют через фильтр МШех®-8У 5 мкм (мембрана РУЭР, Эигароге, МПНроге), затем очищают гель-фильтрацией с использованием матрицы 8ирегДех 200 рд (колонка НДоаД 16/60 обессоливающая, ОЕ НеаНЬсате), предварительно уравновешенной водным буфером рН 6,5, содержащим 0,01 М фосфата, 0,14 М МаС1 и 10-20% ММР. Фракции, содержащие конъюгированное антитело в мономерной форме, собирают, объединяют и концентрируют на приборе Атюоп ИНта-15 (мембрана И1!тасе1 10к или 50к, МПНроге) до концентрации от 2 до 5 мг/мл. Замену буфера окончательно производят длч того, чтобы удалить органический растворитель из буфера для хранения конъюгата. Конъюгат наносят на гель-фильтрационную колонку, состоящую из матрицы 8е- 31 024627 рЬабех™ О25 (колонки Яар-5,-10, ΡΌ-10, Шргер 26/10 обессоливающая, ОЕ НеаИЬсаге), предварительно уравновешенной водным буфером, имеющим состав и рН, подобранные для каждого конъюгата. Конечный конъюгат количественно анализируется методом УФ-спектрометрии с использованием коэффициентов экстинкции, установленных для антитела и соответствующего производного криптофицина, для определения концентрации антитела и степени прививки. Степень замещения может быть также рассчитана путем деконволюции δЕС-НΚМδ-спектра конъюгата.

Способы, описанные с участием антитела Ьи2Н11, применимы аналогичным образом и к другим антителам, а также к другим моноклональным антителам.

Пример 1. (Е)-(3δ,10Κ,16δ)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(δ)-1-((2Κ,3Κ)-3-{4-[4-(4меркапто-4-метилпентаноил)пиперазин-1 -илметил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 2. (Е)-(3δ,10Κ,16δ)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-16-{(δ)-1-[(Κ)-3-(4-хлорметилфенил)оксиранил]этил}-3-изобутил-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-циазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 1 (30 мг; 42,9 мкмол, получено согласно А1-а\\аг Κ.δ., е! а1., ί. Меб. СЬет. 2003, 46, 2985-3007) растворяют в безводном ИМР (2 мл) и смесь охлаждают до 0°С, после этого добавляют ТЕА (107 мкмоль), затем СМδ (64,6 мкмоль). Спустя 15 мин баню удаляют и реакцию продолжают при перемешивании в течение 12 ч при КТ. Смесь разбавляют добавлением АсОЕ! (2 мл) и органический слой промывают водой (2x1 мл), насыщенным водным раствором ЯаНСО₃ (1 мл) и насыщенным водным раствором ЯаС1 (1 мл). Органический слой сушат над М^О₄ и после фильтрования и выпаривания растворителей при ПД получают продукт 2 в форме бесцветного кристаллизующегося масла (25 мг; 81%). 'Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,77-0,83 (м, 6Н); 1,02 (с, 3Н); 1,04-1,07 (м, 3Н); 1,14 (с, 3Н); 1,29-1,36 (м, 1Н); 1,54-1,63 (м, 2Н); 1,80-1,87 (м, 1Н); 2,24-2,33 (м, 1Н); 2,63-2,73 (м, 2Н); 2,96-3,06 (м, 3Н); 3,28-3,32 (м, 1Н); 3,83 (с, 3Н); 3,93 (д, >1,6 Гц, 1Н); 4,27 (ддд, 1=11,3, 8,0, 3,6 Гц, 1Н); 4,78 (с, 2Н); 4,93 (дд, 1=9,6, 3,6 Гц, 1Н); 5,13 (дд, 1=10,8, 5,1 Гц, 1Н); 5,81 (д, 1=14,8 Гц, 1Н); 6,49 (ддд, 1=15,0, 11,2, 3,7 Гц, 1Н); 7,07 (д, 6=8,5 Гц, 1Н); 7,18 (цд, 1=8,5, 1,9 Гц, 1Н); 7.23 (д, 1=9,6 Гц, 1Н); 7,29 (д, 1=1,9 Гц, 1Н); 7,34 (д, 1=8,2 Гц, 2Н); 7,47 (д, 1=8,2 Гц, 2Н); 8,35 (д, 1=8,2 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Еδ т^=713 [М+Н]+; т//=715 [М-Н]^-; !_К=5,17 мин.

Соединение 4. 2,5 -Диоксопирролидин-1 -ил-4-метил-4 -метилдисульфанилпентаноат

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 3 (3,05 г, 15,7 ммоль, получено согласно УО 2007085930) в ИСМ (30 мл), последовательно добавляют ΝΉδ (17,3 ммоль) и хлорид ЕЭС! (17,3 ммоль). Смесь перемешивают 3 ч при КТ, после чего промывают фосфатным буфером рН 6 (2x30 мл), затем насыщенным раствором Ν;·ιΟ (30 мл), сушат над М^О₄ и концентрируют досуха. Полученное кристаллизирующееся масло с запахом промывают смесью гептана/АсОЕ! 75/25 и фильтруют через фриттированное стекло с получением соединения 4 в форме твердого белого вещества (2,08 г, 45%). Фильтрат концентрируют досуха, и полученный неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью гептана/АсОЕ! 50/50-0/100. Фракции, содержащие целевой продукт, концентрируют досуха и обрабатывают изопропиловым эфиром (5 мл); осадок отфильтровывают через фриттированное стекло и получают целевое соединение 4 (1 г, 22%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,29 (с, 6Н); 1,92-1,98 (м, 2Н); 2,41 (с, 3Н); 2,72-2,78 (м, 2Н); 2,81 (с, 4Н); ЖХМС (А4): Е1, т//=291 [М+Н]+.

Соединение 5. трет-Бутил-4-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)пиперазин-1 -карбоксилат

В колбу УЬеа!!оп помещают соединение 4 (200 мг, 686 мкмоль), 1-Вос-пиперазин (686 мкмоль), ТЕА (755 мкмоль) и ИМР (1,6 мл). Смесь перемешивают при КТ в течение ночи, затем рабавляют с помощью АсОЕ! (5 мл), промывают водой (2x5 мл), сушат над М^О₄ и концентрируют досуха. Неочищенный продукт обрабатывают изопропиловым эфиром (3 мл); осадок отфильтровывают через фритти- 32 024627 рованное стекло и получают соединение 5 (213 г, 86%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-Б₆): 1,27 (с, 6Н); 1,41 (с, 9Н); 1,73-1,87 (м, 2Н); 2,34-2,41 (м, 2Н); 2,40 (с, 3Н); 3,23-3,36 (м частично экранирован, 4Н); 3,39-3,45 (м, 4Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=363 [М+Н]+; т^=307 [М+Н-С₄Н₈]^-; Ц=1,08 мин.

Соединение 6. Гидрохлорид 4-метил-4-метилдисульфанил-1-пиперазин-1-илпентан-1-она

К раствору соединения 5 (213 мг, 588 мкмоль) в диоксане (4,4 мл) прибавляют 4 М раствор НС1 в диоксане (4,4 мл). Перемешивание ведут 4 ч при КТ. Смесь отфильтровывают через фриттированное стекло, полученный твердый продукт промывают диоксаном (2 мл), затем изопропиловым эфиром (2 мл) и получают соединение 6 (132 мг, 75%) в форме твердого вещества кремового цвета. ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-ф): 1,27 (с, 6Н); 1,73-1,85 (м, 2Н); 2,37-2,45 (м, 2Н); 2,40 (с, 3Н); 2,98-3,15 (м, 4Н); 3,62-3,73 (м, 4Н); 9,39 (м уш., 2Н). ЖХМС (А1): Е8 т/ζ 263 [М+Н]+; Ц=2, 40 мин.

Соединение 7. (Е)-(38,10К,168)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-16-[(8)-1((2К,3К)-3-{4-[4-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)пиперазин-1 -илметил] фенил}оксиранил)этил] 1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 1 (20,3 мг; 29,0 мкмоль) растворяют в безводном ΌΜΡ (0,77 мл) и ТЕА (72,6 мкмоль), затем добавляют СМ8 (43,6 мкмоль). Спустя 12 ч при КТ образовавшийся продукт 2 не выделяют, а добавляют ТЕА (58,0 мкмоль), затем гидрохлорид 4-метил-4-метилдисульфанил-1-пиперазин-1-илпентан1-она 6 (34,8 мкмоль). Смесь перемешивают дополнительно 72 ч при КТ, затем разбавляют посредством АсОЕ1 (10 мл). Органический слой промывают водой (2x2 мл), насыщенным водным раствором ИаНСО₃(2 мл) и насыщенным водным раствором ИаС1 (2 мл). После сушки над М§8О₄ и фильтрации растворители выпаривают при ПД. Неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 99/1-98/2. Получают твердый белый продукт 7 (5,7 мг; 21%). ТСХ (ЭСМ 90/МеОН 10): К=0,6; ^!Н ЯМР (400 МГц, Д\1СО-сЕ): 0,75-0,81 (м, 6Н); 1,01 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,26 (с, 6Н); 1,28-1,33 (м, 1Н); 1,52-1,61 (м, 2Н); 1,76-1,83 (м, 2Н); 2,27-2,38 (м, 4Н); 2,39 (с, 3Н); 2,64-2,74 (м, 2Н); 2,95-3,05 (м, 2Н); 3,24-3,34 (м, 6Н); 3,44 (шир. с, 4Н); 3,49 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,88 (д, 1=1,7 Гц, 1Н); 4,22-4,29 (м, 1Н); 4,92 (дд, 1=9,9, 3,5 Гц, 1Н); 5,08-5,15 (м, 1Н); 5,81 (д, 1=14,2 Гц, 1Н);

6,48 (ддд, 1=15,2, 11,3, 3,5 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,6 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=8,4, 2,3 Гц, 1Н); 7,22 (д, 1=9,3 Гц, 1Н); 7,25-7,34 (м, 5Н); 8,34 (д, 1=8,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Е8 т/ζ 943 [М+Н]+; т//=941 [М-Н]^-; Ц=4,03 мин.

Пример 1. (Е)-(38,10К,168)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-16-[(8)-1((2К,3К)-3-{4-[4-(4-меркапто-4-метилпентаноил)пиперазин-1-илметил]фенил}оксиранил)этил]-1,4диокса-8,11-диазациклогекса,цец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Продукт 7 (9,6 мг; 10,2 мкмоль) растворяют в смеси этанола (1,2 мл)/воды (1 мл) и смесь встряхивают. Затем добавляют ТСЕР (25,4 мкмоль) и смесь перемешивают 5 ч при КТ. Смесь разбавляют добавлением АсОЕ1 и органический слой промывают смесью 1/1 воды и насыщенного водного раствора ИН₄С1 (1 мл). После сушки органического слоя над М§8О₄, фильтрации и выпаривания растворителей при ПД конечный продукт, пр.1, получают в форме белого твердого вещества (6,5 мг; 71%). ТСХ (ЭСМ 90/МеОН 10): К=0,56; ^!Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-ф): 0,76-0,81 (м, 6Н); 1,01 (с, 3Н); 1,06 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,13 (с, 3Н); 1,24 (с, 6Н); 1,27-1,31 (м, 1Н); 1,56-1,64 (м, 2Н); 1,73-1,85 (м, 3Н); 2,26-2,33 (м, 3Н); 2,36-2,45 (м, 4Н); 2,63-2,75 (м, 2Н); 2,95-3,06 (м, 3Н); 3,34-3,36 (м, 1Н); 3,42-3,51 (м, 6Н); 3,82 (с, 3Н); 3,89 (с, 1Н); 4,22-4,29 (м, 1Н); 4,92 (дд, 1=9,8, 3,4 Гц, 1Н); 5,12 (дд, 1=10,8, 4,9 Гц, 1Н); 5,81 (д, 1=15,2 Гц, 1Н);

6,48 (ддд, 1=15,0, 11,4, 3,4 Гц, 1Н); 7,06 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 7,18 (дд, 1=8,3, 1,5 Гц, 1Н); 7,24 (д, 1=9,8 Гц, 1Н); 7,26-7,36 (м, 5Н); 8,37 (д, 1=7,8 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т/ζ 897 [М+Н]+; т/ζ 895 [М-Н]; Ц=0,97 мин.

- 33 024627

Пример 2. (Е)-(3§,6К,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(§)-1-((2К,3К)-3-{4-[4(4-меркапто-4-метилпентаноил)пиперазин-1-илметил]фенил}оксиранил)этил]-6-метил-1,4-диокса-8,11диазациклоге ксадец- 13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 9. (Е)-(3§,6К,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-16-{(§)-1-[(К)-3-(4-хлорметилфенил)оксиранил]этил}-3-изобутил-6-метил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 8 (49 мг; 71,4 мкмол, которое может быть получено согласно А1-а\\аг К.8., с1 а1., ί. Меб. Сйет. 2003, 46, 2985-3007) растворяют в безводном ЭСМ (5 мл) и смесь охлаждают до 0°С, после этого добавляют ΌΙΡΕΆ (428 мкмоль), затем СМ§ (214 мкмоль). Дают смеси вернуться к КТ и ведут перемешивание 40 ч при КТ. Смесь гидропизуют посредством 5 мл воды, водный слой экстрагируют посредством ΌΟΜ (3x5 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным водным раствором ΝαНСО₃ (10 мл) и насыщенным водным раствором ΝαΤΊ (10 мл) и сушат над Мд§О₄. После фильтрации и выпаривания растворителей при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/МеОН 100/0-90/10. Соединение 9 получают в виде твердого белого вещества (37 мг; 79%). ΊI ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,78 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 0,80 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 1,01 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,30 (м, 1Н); 1,54 (м, 1Н); 1,60 (м, 1Н); 1,82 (м, 1Н); 2,27 (м, 1Н); 2,60-2,78 (м, 3Н); 2,97-3,05 (м, 2Н); 3,15 (м, 1Н); 3,41 (м, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 3,92 (д, 1=1,6 Гц, 1Н); 4,26 (ддд, 1=3,8 и 8,2 и 11,5 Гц, 1Н); 4,77 (с, 2Н); 4,88 (дд, 1=3, 8 и 9,6 Гц, 1Н); 5,12 (ддд, 1=1,5 и 5,3 и 11,2 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,5 и 15,0 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,7 и 11,2 и 15,0 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,23 (дд, 1=2,7 и 9,1 Гц, 1Н); 7,29 (д, 1=2,2 Гц, 1Н); 7,32 (д, 1=8,2 Гц, 2Н); 7,45 (д, 1=8,2 Гц, 2Н); 8,34 (д, 1=8, 2 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т/ζ 703 [М+Н]+; т/ζ 701 [М-Н]^-; т/ζ 747 [М-Н+НСО₂Н]^- пик молекулярного иона; 0=1,17 мин.

Соединение 10. (Е)-(38,6К,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6-метил-16-[(§)-1((2К,3К)-3-{4-[4-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноил)пиперазин-1 -илметил] фенил}оксиранил)этил] 1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 9 (36,6 мг; 52 мкмоль) растворяют в безводном ацетонитриле (3 мл), затем последовательно добавляют ΌΙΡΕΑ (260 мкмоль) и соединение 6 (156 мкмоль). Реакционную среду перемешивают 20 ч при КТ, затем гидролизуют добавлением 4 мл воды. Водный слой экстрагируют посредством АсОЕ1 (3x4 мл), органические слои объединяют, промывают насыщенным водным раствором NаНСО₃ (5 мл) и насыщенным водным раствором №С1 (5 мл). После сушки над Мд§О₄ и фильтрации растворители выпаривают при ПД. Неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 100/0-95/5. Соединение 10 получают в виде твердого белого вещества (39 мг; 80%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,78 (д, 1=6, 6 Гц, 3Н); 0,80 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 1,01 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,26 (с, 6Н); 1,30 (м, 1Н); 1,53 (м, 1Н); 1,60 (м, 1Н); 1,75-1,84 (м, 3Н); 2,26-2,37 (м, 7Н); 2,39 (с, 3Н); 2,61-2,77 (м, 3Н); 2,96-3,05 (м, 2Н); 3,15 (м, 1Н); 3,38 (м частично экранирован, 1Н); 3,44 (м, 4Н);

3,48 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,88 (д, 1=1,6 Гц, 1Н); 4,27 (ддд, 1=4,0 и 8,1 и 11,5 Гц, 1Н); 4,88 (дд, 1=3,8 и 9,6 Гц, 1Н); 5,12 (ддд, 1=1,6 и 5,3 и 11,5 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,6 и 15,1 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,6 и 11,5 и 15,1 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2, 2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,23 (дд, 1-2,6 и 9,2 Гц, 1Н); 7,27 (д, 1=8,4 Гц, 2Н); 7,29 (д, 1=2,2 Гц, 1Н); 7,32 (д, 1=8,4 Гц, 2Н); 8,35 (д, 1=8,1 Гц, 1Н); ЖХМС (А2): Е8 тЦ=929 [М+Н]+; ιη/ζ=927 [М-Н]^-; тЦ=973 [М-Н+НСО₂Н]^- пик молекулярного иона; 0=0,99 мин.

Пример 2. (Е)-(38,6К,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6-метил-16-[(§)-1((2К,3К)-3-{4-[4-(4-меркапто-4-метилпентаноил)пиперазин-1-илметил]фенил}оксиранил)этил]-1,4диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен-2,5,9,12-тетраон

Продукт 10 (34 мг; 36,6 мкмоль) растворяют в смеси этанола (4,3 мл)/воды (3,6 мл) и полученную смесь встряхивают. Затем добавляют ТСЕР (146 мкмоль), при этом смесь становится бесцветной, перемешивают смесь 2 ч при КТ. Смесь разбавляют добавлением АсОЕ1(20 мл) и органический слой промы- 34 024627 вают смесью 1/1 воды и насыщенного водного раствора ΝΚ·|Ο (20 мл). Водный слой экстрагируют 2x20 мл АсОЕ1, органические слои объединяют и промывают насыщенным раствором №С1 (20 мл). После сушки над М^О₄, фильтрации и выпаривания растворителей при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/МеОН 98/2-90/10. Соединение пр.2 получают в виде твердого белого вещества (28,2 мг; 87%). 'Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,77 (д, 1=6, 6 Гц, 3Н); 0,79 (д, 1=6, 6 Гц, 3Н); 1,01 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,04 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,27 (м, 1Н); 1,31 (с, 6Н); 1,53 (м, 1Н); 1,59 (м, 1Н); 1,77 (м, 2Н); 1,82 (м, 1Н); 2,24-2,32 (м, 3Н); 2,34-2,44 (м, 4Н); 2,62-2,76 (м, 4Н); 2,98-3,04 (м, 2Н); 3,15 (м, 1Н); 3,41 (м, 1Н); 3,46 (м, 4Н); 3,48 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,88 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 4,26 (ддд, 1=3,4 и 8,3 и 11,5 Гц, 1Н); 4,88 (дд, 1=3,7 и 10,0 Гц, 1Н); 5,12 (ддд, 1=2,0 и 5,3 и 11,1 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=2,0 и 15,0 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,7 и 11,1 и 15,0 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,0 и 8,3 Гц, 1Н); 7,23 (дд, 1=2,9 и 9,3 Гц, 1Н); 7,27 (д, 1=8,5 Гц, 2Н); 7,29 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 7,32 (д, 1=8,5 Гц, 2Н); 8,35 (д, 1=8,3 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Εδ тА=883 [М+Н]+; тА=881 [М-Н]^-; ΐ_κ=-0,92 мин.

Пример 3. (Е)-(3δ,10Κ,16δ)-10-(3-Хлор-4-меτоксибензил)-3-изобуτил-16-[(δ)-1-((2Κ,3Κ)-3-{4-[(2меркапто-2-метилпропиламино)метил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Η,Ν

Соединение 11. О-Метилоксим 2-метил-2-метилдисульфанилпропиоальдегида

О N ° 11 г (33,3 ммоль) 2-(метилдитио)изобутиральдегида растворяют в 50 мл этанола в инертной атмосфере. Последовательно добавляют 5,56 г (66,54 ммоль) О-метилгидроксиламина в 50 мл этанола, затем 6,65 мл (66,54 ммоль) №ОН. Смесь мутно-белого цвета нагревают с обратным холодильником в течение ночи. После возвращения к КТ смесь выливают в 500 мл воды. Водный слой экстрагируют посредством АсОЕ! (3x175 мл), органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором №С1 (200 мл) и сушат над М^О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД соединение 11 получают в форме бесцветного масла (5,89 г, 32,9 ммоль).

Соединение 12. 2-Метил-2-метилдисульфанилпропиламин

В колбу, продуваемую азотом, последовательно вводят при КТ 1,18 г (9,9 ммоль) простого эфира оксима 11, 19 мл безводного ТНР и 99,5 мл 2 М раствора боранметилсульфида в ТНР. Смесь нагревают 16 ч с обратным холодильником. Затем реакцию останавливают, дают смеси вернуться к КТ, и осторожно добавляют по каплям 100 мл МеОН при 0°С пока происходит пенообразование, затем при КТ. Смесь выпаривают при ПД с образованием около 2,8 г желтого масла, которое обрабатывают 30 мл 5-6н. раствора НС1 в изопропаноле. Смесь нагревают 1 ч с обратным холодильником, затем доводят до КТ в течение ночи. После выпаривания при ПД полученный остаток обрабатывают 80 мл 1н. НС1, затем экстрагируют диэтиловым эфиром (3x20 мл). Водный слой обрабатывают 30% водным раствором аммиака до достижения рН 12,5-13, и 12 мл (водный слой светло-фиолетового цвета) снова экстрагируют 3x20 мл простым эфиром. Органические слои объединяют, сушат над М^О₄, фильтруют и выпаривают досуха при ПД с получением 760 мг неочищенного продукта. Этот остаток окончательно очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ОСМ/МеОН 100/0-90/10. Соединение 12 получают в виде бледножелтого масла (301 мг, 20%). ЖХМС (А2): Εδ тА=152 [М+Н]+; ΐ_κ=0,27 мин.

Соединение 13. (Ε)-(3δ,10Κ,16δ)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(δ)-1-((2Κ,3Κ)-3-{4[(2-метил-2-метилдисульфанилпропиламино)метил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11диазациклоге ксадец- 13-ен-2,5,9,12-тетраон

К раствору, продуваемому аргоном, 25 мг (35 мкмоль) соединения 2 в 3,1 мл безводного НМР, прибавляют последовательно при КТ 9,8 мкл (70 мкмоль) ΤΕΑ и 6,3 мг (42 мкмоль) соединения 12. Перемешивание осуществляют при 40°С. После проведения реакции в течение 72 ч остается исходное соединение 2, тогда добавляют 9,8 мкл (70 мкмоль) ΤΕΑ и 6,3 мг (42 мкмоль) амина 12. После проведения реакции в течение дополнительных 72 ч при 40°С соединение 2 все еще остается: добавляют 6,3 мг (42 мкмоль) амина 12 и перемешивание продолжают при 40°С. Спустя одни сутки реакция полностью завершается.

Смесь разбавляют 10 мл ΑсОΕΐ, промывают 2x10 мл водой, 10 мл насыщенного раствора NаНСОз и

- 35 024627 мл насыщенного раствора №С1. После сушки органического слоя над Мд§О₄ его фильтруют, затем выпаривают при ПД с получением 30 мг неочищенного продукта. Полученный остаток очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 98/2-93/7. Соединение 13 получают в виде белого порошка (23,3 мг; 81%). ТСХ (ИСМ 90/МеОН 10): КР=0,55; ^!Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,76-0,81 (м, 6Н); 1,02 (с, 3Н); 1,07 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,13 (с, 3Н); 1,27-1,33 (м, 7Н); 1,52-1,63 (м, 2Н); 1,82 (схт, >6,8 Гц, 1Н); 2,06 (с шир., 1Н); 2,25-2,34 (м, 1Н); 2,37 (с, 3Н); 2,57 (с, 2Н); 2,66-2,76 (м, 2Н); 2,97-3,06 (м, 3Н); 3,33-3,38 (м, 1Н); 3,75 (с, 2Н); 3,83 (с, 3Н); 3,88 (д, >1,6 Гц, 1Н); 4,27 (ддд, >3,7 и 8,0 и 11,4 Гц, 1Н); 4,93 (дд, 1=3,7 и 9,7 Гц, 1Н); 5,12 (дд, >5,8 и 11,3 Гц, 1Н); 5,82 (дд, >1,5 и 15,2 Гц, 1Н); 6,49 (ддд, >3,8 и 11,3 и 15,2 Гц, 1Н); 7,07 (д, >8,5 Гц, 1Н); 7,18 (дд, >1,9 и 8,5 Гц, 1Н); 7,23 (дд, >2,6 и 9,5 Гц, 1Н); 7,26 (д, >8,2 Гц, 2Н); 7,30 (д, >1,9 Гц, 1Н); 7,35 (д, >8,2 Гц, 2Н); 8,35 (д, >8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=832 [М+Н]+; т/ζ 830 [М-Н]^-; Ιι<=0,96 мин.

Пример 3. (Е)-(3§,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(§)-1-((2К,3К)-3-{4-[(2меркапто-2-метилпропиламино)метил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Продукт 13 (10,6 мг; 12,8 мкмоль) растворяют в смеси этанола (1,5 мл)/воды (1,26 мл). Затем добавляют ТСЕР (9,1 мг, 31,9 мкмоль) и смесь перемешивают 2 ч 30 мин при КТ. Смесь разбавляют добавлением 15 мл АсОЕ! и органический слой промывают смесью 1/1 воды и насыщенного водного раствора ΝΉ₄Ο (5 мл). После сушки органического слоя над Мд§О₄, фильтрации и выпаривания растворителей при ПД неочищенный продукт окончательно очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 98/2-92/8. Соединение пр.3 получают в виде твердого белого вещества (6,4 мг; 63%). ТСХ (ИСМ 90/МеОН 10): К>0,47; Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,80-0,86 (м, 6Н); 1,06 (с, 3Н); 1,11 (д, ί-6,9 Гц, 3Н); 1,18 (с, 3Н); 1,31-1,38 (м, 7Н); 1,57-1,67 (м, 2Н); 1,87 (схт, >6,8 Гц, 1Н); 2,29-2,38 (м, 1Н); 2,56 (с, 2Н); 2,70-2,80 (м, 2Н); 3,00-3,11 (м, 3Н); 3,39-3,43 (м, 1Н); 3,82 (с, 2Н); 3,87 (с, 3Н); 3,92 (д, >1,9 Гц, 1Н);

4,31 (ддд, 1=3,6 и 8,0 и 11,5 Гц, 1Н); 4,97 (дд, >3,7 и 9,7 Гц, 1Н); 5,17 (дд, >5,8 и 11,3 Гц, 1Н); 5,86 (дд, >1,4 и 15,1 Гц, 1Н); 6,54 (ддд, >3,8 и 11,3 и 15,1 Гц, 1Н); 7,11 (д, >8,7 Гц, 1Н); 7,23 (дд, >1,9 и 8,7 Гц, 1Н); 7,27 (дд, >2,7 и 9,6 Гц, 1Н); 7,31 (д, >8,0 Гц, 2Н); 7,34 (д, >1,9 Гц, 1Н); 7,42 (д, >8,0 Гц, 2Н); 8,40 (д, >8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т4=786 [М+Н]+; т4=784 [М-Н]^-; Ц=0,92 мин.

Пример 4. (Е)-(3§,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(§)-1-((2К,3К)-3-{4-[({2меркапто-2-метилпропил}метиламино)метил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 14. Метил-[2-метил-2-метилдисульфанилпроп-(Е)-илиден]амин

г (6,66 ммоль) 2-(метилдитио)изобутиральдегида растворяют в 10 мл безводного ТНР в инертной атмосфере. Прибавляют 2 М раствор метиламина в ТНР (33,3 мл, 66,6 ммоль), затем смесь перемешивают 5 ч при КТ. Разбавляют посредством 50 мл АсОЕ!, промывают водой (30 мл), насыщенным раствором Νηί'Ί (30 мл) и сушат над Мд§О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД получают соединение 14 в виде масла бледно-желтого цвета (1,01 г, 93%). 'Н ЯМР (400 МГц, хлороформ-б): 1,46 (с, 6Н); 2,36 (с, 3Н); 3,32 (с, 3Н); 7,52 (с, 1Н).

Соединение 15. 2-Метил-2-метилдисульфанилпропиламин

Раствор соединения 14 (1,01 г, 6,185 ммоль) в 30 мл ТНР продувают аргоном и охлаждают до 0°С, затем прибавляют при 0°С 1,4 4 г (6,80 ммоль) триацетоксиборгидрида натрия. Перемешивание ведут 15 ч при КТ: исходный имин остается; добавляют при 0°С 1,44 г (6,80 ммоль) триацетоксиборгидрида натрия и 354 мкл (6,185 ммоль) уксусной кислоты, затем перемешивание продолжают при КТ в течение 3 ч. Смесь разбавляют посредством 50 мл АсОЕ! и промывают водой (50 мл). Значение рН водной фазы доводят примерно до 12 добавлением 14 мл 1н. водного раствора гидроксида натрия, затем водный слой экстрагируют диэтиловым эфиром (3x50 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором №-1С1 (50 мл), сушат над Мд§О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД получают соединение 15 в виде бесцветного масла (695 мг, 68%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,25 (с, 6Н); 1,47

- 36 024627 (м уш., 1Н; 2,31 (с, 3Н); 2,38 (с, 3Н); 2,53 (м, 2Н). ЖХМС (А2): Ε8 тА=166 [Μ+Н]? ΐ_Κ=0,28 мин.

Соединение 16. (Ε)-(3§,10Κ,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-{(§)-1-[(2Κ,3Κ)-3-(4{[(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)метиламино]метил}фенил)оксиранил)этил]-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 16 может быть получено нуклеофильным замещением хлоргруппы производного 2 на амин 15, применяя способ, описанный для получения соединения 30.

Пример 4. (Е)-(38,10К,168)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-{(§)-1-[(2К,3К)-3-(4-{[(2меркапто-2-метилпропил)метиламино]метил}фенил)оксиранил]этил}-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение пр.4 может быть получено, применяя способ, описанный для получения примера 6, но исходя из соединения 16.

Пример 5. (Е)-(38,10К,168)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(§)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-(2меркапто-2-метилпропил)пиперазин-1-илметил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 17. трет-Бутил-4-(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)пиперазин-1-карбоксилат

К раствору, продуваемому аргоном, 1-Вос-пиперазина (1,0 г, 5,37 ммоль) в безводном ТНР (20 мл) прибавляют 2-(метилдитио)изобутиральдегид (5,37 ммоль) и изопропоксид титана (IV) (6,71 ммоль). Смесь перемешивают 20 мин при КТ, затем снова прибавляют 2-(метилдитио)изобутиральдегид (5,37 ммоль) и изопропоксид титана (IV) (6,71 ммоль). Перемешивание ведут 2 ч, затем прибавляют 12 мл этанола и перемешивание продолжают 5 мин. После прибавления цианборгидрида натрия (5,37 ммоль) смесь перемешивают 1 час, а затем добавляют дополнительно 5,37 ммоль цианборгидрида натрия. Перемешивание продолжают 1 час. Смесь концентрируют досуха и затем обрабатывают Α^Εΐ. Добавляют воду, и образовавшийся осадок отфильтровывают через фриттированное стекло, промывают с помощью Α^Εΐ и водой. Полученный твердый продукт солюбилизируют в 1н. водном растворе НС1 (50 мл), среду нейтрилизуют 5н. водным раствором №ОН, затем экстрагируют посредством ΌΟΜ. Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором №С1 (50 мл), сушат над Μ§δΟ₄, фильтруют и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируч смесью ^СΜ/метанол 100/0-97/3. Соединение 17 получают в виде бледно-желтого масла (650 мг, 40%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): 1,26 (с, 6Н); 1,39 (с, 9Н); 2,39 (с, 3Н); 2,42 (с, 2Н); 2,44-2,48 (м, 4Н); 3,27 (м частично экранирован, 4Н). ЖХМС (А1): Ε8 т//=321 [М+Н]+; т//=265 пик молекулярного иона; ΐ_Κ=3,02 мин.

Соединение 18. Гидрохлорид 1-(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)пиперазин

К раствору соединения 17 (322 мг, 1,01 ммоль) в диоксане (13 мл) прибавляют 4 М раствор НС1 в диоксане (5 мл). Перемешивание ведут в течение 16 ч при КТ. Смесь фильтруют через фриттированное стекло, полученный твердый продукт промывают диоксаном и получают соединение 18 (231 мг, 90%) в виде белого порошка. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): 1,31 (с шир., 6Н); 2,42 (с, 3Н); 2,59-3,38 (м очень уш., 10Н); 8,78 (м уш., 2Н). ЖХМС (А2): Ε8 тА=221 [Μ+НЦ ΐ_Κ=0,46 мин.

Соединение 19. (Ε)-(3§,10Κ,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-16-[(§)-1((2К,3К)-3-{4-[4-(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)пиперазин-1 -илметил] фенил}оксиранил)этил] 1,4диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен-2,5,9,12-тетраон

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 2 (15,02 мг, 20,93 мкмоль) в безводном ΌΜΤ (0,9 мл), прибавляют раствор соединения 18 (25,12 мкмоль) и ΤΕΑ (52,3 мкмоль) в ΌΜΤ (1 мл).

- 37 024627

Смесь перемешивают при 40°С в атмосфере аргона. После проведения реакции в течение 24 ч добавляют 25,12 мкмоль соединения 18 и 31,4 мкмоль ТЕА. После проведения реакции в течение дополнительных 24 ч при 40°С реакция завершается. Смесь разбавляют АсОЕ! (6 мл) и промывают водой (2x6 мл), насыщенным раствором NаНСΟз (6 мл) и насыщенным раствором Ναί'Ί (6 мл). После сушки над Мд§О₄ органический слой фильтруют, затем выпаривают при ПД с получением 46 мг неочищенного продукта. Остаток очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 100/0-95/5. Соединение 19 получают в виде белого порошка (5,2 мг, 28%). %). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,76 (д, 1=6,4 Гц, 3Н); 0,78 (д, 1=6,4 Гц, 3Н); 1,01 (с, 3Н); 1,06 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,13 (с, 3Н); 1,25 (с, 6Н); 1,27-1,33 (м, 1Н); 1,51-1,63 (м, 2Н); 1,76-1,85 (м, 1Н); 2,23-2,32 (м, 1Н); 2,37 (м, 4Н); 2,39 (с, 3Н); 2,41 (с, 2Н); 2,532,56 (м, 4Н); 2,63-2,76 (м, 2Н); 2,94-3,06 (м, 3Н); 3,34 (м частично экранирован, 1Н); 3,40-3,48 (м, 2Н); 3,82 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 4,26 (ддд, 1=3,8 и 7,8 и 11,3 Гц, 1Н); 4,92 (дд, 1=3,8 и 9,8 Гц, 1Н); 5,075,14 (м, 1Н); 5,81 (д, 1=15,2 Гц, 1Н); 6,48 (ддд, 1=3,8 и 11,3 и 15,2 Гц, 1Н); 7,06 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,18 (дд, ί=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,21-7,32 (м, 6Н); 8,35 (д, 1=8,3 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Е§ тЦ=901 [М+Н]+; тЦ=451 пик молекулярного иона; !_К=4,33 мин.

Пример 5. (Е)-(3§,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(§)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-(2меркапто-2-метилпропил)пиперазин-1-илметил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Продукт 19 (5,7 мг; 6,3 мкмоль) растворяют в смеси этанола (0,8 мл)/воды (0,5 мл). Затем добавляют ТСЕР (4,54 мг, 15,83 мкмоль) и смесь перемешивают 1 ч при КТ. Смесь разбавляют добавлением 7 мл АсОЕ! и органический слой промывают смесью 1/1 воды и насыщенного водного раствора ΝΉ₄Ο (7 мл). После сушки органического слоя над Мд§О₄, фильтрации и выпаривания растворителей при ПД, неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 99/1-95/5. Соединение пр.5 получают в виде твердого белого вещества (2,95 мг; 55%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б6): 0,77 (д, 1=6,3 Гц, 3Н; 0,78 (д, 1=6,3 Гц, 3Н); 1,02 (с, 3Н); 1,06 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,13 (с, 3Н); 1,27 (с, 6Н); 1,29-1,34 (м, 1Н); 1,52-1,63 (м, 2Н); 1,82 (м, 1Н); 2,29 (м, 1Н); 2,37 (с, 2Н); 2,39-2,41 (м, 4Н); 2,57-2,62 (м, 4Н); 2,65-2,76 (м, 2Н); 2,96-3,06 (м, 3Н); 3,34 (м, частично экранирован, 1Н); 3,46 (с, 2Н); 3,83 (с, 3Н); 3,88 (д, ί=2,2 Гц, 1Н); 4,27 (ддд, 1=3,7 и 8,0 и 11,5 Гц, 1Н); 4,93 (дд, 1=3,7 и 9,7 Гц, 1Н); 5,12 (м, 1Н); 5,82 (д, 1=15,2 Гц, 1Н); 6,49 (ддд, 1=3,7 и 11,5 и 15,2 Гц, 1Н); 7,07 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,18 (дд, 1=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,21-7,33 (м, 6Н); 8,36 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Е§ тЦ=855 [М+Н]+; тЦ-428 [М+2Н]²+ пик молекулярного иона; !К=4,13 мин.

Пример 6. (Е)-(3§,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(§)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-({2[2-(2-{2-метил-[2-меркапто-2-метилпропил]аминоэтокси}этокси)этокси]этил}метиламино)метил]фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение 20. Толуол-4-сульфонат 2-{2-[2-(2-гидроксиэтокси)этокси]этокси}этил

К раствору, продуваемому аргоном и охлажденному до 0°С, 5 г (25,74 ммоль) тетраэтиленгликоля в 68,7 мл ЭСМ последовательно прибавляют порциями для поддержания заданного перемешивания 8,95 г (38,61 ммоль) оксида серебра и 5,40 г (28,31 ммоль) тозилхлорида. Прибавляют маленькими порциями 855 мг (5,15 ммоль) К1 для подержания температуры смеси ниже 5°С. Перемешивание продолжают 1 ч при поддержании температуры ниже 5°С. После возвращения в комнатной температуре смесь фильтруют на С1агсе1, остаток промывают посредством ЭСМ, затем фильтрат концентрируют досуха при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве олюента смесь ОСМ/метанол 99/1-95/5. Соединение 20 получают в виде бесцветного масла (5,4 г, 60%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 2,43 (с, 3Н); 3,40 (м, 2Н); 3,44-3,52 (м, 10Н); 3,58 (м, 2Н); 4,11 (м, 2Н); 4,53 (т, 1=5,4 Гц, 1Н); 7,48 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 7,78 (д, 1=8,3 Гц, 2Н). ЖХМС (А2): ЕС тЦ=349 [М+Н]+; тЦ=371 [М+№]+;

!_К=0,69 мин.

Соединение 21. 1-Азидо-3,6,9-триоксаундекан-11-ол

К раствору 5,4 г (15,51 ммоль) соединения 20 в 40,6 мл безводного ацетонитрила прибавляют 1,34 г

- 38 024627 (20,63 ммоль) NаNз, затем смесь нагревают 6 ч 30 мин с обратным холодильником. После возвращения в КТ смесь фильтруют на С1агсе1 и концентрируют при ПД. Остается исходное соединение 20: неочищенный продукт обрабатывают 25 мл безводного ацетонитрила и прибавляют 230 мг (3,5 ммоль) NаNз. Смесь нагревают 5 ч с обратным холодильником. После возвращения в КТ смесь фильтруют на С1агсе1 и концентрируют досуха при ПД с получением соединения 21 в виде масла бледно-желтого цвета (3,37 г, 99%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 3,37-3,43 (м, 4Н); 3,45-3,58 (м, 10Н); 3,60 (м, 2Н); 4,54 (т, ί=5,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=220 [М+Н]+; т//=242 |М+№|' пик молекулярного иона; !_К=0,39 мин.

Соединение 22. Ν-Вос-Аминоэтоксиэтоксиэтоксиэтанол

К раствору, находящемуся в инертной атмосфере аргона, 320 мг 10%-ного палладия на угле в 5 мл АсОЕ! прибавляют раствор 3,25 мг (14,8 ммоль) соединения 21, 6,46 г (29,6 ммоль) третбутилдикарбоната и 4,13 мл (29,6 ммоль) ТЕА в 45 мл АсОЕ!. Рекция протекает в течение 17 ч при 30°С при давлении водорода 2 бар. После возвращения к КТ и ПД смесь фильтруют на С1агсе1 и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 22 получают в виде бесцветного масла (2,92 г, 67%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,37 (с, 9Н); 3,06 (к, 1=6,1 Гц, 2Н); 3,37 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 3,42 (м, 2Н); 3,46-3,53 (м, 10Н); 4,54 (т шир., 1=5,1 Гц, 1Н); 6,71 (т шир., 1=6,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Е8 т//=316 |М+№|'; т//=194 пик молекулярного иона; !_К=2,81 мин.

Соединение сульфонат

23.

2-{2-[2-(2-трет-Бутоксикарбониламиноэтокси)этокси]этокси}этилтолуол-4-

К раствору, продуваемому аргоном, 3,06 г (10,42 мкмоль) соединения 22 в 20 мл ИСМ прибавляют 2,53 мл (31,2 6 ммоль) пиридина. Смесь охлаждают до 0°С, затем прибавляют по каплям раствор 2,98 г (15,63 ммоль) тозилхлорида в 10 мл ИСМ. Перемешивание продолжают 15 ч при КТ. Смесь разбавляют 20 мл ИСМ, промывают насыщенным раствором NаНСОз (30 мл), водой (2x30 мл), насыщенным раствором №аС1 (30 мл) и сушат над Мд8О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/метанол 100/0-90/10. Соединение 23 получают в виде бледно-желтого масла (4,38 г, 94%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6): 1,37 (с, 9Н); 2,42 (с, 3Н); 3,05 (к, 1=6,1 Гц, 2Н); 3,36 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 3,46 (м, 8Н); 3,58 (м, 2Н); 4,10 (м, 2Н); 6,71 (т шир., 1=6,1 Гц, 1Н); 7,48 (д, 1=7,8 Гц, 2Н); 7,78 (д, 1=7,8 Гц, 2Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=448 [М+Н]+; т//=470 [М+№а]+; т//=348 пик молекулярного иона; т//=492 [М-Н+НСО2Н]^-; !К=1,00 мин.

Соединение 24. трет-Бутил-(2-{2-[2-(2-азидоэтокси)этокси]этокси}этил)карбамат

К раствору 4,38 г (9,79 ммоль) соединения 23 в 25 мл ацетонитрила прибавляют 846 мг (13,02 ммоль) азида натрия, затем смесь нагревают 6 ч с обратным холодильником. Содержание исходного соединения остается значительным: после возвращения к КТ добавляют к смеси 1,7 г (26,13 ммоль). Перемешивание поддерживают 24 ч при нагревании с обратным холодильником. После возвращения к КТ смесь фильтруют на С1агсе1 и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 24 получают в виде бледно-желтого масла (2,16 г, 69%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,37 (с, 9Н); 3,06 (к, Л=6,1 Гц, 2Н); 3,34-3,43 (м, 4Н); 3,46-3,58 (м, 8Н); 3,60 (м, 2Н); 6,70 (т шир., 1=6,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=341 [М+№а]+; !_К=0,81 мин.

Соединение 25. трет-Бутил-(2-{2-[2-(2-азидоэтокси)этокси]этокси}этил)метилкарбамат

К раствору, продуваемому аргоном и охлажденному до 0°С, 2,06 г (6,47 ммоль) соединения 24 в 25 мл ТНР последовательно прибавляют при 0°С (порцией) 854 мг (21,35 ммоль) 60%-ного №аН в виде дисперсии в минеральном масле, и 886 мкл (14,23 ммоль)метилиодида. Перемешивание продолжают 1 ч при 0°С, затем 16 ч при КТ. Смесь фильтруют на С1агсе1, промывают ТНР и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/метанол 99/1-90/10. Соединение 25 получают в виде бесцветного масла (1,67 г, 78%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,39 (с, 9Н); 2,80 (с шир., 3Н); 3,29 (т частично экранирован, Д=5,6 Гц, 2Н); 3,38 (м, 2Н); 3,46-3,56 (м, 10Н); 3,60 (т, 1=5,4 Гц, 2Н).

- 39 024627

Соединение 26. трет-Бутил-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этил)метилкарбамат

К раствору, продуваемому аргоном, 1,66 г (4,99 ммоль) соединения 25 в 20 мл ТНР последовательно прибавляют 1,31 г (4,994 ммоль) трифенилфосфина и 108 мкл (5,99 ммоль) воды. Перемешивание продолжают 25 ч 30 мин, затем смесь концентрируют досуха и очищают фильтрацией δРЕ на кондиционированном картридже δСX (Уапап) и промывают метанолом, затем элюируют 0,5н. раствором аммиака в метаноле. Соединение 26 получают в виде бесцветного масла (1,23 г, 80%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСОб₆): 1,39 (с, 9Н); 2,65 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 2,80 (с шир., 3Н); 3,29 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 3,36 (т, 1=5,7 Гц, 2Н); 3,453,56 (м, 10Н). ЖХМС (А2): Еδ т/г=307 [М+Н]+; !_К=0,49 мин.

Соединение 27. трет-Бутилметил-[2-(2-{2-[2-(2-метил-2-метилдисульфанилпропиламино)этокси]этокси}этокси)этил]карбамат ι

О. Ν₄,-_4Λ.^_Χ..Ο .>··,_ -‘.. .N1-1

Ί т ⁰ ' ' ⁰

О 16

К раствору, продуваемому аргоном, 131 мг (426 мкмоль) соединения 26 в 3 мл ИСМ последовательно прибавляют 64 мг (426 мкмоль) 2-метилдитиоизобутиральдегида, 126 мг (596 мкмоль) триацетоксиборгидрида натрия и 24,4 мкл (426 мкмоль) уксусной кислоты. Перемешивание продолжают 6 ч при КТ в атмосфере аргона, реакцию гасят добавлением 1 мл 1н. водного раствора гидроксида натрия, затем смесь экстрагируют 10 мл диэтилового эфира. После концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/изопропанол 90/10, что не позволяет отделить целевой продукт от остаточного исходного амина. Полученный продукт снова очищают хроматографией на колонке с обращенной фазой КР18, используя в качестве элюента смесь воды/ацетонитрила 95/5-5/95. Соединение 27 получают в виде бесцветного масла (67 мг, 36%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,25 (с, 6Н); 1,39 (с, 9Н); 1,58 (м уш., 1Н); 2,38 (с, 3Н); 2,59 (с, 2Н); 2,68 (т, 1=5,6 Гц, 2Н); 2,80 (с шир., 3Н); 3,46 (т, 1=5,6 Гц, 2Н); 3,48-3,54 (м, 12Н). ЖХМС (А1): Еδ т//=441 [М+Н]+; !_К=3, 2 9 мин.

Соединение 28. трет-Бутилметил-{2-[2-(2-{2-[метил-(2-метил-2-метилдисульфанилпропил)амино]этокси}этокси)этокси]этил}карбамат

К раствору, продуваемому аргоном и охлажденному до 0°С, 65 мг (148 мкмоль) соединения 27 в 1 мл ИСМ последовательно прибавляют 19,5 мг (487 мкмоль) 60%-ного ЯаН в виде дисперсии в минеральном масле, и 20 мкл (325 мкмоль)метилиодида. Перемешивание продолжают 45 мин при 0°С, затем 72 ч при КТ. Смесь фильтруют на С1агсе1, затем концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/метанол 99/1-90/10. Соединение 28 получают в виде бесцветного масла (43 мг, 64%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,25 (с, 6Н); 1,39 (с, 9Н); 2,32 (с, 3Н); 2,39 (с, 3Н); 2,54 (с, 2Н); 2,61 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 2,80 (с шир., 3Н); 3,42-3,54 (м, 14Н). ЖХМС (А2): Еδ т//=455 [М+Н]+; !_К=0,77 мин.

Соединение 29. Метил-(2-{2-[2-(2-метиламиноэтокси)этокси]этокси}этил)-(2-метил-2метилдисульфанилпропил)амин

К раствору 43 мг (95 мкмоль) соединения 28 в 1,5 мл ИСМ прибавляют 351 мкл ТРА. Перемешивание продолжают 5 ч при КТ, затем концентрируют досуха. Неочищенный продукт очищают фильтрацией δРЕ на кондиционированном картридже δСX (Уапап) и промывают метанолом, затем элюируют 0,5н. раствором аммиака в метаноле. Соединение 29 получают в виде бесцветного масла (25 мг, 75%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,25 (с, 6Н); 1,75 (м уш., 1Н); 2,27 (с, 3Н); 2,32 (с, 3Н); 2,39 (с, 3Н); 2,53 (м, 2Н); 2,57-2,64 (м, 4Н); 3,44 (т, 1=5,7 Гц, 2Н); 3,46-3,55 (м, 10Н). ЖХМС (А2): Еδ т//=355 [М+Н]+; !_К=0,30 мин.

Соединение 30. (Е)-(3δ,10Κ,16δ)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(δ)-1-((2Κ,3Κ)-3-{4[4-({2-[2-(2-{2-метил-[2-метил-2-метилдисульфанилпропил]аминоэтокси}этокси)этокси]этил}метиламино)метил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен-2,5,9,12тетраон

К раствору, продуваемому аргоном, 15,3 мг (21,3 мкмоль) соединения 2 в 1 мл безводного ацетонитрила последовательно прибавляют 18,6 мкл (106,6 мкмоль) ИГРЕА и раствор 22,7 мг (64 мкмоль) соединения 29 в 1 мл безводного ацетонитрила. Перемешивание продолжают 24 ч в атмосфере аргона при

- 40 024627

40°С. После возвращения к КТ смесь разбавляют 7 мл АсОЕ!, промывают водой (2x3 мл), насыщенным раствором NаНСОз (3 мл), насыщенным раствором №аС1 (3 мл) и сушат над Мд§О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 90/10. Соединение 30 получают в виде твердого бесцветного вещества (14,6 мг, 68%). 'ΐ I ЯМР (500 МГц, ДМСО-й₆): 0,76 (д, 1=6,1 Гц, 3Н); 0,76 (д, 1=6,1 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,04 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,24 (с, 6Н); 1,29 (м, 1Н); 1,50-1,62 (м, 2Н); 1,81 (м, 1Н); 2,15 (с, 3Н); 2,27 (м, 1Н); 2,31 (с, 3Н); 2,38 (с, 3Н); 2,45-2,54 (м частично экранирован, 4Н); 2,60 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 2,63-2,75 (м, 2Н); 2,92-3,06 (м, 3Н); 3,25-3,35 (м частично экранирован, 1Н); 3,44-3,54 (м, 14Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,9 и 8,3 и 11,7 Гц, 1Н); 4,91 (дд, 1=3,4 и 9,8 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,7 и 11,5 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,5 и 15,5 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,5 и 11,5 и 15,5 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,8 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,0 и 8,8 Гц, 1Н); 7,20-7,26 (м, 3Н); 7,27-7,33 (м, 3Н); 8,35 (д, 1=8,3 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е§ т//=1035 [М+Н]+; пик молекулярного иона т//=518 [М+2Н]²+; !_к=0,86 мин.

К раствору 10,9 мг (10,5 мкмоль) соединения 30 в 1,24 мл этанола прибавляют раствор 12,06 мг (42,1 мкмоль) ТСЕР в 1,04 мл воды. Перемешивание ведут 4 ч при КТ. Смесь разбавляют 6 мл АсОЕ!, промывают смесью 1/1 воды/NН₄С1_нас. (6 мл), насыщенным раствором №аС1 (6 мл) и сушат над М§§О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя смесь ЭСМ/метанол 99/1-90/10. Соединение пр.6 получают в виде твердого белого вещества (7,36 мг, 71%). 'II ЯМР (500 МГц, ДМСО-й₆): 0,76 (д, 1=5,9 Гц, 3Н); 0,78 (д, 1=5,9 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,04 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,25 (с, 6Н); 1,28 (м, 1Н); 1,51-1,62 (м, 2Н); 1,80 (м, 1Н); 2,15 (с, 3Н); 2,27 (м, 1Н); 2,34 (с, 3Н); 2,44 (с, 2Н); 2,51 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 2,60 (с, 1Н); 2,63 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 2,662,74 (м, 2Н); 2,93-3,04 (м, 3Н); 3,25-3,37 (м частично экранирован, 1Н); 3,45-3,55 (м, 14Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=1,5 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,7 и 8,0 и 11,5 Гц, 1Н); 4,91 (дд, 1=3,4 и 9,8 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,6 и 11,5 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,5 и 15,2 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,9 и 11,5 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,8 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,8 Гц, 1Н); 7,20-7,26 (м, 3Н); 7,27-7,32 (м, 3Н); 8,35 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Е§ т//=989 [М+Н]+; пик молекулярного иона т//=495 [М+2Н]²+; !_к=3,24 мин.

Пример 7. (Е)-(3§,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(§)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-({2[2-(2-{4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламиноэтокси}этокси)этокси]этил}метиламино)метил]фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен-2,5,9,12-тетраон

О

С1 о

Соединение 31. трет-Бутилметил-[2-(2-{2-[2-(4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламино)этокси]этокси}этокси)этил]карбамат

270 мг (649 мкмоль) соединения 4, 199 мг (649 мкмоль) соединения 26 растворяют в 1,5 мл ЭМР, затем к смеси прибавляют 100 мкл (714 мкмоль) ТЕА. Перемешивание проводят 16 ч при КТ. Смесь разбавляют 10 мл АсОЕ!, промывают водой (2x5 мл), насыщенным раствором №аС1 (5 мл) и сушат над М§§О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 31 получают в виде бесцветного масла (251 мг, 80%). 'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): 1,24 (с, 6Н); 1,39 (с, 9Н); 1,79 (м, 2Н); 2,16 (м, 2Н); 2,40 (с, 3Н); 2,80 (с шир., 3Н); 3,18 (кв., 1=5,9 Гц, 2Н); 3,39 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 3,453,54 (м, 12Н); 7,88 (т шир., 1=5,9 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т/ζ 483 [М+Н]+; т//=505 [М+№а]+; т^=527 [М-Н+НСО₂Н]^-; !_к=1,0 4 мин.

Соединение 32. №-(2-{2-[2-(2-Метиламиноэтокси)этокси]этокси}этил)-4-метил-4-метилдисульфанилпентамид

К раствору 251 мг (520 мкмоль) соединения 31 в 8 мл ЭСМ прибавляют 1,93 мл (26 ммоль) ТРА. Перемешивание продолжают 3 ч при КТ, затем смесь концентрируют досуха. Неочищенный продукт растворяют в минимальном количестве ЭСМ, затем проводят несколько раз перегонку с толуолом. Неочищенный продукт очищают фильтрацией §РЕ на кондиционированном картридже §СХ Аапап) и промывают метанолом, затем элюируют 0,5н. раствором аммиака в метаноле. Соединение 32 получают в

- 41 024627 виде бесцветного масла (159 мг, 80%). ^!Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,24 (с, 6Н); 1,79 (м, 2Н); 2,15 (м, 2Н); 2,27 (с, 3Н); 2,40 (с, 3Н); 2,58 (т, 1=5,7 Гц, 2Н); 3,18 (к, 1=5,7 Гц, 2Н); 3,39 (т, 1=5,7 Гц, 2Н); 3,44 (т, 1=5,7 Гц, 2Н); 3,47-3,54 (м, 8Н); 7,89 (т шир., 1=5,7 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): ЕЗ т//=383 [М+Н]+; !_К=2,68 мин.

Пример 7. (Е)-(3З,10К,16З)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(З)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-({2[2-(2-{4-метил-4-метилдисульфанилпентаноиламиноэтокси}этокси)этокси]этил}метиламино)метил]фенил}оксиранил)этил]-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-циазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Соединение примера 7 может быть получено путем нуклеофильного замещения хлоргруппы производного 2 на амин 32, применяя способ, описанный для получения соединения 30, с последующим восстановлением дисульфида с помощью способа, описанного для получения примера 6.

Пример 8. (Е)-(3З,10К,16З)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-{(З)-1-[(2К,3К)-3-(4меркаптометилфенил)оксиранил]этил}-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12тетраон /V о ,- I ⁴ ·· γН$ Л О О ΗΝ С1 > т , ι ιί ;ι г о / и ° - V

Соединение 33. Димер примера 8

О

Соединение 2 (24,5 мг; 34,1 мкмоль) растворяют в безводном ТНР (2,5 мл) и смесь охлаждают до -10°С и затем добавляют гексаметилдисилатиан (44,3 мкмоль), затем 1М раствор тетрабутиламмонийфторида в ТНР (40,9 мкмоль). Смесь возвращают к КТ и продолжают перемешивание 1 ч 30 мин. Смесь разбавляют добавлением АсОЕ! (5 мл) и органический слой промывают насыщенным водным раствором ИН₄С1 (5 мл). Водный слой экстрагируют АсОЕ! (2x5 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным водным раствором №С1 (5 мл). После сушки над М§ЗО₄ и фильтрации растворители выпаривают при ПД. Неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 100/0-97/3. Получают соединение 33 в виде белого твердого вещества (19 мг, 78%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 0,78 (м, 12Н); 1,00 (с, 6Н); 1,04 (д, 1=6,8 Гц, 6Н); 1,11 (с, 6Н); 1,30 (м, 2Н); 1,49-1,63 (м, 4Н); 1,82 (м, 2Н); 2,26 (м, 2Н); 2,63-2,72 (м, 4Н); 2,93-3,05 (м, 6Н); 3,25-3,37 (м частично экранирован, 2Н); 3,81 (с, 6Н); 3,82 (с, 4Н); 3,89 (д, 1=2,0 Гц, 2Н); 4,25 (ддд, 1=3,7, 8,0 и 11,5 Гц, 2Н); 4,91 (дд, 1=3,7, 9,6 Гц, 2Н); 5,10 (ддд, 1=1,3, 5,3 и 10,8 Гц, 2Н); 5,79 (дд, 1=1,3, 15,3 Гц, 2Н); 6,47 (ддд, 1=3,7, 10,8 и 15,3 Гц, 2Н); 7,05 (д, 1=8,6 Гц, 2Н); 7,17 (дд, 1=2,0, 8,6 Гц, 2Н); 7,22 (дд, 1=2,5, 9,3 Гц, 2Н); 7,26-7,32 (м, 10Н); 8,34 (д, 1=8,0 Гц, 2Н). ЖХМС (А2): ЕЗ т//=1427 [М+Н]+; !_К=1,31 мин.

Пример 8. (Е)-(3З,10К,16З)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-{(З)-1-[(2К,3К)-3-(4меркаптометилфенил)оксиранил]этил}-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12тетраон

Соединение 33 (11 мг; 7,7 мкмоль) растворяют в метаноле (8,8 мл). Затем прибавляют ТСЕР (76,7 мкмоль), растворенный в 2,2 мл воды, и смесь перемешивают 2 ч при КТ. Смесь разбавляют 20 мл АсОЕ! и органический слой промывают смесью 1/1 воды и насыщенного водного раствора ИН₄С1 (20 мл). Водный слой экстрагируют АсОЕ! (2x15 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным водным раствором №С1 (15 мл). После сушки над М§ЗО₄ и фильтрации растворители выпаривают при ПД.

Неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 100/0-95/5. Получают соединение пр.8 в виде белого твердого вещества (4,7 мг, 31%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б6): 0,79 (д, 1=6,4 Гц, 6Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,30 (м, 1Н); 1,50-1,63 (м, 2Н); 1,80 (м, 1Н); 2,27 (м, 1Н); 2,62-2,75 (м, 2Н); 2,84 (т шир., 1=6,5 Гц, 1Н); 2,93-3,06 (м, 3Н); 3,34 (м частично экранирован, 1Н); 3,73 (д шир., 1=6,5 Гц, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=1,6 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,7, 8,0 и 11,4 Гц, 1Н); 4,91 (дд, 1=3,6, 9,6 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,3, 5,3 и 11,4 Гц, 1Н); 5,79 (дд, 1=1,3, 15,2 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,4, 11,3 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=1,9, 8,5 Гц, 1Н); 7,22 (дд, 1=2,3, 9,5 Гц, 1Н); 7,25 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 7,28 (д, 1=1,9 Гц, 2Н); 7,35 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 8,34 (д, 1=8,0 Гц, 2Н). ЖХМС (А2): ЕЗ т^=715 [М+Н]+; т//=713 [М-Н]^-; !К=1,18 мин.

- 42 024627

Пример 9. 1ш2Н11-8РОВ-пр.1.

Согласно общему описанию двухстадийного способа 10,4 мг (0,071 мкмол, 1,174 мл) голого антитела 1ш2Н11 с первоначальной концентрацией 8,8 6 мг/мл обрабатывают 7 экв. Νгидроксисукцинимидилового сложного эфира 4-(2-пиридилдитио)бутановой кислоты (0,16 мг, 0,496 мкмоль), растворенного в 34,2 мкл ОМА таким образом, чтобы в смеси конечная концентрация антител была 8 мг/мл. После очистки получают 2,2 мл антител 1ш2Н11 в концентрации 4,28 мг/мл (9,42 мг, 91%), модифицированных в среднем 4,68 молекулами пиридилсульфида на антитело. Обрабатывают 1,68 мл (7,2 мг, 0,04 9 мкмоль) модифицированных антител 1ш2Н11 с помощью 1,0 3 мг (Е)-(38,10К,168)-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-16-[(8)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-(4-меркапто-4-метилпентаноил)пиперазин1-илметил]фенил}оксиранил)этил]-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраона (соединение пр.1, 1,148 мкмоль), растворенного в 101,2 мкл ОМА. После очистки на 8иретБех в присутствии 10% ИМР и концентрирования на аппарате Аписон иИта-15, окончательную замену буфера производят в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М фосфата и 0,14 М ИаС1. Получают 1,5 мл конъюгата пр. 9 в концентрации 1,1 мг/мл, содержащего в среднем 3 производных криптофицина на антитело (НКМ8) и с мономерной чистотой 99,9%.

Пример 10. 1ш2Н11-8РЭВ-пр.2

Согласно описанию общего способа в одну стадию 13,5 мг (0,092 мкмол, 1,318 мл) голого антитела 1ш2Н11 с первоначальной концентрацией 10,24 мг/мл обрабатывают 6 экв. Νгидроксисукцинимидилового сложного эфира 4-(2-пиридилдитио)бутановой кислоты (0,18 мг, 0,551 мкмоль), растворенного в 38,4 мкл ОМА так, чтобы в смеси конечная концентрация антител была 9 мг/мл. После перемешивания в течение 2 ч со скоростью примерно 2000 об/мин при КТ к 1,333 мл (12,0 мг, 0,081 мкмоль) смеси с модифицированым антителом 1ш2Н11 последовательно прибавляют 1,760 мл буфера рН«7,5-8, 543 мкл ОМА, затем 1,73 мг (Е)-(38,6К,10К,168)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3изобутил-16-[(8)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-(4-меркапто-4-метилпентаноил)пиперазин-1-илметил]фенил}оксиранил)этил]-6-метил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраона (соединение пр. 2, 1,958 мкмоль), растворенного в 18 2 мкл ОМА. После очистки на 8иретБех в присутствии 20% ИМР и концентрирования на приборе Атюоп иИта-15, окончательную замену буфера производят в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М гистидина, 10% сахарозы (м/об) и 5% ИМР (об./об.). Получают 1,5 мл конъюгата пр.10 в концентрации 2,83 мг/мл, содержащего в среднем 3,7 производных криптофицина на антитело (НКМ8) и с мономерной чистотой 98,8%.

Пример 11. 1ш2Н11-8РЭВ-пр.5

Согласно описанию общего способа в одну стадию 9,45 мг (0,064 мкмол, 0,923 мл) голого антитела 1ш2Н11 с первоначальной концентрацией 10,24 мг/мл обрабатывают 6 экв. Игидроксисукцинимидилового сложного эфира 4-(2-пиридилдитио)бутановой кислоты (0,13 мг, 0,398 мкмоль), растворенного в 26,88 мкл ОМА так, чтобы в смеси конечная концентрация антитела была 9 мг/мл. После перемешивания в течение 2 ч со скоростью примерно 2000 об/мин при КТ к 1,0 мл (9,0 мг, 0,061 мкмоль) реакционной среды с модифицированым антителом 1ш2Н11 последовательно прибавляют 1,45 мл буфера рН«7,5-8, 265 мкл ОМА, затем 1,26 мг (Е)-(38,10К,168)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3изобутил-16-[(8)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-(2-меркапто-2-метилпропил)пиперазин-1-илметил]фенил}оксиранил) этил]-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраона (соединение пр.5, 1,472 мкмоль), растворенного в 285 мкл ОМА. После очистки на 8иретБех в присутствии 20% ИМР и концентрирования на приборе Атюоп иИта-15, окончательную замену буфера производят в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М гистидина, 10% сахарозы (м/об) и 5% ИМР (об./об.). Получают 2,5 мл конъюгата пр. 12 в концентрации 1,7 0 мг/мл, содержащего в среднем 3,7/3,1 производных криптофицина на антитело (ИУ/НКМ8) и с мономерной чистотой 98,0%.

- 43 024627

Пример 12. 1ш2Н11^РЭВ-пр.6

Согласно описанию общего способа в одну стадию 10,31 мг (0,070 мкмол, 1,006 мл) голого антитела 1ш2Н 11 с первоначальной концентрацией 10,24 мг/мл обрабатывают 6 экв. Νгидроксисукцинимидилового сложного эфира 4-(2-пиридилдитио)бутановой кислоты (0,14 мг, 0,429 мкмоль), растворенного в 29,32 мкл ОМА так, чтобы в смеси конечная концентрация антитела была 9 мг/мл. После перемешивания в течение 2 ч со скоростью примерно 2000 об/мин при КТ к 1,1 мл (9,9 мг, 0,067 мкмоль) смеси с модифицированным антителом Ьи2Н11 последовательно прибавляют 1,595 мл буфера рН«7,5-8, 291 мкл ОМА, затем 1,60 мг (Е)-(3δ,10К,16δ)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил16-[^)-1-((2К,3К)-3-{4-[4-({2-[2-(2-{2-метил-[2-меркапто-2-метилпропил]аминоэтокси}этокси)этокси]этил}метиламино)метил] фенил}оксиранил)этил] -6,6-диметил-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 ен-2,5,9,12-тетраона (соединение пр.6, 1,617 мкмоль), растворенного в 314 мкл ОМА. После очистки на δире^йеx в присутствии 20% NМР и концентрирования на приборе Атюоп иИга-15, окончательную замену буфера производят в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М гистидина, 10% сахарозы (м/об.) и 5% NМР (об./об.). Получают 3 мл конъюгата пр.12 в концентрации 1,97 мг/мл, содержащего в среднем 3,4 производных криптофицина на антитело (НКМБ) и с мономерной чистотой 99,8%.

Пример 13. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(4-{4-[(2К,3К)-3-((δ)-1-{(Е)-(3δ,10К,16δ)-10-[3-хлор-4метоксибензил]-3-изобутил-6,б-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен16-ил}этил)оксиранил] бензил} пиперазин-1 -ил)ацетат

Соединение 3 4. трет-Бутил-4-метоксикарбонилметилпиперазин-1 -карбоксилат

Растворяют 200 мг (1,07 ммоль) трет-бутилпиперазин-1-карбоксилата в безводном ацетонитриле (10 мл). Прибавляют ТЕА (1,07 ммоль), затем метилбромацетат (1,61 ммоль). Белую суспензию перемешивают 48 ч при КТ, после чего вводят насыщенный водный раствор NаНСΟз (10 мл). Водный слой экстрагируют ЭСМ (3x10 мл), органические слои объединяют, промывают насыщенным водным раствором Ν;·ιΟ и сушат над М^О₄. После фильтрации и выпаривания растворителей при ПД получают неочищенный продукт реакции. Этот неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ОСМ/метанол 98/2. Получают целевой продукт 34 в виде бесцветного масла (174,8 мг; 63%). ТСХ (ЭСМ 90/МеОН 10): КГ=0,66; Ή ЯМР (300 МГц, ДМСО-й₆): 1,39 (с, 9Н); 2,40-2,48 (м, 4Н); 3,25 (с, 2Н); 3,28-3,33 (м частично экранирован, 4Н); 3,61 (с, 3Н).

Соединение 35. Гидрохлорид метилпиперазин-1-илацетата

Соединение 34 (174 мг; 0,67 ммоль) растворяют в безводном диоксане (5 мл) и прибавляют 4 М раствор НС1 в диоксане (0,02 ммоль). Смесь перемешивают 5 ч при КТ, затем суспензию фильтруют через фриттированное стекло. Полученный твердый продукт промывают диоксаном (2 мл), затем изопропиловым эфиром (2 мл), и после этого сушат в вакууме. Получают соединение 35 в виде твердого вещества бежевого цвета (131 мг; 100%). Ή ЯМР (300 МГц, ДМСО-й₆): 2,88-2,97 (м, 4Н); 3,09-3,19 (м, 4Н); 3,53-3,59 (м, 2Н); 3,65 (с, 3Н); 8,65-9,22 (м уш., 2Н).

Соединение 36. Метил-(4-{4-[(2К,3К)-3-((δ)-1-{(Е)-(3δ,10К,16δ)-10-[3-хлор-4-метоксибензил]-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензил}пиперазин-1-ил)ацетат

Производное 1 (20 мг; 28,6 мкмоль) растворяют в безводном ЭСМ (1 мл) и ТЕА (71,5 мкмоль), затем прибавляют СМБ (45,8 мкмоль). После проведения реакции в течение 12 ч при КТ образовавшийся продукт 2 не выделяют. Добавляют ТЕА (85,7 мкмоль), затем вводят гидрохлорид метилпиперазин-1илацетата 35 (42,8 мкмоль). Смесь перемешивают дополнительно 72 ч при КТ, затем добавляют безводный ОМЕ (1 мл) и №П (30 мкмоль). Смесь перемешивают 48 ч при 45°С, затем разбавляют посредством АсОЕ! (5 мл). Органический слой промывают водой (2x2 мл), насыщенным водным раствором NаНСΟз

- 44 024627 (2 мл) и насыщенным водным раствором МаС1 (2 мл). После сушки над Мд8О₄ и фильтрации растворители выпаривают при ПД. Неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 100/0-98/2. Получают соединение 36 в виде твердого белого вещества (8,2 мг; 34%). ТСХ (ИСМ 90/МеОН 10): Κί=0,45; ^!Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-Д6): 0,77 (д, 1=6,1 Гц, 3Н); 0,78 (д, 1=6,1 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=7,1 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,27-1,32 (м, 1Н); 1,50-1,60 (м, 2Н); 1,74-1,84 (м, 1Н); 2,21-2,30 (м, 1Н); 2,37 (с шир., 4Н); 2,64-2,74 (м, 2Н); 2,94-3,06 (м, 3Н); 3,18-3,52 (м, частично экранирован, 9Н); 3,60 (с, 3Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 4,20-4,31 (м, 1Н); 4,91 (дд, 1=3,8 и 9,9 Гц, 1Н); 5,11 (м, 1Н); 5,80 (д, 1=15,2 Гц, 1Н); 6,48 (ддд, 1=3,8 и 11,2 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,3 Гц, 1Н); 7,20-7,33 (м, 6Н); 8,34 (д, 1=8,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Е8 т//=839 [М+Н]+; т//=420 [М+2Н]²+ (пик молекулярного иона); т//=837 [М-Н]^-; т//=883 [М+НСО2Н-Н](пик молекулярного иона); 0=3,57 мин.

Соединение 37. Аллилбромацетат

Растворяют 288 мг (4,95 ммоль) аллилового спирта в 25 мл ИСМ. Раствор охлаждают до 0°С, затем прибавляют 760 мкл (5,45 ммоль) ТЕА и 3,03 мг (24,8 мкмоль) ИМАР. Смесь перемешивают при 0°С, затем прибавляют 1,0 г (4,95 ммоль) бромацетилбромида. Реакцию продолжают в течение ночи при КТ. К смеси добавляют воду; водный слой промывают посредством ИСМ. Органические слои объединяют, промывают водой и насыщенным раствором МаС1 и сушат над Мд8О₄. После фильтрации и выпаривания растворителей при ПД получают продукт 37 (747 мг, 84%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-Д₆): 4,18 (с, 2Н); 4,64 (тд, 1=1,5 и 5,4 Гц, 2Н); 5,25 (кв.д, 1=1,5 и 10,5 Гц, 1Н); 5,35 (кв.д, 1=1,5 и 17,2 Гц, 1Н); 5,92 (тдд, 1=5,4 и 10,5 и 17,2 Гц, 1Н).

Соединение 38. трет-Бутил-4-аллилоксикарбонилметилпиперазин-1 -карбоксилат

К раствору 200 мг (1,07 ммоль) 1-Вос-пиперазина в 8 мл ацетонитрила прибавляют 150 мкл (1,07 ммоль) ТЕА и 250 мг (1,40 ммоль) аллилбромацетата 37. Смесь перемешивают в течение ночи при КТ. Реакцию останавливают добавлением насыщенного раствора МаНСО₃. Смесь экстрагируют посредством АсОЕ! (3 раза); органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором МаС1 и сушат над Мд8О₄. После фильтрации и выпаривания растворителей при ПД неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 100/0-95/5. Получают целевой продукт 38 в виде желтого масла (314 мг; 100%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-Д₆): 1,39 (с, 9Н); 2,45-2,48 (м, 4Н); 3,25-3,34 (м частично экранирован, 6Н); 4,57 (тд, 1=1,5 и 5,6 Гц, 2Н); 5,22 (кд, 1=1,5 и 10,3 Гц, 1Н); 5,30 (кд, 1=1,5 и 17,1 Гц, 1Н); 5,83-5,98 (м, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 тО=285 [М+Н]+; тО=229 пик молекулярного иона; 0=0,51 мин.

Соединение 39. Гидрохлорид аллилпиперазин-1-илацетата

О

О г'· Ν- О 9 Г ΝΗ НС!

л -----а м

Растворяют 314 мг (1,10 ммоль) соединения 38 в 12,6 мл диоксана, затем добавляют 5,5 мл (22,0 ммоль) 4 М раствора НС1 в диоксане. Перемешивание осуществляют в течение ночи при КТ. Смесь концентрируют досуха с получением целевого соединения 39 в виде желтого масла (260 мг, 100%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-Д₆): 2,79-2,88 (м, 4Н); 3,07-3,15 (м, 4Н); 3,48-3,51 (м, 2Н); 4,60 (тд, 1=1,5 и 5,6 Гц, 2Н); 5,23 (кд, 1=1,5 и 10,3 Гц, 1Н); 5,32 (кд, 1=1,5 и 7,4 Гц, 1Н); 5,86-5,98 (м, 1Н); 8,74 (с шир., 2Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=185 [М+Н]+; 0=0,19 мин.

Соединение 40. Аллил-(4-{4-[(2К,3К)-3-((8)-1-{(Е)-(38,10К,168)-10-[3-хлор-4-метоксибензил]-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензил}пиперазин-1-ил)ацетат

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 2 (28,3 мг, 39,5 мкмоль) в безводном ацетонитриле (2,5 мл) прибавляют раствор соединения 39 (118,5 мкмоль) и ТЕА (198 мкмоль) в безводном ацетонитриле (1 мл). Перемешивание ведут 24 ч при 40°С. Смесь разбавляют АсОЕ! (10 мл). Органический слой промывают водой (10 мл), насыщенным водным раствором МаНСО₃ (10 мл), насыщенным водным раствором МаС1 (10 мл). После сушки над Мд8О₄ и фильтрации растворители выпаривают при ПД. Неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 98/2. Соединение 40 получают в виде твердого белого вещества (19,2 мг, 56%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-Д₆): 0,75 (д, 1=6,3 Гц, 3Н); 0,77 (д, 1=6,3 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,25-1,33 (м,

- 45 024627

1Н); 1,50-1,61 (м, 2Н); 1,74-1,84 (м, 1Н); 2,27 (дт, 1=11,3 и 14,2 Гц, 1Н); 2,32-2,42 (м, 4Н); 2,52 (м частично экранирован, 4Н); 2,64-2,74 (м, 2Н); 2,94-3,05 (м, 3Н); 3,25 (с, 2Н); 3,32-3,35 (м частично экранирован, 1Н); 3,40-3,48 (м, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=1,6 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,7 и 8,0 и 11,6 Гц, 1Н); 4,56 (тд, 1=1,5 и 5,5 Гц, 2Н); 4,91 (дд, 1=3,7 и 9,7 Гц, 1Н); 5,11 (м, 1Н); 5,21 (кв.д, 1=1,5 и 10,5 Гц, 1Н); 5,30 (кв.д, 1=1,5 и 17,3 Гц, 1Н); 5,80 (д, 1=16,2 Гц, 1Н); 5,86-5,95 (м, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,8 и 11,2 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,19-7,32 (м, 6Н); 8,34 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Εδ т//=865 [М+Н]+; т//=433,5 [М+2Н]²+ (пик молекулярного иона); т//=863 [М-Н]^-; т//=909 [М+НСО2НН]^-; ΐκ=0,92 мин.

Соединение 41. (4-{4-[(2Κ,3Κ)-3-((δ)-1-{(Ε)-(3δ,10Κ,16δ)-10-[3-Хлор-4-меτоксибензил]-3-изобуτил6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-дчазациклогекоадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензил}пиперазин-1-ил)уксусная кислота

К раствору, находящемуся в атмосере аргона, соединения 40 (12,8 мг, 14,8 мкмоль) в безводной ТНР прибавляют тетракис(трифенилфосфин)палладий (1,48 мкмоль) и морфолин (148 мкмоль). После 3 ч реакции смесь концентрируют досуха и обрабатывают 5 мл ЭСМ. Органический слой промывают 1 мл 0,1н. раствора НС1 в 3 мл воды (рН«5), сушат над М^О₄, фильтруют и выпаривают с получением соединения 41 (6,7 мг, 55%). ^!Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б6): 0,76 (д, 1=6,0 Гц, 3Н); 0,78 (д, 1=6,0 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,28 (м, 1Н); 1,52-1,59 (м, 2Н); 1,76-1,84 (м, 1Н); 2,21-2,32 (м, 1Н); 2,42 (д, 1=6,6 Гц, 4Н); 2,58-2,76 (м, 6Н); 2,97-3,09 (м, 3Н); 3,14 (с шир., 2Н); 3,33 (м экранирован, 1Н); 3,46 (с шир., 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=1,8 Гц, 1Н); 4,20-4,29 (м, 1Н); 4,89-4,93 (м, 1Н); 5,06-5,14 (м, 1Н); 5,80 (д, 1=15,2 Гц, 1Н); 6,43-6,50 (м, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,20-7,32 (м, 6Н); 8,34 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Εδ т//=825 [М+Н]+; т//=413 [М+2Н]²+ (пик молекулярного иона); т//=823 [М-Н]; 1К=0,86 мин.

Пример 13. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(4-{4-[(2Κ,3Κ)-3-((δ)-1-{(Е)-(3δ,10Κ,16δ)-10-[3-хлор-4метоксибензил] -3 -изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен16-ил}этил)оксиранил] бензил} пиперазин-1 -ил)ацетат

Соединение примера 13 может быть получено активированием кислоты 41 согласно способу, описанному для примера 18.

Пример 14. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(2-{2-[2-(2-{4-[(2Κ,3Κ)-3-((δ)-1-{(Ε)-(3δ,10Κ,16δ)-10-[3хлор-4-метоксибензил]-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец13 -ен-16-ил}этил)оксиранил] бензиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение 42. Аллил-3-(2-{2-[2-(2-трет-бутоксикарбониламиноэтокси)этокси]этокси}-этокси)пропаноат

К раствору Вос-15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановой кислоты (50 мг, 137 мкмоль) в 1,25 мл ЭСМ последовательно прибавляют гидрохлорид БЭС1 (164,2 мкмоль), ОМАР (13,7 мкмоль) и аллиловый спирт (164,2 мкмоль). Смесь перемешивают при КТ в течение 16 ч, затем выпаривают досуха. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 100/0-95/5. Соединение 42 получают в виде бесцветного масла (37,5 мг, 67%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,37 (с, 9Н); 2,57 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 3,06 (кв., 1=6,1 Гц, 2Н); 3,37 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 3,44-3,53 (м, 12Н); 3,64 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 4,55 (тд, 1=1,6 и 5,4 Гц, 2Н); 5,20 (кв.д, 1=1,6 и 10,5 Гц, 1Н); 5,30 (кв.д, 1=1,6 и 17,3 Гц, 1Н); 5,90 (тдд, 1=5,4 и 10,5 и 17,3 Гц, 1Н); 6,70 (т шир., 1=6,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Εδ тА=406 [М+Н]+; тА=428 |М+№|'; т//=306 пик молекулярного иона; ίκ=0,91 мин.

Соединение 43. Гидрохлорид аллил-3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропаноата

К раствору соединения 42 (37,5 мг, 92,5 мкмоль) в 2 мл диоксана прибавляют 460 мкл (1,85 ммоль) 4 М раствора соляной кислоты в диоксане. Перемешивание ведут в течение ночи при КТ, затем реакционную среду выпаривают досуха с получением соединения 43 в виде бесцветного масла (31 мг, количе- 46 024627 ственный выход). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ά..): 2,58 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 2,96 (т, 1=5,4 Гц, 2Н); 3,48-3,53 (м, 8Н); 3,55-3,58 (м, 4Н); 3,60 (т, 1=5,4 Гц, 2Н); 3,65 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 4,56 (тд, 1=1,6 и 5,4 Гц, 2Н); 5,21 (кв.д, 1=1,6 и 10,5 Гц, 1Н); 5,30 (кв.д, 1=1,6 и 17,3 Гц, 1Н); 5,91 (тдд, 1=5,4 и 10,5 и 17,3 Гц, 1Н); 7,91 (м ушир., 3Н). ЖХМС (А2): Ε8 тА=306 [Μ+НЦ !_к=0,42 мин.

Соединение 44. (2-{2-[2-(2-{4-[(2Κ,3Κ)-3-((8)-1-{(Ε)-(38,10Κ,168)-10-[3-Хлор-4-метоксибензил]-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 2 (12,7 мг, 17,7 мкмоль) в 1,48 мл безводного ацетонитрила прибавляют последовательно 22,2 мкл 'ΓΕΑ (159 мкмоль) и 30,2 мг соединения 43 (88,4 мкмоль). Перемешивание ведут в течение 24 ч при 40°С: остается исходное соединение 2; снова к смеси прибавляют 22,2 мкл ΤΕΑ (159 мкмоль) и 30,2 мг соединения 43 и (88,4 мкмоль) и перемешивание продолжают дополнительно в течение 48 ч при 40°С. К смеси прибавляют 2 мл воды, затем смесь экстрагируют 2x2 мл Α^Εΐ. Органические слои объединяют, промывают насыщенным водным раствором ΝηНСО₃ (2 мл), насыщенным раствором хлорида натрия (2 мл) и сушат над Μ§δΟ₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ^СΜ/метанол 100/0-95/5. Соединение 44 получают в виде твердого белого вещества (4,8 мг, 27%). Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-А): 0,77 (м, 6Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,29 (м, 1Н); 1,49-1,60 (м, 2Н); 1,81 (м, 1Н); 2,26 (м, 1Н); 2,56 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 2,61-2,73 (м, 4Н); 2,93-3,04 (м, 3Н); 3,28-3,38 (м частично экранирован, 1Н); 3,45-3,53 (м, 14Н); 3,63 (т, 1=6,1 Гц, 2Н);3,72 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,86 (с шир., 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,4 и 8,2 и 11,4 Гц, 1Н); 4,55 (дм, 1=5,4 Гц, 2Н); 4,90 (дд, 1=3,9 и 9,8 Гц, 14); 5,11 (ддд, 1=1,4 и 5,4 и 11,2 Гц, 1Н); 5,19 (дм, 1=10,8 Гц, 1Н); 5,29 (дм, 1=17,2 Гц, 1Н); 5,79 (дд, 1=1,4 и 15,2 Гц, 1Н); 5,90 (м, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,9 и 11,2 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,8 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,0 и 8,8 Гц, 1Н); 7,21 (м, 1Н); 7,24 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 7,28 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 7,33 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 8,35 (д, 1=8,2 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Ε8 т//=986 [Μ+НЦ т//=493,5 [Μ+2Π|²+ пик молекулярного иона; т//=984 [Μ-Н]^-; т//=1030 [Μ-Н+НСОД ^- пик молекулярного иона; !_К=0,95 мин.

Пример 14. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(2-{2-[2-(2-{4-[(2Κ,3Κ)-3-((8)-1-{(Ε)-(38,10Κ,168)-10-[3хлор-4-метоксибензил]-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец13 -ен-16-ил}этил)оксиранил] бензиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение примера 14 может быть получено путем удаления защиты с соединения 44 согласно способу, описанному для соединения 41 и активацией полученной кислоты согласно способу, описанному для примера 18.

Пример 15. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(2-{2-[2-(2-{4-[(2К,3К)-3-((8)-1-{(Е)-(38,10К,168)-10-[Зхлор-4-метоксибензил]-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензилметиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение 45 си]пропановая кислота но,.

Г о

3-[2-(2-{2-[2-(трет-Бутоксикарбонилметиламино)этокси]этокси}этокси)эток-

Растворяют 520 мг (1,423 ммоль) Вос-15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекановой кислоты в 14 мл безводного ТНР, затем смесь охлаждают до 0°С, после этого прибавляют порциями с помощью шпателя 85,4 мг (2,135 ммоль) гидрида натрия. Перемешивание ведут в течение 10 мин при 0°С, затем прибавляют 150,6 мкл (2,419 ммоль)метилиодида при 0°С. Дают температуре вернуться в КТ и продолжают перемешивание 2 ч. Добавляют к смеси 8 мл воды и затем подкисляют смесь добавлением уксусной кислоты для получения рН«4. Экстрагируют 3x10 мл Α^Εΐ. Органические слои объединяют, промывают 10 мл насыщенным раствором №С1 и сушат над Μ^^ψ После фильтрации и концентрирования досуха при ПД получают соединение 45 в виде бесцветного масла (414 мг, 77%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-й6): 1,38 (с, 9Н); 2,43 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 2,80 (с шир., 3Н); 3,29 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 3,45-3,52 (м, 14Н); 3,60 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 12,01 (м уш., 1Н); ЖХМС (А2): Ε8 ιη/ζ=402 [Μ+№]+; тА=378 [Μ-Н]^-; т//=280 пик молекулярного иона; !К=0,95 мин.

- 47 024627

Соединение 46. си)этокси] пропаноат

НО Х-. ^о. [,

О

Алил-3-[2-(2-{2-[2-(трет-бутоксикарбонилметиламино)этокси]этокси}эток-

К раствору 540 мг (1,423 ммоль) соединения 45 в 15 мл безводного ЭСМ последовательно прибавляют 327 мг (1,71 ммоль) ЕЭС1, 17,4 мг (142 мкмоль) ОМАР и 116 мкл (1,71 ммоль) аллилового спирта. Перемешивание ведут 15 ч при КТ, затем смесь концентрируют досуха. Полученный неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 100/0-90/10. Получают соединение 46 в виде бесцветного масла (337 мг; 56%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,38 (с, 9Н); 2,57 (т, Л=6,1 Гц, 2Н); 2,80 (с шир., 3Н); 3,22-3,33 (м частично экранирован, 2Н); 3,44-3,54 (м, 14Н); 3,64 (т, 1=6,1 Гц, 2Н); 4,55 (д шир., 1=4,9 Гц, 2Н); 5,20 (д шир., 1=10,3 Гц, 1Н); 5,30 (д шир., 1=17,1 Гц, 1Н); 5,90 (м, 1Н); ЖХМС (А2): ЕЗ ιη/ζ=442 |М+№|'; тЦ=320 пик молекулярного иона; 0=0,98 мин.

Соединение 47. Алил-3-(2-{2-[2-(2-метиламиноэтокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

К раствору 337 мг (0,802 ммоль) соединения 46 в 20 мл ЭСМ прибавляют 1,19 мл (16,04 ммоль) ТРА. Перемешивание ведут в течение 3 ч при КТ, затем смесь концентрируют досуха при ПД. Полученный неочищенный продукт очищают путем ЗРЕ фильтрации на кондиционированном картридже ЗСХ (Уапап) и промывают метанолом, затем элюируют 0,5н. раствором аммиака в метаноле. Соединение 47 получают в виде бесцветного масла (208 мг, 81%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 2,27 (с, 3Н); 2,54-2,61 (м, 4Н); 3,44 (т, 1=5,6 Гц, 2Н); 3,47-3,52 (м, 12Н); 3,65 (т, 1=6,2 Гц, 2Н); 4,56 (д шир., Д=5,4 Гц, 2Н); 5,20 (д шир., 1=10,5 Гц, 1Н); 5,30 (д шир., 1=17,2 Гц, 1Н); 5,90 (м, 1Н); ЖХМС (А2): ЕЗ тЦ=320 [М+Н]+; 0=0, 4 2 мин.

Соединение 48. Аллил-(2-{2-[2-(2-{4-[(2К,3К)-3-((З)-1-{(Е)-(3З,10К,16З)-10-[3-хлор-4-метоксибензил]-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16ил}этил)оксиранил]бензиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 2 (40 мг, 55,7 мкмоль) в 5 мл безводного ацетонитрила последовательно прибавляют 48,5 мкл Э1РЕА (279 мкмоль) и 53 мг соединения 47 (167 мкмоль). Перемешивание ведут в течение 15 ч при 40°С; к смеси прибавляют 5 мл воды, затем смесь экстрагируют 4x5 мл АсОЕР Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором NаНСОз (5 мл), насыщенным раствором №С1 (5 мл) и сушат над М§ЗО₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 100/0-90/10. Соединение 48 получают в виде твердого бесцветного вещества (45,3 мг; 80%). ЯМР ¹Н (500 МГц, ДМСО-б6): 0,76 (д, 1=5,9 Гц, 3Н); 0,78 (д, 1=5,9 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,04 (д, Д=6,8 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,29 (м, 1Н); 1,50-1,61 (м, 2Н); 1,80 (м, 1Н); 2,15 (с, 3Н); 2,28 (м, 1Н); 2,52 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 2,56 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 2,63-2,73 (м, 2Н); 2,94-3,06 (м, 3Н); 3,25-3,35 (м частично экранирован, 1Н); 3,48 (с, 2Н); 3,49-3,51 (м, 12Н); 3,52 (т, >6,4 Гц, 2Н); 3,63 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=1,5 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,4 и 8,3 и 11,5 Гц, 1Н); 4,55 (д шир., 1=5,0 Гц, 2Н); 4,91 (дд, 1=3,7 и 9,5 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,7 и 11,5 Гц, 1Н); 5,19 (дм, 1=10,3 Гц, 1Н); 5.29 (дм, 1=17,6 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,5 и 15,2 Гц, 1Н); 5,90 (м, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,7 и 11,5 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,0 и 8,5 Гц, 1Н); 7,22 (дд, 1=2,9 и 9,8 Гц, 1Н); 7,25 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 7,28 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 7.30 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 8,35 (д, 1=8,3 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): ЕЗ тЦ=1000 [М+Н]+; тЦ=500,5 [М+2Н]²+; тЦ=1044 [М-Н+НСО2Н]^-; 0=1, 01 мин.

Соединение 49. (2-{2-[2-(2-{4-[(2К,3К)-3-((З)-1-{(Е)-(3З,10К,16З)-10-[3-Хлор-4-метоксибензил]-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропановая кислота

Растворяют 19 мг (18,9 мкмоль) соединения 48 в 3,8 мл безводного ТНР и продувают аргоном. К смеси прибавляют 6 мкл (18,9 мкмоль) диэтиламина и перемешивают 15 мин при КТ, затем добавляют 4,45 мг (19,8 мкмоль) ацетата палладия(П) и 18,89 мг трифенилфосфина на носителе. Перемешивание ведут в течение 6 суток при КТ: исходное соединение еще остается, но реакция дальше не развивается. Смесь фильтруют, концентрируют досуха, поглощают посредством 2 мл безводного ТНР и обрабатывают 10 мкл (31,5 мкмоль) диэтиламина и 10 мл тетракис(трифенилфосфин)палладия в течение 1 ч. Смесь гидролизуют посредством 2 мл 2 М водного раствора гидросульфата натрия и экстрагируют 3x2 мл ЭСМ. Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором №С1 (2 мл) и сушат над М§ЗО₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографи- 48 024627 ей на силикагеле с привитыми диольными группами, элюируя смесью ИСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 49 получают в виде твердого бесцветного вещества (5,4 мг; 30%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,76 (т, 1=5,9 Гц, 3Н); 0,78 (т, >5,9 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,04 (д, >6,8 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,31 (м, 1Н); 1,51-1,62 (м, 2Н); 1,80 (м, 1Н); 2,15 (с, 3Н); 2,28 (м, 1Н); 2,42 (т, >6,4 Гц, 2Н); 2,52 (т, >6,4 Гц, 2Н); 2,642,73 (м, 2Н); 2,94-3,04 (м, 3Н); 3,25-3,44 (м частично экранирован, 3Н); 3,45-3,51 (м, 12Н); 3,53 (т, >6,4 Гц, 2Н); 3,59 (т, >6,4 Гц, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, >2,0 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, >4,2 и 7,8 и 11,5 Гц, 1Н); 4,91 (дд, 1=3,4 и 9,8 Гц, 1Н); 5,11 (дд, >5,4 и 11,2 Гц, 1Н); 5,80 (д, 1=15,2 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,7 и 11,2 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,0 и 8,3 Гц, 1Н); 7,21-7,27 (м, 3Н); 7,28-7.32 (м, 3Н); 8,38 (д шир., 1=7,8 Гц, 1Н); 11,22 (м оч. ушир., 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=960 [М+Н]+; т//=480,5 [М+2Н]²+ пик молекулярного иона; т//=958 [М-Н]^-; 1|<=0,90 мин.

Пример 15. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(2-{2-[2-(2-{4-[(2К,3К)-3-((8)-1-{(Е)-(38,10К,168)-10-[3хлор-4-метоксибензил]-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензилметиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат кислота

Соединение примера 15 может быть получено путем активирования кислоты 49 согласно способу, описанному для примера 18.

Пример 16. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(2-{2-[2-(4-{(2К,3К)-3-[(§)-1-((Е)-(3§,10К,16§)-10-{3-хпор4-метоксибензил}-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен16-ил)этил]оксиранил}бензилпиперазин-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение 50. 3-{2-[2-(2-Гидроксиэтокси)этокси]этокси}пропановая кислота

К раствору 300 мг (1,08 ммоль) трет-бутил-12-гидрокси-4,7,10-триоксадодеканоата в 6 мл ИСМ прибавляют 1,6 мл (21,56 ммоль) ТРА. Перемешивание ведут в течение 3 ч при КТ. Смесь концентрируют досуха, обрабатывают минимальным количеством ИСМ и несколько раз осуществляют перегонку с толуолом с получением соединения 50 в виде бледно-желтого масла (240 мг, количественный выход).

Соединение 51. Аллил-3 -{2-[2-(2-гидроксиэтокси)этокси]этокси}пропаноат

К раствору 240 мг (1,08 ммоль) соединения 50 в 3 мл ИСМ последовательно прибавляют 248 мг (1,29 ммоль) ЕИС1, 13,2 мг (1,29 ммоль) ИМАР и 88 мкл (1,29 ммоль) аллилового спирта. Перемешивание ведут в течение 15 ч при КТ, затем смесь концентрируют досуха при ПД и неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/метанол 98/2-90/10. Получают соединение 51 в виде бесцветного масла (144 мг, 51%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 2,57 (т, 1=6,2 Гц, 2Н); 3,41 (м, 2Н); 3,46-3,52 (м, 10Н); 3,65 (т, 1=6,2 Гц, 2Н); 4,52 (т, 1=5,5 Гц, 1Н); 4,56 (м, 2Н); 5,20 (дм, 1=10,5 Гц, 1Н); 5,50 (дм, 1=17,4 Гц, 1Н); 5,90 (м, 1Н).

Соединение 52. трет-Бутил-4-(2-{2-[2-(2-аллилоксикарбонилэтокси)этокси]этокси}этил)пиперазин1-карбоксилат

К раствору, охлажденному до 0°С, 94 мг (357 мкмоль) соединения 51 в 3,7 мл ИСМ последовательно прибавляют 125 мкл (893 мкмоль) ТЕА и 30,4 мкл (393 мкмоль) мезилхлорида, перемешивание осуществляют в течение 1 ч при КТ. Смесь концентрируют досуха при ПД, затем обрабатывают 5 мл ацетонитрила. К раствору прибавляют 249 мкл (1,785 ммоль) ТЕА и 200 мг (1,071 ммоль) Вос-пиперазина, смесь перемешивают и нагревают 15 ч при 40°С. После возвращения к комнатной температуре смесь концентрируют досуха и очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ИСМ/метанол 98/2-90/10. Получают соединение 52 в виде бесцветного масла (69 мг, 45%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 1,39 (с, 9Н); 2,33 (м, 4Н); 2,46 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 2,57 (т, 1=6,2 Гц, 2Н);3,28 (м частично экранирован, 4Н); 3,45-3,53 (м, 10Н); 3,64 (т, 1=6,2 Гц, 2Н); 4,55 (м, 2Н); 5,20 (дм, 1=10,5 Гц, 1Н); 5,30 (дм, 1=17,2 Гц, 1Н); 5, 90 (м, 1Н).

Соединение 53. Аллил-3-{2-[2-(2-пиперазин-1-илэтокси)этокси]этокси}пропаноат

К раствору 110 мг (256 мкмоль) соединения 52 в 10 мл ИСМ прибавляют 380 мкл (5,11 ммоль) ТРА.

- 49 024627

Перемешивание продолжают 24 ч при КТ. Смесь концентрируют досуха, обрабатывают минимальным количеством ИСМ и затем проводят несколько перегонок с толуолом. Неочищенный продукт очищают фильтрацией 8ΡЕ на кондиционированном картридже 8СХ ^апап) и промывают метанолом, затем элюируют 0,5н. раствором аммиака в метаноле. Соединение 53 получают в виде бесцветного масла (47 мг, 55%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 2,58 (т, 1=6,2 Гц, 2Н); 3,10-3,36 (м шир., 6Н); 3,45-3,78 (м частично экранирован, 16 Н); 4,56 (м, 2Н); 5,20 (дм, 1=10,5 Гц, 1Н); 5,30 (дм, 1=17,2 Гц, 1Н); 5,90 (м, 1Н); 9,00 (м уш., 1Н).

Соединение 54. Аллил-(2-{2-[2-(4-{(2К,3К)-3-[(8)-1-((Е)-(38,10К,168)-10-{3-хлор-4метоксибензил}-3 -изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен16-ил)этил]оксиранил}бензилпиперазин-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение 54 может быть получено путем нуклеофильного замещения хлоргруппы производного 2 на амин 53, используя способ, описанный для получения соединения 30.

Соединение 55. (2-{2-[2-(4-{(2К,3К)-3-[(8)-1-((Е)-(38,10К,168)-10-{3-Хлор-4-метоксибензил}-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил)этил]оксиранил}бензилпиперазин-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропановая кислота

Соединение 55 может быть получено согласно способу, описанному для соединения 41.

Пример 16. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(2-{2-[2-(4-{(2К,3К)-3-[(8)-1-((Е)-(38,10К,168)-10-{3-хлор4-метоксибензил}-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен16-ил)этил]оксиранил}бензилпиперазин-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение примера 16 может быть получено согласно способу, описанному для примера 18. Пример 17. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2К,3К)-3-((8)-1-{(Е)-(10К,168)10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензил}пиперазин-1-ил)-1,1-диметил-4-оксобутилсульфанил]ацетиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение 56. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-3-(2-{2-[2-(2-{2-бромацетиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

К раствору 3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты (671 мг, 2,53 ммоль) в ИСМ (10 мл) прибавляют раствор 2,5-диоксопирролидин-1-илбромацетата (2,53 ммоль) в 4,7 мл ИСМ. Перемешивание продолжают 15 мин при КТ, затем к смеси прибавляют ЭСС. После 4 ч проведения реакции смесь фильтруют через фриттированное стекло, затем фильтрат выпаривают и очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 99/1-94/6. Полученное масло (800 мг) снова очищают хроматографией на силикагеле с привитыми цианогруппами, элюируя смесью ИСМ/метанол 99/1. Получают соединение 56 в виде бесцветного масла (611 мг, 50%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б6): 2,81 (с, 4Н); 2,92 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 3,23 (к, 1=5,9 Гц, 2Н); 3,43 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 3,48-3,55 (м, 12Н); 3,72 (т, 1=5,9 Гц, 2Н); 3,85 (с, 2Н); 8,30 (т шир., 1=5,9 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т/ζ 483 [М+Н]+; т//=481 [М-Н]^-; !К=0,51 мин.

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 2 (19,8 мг, 27,6 мкмоль) в безводном ацетонитриле (2,5 мл) последовательно прибавляют ТЕА (138 мкмоль) и гидрохлорид 4-метил-4-метилдисульфанил-1- 50 024627 пиперазин-1-илпентан-1-она 6 (83 мкмоль).

Перемешивание осуществляют при 40°С в течение 24 ч, затем смесь разбавляют посредством АсОЕ! (10 мл). Органический слой промывают водой (2x10 мл), насыщенным водным раствором NаНСΟз (10 мл) и насыщенным водным раствором №С1 (10 мл). После сушки над Мд§О₄ и фильтрации растворители выпаривают при ПД. Неочищенный продукт реакции очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 99/1-90/10. Получают соединение 7 в виде белого порошка (19,4 мг; 75%). ТСХ (ЭСМ 90/МеОН 10): К=0,6; Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆): 0,75-0,81 (м, 6Н); 1,01 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,26 (с, 6Н); 1,28-1,33 (м, 1Н); 1,52-1,61 (м, 2Н); 1,76-1,83 (м, 2Н); 2,27-2,38 (м, 4Н); 2,39 (с, 3Н); 2,64-2,74 (м, 2Н); 2,95-3,05 (м, 2Н); 3,24-3,34 (м, 6Н); 3,44 (шир. с, 4Н); 3,49 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,88 (д, 1=1,7 Гц, 1Н); 4,22-4,29 (м, 1Н); 4,92 (дд, 1=9,9, 3,5 Гц, 1Н); 5,08-5, 15 (м, 1Н); 5,81 (д, 1=14,2 Гц, 1Н); 6,48 (ддд, 1=15,2, 11,3, 3,5 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,6 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=8,4, 2,3 Гц, 1Н); 7,22 (д, 1=9,3 Гц, 1Н); 7,25-7,34 (м, 5Н); 8,34 (д, 1=8,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А1): Е§ тЦ=943 [М+Н]+; тЦ=941 [М-Н]^-;

!_К=4,03 мин.

Примечание: соединение 7 может быть получено также из О=ОМ5 (см. пример 1).

Соединение пр.1. (Е)-(3§,10К,16§)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-16-[(§)1-((2К,3К)-3-{4-[4-(4-меркапто-4-метилпентаноил)пиперазин-1-илметил]фенил}оксиранил)-этил]-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон о

I

Ν , N

О и

-· N

Пп1 '3 ’ о ,с /с

- ° ί

ΗΝ ·

Ν О

Η

С1 о

Соединение 7 (17,9 мг; 18,97 мкмоль) растворяют в смеси этанола (2,2 мл)/воды (1,8 мл) и смесь встряхивают. Затем добавляют ТСЕР (47,4 мкмоль) и смесь перемешивают 3 ч при КТ, затем разбавляют введением АсОЕ! (20 мл) и органический слой промывают смесью 1/1 воды и насыщенного водного раствора МН₄С1 (20 мл), затем 20 мл насыщенного раствора ЫаС1. После сушки органического слоя над Мд§О₄, фильтрации и выпаривания растворителей при ПД получают продукт пр. 1 в виде твердого белого вещества (15,6 мг; 92%). ТСХ (ТОСМ 90/МеОН 10); К=0,56; Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,76-0,81 (м, 6Н); 1,01 (с, 3Н); 1,06 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,13 (с, 3Н); 1,24 (с, 6Н); 1,27-1,31 (м, 1Н); 1,56-1,64 (м, 2Н); 1,73-1,85 (м, 3Н); 2,26-2,33 (м, 3Н); 2,36-2,45 (м, 4Н); 2,63-2,75 (м, 2Н); 2,95-3,06 (м, 3Н); 3,34-3.36 (м, 1Н); 3,42-3,51 (м, 6Н); 3,82 (с, 3Н); 3,89 (с, 1Н); 4,22-4,29 (м, 1Н); 4,92 (дд, 1=9,8, 3,4 Гц, 1Н); 5,12 (дд, 1=10,8, 4,9 Гц, 1Н); 5,81 (д, 1=15,2 Гц, 1Н); 6,48 (ддд, 1=15,0, 11,4, 3,4 Гц, 1Н); 7,06 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 7,18 (дд, 1=8,3, 1,5 Гц, 1Н); 7,24 (д, 1=9,8 Гц, 1Н); 7,26-7,36 (м, 5Н); 8,37 (д, 1=7,8 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е§ т//=897 [М+Н]+; т/ζ 895 [М-Н]^-; !_К=0,97 мин.

Пример 17. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2К,3К)-3-((§)-1-{(Е)-(10К,16§)10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензил}пиперазин-1-ил)-1,1-диметил-4-оксобутилсульфанил]ацетиламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

К раствору, продуваемому аргоном, соединения пр.1 (15,6 мг, 17,8 мкмоль) в безводном ацетонитриле (1,0 мл) последовательно прибавляют Э1РЕА (19,12 мкмоль) и соединение 56 (19,12 мкмоль). Перемешивание ведут в течение 4 ч при КТ, затем вводят дополнительно 29,5 мкмоль Э1РЕА и перемешивание продолжают в течение 16 ч. На следующие сутки прибавляют дополнительно 2 9,5 мкмоль соединения 56 и Э1РЕА и смесь нагревают при 50°С. После дополнительных 24 ч реакции прибавляют 22,6 мкмоль соединения 56 и 29,5 мкмоль Э1РЕА и смесь нагревают при 60°С в течение дополнительных 24 ч. Затем нагревание прекращают и продолжают перемешивание при КТ в течение 64 ч. Смесь разбавляют 10 мл АсОЕ! и органический слой промывают водой 2x10 мл, затем 10 мл насыщенного раствора ЫаС1. После сушки органического слоя над Мд§О₄, фильтрации и выпаривания растворителей при ПД, неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ОСМ/метанол 99/1-90/10. Получают продукт пр.17 в виде бесцветного твердого вещества (9,2 мг; 41%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСОб6): 0,77-0,82 (м, 6Н); 1,02 (с, 3Н); 1,06 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,13 (с, 3Н); 1,23 (с, 6Н); 1,26-1,35 (м, 1Н); 1,521,64 (м, 2Н); 1,68-1,77 (м, 2Н); 1,78-1,86 (м, 1Н); 2,26-2,33 (м, 3Н); 2,35-2,41 (м, 4Н); 2,68-2,76 (м, 2Н); 2,82 (с, 4Н); 2,93 (т, 1=6.0 Гц, 2Н); 2,96-3,07 (м, 4Н); 3,13 (с, 2Н); 3,20 (кв., 1=5,8 Гц, 2Н); 3,33 (м, 1Н); 3,38-3,57 (м, 18Н); 3,73 (т, 1=5,8 Гц, 2Н); 3,83 (с, 3Н); 3,89 (с, 2Н); 4,27 (м, 1Н); 4,93 (дд, 1=3,8 и 10,0 Гц, 1Н); 5,13 (м, 1Н); 5,82 (д, 1=15,4 Гц, 1Н); 6,49 (ддд, 1=3,8 и 11,1 и 15,4 Гц, 1Н); 7,07 (д, 1=8,8 Гц, 1Н); 7,157,37 (м, 7Н); 8,01 (т, 1=5,8 Гц, 1Н); 8,35 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е§ тЦ=1299 [М+Н]+; тЦ=650 [М+2Н]²+; т/ζ 1297 [М-Н]^-; !К=0,92 мин.

- 51 024627

Пример 18. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-3-(2-{2-[2-(2-{4-[^^)-3-(^)-1-{(Е)-^,10К,^)-10-[3хлор-4-метоксибензил]-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензилоксикарбониламино}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение 58. 4-Нитрофенил-4-(^^)-3-{^)-1-[(Е)-^,10К,^)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил]этил}оксиранил)бензилкарбонат

Производное 57 (20 мг; 28,6 мкмол, получено согласно А1-а\уаг Κ.δ., е! а1., 1. Меб. СЬет. 2003, 46, 2985-3007) растворяют в безводном ИСМ (0,3 мл), раствор продувают аргоном и затем прибавляют сначала ТЕА (40 мкмоль), затем 4-нитрофенилхлорформиат (32,32 мкмоль). Спустя 3 ч 30 мин перемешивания при КТ смесь гидролизуют и разбавляют в 7 мл АсОЕ!. Органический слой промывают водой, затем насыщенным раствором ЯаС1, сушат над М^О₄, фильтруют и выпаривают досуха с получением соединения 58 в виде твердого белого вещества (23 мг, 93%). ЖХМС (А3): Еδ т//=864 [М+Н]+; т//=908 [М+НСО₂Н-Н]^-; !_К=1,43 мин.

Соединение 59. 3-(2-{2-[2-(2-{4-[^^)-3-(^)-1-{(Е)-^,10К,^)-10-[3-Хлор-4-метоксибензил]-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензилоксикарбониламино}этокси) этокси]этокси}этокси)пропановая кислота

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 58 (23 мг, 26,6 мкмоль) в безводном ацетонитриле (1,6 мл) последовательно прибавляют 3-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}этокси)пропионовую кислоту (39,9 мкмоль) и ТЕА (53,2 мкмоль). После перемешивания при КТ в течение 24 ч смесь разбавляют посредством 10 мл АсОЕ!. Органический слой промывают 10 мл воды, содержащей 250 мкл 0,1н. НС1 (рН«4). Водный слой экстрагируют 10 мл АсОЕ! (2 раза); органические слои объединяют, промывают 10 мл воды, затем 10 мл насыщенного раствора ЯаС1, сушат над М^О₄, фильтруют и выпаривают досуха с получением соединения 59 в виде твердого вещества очень бледно-желтого цвета (18,5 мг, 70%). ЖХМС (А3): Еδ т/ζ 990 [М+Н]+; т/ζ 988 [М-Н]^-; !_К=1,32 мин.

К раствору, продуваемому аргоном, соединения 59 (18,5 мг, 18,6 мкмоль) в ТНР (1,5 мл) последовательно прибавляют ИГРЕА (55,8 мкмоль) и Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат (37,2 мкмоль). После 19 ч перемешивания при КТ смесь разбавляют 10 мл АсОЕ!, промывают 10 мл воды (2 раза), затем 10 мл насыщенного раствора ЯаС1, сушат над М^О₄ и выпаривают досуха. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью гептан/АсОЕ! 100/0-0/100, содержащей 10% изопропанола. Продукт пр.17 получают в виде твердого белого вещества (6,08 мг; 30%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б6): 0,83-0,88 (м, 6Н); 0,97 (д, 1=7,1 Гц, 3Н); 1,02 (с, 3Н); 1,15 (с, 3Н); 1,47-1,56 (м, 1Н); 1,58-1,68 (м, 2Н); 1,821,90 (м, 1Н); 2,39-2,47 (м, 1Н); 2,60-2,66 (м, 1Н); 2,71 (дд, 1=11,5 и 14,4 Гц, 1Н); 2,80 (с, 4Н); 2.91 (т, 1=6,0 Гц, 2Н); 2,94-3,07 (м, 3Н); 3,14 (кв., 1=6,0 Гц, 2Н); 3,37-3,56 (м частично экранирован, 15Н); 3,71 (т, 1=6,0 Гц, 2Н); 3,79 (м, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 4,27 (ддд, 1=3,8 и 8,0 и 11,3 Гц, 1Н); 4,96-5,05 (м, 3Н); 5,11 (м, 1Н); 5,88 (д, 1=15,4 Гц, 1Н); 6,48 (ддд, 1=3,8 и 11,3 и 15,4 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,8 Гц, 1Н); 7,14-7,39 (м, 8Н); 8,40 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Еδ т//=108 [М+Н]+; т//=1085 [М-Н]^-; !К=1,09 мин.

- 52 024627

Пример 19. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(1-{4-[(2К,3К)-3-((δ)-1-{(Е)-(3δ,10К,16δ)-10-[3-хлор-4метоксибензил] -3 -изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен16-ил}этил)оксиранил]бензил}-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)бутаноат

Соединение 60. (Е)-(3К,10К,16δ)-16-{(δ)-1-[(2К,3К)-3-(4-Азидометилфенил)оксиранил]этил}-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

К раствору, продуваемому аргоном, 60 мг (85,8 мкмоль) соединения 1 в 9 мл безводного ТНЕ прибавляют 25,9 мкл (120 мкмоль) дифенилфосфоразида. Смесь перемешивают при КТ в течение 10 мин, затем охлаждают до 0°С, после этого добавляют 18,0 мкл (120 мкмоль) ΌΒΉ. Перемешивание проводят при КТ в течение 15 ч. Реакция полностью не завершена: прибавляют 25,9 мкл (120 мкмоль) цифенилфосфоразида и 18,0 мкл (120 мкмоль) ЭВи, затем продолжают перемешивание в течение 24 ч. В реакции остается еще исходное соединение 1: снова добавляют 25,9 мкл (120 мкмоль) дифенилфосфоразида и 18,0 мкл (120 мкмоль) ЭВи, затем перемешивание продолжают в течение 24 ч. Реакционную среду гидролизуют введением 6 мл воды, затем экстрагируют посредством ЭСМ (3x6 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором Ν;·ιΟ (8 мл) и сушат над М^О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 100/0-90/10. Соединение 60 получают в виде твердого белого вещества (46 мг; 74%). ^!Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-й6): 0,76 (д, 1=6,3 Гц, 3Н); 0,78 (д, 1=6,3 Гц, 3Н);1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,30 (м, 1Н); 1,49-1,63 (м, 2Н); 1,82 (м, 1Н); 2,27 (м, 1Н); 2,63-2,74 (м, 2Н); 2,95-3,05 (м, 3Н); 3,25-3,38 (м частично экранирован, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 3,92 (д, 1=1,9 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,6 и 8,0 и 11,5 Гц, 1Н); 4,46 (с, 2Н); 4,92 (дд, 1=3,6 и 9,6 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,7 и 11,3 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,5 и 15,1 Гц, 1Н); 6,48 (ддд, 1=3,8 и 11,3 и 15,1 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,6 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,6 Гц, 1Н); 7,22 (дд, 1=2, 6 и 9,5 Гц, 1Н); 7,28 (д, 1=2,2 Гц, 1Н); 7,34 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 7,38 (д, 1=8,3 Гц, 2Н); 8,34 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Еδ т/ζ 724 [М+Н]+; т/ζ 722 [М-Н]^-; т/ζ 768 [МН+НСО2Н]^- пик молекулярного иона; !_К=1,18 мин.

Соединение 61. (1-{4-[(2К,3К)-3-((δ)-1-{(Е)-(3К,10К,16δ)-10-[3-Хлор-4-меτоксибензил]-3-изобуτил6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензил}-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)бутановая кислота

К суспензии 22 мг (30,4 мкмоль) соединения 60 в 500 мкл воды прибавляют раствор 6,8 мг (60,8 мкмоль) 5-гексиновой кислоты в 500 мкл ТНЕ. Затем прибавляют 122 мкл (12,2 мкмоль) 0,1 М водного раствора сульфата меди и 122 мкл (24,3 мкмоль) 0,2 М водного раствора аскорбата натрия. Перемешивание продолжают в течение 2 ч при КТ. Смесь гидролизуют добавлением 2 мл воды, затем экстрагируют посредством АсОЕ! (3x2 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором №С1 (3 мл) и сушат над МдδΟ₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 61 получают в виде твердого белого вещества (19,4 мг, 76%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-й₆): 0,73 (д, 1=6,4 Гц, 3Н); 0,75 (д, 1=6,4 Гц, 3Н);1,00 (с, 3Н); 1,04 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,11 (с, 3Н); 1,29 (м, 1Н);

I, 50-1,59 (м, 2Н); 1,76-1,85 (м, 3Н); 2,20-2,30 (м, 3Н); 2,62 (т, 1=7,7 Гц, 2Н); 2,65-2,72 (м, 2Н); 2,94-3,04 (м, 3Н); 3,28-3,38 (м частично экранирован, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 3,89 (д, 1=1,6 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,6 и 8,0 и

II, 5 Гц, 1Н); 4,90 (дд, 1=3,6 и 9,6 Гц, 1Н); 5,10 (ддд, 1=1,6 и 5,2 и 11,2 Гц, 1Н); 5,53 (с, 2Н); 5,78 (дд, 1=1,6 и 15,0 Гц, 1Н); 6,46 (ддд, 1=3,7 и 11,2 и 15,0 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=1,9 и 8,5 Гц, 1Н); 7,22 (дд, 1=2,3 и 9,5 Гц, 1Н); 7,28 (д, 1=1,9 Гц, 1Н); 7,31 (с, 4Н); 7,92 (с, 1Н); 8,37 (д шир., 1=8,0 Гц, 1Н); 12,03 (м оч. ушир., 1Н). ЖХМС (А2): Еδ т//=836 [М+Н]+; т//=418,5 [М+2Н]²+ пик молекулярного иона; т2=834 [М-Н]^-; !_К=1,04 мин.

- 53 024627

Соединение 62. Метил-(1-{4-[(2К,3К)-3-((8)-1-{(Е)-(3К,10К,168)-10-[3-хлор-4-метоксибензил]-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил}этил)оксиранил]бензил}-1Н-1,2,3 -триазол-4 -ил)бутаноат

К раствору 5 мг (6 мкмоль) соединения 61 в 500 мкл ЭСМ и 200 мкл метанола прибавляют 4,5 мкл (9,0 мкмоль) 2 М раствора триметилсилилдиазометана в гексане. Перемешивание ведут 30 мин. Смесь концентрируют при ПД и очищают фильтрацией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 98/2. Получают соединение 62 в виде твердого белого вещества (5 мг, 98%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-Б₆): 0,72 (д, 1=6,4 Гц, 3Н); 0,75 (д, 1=6,4 Гц, 3Н); 0,99 (с, 3Н); 1,04 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,11 (с, 3Н); 1,28 (м, 1Н);

I, 50-1,59 (м, 2Н); 1,79 (м, 1Н); 1,83 (м, 2Н); 2,25 (м, 1Н); 2,35 (т, 1=7,6 Гц, 2Н); 2,62 (т, 1=7,6 Гц, 2Н); 2,652,72 (м, 2Н); 2,94-3,05 (м, 3Н); 3,25-3,38 (м частично экранирован, 1Н); 3,57 (с, 3Н); 3,81 (с, 3Н); 3,89 (д, 1=1,5 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,7 и 8,3 и 11,4 Гц, 1Н); 4,89 (дд, 1=3,4 и 9,8 Гц, 1Н); 5,09 (ддд, 1=1,5 и 5,4 и

II, 4 Гц, 1Н); 5,53 (с, 2Н); 5,78 (дд, 1=1,5 и 15,2 Гц, 1Н); 6,46 (ддд, 1=3,4 и 11,4 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,8 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,0 и 8,8 Гц, 1Н); 7,22 (дд, 1=2,5 и 9,8 Гц, 1Н); 7,28 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 7,31 (с, 4Н); 7,92 (с, 1Н); 8,34 (д, 1=8,3 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=850 [М+Н]+; т//=425,5 [М+2Н]²+ пик молекулярного иона; т//=848 [М-Н]^-; т//=894 [М-Н+НСО2Н]^- пик молекулярного иона; !К=1,11 мин.

Пример 19. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(1-{4-[(2К,3К)-3-((8)-1-{(Е)-(38,10К,168)-10-[3-хлор-4метоксибензил] -3 -изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен16-ил}этил)оксиранил]бензил}-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)бутаноат

К раствору, продуваемому аргоном, 13,4 мг (16 мкмоль) соединения 61 в 1,2 мл ТНР последовательно прибавляют 8,4 мкл (48,1 мкмоль) Э1РЕА и 8,21 мг (32,04 мкмоль) И,И'дисукцинимидилкарбоната. Перемешивание ведут в течение 26 ч при КТ. Смесь гидролизуют добавлением 2 мл воды, затем экстрагируют 2x2 мл АсОЕЕ Органические слои объединяют и сушат над М§8О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают фильтрацией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 98/2. Полученный продукт содержит 0,15 моль ИН8. Обрабатывают его 2 мл ЭСМ и промывают водой (2x3 мл), затем сушат над М§8О₄. После фильтрации и концентрирования досуха получают соединение пр.19 в виде твердого белого вещества (12,56 мг; 84%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-Б6): (0,73 (д, 1=6,3 Гц, 3Н); 0,75 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,04 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,11 (с, 3Н); 1,30 (м, 1Н); 1,49-1,60 (м, 2Н); 1,79 (м, 1Н); 1,95 (кв., 1=7,5 Гц, 2Н); 2,26 (м, 1Н); 2,65-2,77 (м, 6Н); 2,81 (с шир., 4Н); 2,92-3,05 (м, 3Н); 3,34 (м частично экранирован, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 3,89 (д, 1=1,9 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,7 и 8,1 и 11,5 Гц, 1Н); 4,90 (дд, 1=3,6 и 9,6 Гц, 1Н); 5,09 (ддд, 1=1,4 и 5,5 и 11,3 Гц, 1Н); 5,54 (с, 2Н); 5,79 (дд, 1=1,4 и 15,1 Гц, 1Н); 6,46 (ддд, 1=3,8 и 11,3 и 15,1 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,21 (дд, 1=2,5 и 9,6 Гц, 1Н); 7,28 (д, 1=2,2 Гц, 1Н); 7,31 (с, 4Н); 7,95 (с, 1Н); 8,33 (д, 1=8,1 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=933 [М+Н]+; т//=467 [М+2Н]²+ пик молекулярного иона; т//=977 [М-Н+НСО2Н]^- пик молекулярного иона; ΐ_κ=1,08 мин.

Пример 20. 2,5-Диоксапирролидин-1-ил-3-(2-{2-[2-(2-{1-[1-(4-{(2К,3К)-3-[(8)-1-((Е)-(10К,168)-10(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил)этил]оксиранил}бензил)-1,2,3-триазол-1-ил]метокси}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат о

Соединение 63. 2-{2-[2-(2-Проп-2-инилоксиэтокси)этокси]этокси}этанол

К раствору, продуваемому аргоном и охлажденному до 0°С, 1 г (5,15 ммоль) тетраэтиленгликоля в 25 мл безводного ТНР прибавляют 144 мг (3,60 ммоль) 60%-ного ИаН в виде дисперсии в минеральном масле. Перемешивание ведут 30 мин при 0°С, затем добавляют 194 мкл (2,58 ммоль) пропаргилбромида. Перемешивание продолжают при КТ в течение 15 ч. Смесь концентрируют при ПД, затем неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 63 получают в виде бесцветного масла (789 мг, 65%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО- 54 024627 й₆): 3,40 (т, 1=2,4 Гц, 1Н); 3,42 (т, 1=5,5 Гц, 2Н); 3,48 (к, 1=5,5 Гц, 2Н); 3,51-3,58 (м, 12Н); 4,14 (д, 1=2,4 Гц, 2Н); 4,53 (т, 1=5,5 Гц, 1Н); ЖХМС (А2): Е8 т//=233[М+Н]+; !_к=0,38 мин.

Соединение 64. трет-Бутил-3-(2-{2-[2-(2-проп-2-инилоксиэтокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

К раствору, продуваемому аргоном, 790 мг (3,40 ммоль) соединения 63 в 8,8 мл безводного ТНР прибавляют 4,4 мг (190 мкмоль) натрия. Смесь нагревают при 40°С в течение 2 ч до полной солюбилизации; после возвращения к КТ к смеси прибавляют 740 мкл (5,09 ммоль) трет-бутилакрилата. Перемешивание продолжают 15 ч при КТ, затем смесь концентрируют при ПД и неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 64 получают в виде бесцветного масла (944 мг, 77%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): 1,44 (с, 9Н); 2,41 (т, 1=6,2 Гц, 2Н); 3,38 (т, 1=2,4 Гц, 1Н); 3,46-3,62 (м, 16Н); 3,59 (т, 1=6,2 Гц, 2Н); 4,14 (д, 1=2,4 Гц, 2Н). ЖХМС (А1): Е8 т//=361 [М+Н]+; т//=383 [М+№а]+; !_к=3,79 мин.

Соединение 65. 3-(2-{2-[2-(2-Проп-2-инилоксиэтокси)этокси]этокси}этокси)пропановая кислота

и

К раствору 944 мг (2,62 ммоль) соединения 64 прибавляют 2 мл (52,4 ммоль) ТРА. Смесь перемешивают 6 ч при КТ, затем концентрируют досуха, обрабатывают минимальным количеством ЭСМ и несколько раз перегоняют с толуолом. Соединение 65 получают в виде бесцветного масла (722 мг, 91%). 'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): 2,44 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,39 (т, 1=2,4 Гц, 1Н); 3,46-3,56 (м, 16Н); 3,60 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 4,14 (д, 1=2,4 Гц, 2Н); 7,44-9,73 (м оч.уш., 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=305 [М+Н]+; т//=303 [М-Н]^-; !р=0, 48 мин.

Пример 20. 2,5-Диоксапирролидин-1-ил-3-(2-{2-[2-(2-{1-[1-(4-{(2К,3К)-3-[(8)-1-((Е)-(10К,168)-10(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил)этил]оксиранил}бензил)-1,2,3-триазол-1-ил]метокси}этокси)этокси]этокси}этокси)пропаноат

Соединение примера 20 может быть получено из соединений 60 и 65 согласно способу, описанному для соединения 61, с последующим активированием кислоты согласно способу, описанному для примера 19.

Пример 21. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(4-{1-[(4-{(2К,3К)-3-[(8)-1-((Е)-(38,10К,168)-10-{3-хлор-4метоксибензил}-3 -изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен16-ил)этил]оксиранил}бензил)метиламино]метил}-1,2,3-триазол-1-ил)бутаноат

Соединение 66. (Е)-(3К,10К,168)-10-(3-Хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-16-[(8)-1((2К,3К)-3-{4-[(метилпроп-2-иниламино)метил]фенил}оксиранил)этил]-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

К раствору, продуваемому аргоном, 40 мг (55,7 мкмоль) соединения 2 в 5 мл безводного ацетонитрила последовательно прибавляют 48,5 мкл (279 мкмоль) Э1РЕА и 13,9 мкл (167 мкмоль) Νметилпропаргиламина. Смесь нагревают при 40°С в течение 15 ч. Остается в реакции исходное соединение 2: снова прибавляют 48,5 мкл (279 мкмоль) Э1РЕА и 13,9 мкл (167 мкмоль) Ν-метилпропаргиламина. После 24 ч перемешивания при 40°С смесь разбавляют 5 мл АсОЕ!, затем промывают 5 мл воды. Водный слой экстрагируют 3x5 мл АсОЕ!, оганические слои объединяют, промывают насыщенным раствором NаНСОз (10 мл), насыщенным раствором Ν;·ιΟ (10 мл) и сушат над М§8О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 66 получают в виде твердого белого вещества (45 мг; количественный выход). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): 0,78 (м, 6Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,30 (м, 1Н); 1,49-1,61 (м, 2Н); 1,81 (м, 1Н); 2,20 (с, 3Н); 2,28 (м, 1Н); 2,63-2,76 (м, 2Н); 2,92-3,07 (м, 3Н); 3,17 (т, 1=2,4 Гц, 1Н); 3,27 (д, 1=2,4 Гц, 2Н); 3,33 (м частично экранирован, 1Н); 3,50 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,88 (д, 1=1,7 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,4 и 7,8 и 11,4 Гц, 1Н); 4,92 (дд, 1=3,5 и 9,7 Гц, 1Н);

- 55 024627

5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,5 и 11,2 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,5 и 15,0 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,9 и 11,2 и 15,0 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,6 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,1 и 8,6 Гц, 1Н); 7,22 (дд, 1=2,1 и 9,4 Гц, 1Н); 7,25-7,33 (м, 5Н); 8,33 (д, 1=7,8 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Εδ тА=750 [М+Н]+; Εδ тА=375,5 [М+2Н]²+ пик молекулярного иона; Εδ т//=748 [М-Н]^-; т/ζ 794 [М-Н+НСО2Н]^-; ΐκ=0,91 мин. Соединение 67. Этил-4-азидобутират

Растворяют 2,86 мл (20 ммоль) этил-4-бромбутаноата и 2,6 г (40 ммоль) ΝαΝ₃ в 30 мл смеси ацетон/вода 2/1. Смесь нагревают 7 ч с обратным холодильником. После возвращения к КТ и концентрирования при ПД остаток обрабатывают 50 мл воды. Водный слой экстрагируют 3x30 мл ЭСМ. Органические слои объединяют, сушат над М^О₄, фильтруют и концентрируют при ПД с получением соединения 67 в виде бесцветного масла (3 г, 95%). ¹Н ЯМР (400 МГц, хлороформ-б): 1,27 (т, 1=7, 2 Гц, 3Н); 1,92 (м, 2Н); 2,41 (т, 1=7,2 Гц, 2Н); 3,36 (т, 1=6,7 Гц, 2Н); 4,15 (к, 1=7,2 Гц, 2Н).

Соединение 68. 4-Азидобутановая кислота о ·' о ' §1

К раствору 3 г (19,9 ммоль) соединения 67 в 47 мл метанола и 37 мл воды прибавляют маленькими порциями 5,58 г (99,5 ммоль) едкого калия. Смесь перемешивают при КТ в течение 6 ч, затем концентрируют при ПД до объема примерно 28 мл. Остаток разбавляют 25 мл воды и экстрагируют 2x20 мл ЭСМ. Водный слой подкисляют до рН« 1 добавлением концентрированной НС1, затем экстрагируют диэтиловым эфиром 3x25 мл. Органические слои объединяют, промывают насыщенным раствором №С1 (25 мл) и сушат над М^О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД получают соединение 68 в виде бесцветного масла (2,05 г, 80%). ¹Н ЯМР (400 МГц, хлороформ-б): 1,93 (м, 2Н); 2,49 (т, 1=7,1 Гц, 2Н); 3,39 (т, 1=6,7 Гц, 2Н); 11,24 (м уш., 1Н).

Соединение 69. (4-{1-[(4-{(2Κ,3Κ)-3-[(δ)-1-((Ε)-(3δ,10Κ,16δ)-10-{3-{лор-4-метоксибензил}-3изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил)этил]оксиранил}бензил)метиламино] метил} -1,2,3 -триазол-1 -ил)бутановая кислота

К раствору 24 мг (32 мкмоль) соединения 66 в 545 мкл ТНР последовательно прибавляют 8,3 мг (13 мкмоль) соединения 68, 545 мкл воды, 128 мкл 0,1 М водного раствора сульфата меди и 128 мкл 0,2 М водного раствра аскорбата натрия. Смесь перемешивают 45 мин при КТ, затем разбавляют 2 мл воды. Водный слой экстрагируют 3x2 мл ΑсОΕΐ. Оганические слои объединяют, промывают насыщенным раствором №С1 (2 мл) и фильтруют М^О₄. После фильтрации и концентрирования при ПД неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле с привитыми диольными группами, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 98/2-90/10. Соединение 69 получают в виде твердого белого вещества (22,6 мг; 80%). Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,76 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 0,78 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,11 (с, 3Н); 1,30 (м, 1Н); 1,50-1,62 (м, 2Н); 1,81 (м, 1Н); 2,03 (м, 2Н); 2,10 (с, 3Н); 2,20 (т, 1=7,0 Гц, 2Н); 2,30 (м, 1Н); 2,64-2,74 (м, 2Н); 2,94-3,03 (м, 3Н); 3,35 (м частично экранирован, 1Н); 3,48 (с, 2Н); 3,61 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 6=1,6 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,7 и 7,7 и 11,5 Гц, 1Н); 4,37 (т, 1=7,0 Гц, 2Н); 4,91 (дд, 1=3,6 и 9,6 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,5 и 11,3 Гц, 1Н); 5,80 (дд, 1=1,5 и 15,1 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,7 и 11,3 и 15,1 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,23 (дд, 1=2,5 и 9,8 Гц, 1Н); 7,26 (д, 1=8,5 Гц, 2Н); 7,28 (д, 1=2,2 Гц, 1Н); 7,34 (д, 1=8,5 Гц, 2Н); 8,02 (с, 1Н); 8,39 (д шир., 1=7,7 Гц, 1Н); 12,14 (м ушир., 1Н). ЖХМС (А2): Εδ тА=879 [М+Н]+; тА=877 [М-Н]^-; ΐ_κ=0,86 мин.

Соединение 70. Меτил-(4-{1-[(4-{(2Κ,3Κ)-3-[(δ)-1-((Е)-(3δ,10Κ,16δ)-10-{3-хлор-4-меτоксибензил}3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-16-ил)этил]оксиранил} бензил)метиламино] метил} -1,2,3 -триазол-1 -ил)бутаноат

К раствору, продуваемому аргоном, 5,5 мг (6,2 мкмоль) соединения 69 в 0,5 мл ЭСМ и 0,2 мл метанола прибавляют 4,7 мкл (9,3 мкмоль) триметилсилилдиазометана. Смесь перемешивают 45 мин при КТ, затем концентрируют досуха. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь ЭСМ/метанол 98/2-95/5. Соединение 70 получают в виде твердого белого вещества (3,4 мг; 62%). Ή ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 0,75 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 0,77 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,11 (с, 3Н); 1,28 (м, 1Н); 1,49-1,61 (м, 2Н); 1,80 (м, 1Н); 2,07 (м, 2Н); 2,10 (м, 3Н); 2,26 (м, 1Н); 2,31 (т, 1=7,0 Гц, 2Н); 2,62-2,74 (м, 2Н); 2,93-3,04 (м, 3Н); 3,27-3,37 (м частично экранирован, 1Н); 3,48 (с, 2Н); 3,58 (с, 3Н); 3,61 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 4,25 (ддд, 1=3,7 и

- 56 024627

8,2 и 11,6 Гц, 1Н); 4,38 (т, 1=7,0 Гц, 2Н); 4,91 (дд, 1=3,9 и 9,8 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,3 и 11,2 Гц, 1Н); 5,79 (дд, 1=1,5 и 15,2 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,9 и 11,2 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,6 Гц, 1Н); 7,16 (дд, 1=2,2 и 8,6 Гц, 1Н); 7,22 (дд, 1=2,4 и 9,8 Гц, 1Н); 7,26 (д, 1=8,6 Гц, 2Н); 7,28 (д, 1=2,2 Гц, 1Н); 7,33 (д, 1=8,6 Гц, 2Н); 8,03 (с, 1Н); 8,34 (д, 1=8,2 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): ЕЗ т//=893 [М+Н]+; т//=447 [М+2Н]²+ пик молекулярного иона; т//=891 [М-Н]^-; т//=937 [М-Н+НСО2Н]^- пик молекулярного иона; !К=0,90 мин.

Пример 21. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-(4-{1-[(4-{(2К,3К)-3-[(З)-1-((Е)-(3З,10К,16З)-10-{3-хлор-4метоксибензил}-3 -изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11 -диазациклогексадец-13 -ен16-ил)этил]оксиранил}бензил)метиламино]метил}-1,2,3-триазол-1-ил)бутаноат

Соединение примера 21 может быть получено путем активации кислоты 69 согласно способу, описанному для примера 19.

Пример 22.

О

Ν ΝΗ,

К ^г

Соединение 71. (Е)-(3К,10К,16З)-16-{(З)-1-[(2З,3З)-3-(4-Азидометилфенил)оксиранил]этил}-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Спирт 57 (36 мг; 51,48 мкмол, получен согласно А1-амаг К.З., е! а1., 1. Меб. СЬет. 2003, 46, 29853007) растворяют в безводном ТНР (2 мл). Раствор продувают аргоном и охлаждают на бане с ледяной водой, после этого добавляют ИРРА (74 мкмоль), затем ИВИ (80 мкмоль). Смеси дают вернуться к КТ и продолжают перемешивание всю ночь. На следующие сутки раствор снова охлаждают на бане с ледяной водой, затем прибавляют дополнительно 74 мкмоль ИРРА и 80 мкмоль ИВИ. После 2 ч проведения реакции при 0°С и 2 ч при КТ, смесь гидролизуют 5 мл воды и затем экстрагруют 3 раза посредством ИСМ. Органические слои объединяют и сушат над №ьЗО₊ фильтруют ивыпаривают при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанола 100/0-95/5. Соединение 57 получают в виде твердого бесцветного вещества (24 мг, 64%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б6) δ (м.д.): 0,84 (д, 1=6,3 Гц, 3Н); 0,86 (д, 1=6,3 Гц, 3Н);0,98 (д, 1=7,1 Гц, 3Н); 1,03 (с, 3Н); 1,15 (с, 3Н); 1,481,67 (м, 3Н); 1,88 (м, 1Н); 2,45 (м, 1Н);2,63 (м, 1Н); 2,71 (дд, 1=11,5 и 14,0 Гц, 1Н); 2,97-3,08 (м, 3Н); 3,36 (м частично экранирован, 1Н); 3,82 (с шир., 4Н); 4,28 (ддд, 1=3,6 и 8,0 и 11,5 Гц, 1Н); 4,44 (с, 2Н); 4,99 (дд, 1=3,7 и 9,5 Гц, 1Н); 5,12 (ддд, 1=1,4 и 5,7 и 11,4 Гц, 1Н); 5,88 (дд, 1=1,4 и 15,2 Гц, 1Н); 6,49 (ддд, 1=3,8 и 11,4 и15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,18 (дд, 1=2,2 и 8,5 Гц, 1Н); 7,26-7,32 (м, 4Н); 7,36 (д, 1=8,5 Гц, 2Н); 8,40 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): ЕЗ т/ζ 722 [М-Н]^-; т/ζ 724 [М+Н]+; т/ζ 768 [М+НСО2НН]^-; !_К=1,19 мин.

Соединение 72. (Е)-(3К,10К,16З)-16-{(З)-1-[(2З,3З)-3-(4-Аминометилфенил)оксиранил]этил}-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Растворяют соединение 71 (22 мг, 30,38 мкмоль) в смеси метанола (1 мл)/воды (0,2 мл), а затем добавляют ТСЕР (34,89 мкмоль). Полученный раствор оставляют для перемешивания на всю ночь при КТ, затем концентрируют при ПД. Остаток обрабатывают насыщенным водным раствором NаΗСО₃ и экстрагируют 3 раза при помощи ИСМ. Объединенные органические слои сушат над №₂ЗО₄, фильтруют и концентрируют при ПД. Получают таким путем промежуточное соединение 72 в виде твердого бесцветного вещества (21 мг, 99%), которое используют неочищенным на следующей стадии. ЖХМС (А5): ЕЗ ιη/ζ=696 [М-Н]^-; т^=698 [М+Н]+; т^=742 [М+НСО2Н-Н]^-; !К=3,19 мин.

Соединение 74. РтосУа1-Сб-РАВАС-а-аминокриптофицин 72.

- 57 024627

Растворяют соединение 72 (21 мг, 30,08 мкмоль) в смеси ацетонитрила (2 мл)/безводного ЭМР (0,5 мл), затем прибавляют раствор соединения 73 (23 мг, 30,1 мкмол; получено согласно \УО 2006/110476) в ацетонитриле (2 мл)). Смесь оставляют на 22 ч для перемешивания при КТ, затем концентрируют при ПД. Остаток обрабатывают посредством ЭСМ и промывают насыщенным водным раствором МаНСО₃, затем сушат над Ма₂8О₄, фильтруют и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 100/0-90/10. Соединение 74 получают в виде твердого белого вещества (22 мг), которое используют неочищенным на следующей стадии. ЖХМС (А5): Е8 т//=1325 [М+Н]+; т/ζ 1369 [М+НСО₂Н-Н]^-; О =4,30 мин.

Соединение 75. Уа1-СП-РЛВАС-а-аминокриптофицин 72

N КН.

7$

Растворяют соединение 74 (22 мг, 16,59 мкмоль) в ЭМР (3 мл), затем прибавляют пиперидин (150 мкл, 1,51 ммоль) и перемешивают 30 мин при КТ. Смесь концентрируют при ПД; остаток растворяют в минимальном количестве метанола и осаждают простым эфиром. Соединение 75 получают в виде твердого белого вещества (15 мг, 82%). ЖХМС (А5): Е8 т//=1103 [М+Н]+; т//=1101 [М-Н]^-; т//=1148 [М+НСО₂Н-Н]^-; 0=3,38 мин.

Соединение 76. Уа1-С^!-ΡЛВЛС-α-аминокрипτофицинглуτаровая кислота 72

Раствор глутарового ангидрида (8 мг, 70 мкмоль) в безводном ЭМР (200 мкл) прибавляют к соединению 75 (15 мг, 13,59 мкмоль), находящемуся в атмосфере аргона. Полученный раствор перемешивают всю ночь при КТ, после этого вводят насыщенный водный раствор МН₄С1 и экстрагируют 3 раза посредством ЭСМ. Объединенные органические слои сушат над Ма₂8О₄, фильтруют и концентрируют при ПД. Полученный остаток обрабатывают с помощью ЭСМ и осаждают простым эфиром. После фильтрации через фриттированное стекло и промывки простым эфиром получают соединение 76 в виде твердого бежевого продукта (8 мг, 48%). 'Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-Д₆) δ (м.д.): 0,80-0,92 (м, 12Н); 0,96 (д, 1=7,1 Гц, 3Н); 1,02 (с, 3Н); 1,15 (с, 3Н); 1,30-1,72 (м, 9Н); 1,86 (м, 1Н); 2,00 (м, 1Н); 2,11-2,26 (м, 4Н); 2,42 (м, 1Н); 2,60-2,74 (м, 2Н); 2,91-3,11 (м, 5Н); 3,38 (м частично экранирован, 1Н); 3,76 (д, 1=1,8 Гц, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 4,17 (м, 3Н); 4,27 (м, 1Н); 4,37 (м, 1Н); 4,90-5,04 (м, 3Н); 5,11 (м, 1Н); 5,50 (м шир., 2Н); 5,88 (д шир., 1=15,2 Гц, 1Н); 6,20 (м ушир., 1Н); 6,48 (м, 1Н); 7,06 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 7,11-7,32 (м, 9Н); 7,60 (м, 2Н); 7,75 (м, 1Н); 7,89 (м, 1Н); 8,28 (м ушир., 1Н); 8,41 (д, 1=7,8 Гц, 1Н); 9,92 (с шир., 1Н); 12,06 (м ушир., 1Н). ЖХМС (А2): Е8 ω/ζ=1217 [М+Н]+; μ/ζ=1215 [М-Н]^-; 0=1,05 мин.

Пример 22.

Растворяют соединение 76 (6 мг, 4,93 мкмоль) в смеси ЭСМ (0,5 мл) и ЭМР (0,1 мл), затем последовательно прибавляют Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат (6 мг, 23,42 мкмоль) и ОГРЕА (4 мкл, 22,96 мкмоль). После 3 ч проведения рекции при КТ прибавляют насыщенный водный раствор ХН₄С1 и смесь экстрагируют 3 раза при помощи ЭСМ. Объединенные органические слои сушат над №₂8О₄, фильтруют и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ЭСМ/метанол 100/0-90/10. Получают соединение пр.22 в виде твердого белого продукта (4 мг, 61%). 'Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-Д₆) δ (м.д.): 0,80-0,90 (м, 12Н); 0,96 (д, 1=7,3 Гц, 3Н); 1,03 (с, 3Н); 1,15 (с,3Н); 1,32-1,76 (м, 7Н); 1,80-1,89 (м, 3Н); 1,97 (м, 1Н); 2,29(м, 2Н); 2,44 (м, 1Н); 2,60-2,75 (м, 4Н); 2,81 (с, 4Н); 2,89-3,08 (м, 5Н); 3,41 (м частично экранирован, 1Н); 3,77 (д, 1=2,0 Гц, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 4,14-4,24 (м, 3Н); 4,27 (ддд, 1=3,9 и 8,3 и 11,5 Гц, 1Н); 4,38 (м, 1Н); 4,93-5,03 (м, 3Н); 5,11 (м, 1Н); 5,39 (с шир., 2Н); 5,88 (д шир., 1=15,2 Гц, 1Н); 5,96 (т, 1=5,9 Гц, 1Н); 6,48 (ддд, 1=3,7 и 11,1 и 15,2 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 7,16-7,36 (м, 9Н); 7,59 (д, 1=7,8 Гц, 2Н); 7,76 (т, 1=6,1 Гц, 1Н); 7,88 (д, 1=8,8 Гц, 1Н); 8,10 (д, 1=7,3 Гц, 1Н); 8,41 (д, 1=8,3 Гц, 1Н); 9,97 (с шир., 1Н). ЖХМС (А2): Е8 ω/ζ=1314 [М+Н]+; тО=1358 [М+НСО₂НН]^-; 0=1,06 мин.

- 58 024627

Пример 23.

Соединение 77. (Е)-(3К,10К,168)-16-{(§)-1-[(2К,3К)-3-(4-Аминометилфенил)оксиранил]этил}-10-(3хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-1,4-диокса-8,11-диазациклогексадец-13-ен-2,5,9,12-тетраон

Растворяют соединение 60 (23 мг, 31,76 мкмоль) в смеси метанола (1 мл) и воды (0,2 мл), после этого добавляют ТСЕР (34,90 мкмоль) и Όί'.Μ (количество, необходимое для солюбилизации). Полученный раствор оставляют для перемешивания на всю ночь при КТ, затем концентрируют при ПД. Затем остаток обрабатывают насыщенным водным раствором NаΗСΟз и экстрагируют 3 раза с помощью Όί','Μ. Объединенные органические слои сушат над №₂8О₄, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ^СΜ/метанол 100/0-90/10. Соединение 77 получают в виде твердого белого вещества (12 мг, 59%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-а6) δ (м.д.): 0,78 (д, 1=6,4 Гц, 6Н); 1,00 (с, 3Н); 1,05 (Д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,30 (м, 1Н); 1,47-1,62 (м, 2Н); 1,79 (м, 1Н); 2,22-2,32 (м, 3Н); 2,63-2,73 (м, 2Н); 2,92-3,05 (м, 3Н); 3,35 (м частично экранирован, 1Н); 3,71 (с, 2Н); 3,81 (с, 3Н); 3,86 (д, 1=1,6 Гц, 1Н;; 4,25 (ддд, 1=3,6 и 8,0 и 11,3 Гц, 1Н); 4,90 (дд, 1=3,6 и 9,6 Гц, 1Н); 5,11 (ддд, 1=1,5 и 5,2 и 11,3 Гц, 1Н); 5,79 (дд, 1=1,5 и 15,0 Гц, 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,6 и 11,3 и 15,0 Гц, 1Н); 7,05 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 7,17 (дд, 1=1,9 и 8,5 Гц, 1Н); 7,19-7,26 (м, 3Н); 7,28 (д, 1=1,9 Гц, 1Н); 7,34 (д, 1=8,0 Гц, 2Н); 8,34 (д, 1=8,0 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Ε8 т//=698 [Μ+НЦ т//=696 [М-Н]^-; т//=742 [М+НСО2Н-Н]^-; !_К=0,87 мин.

Соединение 78. РтосVа1-С^ΐ-ΡΑΒΑС-α-аминокрипτофицин 77.

Растворяют соединение 77 (10 мг, 14,32 мкмоль) в безводном ΌΜΤ (0,1 мл), после этого прибавляют раствор промежуточного соединения 73 (11 мг, 14,35 мкмол; получено согласно АО 2006/110476) в смеси ацетонитрила (1 мл) и ΌΜΤ (0,1 мл)). Смесь перемешивают 3 ч при КТ, затем концентрируют при ПД. Затем остаток очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ^СΜ/метанол 100/0-90/10. Соединение 78 получают в виде твердого белого вещества (18 мг, 95%). ЖХМС (А5): Ε8 т//=1325 [Μ+НЦ т/ζ 1369 [Μ+НСО^-Н]^-; !_К=4,32 мин.

Соединение 79. Vа1-С^ΐ-ΡΑΒΑС-α-аминокрипτофицин 77.

Растворяют соединение 78 (42 мг, 31,68 мкмоль) в ΌΜΤ (5 мл), после этого прибавляют пиперидин (150 мкл, 1,51 ммоль) и перемешивают 30 мин при КТ. Смесь концентрируют при ПД и остаток растворяют в минимальном количестве метанола и осаждают простым эфиром. Соединение 79 получают в виде твердого белого вещества (21 мг, 60%). ЖХМС (А4): Ε8 т//=1103 [Μ+НЦ т//=1101 [М-Н]^-; т//=1147 [Μ+НСО^-Н]^-; !_К=3,67 мин.

Соединение 80. Vа1-С^ΐ-ΡΑΒΑС-α-аминокрипτофицинглуτаровая кислота 77.

Растворяют соединение 79 (20 мг, 18,12 мкмоль) в смеси ΌΜΓ (100 мкл) и безводного ΌΟΜ (500 мкл), после этого прибавляют глутаровый ангидрид (4 мг, 35,06 мкмоль). Полученный раствор перемешивают всю ночь при КТ, затем концентрируют при ПД. Полученный остаток обрабатывают минимальным количеством Όί'.Μ и метанола, осаждают смесью простого эфира и пентана и фильтруют через фриттированное стекло. Соединение 80 получают в виде твердого белого продукта (23 мг, 104% неочищенный продукт), которое используют неочищенным на следующей стадии. ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСОά₆): 0,78 (д, 1=6,3 Гц, 6Н); 0,84 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 0,86 (д, 1=6,6 Гц, 3Н); 1,00 (с, 3Н); 1,04 (д, 1=6,9 Гц, 3Н); 1,12 (с, 3Н); 1,22-1,47 (м, 3Н); 1,51-1,64 (м, 3Н); 1,72 (м, 3Н); 1,80 (м, 1Н); 1,99 (м, 1Н); 2,20 (м, 4Н); 2,28 (м, 1Н); 2,59-2,73 (м, 2Н); 2,90-3,07 (м, 5Н); 3,32 (м частично экранирован, 1Н); 3,81 (с, 3Н); 3,87 (с шир., 1Н); 4,19 (м, 3Н); 4,24 (м, 1Н); 4,38 (м, 1Н); 4,91 (дд, 1=3,3 и 9,6 Гц, 1Н); 4,97 (с шир., 2Н); 5,10 (дд, 1=4,4

- 59 024627 и 10,7 Гц, 1Н); 5,40 (с шир., 2Н); 5,79 (д шир., 1=15,1 Гц, 1Н); 5,99 (м шир., 1Н); 6,47 (ддд, 1=3,6 и 11,3 и 15,1 Гц, 1Н); 7,05 (ц, 1=8,5 Гц, 1Н); 1,11 (д шир., 1=8,5 Гц, 1Н); 7,20-7,34 (м, 8Н); 7,60 (д шир., 1=8,2 Гц, 2Н); 7,76 (т шир., 1=5,4 Гц, 1Н); 7,83 (д, 1=8,5 Гц, 1Н); 8,09 (д шир., 1=7,1 Гц, 1Н); 8,34 (д, 1=8,0 Гц, 1Н); 9,95 (с шир., 1Н); 11,98 (м ушир., 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=1217 [М+Н]+; т//=1215 [М-Н]^-; ΐ_κ=1,03 мин.

Пример 23.

Соединение пример 23 может быть получено путем активирования кислоты 80 согласно способу, описанному для примера 22.

Пример 24. [2-Метил-2-(пиридин-2-илдисульфанил)пропил]метилкарбамат (4-((28,38)-3-{(8)-1-[(Е)(38,10К, 168)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11диазациклогексадец-13-ен-16-ил]этил}оксиранил}бензила . ти х %°_о ^ΗΝ

Ти ι'α°

Соединение 81. Метил-[2-метил-2-(пиридин-2-илдисульфанил)пропил]амин

К раствору амина 15 (478 мг, 2,90 ммоль) в МеОН (35 мл) прибавляют ТСЕР (831 мг, 2,9 ммоль). После 2 ч проведения реакции при КТ полученный раствор прибавляют по каплям в атмосфере аргона к раствору 2,2'-дипиридилдисульфида (960 мг, 4,36 ммоль) в этаноле (70 мл). Реакцию ведут дополнительно в течение 2 ч при КТ, затем смесь концентрируют при ПД. Остаток обрабатывают ИСМ и промывают насыщенным водным раствором NаНСО₃. Органический слой отделяют, а водный слой снова экстрагируют 2 раза с помощью ИСМ. Объединенные органические слои сушат над №₂8О₄, фильтруют и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 98/2-85/15. Получают соединение 81 в виде масла бледно-желтого цвета (587 мг, 89%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б₆): 1,25 (с, 6Н); 1,80 (м уш. 1Н); 2,19 (с, 3Н); 2,45 (с, 2Н); 7,22 (ддд, 1=1,5 и 5,0 и 7,0 Гц, 1Н); 7,74-7,85 (м, 2Н); 8,42 (ддд, 1=1,1 и 1,5 и 5,0 Гц, 1Н).

Пример 24. [2-Метил-2-(пиридин-2-илдисульфанил)пропил]метилкарбамат (4-((28,38)-3-{(8)-1-[(Е)(38,10К,168)-10-(3-хлор-4-метоксибензил)-3-изобутил-6,6-диметил-2,5,9,12-тетраоксо-1,4-диокса-8,11диазациклогексадец-13-ен-16-ил]этил}оксиранил}бензила

К раствору промежуточного соединения 58 (21 мг, 24,3 мкмоль) в безводном ИСМ последовательно прибавляют амин 81 (10 мг, 43,79 мкмоль) и ИГРЕА (8 мкл, 45,43 мкмоль). После проведения реакции в течение 24 ч при КТ прибавляют насыщенный водный раствор NаНСО₃ и смесь экстрагируют 3 раза с помощью ИСМ. Объединенные органические слои сушат над №₂8О₄, фильтруют и концентрируют при ПД. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, элюируя смесью ИСМ/метанол 100/0-95/5. Получают соединение пр24 в виде твердого бесцветного вещества (7 мг, 30%). ¹Н ЯМР (500 МГц, ДМСО-б6): 0,82 (д, 1=6,0 Гц, 3Н); 0,84 (д, 1=6,0 Гц, 3Н); 0,97 (д, 1=6,8 Гц, 3Н); 1,03 (с, 3Н); 1,14 (с, 3Н); 1,25 (с шир., 6Н); 1,45-1,68 (м, 3Н); 1,88 (м, 1Н); 2,42 (м частично экранирован, 1Н); 2,58-2,75 (м, 2Н); 2,83-3,09 (м, 6Н); 3,34 (м частично экранирован, 1Н); 3,46 (с шир., 2Н); 3,81 (с шир., 4Н); 4,28 (м, 1Н); 4,91-5,17 (м, 4Н); 5,88 (д шир., 1=15,2 Гц, 1Н); 6,49 (м, 1Н); 7,05 (д, 1=8,6 Гц, 1Н); 7,15-7,38 (м, 8Н); 7,80 (м шир., 2Н); 8,39 (д, 1=7,8 Гц, 1Н); 8,43 (д шир., 1=4,6 Гц, 1Н). ЖХМС (А2): Е8 т//=953 [М+Н]+; т//=477 [М+2Н]²+; т//=997 [М+НСО2Н-Н]^-; ΐ_κ=1,23 мин.

Пример 25. Ьи2Н11-пр.17

В соответствии с общим способом 8,31 мг (0,057 мкмол, 1,468 мл) голых антител Ьи2Н11 в концентрации 5,66 мг/мл обрабатывают 5 экв. соединения пр.17 (0,442 мг, 0,340 мкмоль), растворенного в 37,3 мкл ИМА так, чтобы конечная концентрация антител в смеси была 3 мг/мл. После очистки на матрице 8ирегбех 200 рд и концентрирования на приборе Атюоп иИга-15 (мембрана И11гасе1 50к, МПЬроге), получают 2,15 мл конъюгата в концентрации 2,48 мг/мл, содержащего в среднем 2,2 цитотоксического соединения на антитело, и с мономерной чистотой 99,7% в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М

- 60 024627 фосфата, 0,14 М №С1 и 20% об. ЯМР. Окончательную замену буфера осуществляют в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М фосфата и 0,14 М №С1 на 1 мл конъюгата. Получают таким путем 1,5 мл раствора конъюгата пр25 в концентрации 1,06 мг/мл, содержащего в среднем 2,8 производных кристофицина (определено УФ-анализом) на антитело, и с мономерной чистотой 99,7%.

Пример 26. йи2Н11-пр.18

В соответствии с общим способом 7,8 мг (0,053 мкмол, 1,458 мл) голых антител 1ш2Н11 в концентрации 5,35 мг/мл обрабатывают 6 экв. соединения пр18 (0,578 мг, 0,531 мкмол, чистота 60%), растворенного в 272 мкл ОМА так, чтобы конечная концентрация антител в смеси была 3 мг/мл. После очистки на матрице Зирегбех 200 р§ и концентрирования на приборе Атюоп ийга-15 (мембрана ИЙгасе1 50к, МПНроге), получают 2,35 мл конъюгатов в концентрации 2,49 мг/мл, содержащих в среднем 2,5 производных криптофицина на антитело, и с мономерной чистотой 100% в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М фосфата, 0,14 М №С1 и 20% об. ЯМР. Окончательную замену буфера осуществляют в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М фосфата и 0,14 М хлорида натрия на 1 мл конъюгата. Получают таким путем 1,5 мл раствора конъюгата пр26 в концентрации 0,84 мг/мл, содержащего в среднем 2,22 производных кристофицина (определено УФ-анализом) на антитело, и с мономерной чистотой 99,9%.

Пример 27. йи2Н11-пр.9.

В соответствии с общим способом 12 мг (81,7 мкмоль, 1,172 мл) голых антител 1ш2Н11 в концентрации 10,24 мг/мл обрабатывают 2x5 экв. соединения пр19 (0,382 мг, 0,41 мкмоль), растворенного в 44,3 мкл ОМА так, чтобы конечная концентрация антител в реакционной среде была 3 мг/мл. После очистки на матрице Зирегбех 200 р§ в присутствии 20% ЯМР и концентрирования на приборе Атюоп иНга-15 (мембрана И11гасе1 50к, МПНроге), получают 1,04 мл конъюгатов в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М фосфата, 0,14 М ЯаС1 и 20% об. ЯМР. Окончательную замену буфера осуществляют в водном буфере рН 6,5, содержащем 0,01 М гистидина, 10% сахарозы (м/об.) и 5% ЯМР (об./об.). Получают 1,5 мл раствора конъюгата пр.27 в концентрации 2,66 мг/мл, содержащего в среднем 1,4 производных кристофицина (НКМЗ) на антитело, и с мономерной чистотой 99,8%.

Примеры, приведенные ниже, осуществляли с конкретным производным криптофицина (чаще с производным Όι), но может быть использовано другое производное из группы Όι-Ό₈ или производное криптофицина общей формулы (ΙΙ). Аналогично этому, получение конъюгатов согласно примерам 10, 11, 12, 25, 26 и 27 может быть применено к другим антителам, отличающимся от 1ш2Н11.

Примечание: в указанных примерах -Ьу8- означает, что связывание происходит по ε-аминогруппам лизина антитела.

Пример 28. Оценка ингибирования пролиферации клеток линий МЭА-МВ-231, МОА-А1 и НСТ116 с помощью цитотоксических соединений, это исследование осуществляли с использованием соединений формулы (II) типа 3Ζ₃, где Ζ_а=ЗΜе или типа -С(=О)^_ЪК_Ъ, где Ζ_ЪΚ_Ъ=Оше.

Клетки МОА-МВ-231, МОА-А1 или НСТ116 в фазе их экспоненциального роста трипсинизировали и суспензировали в соответствующей культуральной среде (ЭМЕМ/Р12 С'зЪсо #21331, 10% ЗУР СЪсо #10500-056, 2 нМ глутамин СЪсо #25030 для клеток МОА; ОМЕМ СЪсо #11960, 10% ЗУР СЪсо #10500-056, 2 нМ глутамин СЪсо #25030 для клеток НСТ116). Клеточную суспензию засевали в 96луночные культуральные планшеты СуГОЦаг (СЕ НеаИйсаге Еигоре, #КРЯЦ0163) в полной культуральной среде, содержащей сыворотку, с плотностью 5000 клеток/лунку (МОА-МВ-231, МОА-А1 и НСТ116). После 4 ч инкубирования добавляли в лунки последовательно разведенные производные криптофицина в уменьшающихся концентрациях от 10^-7 до 10^-12 М (три параллельных опыта для каждой концентрации). Клетки выращивали в течение 3 суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂, в присутствии цитотоксических соединений. На 4-ый день добавляли в каждую лунку по 10 мкл раствора тимидина ¹⁴С (0,1 мкКи/лунку, от Регкш Е1тег #ЯЕС56825000). Включение тимидина ¹⁴С измеряли спустя 96 ч после начала эксперимента с помощью радиоактивного счетчика МюгоЪе1а (от Регкш Е1тег). Данные выражали в процентах выживаемости, используя соотношение между измерением, полученным с клетками, обработанными цитотоксическими соединениями, и измерением, полученным с клетками контрольных лунок (обработанных только культуральной средой).

- 61 024627

Таблица III

Пример 29. Оценка ингибирования пролиферации клеток линий МИА-МВ-231, МИА-А1 и НСТ116 с помощью конъюгатов антитело-цитотоксическое соединение.

Клетки МИА-МВ-231, МИА-А1 и НСТ116 в фазе их экспоненциального роста трипсинизировали и суспензировали в соответствующей культуральной среде (ИМЕМ/Р12 СлЬсо #21331, 10% 8\Т СлЬсо #10500-056, 2 нМ глутамин ОФсо #25030 для клеток МИА; ИМЕМ О1Ьсо #11960, 10% 8νΤ О1Ьсо #10500-056, 2 нМ глутамин ОФсо #25030 для клеток НСТ116). Клеточную суспензию засевали в 96луночные культуральные планшеты Су!ов!аг (ОЕ НеаЙЬсаге Еигоре, #ΡΡΝΟ0163) в полной культуральной среде, содержащей сыворотку, с плотностью 5000 клеток/лунку (МИА-МВ-231, МИА-А1 и НСТ116). После 4 ч инкубирования добавляли в лунки последовательно разведенные производные криптофицина в уменьшающихся концентрациях от 10^-7 до 10^-12 М (три параллельных опыта для каждой концентрации). Клетки выращивали в течение 3 суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в присутствии иммуноконъюгатов антитело-цитотоксическое соединение. На 4-й день добавляли в каждую лунку по 10 мкл раствора тимидина ¹⁴С (0,1 мкКи/лунку, от Ρе^к^η Е1тег #№ЕС56825000). Включение тимидина ¹⁴С измеряли спустя 96 ч после начала эксперимента с помощью радиоактивного счетчика М1сгоЬе1а (от Ρе^к^η Е1тег). Данные выражали в процентах выживаемости, используя соотношение между измерением, полученным с клетками, обработанными иммуноконъюгатом, и измерением, полученным с клетками контрольных лунок (обработанных только культуральной средой). В некоторых экспериментах добавляли в лунки голые антитела Ьи2Н 11 в концентрации 1 мкМ в начале эксперимента и ингибирование пролиферации измеряли, как описано выше.

ТаблицаIV

Claims

1. Производное криптофицина формулы (II) в которой К₃ означает (С₁-С₆)алкильную группу;

К6 и К7 означают, независимо один от другого, Н или (С1-С6)алкильную группу;

К₈ и К₉ означают, независимо один от другого, Н или (С₁-С₆)алкильную группу;

К₁₀ означает Н или по меньшей мере один заместитель фенильного кольца, выбранный из групп (С₁-С₄)алкокси, атома хлора;

К₁₁ означает Н или по меньшей мере один заместитель, выбранный из (С₁-С₄)алкильной группы;

- 62 024627

Ь означает линкер в положении орто(о)-, мета(м)- или пара(п)-, выбранный из

К₁₂ означает Н или (С1-С₆)алкильную группу;

ζ, означает Н или группу -δΡ,,, где К_а означает группу (С₂-С₆)алкил;

Ζ|, означает простую связь, -О- или -ΝΉ-, причем К_ь означает Н или группу (С₁ -С₆)алкил;

где группу -δΖ₃ или -С(=О)^_|:К_1:1 обозначают как химическую реакционноспособную группу (ОСК1).

2. Производное криптофицина по п.1, описанное одной из следующих формул:

3. Производное криптофицина по п.1, выбранное из

- 63 024627 в котором Ζ₃, Ζ_Ь и К_Ь определены в п.1.

4. Применение производного криптофицина по одному из пп.1-3 для образования конъюгата с моноклональным антителом.

5. Способ получения конъюгата, представляющего собой моноклональное антитело, с которым ковалентно связано по меньшей мере одно производное криптофицина формулы (ίί) по п.1, содержащее реакционноспособную химическую группу (ОСК1), состоящий в том, что (ί) вводят в контакт и подвергают взаимодействию водный раствор моноклонального антитела и раствор производного криптофицина, такого как определен в п.1.

6. Способ по п.5, в котором водный раствор моноклонального антитела является забуференным.

7. Способ по п.5 или 6, в котором дополнительно (ίί) отделяют конъюгат, полученный на стадии (ί), от производного криптофицина, и/или непрореагировавшего моноклонального антитела, и/или от возможно образовавшихся агрегатов.

8. Способ по одному из пп.5-7, в котором в случае производного криптофицина, содержащего реакционноспособную химическую группу ОСК1 типа -δΖ₃, подвергают взаимодействию производное криптофицина с моноклональным антителом, содержащим дисульфидные химические группы, если ОСК1 означает -δ№ тиольные химические группы, если ОСК1 означает -δΖ₃, где Ζ_Η>4; малеимидо или иодацетамидо химические группы, если ОСК1 означает -δ№ в случае производного криптофицина, содержащего реакционноспособную химическую группу ОСК1 типа -С(=О)^_ЬК_Ь, подвергают взаимодействию производное криптофицина с аминофункциями моноклонального антитела.

9. Способ по одному из пп.5-8, в котором в случае производного криптофицина, содержащего реакционноспособную химическую группу ОСК1 типа -δΖ₃, моноклональное антитело модифицируют с помощью модифицирующего агента, выбранного из соединения формулы в которой К означает группу (С1-С₆)алкил и АЬК означает (С1-С₆)алкиленовую группу; в случае производного криптофицина, содержащего реакционноспособную химическую группу

ОСК1 типа -δΚ моноклональное антитело модифицируют с помощью модифицирующего агента, выбранного из сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата; сульфосукцинимидил-4(№малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилата;

сукцинимидил-№бромацетата; сукцинимидил-3-(№бромацетамидо)пропионата;

причем АЬК означает (С1-С1₂)алкиленовую группу и Ь является целым числом между 0 и 2000.

10. Конъюгат для применения в качестве противоракового агента, получаемый способом по одному из пп.5-9.

- 64 024627

Фиг. 2